ES3036088T3 - Mir-181 inhibitors and uses thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a agentes capaces de inhibir miR-181, para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos mitocondriales, incluyendo enfermedades mitocondriales con afectación ocular y/o cerebral y neurodegeneración que afecta ocular y/o cerebral asociada a disfunción mitocondrial. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores del MIR-181 y usos de los mismos

Campo técnico

La presente invención se refiere a agentes capaces de inhibir el miR-181, para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de trastornos mitocondriales, incluidas las enfermedades mitocondriales con afectación ocular y/o cerebral y las afecciones neurodegenerativas que afectan a los ojos y/o el cerebro asociadas con la disfunción mitocondrial, como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Antecedentes

Las mitocondrias son actores clave en diferentes procesos celulares y su disfunción contribuye a la patogénesis de una variedad de trastornos humanos, ya sea directamente, p. ej., en el caso de las enfermedades mitocondriales (EM), o indirectamente, p. ej., en el caso de trastornos neurodegenerativos comunes, como la enfermedad de Parkinson (EP) o la enfermedad de Alzheimer (EA), donde las disfunciones mitocondriales se han descrito como un factor causal central en la patogénesis (ref.: PMID: 23567191).

Las enfermedades mitocondriales primarias (EMP) son un grupo heterogéneo de trastornos causados por mutaciones en genes codificados mitocondriales o nucleares implicados en la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Las manifestaciones clínicas de las EMP van desde lesiones de un solo tejido u órgano hasta afecciones sindrómicas multiorgánicas con afectación importante del sistema nervioso central (SNC), que es particularmente sensible a la disfunción mitocondrial. Las EMP incluyen: síndrome de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON, por sus siglas en inglés), síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS, por sus siglas en inglés), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP, por sus siglas en inglés), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojas irregulares (MERRF, por sus siglas en inglés). Las enfermedades mitocondriales secundarias (EMS) son un grupo de trastornos causados por mutaciones en los genes nucleares que afectan directamente a la función mitocondrial, como la ataxia de Friedreich, la paraplejia espástica hereditaria y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

Si bien cada trastorno individual es poco frecuente, se estima que la prevalencia total combinada de EM en adultos es de aproximadamente 1 en 4300, lo que las convierte en uno de los grupos más prevalentes de enfermedades neurológicas hereditarias (Gorman y col., 2015).

Los trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central y/o al ojo se asocian frecuentemente a una disfunción mitocondrial; dichos trastornos pueden ser de naturaleza esporádica o familiar: p. ej., las enfermedades neurodegenerativas esporádicas relacionadas con la edad incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía diabética y el glaucoma.

Las enfermedades neurodegenerativas familiares incluyen la EP familiar, la EA, la enfermedad de Huntington, la retinitis pigmentosa (RP) y la enfermedad de Stargardt.

Las enfermedades mitocondriales (tanto las EMP como las EMS) son bioquímica y genéticamente heterogéneas y su complejidad ha impedido hasta ahora el desarrollo de tratamientos eficaces. Para la mayoría de los pacientes, la terapia se limita a prevenir o tratar complicaciones, tales como la diabetes, la afectación cardíaca y la epilepsia. Los tratamientos disponibles son de apoyo (no abordan los defectos primarios) o se centran en aspectos específicos de la disfunción mitocondrial. Por lo tanto, hasta la fecha no hay ninguna terapia eficaz disponible y el tratamiento de pacientes con enfermedad mitocondrial establecida sigue siendo un desafío importante (Lightowlers y col., 2015; Viscomi y col., 2015). Recientemente, se ha analizado la modulación específica de la biogénesis/dinámica mitocondrial o la depuración/control de calidad mitocondrial como posible estrategia terapéutica en modelos de EM tantoin vitrocomoin vivo(Cerutti y col., 2014; Civiletto y col., 2018; Civiletto y col., 2015; Johnson y col., 2013; Viscomi y col., 2011). A pesar de algunos datos prometedores, estos últimos enfoques arrojaron resultados discordantes y no lograron ser eficaces en diferentes modelos de EM (revisados en Lightowlers y col., 2015; Viscomi y col., 2015). Por lo tanto, existe la necesidad de una modulación más eficaz de las vías mitocondriales como estrategias terapéuticas para las enfermedades mitocondriales.

No hay terapias eficaces disponibles para los trastornos neurodegenerativos tales como la EP o la EA. La enfermedad de Alzheimer es la causa más común de demencia, representando entre el 60 y el 80 % de los casos, mientras que la prevalencia de la enfermedad de Parkinson en los países industrializados se estima generalmente en un 1 % en las personas mayores de 60 años, lo que representa una carga importante para los sistemas de salud, considerando que las opciones de tratamiento hasta la fecha son en su mayoría sintomáticas (Barnes y Yaffe, 2011; de Lau y Breteler, 2006).

Una molécula pequeña para el tratamiento de trastornos mitocondriales, en particular el LHON, se describe en Sreenivas Avula y col. (Current Treatment Options in Neurology, vol. 16, n.° 6, 2014).

Los microARN (miARN) son reguladores finos fundamentales de la expresión génica y representan herramientas terapéuticas prometedoras debido a su capacidad para modular simultáneamente múltiples vías moleculares implicadas en la patogénesis y progresión de la enfermedad. La modulación de los miARN se ha aplicado con fines terapéuticos a diferentes trastornos y ha alcanzado etapas preclínicas y clínicas en casos específicos (Broderick y Zamore, 2011; Christopher y col., 2016; Janssen y col., 2013; Ling y col., 2013). Los miARN desempeñan un papel clave en la supervivencia neuronal y la evidencia acumulada indica que las alteraciones en las redes genéticas reguladas por el miARN aumentan el riesgo de trastornos neurodegenerativos (Hebert y De Strooper, 2009). Los miembros de la familia miR-181 son producidos por tres transcritos primarios independientes localizados en tres cromosomas separados. Cada transcrito produce dos secuencias precursoras, lo que da un total de seis secuencias precursoras. Cada secuencia precursora produce dos cadenas de miARN: la cadena guía o 5p y la cadena pasajera o 3p, lo que da un total de diez formas de miARN maduras: miR-181a-5p, miR-181a-1-3p, miR-181a-2-3p, miR-181b-5p, miR-181b-1-3p, miR-181b-2-3p, miR-181c-5p, miR-181c-3p, miR-181d-5p y miR-181d-3p. Las secuencias maduras de 5p son las que muestran los niveles de expresión más abundantes en los tejidos de mamíferos (Karali y col., 2016) y contienen la misma secuencia “ semilla” en el extremo 5', lo que sugiere un grado significativo de redundancia funcional (Henao-Mejia y col., 2013; Ji y col., 2009). Como se utiliza en la presente memoria, los seis miARN de 5p maduros se definirán como: miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c y miR-181d. Las formas maduras del miR-181a-1 y el miR-181a-2, así como del miR-181b-1 y el miR-181b-2 son idénticas en secuencia; la forma madura del miR-181c tiene una diferencia de nucleótidos en comparación con el miR-181a, mientras que la forma madura del miR-181d tiene una diferencia de nucleótidos en comparación con el miR-181b. El miR-181a y el miR-181b (miR-181a/b) están muy conservados en vertebrados y se expresan en gran medida en diferentes regiones del cerebro y la retina (Boudreau y col., 2014; Karali y col., 2016) y recientemente se informó que se dirigen a los genes implicados en la muerte celular dependiente de las mitocondrias (Hutchison y col., 2013; Ouyang y col.. , 2012; Rodríguez-Blazquez y col., 2015) y la autofagia (Cheng y col., 2016; He y col., 2013; Tekirdag y col., 2013).

El documento WO 2013/055865 menciona el miR-181a entre las numerosas diana de los antagomir para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), una enfermedad que involucra a las neuronas motoras, no atribuible a enfermedades mitocondriales con afectación ocular y/o cerebral.

Filipe Duarte y col. (GENES, vol. 5, n.° 4, 2014) proponen el miR-181a/c como diana terapéutica para las enfermedades cardiovasculares.

Sin embargo, Sabrina Carrella y col. (DEVELOPMENTAL NEUROBIOLOGY, vol. 75, n.° 11, 2015) muestran que la eliminación del mir-181a y mir-181b utilizando oligonucleótidos morfolino conduce a defectos en la neuritogénesis en los peces medaka.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a inhibidores del miR-181 para el tratamiento y/o la prevención de trastornos mitocondriales, incluidas las enfermedades mitocondriales con afectación ocular y/o cerebral y la neurodegeneración que afecta a los ojos y/o el cerebro asociada con la disfunción mitocondrial, tal como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el miR-181, en particular los miR-181 a y b, participan en la regulación global de la función mitocondrial al controlar los genes implicados en la biogénesis, la funcionalidad y la respuesta antioxidante en las mitocondrias en el SNC; además, los inventores han descubierto que el miR-181a/b modula la expresión de los genes relacionados con la muerte celular programada y la autofagia/mitofagia dependientes de las mitocondrias en el SNC.

Los inventores han demostrado sorprendentemente que la inhibición del miR-181 ejerce un efecto neuroprotector en las EM y en la neurodegeneración asociada a la disfunción mitocondrial, de particular gran relevancia, especialmente para afecciones genéticamente heterogéneas, tales como las EM, la EP y la RP, para las que es altamente deseable una estrategia terapéutica independiente de los genes. Los presentes inventores han descubierto que el miR-181a/b modula el recambio mitocondrial mediante una fina coordinación de la biogénesis y la depuración. Los inventores han descubierto además que la inhibición del miR-181 ejerce un efecto beneficioso sobre varias patologías caracterizadas por la disfunción mitocondrial, particularmente al proteger de la muerte celular y la neurodegeneración mediadas por las mitocondrias en enfermedades tales como las EMP, que incluyen el síndrome de Leigh, la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), el síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), la epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF, por sus siglas en inglés), la oftalmoplejía externa progresiva (PEO, por sus siglas en inglés), el síndrome de Pearson, la miopatía y cardiomiopatía de herencia materna (MiMyCA, por sus siglas en inglés), la neuropatía óptica de Kjer, la neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP, por sus siglas en inglés), la atrofia óptica autosómica dominante, el síndrome de Kearns-Sayre, el síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojas irregulares (MERRF, por sus siglas en inglés); las EMS, que incluyen la ataxia de Friedreich, la paraplejía espástica hereditaria, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central y/o al ojo asociados con la disfunción mitocondrial, que incluyen las enfermedades neurodegenerativas esporádicas relacionadas con la edad, p. ej., la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía diabética, el glaucoma; enfermedades neurodegenerativas familiares, que incluyen la EP familiar, la EA, la enfermedad de Huntington, la retinitis pigmentosa (RP) y la enfermedad de Stargardt.

A continuación, la presente invención proporciona un inhibidor del miR-181 para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno mitocondrial, seleccionado del grupo que consiste en: síndrome de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF), oftalmoplejía externa progresiva (PEO), síndrome de Pearson, miopatía y miocardiopatía de herencia materna (MiMyCA), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, epilepsia mioclónica con fibras rojas irregulares (MERRF), ataxia de Friedreich, paraplejía espástica hereditaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad neurodegenerativa esporádica asociada a la edad, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad neurodegenerativa familiar, EP familiar, EA, enfermedad de Huntington, retinitis pigmentosa (RP), enfermedad de Stargardt, siendo dicho inhibidor del miR-181 un ácido nucleico inhibidor que comprende al menos una secuencia complementaria al miR-181, en donde dicho inhibidor comprende una secuencia complementaria a ACAUUCA (Id. de sec. n.° 5).

En la presente invención, los términos trastorno mitocondrial y enfermedad mitocondrial se utilizan indistintamente. Según este aspecto de la invención, un tratamiento y/o prevención de un trastorno mitocondrial puede ser eficaz para mitigar al menos un síntoma de dicho trastorno.

Al tratar la causa subyacente del trastorno, se cree que también se puede lograr el manejo de los síntomas. Mediante el manejo de los síntomas, se pretende mantener la gravedad de los síntomas (es decir, controlar el empeoramiento o la progresión de los síntomas) o, más preferiblemente, reducir la gravedad de los síntomas total o parcialmente.

Como se utiliza en la presente memoria, “tratamiento” (y sus variaciones gramaticales, tales como “tratar” o “ que trata” ) o “ prevención” (y sus variaciones gramaticales, tales como “ prevenir” o “ que previene” ) se refieren a una intervención clínica destinada a alterar el curso natural de la enfermedad en el individuo que se trata, y puede realizarse ya sea como profilaxis o durante el curso de una patología o trastorno clínico. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, aunque no de forma limitativa, prevenir la aparición o recurrencia de una enfermedad o trastorno, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad o trastorno, prevenir la recaída, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad/trastorno, mejorar o paliar el estado de la enfermedad/trastorno y lograr la remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, el inhibidor de la invención se utiliza para retardar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para retrasar la progresión de una enfermedad o trastorno.

Cualquier referencia en esta descripción a métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnósticoin vivodebe interpretarse como una referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para utilizar en esos métodos.

Dicho inhibidor es un agente inhibidor de ácidos nucleicos.

Otros inhibidores, que no entran dentro del objeto para el que se busca protección, son una molécula pequeña o un agente de edición del genoma. Un agente de edición es un agente que puede mediar en la alteración o reparación de genes específicos, en donde dicho agente es una nucleasa diseñada, por ejemplo, una nucleasa de dedos de Zn, una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción o un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas e interespaciadas regularmente. Preferiblemente, el agente inhibidor de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: ARNip, un oligonucleótido antisentido (p. ej., un antagomir, un ácido nucleico bloqueado), una esponja de miARN y/o una ribozima según se define en la presente memoria.

El inhibidor del miR-181 comprende al menos una secuencia complementaria al miR-181. El inhibidor del miR-181 comprende al menos una secuencia complementaria a ACAUUCA (Id. de sec. n.° 5). Preferiblemente, dicho inhibidor reduce la función y/o la actividad del miR-181.

La función y la actividad del miR-181 se pueden medir mediante cualquier método conocido en la técnica, en particular como se describe en la presente memoria.

Más preferiblemente, dicho inhibidor tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en: inhibición de la actividad del miARN, preferiblemente inhibición de la unión a la diana del ARNm, aumento de los niveles de ARNm de al menos una diana específica del miR-181, mejora de la función mitocondrial, aumento del número de mitocondrias, reducción del estrés oxidativo y/o de la muerte celular, mejora de la supervivencia celular. Las propiedades anteriores se pueden medir mediante cualquier método conocido en la técnica, en particular tal como se describe en la presente memoria.

Preferiblemente, dicho miR-181 es un precursor de miR-181 o un miR-181 maduro, preferiblemente dicho miR-181 se selecciona del grupo que consiste en miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c y miR-181d o una combinación de los mismos.

Preferiblemente, el inhibidor del miR-181 comprende una secuencia complementaria a ACAUUCA (Id. de sec. n.° 5) y tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la Id. de sec. n.° 1 o la Id. de sec. n.° 2 o la Id. de sec. n.° 3 o la Id. de sec. n.° 4. Preferiblemente, tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de identidad con la Id. de sec. n.° 1 o la Id. de sec. n.° 2 o la Id. de sec. n.° 3 o la Id. de sec. n.° 4.

Más preferiblemente, dicho inhibidor tiene una longitud de 18 a 21 nucleótidos.

En una realización preferida, dicho inhibidor del miR es una esponja de miARN que tiene la siguiente fórmula:

(X1 sX2sX3)mS2(X1 sX2sX3)n2

en donde

X1, X2 y X3 se eligen independientemente de

- una secuencia MBS complementaria al miR-181a y/o miR-181c, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

- una secuencia MBS complementaria al miR-181b y/o miR-181d, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

X3 puede estar presente o ausente;

s es una secuencia espaciadora de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente de 4 nucleótidos;

S2 es una secuencia espaciadora central de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente de 6 nucleótidos, que corresponde preferiblemente a un sitio de la enzima de restricción, preferiblemente un sitio para la enzima de restricción Xbal; m y n2 son un número seleccionado independientemente de 3, 6 y 24, preferiblemente entre 3, 6

y 12, con máxima preferencia n es 3, n y n2 pueden ser idénticos o diferentes.

En una realización preferida, dicha esponja de miARN tiene la fórmula:

(AsB)mS2(AsB)n2

en donde:

A es una secuencia MBS complementaria al miR-181a y/o miR-181c, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

B es una secuencia MBS complementaria al miR-181b y/o miR-181d, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

s es una secuencia espaciadora de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente de 4 nucleótidos;

S2 es una secuencia espaciadora central de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente de 6 nucleótidos, que corresponde preferiblemente a un sitio para una enzima de restricción, preferiblemente la enzima de restricción XbaI, m y n2 es un número seleccionado independientemente entre 3, 6 y 24, preferiblemente entre 3, 6 y 12, con máxima preferencia n es 3, m y n2 pueden ser idénticos o diferentes.

Preferiblemente, X1, X2, X3, A es 3' TTGTAAGTn1n2n3n2ACAGCCACTCA 5' (Id. de sec. n.° 113)

en donde, según la nomenclatura de la IUPAC:

n1 = A o C o G

n2= A o C o T

n3= A o G o T

o en donde X1, X2, X3, B es 3' TTGTAAGTn'1n'1n'2n'3ACAGCCACCCA 5' (Id. de sec. n.° 114)

en donde, según la nomenclatura de la IUPAC

n'1 = C o G o T

n'2= A o G o T

n'3= A o C o T;

o en donde ni = 3 y n2 = 3;

o en donde s consiste en 4 nucleótidos, preferiblemente s = tagc;

o en donde S2 consiste en 6 nucleótidos, preferiblemente S2 = Tctaga.

Preferiblemente, la secuencia del inhibidor comprende además uno o más nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés) y uno o más nucleótidos no bloqueados, en donde al menos uno de los nucleótidos no bloqueados comprende una modificación química, preferiblemente los nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) tienen un puente de metileno en 2' a 4', preferiblemente la modificación química es una modificación de O-alquilo en 2' o halo en 2'.

Además, preferiblemente dicho inhibidor del miR-181 se utiliza con al menos un agente adicional.

Más preferiblemente, dicho al menos un agente adicional es un inhibidor del miR-181 como se ha definido anteriormente y en la presente invención.

Entonces, el uso se refiere a una combinación de uno o más inhibidores del miR-181, es decir, uno o más ARNip, un oligonucleótido antisentido (p. ej., un antagomir, un LNA), una esponja de miARN y/o una ribozima que pueden ser iguales o diferentes.

En una realización preferida, dicho al menos un agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente que mejora la función mitocondrial, seleccionado de: un agente que aumenta la biogénesis mitocondrial (es decir, un agente que activa una vía que controla la biogénesis mitocondrial, lo que conduce a un aumento de la fosforilación oxidativa y/o una mejora de las actividades defectuosas de los complejos de la cadena respiratoria, por ejemplo, un precursor de NAD+ (p. ej., entre otros, un ribósido de nicotinamida), un agonista de la AMPK (p. ej. AICA<r>), un inhibidor de la poli ADP ribosa polimerasa (PARP) (p. ej., entre otros, olaparib [AZD-2281]), resveratrol, metformina, ácido retinoico, un agente que modula la autofagia, por ejemplo, un activador de la autofagia, p. ej., un inhibidor de mTOR (por ejemplo, rapamicina), un agente que inhibe la apoptosis, un eliminador de ROS, p. ej., compuestos antioxidantes, incluidos el ácido lipoico, las vitaminas C y E, y la CoQ, un agente que cambia la heteroplasmia, un eliminador de compuestos tóxicos, la N-acetilcisteína (NAC), el metronidazol, un suplemento de nucleótidos, un inhibidor de los poros de transición de la permeabilidad, p. ej., la ciclosporina A o un derivado de la misma, un agente que reemplaza el factor faltante, p. ej., una terapia de reemplazo enzimático en donde se reemplaza la enzima que es deficiente o está ausente en el cuerpo, o una terapia génica, p. ej., la administración terapéutica de ácido nucleico a las células de un paciente como un fármaco para tratar una enfermedad.

Los agentes adicionales preferidos de la invención son agentes para tratar una enfermedad de la invención, por ejemplo, agentes para el tratamiento de la enfermedad de LHON: la idebenona, un análogo sintético de la ubiquinona, actúa mejorando el metabolismo oxidativo mitocondrial en el cerebro y reduciendo el estrés oxidativo (Lyseng-Williamson, 2016; Sanchez y col., 2016). La hidroxocobalamina, una forma sintética inyectable de la vitamina B12, un vector AAV recombinante de serotipo 2 que contiene el gen ND4 mitocondrial silvestre humano, un vector AAV recombinante que contiene el gen ND1 mitocondrial silvestre humano, la elamipretida, un bloqueador de la apertura de poros de transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial.

Preferiblemente, dicho inhibidor del miR-181 y dicho al menos un agente adicional se administran de forma secuencial o simultánea.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el inhibidor del miR-181, como se ha definido en una cualquiera de las realizaciones anteriores, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno mitocondrial.

Preferiblemente, la composición comprende además al menos un agente adicional, preferiblemente dicho al menos un agente adicional es un inhibidor del miR-181 como se ha definido anteriormente, preferiblemente dicho al menos un agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: un agente que aumenta la biogénesis mitocondrial, un agente que modula la autofagia, un agente que inhibe la apoptosis, un eliminador de ROS, un agente que cambia la heteroplasmia, un eliminador de compuestos tóxicos, un suplemento de nucleótidos, un agente que reemplaza el gen faltante.

La presente descripción proporciona además un método para tratar un trastorno mitocondrial en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto al menos un inhibidor del miR-181 como se ha definido anteriormente o la composición farmacéutica como se ha definido anteriormente.

La invención también proporciona un vector que comprende al menos un inhibidor del miR-181 como se ha definido anteriormente y una secuencia promotora, preferiblemente el vector es un vector viral, preferiblemente un vector viral adenoasociado para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno mitocondrial. Preferiblemente, la enfermedad mitocondrial es una enfermedad mitocondrial primaria o secundaria.

Preferiblemente, la enfermedad mitocondrial se selecciona del grupo que consiste en: una enfermedad mitocondrial con afectación ocular y/o cerebral, una neurodegeneración que afecta al ojo y/o al cerebro, estando asociada dicha neurodegeneración a una disfunción mitocondrial.

La enfermedad mitocondrial se selecciona del grupo que consiste en: síndrome de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF), oftalmoplejía externa progresiva (PEO), síndrome de Pearson, miopatía y miocardiopatía de herencia materna (MiMyCA), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, epilepsia mioclónica con síndrome de fibras rojas irregulares (MERRF), ataxia de Friedreich, paraplejía espástica hereditaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad neurodegenerativa esporádica asociada a la edad, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad neurodegenerativa familiar, EP familiar, EA, enfermedad de Huntington, retinitis pigmentosa (RP), enfermedad de Stargardt.

La invención se describirá por medio de ejemplos no limitativos en referencia a las siguientes figuras.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. El miR-181a/b modula la biogénesis mitocondrial y la mitofagia

A)La qRT-PCR confirma que el silenciamiento del miR-181a/b conduce a una regulación al alza de las dianas predichas del miR-181a/b en las células SH-SY5Y. N = 3 experimentos independientes.

B)La transfección del imitador de miR-181 inhibe específicamente la actividad de la luciferasa de los constructos que contienen las secuencias diana predichas de la 3'-UTR silvestre. Las mutaciones (mut) puntuales en los sitios de unión del miR-181a/b suprimen la represión de la luciferasa. Los datos se normalizan a una transfección mímica negativa (línea discontinua). N = 6 experimentos independientes.

C)La qRT-PCR revela una regulación al alza de las dianas del miR-181a/b en los ojos de los animalesmiR-181a/b-1/- frente amiR-181a/b-1+l+.n >5 animales/genotipo.

D)Los ratonesmiR-181a/b-t/-muestran un mayor contenido de ADNmt en comparación con los ratonesmiR-181a/b-1+/+.n = 4 animales/genotipo.

E)El análisis por transferencia Western (panel izquierdo) revela niveles aumentados (cuantificados en el panel derecho) de proteínas mitocondriales en los ojos de ratonesmiR-181a/b-1-/~(-/-) frente amiR-181a/b-1+/+(+/+). Los datos se normalizan con respecto a p115 o a Gapdh. N = 3 animales/genotipo. Téngase en cuenta que todas las bandas comparadas de las muestras /+ y -/- provienen de las mismas manchas que se recortaron y se muestran divididas para mayor claridad en la presentación de los datos.

F)El análisis por transferencia Western en las fracciones mitocondriales y citosólicas (panel izquierdo) muestra niveles aumentados de p62 y Parkin (cuantificados en el panel derecho) en la fracción mitocondrial del ojo de ratones -/- frente a /+. Los datos se normalizan con respecto a Ndufb8 o Gapdh para las fracciones mitocondriales y citosólicas, respectivamente. N = 3 animales/genotipo.

*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 prueba t de Student de una cola (enA-Cy enE) y de dos colas (enD).

Figura 2. La inhibición del miR-181a/b contrarresta la muerte celular en modelos de pez medaka de microftalmia con defectos cutáneos lineales (MLS).

A)Los ensayos TUNEL realizados en secciones retinianas y cerebrales de embriones a los que se les inyectó MO y control del pez medaka st30 revelan una disminución en el número de células apoptóticas en los embriones a los que se les inyectó hccs-MO/miR-181a/b-MO y cox7b-MO/miR-181a/b-MO en comparación con los embriones a los que se les inyectóhccs-MOy cox7b-MO, respectivamente. Las barras de escala son de 20 pm.

B)Células/ojo positivos para TUNEL. n > 5 retinas para cada modelo.

C)Los ensayos de caspasa muestran niveles restaurados de las actividades de la caspasa-3 y la caspasa-9 en los embriones a los que se les inyectó hccs-MO/miR-181a/b-MO y cox7b-MO/miR-181a/b-MO, en comparación con los embriones a los que se les inyectóhccs-MOy cox7b-MO, respectivamente. n > 5 embriones para cada modelo. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Análisis de la desviación para un modelo lineal generalizado binomial negativo (enB);

ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey (en C); las barras de error son SEM.

Figura 3. La regulación a la baja del miR-181a/b mejora el fenotipo de los modelos de pez medaka de MLS.

(A-I)Imágenes representativas de embriones de pez medaka st30 a los que se les inyectóhccs-MO(B)ycox7b-MO(H)solos o a los que se les inyectó miR-181a/b-MO(C, I). La coinyección de miR-181a/b-MO mejora la microftalmia y la microcefalia en embriones a los que se les inyectóhccs-MOycox7b-MO.

(D-F, J-L)Los embriones a los que se les inyectó hccs-MO/miR-181a/b-MO y cox7b-MO/miR-181a/b-MO se trataron con Baf-Al, PD98059 o HA14-1. El tratamiento con Baf-A1 contrarresta el efecto protector de la regulación a la baja del miR-181a/b tanto en los embriones hccs-MO/miR-181a/b-MO como en los embriones cox7b-mo/miR-181a/b-MO(D, J). El tratamiento con PD98059 no interfiere con la modulación del fenotipo de MLS mediada por la regulación a la baja del miR-181a/b(E, K). El tratamiento con HA14-1 contrarresta el efecto de la regulación a la baja del miR-181a/b en el modelo hccs-MO/miR-181a/b-MO, pero no en los embriones cox7b-MO/miR-181a/b-MO(F, L). Las barras de escala son de 100 pm.

(M-N)Porcentaje de embriones con o sin fenotipo de MLS en las diferentes condiciones ilustradas en (A-L) en embrioneshccs-MO(M) ycox7b-MO(N). Gris claro: embriones sin fenotipo de MLS; gris oscuro: embriones con fenotipo de MLS. n >300 embriones/condiciones, **p<0,01; ***p<0,001. Análisis de desviación para modelo lineal generalizado; las barras de error son SEM.

Figura 4 La inactivación del miR-181a/b-1 protege a las CGR de la muerte celular en un modelo de ratón de síndrome de LHON inducido por la rotenona

A) Análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-NeuN en la retina de ratonesmiR-181a/b-1+/+ymiR-181a/b-1-/-a los que se les inyectó por vía intravítrea rotenona o DMSO. Las CGR se conservan en ratonesmiR-181a/b-1'/-a los que se les inyectó rotenona en comparación con los controles, tanto una como dos semanas después de la inyección. Las barras de escala son de 50 pm.

B)Número de CGR/mm (indicado como %) una y dos semanas después de la inyección. N=10.

C)Representación gráfica de los resultados de los ensayos de seguimiento optocinético informados como cambio de pliegue de ciclos/grado. La agudeza visual se conserva en los ratonesmiR-181a/b-1-/-a los que se les inyectó rotenona con respecto a los controles, tanto una como dos semanas después de la inyección. N=10.

*** p<0,001 ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey (en B, C); las barras de error son SEM.

D)Reacción histoquímica de la NADH deshidrogenasa en secciones retinianas de ratonesmiR-181a/b-1+/+ymiR-181a/b-1-/-a los que se les inyectó por vía intravítrea rotenona o DMSO. Una semana después de la inyección, la actividad de la NADH deshidrogenasa se pierde en las CGR (CCG, áreas dentro de las líneas discontinuas) de los ojos demiR-181a/b-1+/+a los que se les inyectó rotenona, mientras que se conserva en los ojos demiR-181a/b-1-/-a los que se les inyectó rotenona. CCG, capa de células ganglionares; CNE, capa nuclear externa; CNI, capa nuclear interna. Las barras de escala son de 50 pm.

E)El análisis de inmunofluorescencia, con un anticuerpo anti-CoxIV, en la retina de ratonesmiR-181a/b-1+/+ymiR-181a/b-1-/-, a los que se les inyectó rotenona o DMSO, mostró mitocondrias preservadas en los ojos demiR-18la/b-1/- a los que se les inyectó rotenona. Las barras de escala son de 10 pm.

Figura 5. El agotamiento de miR-181a/b protege las CGR y mejora la función visual en ratones Ndufs4/-

A-D)Análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-NeuN en la retina de ratones silvestres,Ndufs4-/-, Ndufs4-/-/miR-181a/b-1'/-ymiR-181a/b-1-/-.Las CGR se conservan en ratonesNdufs4'/-/miR-181a/b-1'/-con respecto a los ratonesNdufs4-/-.Las barras de escala son de 50 pm.E)Número de CGR/mm (%). N=5.F)Representación gráfica de los resultados de los ensayos de seguimiento optocinético informados como cambio de pliegue de ciclos/grado. La agudeza visual se conserva en los ratonesNdufs4'/-/miR-181a/b-1'/-con respecto a los ratonesNdufs4-/-.N>8.G, H)El análisis electrorretinográfico revela una mejora de los patrones de ondas b en los ratonesNdufs4~/~/miR-181a/b-1~/~con respecto a los ratonesNdufs4-/-.N>5.

Los valores p se calcularon mediante ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey enE-F,y mediante medidas repetidas de ANOVA bidireccional con análisis post hoc enG.Los valores p enGse refieren a 20 log cd.s/m2 y puntos fotópicos. Los valores p de los demás puntos se indican en la tabla S1 del apéndice; las barras de error son SEM.

Figura 6. El agotamiento de miR-181a/b aumenta los niveles de transcritos de Nrf1 y Park2 y mejora la mitofagia en la retina de Ndufs4-/-.

A) La q-RT-PCR revela una regulación al alza de las dianasNrf1yPark2del miR-181a/b en los ojos de los animalesNdufs4-/-/miR-181a/b-1-1-frente a losNdufs4-/-. N = 4 animales/genotipo.B)El análisis de la muerte celular muestra que la regulación a la baja deNRF1suprime la protección mediada por miR-181a/b en las células SH-SY5Y tratadas con FCCP. N=4.C)El análisis por transferencia Western en las fracciones mitocondriales muestra un aumento de los niveles de p62 y Parkin cuantificados enD)en la fracción mitocondrial del ojo de ratonesNdufs4-/-/miR-181a/b-1-1-frente a los ratonesNdufs4-/-.Los datos se normalizan con respecto a Cs. N = 3 animales/genotipo. Los valores p se calcularon mediante ANOVA unidireccional con un análisis post hoc enBy una prueba t de Student con una sola cola enD. Las barras de error son SEM.

Figura 7. El agotamiento de miR-181a/b mejora la biogénesis de las mitocondrias en ratones Ndufs4-/-.

A-C)El análisis de microscopía electrónica muestra una mejora de la morfología de las mitocondrias y un aumento del número de mitocondrias en los ratonesNdufs4-/-/miR-181a/b-1-1-frente a los ratonesNdufs4-1-.Las barras de escala son de 1 pm. El aumento cuantitativo de las mitocondrias se informa en C como número de mitocondrias/CGR, al p30 y p55. N>2 animales/genotipo.D)Los ratonesNdufs4-/-/miR-181a/b-1-1-muestran un mayor contenido de ADNmt en comparación con los ratonesNdufs4-/-,medido mediante q-PCR. N>4 animales/genotipo.E)La actividad bioquímica de los complejos I, II y IV de la CRM se normalizó según el porcentaje de actividad de la citrato sintasa (CS) en ratonesNdufs4-/-/miR-181a/b-1-1-frente a los ratonesNdufs4-/-.N > 3 animales/genotipo. Los valores p se calcularon mediante la prueba t de Student de dos colas; las barras de error son SEM.

Figura 8. La inhibición del miR-181a/b protege a las neuronas DA contra la muerte celular inducida por la 6-OHDA en el pez medaka.

A)La hibridación in situ de ARN en el cerebro de peces medaka muestra una fuerte expresión del miR-181a y miR-l8 lb en las neuronas DA localizadas en el locus coeruleus (flechas). Las barras de escala son de 100 pm.

(B-D)Tinción inmunohistoquímica anti-TH en el cerebro de controles a st38 (tratados con DMSO) (B), de controles tratados con 6-OHDA (C) y de peces medaka a los que se les inyectó miR-181a/b-MO y tratados con 6-OHDA (D) para visualizar las neuronas DA. El tratamiento con 6-OHDA conduce a una reducción de las células positivas para TH (flechas) en los controles, pero no en los peces a los que se les inyectó miR-181a/b. Las barras de escala son de 100 pm.

(B'-D')Ampliaciones más altas de B-D. Las barras de escala son de 40 pm.

E)Número de células positivas para TH/locus coeruleus (indicado como %). N=6, **p <0,01 ANOVA unidireccional con análisis post hoc de T ukey ; las barras de error son SEM.

Figura 9 La inactivación del miR-181a/b-1 mejora el fenotipo de un modelo de ratón de EP inducida por 6-OHDA.

(A-C)Tinción inmunohistoquímica con anti-TH en cerebros de ratonesmiR-181a/b-1+/+ymiR-181a/b-1-/-a los que se les inyectó unilateralmente 6-OHDA en la sustancia negra (SN).

(A, B)La inyección de 6-OHDA conduce a una reducción de las células positivas para TH en la SN con respecto al lado de control donde se inyectó solución salina en ratonesmiR-181a/b-1+/+(A), mientras que en los animalesmiR-181a/b-1-/-,las neuronas DA (flechas) se salvan de la muerte inducida por la 6-OHDA.(B).

(C, D)Disminución de la tinción con anti-TH en las secciones estriatales de ratonesmiR-181a/b-1+/+en el lado donde se inyectó 6-OHDA con respecto al lado de control donde se inyectó solución salina(C), en contraste con ninguna diferencia entre el lado donde se inyectó 6-OHDA y el lado de control en los ratonesmiR-181a/b-1-/-(D). Las barras de escala son de 1 mm.

E)El número de células positivas para TH por sección en la SN se informó como cambio de pliegue, correspondiendo el hemisferio de control a 1 para cada genotipo de ratón. N=6.

F)La prueba de rotaciones inducidas por L-dopa mide los defectos conductuales y motores en ratonesmiR-181a/b-1+/+a los que se les inyectó 6-OHDA. Los ratonesmiR-181a/b-1-/-a los que se les inyectó 6-OHDA son menos sensibles a los efectos de rotación inducida por L-dopa. Se analizaron las rotaciones contralaterales netas (rotaciones contralaterales-ipsilaterales) para cada intervalo de tiempo (T1 = 0-600 s, T2 = 600-1200 s, T3 = 1200-1800 s, T4 = 1800-2400 s). N=8. *p<0,05, *** p<0,001 ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey en E, ANOVA bidireccional con efecto de genotipo para medidas repetidas en F; las barras de error son SEM.

Figura 10 El grupo 1 de miR-181a/b representa la mayor parte de la expresión del miR-181a y miR-181b en el cerebro y el ojo de los ratones.

A, B)Hibridación in situ del ARN con sondas miR-181a y miR-181 b en secciones de retina (A) y sustancia negra (SN) (B) de ratones miR-181a/b-1+/+ y miR-181a/b-1'A. Las barras de escala son de 50 |jm en (A) y 1 mm en (B).

C, D)Análisis de expresión de miR-181a y miR-181b en ojos y cerebro de miR-181a/b-1+/+ y miR-181a/b-1-/- mediante ensayos de Taqman. La eliminación dirigida del grupo 1 de miR-181a/b conduce a una sorprendente reducción de los niveles de expresión de las formas maduras del miR-181a y miR-181b en ambos tejidos. n=3 *** p<0,005 prueba t de Student de una cola; las barras de error son SEM.

E)La tinción de NISSL de secciones cerebrales de ratones miR-181a/b-1+/+ y miR-181a/b-1-/- no muestra diferencias morfológicas obvias en los ratones miR-181a/B-1-/- en comparación con los controles. Las barras de escala son de 1 mm. CNE, capa nuclear externa; CNI, capa nuclear interna; CCG, capa de células ganglionares.

Figura 11. La deleción del miR-181a/b-1 conduce a un aumento del flujo autofágico.

A)El análisis por qRT-PCR revela un aumento de los niveles de las dianas de miR-181a/b Bcl2, Mcl1, Xiap, Atg5, Erk2 y Park2 en los ojos de los animales miR-181a/b-1-/- frente a los miR-181a/b-1+/+. n>5 animales/genotipo.

B)El análisis por transferencia Western (panel izquierdo) de Lc3-I/Lc3-II y p62 en extractos de proteínas de los ojos de los animales en condiciones de alimentación o de hambre revela una disminución de los niveles (cuantificados en el panel derecho) de ambas proteínas en ratones miR-181a/B-1-/- (-/-) frente a miR-181a/B-1+/+ (+/+). n=2 ratones para cada genotipo y condición. Las barras de error son SEM.

C)El análisis por qRT-PCR no revela cambios en los niveles del transcrito de Sqstm1 (p62) y Map1lc3b (LC3) entre los ojos de los ratones miR-181a/b-1-/- y los de miR-181a/b-1+/+, tanto en condiciones de alimentación como de hambre. Estos datos indican que la disminución de los niveles de los marcadores de autofagia Lc3-II y p62 observada en el análisis por transferencia Western se debe al aumento del flujo autofágico en los ojos del miR-181a/b-1-/-. n=3 para cada genotipo y afección. **p<0,01 ***p<0,001 prueba t de Student de una cola.

Figura 12. El silenciamiento del miR-181a/b protege a las células SH-SY5Y de la muerte celular inducida por la FCCP.

El análisis de muerte celular muestra que el silenciamiento del miR-181a/b (100 nM) protege a las células SH-SY5Y del tratamiento con FCCP. n=3 experimentos independientes. **p<0,01, prueba t de Student de dos colas. Las barras de error son SEM.

Figura 13. La desactivación del miR-181a/b en peces medaka conduce a una regulación al alza de los genes implicados en la función mitocondrial y la mitofagia.

qRT-PCR realizada en ARN total extraído de embriones de peces medaka miR-181a/b-MO completos para analizar los niveles de transcrito de las diana de miR-181a/b involucradas en la muerte celular (bcl2, mcl1), mitofagia (atg5, erk2) dependientes de mitocondrias y biogénesis y función mitocondrial (cox11, coq10b, prdx3) y de la diana indirecta ppargc1a. n=3 **<0,05; ***<0,005 prueba t de Student de una cola; las barras de error son SEM.

Figura 14 Ausencia de fenotipos anormales tras el silenciamiento del miR-181a/b mediado por el MO y la administración del fármaco.

(A, B)Los embriones de peces medaka a los que se les inyectó únicamente miR-181a/b-MO (B) no muestran diferencias fenotípicas en comparación con los embriones de control (A).

(C-E)La bafilomicina A (Baf-A1) (C), PD98059 (D) y HA14-1 (E) no inducen ninguna alteración morfológica en los embriones de control a las concentraciones utilizadas en este estudio. Las barras de escala son de 100 jm .

(F)La concentración de bafilomicina A utilizada para el estudio bloquea la autofagia, como lo demuestra el análisis por transferencia Western de Ic3-I/II.

Figura 15. La deleción del miR-181a/b-1 no causa alteraciones significativas en la morfología y función de la retina en ratones.

(A-J)La tinción de inmunofluorescencia de diferentes marcadores retinianos ([A, B] rodopsina [Rod] para los bastones;

[C, D] arrestina de cono [C-Arr] para conos; [E, F] Pax6 para células CGR y amacrinas; [G, H] GS6 para células de Muller; [I, J] sintaxina [Sint] para estructuras sinápticas en la capa plexiforme interna) no revela anormalidades en la organización de la capa celular en la retina de los ratones miR-181a/B-1-/- con respecto a los ratones de control. Las barras de escala son de 50 |jm.

(K, L)El análisis electrorretinográfico no revela diferencias en los patrones de ondas a (K) y ondas b (L) entre los ratones miR-181a/b-1+/+ y miR-181a/b-1-/-, lo que indica que la ablación del miR-181a/b no causa disfunción retiniana. n=10 para cada genotipo.

(M)La representación gráfica del número de CGR/mm (indicado como %) no muestra diferencias significativas entre los ratones miR-181a/b-1+/+ y miR-181a/b-1-/-. n=10 para cada genotipo. CNE: capa nuclear externa; CPE: capa plexiforme externa; CNI: capa nuclear interna; CPI: capa plexiforme interna; CCG: capa de células ganglionares.

Figura 16. La inhibición del miR-181a/b reduce la acumulación de lipofuscina (A2E) en un modelo in vitro de DMAE.

A)Imágenes confocales de células ARPE-19 transfectadas con LNA de control y LNA-miR-181a/b y, a continuación, tratadas con A2E. Los análisis de autofluorescencia indican la cantidad de acumulación de A2E e indican que la inhibición del miR-181a/b reduce la acumulación de A2E en comparación con las células de control.B)Representación gráfica de la cuantificación de la intensidad de autofluorescencia de A2E, la intensidad de mancha de A2E y el área de mancha de A2E por célula en las células transfectadas con LNA-miR-181a/b en comparación con las células de control informada como cambio de pliegue. Valor p de la prueba t de Student ***<0,001, **<0,005

Figura 17. El agotamiento del miR-181a/b reduce la acumulación de lipofuscina (A2E) en el ratón Abca4

A)Análisis por qRT-PCR de dianas de miR-181a/b, transcritos desodlycatlen el EPR deAbca4~/~/miR-181a/b-1/-.B)Imágenes representativas de la acumulación de lipofuscina en el EPR y el SEF en las secciones de retina deAbca4-1-yAbca4-l-/miR-181a/b-1-1-.-C)Cuantificación de la autofluorescencia de la lipofuscina en el EPR y el SEF. Las barras de error son SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Figura 18. La reducción del miR-181a/b mejora la funcionalidad visual en un modelo de ratón de retinitis pigmentosa.

Las respuestas de ERG de los ratones P347S y P347S/m¡R-181a/b+/- al p30 destacan una mejora en los animales heterocigotos con miR-181a/b agotado. N=16, ** p<0,01; ***p<0,001. (Luminancia constante [cds/m2], fotópica = 2,4 log cds/m2)

Figura 19. La reducción del miR-181a/b mejora la expresión del marcador de fotorreceptor en un modelo de ratón de retinitis pigmentosa.

A)Imágenes de inmunofluorescencia de retinas de P347S y P347S/miR-181a/b+/- al p30 teñidas con dos marcadores retinianos diferentes (verde), rodopsina y arrestina de cono, y DAPI (azul).B)Análisis de espesor de la CNE al p30 entre P347S y P347S/miR-181a/b+/\C)El análisis por qRT-PCR revela un aumento de los niveles del principal marcador de Rp (rodopsina, S-opsina, m-opsina, Pde6b y arrestina de cono) en la retina de los ratones P347S/miR-181a/b+/_ con respecto a la retina de los ratones P347S al p30. N=3; las barras de error son SEM

Figura 20. La reducción del miR-181a/b mejora la longitud del segmento externo del fotorreceptor.Los fotorreceptores de P347S/miR-181a/b+/_ mostraron un aumento en la longitud del segmento externo (SE) con respecto a los animales P347S. * p<0,05, prueba t de Student. Las barras de error son SEM

Figura 21. La reducción del miR-181a/b mejora la funcionalidad visual en un modelo de ratón de retinitis pigmentosa en etapa tardía.

Las respuestas de ERG de los ratones P347s y P347S/miR-181a/b+A al p90 destacan una mejora en los animales heterocigotos con miR-181a/b agotado. N=24, ***p<0,001.

Figura 22. La reducción del miR-181a/b mejora la expresión y la supervivencia de los marcadores de fotorreceptores en un modelo de ratón de retintis pigmentosa.

A)Imágenes de inmunofluorescencia de retinas de P347S y P347S/miR-181a/b+/- al p90 teñidas con dos marcadores retinianos diferentes (verde), rodopsina y arrestina de cono, y DAPI (azul).B)Los análisis de espesor de la CNE al p90 entre P347S y P347S/miR-181a/b+' destacan un aumento significativo del grosor de la CNE.C)El análisis por qRT-PCR revela un aumento de los niveles del principal marcador de PR (rodopsina, S-opsina, M-opsina, Pde6b y arrestina de cono) en la retina del ratón P347S/miR-181a/b+/' en comparación con la retina del ratón P347S al p30. N=3; las barras de error son SEM

Figura 23. A)Términos regulados a la baja a partir del análisis transcriptómico de ojos de ratón P347S frente a ojos de ratón silvestre. B) Análisis por qRT-PCR de varias dianas de miR-181a/b (Hprt, Cox11, Erk2, Bcl2, Nrf1, Coq10b, Atg5, Xiap, Pgc1a, Park2, Prdx3) en el ojo de P347S/181a/b+A en comparación con el de P347S al p30; * p<0,05;** p<0,01, prueba t de Student de una cola. Las barras de error son SEM.

Figura 24. La reducción del miR-181a/b disminuye la caspasa 3 activada en la retina de P347S.

A)Imágenes de inmunofluorescencia en secciones retinianas congeladas de P347S y P347S/miR-181a/b+/- al p30, teñidas con un anticuerpo anti-caspasa 3 activa (verde) y DAPI (azul). El ensayo revela un menor número de células apoptóticas en las retinas de P347S/miR-181a/b+/- frente a las de P347S.B)El recuento de células positivas para el anticuerpo anti-caspasa-3 activa se realizó manualmente. N = 5; * p <0,05, prueba t de Student. Las barras de error son SEM

Figura 25. La reducción del miR-181a/b disminuye la tinción TUNEL en la retina de P347S.A) Tinción TUNEL-POD de P347S y P347S/miR-181a/b+/_ de retinas congeladas al p30. Las manchas marrones indican daño bicatenario o monocatenario del ADN. El ensayo revela un número reducido de células apoptóticas en los ratones P347S/miR-181a/b+/- con respecto a los ratones P347S/miR-181a/b+/+.B)El recuento de células positivas para TUNEL-POD se realizó manualmente. N = 3; * p <0,05, prueba t de Student. Las barras de error son s Em

Figura 26. La reducción del miR-181a/b mejora la morfología de las mitocondrias en los fotorreceptores de P347S. A)Imágenes de microscopía electrónica (ME) de la retina de animales de tipo salvaje, P347S y P347S/mir-181a/b+/_ al p30; n = 2 animales/genotipo. Las imágenes de microscopía electrónica de las mitocondrias de RP de ratones de tipo salvaje, P347S y P347s/miR-181a/b+/_ al p30 mostraron una mejora del fenotipo mitocondrial en animales con regulación a la baja del miR-181a/b.B)Cuantificación de la longitud del diámetro principal mitocondrial. N = 2; ** p=0,01, prueba t del estudiante. Las barras de error son SEM

Figura 27. La reducción del miR-181a/b mejora la expresión de los marcadores mitocondriales en los ojos de P347S. A)Niveles de proteína de la Mfn2 detectados mediante análisis por transferencia Western en extractos de proteína de ojos de animales silvestres, P347S y P347S/miR-181a/b+A al p30; cuantificación en D), los datos se normalizan con respecto a p115. n = 2 animales/genotipo. Las barras de error son SEM.B)Niveles de proteína de la subunidad CI NDUFB8, CII SDHB, CIII UQCRC2, CIV MTC01 y CV ATP5A detectados mediante análisis por transferencia Western en extractos de proteínas de ojos de animales silvestres, P347S y P347S/miR-181a/b+A al p30. Cuantificaciones de los niveles de proteína en D) Los datos están normalizados con respecto a p115. n = 2 animales/genotipo. Las barras de error son SEM.C)Los niveles de proteína de la citrato sintasa se detectaron mediante análisis por transferencia Western en extractos de proteína de ojos de animales silvestres, P347S y P347S/miR-181a/b+A al p30; las cuantificaciones de los niveles de proteína también se muestran en D). Los datos están normalizados con respecto a p115. n = 4 animales/genotipo.D)Representación gráfica de la cuantificación de proteínas en transferencia Western mostrada en A, B y C. Los datos están normalizados con respecto a p115. * p <0,05; ** p <0,01, *** p <0,001 prueba t de Student de dos colas. Las barras de error son SEM.

Figura 28. Validación experimental in vitro de la eficacia de la esponja de miR-181a/b.

A)Mapa de esponja AAV2.1-CMV-EGFP-miR-181.B)Análisis por qRT-PCR de los transcritos de diana directa de miR-181a/b (XIAP, NRF1, PRDX3, MCL1, ATG5, SIRT1, BCL2, BCL2, ERK2, PARK2, COX11) en SH-SY5Y tras 48 h de transfección con la esponja AAV2.1-CMV-EGFP-miR-181a/b (esponja 181). Los niveles de transcrito de las dianas de miR-181a/b aumentan en la muestra de esponja 181 con respecto a la muestra de control (CTRL = células transfectadas con AAV2.1-CMV-eGFP). N = 3. Estos datos indican que la esponja de miR-181 secuestra el miR-181a/b endógeno, impidiendo de este modo la unión de sus dianas directas e inhibiendo su actividad.

Breve descripción de las secuencias en la lista de secuencias

Comparación de secuencias de los miembros de la familia miR-181.

m¡R-181 a-5p AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

m¡R-181 b-5p AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU

miR-181 c-5p AACAUUCAAC-CUGUCGGUGAGU

miR-181 d-5p AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU

•k'k^-k'k'k'k'k ■ k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k<V r>(*=secuencia idéntica)

m¡R-181 a-5p AACAUUCAACgCUGUCGGUGAGU

m¡R-181 c-5p a ACAUUCAAC|CUGUCGGUGAGU (*=secuencia idéntica)

• k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k ' k

m¡R-181 b-5p AACAUUCAUUG|<ü>GUCGGUGGGÜ

m¡R-181 d-5p AACAUUCAUUGgJuGUCGGUGGGU (*=secuencia idéntica)•k'k'k'k'k'k'k'k'k-k'k -k'k'k'k'k'k'k-k-k'k'k

miR-181a (Id. de sec. n.° 1)

AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

miR-181b (Id. de sec. n.° 2)

AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU

miR-181c (Id. de sec. n.° 3)

AACAU U CAAC-C U G UCGGUGAG U

miR-181d (Id. de sec. n.° 4)

AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU

Secuencia semilla del miR-181 (Id. de sec. n.° 5)

ACAUUCA LAN A Id. de sec. n.° 6)

CGACAGCGTTGAATGT LNA B (Id. de sec. n.° 7)

CGACAGCAATGAATGT

Secuencia de esponja de miR-181: (Id. de sec. n.° 8) 3'TTGTAAGTGATAACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCGTAACAGCCACCCAfaqcTTGTAAGTGATAACAGCCACT CAtaqcTTGTAAGTCGTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGATAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCGTAACAGC CACCCAtctagaTTGTAAGTGATAACAGCCACTCAtagcTTGTAAGTCGTAACAGCCACCCAfgqcTTGTAAGTGATA ACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCGTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGATAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGT CGT AACAGCCACCCA-5'

Leyenda de la esponja de miR-181:

Esponja de MiR-181 “sec. A de MBS” en negrita;esponja de miR-181 “ sec. B de MBS” en letra subrayada; espaciador “ 1” :tagc en cursiva; espaciador “ 2” o espaciador central: Tctaga (enzima de restricción) Secuencia de esponja de miR-181: Id. de sec. n.° 9 3'TTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAfggcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACT CAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCTTAACAGCC ACCCAtctagaTTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAAtaqcTTGTAAGTGTAA ACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAfggcTTGTAAGT CTTAACAGCCACCCA-5'

Secuencia de esponja de miR-181: Id. de sec. n.° 10 3'TTGTAAGTCTAAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTAAACAGCCACT CAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTAAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCC ACCCAtctagaTTGTAAGTCTAAACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTAAA CAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtagcTTGTAAGTCTAAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCT TAACAGCCACCCA-5'

Secuencia de esponja de miR-181: Id. de sec. n.° 11

3'TTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAfaqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCA(qqcTTGTAAGTCTGGACAGCCACT CAtaqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCGAAACAGC CACCCAtctagaTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAtagcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTGG ACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAtaqTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTC GAAACAGCCACCCA-5'

Secuencia de esponja de miR-181: Id. de sec. n.° 12 3'TTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACT CAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCC ACCCAtctagaTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTGG ACAGCCACTCAfgqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAtaqTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTC GAAACAGCCACCCA-5'

Secuencia de esponja de miR-181: Id. de sec. n.° 13 3'TTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAfaqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAfqqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACT CAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTGTAAACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTCTTAACAGCC ACCCAtctagaTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAfaqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAtaqcTTGTAAGTCTGG ACAGCCACTCAfqqcTTGTAAGTCGAAACAGCCACCCAfqqTTGTAAGTCTGGACAGCCACTCAtaqcTTGTAAGTC GAAACAGCCACCCA-5'

Secuencia de esponja AAV2.1 CMV-EGFP-miR-181 (Id. de sec. n.° 14)

> [AAV2.1_CM V_eGFP_m ¡R-181sponge] - 5838 bp agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcggg cagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtgga attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggctgcgcgctcgctcgctcact gaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggc caactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgc ccttaagctagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggta aatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggacttt ccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattga cgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtc atcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacccc 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Definiciones

Los términos “ polinucleótido” , “ oligonucleótido” , “ ácido nucleico” y “ molécula de ácido nucleico” se utilizan en la presente memoria para incluir una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ADN de cadena triple, doble y simple, así como ARN de cadena triple, doble y simple. También incluye modificaciones, tales como mediante metilación y/o mediante adición de caperuza, y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, los términos “ polinucleótido” , “ oligonucleótido” , “ ácido nucleico” y “ molécula de ácido nucleico” incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un glucósido N o C de una base de purina o pirimidina y otros polímeros que contienen cadenas principales no nucleotídicas, por ejemplo, polímeros de poliamida (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos [ANP]) y polimorfolino (comercializado por Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, como Neugene) y otros polímeros de ácidos nucleicos sintéticos específicos de secuencia, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el emparejamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el ADN y el ARN. No se pretende hacer ninguna distinción en cuanto a longitud entre los términos “ polinucleótido” , “ oligonucleótido” , “ ácido nucleico” y “ molécula de ácido nucleico” , y estos términos se utilizarán indistintamente. Por lo tanto, estos términos incluyen, por ejemplo, fosforamidatos de 3'-desoxi-2',5'-ADN, oligodesoxirribonucleótidos N3' P5', ARN sustituido con 2'-O-alquilo,<a>D<n>bicatenario y monocatenario, así como ARN bicatenario y monocatenario, microARN, híbridos de ADN:ARN e híbridos entre ANP y ADN o ARN, y también incluyen tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas conocidas en la técnica, metilación, “ caperuzas” , sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metilo adenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluoruridina, C5-yodouridina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oooadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina), modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (p. ej., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con enlaces cargados negativamente (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) y con enlaces cargados positivamente (p. ej., aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres), aquellas que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluidas nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercalantes (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido. El término también incluye ácidos nucleicos bloqueados (p. ej., que comprenden un ribonucleótido que tiene un puente de metileno entre el átomo de oxígeno en 2' y el átomo de carbono en 4'). Ver, por ejemplo, (Elayadi y Corey, 2001; Koshkin y col., 1998; Kurreck y col., 2002; Obika y col., 1998; Orum y Wengel, 2001).

Los términos “ etiqueta” y “ etiqueta detectable” se refieren a una molécula que se puede detectar, que incluye, aunque no de forma limitativa, isótopos radiactivos, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (p. ej., biotina o haptenos) y similares. El término “ agente fluorescente” se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de mostrar fluorescencia en el rango detectable. Los ejemplos particulares de etiquetas que se pueden utilizar con la invención incluyen, aunque no de forma limitativa, ficoeritrina, tintes Alexa, fluoresceína, YPet, CyPet, azul Cascade, aloficocianina, Cy3, Cy5, Cy7, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo de Texas, luminol, ésteres de acradimum, biotina, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), proteína fluorescente verde mejorada (EGFP, por sus siglas en inglés), proteína fluorescente amarilla (YFP, por sus siglas en inglés), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, por sus siglas en inglés), proteína fluorescente azul (BFP, por sus siglas en inglés), proteína fluorescente roja (RFP, por sus siglas en inglés), Dronpa, mCherry, mOrange, mPlum, Venus, luciferasa de luciérnaga, luciferasa de Renilla, NADPH, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina, acetiltransferasa cloranfenica, ureasa, agentes de contraste para IRM (p. ej., gadodiamida, ácido gadobénico, ácido gadopentético, gadoteridol, gadofosveset, gadoversetamida y ácido gadoxético) y agentes de constraste para tomografía computarizada (TC) (p. ej., ácido diatrizoico, ácido metrizoico, lodamida, ácido lotalámico, ácido loxitalámico, ácido loglícico, ácido acetrizoico, ácido locármico, metiodal, diodona, metrizamida, lohexol, ácido loxáglico, lopamidol, lopromida, lotrolano, loversol, lopentol, lodixanol, lomeprol, lobitridol, loxilano, ácido lodoxámico, ácido lotróxico, ácido loglicámico, adipiodona, ácido lobenzámico, ácido lopanoico, ácido locetámico, yopodato de sodio, ácido tiropanoico y yopodato de calcio).

El término “ recombinante” , como se utiliza en la presente memoria para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico,<a>R<n>, miARN, ADNc, viral, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con la totalidad o una parte del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza.

El término “ recombinante” , como se utiliza con respecto a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y, a continuación, se expresa en organismos transformados, como se describe más adelante.

microARN

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ microARN” , “ miARN” , “ microARN maduro” y “ miARN maduro” se refieren a una molécula de ARN monocatenario no codificante que tiene una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos (incluidos aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24 y aproximadamente 25 nucleótidos) que reduce eficazmente el nivel de expresión de los polinucleótidos y polipéptidos diana a través de la vía de interferencia del ARN (p. ej., mediante la asociación con el RISC y la posterior degradación del ARNm diana o la inhibición de la traducción). El término “ microARN” se refiere tanto a miARN endógenos que se encuentran en cualquier organismo (p. ej., plantas, animales) como a miARN artificiales que incluyen moléculas de ARN monocatenario con secuencias de aproximadamente 19-25 nucleótidos de longitud distintas de las que se encuentran en los miARN endógenos y que reducen eficazmente la expresión de los polinucleótidos diana a través de la interferencia del ARN.

Los microARN se agrupan en familias basándose en sus propiedades de direccionamiento, que dependen principalmente de la identidad de su región semilla extendida (nucleótidos 2-8 del miARN); los miembros de la misma familia semilla usualmente están relacionados evolutivamente, y los miARN relacionados evolutivamente usualmente son miembros de la misma familia semilla. Sin embargo, el uso del término “ familia” no denota estrictamente una ascendencia común, como se describe en Bartel, 2018.

Los miARN de la presente invención pertenecen a la familia miARN 181 de miARN.

Como se define en la presente memoria, los miARN 181 son un grupo de miARN que comparten la misma secuencia semilla, a saber, ACAUUCA (Id. de sec. n.° 5). Preferiblemente, dicho grupo de miARN se define en la presente memoria como una familia de miARN.

Los miembros de la familia miR-181 son producidos por tres transcritos primarios independientes localizados en tres cromosomas separados. Cada transcrito produce dos secuencias precursoras, lo que da un total de seis secuencias precursoras. Cada secuencia precursora produce dos cadenas de miARN: la cadena guía o 5p y la cadena pasajera o 3p, lo que da un total de diez formas de miARN maduras: miR-181a-5p, miR-181a-1-3p, miR-181a-2-3p, miR-181b-5p, miR-181b-1-3p, miR-181b-2-3p, miR-181c-5p, miR-181c-3p, miR-181d-5p y miR-181d-3p. Las secuencias maduras de 5p son las que muestran los niveles de expresión más abundantes en los tejidos de mamíferos (Karali y col., 2016) y contienen la misma secuencia “ semilla” en el extremo 5', lo que sugiere un grado significativo de redundancia funcional (Henao-Mejia y col., 2013; Ji y col., 2009). Como se utiliza en la presente memoria, los seis miARN de 5p maduros se definirán como: miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c y miR-181d. Las formas maduras del miR-181a-1 y miR-181a-2, así como del miR-181b-1 y miR-181b-2 son idénticas en secuencia; la forma madura del miR-181c tiene una diferencia de nucleótidos en comparación con el miR-181a, mientras que la forma madura del miR-181d tiene una diferencia de nucleótidos en comparación con el miR-181b.

Un “ sitio diana” es la secuencia de ácido nucleico reconocida por un microARN. Un único sitio diana típicamente tiene de aproximadamente seis a aproximadamente diez nucleótidos. Típicamente, el sitio diana está ubicado dentro de la UTR 3' de un ARNm, pero el sitio diana también puede estar ubicado en la UTR 5' o en la región codificante de un ARNm.

Un “ sitio diana del inhibidor” es una secuencia dentro de la secuencia madura de un miARN 181 complementaria a dicho ácido nucleico inhibidor. La secuencia del miARN 181 puede ser una secuencia precursora o una secuencia madura. Preferiblemente, la secuencia del miARN 181 es una secuencia madura.

Ácidos nucleicos inhibidores

Los ácidos nucleicos inhibidores comprenden ARN inhibidor y ADN inhibidor, p. ej., pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. El término “ ácido nucleico inhibidor” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia que es complementaria a un ácido nucleico diana (p. ej., un microARN diana, p. ej., cualquiera de los microARN definidos por la Id. de sec. n.° 1, 2, 3 o 4) y se une a él, mediando en una disminución en el nivel o la actividad del ácido nucleico diana (p. ej., la actividad en la unión a la diana del ARNm) a través del impedimento estérico o mediante degradación de la diana. Los ejemplos no limitativos de ácidos nucleicos inhibidores incluyen ARN interferente, ARNhc, ARNip, ribozimas, antagomir, LNA, esponja de miR y oligonucleótidos antisentido. En la presente memoria se describen métodos para fabricar ARN inhibidores. En la técnica se conocen métodos adicionales para fabricar ácidos nucleicos inhibidores.

Como se utiliza en la presente memoria, “ un ARN interferente” se refiere a cualquier secuencia de ARN bicatenario o monocatenario, capaz, directa o indirectamente (es decir, tras la conversión), de inhibir o regular a la baja la expresión génica mediando en la interferencia del ARN. El ARN interferente incluye, aunque no de forma limitativa, ARN interferente pequeño (“ARNip” ) y ARN de horquilla corta (“ARNhc” ). Por “ interferencia de ARN” se entiende la degradación selectiva de un transcrito de ARN mensajero compatible con la secuencia.

Como se utiliza en la presente memoria, “ un ARNhc” (ARN en forma de horquilla corta) se refiere a una molécula de ARN que comprende una región antisentido, una porción de bucle y una región sentido, en donde la región sentido tiene nucleótidos complementarios que se emparejan con la región antisentido para formar un tallo dúplex.

Tras el procesamiento postranscripcional, el ARN de horquilla corta se convierte en un ARN interferente pequeño mediante un evento de escisión mediado por la enzima Dicer, que es un miembro de la familia de ARNasa III.

Un “ARN interferente pequeño” o “ARNip” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula de ARN pequeña capaz de inhibir o regular a la baja la expresión génica mediando en la interferencia del ARN de una manera específica de secuencia. El ARN pequeño puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 18 a 21 nucleótidos.

Como se utiliza en la presente memoria, un “ antagomir” se refiere a un ARN sintético pequeño que tiene complementariedad con una diana de microARN específica, opcionalmente con un emparejamiento incorrecto en el sitio de escisión o con una o más modificaciones de bases para inhibir la escisión.

Como se utiliza en la presente memoria, la frase “ procesamiento postranscripcional” se refiere al procesamiento del ARNm que se produce después de la transcripción y está mediado, por ejemplo, por las enzimas Dicer y/o Drosha. Los agentes inhibidores útiles en los métodos de tratamiento descritos en la presente memoria incluyen moléculas de ácido nucleico inhibidoras que disminuyen la expresión o la actividad de cualquiera de los microARN (p. ej., microARN maduro o microARN precursor) de la Id. de sec. n.° 1, 2, 3 o 4 o una combinación de las mismas.

Los ácidos nucleicos inhibidores útiles en los presentes métodos y composiciones incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS, por sus siglas en inglés), compuestos de ARNip, compuestos de ARN de interferencia (ARNi) monocatenario o bicatenario, tales como compuestos de ARNip, bases modificadas/ácidos nucleicos bloqueados (LNA), antagomir, ácidos nucleicos peptídicos (ANP) y otros compuestos oligoméricos, o imitadores de oligonucleótidos que hibridan con al menos una porción del ácido nucleico diana y modulan su función. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores incluyen ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleótidos antisentido quiméricos, oligonucleótidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN interferente corto (ARNip); un ARN microinterferente (miARN); un ARN temporal pequeño (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); Ar N activadores pequeños (ARNap) o combinaciones de los mismos. Ver, p. ej., el documento WO 2010/040112.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores tienen una longitud de 10 a 50, 13 a 50 o 13 a 30 nucleótidos. Un experto en la técnica apreciará que se trata de oligonucleótidos que tienen porciones antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo dentro de los mismos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen una longitud de 15 nucleótidos. En algunas realizaciones, los compuestos oligonucleotídicos o antisentido de la invención tienen una longitud de 12 o 13 a 30 nucleótidos. Un experto en la técnica apreciará que se trata de ácidos nucleicos inhibidores que tienen porciones antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo dentro de los mismos.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores son oligonucleótidos quiméricos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos un nucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región de nucleótidos modificados que confiere una o más propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, una mayor resistencia a las nucleasas, una mayor absorción en las células, una mayor afinidad de unión a la diana) y una región que es un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. Los ácidos nucleicos inhibidores quiméricos de la invención se pueden formar como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o imitadores de oligonucleótidos, como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos también se denominan en la técnica híbridos o gapmeros. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas comprenden, aunque no de forma limitativa, las patentes US-5.013.830, 5.149.797, 5.220.007, 5.256.775, 5.366.878, 5.403.711, 5.491.133, 5.565.350, 5.623.065, 5.652.355, 5.652.356 y 5.700.922.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor comprende al menos un nucleótido modificado en la posición 2' del azúcar, con máxima preferencia un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluoro. En otras realizaciones preferidas, las modificaciones del ARN incluyen modificaciones de 2'-fluoro, 2'-amino y 2' O-metilo en la ribosa de las pirimidinas, residuos básicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en los oligonucleótidos y se ha demostrado que estos oligonucleótidos tienen una Tf más alta (es decir, una mayor afinidad de unión a la diana) que los 2'-desoxioligonucleótidos contra una diana determinada.

Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleótidos y nucleósidos hacen que el oligonucleótido en el que se incorporan sea más resistente a la digestión por las nucleasas que el oligodesoxinucleótido nativo; los oligonucleótidos modificados sobreviven intactos durante más tiempo que los oligonucleótidos no modificados. Los ejemplos específicos de oligonucleótidos modificados incluyen aquellos que comprenden cadenas principales modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Los más preferidos son los oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y aquellos con cadenas principales de heteroátomos, particularmente cadenas principales CH2-NH-0-CH2, CH,~N(CH3)~0~CH2 (conocida como cadena principal de metileno(metilimino) o MMI) CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 y O-N(CH3)- CH2-CH2, en donde la cadena principal de fosfodiéster nativa se representa como O-P-O-CH; cadenas principales de amida (ver De Mesmaeker y col., 1995); estructuras de cadena principal morfolino (ver la patente US-5.034.506); cadena principal de ácido nucleico peptídico (ANP) (en donde la cadena principal de fosfodiéster del oligonucleótido se reemplaza con una cadena principal de poliamida, uniéndose los nucleótidos directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la cadena principal de poliamida, ver Nielsen y col., 1991). Los enlaces que contienen fósforo incluyen, aunque no de forma limitativa, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilfosfonatos que comprenden 3'alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosfonatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos de estos enlaces 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos se unen 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'; ver las patentes US-3.687.808, 4.469.863, 4.476.301, 5.023.243, 5.177.196, 5.188.897, 5.264.423, 5.276.019, 5.278.302, 5.286.717, 5.3 21.131, 5.399.676, 5.405.939, 5.453.496, 5.455.233, 5.466.677, 5.476.925, 5.519.126, 5.536.821,5.541.306, 5.550.

111,5.563.253, 5.571.799, 5.587.361 y 5.625,050. Los compuestos oligoméricos a base de morfolino se describen en Braasch y Corey, 2002; Heasman, 2002; Lacerra y col., 2000; Nasevicius y Ekker, 2000 y en la patente US-5.034.506. Los imitadores de oligonucleótidos de ácidos nucleicos de ciclohexenilo se describen en Wang y col., 2000a.

Las cadenas principales de oligonucleótidos modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen cadenas principales que están formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estas comprenden aquellas que tienen enlaces de morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2; ver las patentes US-5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264, 562; 5, 264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596, 086; 5.602.240; 5.602.240; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623, 070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

También se pueden incluir uno o más restos de azúcar sustituidos, p. ej., uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 u O(CH2)n CH3, donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C1 a C10, alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleotínico; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye el 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil)] (Martin, 1995). Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-propoxi (2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleótido, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos también pueden tener imitadores de azúcar, tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

Los ácidos nucleicos inhibidores también pueden incluir, adicional o alternativamente, modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la técnica simplemente “ bases” ). Como se utiliza en la presente memoria, las nucleobases “ no modificadas” o “ naturales” incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases que se encuentran raras veces o transitoriamente en los ácidos nucleicos naturales, p. ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (también denominada 5-metil-2' desoxi-citosina y frecuentemente denominada en la técnica 5-Me-C), 5hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, así como nucleobases sintéticas, p. ej., 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Ver Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, págs. 75-77; y (Gebeyehu y col., 1987). También se puede incluir una base “ universal” conocida en la técnica, p. ej., inosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-Me-C aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico entre 0,6 y 1,2 °C (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y actualmente son las sustituciones de bases preferidas.

No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido dado se modifiquen uniformemente y, de hecho, más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas se puede incorporar en un único oligonucleótido o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido.

En algunas realizaciones, tanto un enlace de azúcar como un enlace internucleósido (es decir, la cadena principal) de las unidades de nucleótidos se reemplazan con grupos nuevos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Uno de estos compuestos oligoméricos, un imitador de oligonucleótido que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (ANP). En los compuestos de ANP, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una cadena principal que contiene amida, por ejemplo, una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de compuestos de ANP comprenden, aunque no de forma limitativa, las patentes US-5.539.082, 5.714.331 y 5.719.262. Se pueden encontrar más enseñanzas sobre los compuestos de ANP en Nielsen y col., 1991.

Los ácidos nucleicos inhibidores también pueden incluir una o más modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la técnica simplemente “ bases” ). Como se utiliza en la presente memoria, las nucleobases “ no modificadas” o “ naturales” comprenden las bases de purina: adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina: timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas comprenden otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquinina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Además, las nucleobases comprenden las descritas en la patente US-3.687.808, las descritas en “ The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering” , páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., Ed. John Wiley & Sons, 1990, las descritas por Englisch y col., Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, página 613, y las descritas por Sanghvi, Y. S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., Eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y actualmente son sustituciones de bases preferidas, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietil. Las nucleobases modificadas se describen en la patente US-3.687.808, así como en las patentes 4.845.205, 5.130.302, 5.134.066, 5.175, 273, 5.367.066, 5.432.272, 5.457.187, 5.459.255, 5.484.908, 5.502.177, 5.525.711, 5.552.540, 5.587.469, 5.596.091, 5.614.617, 5.750.692 y 5.681.941.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores se unen químicamente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligonucleótido. Dichos restos comprenden, aunque no de forma limitativa, restos de lípido tales como un resto de colesterol (Letsinger y col., 1989), ácido cólico (Manoharan y col., 1994), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col., 1992; Manoharan y col., 1993), un tiocolesterol (Oberhauser y Wagner, 1992), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Kabanov y col., 1990; Svinarchuk y col., 1993), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan y col., 1995; Shea y col., 1990), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Mancharan y col., Nucleosides & Nucleotides 14:969-973, 1995), o ácido adamantanoacético (Manoharan y col., 1995), un resto de palmitilo (Mishra y col., 1995) o un resto de octadecilamina o hexilaminocarbonil-t oxicolesterol (Crooke y col., 1996). Ver también las patentes US-4.828.979, 4.948.882, 5.218.105, 5.525.465, 5.541.313, 5.545.730, 5.552.538, 5.578.717, 5.580.731, 5.580.731, 5.591.584, 5.109.124, 5.118.802, 5.138.045, 5.414.077, 5.486.603, 5.512.439, 5.578.718, 5.608.046, 4.587.044, 4.605.735, 4.667.025, 4.762.779, 4.789.737, 4.824.941, 4.835.263, 4.876.335, 4.904.582, 4.958.013, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.245.022, 5.254.469, 5.258.506, 5.262.536, 5.272.250, 5.292.873, 5.317.098, 5.371.241, 5.391.723, 5.416.203, 5.451.463, 5.510.475, 5.512.667, 5.514.785, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.595.726, 5.597.696, 5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941.

Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y tintes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción, mejoran la resistencia a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción, la distribución, el metabolismo o la excreción de los compuestos de la presente invención. Los grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y la patente US-6.287.860. Los restos conjugados incluyen, aunque no de forma limitativa, restos de lípido tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexilo-hexil Adecilrac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una cadena de poliamina o polietilenglicol, o ácido adamantanoacético, un resto de palmitilo o un resto de octadecilamina o hexilaminocarbonil-oxicolesterol. Ver, p. ej., las patentes US-4.828.979, 4.948.882, 5.218.105, 5.525.465, 5.541.313, 5.545.730, 5.552.538, 5.578.717, 5.580.731, 5.580.731, 5.591.584, 5.109.124, 5.118.802, 5.138.045, 5.414.077, 5.486.603, 5.512.439, 5.578.718, 5.608.046, 4.587.044, 4.605.735, 4.667.025, 4.762.779, 4.789.737, 4.824.941, 4.835.263, 4.876.335, 4.904.582, 4.958.013, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.245.022, 5.254.469, 5.258.506, 5.262.536, 5.272.250, 5.292.873, 5.317.098, 5.371.241,5.391.723, 5.416.203, 5.451.463, 5.510.475, 5.512.667, 5.514.785, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.595.726, 5.597.696, 5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941.

Los ácidos nucleicos inhibidores útiles en los presentes métodos son suficientemente complementarios al miARN diana, es decir, se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad para proporcionar el efecto deseado. El término “ complementario” se refiere a la capacidad de emparejamiento, mediante enlaces de hidrógeno, entre dos secuencias que comprenden bases de origen natural o no natural o análogos de las mismas. Por ejemplo, si una base en una posición de un ácido nucleico inhibidor es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una base en la posición correspondiente de un miARN, entonces se considera que las bases son complementarias entre sí en esa posición. En algunas realizaciones, no se requiere una complementariedad del 100 %. En algunas realizaciones, se requiere un 100 % de complementariedad. Se pueden utilizar métodos de rutina para diseñar un ácido nucleico inhibidor que se una a la secuencia diana con suficiente especificidad.

Aunque en la presente memoria se exponen secuencias específicas de ciertos segmentos diana ilustrativos, un experto en la técnica reconocerá que su propósito es ilustrar y describir realizaciones particulares dentro del alcance de la presente invención. Un experto en la técnica podrá identificar fácilmente segmentos diana adicionales basándose en esta descripción. Los segmentos diana de 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleótidos consecutivos dentro de la secuencia semilla, o inmediatamente adyacente a la misma, también se consideran adecuados para el direccionamiento. En algunas realizaciones, los segmentos diana pueden incluir secuencias que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 5' de una de las secuencias semilla (los nucleótidos restantes son un tramo consecutivo del mismo ARN que comienza inmediatamente corriente arriba del extremo 5' de la secuencia semilla y continúa hasta que el ácido nucleico inhibidor contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nucleótidos). En algunas realizaciones, los segmentos diana están representados por secuencias de ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 3' de una de las secuencias semilla (los nucleótidos restantes son un tramo consecutivo del mismo miARN que comienza inmediatamente corriente abajo del extremo 3' del segmento diana y continúa hasta que el ácido nucleico inhibidor contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nucleótidos). Un experto en la técnica que posea las secuencias proporcionadas en la presente memoria podrá, sin excesiva experimentación, identificar otras regiones diana preferidas. En algunas realizaciones, un ácido nucleico inhibidor contiene una secuencia que es complementaria a al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos contiguos presentes en la diana (p. ej., el miARN diana, p. ej., el miR-181 maduro o precursor, o el ARNm diana).

Una vez que se han identificado una o más regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos de ácido nucleico inhibidores que sean suficientemente complementarios a la diana, es decir, que se hibriden suficientemente bien y con suficiente especificidad (es decir, no se unan sustancialmente a otros ARN no diana), para proporcionar el efecto deseado. En el contexto de esta invención, hibridación se refiere a un enlace de hidrógeno, que puede ser un enlace de hidrógeno de Watson-Crick, un enlace de hidrógeno de Hoogsteen o un enlace de hidrógeno de Hoogsteen invertido, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se emparejan mediante la formación de enlaces de hidrógeno. El término complementario, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición determinada de un oligonucleótido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de miARN o una molécula de ARNm, entonces el ácido nucleico inhibidor y el miARN o ARNm se consideran complementarios entre sí en esa posición. Los ácidos nucleicos inhibidores y el miARN o el ARNm son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí. Por lo tanto, “ específicamente hibridable” y “ complementario” son términos que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso de tal modo que se produzca una unión estable y específica entre el ácido nucleico inhibidor y la diana de miARN. Por ejemplo, si una base en una posición de un ácido nucleico inhibidor es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una base en la posición correspondiente de un miARN o un ARNm, entonces se considera que las bases son complementarias entre sí en esa posición. No se requiere un 100 % de complementariedad.

Se sabe en la técnica que una secuencia de ácido nucleico complementaria no tiene que ser 100 % complementaria a la de su ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridable. Para los fines de los presentes métodos, una secuencia de ácido nucleico complementaria es específicamente hibridable cuando la unión de la secuencia a la molécula de miARN o ARNm diana interfiere con la función normal del miARN o ARNm diana para provocar una pérdida de expresión o actividad, y cuando hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica de la secuencia a secuencias de ARN no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, p. ej., en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que los ensayos se realizan en condiciones adecuadas de rigurosidad en el caso de ensayos in vitro. Por ejemplo, la concentración rigurosa de sal será normalmente inferior a aproximadamente 750 mM de NaCl y 75 mM de citrato trisódico, preferiblemente inferior a aproximadamente 500 mM de NaCl y 50 mM de citrato trisódico, y más preferiblemente inferior a aproximadamente 250 mM de NaCl y 25 mM de citrato trisódico. La hibridación de baja rigurosidad se puede obtener en ausencia de disolvente orgánico, p. ej., formamida, mientras que la hibridación de alta rigurosidad se puede obtener en presencia de al menos aproximadamente el 35 % de formamida, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 50 % de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30 °C, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37 °C, y con máxima preferencia de al menos aproximadamente 42 °C. Los expertos en la técnica conocen bien parámetros adicionales variables, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, p. ej., dodecilsulfato de sodio (SDS), y la inclusión o exclusión del ADN portador. Se logran varios niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones según sea necesario. En una realización preferida, la hibridación se producirá a 30 °C en 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato trisódico y 1 % de SDS. En una realización más preferida, la hibridación se producirá a 37 °C en NaCl 500 mM, citrato trisódico 50 mM, SDS al 1 %, formamida al 35 % y 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón (ssDNA, por sus siglas en inglés) desnaturalizado. En una realización de máxima preferencia, la hibridación se producirá a 42 °C en NaCl 250 mM, citrato trisódico 25 mM, SDS al 1 %, formamida al 50 % y 200 |jg/ml de ssDNA. Las variaciones útiles de estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

Para la mayoría de las aplicaciones, los pasos de lavado que siguen a la hibridación también variarán en cuanto a rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad del lavado se pueden definir por la concentración de sal y por la temperatura. Como anteriormente, la rigurosidad del lavado se puede aumentar disminuyendo la concentración de sal o aumentando la temperatura. Por ejemplo, la concentración rigurosa de sal para los pasos de lavado será preferiblemente inferior a aproximadamente 30 mM de NaCl y 3 mM de citrato trisódico, y con máxima preferencia inferior a aproximadamente 15 mM de NaCl y 1,5 mM de citrato trisódico. Las condiciones rigurosas de temperatura para los pasos de lavado normalmente incluirán una temperatura de al menos aproximadamente 25 °C, más preferiblemente de al menos aproximadamente 42 °C, y aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 68 °C. En una realización preferida, los pasos de lavado se realizarán a 25 °C en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 0,1 %. En una realización más preferida, los pasos de lavado se realizarán a 42 °C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1 %. En una realización más preferida, los pasos de lavado se realizarán a 68 °C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1 %. Las variaciones adicionales de estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Benton, 1977; Grunstein, 1975 y en Ausubel y col. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

En general, los ácidos nucleicos inhibidores útiles en los métodos descritos en la presente memoria tienen al menos un 80 % de complementariedad de secuencia con una región diana dentro del ácido nucleico diana, p. ej., una complementariedad de secuencia del 90 %, 95 % o 100 % con la región diana dentro de un miARN. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del oligonucleótido antisentido son complementarias y, por lo tanto, se hibridarían específicamente con una región diana representaría una complementariedad del 90 por ciento. El porcentaje de complementariedad de un ácido nucleico inhibidor con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando herramientas básicas de búsqueda de alineación local (programas BLAST) (Altschul, 1990; Zhang, 1997). Los compuestos antisentido y otros compuestos de la invención que se hibridan con un miARN o un ARNm se identifican a través de experimentación de rutina. Generalmente, los ácidos nucleicos inhibidores deben conservar la especificidad para su diana, es decir, no deben unirse directamente a los transcritos distintos de la diana prevista ni afectar directamente de manera significativa a los niveles de expresión de los mismos, en donde dicha diana prevista puede ser uno o más de un miARN que pertenezca a la misma familia o a familias diferentes.

Para más información sobre los ácidos nucleicos inhibidores, ver los documentos US2010/0317718 (oligos antisentido); US2010/0249052 (ácido ribonucleico bicatenario [ARNbc]); US2009/0181914 y US2010/0234451 (LNA); US2007/0191294 (análogos de ARNip); US2008/0249039 (ARNip modificado); y WO2010/129746 y WO2010/040112 (ácidos nucleicos inhibidores).

Antisentido

Los oligonucleótidos antisentido se diseñan típicamente para bloquear la expresión de una diana de ADN o ARN uniéndose a la diana y deteniendo la expresión a nivel de transcripción, traducción o corte y empalme. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son secuencias de ácido nucleico complementarias diseñadas para hibridarse en condiciones rigurosas con el microARN diana o el ARNm del marcador inflamatorio diana. Por lo tanto, se eligen oligonucleótidos que sean suficientemente complementarios a la diana, es decir, que se hibriden suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.

Bases modificadas/ácidos nucleicos bloqueados (LNA)

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores utilizados en los métodos descritos en la presente memoria comprenden uno o más enlaces o bases modificados. Las bases modificadas incluyen fosforotioato, metilfosfonato, ácidos nucleicos peptídicos o moléculas de ácido nucleico bloqueado (LNA).

Los LNA son ribonucleótidos modificados que contienen un puente adicional entre los carbonos en 2' y 4' del resto de azúcar ribosa, lo que da como resultado una conformación “ bloqueada” que confiere una mayor estabilidad térmica. Por lo tanto, los LNA comprenden una clase de análogos de ARN bicíclicos en los que el anillo de furanosa de la cadena principal de azúcar y fosfato se bloquea químicamente en un ARN que imita la conformación tipo N (C3'-endo) mediante la introducción de un puente de metileno 2'-O, 4'-C. Dichas modificaciones aumentan la resistencia a las nucleasas y la afinidad de unión del oligonucleótido antisentido a sus miARN cognados.

Preferiblemente, los nucleótidos modificados son moléculas de ácido nucleico bloqueado, que incluyen [alfa]-L-LNA. Los LNA comprenden análogos del ácido ribonucleico en donde el anillo de ribosa está “ bloqueado” por un puente de metileno entre el 2'-oxígeno y el 4'-carbono, es decir, oligonucleótidos que contienen al menos un monómero de LNA, es decir, un nucleótido de 2'-O,4'-C-metileno-D-ribofuranosilo. Las bases del LNA forman pares de bases estándar de Watson-Crick, pero la configuración bloqueada aumenta la velocidad y la estabilidad de la reacción de emparejamiento de bases (Jepsen y col., 2004). Los LNA también tienen una afinidad de emparejamiento de bases mayor con el ARN que con el a Dn . Estas propiedades hacen que los LNA sean especialmente útiles como sondas para la hibridación in situ con sonda fluorescente (FISH, por sus siglas en inglés) y la hibridación genómica comparativa, como herramientas de desactivación de los miARN y como oligonucleótidos antisentido para apuntar a los ARNm u otros ARN, p. ej., los miARN y los ARNm como se describe en la presente memoria.

Las moléculas de LNA pueden incluir moléculas que comprenden 10-30 nucleótidos, p. ej., 12-24, p. ej., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos en cada cadena, en donde una de las cadenas es sustancialmente idéntica a una región diana en el miARN o el ARNm, p. ej., es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica, p. ej., al tener 3, 2, 1 o 0 nucleótido(s) desemparejado(s). Las moléculas de LNA se pueden sintetizar químicamente utilizando métodos conocidos en la técnica.

Las moléculas de LNA se pueden diseñar utilizando cualquier método conocido en la técnica; se conocen varios algoritmos y están disponibles comercialmente (p. ej., en Internet, por ejemplo, en exiqon.com). Ver, p. ej., (Levin y col., 2006; McTigue y col., 2004; You y col., 2006). Por ejemplo, se pueden utilizar métodos de “ recorrido genético” , similares a los utilizados para diseñar oligos antisentido, para optimizar la actividad inhibitoria del LNA; por ejemplo, se puede preparar una serie de oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos que abarquen la longitud de un miARN o ARNm diana y, a continuación, analizarla para determinar su actividad.

Opcionalmente, se pueden dejar huecos, p. ej., de 5 a 10 nucleótidos o más, entre los LNA para reducir el número de oligonucleótidos sintetizados y analizados. El contenido de GC está preferiblemente entre aproximadamente el 30 60 %. Las directrices generales para el diseño de LNA son conocidas en la técnica; por ejemplo, las secuencias de LNA se unen fuertemente a otras secuencias de LNA, por lo que es preferible evitar una complementariedad significativa dentro de un LNA. Siempre que sea posible, se deben evitar series contiguas de tres o más G o C, o más de cuatro residuos de LNA (por ejemplo, puede que no sea posible con oligonucleótidos muy cortos [p. ej., de aproximadamente 9 a 10 nt]). En algunas realizaciones, los LNA son xilo-LNA.

En algunas realizaciones, las moléculas de LNA se pueden diseñar para que se dirijan a una región específica del miARN. Por ejemplo, pueden dirigirse a una región funcional específica, p. ej., una región que comprende una secuencia semilla. Alternativamente o además, se pueden dirigir a regiones altamente conservadas, p. ej., regiones identificadas alineando secuencias de especies dispares tales como primates (p. ej., humanos) y roedores (p. ej., ratones) y buscando regiones con altos grados de identidad. El porcentaje de identidad se puede determinar de forma rutinaria utilizando herramientas básicas de búsqueda de alineación local (programas BLAST) (Altschul y col., 1990; Zhang & Madden, 1997) (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Zhang y Madden, Genome Res. 7:649-656, 1997), p. ej., utilizando los parámetros predeterminados.

Para obtener información adicional sobre los LNA, ver las patentes US-6.268.490, 6.734.291, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 7.053.207, 7.060.809, 7.084.125 y 7.572.582; y publicaciones de preconcesión US-2010/0267018, 2010/0261175 y 2010/0035968; Koshkin y col., Tetrahedron 54:3607-3630, 1998; Obika y col., Tetrahedron Lett.

39:5401-5404, 1998; Jepsen y col., Oligonucleotides 14:130-146, 2004; Kauppinen y col., Drug Disc. Today 2(3):287-290, 2005; y Ponting y col., Cell 136(4): 629-641, 2009, “ Locked nucleic acids” (LNA), J Am Chem Soc. 29 de mayo de 2002; 124(21):5974-82. “ Locked nucleic acid (LNA) recognition of RNA: NMR solution structures of LNA:RNA hybrids” . Petersen M1, Bondensgaard K, Wengel J, Jacobsen JP; Handb Exp Pharmacol. 2006;(173):405-22. “ Locked nucleic acid: high-affinity targeting of complementary RNA for RNomics” Kauppinen S1, Vester B, Wengel J.; RNA Biol. julio-agosto de 2009; 6(3):321-3. Publicación electrónica del 18 de julio de 2009.

“ Locked nucleic acid as a novel class of therapeutic agents” . Veedu RN1, Wengel J.Chem Biodivers. marzo de 2010; 7(3):536-42. doi: 10.1002/cbdv.200900343. “ Locked nucleic acids: promising nucleic acid analogs for therapeutic applications” . Veedu RN1, Wengel J. Curr Opin Mol Ther. junio de 2001; 3(3):239-43.; “ Locked nucleic acids: a promising molecular family for gene-function analysis and antisense drug development” . Orum H1, Wengel J. y las referencias citadas allí.

Ver también USSN 61/412.862.

Alternativamente, los oligonucleótidos antisentido pueden comprender ácidos nucleicos peptídicos (ANP), que contienen una cadena principal basada en péptidos en lugar de una cadena principal de azúcar y fosfato, p. ej., una cadena principal de fosfato de desoxirribosa se reemplaza con una cadena de poliamida de unidades de N-(2.aminoetil)-glicina (Fabani, M.M.; Abreu-Goodger, C.; Williams, D.; Lyons, P.A.; Torres, A.G.; Smith, K.G.; Enright, A.J.; Gait, M.J.; Vigorito, E. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res.

2010,38, 4466-4475). Los oligonucleótidos antisentido pueden contener una o más modificaciones químicas, que incluyen, aunque no de forma limitativa, modificaciones de azúcar, tales como modificaciones de 2'-O-alquilo (p. ej., 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo), 2'-fluoro y 4' tío, y modificaciones de la cadena principal, tales como uno o más enlaces de fosforotioato, morfolino o fosfonocarboxilato (ver, por ejemplo, las patentes US-6.693.187 y 7.067.641). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido adecuados son los “ gapmeros” con 2'-O-metoxietilo que contienen ribonucleótidos modificados con 2'-O-metoxietilo en los extremos 5' y 3' con al menos diez desoxirribonucleótidos en el centro. Estos “ gapmeros” son capaces de desencadenar mecanismos de degradación de las dianas de ARN dependientes de la RNasa H. Se conocen en la técnica otras modificaciones de los oligonucleótidos antisentido para mejorar la estabilidad y mejorar la eficacia, tales como las descritas en la patente US-6.838.283, y son adecuadas para utilizar en los métodos de la invención. Otros oligonucleótidos antisentido de la invención incluyen pequeñas cremalleras de ARN.

Los oligonucleótidos antisentido, útiles para inhibir la actividad de los microARN, tienen una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de miARN madura y/o precursora, p. ej., al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementaria a una secuencia de miARN madura y/o precursora. En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido puede ser sustancialmente complementario a una secuencia de miARN madura y/o precursora, es decir, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementaria a una secuencia de polinucleótido diana. En una realización, el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia que es 100 % complementaria a una secuencia de miARN madura y/o precursora.

Los nucleótidos antisentido de la presente invención pueden dirigirse a una secuencia de miR-181, que incluye, aunque no de forma limitativa, miR-181a (Id. de sec. n.° 1), miR-181b (Id. de sec. n.° 2), miR-181c (Id. de sec. n.° 3), 0 miR-181d (Id. de sec. n.° 4) o una combinación de las mismos.

Los nucleótidos antisentido preferidos de la invención son ácidos nucleicos bloqueados que comprenden una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miR-181a de la Id. de sec. n.° 1 o 3, p. ej., al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementaria a dicha secuencia del miARN y se dirigen al miARN 181a y/o mir-181c.

Otros nucleótidos antisentido preferidos de la invención son los ácidos nucleicos bloqueados que comprenden una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miR-181a de la Id. de sec. n.° 2 o 4, p. ej., al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementaria a dicha secuencia del miARN y se dirige al miARN 181b y/o mir-181 d.

Los ácidos nucleicos bloqueados particularmente preferidos comprenden las Id. de sec. n.° 1, 2, 3 o 4 y se modifican en uno o más nucleótidos.

Una realización preferida de la invención comprende una combinación de LNA que se dirigen al mir-181a/c y miR-181 b/d, una realización particularmente preferida comprende una combinación de LNA A (Id. de sec. n.° 6) y LNA B (Id. de sec. n.° 7) como se describe en la presente memoria.

Antagomir

En algunas realizaciones, el antisentido es un antagomir (Krutzfeldt, J.; Rajewsky, N.; Braich, R.; Rajeev, K.G.; Tuschl, T.; Manoharan, M.; Stoffel, M. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 2005, 438, 685-689.). Los antagomir son oligonucleótidos antisentido modificados químicamente que se dirigen a un microARN (p. ej., se dirigen al hsa-miR-181). Por ejemplo, un antagomir para utilizar en los métodos descritos en la presente memoria puede incluir una secuencia de nucleótidos lo suficientemente complementaria como para hibridarse con una secuencia diana de miARN de aproximadamente 12 a 25 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 15 a 23 nucleótidos. De manera adecuada, los antagomir pueden ser ribonucleótidos monocatenarios modificados químicamente que son al menos parcialmente complementarios a la secuencia de miARN. Los antagomirs pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como modificaciones de 2-O-metil-azúcar.

Generalmente, los antagomirs incluyen un resto de colesterol, p. ej., en el extremo 3'. En algunas realizaciones, los antagomir tienen varias modificaciones para la protección contra la RNasa y propiedades farmacológicas, tales como una mayor absorción en tejidos y células. Por ejemplo, además de las modificaciones descritas anteriormente para los oligos antisentido, un antagomir puede tener una o más de 2'-O-metilación completa o parcial del azúcar y/o una cadena principal de fosforotioato. Las modificaciones de fosforotioato proporcionan protección contra la actividad de la RNasa y su lipofilicidad contribuye a mejorar la absorción en tejidos. En algunas realizaciones, el antagomir puede incluir seis modificaciones de la cadena principal de fosforotioato; dos de los fosforotioatos se encuentran en el extremo 5' y cuatro en el extremo 3'. Ver, p. ej., Krutzfeldt y col., Nature 438:685-689, 2005; Czech, N. Engl. J. Med. 354: 1194 1195, 2006; Robertson y col., Silence 1: 10, 2010; Marquez y McCaffrey, Human Gene Ther. 19(I):27-38, 2008; van Rooij y col., Circ. Res. 103(9):919-928, 2008; y Liu y col., Int. J. Mol. Sci. 9:978-999, 2008.

Los antagomir útiles en los presentes métodos también se pueden modificar en longitud o de otro modo con respecto al número de nucleótidos que forman el antagomir. Generalmente, los antagomir tienen una longitud de aproximadamente 20 a 21 nucleótidos para una función óptima, ya que este tamaño coincide con el tamaño de la mayoría de los microARN maduros. Los antagomir deben conservar la especificidad para su diana, es decir, no deben unirse directamente a transcritos distintos de la diana prevista ni afectar directamente de manera significativa a los niveles de expresión de los mismos.

Los antagomir pueden ser al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementarios a una secuencia de miARN madura y/o precursora. En algunas realizaciones, el antagomir puede ser sustancialmente complementario a una secuencia de miARN madura, es decir, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementario a una secuencia de polinucleótido diana. En otras realizaciones, los antagomirs son 100 % complementarios a la secuencia de miARN madura.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor está bloqueado e incluye un resto de colesterol (p. ej., un antagomir bloqueado).

ARNip

En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que es complementaria a un miARN diana o a un ARNm diana puede ser un ARN interferente, que incluye, aunque no de forma limitativa, un ARN interferente pequeño (“ARNip” ) o un ARN de horquilla corta (“ARNhc” ). Los métodos para construir ARN interferentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ARN interferente se puede ensamblar a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la otra cadena; tal como cuando la cadena antisentido y la cadena sentido forman una estructura dúplex o bicatenaria); la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma (es decir, un gen no deseado) y la cadena sentido comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. Alternativamente, el ARN interferente se ensambla a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones sentido y antisentido autocomplementarias se unen por medio de un conector o conectores basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico. El ARN interferente puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrica, de horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana separada o una porción de la misma y la región sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. El ARN interferente puede ser un polinucleótido circular monocatenario que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma, y la región sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular se puede procesar in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar en la interferencia del ARN.

En algunos casos, la región codificante del ARN interferente codifica una molécula de ARN autocomplementaria que tiene una región sentido, una región antisentido y una región de bucle. Una molécula de ARN de este tipo, cuando se expresa, forma deseablemente una estructura de “ horquilla” y se denomina en la presente memoria “ARNhc” . La región de bucle tiene generalmente una longitud de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de bucle tiene una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región sentido y la región antisentido tienen una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 nucleótidos. Tras el procesamiento postranscripcional, el ARN de horquilla corta se convierte en un ARNip mediante un evento de escisión mediado por la enzima Dicer, que es un miembro de la familia de RNasas III. El ARNip es después capaz de inhibir la expresión de un gen con el que comparte homología. Para obtener más información, ver Brummelkamp y col., Science 296:550-553, 2002; Lee y col., Nature Biotechnol, 20, 500-505, 2002; Miyagishi y Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; Paddison y col., Genes & Dev. 16:948-958, 2002; Paul, Nature Biotechnol. 20, 505-508, 2002; Sui, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99(6):5515-5520, 2002; Yu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:6047-6052, 2002.

Esponjas de miARN

Las esponjas o señuelos de miARN (Ebert y col., Nat Methods. septiembre de 2007; 4(9):721-6. Publicación electrónica del 12 de agosto de 2007. Generation of miARN sponge constructs. Kluiver, J., Slezak-Prochazka, I., Smigielska-Czepiel, K., Halsema, N., Kroesen, B. J. y Anke van den Berg. Methods, 23 de julio de 2012. Publicación electrónica antes de la impresión; F.C. Tay, y col., Using artificial microRNA sponges to achieve microRNA loss-of-function in cancer cells, Adv. Drug Deliv. Rev. [2014]) son transcritos expresados in vivo que contienen múltiples sitios de unión antisentido al miARN (MBS, por sus siglas en inglés) de alta afinidad que imitan a los que se encuentran en los ARNm y son complementarios a un miARN diana; estos transcritos pueden secuestrar de manera eficiente miARN específicos y, por lo tanto, evitar su unión a genes diana endógenos. Estos sitios de unión usualmente son repeticiones en tándem de sitios idénticos diseñados para dirigirse a miARN específicos individuales o a miembros de la familia de miARN que comparten la misma región semilla; considerando que la interacción entre el microARN y la diana depende del emparejamiento de bases en la región semilla (posiciones 2 a 8 del microARN), una diana de señuelo debe interactuar con todos los miembros de una familia semilla de microARN. Al hacerlo, debería inhibir las clases funcionales de los microARN mejor de lo que lo hacen los oligonucleótidos antisentido, que se cree que bloquean las secuencias de microARN individuales.

El diseño de esponjas o señuelos de miARN se ha descrito, por ejemplo, en “ Ebert MS, Neilson JR, Sharp PA (2007) MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nat Methods 4: 721-72” y “ Kluiver J, Slezak-Prochazka I, Smigielska-Czepiel K, Halsema N, Kroesen BJ, van den Berg A (2012) Generation of miARN sponge constructs. Methods 58: 113-117”

Las secuencias de esponja típicamente consisten en múltiples sitios de unión a miARN (MBS) separados por secuencias espaciadoras de 4 a 6 nucleótidos de longitud. Los MBS son perfectamente antisentido o contienen una protuberancia en la posición central. Sin embargo, la interacción miARN y esponja con bases perfectamente emparejadas es vulnerable a la escisión mediada por Ago2, por lo que se informa que los MBS que contienen una protuberancia central de 4 nucleótidos son más eficaces. Las esponjas de miARN ofrecen la ventaja de inhibir a todos los miembros de la familia semilla y, además, cuando se introducen múltiples MBS, pueden utilizarse para inhibir grupos de miARN completos. Dadas las ventajas sobre otros medios de inhibición del miARN, las esponjas de miARN tienen el potencial de utilizarse en el tratamiento de enfermedades (Ebert MS y col., Nat Methods 2007, Ebert MS y Sharp PA, RNA 2010, Liu Z y col., Int J Mol Sci 2008, KluiverJ y col., Methods 2012, Kluiver y col., PLoS One 2012). El diseño del constructo de esponja de miARN y las pruebas fuera del objetivo se pueden realizar utilizando una herramienta basada en la web MiRNAsong: generador y probador de esponja de microARN.

De manera adecuada, una esponja comprende un sitio de unión antisentido al miARN (MBS) de alta afinidad que incluye una secuencia complementaria al miARN diana y una región de “ protuberancia” , es decir, una región no coincidente en los nucleótidos 9 a 12 de la secuencia de m Bs . Adecuadamente, la región complementaria es al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica al miARN diana. Con máxima preferencia, la región complementaria es al menos un 80 % idéntica al miARN diana. De manera adecuada, la secuencia complementaria a la secuencia de miARN diana incluye la secuencia semilla, p. ej., la secuencia dentro de un miARN dado que es esencial para el reconocimiento del transcrito diana, y la región “ protuberancia” está fuera de dicha secuencia semilla. Cada secuencia de MBS (sec. de MBS) tiene la misma longitud que el miARN diana maduro. Cada sec. de MBS se repite varias veces, entre 6 y 24 veces, preferiblemente entre 6 y 12 veces, con máxima preferencia 6 veces. De manera adecuada, las secuencias de MBS están separadas entre sí por una secuencia “ espaciadora” que consiste en 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente 4 nucleótidos.

De manera adecuada, la esponja de miARN de la invención puede comprender dos o más secuencias de MBS dirigidas a dos o más miARN, preferiblemente dos o más miARN dentro de la misma familia, alternativamente dos o más miARN de diferentes familias.

De manera adecuada, una esponja de miARN que comprende una secuencia de MBS complementaria a una secuencia semilla dada inhibe todos los miARN que portan dicha secuencia semilla. De manera adecuada, una familia de miARN comprende miARN con secuencias altamente relacionadas; de manera adecuada, los miARN de la misma familia comparten la misma secuencia semillas.

Los inhibidores de la invención comprenden dos secuencias de MBS separadas por secuencias espaciadoras; de manera adecuada, las dos secuencias de MBS pueden dirigirse a los mismos o a diferentes miARN.

Por ejemplo, el inhibidor de miARN puede tener la siguiente fórmula:

(X1 sX2sX3)mS(X1 sX2sX3)n2

En donde

X1, X2 y X3 se eligen independientemente de

- una secuencia de MBS complementaria al miR-181a y/o miR-181c, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia o

- una secuencia de MBS complementaria al miR-181b y/o miR-181d, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

X3 puede estar presente o ausente;

s es una secuencia espaciadora de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente de 4 nucleótidos;

S2 es una secuencia espaciadora central de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente 6 nucleótidos, que corresponde preferiblemente a un sitio de la enzima de restricción, preferiblemente un sitio para la enzima de restricción Xbal rn y n2 son un número seleccionado independientemente de 3, 6 y 24, preferiblemente entre 3, 6 y 12, con máxima preferencia n es 3, m y n2 pueden ser idénticos o diferentes.

Los inhibidores de miARN preferidos de la invención comprenden dos secuencias de MBS separadas por secuencias espaciadoras con la siguiente fórmula:

(AsB)mS2(AsB)n2

en donde:

A es una secuencia de MBS complementaria al miR-181a y/o miR-181c, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

B es una secuencia de MBS complementaria al miR-181b y/o miR-181d, preferiblemente modificada del nucleótido 9 al nucleótido 12 para crear una protuberancia;

s es una secuencia espaciadora de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente de 4 nucleótidos;

S2 es una secuencia espaciadora central de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente 6 nucleótidos, que corresponde preferiblemente a un sitio de la enzima de restricción, preferiblemente un sitio para la enzima de restricción Xbal m y n2 son un número seleccionado independientemente de 3, 6 y 24, preferiblemente entre 3, 6 y 12, con máxima preferencia n es 3, m y n2 pueden ser idénticos o diferentes.

Preferiblemente X1, X2, X3, A es 3' TTGTAAGTVHDHACAGCCACTCA 5'

en donde, según la nomenclatura de la IUPAC:

V= A o C o G

H= A o C o T

D= A o G o T

Más preferiblemente, X1, X2, X3, B es 3' TTGTAAGT BBDH ACAGCCACCCA 5'.

en donde, según la nomenclatura de la IUPAC

B= C o G o T

D= A o G o T

H= A o C o T

Aún preferiblemente rn = 3 y n2 = 3.

Preferiblemente, S consiste en 4 nucleótidos, preferiblemente S= tagc.

Aún preferiblemente, S2 consiste en 6 nucleótidos, preferiblemente S2 = Tctaga.

De manera adecuada, en algunas realizaciones, los inhibidores del miR-181 son oligonucleótidos antisentido modificados químicamente, adecuadamente LNA, inhibidores del ARN, p.ej., antagomir o esponjas de miARN que comprenden una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia madura del miR-181a y/o miR-181b o una combinación de las mismas.

Como se utiliza en la presente memoria, “ sustancialmente complementaria” se refiere a una secuencia que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementaria a una secuencia de polinucleótido diana (p. ej., una secuencia de miARN madura o precursora).

Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de miARN precursora (pre-miARN). El oligonucleótido antisentido comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia ubicada fuera de la región tronco-bucle de la secuencia pre-miARN. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son adecuadamente complementarios a la secuencia de miARN madura.

La reacción de escisión del ARN diana guiada por los ARNip es altamente específica de secuencia. Generalmente, para la inhibición se prefieren los ARNip que contienen secuencias de nucleótidos idénticas a una porción del ácido nucleico diana (es decir, una región diana que comprende la secuencia semilla de un miARN o ARNm diana). Sin embargo, no se requiere una identidad de secuencia del 100 % entre el ARNip y el gen diana para poner en práctica la presente invención. Por lo tanto, la invención tiene la ventaja de poder tolerar variaciones de secuencia que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. Por ejemplo, también se ha descubierto que las secuencias de ARNip con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales únicas con respecto a la secuencia diana son eficaces para la inhibición. Alternativamente, las secuencias de ARNip con sustituciones o inserciones de análogos de nucleótidos pueden ser eficaces para la inhibición. Generalmente, los ARNip deben conservar la especificidad para su diana, es decir, no deben unirse directamente a transcritos distintos de la diana prevista ni afectar directamente de manera significativa a los niveles de expresión de los mismos.

Por “ dosis o cantidad terapéuticamente eficaz” de un miARN, un imitador del miARN o un inhibidor del miARN se entiende una cantidad que, cuando se administra como se describe en la presente memoria, produce una respuesta terapéutica positiva, tal como el aumento de los niveles del ARNm de las dianas específicas del miR-181, la mejora de la función mitocondrial y/o el aumento del número de mitocondrias, la reducción del estrés oxidativo y la muerte celular con una mejora de la supervivencia celular.

Ribozimas

También se pueden utilizar moléculas de ácido nucleico enzimáticas transescindibles, que han demostrado ser prometedoras como agentes terapéuticos para enfermedades humanas (Usman y McSwiggen, Ann. Rep. Med. Chem.

30:285-294, 1995; Christoffersen y Marr, J. Med. Chem. 38:2023-2037, 1995). Las moléculas de ácido nucleico enzimáticas se pueden diseñar para escindir dianas de miARN o ARNm específicas dentro del fondo del ARN celular. Tal evento de escisión hace que el miARN o el ARNm no sean funcionales.

Generalmente, los ácidos nucleicos enzimáticos con actividad de escisión del ARN actúan uniéndose primero a un ARN diana. Dicha unión se produce a través de la porción de unión a la diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene muy cerca de una porción enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. Por lo tanto, el ácido nucleico enzimático primero reconoce y, a continuación, se une a un ARN diana a través del emparejamiento de bases complementarias y, una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana. La escisión estratégica de dicho ARN diana destruirá su actividad. Una vez que un ácido nucleico enzimático se ha unido y escindido a su ARN diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse y escindir repetidamente nuevas dianas.

Varios enfoques, tales como las estrategias de selección (evolución) in vitro (Orgel, Proc. R. Soc. London, B 205:435, 1979), se han utilizado para desarrollar nuevos catalizadores de ácidos nucleicos capaces de catalizar una variedad de reacciones, tales como la escisión y la ligación de enlaces fosfodiéster y enlaces de amida (Joyce, Gene, 82, 83 87, 1989; Beaudry y col., Science 257, 635-641, 1992; Joyce, Scientific American 267, 90-97, 1992; Breaker y col., TIBTECH 12:268, 1994; Barrel y col., Science 261: 1411-1418, 1993; Szostak, TIBS 17, 89-93, 1993; Kumar y col., FASEB J., 9: 1183, 1995; Breaker, Curr. Op. Biotech., 1:442, 1996). El desarrollo de ribozimas que sean óptimas para la actividad catalítica contribuiría significativamente a cualquier estrategia que emplee ribozimas que escindan el ARN con el fin de regular la expresión génica. La ribozima cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalítica (kcat) de aproximadamente 1 min_1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) del cofactor Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima artificial de “ARN ligasa” cataliza la correspondiente reacción de automodificación con una velocidad de aproximadamente 100 min'1. Además, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de unión al sustrato hechos de ADN catalizan la escisión del ARN con múltiples velocidades de rotación que se acercan a los 100 min’1.

Fabricación y utilización de ácidos nucleicos inhibidores

Las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas para poner en práctica los métodos descritos en la presente memoria, ya sean ARN, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, se pueden aislar de una variedad de fuentes, diseñarse, amplificarse y/o expresarse genéticamente o generarse de forma recombinante.

Las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes se pueden aislar o clonar individualmente y analizar para determinar la actividad deseada. Se puede utilizar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo, p. ej., sistemas de expresión in vitro, de células bacterianas, fúngicas, de mamíferos, de levaduras, de insectos o de plantas. Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención (p. ej., cualquiera de los ácidos nucleicos inhibidores o ácidos nucleicos sentido descritos en la presente memoria) se pueden insertar en vectores de administración y expresarse a partir de unidades de transcripción dentro de los vectores. Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores virales. La generación del constructo de vector se puede lograr utilizando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada bien conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación, las técnicas estándar de PCR, síntesis de oligonucleótidos, digestión con endonucleasas de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación de ADN, por ejemplo, como se describe en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)), Coffin y col. (Retroviruses. (1997)) y “ RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, ed., Oxford University Press, (2000)).

Como será evidente para un experto en la técnica, están disponibles una variedad de vectores adecuados para transferir los ácidos nucleicos de la invención a las células. La selección de un vector apropiado para administrar ácidos nucleicos y la optimización de las condiciones para la inserción del vector de expresión seleccionado en la célula están dentro del alcance de un experto en la técnica sin necesidad de una experimentación excesiva. Los vectores virales comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene secuencias para la producción de virus recombinantes en una célula empaquetadora. Los vectores virales que expresan los ácidos nucleicos de la invención se pueden construir basándose en cadenas principales virales que incluyen, aunque no de forma limitativa, un retrovirus, lentivirus, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociado, virus de la viruela o alfavirus. Los vectores recombinantes (p. ej., vectores virales) capaces de expresar los ácidos nucleicos de la invención se pueden administrar como se describe en la presente memoria, y pueden persistir en las células diana (p. ej., transformantes estables). Por ejemplo, dichos vectores recombinantes (p.ej., un vector recombinante que da como resultado la expresión de un oligómero antisentido que es complementario al hsa-miR-155) se pueden administrar (p. ej., mediante inyección o infusión) en el líquido cefalorraquídeo del sujeto (p. ej., mediante inyección intracraneal, inyección intraparenquimatosa, inyección intraventricular e inyección intratecal, ver, p. ej., Bergen y col., Pharmaceutical Res.

25:983-998, 2007). Una serie de vectores virales recombinantes ilustrativos que pueden utilizarse para expresar cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria también se describen en Bergen y col. (supra). Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de vectores virales recombinantes.

Los ácidos nucleicos proporcionados en la presente memoria (p. ej., los ácidos nucleicos inhibidores) se pueden complejar además con uno o más polímeros catiónicos (p. ej., poli-L-lisina y poli(etilenimina)), lípidos catiónicos (p. ej., propofol de 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio (DOTAP), N-metil-4-(dioleil)metilpiridinio y 3P-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol) y/o nanopartículas (p. ej., nanopartículas catiónicas de cianoacrilato de polibutilo, nanopartículas de sílice o nanopartículas a base de polietilenglicol) antes de la administración al sujeto (p. ej., inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo del sujeto). En la técnica se conocen ejemplos adicionales de polímeros catiónicos, lípidos catiónicos y nanopartículas para la administración terapéutica de ácidos nucleicos. También se ha demostrado que la administración terapéutica de ácidos nucleicos se logra después de la inyección intratecal de complejos de polietilenimina/ADN (Wang y col., Mol. Ther. 12:314-320, 2005). Los métodos para la administración de ácidos nucleicos descritos en la presente memoria no son limitativos. En la técnica se conocen métodos adicionales para la administración terapéutica de ácidos nucleicos a un sujeto.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores (p. ej., uno o más ácidos nucleicos inhibidores dirigidos a hsa-miR-155) se pueden administrar de forma sistémica (p. ej., por vía intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal) o intratecalmente (p. ej., administración epidural). En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor se administra en forma de una composición (p. ej., complejada con uno o más lípidos catiónicos). Los ejemplos no limitativos de lípidos catiónicos que pueden utilizarse para administrar uno o más ácidos nucleicos inhibidores (p. ej., cualquiera de los ácidos nucleicos inhibidores descritos en la presente memoria) incluyen: la lipofectamina, las moléculas lipídicas catiónicas descritas en el documento WO 97/045069 y las publicaciones de solicitud de patente US-2012/0021044, 2012/0015865, 2011/0305769, 2011/0262527, 2011/0229581, 2010/0305198, 2010/0203112 y 2010/0104629. Las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas para poner en práctica esta invención se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describe, p. ej., en Adams, J. Am. Chem. Soc. 105:661, 1983; Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444, 1997; Frenkel, Free Radic. Biol. Med.

19:373-380, 1995; Blommers, Biochemistry 33:7886-7896, 1994; Narang, Meth. Enzymol. 68:90, 1994; Brown, Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; Beaucage, Tetra. Lett. 22: 1859, 1981; y la patente US-4.458.066.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se pueden estabilizar contra la degradación nucleolítica, tal como mediante la incorporación de una modificación, p. ej., una modificación de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos de la invención incluyen un fosforotioato en al menos el primer, segundo o tercer enlace internucleotídico en el extremo 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos. Como otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede incluir un nucleótido modificado en 2', por ejemplo, un 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-D<m>A<e>OE) o 2'-O-N-metilacetamida (2'-O-N<m>A). Como otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede incluir al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo y, en algunas realizaciones, todos los nucleótidos incluyen una modificación con 2'-O-metilo. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos están “ bloqueados” , es decir, comprenden análogos de ácidos nucleicos en los que el anillo de ribosa está “ bloqueado” mediante un puente de metileno que conecta el átomo 2'-O y el átomo 4'-C (ver, por ejemplo, Kaupinnen y col., Drug Disc. Today 2(3):287-290, 2005; Koshkin y col., J. Am. Chem. Soc, 120(50): 13252-13253, 1998). Para modificaciones adicionales, ver los documentos US-2010/0004320, US-2009/0298916 y US-2009/0143326.

Las técnicas para la manipulación de los ácidos nucleicos utilizadas para poner en práctica esta invención, tales como, p. ej., la subclonación, el etiquetado de sondas (p. ej., el etiquetado con cebadores aleatorios utilizando polimerasa de Klenow, la traducción de mellas, la amplificación), la secuenciación, la hibridación y similares están bien descritas en la literatura científica y de patentes, ver, p. ej., Sambrook y col., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3.a ed. (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Eds. (John Wiley y Sons, Inc., Nueva York 2010); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, Ed. Elsevier, Nueva York (1993).

Métodos de tratamiento

También se proporcionan métodos para tratar un trastorno mitocondrial que incluyen administrar a un sujeto al menos un (p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis) agente (p. ej., un ácido nucleico) que disminuye el nivel o la actividad de uno o más (p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis) de los microARN de la Id. de sec. n.° 1, 2, 3 o 4 (p. ej., un ácido nucleico inhibidor, p. ej., un antagomir).

En algunas realizaciones, al sujeto se le administra al menos un ácido nucleico inhibidor que comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia contigua presente en el miR-181 (p. ej., una secuencia contigua presente en el hsa-miR-181 maduro o precursor). En realizaciones no limitativas, el ácido nucleico inhibidor puede ser un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un ARNip o un antagomir. En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico inhibidor se inyecta en el líquido cefalorraquídeo de un sujeto. En algunas realizaciones, la inyección es una inyección intracraneal o una inyección intratecal. En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico inhibidor se compleja con uno o más polímeros catiónicos y/o lípidos catiónicos (p. ej., cualquiera de los polímeros catiónicos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica). Los antagomir para disminuir la expresión y/o la actividad de un miARN diana específico (p. ej., el miR-181) se pueden diseñar utilizando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Krutzfeld y col., Nature 438:685-689, 2005). En la presente memoria se describen métodos ilustrativos adicionales para diseñar y fabricar antagomirs y otros tipos de ácidos nucleicos inhibidores.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor que reduce los niveles del miR-181 es la secuencia de LNA del antogmir-181. Los métodos para diseñar antagomir para apuntar a moléculas de microARN se describen en Obad y col., Nature Genetics 43:371-378, 2011. Los ácidos nucleicos inhibidores adicionales para disminuir los niveles o la expresión del miR-181 se describen en Worm y col., Nucleic Acids Res. 37:5784-5792, 2009, y Murugaiyan y col., J. Immunol. 187:2213-2221,2011.

A un sujeto se le puede administrar al menos una (p. ej., al menos 2, 3, 4 o 5) dosis del agente (p. ej., uno o más ácidos nucleicos inhibidores). El agente (p. ej., uno o más ácidos nucleicos inhibidores) se puede administrar al sujeto al menos una vez al día (p. ej., dos veces al día, tres veces al día y cuatro veces al día), al menos una vez a la semana (p. ej., dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana) y/o al menos una vez al mes. Un sujeto se puede tratar (p. ej., se puede administrar al sujeto periódicamente el agente) durante un período de tiempo prolongado (p. ej., al menos un mes, dos meses, seis meses, un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años). Como se describe en detalle en la presente memoria, la dosificación del agente que se ha de administrar al sujeto puede determinarla un médico teniendo en cuenta una serie de factores fisiológicos que incluyen, aunque no de forma limitativa, el sexo del sujeto, el peso del sujeto, la edad del sujeto y la presencia de otras afecciones médicas. El agente se puede administrar al sujeto por vía oral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intracraneal, mediante inyección en el líquido cefalorraquídeo o mediante inyección en los ojos (inyección intravítrea o subretiniana). Del mismo modo, el agente se puede formular como un portador sólido (p. ej., para administración oral) o como un portador líquido fisiológicamente aceptable (p. ej., solución salina) (p. ej, para administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular, cerebroespinal (intratecal), intracraneal, intravítrea o subretiniana). En algunas realizaciones, el agente (p. ej., uno o más ácidos nucleicos inhibidores) se puede administrar mediante inyección o se puede administrar mediante infusión durante un período de tiempo.

Los agentes que se han de administrar a un sujeto para el tratamiento de un trastorno mitocondrial se describen en la presente memoria y se pueden utilizar en cualquier combinación (p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de cualquier combinación de los agentes o clases de agentes descritos a continuación).

Enfermedades de la invención

Las enfermedades que se han a tratar y/o prevenir en la presente invención incluyen enfermedades tales como las enfermedades mitocondriales primarias, que incluyen el síndrome de Leigh, la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), el síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), la epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF), la oftalmoplejía externa progresiva (PEO), el síndrome de Pearson, la miopatía y miocardiopatía de herencia materna (MIMyCA), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojas irregulares (MERRF); enfermedades mitocondriales secundarias que incluyen la ataxia de Friedreich, la paraplejía espástica hereditaria y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central y/o al ojo asociados con la disfunción mitocondrial: incluidas las enfermedades neurodegenerativas esporádicas relacionadas con la edad, p. ej., la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y la retinopatía diabética, glaucoma; enfermedades neurodegenerativas familiares, incluida la EP familiar, la EA, la enfermedad de Huntington, la retinitis pigmentosa (RP) y la enfermedad de Stargardt

LHON es una forma no sindrómica de neuropatía óptica mitocondrial, caracterizada por la degeneración de las CGR que conduce a la pérdida de la visión central. Es una de las enfermedades mitocondriales más frecuentes (prevalencia 1:30.000) que típicamente aparece entre los 15 y los 35 años. Al igual que otras EM, LHON se caracteriza por una alta heterogeneidad genética, ya que es causada por mutaciones puntuales en múltiples genes codificados por el genoma mitocondrial (ADNmt). En aproximadamente el 95 % de los pacientes con LHON, las mutaciones se localizan en los genesND1, ND4 o ND6,que codifican las subunidades del complejo I (Carelli, 2004; Meyerson, 2015).

El síndrome de microftalmia con defectos cutáneos lineales (MLS) es un trastorno del neurodesarrollo ligado al cromosoma X que se caracteriza por microftalmia, anomalías cerebrales y defectos cutáneos en mujeres heterocigotas y letalidad intrauterina en hombres hemicigotos (Indrieri, 2016). La enfermedad se debe a mutaciones en actores clave de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM), como la holocitocromo sintasa de tipo C (HCCS), que participa en la funcionalidad del complejo III (Bernard y col., 2003; Indrieri y col., 2013; Wimplinger y col., 2006), y la c Ox 7B, la subunidad 7B de la citocromo c oxidasa (complejo IV de la CRM) (Indrieri y col., 2012)

Las mutaciones en el gen de la rodopsina son una causa de retinitis pigmentosa (RP) dominante y recesiva, y representan aproximadamente el 10 % de todos los casos. Por lo tanto, los mutantes dominantes de la rodopsina son mutantes con ganancia de función o mutantes dominantes negativos. Se definieron varias clases: de clase I, son similares a la opsina silvestre (wt) en su capacidad para localizarse en la membrana citoplasmática y unirse al 11-cisretinaldehído para formar la rodopsina espectralmente activa; de clase II, son probablemente defectuosos en el plegamiento y/o estabilidad de las proteínas, se acumulan de forma anormal en el retículo endoplásmico rugoso, no se transportan de manera eficiente a la membrana citoplasmática como sucede con la opsina silvestre y no pueden unirse a la 11-cis-retinaldehído para formar un fotopigmento espectralmente activo; de clase III, activan constitutivamente la transducina.

Entre los mutantes de clase I están los que afectan a la prolina-347 cerca del extremo carboxilo-terminal. Este residuo se conserva entre todos los pigmentos visuales conocidos. Se han identificado seis mutaciones diferentes sin sentido que afectan a este residuo entre los pacientes con RP, lo que indica que la prolina-347 media en alguna función vital de la rodopsina.

Métodos de administración

En ciertas realizaciones, el inhibidor del miR-181 se expresa in vivo a partir de un vector. Un “vector” es una composición de materia que se puede utilizar para administrar un ácido nucleico de interés al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores que incluyen, aunque no de forma limitativa, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término “vector” incluye un plásmido que se replica de forma autónoma o un virus. Los ejemplos de vectores virales incluyen, aunque no de forma limitativa, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares. Un constructo de expresión se puede replicar en una célula viva o se puede fabricar sintéticamente. Para los fines de esta solicitud, los términos “ constructo de expresión” , “vector de expresión” y “vector” se utilizan indistintamente para demostrar la aplicación de la invención en un sentido general e ilustrativo, y no pretenden limitar la invención.

En una realización, un vector de expresión para un inhibidor del miR-181 comprende un promotor “ unido funcionalmente” a un polinucleótido que codifica el inhibidor del miR-181. La frase “ unido funcionalmente” o “ bajo control transcripcional” , como se utiliza en la presente memoria, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por parte de la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

Los vectores virales particularmente preferidos son los vectores AAV, adecuadamente los vectores AAV9, AAV5 y AAV2 (p. ej., AAV2/2, AAV2/8, AAV2/7m8, AAV2/9, AAV2/PhP.B).

Los promotores preferidos de la presente invención son los promotores ubicuos, p. ej., los promotores que impulsan la expresión ubicua del miARN de la invención, por ejemplo, los promotores de CMV o CBA; alternativamente, los promotores de la invención pueden ser promotores específicos de células o tejidos, p. ej., el promotor a-syn para la expresión específica de neuronas o, por ejemplo, el promotor del RHO para la expresión específica de fotorreceptores.

Los sistemas de administración no virales son complejos que comprenden plásmidos y materiales sintéticos, usualmente cargados positivamente, tales como liposomas, polisacáridos, polipéptidos y polímeros artificiales como los descritos en D. Ibraheem, A. Elaissari, H. Fessi, Gene therapy and DNA Delivery Systems, Int. J. Pharm. 459 (2014) 70-83. Un ejemplo de este tipo es el sistema de administración basado en el uso de liposomas policatiónicos a base de fosfato de dicetilo-tetraetilenpentamina (TEPA-PCL, por sus siglas en inglés). A través de este sistema, los miARN y otros nucleótidos, incluidas las esponjas de miARN, se administran a la célula a través de la macropinocitosis y se liberan en el citoplasma con gran eficacia. Los sistemas de administración no virales ofrecen la posibilidad de una baja inmunogenicidad y una baja toxicidad, por lo que son atractivos para proporcionar una seguridad mejorada.

Descripción detallada de la invención

Material y métodos

Estudios con animales

Declaración ética: Todos los estudios en peces y ratones se realizaron según las directrices institucionales para la investigación con animales y fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia y el Departamento de Salud Pública, Salud Animal, Nutrición y Seguridad Alimentaria de conformidad con la ley sobre experimentación con animales (artículo 7; D.L. 116/92; número de protocolo: 389/2015-PR). Todos los tratamientos con animales fueron revisados y aprobados previamente por el Comité de Ética Institucional del Instituto Teletón de Genética y Medicina (Pozzuoli, Italia).

Líneas celulares

Las células HeLa y SH-SY5Y se obtuvieron de la ATCC (CRM-CCL-2, CRL-2266) y se mantuvieron en cultivo, respectivamente, con el medio Eagle modificado (GIBCO) de Dulbecco o una mezcla 1:1 del medio modificado Eagle de Dulbecco y la mezcla de nutrientes F-12, suplementada con un 10 % de FBS (SIGMA) y un 1 % de penicilina/estreptomicina, según lo sugerido por el proveedor.

Ensayos de luciferasa

Las secuencias 3'UTR humanas que contenían los sitios de unión predichos del miR-181a/b se amplificaron mediante PCR y se insertaron en el vector pGL3-tk-luciferasa. Los constructos que contenían sitios de unión al miR-181a/b mutagenizados se obtuvieron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene). Las secuencias de cebador se presentan en la tabla I. Los plásmidos se transfectaron en células HeLa (reactivo PolyFect, QIAGEN). Después de 7 h, las células se transfectaron con 100 nM del imitador negativo de miRIDIAN o imitador de miR-181 (DHARMACON) utilizando interferina (Polyplus). Después de 24 h, las actividades de la luciferasa se cuantificaron utilizando el ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega).

Tabla I: Secuencias de cebador para la amplificación y mutagénesis de la 3'UTR humana

Extracciones del ARN

Las muestras de tejido o células para la extracción del ARN total se procesaron en el reactivo de lisis QiAzol (QIAGEN). El ARN total se extrajo utilizando el kit de extracción RNeasy (QIAGEN), según las instrucciones del fabricante.

PCR cuantitativa en tiempo real

Para los experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), los ADNc se generaron utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (QIAGEN), según las instrucciones del fabricante.

Los cebadores para las reacciones de qRT-PCR se diseñaron para abarcar dos exones diferentes a fin de evitar la amplificación del ADN genómico utilizando herramientas in silico (www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) para predecir su temperatura de fusión (Tf) y evitar la posibilidad de autohibridación o dimerización del cebador. La especificidad de los cebadores diseñados se probóin silicoutilizando la herramienta BLAT o BLAST en Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) o Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html). Los cebadores se probaron según Bustin y col., 2009. Las secuencias de cebador se presentan en la tabla II. Los datos de cuantificación, obtenidos en las reacciones de qRT-PCR sobre los ADNc obtenidos de los diferentes tratamientos, se expresan en términos de umbrales de ciclo (Ct, por sus siglas en inglés). Los genesHPRTyGAPDHse utilizaron como controles de referencia endógenos para los experimentos. Los valores de Ct se promediaron para cada triplicado técnico en placa. El Ct promediado se normalizó como la diferencia en los valores de Ct (ACt) entre los ARNm analizados y cada gen de referencia en cada muestra en análisis. A continuación, los valores de ACT de cada muestra se normalizaron con respecto a los valores de ACT del control (AACt). La variación se informó como cambio de pliegue (2'AACt). Los experimentos se realizaron por duplicado para cada placa y todos los resultados se muestran como la media ± SEM de al menos 3 ensayos biológicos independientes.

Para el análisis en condiciones de alimentación y hambre: los ratones en estado de hambre se sacrificaron después de 12 horas de privación de nutrientes (p. ej., se retiró el suministro de alimentos durante 12 horas), mientras que los ratones alimentados se sacrificaron después de 12 horas de privación de nutrientes y 1 hora de realimentación (p. ej., el suministro de alimento se devolvió a cada jaula).

Tabla II: Secuencias de cebador para el análisis por qRT-PCR.

Transfecciones de SH-SY5Y y tratamiento con FCCP

Las células SH-SY5Y se transfectaron con 100 nM de inhibidor del miARN de control negativo e inhibidores del miR-181a y miR-181b (DHARMACON IH-300552-07-0005 e IH-300554-08-0005, respectivamente) utilizando Dharmafect (DHARMACON).

Los inhibidores del miR son moléculas de ARN monocatenario sintéticas diseñadas para inhibir la actividad del microARN endógeno. Tras 72 h de transfección, las células SH-SY5Y se trataron con f Cc P 25 pM (Sigma, C2920). Tras 6 h de tratamiento con FCCP, se evaluó la muerte celular mediante tinción con azul tripano.

T ratamiento con LNA en células ARPE

Las células ARPE-19 (CRL-2302) se transfectaron con 80 nM de inhibidor de miARN de control negativo LNA e inhibidores de miR-181a (CGACAGCGTTGAATGT Id. de sec. n.° 6) LNA y de miR-181b (CGACAGCAATGAATGT Id. de sec. n.°7) LNA (Exiqon) utilizando interferina (Polyplus). T ras 48 h de transfección, las células ARPE-19 se trataron con 100 uM de<a>2<e>(A<c>M<e>BIOSCIENCE INC. Síntesis de clientes A2E, AB4344). Después de 6 h de tratamiento con A2E, se evaluó la autofluorescencia celular.

Ensayo cuantitativo de miARN maduro

Para la detección cuantitativa madura de miR-181a y miR-181b, los inventores utilizaron sondas de hidrólisis (TaqMan, Applied Biosystem). Los ADNc para el análisis de miARN maduros se generaron utilizando el kit de transcripción inversa de microARN TaqMan con cebadores específicos de miARN, según las instrucciones del fabricante. Los datos de cuantificación, obtenidos en las reacciones de TaqMan-PCR en ADNc de Taqman de los diferentes tratamientos, se expresan en términos de umbrales de ciclo (Ct). Se utilizó una sonda TaqMan para el ARNsno234como control endógeno para los experimentos. Los valores de Ct se analizaron como se describe en la sección “ PCR cuantitativa en tiempo real” . Los experimentos se realizaron por duplicado para cada placa y todos los resultados se muestran como la media ± SEM de tres réplicas biológicas independientes.

Hibridaciónin situde ARN (ISH)

Los ojos o cerebros de los ratones se fijaron durante la noche en PFA al 4 %, se crioprotegieron con sacarosa al 30 % y se embebieron en OCT. Las criosecciones de 20 micrómetros se trataron con 5 pg/ml de proteinasa K durante 15 min. Tras lavarlas con 2 mg/ml de glicina y después de la fijación con PFA al 4 % y glutaraldehído al 0,2 %, las secciones se prehibridaron con formamida al 50 %, tampón de citrato salino de sodio (SSC) 5X y ácido cítrico hasta alcanzar un pH de 6, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1 %, 500 g/ml de ARNt de levadura y 50 g/ml de heparina. Las sondas de ácido nucleico bloqueado de miRCURY (de Exiqon) para la detección de miR-181a y miR-181b se utilizaron a una concentración final de 30 nM. La hibridación de la sonda se realizó durante la noche a 42 °C. Las secciones hibridadas se lavaron con formamida al 50 %, SSC 2x a la temperatura de hibridación. Las secciones se bloquearon durante 1 hora en MABT (ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM y Tween20 al 0,1 %) que contenía reactivo de bloqueo al 1 % (Roche) y suero de oveja al 10 %, y se incubaron con un anticuerpo antidigoxigenina etiquetado con fosfatasa alcalina (AP) (1:2000; Roche) en MABT/reactivo de bloqueo al 1 % durante una noche a 4 °C. Las secciones se tiñeron con NBT-BCIP (Roche) y se obtuvieron imágenes de las mismas bajo el microscopio Leica DM5000.

La hibridación in situ en peces medaka se realizó como se describe (Carrella y col., 2015).

Análisis cuantitativo del contenido de ADN mitocondrial

La PCR en tiempo real de SYBR Green se realizó utilizando cebadores para el gen COI (ADNmt) y el RNasa P (referencia del gen nuclear), como se describe (Viscomi y col., 2009). El número relativo de copias del ADNmt se calculó a partir del valor umbral del ciclo (ACt) y el número de copias del ADNmt por célula se calculó como 2 x 2'Act para responder por las dos copias de RNasa P en cada núcleo.

Aislamiento de proteínas y transferencia Western (WB, por sus siglas en inglés)

Las muestras de tejido y células para la extracción de la proteína total se homogeneizaron en un tampón RIPA con un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Las concentraciones del extracto de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad). Se cargaron un total de 30 |jg de proteína de cada muestra en geles de poliacrilamida y SDS. Los extractos mitocondriales y citosólicos se obtuvieron de ojos enteros sin cristalino como se describe (Comitato y col., 2014). Se cargaron 30 jg de proteínas de las fracciones mitocondriales y citosólicas de cada muestra en geles de poliacrilamida y SDS. Para la transferencia Western, los geles se electrotransfirieron sobre filtros de nitrocelulosa y se inmunotiñeron secuencialmente con los siguientes anticuerpos primarios: anti-p62 (Abnova, clon 2C11, 1:1000); anti-LC3B (Novus, 1:500); anti-Mfn2 (Abcam, ab56889, 1:1000); anti-citrato sintasa (Abcam, ab9660, 1:1000); anti-p115 (Santa Cruz, sc-48363, 1:3000); anti-Tim23 (Santa Cruz, sc-13298, 1:250); anti-Ndufb11 (Proteintech, 1:1000); anti-Ndufb8 (Abcam, Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail ab110413, 1:250); anti-CoXIV (Cell Signaling 4844, 1:1000); anti-Parkin (Cell Signaling 4211, 1:500); anti-Gapdh (Santa Cruz sc-32233, 1:3000).

Las proteínas de interés se detectaron con un anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo (1:3000, GE Healthcare) visualizado con el sustrato Luminata Crescendo (Millipore) o el sustrato Super Signal West Femto (Thermo Scientific), según el protocolo del fabricante. Las imágenes de transferencia Western se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Chemidoc-It (UVP) y la intensidad de la banda se calculó utilizando el software ImageJ. Las señales para cada tinción de proteína se cuantificaron y, a continuación, se normalizaron para la GAPDH o p115 o para la Ndufb8 (fracciones mitocondriales) en la misma muestra (normalización interna). A continuación, estos valores normalizados se compararon con los valores de la muestra de control. Solo se compararon las bandas de la misma mancha. El promedio de los valores normalizados de tres réplicas biológicas diferentes se informa como el cambio de pliegue relativo.

Para el análisis en condiciones de alimentación y hambre: los ratones en estado de hambre se sacrificaron después de 12 horas de privación de nutrientes, mientras que los ratones en estado de alimentación se sacrificaron después de 12 horas de privación de nutrientes y 1 hora de realimentación.

Peces medaka y morfolino

La crianza y la estadificación de los peces medaka (cepa Cab) se realizaron como se describe (Iwamatsu, 2004). El diseño, la especificidad y la eficiencia inhibitoria de los MO se han descrito previamente (Carrella y col., 2015; Indrieri y col., 2013; Indrieri y col., 2012). Los oligos morfolino son herramientas avanzadas para bloquear sitios en el ARN y obstruir los procesos celulares. Un oligo morfolino se une específicamente a su sitio diana seleccionado para bloquear el acceso de los componentes celulares a ese sitio diana. Esta propiedad se puede aprovechar para bloquear la traducción, bloquear el corte y empalme, bloquear los miARN o sus dianas y bloquear la actividad de las ribozimas. Un oligo morfolino es radicalmente diferente de los ácidos nucleicos naturales, ya que los anillos de metilenmorfolina sustituyen a los restos de azúcar ribosa o desoxirribosa y los enlaces fosforodiamidato no iónicos sustituyen a los fosfatos aniónicos del ADN y el ARN. Cada anillo de morfolina posiciona adecuadamente una de las bases de ADN estándar (A, C, G, T) para el emparejamiento, de modo que un oligo morfolino de 25 bases se una fuerte y específicamente a su sitio diana complementario de 25 bases en una cadena de ARN mediante el emparejamiento de Watson-Crick. Debido a que las enzimas no reconocen la cadena principal no cargada del oligo morfolino, es completamente estable a las nucleasas. hccs-MO, cox7b-MO, miR-181a-MO y miR-181b-MO (MO-miR-181a 5'-AACT CACCGACAGCGTT GAAT GTT C-3' Id. de sec. n.° 111; MO-miR-181b 5'-AACCCACCGACAGCAATGAATGTTG-3' Id. de sec. n.° 112) se inyectaron en embriones medaka unicelulares fertilizados a una concentración de 0,3 mM, 0,1 mM, 0,075 mM y 0,075 mM, respectivamente.

Ensayo TUNEL

El ensayo TUNEL de montaje completo se realizó en embriones de pez medaka st30 utilizando un kit de detección de muerte celular in situ (Roche) como se describe (Indrieri y col., 2013). Tras la tinción, los embriones se embebieron en una mezcla de BSA/gelatina y se seccionaron con vibratomo. Las secciones se analizaron con un microscopio Leica DM-6000 y las células positivas para TUNEL se contaron manualmente en toda la retina.

Ensayos de caspasa

A veinte embriones para la muestra se les retiró el corión en el estadio 32 y se congelaron en nitrógeno líquido durante al menos 24 h. Los ensayos de caspasa se realizaron en lisados de proteínas utilizando el reactivo de luciferasa caspasa-3/7 y caspasa-9-GLO (Promega), como se informó anteriormente (Indrieri y col., 2013). Las señales de luminiscencia emitidas se normalizaron para la concentración de proteína de cada muestra.

Tratamientos farmacológicos en el pez medaka

Se retiró el corión de los embriones en estadio 24 y se realizó la incubación durante 24 h en Bafilomicina A 50 nM (SIGMA, B1793), PD98059 25 pM (Cell Signaling, n.° 9900) o HA14-1 6 pM (SIGMA, 48787). Los fármacos se diluyeron en DMSO al 3 %/medio embrionario. El modelo de pez medaka con EP se generó mediante el cultivo de embriones del estadio 32 al estadio 38 en 6-OHDA 500 pM (SIGMA, H4381) en un medio embrionario con DMSO al 3 % y ácido ascórbico al 0,2 %. El medio se refrescó dos veces al día. Los embriones de control se cultivaron en el medio embrionario con DMSO al 3 %.

Detección de neuronas dopaminérgicas en peces medaka

Los peces de control y miR-181a/b-MO tratados con DMSO o 6-OHDA se fijaron en PFA al 4 %. Los peces se trataron con 10 pg/ml de proteinasa K durante 1 h y 30 min, se lavaron con 2 mg/ml de glicina y se fijaron en PFA al 4 % durante 20 min. A continuación, los embriones se incubaron con 0,1 % de citrato de sodio/0,1 % de Triton X-100 durante 10 minutos en hielo. Tras una incubación durante una noche con un anticuerpo anti-TH (Abcam ab112, 1:500), los peces se incubaron con un anticuerpo conjugado con peroxidasa anti-IgG de conejo (1:200; Vector Laboratories) y, a continuación, se realizó la tinción con diaminobencidina (DAB; Sigma). Los embriones se embebieron en una mezcla de BSA/gelatina y se seccionaron con vibratomo. Las secciones se observaron con un microscopio Leica DM-6000 y las células positivas para el anti-TH se contaron manualmente en todo el locus coeruleus del pez medaka.

Inyecciones de rotenona

La rotenona (SIGMA, R8875-) se inyectó por vía intravítrea a la concentración final de 5 mM, como se informó (Heitz y col., 2012). Para el análisis histológico de las CGR, se inyectó rotenona en un ojo de ratones de dos meses, miR-181a/b-+/+ y miR-181a/b-1-/-,y en el ojo contralateral DMSO (control interno). Para las pruebas optocinéticas, a los ratones se les inyectó bilateralmente rotenona 5 mM o DMSO.

Análisis de la actividad de la NADH deshidrogenasa mediante tinción

La reacción histoquímica de la NADH deshidrogenasa se realizó como se describe (Marella, 2010) con modificaciones menores. En resumen, las secciones retinianas se lavaron tres veces en PBS y, a continuación, se incubaron en una solución que contenía 2 mg/ml de azul nitro de tetrazolio, NADH 0,5 mM, Tris-Cl 50 mM, pH de 7,6 a 37 °C durante 30 min. Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS y se montaron con PBS/glicerol al 50 %.

Seguimiento optocinético

La agudeza visual de los ratones a los que se les inyectó rotenona se evaluó utilizando el sistema optomotor (OptoMotry; Cerebral Mechanics) como se describe (Chadderton y col., 2013).

Análisis de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

Para el análisis de inmunofluorescencia, los ojos de los ratones se fijaron en PFA al 4 %, se crioprotegieron con sacarosa al 30 %, se incrustaron en OCT y se crioseccionaron. Las secciones se permeabilizaron hirviéndolas en tampón de citrato de sodio o mediante incubación con NP40 al 1 % durante 15 minutos para la inmunotinción con arrestina con cono. Los siguientes anticuerpos primarios se incubaron durante la noche: anti-rodopsina (Abcam, ab3267, 1:5000); anti-arrestina de cono (Millipore, 1:1000); anti-Pax6 (Covance, 1:250); anti-GS6, (Millipore, 1:100); anti-sintaxina (S<i>GMA 1:100); anti-NeuN (Millipore, clon A60 1:400); anti-CoxIV (Cell Signaling 4844, 1:400). A continuación, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios con Alexa Fluor (1:1000; Invitrogen). Las secciones se tiñeron por contraste con DAPI (Vector Laboratories). Las CGR teñidas con anticuerpos anti-NeuN se contaron en 8 portaobjetos diferentes para cada ojo en las áreas que rodean el nervio óptico. Se obtuvieron imágenes de las secciones con microscopía confocal Zeiss LSM710.

Para la detección de neuronas dopaminérgicas en ratones, los ratones se anestesiaron y, a continuación, se perfundieron con PFA al 4 % después de 30-35 días desde la cirugía. Los cerebros se fijaron posteriormente en PFA al 4 % y se seccionaron con vibratomo. Se seccionó el mesencéfalo a profundidad completa y las secciones se recolectaron consecutivamente. Las secciones flotantes se incubaron durante 20 minutos en PBS 1x/FBS al 10 %/Triton al 0,1 % y, a continuación, durante 1 h en BSA 0,1 %/FBS al 10 %/Triton al 0,1 % en PBS 1x. Tras una incubación durante la noche con un anticuerpo anti-TH (Abcam ab112, 1:1000), las secciones se incubaron con un anticuerpo conjugado con peroxidasa anti-IgG de conejo (1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y, a continuación, se realizó la tinción con diaminobencidina (DAB; Sigma). Todas las secciones que contenían el área de la SN se seleccionaron utilizando el atlas del cerebro del ratón (Paxinos, 2004) (Bregma -2,54 a -3,64 mm). Para el recuento se utilizó una de cada cuatro secciones que cubrían toda la extensión de la SN. Las secciones cerebrales se observaron con un microscopio Leica DM-6000 y las células positivas para TH se contaron manualmente tanto en el lado inyectado con 6-OHDA como en el lado de control de cada animal. El criterio para contar las células positivas para Th fue la presencia de sus núcleos en el plano focal. La parte compacta de la SN se definió cuidadosamente utilizando el atlas del cerebro del ratón (Paxinos, 2004), y se tuvo especial cuidado de no incluir otras regiones positivas para TH de la SN, así como el área tegmental ventral.

Electrorretinograma (ERG)

Los ratones se mantuvieron en la oscuridad durante 3 h y se anestesiaron. Se provocaron electrorretinogramas ultrarrápidos (ERG) mediante destellos de luz de 10 ms generados a través de un estimulador Ganzfeld (CSO, Costruzione Strumenti Oftalmici, Florencia, Italia) y se registraron como se ha descrito anteriormente (Botta y col., 2016; Surace y col., 2005). Los umbrales de ERG y onda b se evaluaron utilizando el siguiente protocolo. Los ojos se estimularon con destellos de luz que aumentaron de -5,2 a 1,3 log cd*s/m2 (que corresponden a 1 * 10'52 a 20,0 cd*s/m2) en condiciones escotópicas. Para el análisis por ERG en condiciones escotópicas, se consideraron las respuestas provocadas por 11 estímulos (de -5,2 a 1,3 log cd*s/m2) con un intervalo de 0,6 unidades logarítmicas. Para minimizar el ruido, se promediaron tres respuestas de ERG en cada estímulo de 0,6 unidades logarítmicas, de -5,2 a 0,0 log cd*s/m2, mientras que se consideró una respuesta de ERG para estímulos más altos (de 0,0 a 1,3 log cd*s/m2). Las amplitudes de las ondas a y b registradas en condiciones escotópicas se representaron en función del aumento de la intensidad de la luz (de -4 a 1,3 log cd*s/m2). El ERG fotópico se registró después de la sesión escotópica estimulando el ojo con diez destellos de 10 ms de 20,0 cd*s/m2 sobre una iluminación de fondo constante de 50 cd/m2.

Ensayos conductuales y de inyección de 6-OHDA

Los ratones machos de dos meses,miR-181a/b-+l+ymiR-181alb-1~l-,se anestesiaron y se colocaron en un marco esterotáxico (Kopf Instruments). La 6-OHDA (2 mglkg; Sigma) se disolvió en una solución de NaCl al 0,9 %lácido ascórbico al 0,01 % y se inyectó unilateralmente en el lado derecho, en la sustancia negra en las coordenadas: AP=-3,1; L=±0,8; DV=-4,8, -5,2 según Paxinos, 2004. Para proteger el sistema noradrenérgico (De Leonibus, 2007), los ratones recibieron una inyección de desipramina (35 mglkg i.p.; Sigma), 15 minutos antes de la anestesia. El volumen total de inyección de 6-OHDA fue de 0,8 pl (0,5 pl a DV=-5,2 y 0,3 pl a DV=-4,8). Se inyectó solución salina en el otro lado del cerebro. Después de la cirugía, los animales recibieron 1 ml de solución salina y los primeros 3 días recibieron 1 ml de solución de sacarosa dos veces al día para evitar la pérdida excesiva de peso corporal asociada a la afagia inducida por la lesión. Después de 15 días, los animales se analizaron para determinar la rotación contralateral inducida por la L-dopa, como parámetro de lectura de la extensión de la lesión (De Leonibus, 2009). Las pruebas de comportamiento se realizaron durante un período de luz. Antes de la prueba, los animales se aclimataron a la sala de comportamiento durante al menos 30 minutos. Los ratones se colocaron en un cilindro de plexiglás (19 cm de diámetro) y se les inyectó benserazida (20 mglkg, i.p. Sigma) y se realizó un seguimiento en vídeo (AnyMaze, Stoelting) durante 20 minutos. Tras este período de habituación, a los ratones se les inyectó L-dopa (25 mglkg, i.p., Sigma) y se realizó un seguimiento en vídeo durante 40 minutos adicionales. Las rotaciones in situ se definen como un giro completo de 360° del cuerpo.

Los ratones P347S son ratones transgénicos que portan una mutación humana de prolina-347 a serina (P347S), descrita en PMID:8943080

Análisis estadístico

Los animales se asignaron a grupos experimentales y de control al azar. No se excluyó ningún dato del análisis. Las pruebas conductuales y visuales se realizaron a ciegas. El número de réplicas experimentales se indica en la leyenda de cada figura. En todos los experimentos, la importancia de las diferencias entre los grupos se evaluó mediante un ANOVA unidireccional o bidireccional con análisis post hoc de Tukey , la prueba t de Student de una o dos colas, el análisis de la desviación para el modelo lineal generalizado o el análisis de la desviación para el modelo lineal generalizado binomial negativo, como se indica en las leyendas de las figuras. Se consideró significativo un valor p <0,05. Los datos cuantitativos se presentan como media ± SEM, se consideró significativo un valor p <0,05.

Ejemplos

Ejemplo 1

El miR-181a/b controla el recambio mitocondrial

Los presentes inventores identificaron elPPARGC1Ay elNRF1,reguladores maestros de la biogénesis mitocondrial (Finck y Kelly, 2006; Wu y col., 1999), el COX11 y elCOQ10B,que participan en el ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM) (Carr y col., 2002; Desbats y col., 2015), y elPRDX3,un importante eliminador de ROS mitocondrial (Wonsey y col., 2002), como genes diana putativos del miR-181a/b mediante una búsqueda bioinformática (Gennarino y col., 2012). Curiosamente, el análisis por qRT-PCR indicó un aumento de los niveles de todos los transcritos anteriormente mencionados en las células del neuroblastoma humano SH-SY5Y tras el silenciamiento del miR-181a/b con inhibidores adquiridos en Dharmacon, como se describe en detalle a continuación (figura 1A).

Para validar las nuevas dianas predichas del miR-181a/b, la 3'-UTR de cada gen humano(PPARGC1A, NRF1, COX11, COQ10ByPRDX3),incluido el sitio diana predicho del miR-181, se clonó en el plásmido pGL3-TK-luciferasa, corriente abajo de la región codificante del gen indicador de la luciferasa. A continuación, se probó la capacidad del imitador del miR-181 transfectado para influenciar en la actividad de la luciferasa. La presencia de la secuencia 3'-UTR de los genes analizados inhibió la actividad de la luciferasa en respuesta al imitador del miR-181 (oligonucleótidos dúplex sintéticos idénticos en secuencia a los miARN 181 a y b que imitan su función, figura 1B, adquiridos en Dharmacon, como se describe en detalle en la sección de métodos). Además, las mutaciones puntuales en el sitio de unión del miR-181a/b en la 3'-UTR de cada gen suprimieron la represión de la luciferasa, lo que demuestra que estos miARN se dirigen directa y específicamente a los genesNRF1, COX11, COQ10ByPRDX3(figura 1B). El direccionamiento directo delPPARGc IAno se validó (figura 1B), lo que indica que la regulación al alza observada mediante la qRT-PCR después del silenciamiento del miR-181a/b (figura 1A) podría ser el resultado de un efecto indirecto.

Basándose en los resultados anteriores, los inventores dedujeron que la regulación a la baja del miR-181a/b podría estimular la biogénesis mitocondrial y verificaron esta hipótesis in vivo. En los mamíferos, el miR-181a y el miR-181b se organizan en dos grupos, a saber,miR-181a/b-1ymiR-181a/b-2,localizados en diferentes loci genómicos (cromosomas 1 y 2, respectivamente). Las formas maduras del miR-181a-1 y miR-181a-2, así como las del miR-181b-1 y el miR-181b-2, muestran secuencias idénticas. Además, tanto el miR-181a como el miR-181b contienen la misma secuencia “ semilla” (Ji y col., 2009) ACAUUCA, es decir, la región que se cree que desempeña el papel más importante en el reconocimiento de dianas (Bartel, 2009). Se seleccionó el modelo de ratón que albergaba una deleción dirigida del grupo 1 demiR-181a/b(descrito en Henao-Mejia y col., 2013), ya que dicho grupo representa la mayor parte de la expresión del miR-181a/b maduro tanto en el cerebro como en la retina, como lo demuestran la hibridación in situ del ARN, los ensayos de Taqman y el aumento de varias dianas del miR-181a/b validados, tales comoBc/2, Mcl1, Xiap, Atg5, Erk2yPark2(Cheng y col., 2016; He y col., 2013; Hutchison y col., 2013; Ouyang y col., 2012; Rodríguez-Ortiz y col., 2014; Tekirdag y col., 2013) (figuras 7 A-D; 9). Curiosamente, el aumento de los niveles de expresión deNrf1, Ppargc/a, Cox11, Coq10byPrdx3en el ojo de los ratonesmiR-181a/b-1-/-se observó mediante RT-PCR, como se muestra en la figura 1C. Los niveles elevados deNrf1yPpargclaindican una biogénesis mitocondrial mejorada (Finck y Kelly, 2006; Wu y col., 1999). Según esta observación, se detectó un aumento del ADN mitocondrial (ADNmt) medido mediante qRT-PCR y mostrado en la figura 1D, así como un aumento de los niveles de proteína de las subunidades del complejo de la CRM (Ndufb11 y Cox4) y de los marcadores mitocondriales generales (Mfn2, Tim23 y citrato sintasa [Cs]), evaluados mediante transferencia Western (WB) en el ojo de RatonesmiR-181a/b-1-/-y se muestran en la figura 1 E. En general, estos datos demuestran que la inactivación del miR-181a/b estimula la biogénesis mitocondrial en el SNC, y sugieren una acción amplia de estos dos miARN en el recambio mitocondrial global. Los inventores investigaron además si la inactivación del miR-181a/b mejora la mitofagia en el ojo del ratón. Como se muestra en la figura 8A, los niveles de transcrito de los genes, medidos mediante RT-PCR, se regularon al alza en los ojos delmiR-181a/b-1~/-.Además, el análisis de transferencia Western detectó un aumento del reclutamiento de Park2/Parkin y del adaptador autofágicoSqstm1/p62en las fracciones mitocondriales, como se muestra en la figura 1F; lo que indica un aumento de la mitofagia en los ojos delmiR-181a/b-1~/-.La autofagia general se analizó más a fondo evaluando los niveles deSqstm1/p62y del marcador de autofagiaMap/1c3b/Lc3-IIen los extractos de proteínas totales. Mediante transferencia Western, se observó una disminución de los niveles de estas dos proteínas, más evidente en condiciones de hambre (figura 8B), sin cambios en los niveles de transcrito correspondientes (figura 8C), lo que indica un aumento en la tasa de flujo autofágico en los ojos delmiR-181a/b-1-/-.

En conjunto, estos resultados revelan un papel importante del miR-181a/b en la regulación del recambio mitocondrial mediante la coordinación de la biogénesis mitocondrial y la depuración in vivo.

Ejemplo 2

La inhibición del miR-181a/b protege a las neuronas de la muerte celular y mejora el fenotipo de los modelos in vivo del síndrome de MLS

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que la inactivación del miR-181a/b protege del daño mitocondrial. En primer lugar, evaluaron si la regulación a la baja del miR-181a/b in vitro protege a las células SH-SY5Y del FCCP, un potente desacoplador de la fosforilación oxidativa (OXPHOS): mientras que el 50 % de las células de control murieron a las 6 horas (h) del tratamiento con el FCCP, las células silenciadas con miR-181a/b no mostraron ningún cambio en el grado de muerte celular (figura 9), lo que demuestra que el silenciamiento del miR-181a/b efectivamente protege a las células del daño mitocondrial.

Los inventores evaluaron además el efecto neuroprotector de la inactivación del miR-181a/b en modelos in vivo de neurodegeneración mediada por las mitocondrias en dos modelos de peces para una forma poco frecuente de EM, el síndrome de microftalmia con lesiones cutáneas lineales (MLS). La MLS es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por microftalmia, anomalías cerebrales y defectos cutáneos en mujeres heterocigotas y letalidad intrauterina en hombres hemicigotos (Indrieri, 2016). La enfermedad se debe a mutaciones en actores clave de la CRM, tales como la holocitocromo sintasa de tipo C (HCCS), que participa en la funcionalidad del complejo III (Bernard y col., 2003; Indrieri y col., 2013; Wimplinger y col., 2006), y la COX7B, la subunidad 7B de la citocromo c oxidasa (complejo IV de la c Rm ) (Indrieri y col., 2012). Anteriormente se generaron dos modelos de peces medaka(Oryzias latipes)de MLS mediante la inactivación, utilizando un enfoque basado en morfolino (MO), de la expresión delhccso elcox7B(Indrieri y col., 2013; Indrieri y col., 2012). Ambos modelos(hccs-MO y cox7b-MO)muestran un fenotipo microftámico y microcefálico grave debido al aumento de la muerte celular en el SNC (Indrieri y col., 2013; Indrieri y col., 2012). En el medaka, las formas maduras del miR-181a y b se conservan perfectamente en comparación con sus homólogos mamíferos, tanto en términos de identidad de secuencia (100 %) como de patrón de expresión, particularmente en la retina (Carrella y col., 2015). El silenciamiento mediado por MO del miR-181a/b en el medaka conduce a un aumento de los niveles de la mayoría de las dianas involucradas en las funciones mitocondriales y en la autofagia (figura 10). Curiosamente, la regulación a la baja del miR-181a/b en cualquiera de los modelos de medaka de MLS condujo a una reducción notable de la muerte celular en el cerebro y ojos, como muestran los ensayos de TUNEL y activación de la caspasa en la figura 2. En consecuencia, la regulación a la baja del miR-181a/b dio como resultado un rescate total del fenotipo de la enfermedad en aproximadamente el 50 % de los morfantes para el hccs (figura 3 A-C, M) y el cox7B (figura 3 G-I, N), mientras que el silenciamiento del miR-181a/b mediado por MO no provocó ninguna alteración morfológica evidente (figura 11 A, B). Estos datos demuestran que la regulación a la baja del miR-181a/b mejora el fenotipo en los modelos defectuosos del complejo III y IV de la CRM, lo que indica que el efecto protector del silenciamiento del miR-181a/b en los modelos de<m>L<s>es independiente del gen.

Dado que el miR-181a/b regula la mitofagia y la autofagia en el ojo, los inventores probaron si dichos procesos están implicados en la mejora del fenotipo mediada por la regulación a la baja del miR-181a/b. Para ello, los embriones a los que se les inyectóhccs-MO/miR-181a/b-MOycox7b-MO/miR-181a/b-MOse trataron con bafilomicina A1 (Baf-A1), un inhibidor general de la autofagia, a 50 nM. Esta concentración es capaz de bloquear la autofagia sin inducir ninguna anomalía morfológica evidente en los embriones de control (figura 11 C, F). Curiosamente, el tratamiento con Baf-A1 suprimió el efecto protector de la regulación a la baja del miR-181a/b en un número significativo de embrioneshccs-MO/miR-181a/b-MO(figura 3 D, M) y cox7b-MO/miR-181a/b-MO (figura 3 J, N), lo que indica que el aumento de la autofagia/mitofagia contribuye sustancialmente a la mejora del fenotipo en los modelos de medaka con MLS.

Dado que la regulación a la baja del miR-181a/b también aumentó los niveles de ARNm deerk2,un componente clave de la cascada MAPK/ERK, y debcl2ym cll,miembros de la familia antiapoptótica Bcl2, como se muestra en la figura 10, los inventores también probaron si las dos últimas vías estaban implicadas en la mejora del fenotipo de MLS. Por lo tanto, los inventores trataron los embriones a los que se les inyectó hccs-MO/miR-181a/b-MO y cox7b-MO/miR-181a/b-MO con PD98059, un inhibidor selectivo de la vía MAPK/ERK (Alessi y col., 1995), o con HA14-1, un inhibidor de las proteínas Bcl-2 (Wang y col., 2000b). El PD98059 y el HA14-1 se utilizaron en concentraciones que no indujeron ninguna alteración morfológica en los embriones de control (Carrella y col., 2015; y figura 11 D, E). El tratamiento con PD98059 no tuvo ningún efecto sobre el grado de rescate del fenotipo en ninguno de los modelos de MLS (figura 3 E, K, M, N), lo que sugiere que la vía MAPK no está implicada principalmente en el efecto protector ejercido por la regulación a la baja del miR-181a/b en los modelos de MLS analizados. Por otro lado, el HA14-1 redujo significativamente el grado de recuperación del fenotipo en los embriones a los que se les inyectóhccs-MO/miR-181a/b-MO, pero no en los embriones a los que se les inyectó cox7b-MO/miR-181a/b-MO (figura 3 F, L-N). En conjunto, estos datos sugieren que el aumento de la autofagía/mitofagia está implicado en la mejora del fenotipo de MLS en ambos modelos, lo que indica un papel principal de esta vía en la protección neuronal mediada por la regulación a la baja del miR-181a/b. Además, el aumento de los niveles debcl2desempeña un papel únicamente en la mejora de los embriones con defectos en el hccs, lo que indica que la contribución de la vía apoptótica mediada por el Bcl2 puede variar según el defecto mitocondrial específico.

Ejemplo 3

La inhibición del miR-181a/b mejora el fenotipo de un modelo de ratón de síndrome de LHON

La eficacia de la inhibición del miR-181a/b se probó aún más en un modelo de ratón de neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) inducida por fármacos. LHON es una forma no sindrómica de neuropatía óptica mitocondrial caracterizada por la degeneración de las células ganglionares de la retina (CGR) que conduce a la pérdida de la visión central. LHON representa una de las formas más frecuentes de EM, con una prevalencia de 1 a 30.000 individuos y su inicio se produce entre los 15 y los 35 años (Carelli y col., 2004). Al igual que otras EM, LHON se caracteriza por una alta heterogeneidad genética, ya que es causada por mutaciones puntuales en múltiples genes codificados por el genoma mitocondrial (Carelli y col., 2004; Meyerson y col., 2015). En aproximadamente el 95 % de los pacientes con LHON, las mutaciones se localizan en los genesND1, ND4 o ND6,que codifican las subunidades del complejo I (Carelli y col., 2004; Meyerson y col., 2015). La inyección intravítrea de rotenona, un inhibidor del complejo I de la CRM, provoca un daño selectivo de las CGR, y los ratones a los que se les inyectó se consideran un modelo fiable de LHON inducida por fármacos (Carelli y col., 2013). Para evaluar si la inactivación genética del miR-181a/b ejerce un efecto protector contra LHON inducida por la rotenona, a los ratonesmiR-181alb-1+l+ymiR-181alb-1-l~se les inyectó rotenona por vía intravítrea. Como controles internos, a los ojos contralaterales se les inyectó DMSO. Como se informó anteriormente (Heitz y col., 2012), los ratones de controlmiR-181a/b-1+l+a los que se les inyectó rotenona mostraron una reducción notable en el número de CGR (figura 4 A, B). Por el contrario, no hubo diferencia en el número de CGR entre la retina inyectada con rotenona y aquella inyectada con DMSO en ratonesmiR-181alb-1~l~,tanto una como dos semanas después de la inyección (figura 4 A, B). Curiosamente, los ratonesmiR-181alb-1~l~a los que se les inyectó rotenona también mostraron una actividad conservada del complejo I de la CRM en las CGR, como lo demuestra la tinción de la actividad de la NADH deshidrogenasa, con respecto a los ratonesmiR-181alb-1+l+a los que se les inyectó rotenona (figura 4C). En consecuencia, el análisis de inmunofluorescencia de CoxIV destacó que el agotamiento delmiR-181alb-1protege la integridad de la red mitocondrial contra el daño inducido por la rotenona (figura 4D). Finalmente, los inventores también probaron la función retiniana mediante la respuesta optocinética (OKR, por sus siglas en inglés). Para este análisis, se inyectó bilateralmente rotenona o DMSO a ratonesmiR-181alb-1+l+ymiR-181alb-1~l~.Curiosamente, los ratonesmiR-181alb-1+l+mostraron una disminución grave del rendimiento visual a partir de 1 semana después de la administración de rotenona, mientras que los ratonesmiR-181alb-tl~estuvieron significativamente protegidos contra la toxicidad inducida por la rotenona (figura 4E). La ablación delmiR-181alb-1mejoró la disfunción visual incluso dos semanas después de la inyección de rotenona (figura 4 A, E). Es importante destacar que la ablación delmiR-181alb-1no causa de por sí ninguna anomalía en la morfología retiniana ni en el número de CGR (como lo demuestra el análisis de inmunofluorescencia con marcadores celulares retinianos representativos [figuras 12 A-J, M]) ni alteración de la función retiniana (evaluada mediante análisis de electrorretinograma [ERG] [figura 12 K-L]). En conjunto, estos datos indican que la inhibición del miR-181alb ejerce un efecto protector en un modelo mamífero de LHON y, por lo tanto, representa una estrategia terapéutica para esta afección.

Ejemplo 4

La inactivación del miR-181alb rescata el fenotipo de LHON en el modelo de ratónNdufs4-l~.

Los ratones a los que se les inyectó rotenona se consideran un modelo fiable de LHON (Carelli y col., 2013). Sin embargo, este último representa un modelo agudo en el que es difícil analizar el mecanismo por el cual la regulación a la baja del miR-181alb ejerce su función protectora. Por lo tanto, los inventores explotaron el modelo de ratónNdufs4-l- (Kruse y col., 2008) para caracterizar y validar aún más la eficacia de la inactivación del miR-181alb en modelos de mamífero con EM. Las mutaciones homocigotas en elNDUFS4son responsables de una de las formas más graves del síndrome de Leigh (LS), una afección neurodegenerativa hereditaria que se caracteriza por un mal pronóstico, ya que los pacientes suelen morir antes de los 3 años de edad. El NDUFS4 es una subunidad del complejo I de la CRM codificada por ADN nuclear ubicada en el dominio de la NADH-deshidrogenasa del complejo, responsable de su actividad catalítica (Breuer y col., 2013; Stroud y col., 2016; Zhu y col., 2016). Los ratones con inactivación homocigótica delNdufs4desarrollan una encefalopatía grave parecida al LS que provoca la muerte entre 50 y 60 días posnatales (P) (Breuer y col., 2013; Kruse y col., 2008). Además, estos ratones también muestran un fenotipo de LHON caracterizado por una disfunción de las CGR que comienza desde el P16-P20 y conduce a una muerte detectable de las CGR después del P42 (Song y col., 2017; Yu y col., 2015), lo que convierte a la línea de desactivación delNdufs4en un buen modelo para estudiar el efecto de la inactivación del miR-181alb en la LHON. Al cruzar los ratonesmiR-181alb-1-l~con los ratonesNdufs4-l~,se obtuvieron animalesNdufs4~l~lmiR-181alb-1~l~para estudiar el efecto de la inactivación del miR-181alb en el fenotipo retiniano. Como se informó anteriormente (Yu y col., 2015), los ratonesNdufs4-l~mostraron una reducción significativa en el número de CGR al P55, como lo confirma el recuento de células positivas para NeuN (figura 5A, B, E). Esta reducción se rescató en las retinas deNdufs4~l-lmiR-181alb-1l- (figura 5C, E), en las que el número de células positivas para NeuN era indistinguible del de los ratones silvestres ymiR-181alb-1~l~(figura 5D, E). Además, la prueba OKR mostró una mejora significativa de la agudeza visual en los ratonesNdufs4~l-lmiR-181alb-1-l~en comparación con los ratonesNdufs4-l~(figura 5F) al P25, lo que indica un efecto notable de la regulación a la baja del miR-181alb tanto en la disfunción como en la muerte de las CGR. Por último, también se analizó la respuesta de ERG, que anteriormente se había informado que estaba alterada en ratonesNdufs4-l~debido a la ausencia de una respuesta de onda b (Kruse y col., 2008; Yu y col., 2015). Se observó una mejora significativa de la onda b (tanto en los rangos escotópicos como fotópicos) en los ratonesNdufs4~l~lmiR-181alb-l~l~con respecto a los ratonesNdufs4~l-(figura 5G-H), lo que indica una mejora significativa de la respuesta retiniana a los estímulos luminosos al día P30. En conjunto, estos resultados indican que en el modelo deNdufs4-l~del miR-181alb, la regulación a la baja evita que las CGR mueran y mejora la función visual antes de que los miARN ejerzan su actividad sobre la muerte de las CGR.

Para obtener más información sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la mejora del fenotipo retiniano deNdufs4-l~inducido por la inhibición del miR-181alb, se analizaron los niveles de expresión de las dianas del miR-181alb en los ratonesNdufs4~l~lmiR-181alb-1~l~,y se observó un aumento significativo de los transcritos deNrf1yPark2en comparación conNdufs4-l~(figura 6A). Como se mencionó anteriormente,Park2yNrf1son actores importantes en el control, respectivamente, de la mitofagia (Narendra y col., 2008) y la biogénesis mitocondrial (Finck y Kelly, 2006; Wu y col., 1999), es decir, vías que demostraron los inventores están reguladas al alza en ratonesmiR-181alb-1~lfrente a ratones silvestres (figura 1). Por lo tanto, los inventores plantearon la hipótesis de que la activación de estas vías contribuye significativamente a la mejora fenotípica observada en ratonesNdufs4-l~lmiR-181alb-1-l~.Notablemente, los niveles de Parkin y p62 aumentaron en las fracciones mitocondriales de los ratonesNdufs4-l~lmiR-181alb-1-l~con respecto a los ratonesNdufs4-l~(figura 6C, D), lo que indica una mayor activación de la mitofagia en respuesta al agotamiento del miR-181alb. Los estudios de microscopía electrónica (ME) mostraron una falta de acumulación de autofagosomas y autolisosomas que contenían material no digerido, excluyendo un posible bloqueo de la mitofagia a nivel del reclutamiento de autofagosomas o la fusión de autofagosomas y lisosomas (figura 7B). Además, en consonancia con la regulación al alza deNrf1,se observó mediante ME un aumento del número de mitocondrias tanto al P30 como al P55 en las CGR de los ratonesNdufs4~l-lmiR-181alb-1-l~con respecto a los ratonesN d u fs 4(figuras 7A-C). El aumento de la biogénesis mitocondrial también se confirmó mediante el aumento del ADNmt en ratonesNdufs4~l~lmiR-181alb-1~l~frente a ratonesNdufs4-l~,medido mediante q-PCR (figura 7D). Curiosamente, el aumento en el número de mitocondrias en las CGR de los ratonesNdufs4~limiR-181alb-1~l'estuvo acompañado de una mejora notable de su estructura morfológica, tal como un aumento del número de crestas y una matriz más densa en electrones, con respecto a los ratonesNdufs4-l~(figura 7A, B). En particular, la regulación a la baja de laNRF1suprimió significativamente el rescate mediado por el mir-181alb en las células SH-SY5Y tratadas con FCCP, lo que indica que, efectivamente, la NRF1 está implicada en el efecto neuroprotector ejercido por la regulación a la baja del miR-181alb (figura 6B). Finalmente, también se analizó la actividad bioquímica de los complejos I, II y IV de la CRM. Los últimos análisis mostraron un aumento en las actividades de los complejos I y II, y una tendencia similar en la actividad del complejo IV, normalizada a la actividad de la enzima citrato sintasa del ciclo de Krebs en los ratonesNdufs4-l-lmiR-181alb-1-l~en comparación con los ratonesNdufs4-l~al P30 (figura 7E), lo que indica que la regulación a la baja del miR-181 alb es parcialmente capaz de contrarrestar el defecto bioquímico del complejo I de la CRM en el ratónNdufs4-l-. En conjunto, estos datos indican que la regulación a la baja del miR-181alb ejerce su efecto protector principalmente mediante la estimulación simultánea de la mitofagia y la biogénesis mitocondrial, lo que conduce a una mejora del recambio mitocondrial en la retina y, en última instancia, a una mejora de los fenotipos morfológicos y bioquímicos mitocondriales.

Ejemplo 5

La inhibición del miR-181alb protege las neuronas dopaminérgicas en modelos de enfermedad de Parkinson inducida por 6-OHDA

Los miR-181alb se expresan significativamente en la sustancia negra (SN) y en el cuerpo estriado (Boudreau y col., 2014) (figura 10B) y anteriormente se demostró que están regulados al alza en el cerebro de los pacientes con EP. Se evaluó el efecto de la inactivación del miR-181alb en modelos de EP inducida por fármacos y generada en peces y ratones utilizando la neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). La 6-OHDA induce la muerte selectiva de las neuronas dopaminérgicas (DA) nigroestriatales en peces (Parng y col., 2007) y ratones (Jagmag y col., 2015) y se utiliza ampliamente para investigar las disfunciones motoras y bioquímicas en la EP. La expresión del miR-181a y el miR-181b en el cerebro se conserva en el pez medaka, con una fuerte señal en el locus coeruleus, donde se agrupan las neuronas DA de los teleósteos (Figura 8A). En las larvas del medaka de control, el tratamiento con 6-OHDA provocó la pérdida de aproximadamente el 30 % de las neuronas DA en ellocus coeruleus,como lo demuestran la inmunotinción y el recuento de la tirosina hidroxilasa (TH) (figura 8 B, C, E). Por el contrario, los animales a los que se les inyectó miR-181alb MO descritos en [39] (MO-miR-181a 5'-AACTCACCGACAGCGTTGAATGTTC-3') Id. de sec. n.° 111; MO-miR-181b 5'-AACCCACCGACAGCAATGAATGTTG-3' Id. de sec. n.° 112) estaban protegidos contra la toxicidad de la 6-OHDA y no mostraron diferencias significativas en el número de células positivas para TH en comparación con los controles no tratados (figura 8 B, D, E).

Además, se analizó un modelo de EP de ratón generado mediante inyección estereotáxica de 6-OHDA. Según los datos publicados (Jagmag y col., 2015), la inyección unilateral de 6-OHDA en el SN de ratonesmiR-181alb-1+l+provocó una destrucción masiva de las neuronas DA (figura 9A) y sus terminales en el cuerpo estriado (figura 9C), en comparación con el lado de control donde se inyectó solución salina, como lo muestran la inmunotinción y el recuento de células positivas para TH (figura 9 A, C, E). Curiosamente, los ratonesmiR-181alb-tl~mostraron una mayor supervivencia de las neuronas DA en el lado donde se inyectó 6-OHDA (figura 9 B, D, E). La rotación contralateral inducida por L-dopa es la lectura más ampliamente utilizada de la degeneración neuronal de la DA nigral y estriatal en roedores a los que se les inyectó unilateralmente 6-OHDA (De Leonibus, 2009). Los ratonesmiR-181a /b-1 -/-tratados con 6-OHDA a los que se les inyectó L-dopa mostraron un comportamiento rotacional más bajo en comparación con los ratonesmiR-181alb-1+l+,confirmando de este modo un grado reducido de denervación en los animalesmiR-181alb-1~l~(figura 9F). Notablemente, de manera similar a lo observado en la retina, la ablación del miR-181alb-1 en sí no causó ninguna anomalía morfológica evidente en el SN, como lo demuestra la tinción de NISSL (figura 9E).

En conjunto, los datos actuales indican que la regulación a la baja del miR-181alb mejora el fenotipo de los modelos preclínicos de la EP al proteger las neuronas DA de la muerte inducida por la 6-OHDA en peces medaka y ratones.

Ejemplo 6

Inhibición del miR-181 alb en la degeneración macular asociada a la edad

La disfunción mitocondrial se ha implicado en la fisiopatología de varias enfermedades asociadas a la edad, incluida la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una enfermedad degenerativa compleja y multifactorial. El deterioro de la visión en la DMAE es el resultado del daño a los fotorreceptores, pero el evento patógeno primario es la degeneración del epitelio pigmentario de la retina (EPR). En la DMA<e>, se ha planteado la hipótesis de que la acumulación en el EPR de lipofuscina, un producto del recambio de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF), es la causa primaria de la enfermedad, ya que conduce a la disfunción del EPR y a la apoptosis a través de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Cada vez hay más pruebas que indican que la alteración de la autofagia y la disfunción mitocondrial, tanto en el EPR como en los fotorreceptores, agravan el estrés oxidativo y contribuyen a la patogénesis de la DMAE. Los inventores probaron la eficacia de la inhibición del miR-181a/b para mejorar el fenotipo de la DMAE. En particular, se utilizó un modelo in vitro de DMAE que consistía en la línea celular ARPE-19 (EPR) cargada con lipofuscina (A2E). La acumulación de A2E en ARPE-19 podría medirse mediante la cuantificación de la autofluorescencia. Las células ARPE-19 se transfectaron con oligonucleótidos antisentido de ácido nucleico bloqueado (LNA), que inhiben la actividad del miR-181, y se compararon con las muestras de control. Dos días después de la transfección, las células de control y las transfectadas LNA-miR-181 se cargaron con 100 pM de A2E durante 6 horas (figura 16A). La inhibición del miR-181 reduce la autofluorescencia del A2E en aproximadamente un 50 %, lo que sugiere una disminución de la acumulación de lipofuscina en comparación con las células de control, cuantificada en el gráfico (media de intensidad de A2E, figura 16B). Además, la regulación a la baja del miR-181 condujo a una disminución de la intensidad de la mancha de A2E y del área de la mancha de A2E en comparación con las células de control (figura 16B), lo que sugiere que la inhibición del miR-181 conduce a una mejora de la patología retiniana relacionada con la acumulación de lipofuscina.

La DMAE es causada principalmente por factores ambientales y de estilo de vida, pero también por factores genéticos, tales como el polimorfismo en elABCA4,que aumentan el riesgo de DMAE. Las mutaciones recesivas en el genABCA4son responsables de la enfermedad de Stargardt, una distrofia macular caracterizada por la acumulación de lipofuscina, una afección que se encuentra comúnmente en la DMAE. Por lo tanto, el modelo de ratónAbca4-1-se considera un modelo in vivo adecuado para la evaluación de las estrategias terapéuticas de la DMAE. El inventor probó el efecto de la regulación a la baja del miR-181a/b al cruzar el ratónAbca4-/-con el ratónmiR-181a/b-1-/-.Curiosamente, en el EPR del ratónAbca4~l~/miR-181a/b-1~l~se observaron niveles aumentados de ARNm diana del miR-181a/b, así como deSod1yCat1,que codifican la proteína antioxidante (figura 17A). Los ratonesAbca4-/-presentan una marcada acumulación de A2E en el EPR y en los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF), lo que parece desempeñar un papel clave en la fisiopatología de las enfermedades de la retina. Los niveles de autofluorescencia de la lipofuscina (excitación: 560 ± 40 nm; emisión: 645 ± 75) se evaluaron en criosecciones retinianas (tanto en el EPR solo como en los SEF). Curiosamente, los datos preliminares en ratones de 5 meses de edad muestran una disminución de la autofluorescencia (AF) de la lipofuscina en el EPR y los SEF de ratonesAbca4~ l~/miR-181a/b-1~l~en comparación con los ratones Abca4 -/- (Fig.17B, C).

Ejemplo 7

Inhibición del miR-181 en la retinitis pigmentosa

Las mutaciones en el gen de la rodopsina son una causa de retinitis pigmentosa (RP) dominante y recesiva, y representan aproximadamente el 10 % de todos los casos. Por lo tanto, los mutantes dominantes de la rodopsina son mutantes con ganancia de función o mutantes dominantes negativos. Se definieron varias clases:

- de clase I, son como la rodopsina silvestre (wt) en su capacidad para localizarse en la membrana citoplasmática y unirse al 11-cis-retinaldehído para formar rodopsina espectralmente activa. Las mutaciones que afectan a la señal de direccionamiento ciliar, VXPX, están mal localizadas, incluso en la sinapsis, donde podrían inhibir la fusión de las vesículas sinápticas o activar de manera anormal la transducina;

- de clase II, son probablemente defectuosos en el plegamiento y/o estabilidad de las proteínas, se acumulan de forma anormal en el retículo endoplásmico rugoso, no se transportan eficazmente a la membrana citoplasmática y no logran unirse al 11-cisretinaldehído para formar un fotopigmento espectralmente activo;

- de clase III, activan constitutivamente la transducina.

Entre los mutantes de clase I están los que afectan a la prolina-347 cerca del extremo carboxilo-terminal. Este residuo se conserva entre todos los pigmentos visuales conocidos. Se han identificado seis mutaciones diferentes sin sentido que afectan a este residuo entre los pacientes con RP, lo que indica que la prolina-347 media en alguna función vital de la rodopsina.

Los ratones transgénicos que portan una mutación de la prolina-347 humana a serina (P347S) (ref. PMID:8943080) desarrollan una degeneración de los fotorreceptores. A la edad de un mes (P30), la capa fotorreceptora ya se ha reducido drásticamente y, a los tres meses (P90), solo una fila de cuerpos de células fotorreceptoras está presente en la retina P347S. De manera concordante, la respuesta del electrorretinograma (ERG) se reduce drásticamente al P30 y es casi nula al P90.

Los inventores cruzaron los animales transgénicos P347S con animales heterocigotos miR-181a/b-1. La retina de los ratones transgénicos P347S se comparó con la retina de los ratones P347S/miR-181a/b /- de la misma camada. Los ratones se caracterizaron al P30 y P90 con la prueba de ERG y mediante análisis histológico y molecular.

La respuesta de ERG (onda b) de la retina de P347S/miR-181a/b /- en comparación con la retina de P347S al P30 es significativamente mayor, como se muestra en la figura 18 (N = 16). La respuesta fotópica, debido a la funcionalidad de los conos, muestra un menor aumento. En consecuencia, la tinción de inmunofluorescencia (IF) para dos marcadores principales de bastones (rodoposina, Rod) y conos (C-arrestina, C-arr), respectivamente, mostró niveles aumentados de tinción para rodopsina y no hubo diferencias en la tinción para C-arrestina (figura 19A), a pesar de que el grosor de la capa nuclear externa (CNE) no mostró diferencias (figura 19B). El aumento de los niveles de rodopsina, así como de otros marcadores fotorreceptores, también se confirmó mediante el análisis por qRT-PCR descrito en la figura 19C. Además, al P30, los inventores también observaron una mejora de la longitud del segmento externo (SE), cuantificada en el gráfico mostrado en la figura 20.

Al P90, la respuesta de ERG de los animales P347S/miR-181a/b /- sigue siendo significativamente mayor en comparación con los animales P347S (figura 21). La tinción de IF para Rod y C-arr mostró niveles aumentados de ambos marcadores al P90 (figura 22) y las secciones histológicas revelan que la CNE de P347S/miR-181a/b+/- está constituida por más de una fila de cuerpos celulares fotorreceptores; la diferencia en comparación con la CNE de P347S se indica en el gráfico de la figura 22B. El aumento de los niveles de rodopsina y C-arrestina, así como de otros marcadores fotorreceptores, también se analizaron mediante el análisis por qRT-PCR descrito en la figura 22C.

Los datos del transcriptoma del modelo de ratón P347S (figura 23A), que revelaron que en el modelo de ratón P347S hay una fuerte regulación a la baja de los genes y vías relacionados con las mitocondrias, además de los datos que muestran cómo el miR-181a/b puede regular las vías relacionadas con las mitocondrias, llevaron a los inventores a analizar el fenotipo mitocondrial en ratones P347S que albergan una deleción heterocigótica del grupo genómico del miR-181a/b-1.

Para entender cómo la regulación a la baja del miR-181a/b mejora el fenotipo retiniano de los ratones P347S, los inventores verificaron si las dianas validadas del miR-181a/b estaban reguladas al alza en las retinas de los ratones P347S/miR-181a/b+A en comparación con el modelo P347S. El análisis molecular se realizó mediante qRT-PCR (figura 23B) en las siguientes dianas validadas del miR-181a/b:PpargclayNrf1,que participan en la biogénesis mitocondrial;Cox11yCoq10b,que son componentes de la cadena respiratoria mitocondrial;Prdx3,que codifica una proteína con función antioxidante,Erk2, Atg5yPark2,que participan en la regulación de la vía de autofagia/mitofagia;Xiap,que desempeña un papel crucial en la regulación de la muerte celular mediada por las mitocondrias;Bcl2yMcl1,que son genes antiapoptóticos y que promueven la supervivencia. Los inventores encontraron una regulación al alza de todas las dianas:Cox11, Erk2, Mcl1, Bcl2, Nrf1, Coq10b, Xiap, Ppargcla, Park2yPrdx3,exceptoAtg5.Todos estos datos en conjunto sugieren que la regulación al alza de los genes diana del miR-181a/b anteriores puede, en principio, contribuir a la protección de la RP observada en los ratones P347S/miR-181a/b+A

Para obtener más información sobre el efecto protector ejercido por el agotamiento del grupo 1 del miR-181a/b en ratones P347S, los inventores realizaron un ensayo de muerte celular. Como se mostró anteriormente, el miR-181a/b se dirige a varios genes antiapoptóticos y que promueven la supervivencia. En primer lugar, realizaron la inmunofluorescencia en retinas congeladas para detectar el anticuerpo anti-caspasa 3 activa en ratones P347S y P347S/miR-181a/b+A (figura 24A). La caspasa-3 se activa en las células apoptóticas tanto por vías extrínsecas (ligando de muerte) como intrínsecas (mitocondriales). Esta proteína existe como una proenzima inactiva que se somete a un procesamiento proteolítico para producir una enzima activa que desempeña un papel importante en la vía apoptótica. Como revelan el ensayo de inmunofluorescencia y su cuantificación (figura 24B), en el modelo de ratón P347S/miR-181a/b+/_ hay una reducción significativa de las células positivas al anticuerpo anti-caspasa 3 activa, lo que indica que la regulación a la baja del miR-181a/b protege efectivamente a las células de la apoptosis. Además, los inventores confirmaron los datos utilizando un marcador adicional de muerte celular, el ensayo TUNEL-POD. El etiquetado de extremos mellados con dUTP mediante desoxinucleotidil transferasa termina (TUNEL) es un método para detectar la fragmentación del ADN mediante el etiquetado de los extremos 3'-hidroxilo. El sello distintivo de la muerte celular es la degradación del ADN. La escisión del ADN puede producir roturas (mellas) del ADN bicatenario y monocatenario. Ambos tipos de roturas se pueden detectar mediante el etiquetado de los extremos 3'-OH libres con nucleótidos modificados (p. ej., biotina-dUTP, fluoresceína-dUTP) en una reacción enzimática. La enzima desoxirribonucleotidil transferasa terminal (TdT) cataliza la polimerización independiente de la plantilla de desoxirribonucleótidos en el extremo 3' del ADN monocatenario y bicatenario. Con esta técnica, es posible detectar todos los tipos de muerte celular independientemente del mecanismo. Como se muestra en la figura 25 A, en la que las células muertas están resaltadas en gris oscuro y se indican con flechas, y se cuantifican en la figura 25B, hay una fuerte reducción de células muertas en las retinas de los ratones P347S/miR-181a/b+/' frente a los ratones P347S.

Todos estos datos juntos muestran que el agotamiento del grupo 1 del miR-181a/b protege a las células de la muerte en los ratones P347S.

Según los datos del transcriptoma (figura 23A), la microscopía electrónica de transmisión (MET) reveló que en el modelo de ratón P347S existe un fenotipo mitocondrial caracterizado por mitocondrias más pequeñas y fragmentadas (figura 26A).

Mediante el análisis de MET, la retina de los ratones P347S/miR-181+/' mostró una mejor estructura en comparación con la de los ratones P347S/miR-181+/+. El SE en los ratones P347S/miR-181+/+ se destruye por completo, mientras que en los animales P347S/miR-181, tanto el SE como el SI están mejor organizados y empaquetados (figura 26A). Además, la diferencia en la morfología mitocondrial entre los dos modelos es sorprendente. En las retinas de P347S, las mitocondrias están fragmentadas y son muy pequeñas. Por el contrario, en los animales P347S/miR-181+/-, las mitocondrias son más alargadas y tienen una mejor morfología (figura 26A, cuantificada en el gráfico de la figura 26B), lo que es coherente con todos los datos anteriores que indican la participación del miR-181 en la funcionalidad mitocondrial.

La mejora fenotípica relacionada con las mitocondrias se investigó más a fondo mediante transferencia Western. Los inventores analizaron los niveles de proteína de la Mfn2 (mitofusina), una GTPasa ubicada en la membrana mitocondrial externa (figura 27A). La Mfn2 es una proteína implicada en la fusión mitocondrial. Dentro de la célula, las mitocondrias existen en un estado dinámico en constante cambio, alargándose y dividiéndose constantemente (fusión y fisión, respectivamente). La fisión desempeña un papel en la segregación de las mitocondrias disfuncionales mientras que, por otro lado, se ha demostrado que la fusión ayuda a equilibrar los metabolitos de la matriz y el ADNmt intacto. Ciertas mitocondrias dañadas pueden fusionarse con otras mitocondrias sanas en un intento de rescatar las dañadas. Se cree que el equilibrio de estos dos eventos es esencial para la homeostasis mitocondrial, la estabilidad celular y la supervivencia celular. En particular, la fusión mitocondrial está mediada por tres GTPasas diferentes, incluida la Mfn2. El análisis por transferencia Western reveló una tendencia hacia un aumento de los niveles de proteína Mfn2 en los ratones p347S/miR-181a/b+/- en comparación con los ratones P347S. Resulta tentador especular que la regulación al alza de la Mfn2 podría estar implicada en la mejora de la morfología mitocondrial visible mediante la MET en las retinas de los ratones P347S/miR181-a/b+/+. Los inventores también realizaron un análisis de la OXPHOS mediante transferencia Western para analizar la CRM (figura 27B). Este procedimiento se basa en una transferencia Western en la que se utilizan simultáneamente anticuerpos contra antígenos específicos de los cinco complejos de la cadena mitocondrial. Se observó una regulación a la baja de estas proteínas en el modelo de ratón P347<s>con respecto a los ojos de los ratones silvestres. En el modelo P347S/miR-181a/b+/', se detectó un importante rescate de los niveles de proteína. Además, se encontró una regulación al alza de los niveles de proteína para el marcador mitocondrial general citrato sintasa (Cs), una enzima implicada en el primer paso del ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs) (figura 27C). Esta proteína está localizada en la matriz mitocondrial y puede proporcionar una indicación de un aumento de la masa mitocondrial en los ojos de P347S/miR-181a/b+/- con respecto a los ojos de P347S. Los datos se cuantifican en el gráfico de la figura 27D.

Ejemplo 8

Validación experimental in vitro de la eficacia de la esponja de miR-181

Se generaron vectores AAV (serotipo 2) que expresaban un constructo de “ esponja” para la inhibición del miR-181 (ver la secuencia de esponja de miR-181 más arriba) bajo el control del promotor constitutivo del citomegalovirus (CMV) (AAV.CMV.miR-181.esponja). Se ha informado previamente que el serotipo AAV2 transduce eficazmente las CGR en varias especies, incluidos ratones y primates no humanos, tras la administración intravítrea (Koilkonda y col., 2014a; Koilkonda y col., 2014b; Kwong y col., 2015; Tshilenge y col., 2016). Este serotipo AAV lo utilizan habitualmente los investigadores que participan en la terapia génica para enfermedades de la retina (Botta y col., 2016; Maguire y col., 2009; Maguire y col., 2008; Mussolino y col., 2011). Las esponjas del miARN son moléculas de ARN con secuencias antisentido del miARN repetidas en tándem (sitios de unión al miARN (MBS) que pueden apartar los miARN de sus dianas endógenas y son herramientas valiosas para lograr la pérdida a largo plazo de la función del miARN in vivo (Ebert y Sharp, 2010). Las esponjas del miARN se han aplicado con éxito en modelos animales (Ebert y Sharp, 2010; Tay y col., 2015). El diseño de la esponja se llevó a cabo según Ebert y col., 2007; Gentner y col., 2009; Kluiver y col., 2012. En resumen, los inventores diseñaron 6 MBS antisentido para miARN181a y 6 MBS antisentido para miARN181b con un desajuste central (“ protuberancia” ) en la posición 9-12 de las secuencias del miR-181a o b. La protuberancia se creó cambiando los nucleótidos en la posición 9-12 para reducir las posibilidades de emparejamiento de bases (incluida la oscilación G-U). Los dos MBS estarán separados por una secuencia de 4 nt (“ espaciador” ). Los dúplex de oligonucleótidos de esponja (doble cadena) se clonaron en un vector que contenía un casete de expresión con una secuencia de esponja de unión al miARN insertada en la UTR 3' de un gen indicador de la GFP (Karali y col., 2011).

Análisis mediante qRT-PCR de los transcritos diana directos del miR-181a/b (XIAP, NRF1, PRDX3, MCL1, ATG5, SIRT1, BCL2, BCL2, ERK2, PARK2, COX11) en células SH-SY5Y tras una transfección de 48 h con la esponja AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181 (esponja 181). Los niveles de transcrito de las dianas del miR-181a/b aumentan en la muestra de la esponja 181 en comparación con la muestra de control (CTRL = células transfectadas con AAV2.1-CMV-eGFP, N = 3) (figura 28). Estos datos indican que la esponja de miR-181 está secuestrando el miR-181 endógeno, impidiendo de este modo la unión de sus dianas directas e inhibiendo su actividad.

Una de las vías moduladas por el miR-181a/b es la muerte celular dependiente de las mitocondrias, en la que la familia de proteínas Bcl-2 desempeña un papel regulador clave. Esta familia de proteínas controla la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP, por sus siglas en inglés), la formación de un canal de la membrana interna denominado poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (PTP) y la liberación del citocromo c y de otros desencadenantes apoptóticos (Rasola y Bernardi, 2007; Tait y Green, 2010). Aunque la contribución de la apoptosis a la patogénesis de las EM primarias no está establecida de manera unívoca, el aumento de los niveles de proteínas Bcl-2 antiapoptóticas puede representar una estrategia eficaz para prolongar la supervivencia celular y retrasar la progresión de la enfermedad. En particular, la inhibición de la MOMP y el PTP, ya sea mediante la sobreexpresión de la proteína Bcl-xl de la familia Bcl-2 o mediante el tratamiento con ciclosporina A (CsA), contrarrestó el aumento de la muerte celular y mejoró el fenotipo de un modelo de medaka de MLS con deficiencia de hccs (Indrieri y col., 2013). La importancia de la muerte celular dependiente de las mitocondrias en las enfermedades asociadas a la disfunción mitocondrial también ha quedado demostrada por el efecto positivo del tratamiento con CsA en pacientes con distrofia muscular congénita de Ullrich y miopatía de Bethlem (Merlini y col., 2008) y en modelos animales de EP (Tamburrino y col., 2015). En este caso, los inventores muestran que la inhibición del miR-181a/b conduce a niveles aumentados de miembros de la familia Bcl-2, tales como Bcl-2 y Mcl-1, y rescata el fenotipo en los dos modelos de MLS analizados. Además, el HA14-1, un potente inhibidor de las proteínas Bcl-2 (Wang y col., 2000b), suprime significativamente la mejora mediada por el miR-181a/b del fenotipo de MLS en el modelo defectuoso en el hccs, pero no en el modelo defectuoso en el cox7b. Estos datos indican que una sola vía, p. ej., la muerte celular dependiente de las mitocondrias y su modulación, pueden tener diferentes efectos sobre las formas de EM altamente relacionadas, según el defecto genético subyacente. Además, esta observación refuerza la hipótesis de los inventores de que actuar simultáneamente en más de una vía representa una estrategia más eficaz para tratar las EM genéticamente heterogéneas.

Se ha demostrado que el aumento de la autofagia y la mitofagia ejerce efectos protectores en diferentes enfermedades neurodegenerativas, incluida la EP (Decressac y col., 2013; Martínez-Vicente, 2017). Cabe destacar que dos productos genéticos mutados en las formas familiares de inicio temprano de la EP, es decir, el Parkin y el PINK1, participan en la depuración de las mitocondrias dañadas a través de la vía de la autofagia (Geisler y col., 2010; Vives-Bauza y col., 2010). Además, el tratamiento con rapamicina, un inhibidor de mTOR, que activa la autofagia, retrasó significativamente tanto la progresión de la neurodegeneración como el desenlace fatal del ratón Ndufs4'/_, un modelo del síndrome de Leigh, una de las formas más graves de EM (Johnson y col., 2013). En este caso, los inventores muestran que la regulación a la baja del miR-181a/b conduce a un aumento de la autofagia y la mitofagia en el SNC. Según estos datos, la inhibición de la autofagia general tanto en los embriones hccs/miR-181a/b-MO como en los cox7B/miR-181a/b-MO reduce el efecto neuroprotector de la regulación a la baja del miR-181a/b sobre el fenotipo de la MLS, lo que indica que el aumento de la autofagia/mitofagia contribuye significativamente al rescate fenotípico en ambos modelos.

Si bien la eliminación de las mitocondrias disfuncionales limitaría el riesgo de apoptosis, una activación descontrolada de la mitofagia sin una biogénesis mitocondrial compensatoria adecuada puede contribuir a una mayor disfunción mitocondrial, lo que lleva a la pérdida de masa mitocondrial, el colapso energético y la muerte celular (Villanueva Paz y col., 2016; Zhu y col., 2013). Además, la biogénesis mitocondrial mejorada podría tener per se un efecto protector en las EM. De hecho, la variabilidad en el contenido del ADN mitocondrial y la biogénesis mitocondrial se ha asociado con una penetrancia incompleta en los portadores no manifestados de LHON (Giordano y col., 2014), y se ha descubierto que el aumento en la biogénesis mejora el fenotipo de diferentes modelos de EM in vitro e in vivo (Komen y Thorburn, 2014). Sin embargo, algunos resultados discrepantes y contradictorios obtenidos con compuestos que desencadenan la biogénesis mitocondrial (incluidos el bezafibrato, el resveratrol y el AICAR) (Komen y Thorburn, 2014) indican claramente que se necesita más trabajo para utilizar eficazmente la modulación de la biogénesis mitocondrial a fin de aumentar la funcionalidad mitocondrial en los pacientes. El estrecho equilibrio entre la mitofagia y la biogénesis mitocondrial se perfila como un aspecto crítico en la determinación de la viabilidad celular en las enfermedades caracterizadas por la disfunción mitocondrial (Zhu y col., 2013). En este caso, los inventores muestran que el miR-181a/b puede controlar simultáneamente ambos procesos. Paralelamente al aumento de la mitofagia observado tras la inactivación del miR-181a/b, los inventores también observaron mayores niveles de varias proteínas mitocondriales y de ADNmt, lo que indica un aumento de la biogénesis mitocondrial. En consecuencia, los animales con disminución del miR-181a/B mostraron una actividad mejorada del complejo I de la CRM y preservaron la integridad mitocondrial en el modelo de LHON inducido por rotenona. En conjunto, los inventores demuestran que los miR-181 a/b representan nuevos controladores del recambio mitocondrial y esta actividad puede desempeñar un papel clave en la neuroprotección.

Las EM son un grupo de trastornos genéticamente heterogéneos. Si bien cada trastorno individual es poco frecuente, se estima que la prevalencia total combinada de EM en adultos es de aproximadamente 1 en 4300, lo que las convierte en uno de los grupos más prevalentes de enfermedades neurológicas hereditarias (Gorman y col., 2015). En este estudio, los inventores demuestran que la regulación a la baja del miR-181a/b ejerce un efecto neuroprotector en múltiples modelos de EM. Nuestros resultados son de particular interés para afecciones genéticamente heterogéneas, como la LHON, para las que es muy deseable una estrategia terapéutica independiente de los genes. Además, los datos de prueba de principio que los inventores generaron en modelosin vivode EP destacan al miR-181a/b como nuevas posibles dianas terapéuticas para esta enfermedad.

Cabe señalar que los ratonesm iR -181a /b -1muestran una esperanza de vida normal (Henao-Mejia y col., 2013) y no presentan anomalías evidentes en el cerebro ni los ojos, lo que proporciona evidencia inicial la seguridad de la regulación a la baja de estos dos miARN en el SNC. La modulación del miR-181a/b en el SNC representa una estrategia prometedora para el tratamiento de una serie de trastornos neurodegenerativos raros y comunes asociados con la disfunción mitocondrial primaria o secundaria que, en conjunto, representan una carga importante para la salud pública.

Referencias

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Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   i .Un inhibidor del miR-181 para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno mitocondrial seleccionado del grupo que consiste en: síndrome de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF), oftalmoplejía externa progresiva (PEO), síndrome de Pearson, miopatía y miocardiopatía de herencia materna (MiMyCA), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, ataxia de Friedreich, paraplejía espástica hereditaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad neurodegenerativa esporádica relacionada con la edad, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad neurodegenerativa familiar, EP familiar, EA familiar, enfermedad de Huntington, retinitis pigmentosa (RP) y enfermedad de Stargardt, siendo dicho inhibidor un agente de ácido nucleico inhibidor que comprende al menos una secuencia complementaria al miR-181, en donde dicho inhibidor comprende una secuencia complementaria a ACAUUCA (Id. de sec. n.° 5).
2. 2. El inhibidor del miR-181 para utilizar según la reivindicación 1, en donde dicho miR-181 es un precursor de miR-181 o un miR-181 maduro, preferiblemente dicho miR-181 se selecciona del grupo que consiste en miR-181 a-1, miR-181a-2, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c y miR-181d o una combinación de los mismos.
3. 3. El inhibidor del miR-181 para utilizar según las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho inhibidor comprende una secuencia complementaria a ACAUUCA (Id. de sec. n.° 5) y tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria a la Id. de sec. n.° 1 o la Id. de sec. n.° 2 o la Id. de sec. n.° 3 o la Id. de sec. n.° 4.
4. 4. El inhibidor del miR-181 para utilizar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho inhibidor tiene una longitud de 18 a 21 nucleótidos.
5. 5. El inhibidor del miR-181 para utilizar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia comprende además uno o más nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) y uno o más nucleótidos no bloqueados, en donde al menos uno de los nucleótidos no bloqueados comprende una modificación química, preferiblemente los nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) tienen un puente de metileno en 2' a 4', preferiblemente la modificación química es una modificación de O-alquilo en 2' o halo en 2'.
6. 6. El inhibidor del miR-181 para utilizar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho inhibidor consiste en una secuencia seleccionada de: Id. de sec. n.° 6, Id. de sec. n.° 7, Id. de sec. n.° 8, Id. de sec. n.° 9, Id. de sec. n.° 10, Id. de sec. n.° 11, Id. de sec. n.° 12 o Id. de sec. n.° 13.
7. 7. El inhibidor del miR-181 para utilizar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho inhibidor del miR-181 se utiliza con al menos un agente adicional, preferiblemente dicho al menos un agente adicional es un inhibidor del miR-181 según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferiblemente dicho al menos un agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: un agente que aumenta la biogénesis mitocondrial, un agente que modula la autofagia, un agente que inhibe la apoptosis, un eliminador de ROS, un agente que cambia la heteroplasmia, un eliminador de compuestos tóxicos, un suplemento de nucleótidos, un agente que reemplaza el gen faltante, preferiblemente dicho inhibidor del miR-181 y dicho al menos un agente adicional se administran de forma secuencial o simultánea.
8. 8. Una composición farmacéutica que comprende al menos un inhibidor del miR-181 según se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno mitocondrial seleccionado del grupo que consiste en: síndrome de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF), oftalmoplejía externa progresiva (PEO), síndrome de Pearson, miopatía y miocardiopatía de herencia materna (MiMyCA), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, ataxia de Friedreich, paraplejía espástica hereditaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad neurodegenerativa esporádica relacionada con la edad, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad neurodegenerativa familiar, EP familiar, EA familiar, enfermedad de Huntington, retinitis pigmentosa (RP) y enfermedad de Stargardt, preferiblemente la composición comprende además al menos un agente adicional, preferiblemente dicho agente adicional es un inhibidor del miR-181 según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferiblemente dicho al menos un agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: un agente que aumenta la biogénesis mitocondrial, un agente que modula la autofagia, un agente que inhibe la apoptosis, un eliminador de ROS, un agente que cambia la heteroplasmia, un eliminador de compuestos tóxicos, un suplemento de nucleótidos, un agente que reemplaza el gen faltante.

   Un vector para utilizar en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno mitocondrial seleccionado del grupo que consiste en: síndrome de Leigh, neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), síndrome de miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y accidente cerebrovascular (MELAS), epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas irregulares (MERRF), oftalmoplejía externa progresiva (PEO), síndrome de Pearson, miopatía y miocardiopatía de herencia materna (MiMyCA), neuropatía óptica de Kjer, neuropatía ataxia y retinitis pigmentosa (NARP), atrofia óptica autosómica dominante, síndrome de Kearns-Sayre, ataxia de Friedreich, paraplejía espástica hereditaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad neurodegenerativa esporádica relacionada con la edad, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad neurodegenerativa familiar, EP familiar, EA familiar, enfermedad de Huntington, retinitis pigmentosa (RP) y enfermedad de Stargardt, en donde el vector comprende al menos un inhibidor del miR-181 según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una secuencia promotora, preferiblemente el vector es un vector viral, preferiblemente un vector viral adenoasociado.

   El vector para utilizar según la reivindicación 9, que tiene la Id. de sec. n.° 14.