ES2992014T3

ES2992014T3 - CD59 para inhibir la activación del inflamasoma

Info

Publication number: ES2992014T3
Application number: ES19711181T
Authority: ES
Inventors: Rajendra Kumar-Singh; Binit Kumar; Siobhan M Cashman
Original assignee: Tufts University
Current assignee: Tufts University
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2024-12-05
Anticipated expiration: 2039-02-11
Also published as: CN112203677A; US20210052743A1; EP4442320A2; CA3090997A1; AU2025205643A1; EP4442320A3; JP2024038469A; IL308516A; IL276641A; IL308516B1; IL276641B1; JP2025108428A; JP7430394B2; MX2020008457A; WO2019157447A1; AU2019216975A1; IL276641B2; EP3752176A1; JP2021512932A; AU2019216975B2

Abstract

Se proporcionan métodos y kits para inhibir la activación del inflamasoma en células de un sujeto o un ojo afectado por la inflamación en un sujeto administrando al sujeto una composición que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células o el ojo afectado por la inflamación o una proteína CD59 soluble, inhibiendo la composición la activación del inflamasoma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

CD59 para inhibir la activación del inflamasoma

Antecedentes

El complemento es un componente crítico del sistema inmune innato y su papel se ha descrito en diversas enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades autoinmunes, cáncer, lesión por isquemia/reperfusión, entre otras (Morgan, B. P, et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877). Un papel del complemento también se ha descrito previamente en el modelo experimental de la uveítis autoinmune (EAU) (An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol.159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394; Zhang, L., et al. (2016) J. Leukoc. Biol. 99, 447-454). Se sabe poco sobre los mecanismos que conectan la activación del complemento con la patología mediada por células T en la EAU. La activación del complemento termina con el ensamblaje del complejo de ataque a membrana (MAC) en la membrana de las células, lo que resulta en la formación de un poro. A nivel sublítico, la formación del poro facilita el intercambio de iones a través de la membrana plasmática y la liberación de citocinas. Como resultado, la deposición del MAC conduce a la lisis celular. El papel del MAC en la fisiopatología de la EAU aún no se ha determinado. Se sabe que la entrada de Ca2+ en la célula después de la deposición del MAC activa el inflamasoma NLRP3 en las células epiteliales primarias del pulmón humano (Triantafilou, K., et al. (2013) J. Cell Sci. 126, 2903-2913).

El inflamasoma NLRP3 se ha implicado en diversos trastornos inflamatorios, incluyendo degeneración macular relacionada con la edad, cardiomiopatía, artritis, enfermedad renal crónica, enfermedades neurodegenerativas, etc. (Amin, J., et al. (2017) Brain pathol. 27, 192-204). La administración del lipopolisacárido (LPS) en ratones conduce a la maduración de IL-1p asociada al MAC (Laudisi, F., et al. (2013) J. Inmunol. 191, 1006-1010). Aunque el inflamasoma está altamente regulado por el complemento y es necesario durante la resolución de la lesión del tejido o enfermedad, el inflamasoma no regulado puede conducir a una inflamación grave y daño a los tejidos del hospedero (Latz, E., et al. (2013) Nat. Rev. Immunol. 13, 397-411). La activación del inflamasoma NLRP3 está controlada por un proceso de dos pasos que requiere una señal cebadora inicial la cual implica una expresión aumentada de la proteína NLRP3 y una señal de activación subsecuente necesaria para la formación del complejo proteico del inflamasoma que da como resultado la escisión mediada por caspasa-1 de pro-IL-1 p en IL-1p madura (Broz, P, et al. (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420). La expresión no regulada de IL-1p puede conducir al desarrollo de enfermedades autoinmunes y autoinflamatorias, incluyendo enfermedad de Behcet, enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, enfermedades reumáticas, enfermedad tiroidea autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, gota, fiebre mediterránea familiar y síndromes periódicos asociados a criopirina. (Dinarello, C. A., et al. (2013) Semin. Immunol. 25, 469-484; Gabay, C., et al. (2010) Nat. Rev. Rheumatol. 6, 232-241; Jesus, A. A., et al. (2014) Annu. Rev. Med. 65, 223 244). Adicionalmente, se ha establecido que IL-1 p es secretada activamente en la retina por las células mieloides, lo que indica un papel patogénico potencial de la señalización de IL-1R en la EAU (Wan, C. K., et al. (2016) J. Immunol. 196, 543-546). Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos detallados de cómo se regula IL-1p en la EAU sigue siendo difícil de alcanzar.

La uveítis es un trastorno inflamatorio ocular crónico de las capas uveal y retinal del ojo, responsable por alrededor del 10% a alrededor del 15% de la ceguera total en los EE.UU. (Durrani, 0. M., et al. (2004) Ophthalmologica 218, 223-236). La uveítis se clasifica como infecciosa si un agente biológico externo desencadena una respuesta inmune o no infecciosa si se desencadena una reacción autoinmune. El tratamiento clínico de la uveítis ha sido mediante el uso de corticosteroides, fármacos inmunosupresores o anticuerpos monoclonales, sin embargo, estas aproximaciones tienen un éxito limitado y están asociadas con efectos secundarios significativos (Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268; Prete, M., et al. (2016) Clin. Exp. Med. 16, 125-136). Por lo tanto, existe una necesidad clínica no satisfecha para desarrollar terapias eficaces para la uveítis.

Sumario

En la presente memoria se describen métodos, composiciones y kits para tratar a individuos que padecen trastornos relacionados con el inflamasoma con una proteína CD59 independiente de la membrana (soluble). La proteína CD59 independiente de la membrana se puede expresar mediante de un ácido nucleico administrado o mediante la administración directa de la proteína. Se contemplan ácidos nucleicos que codifican para una proteína CD59 independiente de la membrana o una composición de la misma para uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con el inflamasoma. También se contempla una proteína CD59 independiente de la membrana o una composición de la misma para uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con el inflamasoma. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con el inflamasoma está en el ojo de un sujeto. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con el inflamasoma comprende una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de VogtKoyanagi-Harada, una oftalmía simpática y una sarcoidosis. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con el inflamasoma comprende una uveítis. Las proteínas o ácidos nucleicos que codifican para la CD59 soluble/independiente de la membrana se pueden administrar a un sujeto que haya mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones los resultados positivos están en un ojo del sujeto. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALp), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3).

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos subsecuentes de esta descripción deben de interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Se divulga en la presente memoria un método para inhibir la activación del inflamasoma en células de un ojo afectado por la inflamación en un sujeto, incluyendo el método, administrar al sujeto una composición que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del ojo afectado por la inflamación, inhibiendo la composición la activación del inflamasoma. El término "independiente de la membrana" como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de aminoácidos de CD59 que carece de un anclaje de GPI o tiene un anclaje de GPI modificado que carece de función y capacidad para unirse a una membrana celular o una estructura asociada a la membrana celular, como una proteína unida a la membrana. Una realización del método prevé que la CD59 independiente de la membrana inhiba la activación del inflamasoma independientemente de la función del MAC.

En una realización del método, la composición inhibe la activación del inflamasoma independientemente de la función del complejo de ataque a membrana (MAC). En una realización del método, el sujeto tiene al menos una afección seleccionada de: una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, una retinopatía diabética, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una psoriasis, una anemia hemolítica inmune, una púrpura trombocitopénica, una enfermedad de Alzheimer, una esclerosis múltiple, un infarto al miocardio, una enfermedad vascular aterosclerótica, una microvasculopatía, una tiroiditis, una enfermedad intestinal inflamatoria, una rechazo de injerto de órgano, una nefritis membranosa, una oftalmía simpática y una sarcoidosis.

En una realización del método, la uveítis es al menos una seleccionada de: uveítis anterior, uveítis intermedia, uveítis posterior y panuveítis. Una realización del método incluye adicionalmente la obtención de una muestra del sujeto. En una realización del método, la muestra es al menos una seleccionada de: lágrimas, sangre, orina, secreción ocular, flema y moco.

Una realización del método incluye adicionalmente, antes de la administración, medir en el ojo al menos una de una función de la retina del ojo y un marcador de actividad del inflamasoma. Una realización del método incluye adicionalmente, después de la administración, medir en el ojo al menos una de una función de la retina del ojo y un marcador de actividad del inflamasoma.

En una realización del método, el marcador de actividad del inflamasoma es al menos uno seleccionado de:

caspasa 1, caspasa 5, IL-1 p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y<c>D4+. En una realización del método, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En una realización del método, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3).

En una realización del método, la medición de la función de la retina o del marcador de actividad del inflamasoma incluye adicionalmente la realización de al menos un procedimiento seleccionado de: un examen ocular, una tomografía de coherencia óptica (OCT), una citología de impresión conjuntival (CIT), una RTPCR, una ELISA y una PCR.

Una realización del método incluye adicionalmente administrar la composición en una dosis suficiente para tratar la uveítis. Una realización del método incluye adicionalmente antes de la administración, diseñar la secuencia de nucleótidos en un vector viral. Una realización del método incluye adicionalmente administrar la secuencia de nucleótidos como un ácido nucleico desnudo.

En una realización del método, el vector viral es un genoma diseñado genéticamente de al menos un virus seleccionado del grupo que consiste de: un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes y un lentivirus. En una realización del método, el lentivirus es un retrovirus.

Una realización del método incluye adicionalmente el diseño de la proteína CD59 independiente de la membrana para tener al menos una mutación que resulte en la pérdida de la función de un dominio de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de la proteína CD59 traducida. Una realización del método incluye adicionalmente el diseño de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59 independiente de la membrana mediante la deleción de nucleótidos que codifican para la región del dominio de anclaje del glicosilfosfatidilinositol (GPI).

En una realización del método, la administración incluye adicionalmente inyectar la composición por vía ocular. En una realización del método, la administración incluye adicionalmente la aplicación tópica de la composición. En una realización del método, la inyección ocular se selecciona del grupo que consiste en inyección subretinal, inyección vítrea, inyección intraocular, inyección subconjuntival e inyección subtenoniana. En una realización del método, la inyección ocular incluye adicionalmente la administración a una capa externa del ojo.

Una realización del método incluye adicionalmente la administración de un agente terapéutico adicional al ojo. En algunas realizaciones del método, el agente terapéutico adicional es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: antitumoral, antiviral, antibacteriano, anti micobacteriano, antifúngico, anti proliferativo y anti apoptótico. En algunas realizaciones del método, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio, un agente vasopresor, un inhibidor de la colagenasa, un esteroide, un inhibidor de metaloproteinasa de matriz, un ascorbato, una angiotensina, una calreticulina, una tetraciclina, una fibronectina, un colágeno, una trombospondina, unos factores de crecimiento transformantes (TGF), un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), un factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), unos factores de crecimiento tipo insulina (IGFs), una proteína de unión a IGF (IGFBP), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor de diferenciación neu (NDF), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un EGF de unión a heparina (HBEGF), una trombospondina, un factor C de von Willebrand, una heparina, un sulfato de heparina y un ácido hialurónico.

La divulgación en la presente memoria proporciona un kit para inhibir una actividad de un inflamasoma en un ojo afectado por la inflamación en un sujeto, el kit incluye: una composición farmacéutica que incluye una proteína CD59 independiente de la membrana y/o una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59, de modo que la composición está en una dosis suficiente para inhibir el inflamasoma en el ojo afectado por la inflamación en el sujeto; instrucciones de uso; y, un recipiente.

La divulgación en la presente memoria proporciona un kit para tratar uveítis en un sujeto que incluye: una composición farmacéutica que comprende una proteína CD59 independiente de la membrana y/o una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59, de modo que la composición está en una dosis suficiente para tratar la uveítis en el sujeto; instrucciones de uso; y, un recipiente.

La divulgación en la presente memoria proporciona un método para inhibir la activación del inflamasoma en células de un ojo afectado por la inflamación en un sujeto, comprendiendo el método: administrar al sujeto una composición que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del ojo afectado por la inflamación, en la que la composición inhibe la activación del inflamasoma, en la que el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el ojo afectado por la inflamación del sujeto. En ciertas realizaciones del método, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y Py D (NALP), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones del método, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y Py D (NALP). En ciertas realizaciones del método, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones del método, el método comprende adicionalmente medir en el ojo un marcador de actividad del inflamasoma después de la administración de la composición que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente al promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana. En ciertas realizaciones del método, al sujeto se le ha diagnosticado con o se sospecha que padece de una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, una penfigoide cicatricial ocular, una penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática y una sarcoidosis. En ciertas realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado con o se sospecha que padece una uveítis. Los resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el ojo afectado por la inflamación del sujeto descrito en la presente memoria se refieren a una expresión o actividad elevada de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en comparación con la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el ojo de un individuo no diagnosticado o afectado por una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de las membranas mucosas, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática o una sarcoidosis. Alternativamente, la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el ojo afectado por la inflamación del sujeto se determina mediante una puntuación histológica.

La divulgación proporciona un método para inhibir la activación del inflamasoma en las células de un sujeto afectado por la inflamación, comprendiendo el método: (a) administrar al sujeto una composición que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del sujeto afectado por la inflamación; o (b) administrar al sujeto una composición que comprende una proteína CD59 soluble, en la que la composición inhibe la activación del inflamasoma. En ciertas realizaciones, la composición inhibe la activación del inflamasoma independientemente de la función del complejo de ataque a membrana (MAC). En ciertas realizaciones, el sujeto tiene al menos una afección asociada al inflamasoma seleccionada de: Enfermedad de Alzheimer, una esclerosis múltiple, un infarto al miocardio, una enfermedad vascular aterosclerótica, una microvasculopatía, una tiroiditis, una enfermedad inflamatoria intestinal, un rechazo de injerto de órgano, una nefritis membranosa, una oftalmia simpática y una sarcoidosis. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente obtener una muestra del sujeto. En ciertas realizaciones, la muestra es al menos una seleccionada de: sangre, plasma, suero, células mononucleares de sangre periférica, líquido cefalorraquídeo u orina. En ciertas realizaciones, el método comprende, adicionalmente, antes de la administración, medir en el sujeto un marcador de actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones, el método comprende, adicionalmente después de la administración, medir en el sujeto un marcador de actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma es al menos uno seleccionado de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), FN-<y>, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente administrar la composición en una dosis suficiente para tratar la afección asociada al inflamasoma. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana es un genoma diseñado genéticamente de al menos un virus seleccionado del grupo que consiste en: un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes y un lentivirus. En ciertas realizaciones, el lentivirus es un retrovirus. En ciertas realizaciones, la administración comprende adicionalmente inyectar la composición por vía intravenosa. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente aplicar la composición por vía tópica. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente administrar un agente terapéutico adicional. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: antitumoral, antiviral, antibacteriano, anti micobacteriano, antifúngico, anti proliferativo y anti apoptótico. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio, un agente vasopresor, un inhibidor de la colagenasa, un esteroide, un inhibidor de metaloproteinasa de matriz, un ascorbato, una angiotensina, una calreticulina, una tetraciclina, una fibronectina, un colágeno, una trombospondina, unos factores de crecimiento transformantes (TGF), un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), un factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), unos factores de crecimiento tipo insulina (IGFs), una proteína de unión a IGF (IGFBP), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor de diferenciación neu (NDF), un factor de crecimiento de hepatocito (HGF), un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un EGF de unión a heparina (HBEGF), una trombospondina, un factor C de von Willebrand, una heparina, un sulfato de heparina y un ácido hialurónico. Se describe en la presente memoria un kit para inhibir una actividad de un inflamasoma en una célula afectada por la inflamación en un sujeto, comprendiendo el kit: (a) una composición farmacéutica que comprende: (i) una proteína CD59 independiente de la membrana y/o una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59; o (ii) una proteína CD59 soluble, en la que la composición está en una dosis suficiente para inhibir el inflamasoma en la célula afectada por la inflamación en el sujeto; (b) instrucciones de uso; y (c) un recipiente.

La divulgación proporciona un método para tratar al menos una afección seleccionada de: enfermedad de Alzheimer, una esclerosis múltiple, un infarto al miocardio, una enfermedad vascular aterosclerótica, una microvasculopatía, una tiroiditis, una enfermedad inflamatoria intestinal, un rechazo de injerto de órgano, una nefritis membranosa, una oftalmía simpática y una sarcoidosis, comprendiendo el método: (a) administrar al sujeto una composición que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana de las células; o (ii) una proteína CD59 soluble; inhibiendo la composición la activación del inflamasoma. Se describe en la presente memoria un método para inhibir la activación del inflamasoma en células de un sujeto afectado por la inflamación, comprendiendo el método: (a) medir en el sujeto un marcador de actividad del inflamasoma; y (b) si el marcador de actividad del inflamasoma es positivo, administrar al sujeto una composición que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del sujeto afectado por la inflamación; o (ii) una proteína CD59 soluble; la composición inhibe la activación del inflamasoma. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-<y>, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente medir en el sujeto un marcador de actividad del inflamasoma después de la administración de la composición que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente al promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana o la proteína CD59 soluble.

Se describe en la presente memoria un método para inhibir la activación del inflamasoma en células de un sujeto afectado por la inflamación, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del sujeto afectado por la inflamación, en el que la composición inhibe la activación del inflamasoma; o (b) una proteína CD59 soluble; en el que el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el sujeto afectado por la inflamación. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1 p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), FN-Y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente medir en el sujeto un marcador de actividad del inflamasoma después de la administración de la composición que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente al promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana; o (b) la proteína CD59 soluble. En ciertas realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado con o se sospecha que padece una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática y una sarcoidosis. En ciertas realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado con o se sospecha que padece una uveítis. En ciertas realizaciones, los resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el sujeto afectado por la inflamación es la expresión o actividad elevada de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en comparación con la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en un sujeto no diagnosticado o afectado por la enfermedad de Alzheimer, una esclerosis múltiple, un infarto al miocardio, una enfermedad vascular aterosclerótica, una microvasculopatía, una tiroiditis, una enfermedad inflamatoria intestinal, un rechazo de injerto de órgano, una nefritis membranosa, una oftalmía simpática y una sarcoidosis. En ciertas realizaciones, los resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el sujeto afectado por la inflamación se determinan mediante una puntuación histológica.

Descripción breve de las figuras

Figura 1A - Figura 1F son conjuntos de microfotografías y gráficas de barras los cuales demuestran que la activación del inflamasoma NLRP3 mediada por MAC aumenta la producción de IL-1 p en la EAU. Los valores se representan como media ± SEM. GCL, capa de células ganglionares; INL, capa nuclear interna; ONL, capa nuclear externa; OS, segmentos externos, Barra de escala -100 pm.

Figura 1Aes un conjunto de microfotografías de secciones de criostato de la retina teñidas con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (columna izquierda), anticuerpo C5b9 (columna central) que indican una formación elevada del MAC en la retina con EAU en comparación con la retina de control normal en ratones. Se observó que la retina de ratón C9'/_ con EAU (fila inferior) era negativa para la proteína C5b9 y, por lo tanto, para MAC.

Figura 1B es una gráfica de barras de la producción de la proteína IL-1p medida por ELISA en retinas con EAU (barra central) y tejidos de control. Se observó que la producción de proteína IL-1p en retinas con EAU era 112% la de las retinas de control, mediante ELISA, y aumentada 45 veces mediante RT-PCR. Se observó un nivel de proteína IL-1 p 37% mayor en las retinas de C9-/- con EAU y un aumento de 3.8 veces en la proteína IL-1p y el ARNm, respectivamente, en comparación con las retinas de control normales.

Figura 1C es una gráfica de barras de la producción del ARNm de IL-1 p medido por RT-PCR en retinas con EAU (barra central) y tejidos de control. Se observó que el nivel del ARNm de IL-1 p en las retinas con EAU era 4464% mayor que en las retinas de control normales. Se observó que el nivel del ARNm de IL-1p en las retinas C9-/- con EAU era 285% mayor que en las retinas de control normales.

Figura 1D es una fotografía de una inmunodetección tipo Western y una gráfica de barras que muestra que se observó un nivel de proteína NLRP3 de más de 200% mayor en las retinas con EAU en comparación con las retinas de control normales de ratones. Se observó un nivel de proteína NLRP3 ligeramente mayor en las retinas de C9-/- con EAU en comparación con las retinas de control normales de ratones.

Figura 1E es una fotografía de una inmunodetección tipo Western y una gráfica de barras que muestra que se observaron niveles de proteína Caspasa 1 (p20) de más del 80% mayores en las retinas con eA u en comparación con las retinas de control normales de ratones. Se observó un nivel de proteína Caspasa 1 (p20) 30% mayor en las retinas de C9-/- con EAU en comparación con las retinas de control normales de ratones.

Figura 1F es una fotografía de una inmunodetección tipo Western y una gráfica de barras que muestra 44% más de proteína ASC en las retinas con EAU en comparación con las retinas de control normales en ratones. Se observó que los niveles de ASC en las retinas de ratones de C9-/- con EAU estaban marginalmente elevados en relación con las retinas de control normales. Los valores de inmunodetección tipo Western y RT-PCR se normalizaron a p-actina.

Figura 2A - Figura 2B son conjuntos de formas de onda del electrorretinograma (ERG) y gráficas lineales que muestran los efectos de la formación del MAC en la función de la retina en la EAU. Los datos obtenidos en los ejemplos en la presente memoria indican que la EAU produce un daño extenso a los fotorreceptores, lo que perjudica la función de la retina en comparación con las retinas de control normales.

Figura 2Aes un conjunto de respuestas al ERG en los grupos normal, con EAU y C9-/- con EAU. Se analizaron las respuestas adaptadas a la oscuridad (escotópica) y adaptadas a la luz (fotópica) en retinas de ratones normales, con EAU y C9-/- con EAU. Para ERGs adaptados a la oscuridad, se utilizaron intensidades de destellos de luz de -20 dB (decibel) (0.025 cds/m2), -10dB (0.25 cd/m2) y 0dB (2.5 cd/m2). Para ERG adaptado a la luz, se utilizaron intensidades de destellos de luz de 0dB (2.5 cds/m2) y 1dB (3.15 cds/m2).

Figura 2B es un conjunto de gráficas lineales de amplitudes de ERG de ondas a adaptadas a la oscuridad y a la luz y amplitudes de ERG de ondas b trazadas con respecto a las intensidades. Para los ERGs adaptados a la oscuridad, se utilizaron intensidades de destellos de luz de -20dB, -10dB y 0dB. Para el ERG adaptado a la luz, se utilizaron intensidades de destellos de luz de 0dB y 1dB. Los valores se representan como media ± SEM.*p<0.05, #p<0.05 en comparación con EAU.

Figura 3A- Figura 3F son conjuntos de microfotografías y diagramas de puntos que muestran que los ratones C9'A no están protegidos de la EAU. En los ejemplos en la presente memoria, los ratones fueron inmunizados por vía subcutánea con 200 |jg de péptido IRBP (1-20) en 0.2 mL de emulsión del adyuvante completo de Freund (CFA) que contiene 2.5 mg/mL deMycobacterium tuberculosis.A los ratones se les inyectaron simultáneamente 1.5 jg de toxina deBordetella pertussisdiluida en 100 j l de salina amortiguada con fosfato (PBS) mediante una inyección intraperitoneal. Se analizó la gravedad de la EAU fundoscópica después de 24 días entre ratones normales, con EAU y C9-/- con EAU. Se examinaron lesiones focales, lesiones lineales, vasculitis, hemorragias retinales, infiltrados y desprendimientos de la retina. De acuerdo con la gravedad de estos hallazgos, las puntuaciones clínicas de la eA u se calificaron en una escala de 0-4.

Figura 3Aes un conjunto de microfotografías de imágenes de fondo de ojo de los grupos de EAU y C9-/- con EAU que muestran infiltrados inflamatorios de la retina (punta de flecha blanca), vasculitis (flecha blanca) y pliegues retinales (flecha negra).

Figura 3B - Figura 3F son gráficas de puntos de puntuaciones clínicas generales individuales, puntuaciones de vasculatura, puntuaciones de infiltración celular, puntuaciones del disco óptico y puntuaciones del daño estructural respectivamente. Se calcula la combinación de la puntuación de vasculatura (Figura 3C), la puntuación de infiltración celular (Figura 3D), la puntuación del disco óptico (Figura 3E) y la puntuación del daño estructural (Figura 3F) y se grafica como puntuación clínica general individual (Figura 3B). Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 4A - Figura 4E es un conjunto de microfotografías y gráficas de barras de imágenes de la retina e histología de tejidos de ratones con EAU, control normal y C9'A con EAU.

Figura 4Aes un conjunto de microfotografías de escaneos OCT horizontales que muestran pagamientos en la retina (flecha roja) e infiltrados celulares vítreos (flecha blanca) en ratones con EAU y C9-/- con EAU y no en ratones de control normales.

Figura 4B es un conjunto de microfotografías de secciones de la retina (5 |jm) las cuales se obtuvieron de ojos embebidos en parafina cosechados en el día 24 después de la inducción de la EAU y teñidos con hematoxilina y eosina. La infiltración de células inmunes inflamatorias en el vítreo (V) se muestra con flechas negras; el asterisco negro representa el desprendimiento de la retina (R); los pliegues de la retina se muestran con puntas de flecha blancas.

Figura 4C - Figura 4E son conjuntos de gráficas de barras que muestran el grado de gravedad de la patología de la EAU puntuando individualmente la infiltración celular, la vasculitis y el daño a los fotorreceptores, respectivamente, como se describe en los ejemplos en la presente memoria. Los valores se representan como media ± SEM. RPE-CH, RPE y coroides; R, Retina; V, Vítreo; GCL, Capa de células ganglionares; INL, Capa nuclear interna; ONL, Capa nuclear externa; OS, Segmentos externos; OpN, Nervio óptico, Barra de escala 100jm.

Figura 5A- Figura 5F son conjuntos de microfotografías y gráficas de barras que muestran que CD59 soluble inhibe la activación del inflamasoma NLRP3 y la producción de IL-1p en la EAU.

Figura 5Aes un conjunto de microfotografías de secciones criostáticas de la retina de ojos de ratones con EAU inyectados con ya sea AAVCAGsCD59 o con AAVCAGGFP de control, y se tiñieron con anticuerpo C5b9 o con DAPI.

Figura 5B es una gráfica de barras del nivel de proteína IL-1p medido por ELISA. Se observó que los niveles de proteína IL-1p en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 eran 40% más bajos que en las retinas de control de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP.

Figura 5C es una gráfica de barras del nivel del ARNm de IL-1 p medido por RT-PCR. Se observó que los niveles del ARNm de IL-1 p en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 eran 70% más bajos que en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control.

Figura 5D es una fotografía de una inmunodetección tipo Western y una gráfica de barras que muestra una cantidad de proteína NLRP360% menor en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control.

Figura 5E es una fotografía de una inmunodetección tipo Western y una gráfica de barras que muestra 60% menos de proteína Caspasa 1 (p20) en las retinas de ratones con eAu inyectados con AAVCAGsCD59 que en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control.

Figura 5F es una microfotografía de una inmunodetección tipo Western y una gráfica de barras que muestra niveles comparables de proteína ASC en retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 y retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control. Los valores de inmunodetección tipo western y RT-PCR están normalizados a p-actina. Los valores se representan como media ± SEM. GCL, capa de células ganglionares; INL, capa nuclear interna; ONL, capa nuclear externa; OS, segmentos externos, Barra de escala -100 jm .

Figura 6A - Figura 6B son conjuntos de formas de onda de electrorretinograma (ERG) y gráficas lineales que muestran que CD59 soluble mejora la función de la retina en la EAU.

Figura 6A es un conjunto de respuestas al ERG en ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 o con AAVCAGGFP de control. Se analizaron las respuestas adaptadas a la oscuridad (escotópicas) y adaptadas a la luz (fotópicas) en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 o con un control AAVCAGGFP Para ERG adaptado a la oscuridad, se utilizaron intensidades de destellos de luz de -20dB (0.025 cds/m2), -10dB (0.25 cd/m2) y 0dB (2.5 cd/m2). Para ERG adaptado a la luz, se utilizaron intensidades de destellos de luz de 0dB (2.5 cds/m2) y 1dB (3. l5 cds/m2).

Figura 6B es un conjunto de gráficas lineales que muestran amplitudes de ERG de ondas a y ondas b adaptadas a la oscuridad y a la luz, graficadas con respecto a las intensidades. Para el ERG adaptado a la oscuridad, se utilizaron intensidades de destellos de luz de -20dB, -10dB y 0dB. Para el ERG adaptado a la luz, se utilizaron intensidades de destellos de luz de 0dB y 1dB. Las respuestas al ERG de los controles C57BL/6J se presentan en la figura 2A. Los valores se representan como media ± SEM. *p<0.05, #p<0.05 versus AAVCAGGFP

Figura 7A- Figura 7F son conjuntos de microfotografías y gráficas de puntos que muestran que CD59 soluble atenúa la gravedad de la puntuación clínica en la EAU. Se analizó la gravedad de la EAU fundoscópica en ratones con EAU inyectados con PBS, AAVCAGsCD59 y AAVCAGGFP Las puntuaciones clínicas de la EAU se calificaron en una escala de 0-4.

Figura 7A es un conjunto de microfotografías de imágenes de fondo de ojo de ratones inyectados con PBS, AAVCAGsCD59 o Aa VCAGGFP muestran infiltrados inflamatorios de la retina (punta de flecha blanca), vasculitis (flecha blanca) y papiledema (asterisco blanco).

Figura 7B - Figura 7F son gráficas de puntos de la puntuación clínica general individual, la puntuación de la vasculatura, la puntuación de infiltración celular, la puntuación del disco óptico y la puntuación del daño estructural, respectivamente. Se calculó la combinación de la puntuación de vasculatura, la puntuación de infiltración celular, la puntuación del disco óptico y la puntuación del daño estructural y se graficó como puntuación clínica general individual. Se observó que las retinas del grupo de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 tenían puntuaciones individuales estadísticamente significativas mejoradas para la infiltración celular, la vasculatura y el daño estructural y la puntuación clínica general, en comparación con las retinas del grupo de ratones inyectados con AAVCAGGFP de control. Se observó que las diferencias en las puntuaciones del disco óptico (Figura 7E) seguían siendo estadísticamente insignificantes para los ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control. Las diferencias entre los ojos inyectados con PBS y AAVAGGFP siguieron siendo estadísticamente insignificantes. Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 8A - Figura 8E son conjuntos de microfotografías y gráficas de barras que muestran el efecto de CD59 en los cambios en OCT y las puntuaciones de histología de la retina en ratones con EAU.

Figura 8Aes un conjunto de microfotografías de escaneos OCT horizontales que muestran pliegues retinales en la retina (flecha roja) e infiltrados celulares vítreos (flecha blanca) en retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP o con AAVCAGsCD59 de control o con PBS de control.

Figura 8B es un conjunto de microfotografías de secciones de la retina (5 pm) las cuales se obtuvieron de ojos embebidos en parafina en el día 24 después de la inducción de la EAU y se tiñeron con hematoxilina y eosina. La infiltración de células inmunes inflamatorias en el vítreo (V) está indicada por flechas negras; el desprendimiento de la retina (R) está indicado por un asterisco negro; los pliegues retinales están indicados por puntas de flecha blancas.

Figura 8C - Figura 8E son conjuntos de gráficas de barras que muestran el grado de gravedad de la patología de la EAU punteando individualmente la infiltración celular, vasculitis y daño a los fotorreceptores, respectivamente, como se describe en los ejemplos en la presente memoria. Los valores se representan como media ± SEM. RPE-CH, RPE y coroides; R, Retina; V, Vítreo; GCL, Capa de células ganglionares; INL, Capa nuclear interna; ONL, Capa nuclear externa; OS, Segmentos externos; OpN, Nervio óptico; Barra de escala 100pm.

Figura 9 es una gráfica de barras que muestra la elevación del MAC en las retinas con EAU. Se observó que la cantidad de intensidad de fluorescencia del MAC en las retinas de ratones con EAU era 70% mayor en la formación del MAC en comparación con las retinas de control normales en ratones. Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 10A - Figura 10D son conjuntos de gráficas de barras que muestran los efectos del MAC en la diferenciación de células Th1 y Th17 en retinas con EAU. Las retinas recién disecadas se cuantificaron para los niveles de ARNm y proteína de IL-17 e IFN-y utilizando ELISA y RT-PCR en retinas de control, con eAu y C9'/_ con EAU.

Figura 10A es una gráfica de barras que muestra que el nivel de proteína IFN-<y>en las retinas de ratones con EAU fue 102% y el ARNm fue 200 veces mayor, respectivamente, que el nivel de expresión de proteína IFN-y en las retinas de ratones normales de control. El nivel de expresión de la proteína IFN-<y>en retinas C9'/_ con EAU se observó que era 14% mayor, que el nivel de expresión de proteína IFN-y en las retinas de ratones normales de control.

Figura 10B es una gráfica de barras que muestra que el nivel del ARNm de IFN-<y>en las retinas de ratones con EAU fue 200 veces mayor en comparación con el nivel del ARNm de IFN-y en las retinas de ratones normales de control y la proteína fue 102% de lo normal. Se observo que el nivel del ARNm de IFN-y en retinas C9'/_ con EAU era 1315%, mayor en comparación con el nivel del ARNm de IFN-<y>en las retinas de ratones normales de control.

Figura 10C es una gráfica de barras que muestra que se observó que los niveles de proteína IL-17 en las retinas de ratones con EAU eran 99% mayores que los niveles de proteína IL-17 en las retinas de control normales. Se observo que los niveles de proteína IL-17 en retinas C9'/_ con EAU eran solo 44% superiores en comparación con los niveles de proteína IL-17 en las retinas de los ratones normales de control.

Figura 10D es una gráfica de barras que muestra los niveles del ARNm de IL-17 en las retinas de ratones con EAU y ratones C9-/- con EAU. Los niveles del ARNm de IL-17 en las retinas normales de control se mantuvieron por debajo del límite de detección. Cada experimento se repitió dos o tres veces. Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 11A - Figura 11C son conjuntos de diagramas de dispersión y gráficas de barras de cantidades de IFN-Y o IL-17 en células Th1 y Th17 en el ganglio linfático de drenaje (DLN) en ratones con EAU. Se recolectaron células DLN de ratones con EAU y C9-/- con EAU 24 días después de la inducción de la EAU.

Figura 11A es un conjunto de gráficas de dispersión para células del DLN las cuales se tiñeron para IL-17A e IFN-y, se graficaron con respecto a las células CD4+.

Figura 11B y Figura 11C son gráficas de barras que muestran un aumento significativo en las células CD4+ positivas para IL-17 e IFN-y de los ganglios linfáticos de drenaje en ratones con EAU en comparación con los ratones normales de control. La diferencia en el porcentaje de células CD4+ positivas para IL-17 y células CD4+ positivas para IFN-<y>de los ganglios linfáticos de drenaje en ratones C9'/_ con EAU en relación con los ratones con EAU era insignificante. Cada experimento se repitió tres veces. Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 12 es una gráfica de barras que muestra que la formación del MAC se inhibe mediante una única inyección intravítrea de AAVCAGsCD59 en retinas con EAU. La cantidad de intensidad de fluorescencia del MAC en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 se redujo 45% en la formación del MAC en comparación con la cantidad en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control. Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 13A - Figura 13D son conjuntos de gráficas de barras que muestran que CD59 soluble inhibe la diferenciación de las células Th1 y Th17 en retinas con EAU. Se cuantificaron retinas recién disecadas para los niveles del ARNm y proteína de IL-17 e IFN-<y>utilizando ELISA y RT-PCR en ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 y AAVCAGGFP de control.

Figura 13A es una gráfica de barras que muestra que el nivel de proteína IFN-y fue 25% menor en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los niveles de proteína IFN-y en ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control.

Figura 13B es una gráfica de barras que muestra que el nivel de expresión del ARNm de IFN-y fue 47% menor en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los niveles de ARNm de IFN-<y>en ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control.

Figura 13C es una gráfica de barras que muestra que el nivel de proteína IL-17 fue 35% menor en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los niveles de proteína IL-17 en ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control.

Figura 13D es una gráfica de barras que muestra que el nivel del ARNm de IL-17 fue 10% menor en las retinas de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los niveles del ARNm de IL-17 en ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control. Se observó que las diferencias en las cantidades del ARNm de IL-17 e IFN-<y>no eran estadísticamente significativas. Cada experimento se repitió dos o tres veces. Los valores se representan como media ± SEM.

Figura 14A- Figura 14C son microfotografías y una inmunodetección tipo western que muestran las retinas de ratones C57Bl/6J de seis semanas de edad inyectados con 3.5 * 109 copias del genoma/pl de AAVCAGsCD59 o AAVCAGGFP (1 pl) y una semana más tarde se desafiaron con EAU y se mantuvieron durante 24 días.

Figura 14A es una imagen de fondo de ojo que exhibe la expresión de GFP en la retina del ratón.

Figura 14B son imágenes de criostato de retina del grupo inyectado con AAVCAGFP que exhiben una expresión robusta de GFP en la capa de células ganglionares (fila superior), la capa plexiforme interna y la capa nuclear interna en la retina del ratón con EAU leve (fila del medio) y la retina del ratón con EAU grave que exhibe expresión de GFP en fotorreceptores y epitelio pigmentario de la retina (fila inferior). Fila superior: AAVCAGsCD59 de control

Figura 14C es una inmunodetección tipo Western que muestra la expresión de sCD59 de la retina de ratón después de una única inyección intravítrea de AAVCAGsCD59. Abreviaciones: GCL, capa de células ganglionares; INL, capa nuclear interna; ONL, capa nuclear externa; OS, segmentos externos; RPE, epitelio pigmentario de la retina.

Descripción detallada

En la presente memoria se describen métodos, composiciones y kits para tratar a individuos que padecen trastornos relacionados con el inflamasoma con una proteína CD59 independiente de la membrana (soluble). La proteína CD59 independiente de la membrana se puede expresar a partir de un ácido nucleico administrado o mediante la administración directa de la proteína. Se contemplan ácidos nucleicos que codifican para una proteína CD59 independiente de la membrana o una composición de la misma para uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con el inflamasoma. También se contempla una proteína CD59 independiente de la membrana o una composición de la misma para uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con el inflamasoma. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con el inflamasoma está en el ojo de un sujeto. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con el inflamasoma comprende una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática y una sarcoidosis. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con el inflamasoma comprende una uveítis. Las proteínas o ácidos nucleicos que codifican a CD59 soluble/independiente de la membrana se pueden administrar a un sujeto que haya mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones los resultados positivos están en un ojo del sujeto. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALp), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3).

La inmunización de ratones con un péptido derivado de la proteína de unión al interfotorreceptor de la retina (IRBP) resulta en una enfermedad autoinmune mediada por células T análoga a las características clínicas e histológicas observadas en la uveítis humana (Caspi, R. R., et al. (1988) J. Inmunol 140, 1490-1495; Chan, C. C., et al. (1990) J. Autoinmun. 3, 247-255). Este modelo experimental de uveítis autoinmune (EAU) se utiliza como una aproximación para el estudio de la uveítis y para el desarrollo de terapias para esta enfermedad, que se utiliza en los ejemplos en la presente memoria.

Con la finalidad de entender mejor el mecanismo potencial mediante el cual MAC puede estar involucrado en la patogénesis de la EAU y para dilucidar la importancia de la activación de NLRP3 y la producción de IL-1 p en el desarrollo de la EAU, se examinó la deposición del MAC en la retina con EAU y que el MAC puede ser necesario para la activación del inflamasoma NLRP3 y la subsecuente liberación de IL-1p.

MAC contiene una molécula de cada uno de C5b, C6, C7, C8 y hasta doce moléculas de C9. Dado que los ratones C9-/- no pueden ensamblar un MAC funcional, dichos ratones pueden estar parcialmente protegidos de la EAU. En los ejemplos en la presente memoria, se indujo EAU en los ratones de control C57BL/6J y los ratones C9-/- y la patología de la EAU en los ratones de control se comparó con la patología de la EAU en los ratones C9-/-. Se examinó el potencial terapéutico de la inhibición de C9 en la EAU mediante una aproximación de terapia génica utilizando un virus adenoasociado (AAV) que expresa una CD59 soluble (AAVCAGsCD59), la cual es una proteína que previene la incorporación de C9 en el complejo preformado C5b-8. El desarrollo de la EAU en ratones inyectados con AAVCAGsCD59 se monitoreó mediante imágenes de fondo de ojo, tomografía de coherencia óptima de dominio espectral (SD-OCT), histopatología de la retina e inmunohistoquímica. La función de la retina se cuantificó mediante electrorretinograma (ERG) y la activación del inflamasoma NLRP3 se midió mediante inmunotransferencias tipo Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). Los resultados observados en los ejemplos en la presente memoria asocian por primera vez un papel directo del MAC como un activador del inflamasoma NLRP3 y la producción de IL-1 p en el desarrollo de la EAU. Los datos de los ejemplos incluidos en la presente memoria demuestran por primera vez que la expresión de CD59 soluble mediada por AAV es una posible terapia génica para el tratamiento de la uveítis.

En los ejemplos en la presente memoria, se investigó el papel directo del MAC en la activación del inflamasoma NLRP3 en la EAU. Los datos de los ejemplos en la presente memoria demuestran que el MAC se deposita en la retina con EAU, lo que resulta en la activación del inflamasoma NLRP3 y una producción aumentada de IL-1p. Los ejemplos demuestran adicionalmente que los ratones C9'/_ con EAU no logran formar MAC en su retina y concomitantemente tienen una activación atenuada del inflamasoma NLRP3, lo que indica un vínculo entre la deposición del MAC y la activación del inflamasoma NLRP3 en la EAU. Aunque los ratones C9-/- no logran rescatar el fenotipo patológico de la EAU, la administración mediada por AAV de sCD59, un inhibidor de la incorporación de C9 en MAC, atenúa inesperadamente muchos aspectos del fenotipo patológico de la EAU, incluyendo la activación del inflamasoma NLRP3.

El sistema del complemento es un componente principal de la inmunidad innata y consta de un grupo diverso de proteínas plasmáticas y unidas a la membrana. Estas proteínas unidas a la membrana juegan un papel central en la protección contra patógenos y en la regulación de los procesos inmunes e inflamatorios. La activación del complemento contra patógenos para la defensa del hospedero es necesaria, pero un complemento sobreactivado puede causar daños a los tejidos del hospedero (Morgan, B. P, et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877; Carroll, M. V., et al. (2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 965-975). Por lo tanto, es necesario mantener un equilibrio entre la activación del complemento y la inhibición del complemento por las proteínas reguladoras del complemento. El sistema del complemento sobre activado y no regulado termina en la formación del MAC, que se ha demostrado que está involucrado en una variedad de trastornos oculares, incluyendo la EAU (An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Inmunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394; Gehrs, K. M., et al. (2010) Arch. Ophthalmol. 128, 349-358; Yanai, R., et al. (2012) Adv. Exp. Med. Biol. 946, 161-183). Sin embargo, aún queda por investigar el papel directo de la deposición del MAC en la patogénesis de la EAU. En los ejemplos en la presente memoria, se observó que MAC se depositó en la EAU, lo que condujo a una mayor producción de IL-1p. Sin embargo, se observó que los ratones C9-/- con EAU que carecen de la capacidad para formar MAC y, en consecuencia, se observó que tenían niveles reducidos de IL-1p.

Aunque la deposición del MAC en las membranas celulares eventualmente resulta en la muerte celular mediante lisis, el MAC sublítico en las membranas celulares se ha implicado en la regulación del ciclo celular y la proliferación, la apoptosis, la producción de citocinas y el inicio de cascadas de señalización corriente abajo (Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877). El complejo del inflamasoma NLRP3 es un grupo de proteínas citoplasmáticas que consiste en una subunidad reguladora primaria NLRP3, una subunidad adaptadora ASC y la subunidad efectora caspasa-1 que convierte pro-IL-1 p en IL-1 p activa (Latz, E., et al. (2013) Nat. Rev. Immunol. 13, 397-411; Broz, P., et al. (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420). Estudios recientes en modelos cebados con LPS han demostrado que la formación de poros inducida por MAC sublítica condujo a una acumulación de Ca2+ intracelular que posteriormente activó el inflamasoma NLRP3 (Triantafilou, K., et al. (2013) J. Cell Sci. 126, 2903-2913; Laudisi, F., et al. (2013) J. Inmunol. 191, 1006-1010). El inflamasoma NLRP3 se ha implicado previamente en diversas enfermedades oculares (Devi, T S. et al. (2012) Exp. Diab. Res. 2012, 438238; Tseng, W A., et al. (2013) Invest Ophthalmol Vis Sci 54, 110-120). Las observaciones en los ejemplos en la presente memoria demostraron que la atenuación de la activación del inflamasoma NLRP3 es una nueva aproximación terapéutica para el tratamiento de la uveítis. Los ejemplos en la presente memoria demuestran por primera vez el papel directo de la activación del MAC y el inflamasoma NLRP3 en el modelo de ratón con EAU. Los datos obtenidos en los ejemplos en la presente memoria demuestran que MAC activó directamente y aumentó la expresión proteica de las subunidades NLRP3, Caspasa-1 y ASC. Estas subunidades activadas forman el complejo del inflamasoma NLRP3 el cual produce IL-1p activa. Los ratones C9-/- con EAU no activaron el inflamasoma NLRP3 y la IL-1 p permaneció cerca de los niveles basales, lo que confirma la activación del inflamasoma NLRP3 como una vía dependiente del MAC.

Las células T CD4+ efectoras autorreactivas están asociadas con la patogénesis en la EAU. Tanto los linajes Th1 como Th17 son específicamente responsables del desarrollo de la EAU y se han reportado en pacientes con uveítis (Amadi-Obi, A., et al. (2007) Nat. Med. 13, 711-718; Caspi, R. R., et al. (1996) J. Inmunol. 157, 2668 2675). Además, la señalización de IL-1 p promueve la diferenciación de células T CD4+ en células Th17 (Chung, Y., et al. (2009) Immunity 30, 576-587). Estudios recientes han demostrado que bloquear la vía de señalización de IL-1 puede potencialmente tratar la EAU en ratones (Wan, C. K., et al. (2016) J. Inmunol. 196, 543-546). El antagonista de IL-1Ranakinra,el señuelo soluble de IL-1Rrilonacept,y el anticuerpo neutralizante de IL-1bcanakinumabhan sido aprobados para el tratamiento de la uveítis (Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268). Sin embargo, efectos secundarios múltiples y corta duración de acción hacen que su uso sea limitado. En los ejemplos en la presente memoria, se observó producción aumentada de IL-1 p en las retinas de ratones afectados con EAU; sin embargo, se observaron niveles más bajos de IL-1p en las retinas de ratones C9-/- afectados con EAU. Además, se observó una mayor diferenciación de las células Th1 y Th17 en las retinas de los ratones afectados con EAU; sin embargo, se observó una disminución de las células Th1 y Th17 en las retinas C9-/- afectadas con EAU, como lo indican los respectivos niveles de proteína IL17 e IFN-Y y el ARNm. Además, se observaron niveles aumentados de células Th1 y Th17 positivas para CD4 en DLN de ratones con EAU. Sin embargo, se observó que los niveles de células Th1 y Th17 positivas para CD4 permanecieron sin cambios en DLN de ratones C9-/- con EAU. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo de acción en particular, aquí se plantea que la producción de IL-1p inducida por MAC y la diferenciación de células Th1 y Th17 en la retina con EAU es un efecto local.

Muchas proteínas reguladoras del complemento se secretan o se encuentran en la superficie de las células para mantener bajo control el daño mediado por el complemento a los tejidos del hospedero. Estas proteínas incluyen el factor H, el factor acelerador del decaimiento (CD55), la proteína cofactora de membrana (CD46) y la protectina (CD59). La disminución de la actividad o deficiencia de estas proteínas reguladoras del complemento puede conducir a inmunopatologías que incluyen EAU y uveítis anterior autoinmune experimental (Morgan, B. P, et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877; An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Carroll, M. V., et al. (2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 965-975; Jha, P., et al. (2006) J. Inmunol. 176, 7221-7231). La uveítis autoinmune es una enfermedad crónica y multifactorial asociada con una enfermedad sistémica. Diversos estudios han demostrado que la inhibición de la activación del complemento puede ayudar a mejorar la patología de la EAU en ratones (An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394). Las realizaciones de los métodos en la presente memoria demuestran una aproximación de terapia génica de acción prolongada que utiliza AAV para administrar sCD59 a ratones con EAU. Por primera vez se demuestra que AAVCAGsCD59 inhibe la deposición del MAC en la retina con EAU. Los ejemplos en la presente memoria demuestran que AAVCAGsCD59 inhibe la activación del inflamasoma NLRP3 y atenúa la producción de IL-1 p.

Adicionalmente, los ejemplos en la presente memoria demuestran que una única inyección intravítrea de AAVCAGsCD59 inhibió patologías fenotípicas en ratones con EAU. En estos ratones, los signos clínicos asociados con la EAU se mejoraron significativamente, tal como la reducción de la inflamación, menos infiltrados de células inmunes y reducción de la vasculitis. Los datos obtenidos en los ejemplos en la presente memoria demuestran que la inyección de AAVCAGsCD59 conduce a una mejora en la pérdida de la función de la retina asociada con la EAU en ERGs adaptados tanto a la oscuridad como a la luz. En los ejemplos en la presente memoria, se observó que los ratones C9-/- inhibían significativamente la activación del inflamasoma NLRP3 y se observó que reducían la regulación positiva de IL-1 p. Aunque se observó una tendencia hacia una puntuación histológica mejorada y una función de la retina mejorada en ratones C9-/- con EAU, se observó que las diferencias no alcanzaron un nivel significativo de significancia estadística, excepto algunos puntos de datos en ERG.

Inesperadamente, nuestros estudios sí sugieren que AAVCAGsCD59 posiblemente atenúa la inflamación por un medio distinto al de bloquear la incorporación de C9 al complejo c5b-8. Se ha reportado previamente que el CD59 anclado a GPI se une a CD2 y transduce señales de activación dentro de las células T (Deckert, M. et al. (1995) Eur J Inmunol. 25, 1815-22). El entrecruzamiento de CD59 induce la cascada de señalización del receptor de células T zeta/ZAP-70 y la síntesis de interleucina-2 (IL-2). Se ha descubierto que la IL-2 tiene éxito en la modulación del sistema inmunológico en enfermedades que incluyen diabetes tipo 1 y vasculitis (Hartemann, A. et al. (2013) The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 1, 295-305), lo que respalda la hipótesis de que sCD59 puede atenuar la inflamación de manera independiente al MAC. El modelo de EAU utilizado en la presente memoria para analizar la uveítis presenta inconsistencias relacionadas con el desarrollo de EAU leve a moderada. Estos pequeños cambios pueden afectar significativamente el resultado.

La uveítis es una enfermedad inflamatoria crónica y muchos pacientes enfrentan episodios de recaída y algunos de ellos son refractarios a las terapias disponibles. En general, las terapias convencionales siguen siendo limitadas en el manejo de las etapas graves y avanzadas de la uveítis en pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas (enfermedad de Bechet, enfermedad de Vogt-Koyanagi, etc.) debido a los efectos secundarios significativos y la eficacia a corto plazo. El tratamiento para el manejo de la uveítis no ha avanzado significativamente durante las últimas décadas (Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268). Considerando estas preocupaciones, resulta práctico desarrollar una terapia de acción prolongada tal como la inhibición continua de la activación dependiente del MAC del inflamasoma en pacientes con uveítis. Por lo tanto, la inyección intravítrea única de AAVsCD59 tiene potencial y ventajas significativas en relación con el efecto a corto plazo de las terapias actuales. Se ha demostrado que las terapias génicas dependientes de AAV tienen éxito en el tratamiento de enfermedades oculares en modelos animales (Adhi, M., et al. (2013) PLoS One 8, e79661; Ildefonso, C. J., et al. (2015) Hum. Gen Ther. 26, 59-68). Además, las terapias genéticas mediadas por AAV han avanzado con éxito en ensayos clínicos en humanos para la degeneración macular relacionada con la edad (Mingozzi, F, et al. (2011) Nat. Rev. Genet. 12, 341-355).

Los ejemplos en la presente memoria demuestran que MAC es un regulador importante de la activación del inflamasoma NLRP3 y la producción de IL-1p en la eA u . El MAC juega un papel importante en la diferenciación de las células Th1 y Th17 al aumentar la producción de IL-1p. Se observó que la expresión de sCD59 mediada por AAV inhibe eficazmente la deposición del MAC y posteriormente inhibe la activación del inflamasoma NLRP3. Se observó que una única inyección intravítrea de AAVCAGsCD59 inhibía eficazmente el desarrollo de la EAU en ratones.

Proteína CD59

CD59 es una glicoproteína unida a la membrana que se encuentra asociada con membranas celulares, incluyendo eritrocitos, linfocitos y células endoteliales vasculares de humano. La proteína CD59 inhibe el ensamblaje de los MACs funcionales y, por lo tanto, protege a las células de la activación y/o lisis mediada por el complemento.

Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo de acción en particular, se prevé aquí que las membranas plasmáticas de las células normalmente están protegidas de los efectos del complemento por las proteínas de la superficie celular, por ejemplo, CD59, que inhiben específicamente la activación del poro C5b-9 tras la unión de la proteína del complemento C9 a la membrana C5b-8 (Holguin et al. 1989 J. Clin. Invest. 84: 7-17; Sims et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 19228-19235; Davies et al. 1989 J. Exp. Med. 170: 637-654; Rollins et al. 1990 J. Inmunol. 144: 3478-3483; y Hamilton et al. 1990 Blood 76: 2572-2577). CD59 compite con la proteína del complemento C9 por la unión a la proteína del complemento C8 en el complejo C5b-8, disminuyendo o previniendo así la formación del complejo de ataque a membrana C5b-9. Por lo tanto, CD59 actúa para reducir tanto la activación celular como la lisis celular mediante los MACs del complemento terminal.

La proteína CD59 humana madura está compuesta de 77 aminoácidos y tiene un peso molecular de 18-21 kD. La proteína precursora CD59 de humano incluye un péptido señal amino terminal de 25 aminoácidos y un péptido de carboxilo terminal de 26 aminoácidos lo que resulta en la unión de un anclaje de membrana. Las secuencias de aminoácidos de ejemplos de CD59 de humano precursora, una CD59 de humano madura y secuencias de CD59 de otros mamíferos, por ejemplo, babuino, mono verde africano, mono búho, tití, HVS-15, cerdo, conejo, rata y ratón, se muestran en Sims et al. patente de U.S. número 7,166,568, expedida el 23 de enero de 2007.

La estructura de la proteína CD59 incluye un único dominio rico en cisteína, un núcleo hidrofóbico con tres bucles y un cuarto bucle helicoidal pequeño (Yu et al. 1997 Journal of Experimental Medicine 185(4): 745-753).

Se ha caracterizado la estructura y secuencia del gen que codifica para CD59 (Fodor et al. patente de U.S número 5,624,837, expedida el 29 de abril de 1997). El gen se encuentra en el brazo corto del cromosoma 11 en humanos, específicamente en el cromosoma 11p13 y 11p14 (número de acceso de Herencia Mendeliana en el Hombre en Línea y 107271), y consta de 4 exones que abarcan 20 kb (Petranka et al. 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 7876-7879). Un primer exón no traducido está precedido por una región promotora rica en G y C que carece de un motivo consenso TATA o CAAT. El segundo exón codifica para la secuencia líder hidrofóbica de la proteína y el tercer exón codifica la porción N terminal de la proteína madura. El cuarto exón codifica para el resto de la proteína madura, incluyendo la secuencia hidrofóbica para la unión del anclaje de glicofosfoinosital (GPI) a una membrana celular.

CD59 es una glicoproteína anclada en glicosilfosfatidilinositol que se expresa en leucocitos de sangre periférica humana, eritrocitos y muchas líneas celulares. La proteína se expresa tanto en células hematopoyéticas como en no hematopoyéticas, por ejemplo, en células endoteliales, fibras nerviosas periféricas, neuronas, microglia, oligodendrocitos, astrocitos, células ependimarias, células epiteliales, células acinares de las glándulas salivales, epitelio bronquial, túbulos renales y epitelio escamoso. Véase Nose, M. et al. 1990 Immunology 70(2): 145-149; Vedeler, C. et al. 1994 Immunology 82(4): 542-547; y Hidestima, T et al. 1990 Immunology 69(3): 396:401. Sawada, R. et al. 1989 Nucleic Acids Res 17(16): 6728 reportaron un ADNc que codifica para CD59. El ADNc que codifica para CD59 también se ha clonado a partir de líneas celulares de leucemia de células T humanas (YT) y eritroleucemia humana (K562), y CD59 se ha expresado transitoriamente en células COS (Walsh, L. A. et al. 1990 Eur. J. Immol 21(3): 847-850). CD59 de humano incluye 26 aminoácidos ubicados en el C terminal, los cuales especifican una secuencia señal para la unión de un ancla de glicosilfosfatidil inositol (anclaje de GPI) en el aminoácido asparagina en la posición 77. Se muestra una secuencia de ADNc de CD59 en Fodor et al., patente de U.S. número 5,624,837 expedida el 29 de abril de 1997.

El análisis de la asociación física de CD59 con componentes del MAC muestra que existen sitios de unión separados para CD59 dentro de las cadenas a de cada una de C8 de humano y C9 de humano. El sitio de unión para las interacciones de CD59 de humano con C9 de humano se ha identificado como los residuos de aminoácidos 42 a 58 en la secuencia de CD59 madura de humano, que se une a la región de C9 de humano correspondiente a los residuos de aminoácidos 334 a 418 de esa proteína de humano, más particularmente los residuos de aminoácidos 359 a 384 de C9 de humano, inmediatamente C terminales al dominio de inserción a la membrana predicho de C9 (Sims et al. PCT/US96/17940 presentada el 8 de noviembre de 1996).

Las cadenas laterales de residuos de aminoácidos expuestas en la superficie activa que están disponibles para unirse a C8/C9, identificadas a partir de la estructura de la solución de CD59 madura de humano a partir de datos de NMR publicados y el conocimiento de la porción activa de la molécula de CD59, son histidina en la posición 44, asparagina en la posición 48, ácido aspártico en la posición 49, treonina en las posiciones 51 y 52, arginina en la posición 55 y ácido glutámico en la posición 58. Las estructuras de NMR para CD59 se describen en depósitos por Kieffer et al., la proteína reguladora del complemento de humano c D59 (región extracelular, residuos 170; NMR, 10 estructuras), MMDB Id: 891, PDB Id: 1ERH; Kieffer et al., la proteína reguladora del complemento de humano CD59 (región extracelular, residuos 1 a 70; NMR, restringida), MMDB Id: 890, PDB Id: 1ERG; Fletcher et al., CD59 en complejo con Glcnac-Beta-1,4-(Fuc-Alfa-1,6)-Glcnac-Beta-1 (NMR, 10 estructuras), MMDB Id: 498, PDB Id: 1CDS ; Fletcher et al., CD59 en complejo con Glcnac-Beta-1,4-Glcnac-Beta-1 (NMR, 10 estructuras), MMDB Id: 497, PDB Id: 1CDR. Los depósitos 1CDS y 1CDR de Fletcher et al. las secuencias de aminoácidos de CD59 que presentan estas cadenas laterales en las mismas posiciones relativas funcionan de una manera similar al CD59 de humano (Sims et al.), y dichas variantes están dentro del alcance de los métodos, kits y composiciones farmacéuticas de la presente memoria.

Se ha analizado la relación entre la activación del complemento y los niveles anormales de autoanticuerpos con respecto a enfermedades oculares como la degeneración macular y otras afecciones. Hageman et al. Solicitud de patente de U.S. número 2005/0287601 publicada el 29 de diciembre de 2005 propone diagnosticar la degeneración macular midiendo la presencia de autoanticuerpos específicos para una proteína de la retina (proteínas del RPE y la coroides) en muestras de pacientes con AMD.

Las teorías han relacionado la causalidad de la enfermedad de Alzheimer y la degeneración macular relacionada con la edad con el complemento, y la prevención inhibiendo la activación del sistema del complemento y la formación del MAC. La solicitud de patente de U.S. número 2007/0196367 A1 de Dinu publicada el 23 de agosto de 2007 propone prevenir la formación de desechos mediante la inhibición del complemento como una terapia para la enfermedad de Alzheimer y AMD. La solicitud de patente de U.S. número 2007/0203190 A1 de Patil et al. publicada el 30 de agosto de 2007 enlista compuestos de hidroxilamina (por ejemplo, TEMPOL-H, TEMPO-H y OXANO-H) o derivados de éster como inhibidores putativos de la activación del complemento.

La solicitud de patente de U.S número 2005/0265995 de Tomlinson et al., publicada el 1 de diciembre de 2005 inhibe la proteinuria dirigida por el complemento en ratas utilizando un agente producido mediante la unión de cada uno de los inhibidores del complemento Crry y CD59 en el extremo amino a un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se une a las células epiteliales glomerulares de rata y a las células epiteliales tubulares proximales. En esta referencia se describe que CD59 soluble es ineficaz como inhibidor. Bora et al. 2007 J. Inmunol 178: 1783-1790 utiliza métodos recombinantes para producir una composición dirigida a la membrana fusionando el brazo de unión, Fc, de una inmunoglobulina G (IgG1) a la proteína CD59 (rsCD59a-Fc), e inyecta esta fusión en ratones por vía intravenosa, intraocular (intravítrea) e intraperitoneal. Los números de puntos positivos para CNV se redujeron en los sujetos tratados con la proteína de fusión por vía intraperitoneal en comparación con las vías intravítrea e intravenosa. La funcionalidad de Fc puede resultar en una unión inmediata tras el contacto de la proteína de fusión en general y de manera no específica a las células después de la administración. La administración de proteína purificada está limitada adicionalmente por el metabolismo y la vida media debido a la presencia de proteasas y peptidasas. Tomlinson et al. 2009 IOVS 50(7): 3056-3064 redujeron el tamaño de los puntos de CNV en un modelo de ratón inyectando por vía intravenosa a los animales que tenían puntos de CNV con un plásmido que codifica para un inhibidor del complemento de la proteína de fusión, producido al unir el dominio de unión del N terminal del factor H a un fragmento del receptor del complemento 2 (CR2) que se dirige a las moléculas de la membrana en las células.

Una composición de CD59 proporcionada en la presente memoria carece de la secuencia de aminoácidos primaria para un anclaje de GPI funcional. Una proteína funcional equivalente incluye una secuencia de aminoácidos del dominio de anclaje de GPI modificada que es funcionalmente defectuosa y carece de la capacidad de dirigirse a una membrana. Una sCD59 es un ejemplo de una CD59 recombinante independiente de la membrana (rmiCD59). Los métodos adicionales para obtener CD59 independiente de la membrana incluyen métodos no recombinantes, como proporcionar un inhibidor de la asociación de la membrana, por ejemplo, sintetizando CD59in vivooin vitrode tal manera que falta el anclaje de GPI. En la presente memoria se muestran ejemplos de métodos para obtener CD59 independiente de la membrana. En el arte de la genética y la biología molecular se conocen bien técnicas recombinantes adicionales para alterar la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de una molécula.

En diversas realizaciones, la proteína CD59, descrita en la presente memoria, es una proteína CD59 soluble. La composición proporciona una proteína CD59 e incluye un ácido nucleico de longitud completa de CD59 que se había modificado para eliminar la secuencia señal para la unión del anclaje de GPI en los nucleótidos que codifican para el aminoácido asparagina en la posición 77. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico de CD59 se modificó mediante mutaciones puntuales, sustituciones o deleciones para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos modificada en la ubicación de anclaje de GPI, de modo que la proteína sería incapaz de adherirse a la membrana de una célula.

El término "independiente de la membrana" como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de aminoácidos de CD59 que carece de un anclaje de GPI o tiene un anclaje de GPI modificado que carece de función y capacidad para unirse a una membrana celular o una estructura asociada a la membrana celular, como una proteína de unión a la membrana. Un anclaje de GPI se puede modificar a través de tecnología de ADN recombinante para eliminar el dominio de anclaje de GPI o para introducir una o más mutaciones para interrumpir la función del GPI. Estas una o más mutaciones pueden comprender una inserción de uno o más aminoácidos, una deleción de uno o más aminoácidos o una sustitución de uno o más aminoácidos.

El anclaje de GPI implica una vía de múltiples pasos en el retículo endoplásmico que incluye la interacción de numerosos productos génicos. Muchas proteínas, incluyendo CD59, requieren de GPI para expresarse en la superficie celular y para funcionar eficazmente. El mecanismo mediante el cual la estructura en una señal de proteína codifica para la unión de los anclajes de GPI es revisado porOrlean et al. 2007 JLR 48: 993-1011. La unión de GPI implica una secuencia de aminoácidos que contiene: una señal de secreción N terminal hidrofóbica que dirige a la proteína al ER y una secuencia de señal de anclaje de GPI C terminal. Además de la señal de secreción de CD59 nativa, la cual se encuentra en el amino terminal de la proteína y se escindein vivo, otras señales de secreción son adecuadas para la proteína CD59 y están dentro del alcance de los métodos en la presente memoria. Las señales de secreción eucariontes generales que son adecuadas para uso en células de mamíferos aquí se describen, por ejemplo, en Ding et al. patente de U.S. número 6,733,997 B1, expedida el 11 de mayo de 2004; Tan et al. 2002 Protein Engineering 15(4): 337-345; y Tan et al. 1999 Biochim. Biophys. Acta. 1452: 103-120.

El aminoácido al que se une el GPI se denomina como el residuo omega (u>), los aminoácidos N terminales al residuo omega se denominan omega menos (u>-) y los aminoácidos C terminales al residuo omega se denominan omega más (w+). La secuencia de anclaje de GPI incluye un tramo de alrededor de diez aminoácidos polares (es decir, w-10 a u>-1), por ejemplo, arginina, lisina, aspartato, glutamato, asparagina o glutamato, que forman una región de enlace flexible. Se ha observado que el residuo u> es uno de: glicina, alanina, serina, asparagina, ácido aspártico o cisteína. La mutación, que incluye la sustitución y deleción de ácidos nucleicos que codifican para aminoácidos en posiciones omega, se utiliza para reducir o eliminar la unión del anclaje de GPI o reducir o eliminar la funcionalidad efectiva del anclaje de GPI. Por ejemplo, dicha variación incluye sustituir los ácidos nucleicos que codifican para leucina hidrofóbica (por ejemplo, ácidos nucleicos CTG) y alanina (por ejemplo, ácidos nucleicos g Ca ) con ácidos nucleicos que codifican para glutamina (por ejemplo, ácidos nucleicos CAG) y ácido glutámico (por ejemplo, ácidos nucleicos GAA), o glicina (por ejemplo, ácidos nucleicos GGN), los cuales son aminoácidos menos hidrofóbicos (es decir, más hidrofílicos). Alternativamente, una variación incluye sustituir el residuo w con otro aminoácido, por ejemplo, sustituir una glicina por una tirosina.

Otras secuencias promotoras que son útiles para regular la transcripción de secuencias del gen CD59 están dentro del alcance de expresión de los vectores en la presente memoria. Estos promotores son, por ejemplo, promotores constitutivos, promotores específicos del ciclo celular, promotores ubicuos, promotores específicos de tejido, promotores regulados metabólicamente, promotores inducibles y promotores que se encuentran en sujetos específicos, incluyendo humanos y animales. Se muestran ejemplos de promotores y sistemas promotores, por ejemplo, en Evans et al. patente de U.S número 6,677,311 B1, expedida el 13 de enero de 2004; Clark et al. patente de U.S número 7,109,029 B2, expedida el 19 de septiembre de 2006; y Hallenbeck et al. patente de U.S número 5,998,205, expedida el 7 de diciembre de 1999.

En el resto de la secuencia de aminoácidos de la porción de la proteína CD59 que no está involucrada en el anclaje de GPI, se prevé que el alcance de la proteína CD59 en la presente memoria incluya modificaciones de secuencia conservadas. Como se utiliza en la presente memoria, el término "modificaciones de secuencia conservadas" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de la proteína CD59 o CD59 independiente de la membrana que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir, las secuencias de aminoácidos de CD59 que presentan estas cadenas laterales en las mismas posiciones relativas funcionarán de una manera similar al CD59 de humano. Estas modificaciones conservadas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos de CD59 se logra utilizando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis basada en PCR. Estas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, y Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011.

Las sustituciones conservadas de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de CD59 es una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la de la secuencia de tipo silvestre. El término "sustancialmente idéntica" se utiliza en la presente memoria para referirse a una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos, de modo que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene al menos alrededor de 60% de identidad, o al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98% o 99% de identidad. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de CD59 es una secuencia de aminoácidos que es "idéntica" a la de la secuencia de tipo silvestre. Una secuencia idéntica es una que muestra 100% de identidad con una secuencia de tipo silvestre de CD59. En una determinada realización, una secuencia idéntica puede estar flanqueada en el N o C terminal por uno o más aminoácidos. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden comprender una etiqueta de epítope, una etiqueta de purificación, el remanente de un sitio de escisión introducido para permitir que se elimine una etiqueta de purificación, o una o más modificaciones para mejorar la estabilidad o biodisponibilidad de la proteína.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "alrededor de" se refiere a un número, medida o cantidad que está cerca de la cantidad indicada por 10% o menos.

Los polipéptidos CD59 son útiles para el tratamiento de trastornos mediados por el inflamasoma. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido CD59 de humano útil para los métodos descritos en la presente memoria se establece mediante la secuencia: MGIQGGSVLFGLLL VLA VFCHSGHSLQCYNCPNPT ADCKTA VNCSSDFDACL ITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYC-CKKDLCNFNEQLENG GTSLSEKTVLLLVTPFLAAAW-SLHP (SEQ ID NO: 1). La secuencia señal de CD59 se escinde antes de la secreción de la célula y es prescindible para la utilidad terapéutica. Sin embargo, los ácidos nucleicos que codifican para una CD59 con una secuencia señal aumentan la secreción de un polipéptido CD59 y, por lo tanto, puede ser deseable incluir una secuencia señal en los polipéptidos CD59 codificados por ácidos nucleicos. Un polipéptido CD59 de humano escindido en la secuencia señal útil para los métodos descritos en la presente memoria se establece mediante la secuencia: LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITK-AGLQVYNKCWKFEHCNFNDVT TRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTV-LLLVTPFLAAAWSLHP (SEQ ID NO: 2). Sin embargo, el extremo exacto de la secuencia de señal puede variar de SEQ ID NO: 2 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoácidos de la primera leucina de SEQ ID NO: 2; ya sea en la dirección N terminal o C terminal del polipéptido CD59 completo establecido en SEQ ID NO: 1. Una deleción adicional de los 26 aminoácidos N terminales elimina el dominio del anclaje de GPI del CD59 de humano. Un polipéptido CD59 de humano soluble, escindido en la secuencia señal, útil para los métodos descritos en la presente memoria se establece mediante la secuencia: LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITK-AGLQVYNKCWKFEHCNFNDVT TRLRENELTYYCCK-KDLCNFN EQLEN (SEQ ID NO: 3). Esta versión soluble también puede variar en su extremo N terminal exacto en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoácidos, lo que resulta en una deleción adicional de su N terminal o la restauración de su N terminal. En ciertas realizaciones, la versión soluble de CD59 comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 2 con una o más mutaciones en un residuo necesario para la unión a GPI. En ciertas realizaciones, los residuos son una cualquiera o ambas de las asparaginas en el aminoácido 70 o 77 de SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el polipéptido CD59 útil para los métodos descritos en la presente memoria comprende la deleción de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 aminoácidos del extremo N terminal, del extremo C terminal o de ambos extremos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1,2 o 3. El polipéptido CD59 utilizado con los métodos descritos en la presente memoria puede comprender o consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. Además, el polipéptido CD59 utilizado en la presente memoria puede comprender secuencias adicionales no derivadas de CD59, incluyendo etiquetas de purificación, restos de etiquetas de purificación escindidas, polipéptidos inhibidores del complemento adicionales, polipéptidos antiinflamatorios o polipéptidos que aumentan la estabilidad o biodisponibilidad del polipéptido CD59. Los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que comprende o consiste en un polipéptido CD59, descrito en la presente memoria, también son útiles para el tratamiento de trastornos mediados por el inflamasoma. Por lo tanto, también se prevé un ácido nucleico o una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que comprende o consiste en un polipéptido CD59 descrito en la presente memoria. El ácido nucleico se puede incluir adecuadamente en un vector recombinante tal como un vector viral o plasmídico que sea adecuado para administración a un sujeto. Estos vectores también pueden incluirse adicionalmente en composiciones farmacéuticas para administración a un individuo con un trastorno mediado por el inflamasoma.

Un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de S<e>Q<i>D NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 se puede utilizar en un método para tratar un trastorno del inflamasoma en un sujeto como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 se utiliza en un método para tratar un trastorno del inflamasoma en un ojo de un sujeto. En ciertas realizaciones, el trastorno del inflamasoma es uveítis. En ciertas realizaciones, el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y Py D (NALP), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un polipéptido CD59 humano a un individuo que ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. El polipéptido CD59 puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3.

Un ácido nucleico o una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de SEQ iD NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 se puede utilizar en un método para tratar un trastorno del inflamasoma en un sujeto. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico o la pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 se utiliza en un método para tratar un trastorno del inflamasoma en un ojo de un sujeto. En ciertas realizaciones, el trastorno del inflamasoma es uveítis. En ciertas realizaciones, el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1 p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-<y>, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3).

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un polipéptido CD59 de humano a un individuo que ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. El polipéptido CD59 puede comprender o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-<y>, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y pYd (NALp ). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones, los resultados positivos se obtienen del ojo del individuo.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un polipéptido CD59 humano a un ojo de un individuo que ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. El polipéptido CD59 puede comprender o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1 p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones, los resultados positivos se obtienen del ojo del individuo.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un polipéptido CD59 humano a un individuo afectado por uveítis. El polipéptido CD59 puede comprender o consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la establecida en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, N SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el polipéptido se administra a un ojo afectado del individuo.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido CD59 humano a un individuo que ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. El ácido nucleico puede codificar para un polipéptido CD59 que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la establecida en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1 p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (<n>A<l>P), IFN-<y>, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones, los resultados positivos se obtienen del ojo del individuo.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido CD59 humano a un ojo de un individuo que ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma. El ácido nucleico puede codificar para un polipéptido CD59 que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la establecida en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1, caspasa 5, IL-1 p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y CD4+. En ciertas realizaciones, el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), o una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). En ciertas realizaciones, la NALP es la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3). En ciertas realizaciones, los resultados positivos se obtienen del ojo del individuo.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden la administración de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido CD59 humano a un individuo afectado por uveítis. El ácido nucleico puede codificar para un polipéptido CD59 que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la establecida en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico se administra a un ojo afectado del individuo.

Los cálculos de identidad de secuencia entre secuencias se realizan de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos para un alineamiento óptimo). Luego se comparan los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos o de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las proteínas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, los cuales deben de introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se logran mediante un algoritmo matemático. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando un programa de software de alineamiento utilizando los parámetros predeterminados. Los programas adecuados incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W de Thompson et al., Nuc. Acids Research 22:4673, 1994 (www.ebi.ac.uk/clustalw), BL2SEQ de Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174:247, 1999 (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html), SAGA de Notre Dame and Higgins, Nuc. Acids Research 24: 1515, 1996 (igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred) y DIALIGN de Morgenstern et al., Bioinformatics 14: 290, 1998 (bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign).

Vectores

El término "recombinante" se refiere a proteínas producidas mediante la manipulación de organismos genéticamente modificados, por ejemplo, microorganismos.

De acuerdo con la presente invención, una fuente de CD59 incluye secuencias de polinucleótidos que codifican para la proteína<c>D59, por ejemplo, diseñadas en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de la proteína CD59 en células hospederas adecuadas. Para expresar una proteína<c>D59 biológicamente activa, se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína<c>D59, o su equivalente funcional, en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos de ácidos nucleicos codificantes necesarios que regulan la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, unida operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la proteína CD59.

Se utilizan métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen una secuencia que codifica para la proteína CD59 unida operativamente a elementos de control transcripcional y traduccional adecuados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinantein vitro,técnicas sintéticas y recombinaciónin vivoo recombinación genética. Estas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed, J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, y Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011.

Una variedad de sistemas hospederos/vectores de expresión disponibles comercialmente son útiles para contener y expresar una secuencia codificante para la proteína CD59. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de a Dn de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos en contacto con vectores de expresión virales (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti, pBR322 o pET25b); o sistemas de células animales. Véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, y Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med, 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011.

Los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores de adenovirus, vectores de lentivirus, vectores de virus adenoasociados (A<a>V) y vectores de adenovirus dependientes de auxiliares. Los vectores virales entregan una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína CD59 que, como se muestra en la presente memoria, interfiere con la acción deletérea del MAC en la patogénesis de la AMD. Los vectores de empaquetamiento de adenovirus están disponibles comercialmente de American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA). Se muestran métodos para construir vectores de adenovirus y utilizar vectores de adenovirus en Klein et al. 2007 Ophthalmology 114: 253-262, y van Leeuwen et al. 2003 Eur. J. Epidemiol. 18: 845-854.

Los vectores de adenovirus se han utilizado en la expresión de genes eucariotas (Levrero et al. 1991 Gene, 101: 195-202) y el desarrollo de vacunas (Graham et al. 1991 Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7, (Murray, Ed.), Humana Press, Clifton, NJ, 109-128). Adicionalmente, los vectores de adenovirus recombinantes se utilizan para terapia génica (Wu et al. patente de U.S. número 7,235,391, expedida el 26 de junio de 2007).

Los vectores de adenovirus recombinantes se generan, por ejemplo, a partir de la recombinación homóloga entre un vector lanzadera y un vector proviral (Wu et al., patente de U.S. número 7,235,391, expedida el 26 de junio de 2007). Los vectores de adenovirus en la presente memoria son defectuosos en la replicación, por ejemplo, son condicionalmente defectuosos, carecen de la región E1 del adenovirus, y se introduce un polinucleótido que codifica para CD59 en la posición desde la cual se han eliminado las secuencias codificantes de E1. El polinucleótido codificado por el gen CD59 se inserta alternativamente en la región E3.

Las líneas de células auxiliares se pueden derivar de células humanas, tales como, células renales embrionarias humanas 293, células musculares, células hematopoyéticas u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias humanas. Alternativamente, las células auxiliares se pueden derivar de las células de otras especies de mamíferos que son permisivas para el adenovirus humano, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias de mono. La generación y propagación de estos vectores de adenovirus defectuosos en la replicación utilizando una línea de células auxiliares se describen en Graham et al 1977 J. Gen. Virol. 36: 59-72.

Los vectores de empaquetamiento de vectores lentivirales están disponibles comercialmente de Invitrogen Corporation (Carlsbad CA). Se prepara un sistema de empaquetamiento basado en VIH para la producción de vectores lentivirales utilizando construcciones en Naldini et al. 1996 Science 272: 263-267; Zufferey et al. 1997 Nature Biotechnol. 15: 871-875; y Dull et al. 1998 J. Virol. 72: 8463-8471.

Hay una serie de construcciones vectoriales disponibles para empaquetarse utilizando un sistema basado en la estructura principal del vector lentiviral SIN de tercera generación (Dull et al. 1998 J. Virol. 72: 8463-8471). Por ejemplo, el vector de la construcción pRRLsinCMVGFPpre contiene un 5'LTR en el que la secuencia promotora del VIH ha sido reemplazada por la del virus del sarcoma de Rous (RSV), un 3' LTR auto inactivante que contiene una deleción en la región promotora U3, la señal de empaquetamiento del VIH, secuencias RRE unidas a un casete de gen marcador que consiste en la proteína fluorescente verde (GFP) de medusaAequoraimpulsada por el promotor CMV y el elemento PRE del virus de la hepatitis de la marmota, el cual parece mejorar la exportación nuclear. El gen marcador GFP permite cuantificar la eficiencia de transfección o transducción mediante observación directa de microscopía de fluorescencia UV o citometría de flujo (Kafri et al. 1997 Nature Genet. 17: 314-317; y Sakoda et al. 1999 J. Mol. Cell. Cardiol. 31: 2037-2047).

La manipulación de ácidos nucleicos retrovirales para construir un vector retroviral que contiene el gen que codifica para la proteína CD59 y las células de empaquetamiento se logra utilizando técnicas conocidas en el arte. Véase Ausubel, et al., 1992, Volume 1, Section i Ii (units 9.10.1-9.14.3); Sambrook et al, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y; Miller, et al., Biotechniques. 7:981-990, 1989; Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed, J. M. Walker et al., Humana Press, 2008; Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011; Eglitis, et al., Biotechniques. 6:608-614, 1988; Patentes de U.S. números 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767, y 5,124,263; y publicaciones de patentes PCT números WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829, y WO 93/14188.

Se construye un vector retroviral y se empaqueta en partículas virales transductoras no infecciosas (viriones) utilizando un sistema de empaquetamiento anfotrópico. Se encuentran ejemplos de tales sistemas de empaquetamiento en, por ejemplo, Miller et al. 1986 Mol. Cell Biol. 6:2895-2902; Markowitz et al. 1988 J. Virol.

62:1120-1124; Cosset et al. 1990 J. Virol. 64: 1070-1078; Patentes de U.S. números 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767 y 5,124,263, y publicaciones de patentes PCT números WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829, y WO 93/14188.

La generación de "células productoras" se logra mediante la introducción de vectores retrovirales en células de empaquetamiento. Se encuentran ejemplos de dichos vectores retrovirales en, por ejemplo, Korman et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 2150-2154; Morgenstern et al. 1990 Nucleic Acids Res. 18: 3587-3596; Patentes de U.S. números 4,405,712, 4,980,289, y 5,112,767; y publicaciones de patentes PCT números WO 85/05629, WO 90/02797, y WO 92/07943.

Los vectores de empaquetamiento del virus del herpes están disponibles comercialmente en Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Los virus del herpes ejemplares son un virus del herpes a, tales como virus deVaricella Zostero virus de la pseudorrabia; un virus del herpes simplextal como HSV-1 o HSV-2; o un virus del herpes tal como el virus de Epstein Barr. Se muestra un método para preparar partículas vacías de virus del herpes que se pueden empaquetar con un segmento de nucleótido deseado, por ejemplo, una secuencia de nucleótido o polinucleótido de CD59, en ausencia de un virus auxiliar que sea capaz de combatir a la mayoría de los virus del herpes en Fraefel et al. (Patente de U.S. número 5,998,208, expedida el 7 de diciembre de 1999)).

El vector de ADN del virus del herpes se puede construir utilizando técnicas familiares para el experto en la técnica. Por ejemplo, los segmentos de ADN que codifican para el genoma completo de un virus del herpes se dividen entre diversos vectores capaces de transportar segmentos de ADN grandes, por ejemplo, cósmidos (Evans et al., Gene 79, 9-20, 1989.), cromosomas artificiales de levadura (YACS) (Sambrook, J. et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y, 1989) o plásmidos del elemento F deE. coli(O'Conner et al. 1989 Science 244:1307-1313).

Por ejemplo, se han aislado conjuntos de cósmidos los cuales contienen clones sobrelapados que representan los genomas completos de una variedad de virus del herpes, incluyendo el virus de Epstein Barr, virus deVarícella Zoster,virus de la pseudorrabia y HSV-1. Véase M. van Zijl et al. 1988 J. Virol. 62: 2191; Cohen et al.

1993 Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 90: 7376; Tomkinson et al. 1993 J. Virol. 67: 7298; y Cunningham et al. 1993 Virology 197: 116.

El AAV es un parvovirus dependiente en el sentido de que depende de la coinfección con otro virus (ya sea un adenovirus o un miembro de la familia del virus del herpes) para experimentar una infección productiva en células cultivadas (Muzyczka 1992 Curr Top Microbiol Immunol, 158: 97 129). Por ejemplo, el virus AAV recombinante (rAAV) se elabora cotransfectando un plásmido que contiene el gen de interés, por ejemplo, el gen CD59, flanqueado por las dos repeticiones terminales de AAV (McLaughlin et al. 1988 J. Virol., 62(6): 1963 1973; Samulski et al. 1989 J. Virol., 63: 3822-3828) y un plásmido de expresión que contiene las secuencias codificantes para AAV de tipo silvestre sin las repeticiones terminales. Las células también se ponen en contacto o se transfectan con adenovirus o plásmidos que llevan los genes de adenovirus necesarios para la función auxiliar del AAV. Las reservas de virus AAV recombinantes obtenidas de tal manera que incluyen adenovirus los cuales deben separarse físicamente de las partículas AAV recombinantes (por ejemplo, mediante centrifugación por densidad con cloruro de cesio).

Los vectores de empaquetamiento de virus adenoasociado (AAV) están disponibles comercialmente en GeneDetect (Auckland, New Zealand). Se ha demostrado que el AAV tiene una alta frecuencia de integración e infecta células que no se dividen, lo que lo hace útil para la administración de genes a células de mamíferos en cultivos de tejidos (Muzyczka 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158: 97-129). El AAV tiene un amplio intervalo de hospederos para infectividad (Tratschin et al. 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Laughlin et al.

1986 J. Virol., 60(2): 515-524; Lebkowski et al. 1988 Mol. Cell. Biol. 8(10): 3988-3996; McLaughlin et al. 1988 J. Virol. 62(6):1963-1973).

Se describen métodos para construir vectores AAV y utilizar vectores AAV, por ejemplo, en patentes de U.S. números 5,139,941 (Wu et al.) expedida el 26 de junio de 2007 y 4,797,368 (Carter et al.) expedida el 10 de enero de 1989. El uso de AAV en la administración de genes se describe adicionalmente en LaFace et al. 1988 Virology 162(2): 483486; Zhou et al. 1993 Exp. Hematol 21: 928-933; Flotte et al. 1992 Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7(3): 349-356; y Walsh et al. 1994 J. Clin. Invest 94: 1440-1448.

Los vectores AAV recombinantes se han utilizado con éxito para transducciónin vitroein vivode genes marcadores (Kaplitt et al. 1994 Nat Genet., 8(2):148-154; Lebkowski et al. 1988 Mol. Cell. Biol. 8(10): 3988 3996; Samulski et al. 1991 EMBO J. 10: 3941-3950; Shelling and Smith 1994 Gen Therapy, 1: 165-169; Yoder et al. 1994 Blood, 82 (Supl.): 1: 347A; Zhou et al. 1993 Exp. Hematol 21: 928-933; Tratschin et al. 1985 Mol. Cell. Biol. 5: 3258-3260; McLaughlin et al. 1988 J. Virol. 62(6): 1963-1973) y la transducción de genes implicados en enfermedades de humanos (Flotte et al. 1992 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7(3): 349-356; Ohi et al. 1990 Gen, 89(2): 279-282; Walsh et al. 1994 J. Clin. Invest. 94: 1440-1448; y Wei et al. 1994 Gen Therapy, 1: 261 268).

En ciertas realizaciones, los vectores en la presente memoria son vectores no virales, por ejemplo, vehículos de administración de genes sintéticos o vectores que no están relacionados con una partícula viral y que administran específicamente el material codificante del gen CD59 a las células o tejido diana. Los ejemplos de vectores no virales incluyen liposomas, péptidos, nanopartículas, emulsiones o sistemas encapsulados de dos o más fases u otra preparación adecuada. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un método, kit o composición implica un vector no viral con ácido nucleico que se carga y se pone en contacto con un tejido o célula. Por ejemplo, un liposoma que contiene ADN desnudo que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana que tiene un anclaje de GPI modificado que no se dirige a una membrana, o un gen que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana que no tiene anclaje de GPI, se encapsula en el liposoma y el liposoma se pone en contacto con el tejido o la célula de manera tal que el ácido nucleico se administra de manera efectiva al tejido o la célula para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el complemento.

Anticuerpos

El término "anticuerpo" como se refiere en la presente memoria incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, "porción de unión al antígeno") o cadenas individuales de estos. Un "anticuerpo" natural es una glicoproteína que incluye al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro.

Como se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo que "se une específicamente al MAC humano" se pretende referir a un anticuerpo que se une al MAC humano con una Kd de 5 * 10-9 M o menos, 2 * 10-9 M o menos, o 1 * 10-10 M o menos. Por ejemplo, el anticuerpo es monoclonal o policlonal. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utilizan en la presente memoria se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de unión única y afinidad para MAC o para un epítope particular del MAC. El anticuerpo es una IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4.

También es útil para el ensayo del MAC un anticuerpo que es un anticuerpo recombinante. El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón). Las células hospederas de mamíferos para expresar los anticuerpos recombinantes utilizados en los métodos en la presente memoria incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO dhfr-, descritas en Urlaub and Chasin 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 4220, y se utiliza con un marcador seleccionable DH FR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman and P A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma N<s>O, células COS y células SP2. En particular, para uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión del gen GS que se muestra en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Para producir anticuerpos, se introducen vectores de expresión que codifican para la proteína de interés intacta o una porción en células hospederas de mamíferos, y las células hospederas se cultivan durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se crecen las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteínas.

En la técnica se conocen ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia la diana de diversas especies, incluyendo, por ejemplo, ELISAs, inmunodetecciones tipo Western y RIAs. Las cinéticas de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también se pueden evaluar mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, como el análisis Biacore.

Las metodologías generales para la producción de anticuerpos, incluyendo los criterios a tener en cuenta al elegir un animal para la producción de antisueros, se describen en Harlow et al. (1988, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 93-117). Por ejemplo, un animal de tamaño adecuado, tal como cabras, perros, ovejas, ratones o camellos, se inmuniza mediante la administración de una cantidad de inmunógeno, tal como la proteína intacta o una porción de la misma que contiene un epítope del MAC humano, eficaz para producir una respuesta inmune. Un protocolo ejemplar es el siguiente. Se inyecta al animal por vía subcutánea en la espalda con 100 microgramos a 100 miligramos de antígeno, dependiendo del tamaño del animal, seguido tres semanas después con una inyección intraperitoneal de 100 microgramos a 100 miligramos de inmunógeno con adyuvante dependiendo del tamaño del animal, por ejemplo, adyuvante completo de Freund. Se administran inyecciones intraperitoneales adicionales cada dos semanas con adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund, hasta lograr un título adecuado de anticuerpos en la sangre del animal. Los títulos ejemplares incluyen un título de al menos alrededor de 1:5000 o un título de 1:100,000 o más, es decir, la dilución que tiene una actividad detectable. Los anticuerpos se purifican, por ejemplo, mediante purificación por afinidad en columnas que contienen MAC humano.

La técnica de inmunizaciónin vitrode linfocitos humanos se utiliza para generar anticuerpos monoclonales. Las técnicas para inmunizaciónin vitrode linfocitos humanos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Inai et al. May 1993 Histochemistry 99(5): 335-362; Mulder et al. 1993 Hum. Inmunol. 36(3): 186-192; Harada, et al. 1993 J. Oral. Pathol. Med., 22(4): 145-152; Stauber, et al. 1993 J. Inmunol. Methods 161(2): 157-168; y Venkateswaran et al. 1992 Hybridoma 11(6): 729-739. Estas técnicas se pueden utilizar para producir anticuerpos monoclonales reactivos al antígeno, incluyendo anticuerpos monoclonales IgG e IgM específicos para el antígeno. Cualquier anticuerpo o fragmento del mismo que tiene afinidad y sea específico para el MAC humano está dentro del alcance del ensayo para la deposición del MAC proporcionado en la presente memoria.

En los ejemplos en la presente memoria, el contacto con CD59 se logra inyectando células o tejidos con un vector que codifica para el gen CD59.

En los ejemplos en la presente memoria, la lisis celular se mide mediante la captación de yoduro de propidio (PI). El Pi está disponible comercialmente, por ejemplo, en Fluka BioChemica (Buchs, Switzerland). El PI es un agente intercalante que emite fluorescencia cuando se une al ADN. El PI es impermeable a la membrana y generalmente se excluye de las células viables, por lo tanto, PI se utiliza comúnmente para identificar y/o determinar la cantidad de células no vivas en una población mixta.

En los ejemplos en la presente memoria y en ciertas realizaciones, la proteína detectable es una proteína fluorescente, por ejemplo, proteína fluorescente verde, aequorina, proteína fluorescente cian, proteína fluorescente DsRed, proteína fluorescente verde mejorada y proteína fluorescente amarilla. La proteína fluorescente verde (GFP) y la aequorina son composiciones bioluminiscentes aisladas de la medusaAequorea victoria.Cuando un ion calcio se une a aequorina, el complejo se descompone en apoaequorina y una composición luminiscente, la cual emite luz azul. La aequorina sintética está disponible comercialmente en Sealite, Sciences (Bogart, Ga.) como AQUALITE®. La GFP emite luz en la porción verde inferior del espectro visible, y la GFP sintética está disponible comercialmente en Clontech (Mountain View, CA).

Se han realizado mutaciones a la secuencia de aminoácidos de GFP para producir secuencias de aminoácidos de GFP derivadas que emiten fluorescencia de diferentes colores, por ejemplo, proteína fluorescente cian, proteína fluorescente DsRed, proteína fluorescente verde mejorada y proteína fluorescente amarilla. La proteína fluorescente cian sintética, la proteína fluorescente DsRed sintética, la proteína fluorescente verde sintética mejorada y la proteína fluorescente amarilla sintética están cada una disponibles comercialmente en Clontech (Mountain View, CA).

En realizaciones alternativas, el agente detectable es un agente fluorescente que no es una proteína fluorescente, por ejemplo, verde de indocianina, doxorrubicina, riboflavina, clorofila y porfirina.

El verde de indocianina (ICG) es un colorante de tricarbocianina que, al excitarse, emite luces a alrededor de 800 nm, alrededor de 820 nm, alrededor de 840 nm o alrededor de 860 nm. ICG está disponible comercialmente en H.W. Sands Corp. (Jupiter, FL). La doxorrubicina es fluorescente y emite luz en longitudes de onda de, por ejemplo, alrededor de 550 nm, 600 nm o 650 nm. La doxorrubicina está disponible comercialmente en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). La riboflavina está disponible comercialmente en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y es fluorescente, emitiendo luz a una longitud de onda de, por ejemplo, alrededor de 450 nm, alrededor de 550 nm, alrededor de 650 nm o alrededor de 750 nm. La clorofila A es un pigmento fotosintético verde que emite luz a una longitud de onda de, por ejemplo, alrededor de 600 nm, alrededor de 700 nm o alrededor de 800 nm. La clorofila A está disponible comercialmente a través de proveedores como Sigma Chemical (St. Louis, MO) y Turner Designs (Sunnyvale, CA). La porfirina es un macrociclo heterocíclico formado por 4 subunidades de pirrol unidas en lados opuestos a través de 4 puentes de metino (=CH-). La extensa estructura conjugada de porfirina hace que el compuesto sea cromático, es decir, fluorescente a una longitud de onda de, por ejemplo, alrededor de 600 nm, o alrededor de 650 nm, o alrededor de 700 nm. La porfirina está disponible comercialmente en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

En otras realizaciones alternativas, el agente detectable es un agente enzimático, que es una proteína, por ejemplo, p-galactosidasa o fosfatasa alcalina, que se puede expresar en un vector de nucleótidos.

La p-galactosidasa es una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de p-galactósidos en monosacáridos. Un kit de detección de p-galactosidasa luminiscente está disponible comercialmente en Clontech (Mountain View, CA). La fosfatasa alcalina es una enzima hidrolasa responsable de eliminar los grupos fosfato de muchos tipos de moléculas, incluyendo nucleótidos, proteínas y alcaloides. Un kit de detección de fosfatasa alcalina luminiscente está disponible comercialmente en Sigma Aldrich (St. Louis, MO).

Composiciones farmacéuticas

La divulgación proporciona un método que utiliza un ácido nucleico que codifica para una proteína CD59 para inhibir la activación del inflamasoma en células de un ojo afectado por la inflamación en un sujeto, o una proteína CD59 soluble. En diversas realizaciones, la proteína CD59 incluye una proteína CD59 independiente de la membrana (soluble). En ciertas realizaciones, la composición de CD59 está formulada para administración intravenosa. En ciertas realizaciones, la composición se compone como una formulación oftalmológica para administración al ojo y se puede combinar para mejorar la administración al fondo del ojo, para proporcionar una liberación sostenida localmente en la retina o formularse de otro modo para proporcionar un tratamiento eficaz de los vasos y/o el tejido involucrado en enfermedades oculares, incluyendo la degeneración macular. En realizaciones relacionadas, la composición farmacéutica está formulada lo suficientemente pura para administración a un sujeto humano, por ejemplo, a la circulación o al ojo de un sujeto humano. En ciertas realizaciones, estas composiciones incluyen opcionalmente adicionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales. En ciertas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en factores de crecimiento, agentes antiinflamatorios, agentes vasopresores que incluyen, pero no se limitan a, óxido nítrico y bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de la colagenasa, esteroides tópicos, inhibidores de la metaloproteinasa de matriz, ascorbatos, angiotensina II, angiotensina III, calreticulina, tetraciclinas, fibronectina, colágeno, trombospondina, factores de crecimiento transformantes (TGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento tipo insulina (IGFs), proteínas de unión a IGF (IGFBPs), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de diferenciación neu (NDF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), EGF de unión a heparina (HBEGF), trombospondinas, factor C de von Willebrand, heparina y sulfatos de heparina y ácido hialurónico.

En otras realizaciones, el agente adicional es un compuesto, composición, agente biológico o similar que potencia, estabiliza o sinergiza o incluso sustituye la capacidad de la proteína CD59 para proteger a las células de la deposición del MAC. También se incluyen agentes terapéuticos que se pueden proporcionar de manera benefica o conveniente al mismo tiempo que la proteína CD59, tales como agentes utilizados para tratar la misma, un síntoma, condición o enfermedad concurrente o relacionada. En algunas realizaciones, el fármaco puede incluir, sin limitación, agentes antitumorales, antivirales, antibacterianos, anti micobacterianos, antifúngicos, anti proliferativos o anti apoptóticos. Los fármacos que se incluyen en las composiciones de la invención son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman, et al., eds., McGraw-Hill, 1996.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA, 1995 proporciona diversos portadores utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Algunos ejemplos de materiales los cuales pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, azúcares tales como glucosa y sacarosa; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones amortiguadoras de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes desmoldantes, agentes de recubrimiento, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.

Dosis terapéuticamente eficaz

El tratamiento de un ojo afectado por la inflamación mediante los métodos proporcionados en la presente memoria implica poner en contacto un tejido o células con una composición farmacéutica, por ejemplo, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene como agente activo un ácido nucleico que codifica para una proteína CD59 o una fuente de expresión de una proteína CD59, a un sujeto con necesidad de la misma, en las cantidades y durante el tiempo que sean necesarios para lograr el resultado deseado. Los métodos incluyen, por ejemplo, el tratamiento de la uveítis poniendo en contacto un tejido ocular o célula con una proteína CD59 o con un vector que codifica para la proteína CD59.

Las composiciones, de acuerdo con el método de la presente invención, se pueden administrar utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para tratar la uveítis u otras enfermedades y afecciones relacionadas con el complemento. Por tanto, la expresión "cantidad eficaz para tratar la uveítis", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cantidad suficiente de la composición para prevenir o mejorar de forma benefica los síntomas de la uveítis.

La dosis exacta es elegida por el médico individual en función del paciente a tratar. La dosis y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente(s) activo(s) o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, por ejemplo, etapa intermedia o avanzada de la uveítis; edad, peso y género del paciente; dieta, tiempo y frecuencia de la administración; vía de administración; combinaciones de fármacos; sensibilidades de reacción; y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada hora, dos veces por hora, cada 3 a 4 horas, diariamente, dos veces al día, cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la composición particular.

Los agentes activos de la invención se formulan preferiblemente en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La expresión "forma unitaria de dosificación" como se utiliza en la presente memoria se refiere a una unidad físicamente discreta de un agente activo adecuado para el paciente que será tratado. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones de la presente invención será decidido por el médico tratante dentro del alcance del criterio médico sólido. Para cualquier agente activo, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, como se proporciona en la presente memoria, generalmente ratones, pero también potencialmente ratas, conejos, perros o cerdos. El modelo de célula animal proporcionado en la presente memoria también se utiliza para lograr una concentración deseable, un intervalo de dosificación total y una vía de administración. Entonces, esta información se puede utilizar para determinar dosis y vías de administración útiles en los humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de agente activo que mejora los síntomas o la condición o previene la progresión de la uveítis. La eficacia terapéutica y toxicidad de los agentes activos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis es terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) y LD50 (la dosis es letal para el 50% de la población). La proporción de dosis de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción, LD50/ED50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios con animales se utilizan en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano.

La dosificación diaria de los productos se puede variar sobre de un amplio intervalo, tal como de 0.001 a 100 mg por adulto humano por día. Para la administración ocular, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de una solución que contiene 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0 o 500.0 microgramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar.

La dosis de una proteína CD59 soluble, administrada por vía intravenosa, puede estar en un intervalo de 0.01 miligramos por kilogramo por dosis a alrededor de 10 miligramos por kilogramo por dosis, de 0.1 miligramos por kilogramo por dosis a alrededor de 5 miligramos por kilogramo por dosis, o de 1.0 miligramo por kilogramo por dosis a alrededor de 5 miligramos por kilogramo por dosis. El protocolo de dosificación incluye una frecuencia de diariamente, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

Una dosis unitaria normalmente contiene de alrededor de 0.001 microgramos a alrededor de 500 microgramos del ingrediente activo, preferiblemente de alrededor de 0.1 microgramos a alrededor de 100 microgramos del ingrediente activo, más preferiblemente de alrededor de 1.0 microgramos a alrededor de 10 microgramos del ingrediente activo. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra normalmente en un nivel de dosificación de alrededor de 0.0001 mg/kg a alrededor de 25 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, el intervalo es de alrededor de 0.001 a 10 mg/kg de peso corporal por día, o de alrededor de 0.001 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal por día. Las composiciones se pueden administrar en un régimen de, por ejemplo, una a cuatro o más veces al día. Una dosis unitaria se puede dividir, por ejemplo, administrarse en dos o más dosis divididas.

La administración como una fuente de expresión de una proteína CD59 es la administración de una dosis de un vector viral o un vector de ácido nucleico, de modo que la dosis contiene al menos alrededor de 50, 100, 500, 1000 o al menos alrededor de 5000 partículas por célula a tratar. El número de células se puede calcular a partir del área de la retina que necesita tratamiento mediante métodos conocidos por una persona experta en la técnica del tratamiento de la uveítis o de trastornos oculares.

Administración de composiciones farmacéuticas

Tal como se formula con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado en una dosis deseada, la composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria se administra a humanos y otros mamíferos por vía tópica, tal como por vía ocular (como mediante soluciones, ungüentos o gotas), nasal, bucal, oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal o intraperitoneal.

Las inyecciones oculares incluyen inyección intraocular en el humor acuoso o vítreo, o la inyección en las capas externas del ojo, como por ejemplo mediante inyección subconjuntival o inyección subtenoniana.

Las formas de dosificación líquidas para administración ocular, oral, intravenosa u otra administración sistémica incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del agente(s) activo(s), las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, de castor y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones administradas por vía ocular, oral u otras administraciones sistémicas también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes y agentes emulsionantes y de suspensión.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica inventiva incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches. El agente activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o amortiguador necesario según se requiera. Por ejemplo, las vías de administración ocular o cutánea se logran con gotas acuosas, una bruma, una emulsión o una crema. La administración puede ser terapéutica o puede ser profiláctica. La invención incluye dispositivos oftalmológicos, dispositivos quirúrgicos, dispositivos o productos audiológicos, los cuales contienen las composiciones divulgadas (por ejemplo, vendas o tiras de gasa), y métodos para fabricar o utilizar dichos dispositivos o productos. Estos dispositivos pueden estar recubiertos con, impregnados con, unidos a o tratados de otro modo con una composición como la descrita en la presente memoria.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de los ingredientes activos al cuerpo. Estas formas de dosificación se pueden preparar disolviendo o dispensando el compuesto en el medio adecuado. También se pueden utilizar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La tasa se puede controlar ya sea proporcionando una membrana controladora de la tasa o mediante dispersión del compuesto en una matriz de polímero o gel.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o agentes humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteral aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la solución de Ringer, U.S.P y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos, estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluyendo los mono o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se utilizan ácidos grasos como el ácido oleico. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso. Con la finalidad de prolongar el efecto de un agente activo, a menudo es deseable retardar la absorción del agente mediante inyección subcutánea o intramuscular. La absorción retardada de un agente activo administrado por vía parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo el agente en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se elaboran formando matrices de microencapsulaciones del agente en polímeros biodegradables como poliglicólido polilactida. Dependiendo de la proporción del agente activo al polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la tasa de liberación del agente activo. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el agente en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar mezclando el o los agentes activos de esta invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios, los cuales son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el o los agentes activos.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, el agente activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte, farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) rellenos o extensores tales como almidones, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos.

También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras utilizando excipientes tales como azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólidas de tabletas, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos de control de la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En dichas formas de dosificación sólidas, los agentes activos se pueden mezclar con al menos un diluyente inerte, como sacarosa o almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas a los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para la formación de tabletas y otros auxiliares para la formación de tabletas, tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, tabletas y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes amortiguadores. Estos pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que libere el o los agentes activos sólo, o preferentemente, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones embebidas que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Una parte de este trabajo se adjunta a la presente como Apéndice. A, se preparó para publicación como un manuscrito titulado " Complement mediated activation of the NLRP3 Inflammasome and its Inhibition by AAV mediated delivery of CD59 in a model of uveitis" de los coautores y coinventores Binit Kumar, Siobhan M. Cashman y Rajendra Kumar-Singh.

Monitoreo de enfermedades y selección de pacientes para tratamiento

Las composiciones de proteína y ácido nucleico de CD59, descritas en la presente memoria, son útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y relacionadas con el inflamasoma. Las composiciones descritas se pueden administrar a un individuo seleccionado para el tratamiento sobre la base de un resultado positivo en una prueba que analiza la actividad del inflamasoma. Esta prueba no se limita a medidas directas de la activación del inflamasoma, sino también a medidas indirectas. Una medida indirecta puede ser, por ejemplo, la medición de citocinas, quimiocinas, marcadores de la superficie celular de tejidos inflamados o enfermos, la activación celular de tipos inmunes específicos, la presencia o ausencia de tipos inmunes específicos. Por ejemplo, las citocinas como IL-1a, IL-1p e IL-18 se elevan en respuesta a la activación del inflamasoma. Por lo tanto, el individuo seleccionado puede mostrar niveles elevados de estas citocinas en plasma, suero, sangre, secciones histológicas, ARNm o extractos de células de un tejido enfermo, o niveles elevados de expresión o secreción por células inmunes aisladas de la sangre o de un tejido enfermo. Un criterio de selección para el tratamiento con una composición de proteína o ácido nucleico de CD59 puede ser niveles elevados o actividad de una o más de caspasa 1, caspasa 5, IL-1p, IL-p17, IL-18, proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/A<s>C), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP), IFN-Y, un marcador de células T Th1 o citocina, un marcador de células T Th17 o citocina, y c D4+.

Los niveles elevados de citocinas IL-1 a, IL-1 p, IL-p17, IL-18 o IFN-<y>se pueden evaluar, por ejemplo, mediante ELISA, AlphaLISA®, inmunohistoquímica, análisis de citometría de flujo de poblaciones celulares relevantes o RT-PCR cuantitativa. La activación de la caspasa y el inflamasoma se puede determinar mediante inmunohistoquímica de una muestra de biopsia utilizando anticuerpos específicos para los componentes de la caspasa y el inflamasoma activados, como la caspasa 1, la caspasa 5, la proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC), una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP). Las células Th1 y Th17 se pueden identificar utilizando citometría de flujo para los marcadores de la superficie celular CXCR3 o CCR5 o para el factor de transcripción TBX21, en el caso de Th1; o para los marcadores de la superficie celular CCR6 y CCR4, o tinción intracelular para el factor de transcripción RORg/gt en el caso de Th17.

Las composiciones de proteína y ácido nucleico de CD59 descritas se pueden administrar a un individuo seleccionado para el tratamiento sobre la base de un diagnóstico de un trastorno relacionado con el inflamasoma, como la enfermedad de Alzheimer, una esclerosis múltiple, un infarto al miocardio, una enfermedad vascular aterosclerótica, una microvasculopatía, una tiroiditis, una enfermedad inflamatoria intestinal, un rechazo de injerto de órgano, una nefritis membranosa, una oftalmía simpática y una sarcoidosis. Se incluyen trastornos oculares relacionados con el inflamasoma, como una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática y una sarcoidosis.

En ciertas realizaciones, las composiciones de proteína o ácido nucleico de CD59 se pueden administrar después de que se haya monitoreado a un individuo para su respuesta a al menos una dosis de dicha composición u otro tratamiento para reducir la inflamación o resolver una enfermedad relacionada con el inflamasoma. Este ciclo de administración y monitoreo se puede repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más veces o hasta lograr una respuesta clínica adecuada o hasta que se haya reducido la actividad del inflamasoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de proteína y ácido nucleico de CD59 pueden ser: 1) administradas a un individuo seleccionado por tener una enfermedad relacionada con el inflamasoma o un resultado positivo para la actividad del inflamasoma; 2) posteriormente se puede monitorear al individuo y, en función del empeoramiento, la ausencia de cambios o una respuesta subóptima según lo determinado por una prueba de la actividad del inflamasoma o criterios de diagnóstico para una enfermedad relacionada con el inflamasoma, el individuo puede recibir al menos una o más administraciones posteriores de la composición. En ciertas realizaciones, las composiciones de proteína y ácido nucleico de CD59 pueden ser: 1) administradas a un individuo; 2) posteriormente se puede monitorear al individuo y, en función del empeoramiento, la ausencia de cambios o una respuesta subóptima o mayor según lo determinado por una prueba de actividad del inflamasoma o criterios de diagnóstico para una enfermedad relacionada con el inflamasoma, el individuo puede recibir al menos una o más administraciones posteriores de la composición.

Ejemplos

Ejemplo 1: Ratones

Los ratones C57BL/6J y C9-/- en el fondo C57BL/6J se adquirieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en las instalaciones para animales de Tufts University School of Medicine, Boston. Todos los protocolos de estudios con animales se conforman a la resolución de la Association for Research in Visión and Ophthalmology resolution on the use of Animals in Vision Research y las recomendaciones de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals de los National Institutes of Health.

Ejemplo 2: Construcciones AAV e inyecciones intravítreas

Se construyó un vector de serotipo 2 AAV que expresa una forma truncada de CD59 de humano o protectina (AAVCAGsCD59) en la que se ha eliminado la señal de anclaje del glicosilfosfatidilinositol (GPI) mediante protocolos descritos en Cashman, S. M., et al. (2011) PLoS One 6, e19078. La CD59 soluble (sCD59) se expresa a partir de un promotor de p-actina de pollo. Como control negativo, se utilizó un vector similar que expresa la proteína fluorescente verde (AAVCAGGFP). A ratones C57Bl/6J de seis semanas de edad se les inyectaron 3.5 x 109 copias del genoma/jl de AAVCAGsCD59 o AAVCAGGFP o PBS (1 j l) y una semana después los ratones fueron desafiados con EAU como se describe en los ejemplos en la presente memoria.

Ejemplo 3: Inducción de EAU mediante inmunización activa

Se inmunizaron ratones C57Bl/6J y C9-/- de seis semanas de edad en el mismo fondo genético con 200 jg de péptido 1-20 de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP) de humano (secuencia de aminoácidos: GPT<h>L<f>QPSLVLDMAKVLLD, SEQ ID NO: 1; Biomatik Corporation, Cambridge, ON, Canada) emulsionado en 200 j l de 1:1 vol/vol con adyuvante completo de Freund (CFA) que contiene la cepa H37RA deMycobacterium tuberculosis(2.5 mg/mL). Los ratones recibieron simultáneamente 1.5 jg de toxina deBordetella pertussisdiluida en 100 ul de PBS mediante inyección intraperitoneal (Agarwal, R. K., et al. (2012) Methods Mol. Biol. 900, 443-469).

Ejemplo 4: Inmunohistoquímica

Las secciones de retina criostáticas (10 jm ) se rehidrataron en PBS durante 15 minutos, se bloquearon con suero de cabra normal al 6% en PBS durante una hora y se incubaron durante la noche en una cámara húmeda con el anticuerpo primario contra conejo anti humano C5b-9 (Complement Technology, Inc., Tyler, TX; dilución: 1:800, diluido en PBS que contiene suero de cabra normal al 2%). Posteriormente, las secciones se lavaron y se incubaron en anticuerpo secundario anti conejo conjugado con Cy3 (Molecular Probes, Eugene, OR) para localizar C5b-9 en secciones de la retina. Los portaobjetos se montaron en un medio anti decoloración que contenía DAPI (Vectashield-DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA) para contrateñir los núcleos y se obtuvieron imágenes con un microscopio confocal Leica. La intensidad de la tinción de C5b-9 en toda la sección se cuantificó utilizando el software Imaged (National Institutes of Health; Bethesda, MD).

Ejemplo 5: Análisis de inmunodetección tipo Western

Las retinas murinas se cosecharon y homogeneizaron en amortiguador RIPA enfriado con hielo que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7.4), 250 mM de NaCl y Nonidet P-40 al 1%, con un cóctel de inhibidores de proteasa. Cada muestra de proteína (35 jg ) se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (cualquier kD™ Mini-PROTEICO® gel prefabricado, Biorad, CA) para NLRP3, Caspasa-1 y ASC, y posteriormente se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con amortiguador de bloqueo (LI-COR, Lincoln, NE, USA), mezclado con Tween-20 al 0.1%, las inmunodetecciones se incubaron durante la noche a 4°C con monoclonal de ratón anti NLRP3, monoclonal de ratón anti Caspasa 1 y policlonal de conejo anti ASC (Adipogen Corporation, San Diego, CA; dilución: 1:500) como los anticuerpos primarios. Después de la incubación con el anticuerpo secundario adecuado, las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el escáner de infrarrojo LI-COR-Odyssey (LI-COR). Las manchas se volvieron a sondear con p-actina como control de carga.

Ejemplo 6: Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Las citocinas se cuantificaron mediante ELISA de sándwich para IL-1 p, IFN-<y>e IL-17 de ratón (PeproTech, Rocky Hills, NJ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando 20 jg de sobrenadante de proteína de la retina. Los sobrenadantes se agregaron por duplicado y la citocina que se estaba midiendo se reveló con un anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano picante. La concentración de citocinas se describió en pg/mL.

Ejemplo 7: Expresión génica

El ARN total se aisló de la retina de ratón utilizando el mini kit RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se cuantificó mediante absorbancia de 260 nm en un 'Nanodrop' y se utilizó 1 jg de ARN para la síntesis del ADNc utilizando el kit de transcripción reversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) utilizando cebadores TaqMan prediseñados para beta-actina (Mm02619580_g1), IL-1 p (Mm00434228_m1), IL-17 (Mm00439619_m1) e IFN-Y (Mm01168134_ml). La desnaturalización se realizó a 95 °C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos, y el recocido y la extensión se realizaron a 60°C durante 60 segundos. Los productos finales de la PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2% para confirmar la especificidad de la PCR. Los valores de Ct obtenidos de la RT-PCR se normalizaron al valor de Ct de b-actina en la misma muestra utilizando el método ddCt y se obtuvieron datos de cambio de veces en la expresión génica. La expresión génica de IL-17 se cuantificó semi cuantitativamente.

Ejemplo 8: Citometría de flujo

Se aislaron células de los ganglios linfáticos de drenaje de ratones y se obtuvieron suspensiones de células individuales pasando las células a través de una malla de nailon de 40 pm. Las células de ganglios linfáticos de drenaje que habían sido estimuladas con 50 ng/mL de PMA y 500 ng/mL de ionomicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) durante cuatro horas en presencia de GolgiStop (BD Biosciences, San José, CA) antes de la tinción de citocinas intracelulares. Las células se tiñeron para los marcadores de la superficie CD4 y luego se fijaron con amortiguador Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, San Jose, CA) para la tinción de citocinas. Las células se tiñeron con anticuerpos marcados con fluoróforo diluidos adecuadamente para dianas intracelulares (IFN<y>, IL-17; eBiosciences, Inc., San Diego, CA) y controles de isotipo respectivos en amortiguador Perm/Wash (BD Biosciences, San José, CA). La citometría de flujo se realizó en un FACS Calibur (BD Biosciences) y los datos se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Se estableció la selección con base en los controles de isotipo adecuados. Donde se indica, el porcentaje de células positivas representa el porcentaje en la población seleccionada en relación con los controles normales.

Ejemplo 9: Electrorretinograma

Se utilizó el análisis de Electrorretinograma (ERG) escotópico y fotópico para medir la pérdida de la función de los bastones y los conos. Tres semanas después de la inducción de la EAU, se registraron los exámenes de ERG utilizando un sistema UTAS con BigShot ganzfeld (LKC Technologies; Gaithersburg, MD). Después de la adaptación a la oscuridad durante la noche, los ratones fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) bajo condiciones de oscuridad. Las pupilas se dilataron con tropicamida al 1% y clorhidrato de fenilefrina al 2.5%. Los electrodos de oro de las lentes de contacto activas del ERG se colocaron suavemente en el centro de la córnea con una gota de lubricante (GenTeal, Alcon, Inc., Fort Worth, TX) para mantener la hidratación de la córnea y una mejor conductividad eléctrica. Los electrodos de referencia y los electrodos de tierra se insertaron subcutáneamente en la parte posterior del cuello y cerca de la base de la cola, respectivamente. Los ERGs escotópicos se obtuvieron con destellos de luz blanca de 10 mseg a 0 dB (5 cd/m2), -10 dB (25 cd/m2), -20 dB (25 cd/m2). Se examinaron ERGs fotópicos simultáneos después de un blanqueamiento con luz blanca de dos minutos. Las respuestas fotópicas se obtuvieron con destellos de luz blanca a intensidad de 0 dB y 1dB (3.15 cds/m2). Se promediaron diez respuestas en cada intensidad de destello. La amplitud de la onda a se midió desde la línea de base hasta el pico negativo de la onda a, y la onda b se midió desde el pico negativo de la onda a hasta el pico de la onda b.

Ejemplo 10: Tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (OCT) e imágenes de fondo de ojo

Los ratones fueron anestesiados con un cóctel de ketamina y xilazina y se les dilataron las pupilas con una gota de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2.5%. Las córneas se mantuvieron humedecidas mediante la aplicación tópica de un lubricante ocular (GenTeal, Alcon, Inc., Fort Worth, TX). Las imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) se adquirieron utilizando un sistema de imágenes oftálmicas de dominio espectral Bioptigen (Bioptigen Envisu R2300, Morrisville, NC). Se obtuvieron escaneos de volumen y escaneos B simples promediados con imágenes centradas en la cabeza del nervio óptico como se describe en Chen, J., et al. (2013) PLoS One 8, e63904.

Después de 24 días de la EAU, se realizó una toma de imágenes de fondo de ojo y se capturaron imágenes utilizando un microscopio de imágenes de retina Micron III y el software StreamPix (Phoenix Research Labs, Pleasanton, CA). Específicamente, se examinaron los ojos en busca de síntomas fisiológicos y patológicos tales como infiltrados, abultamientos alrededor de los vasos sanguíneos, lesiones lineales blancas, distrofia de la retina, hemorragias subretinianas y desprendimiento de la retina. Dos observadores independientes evaluaron de forma ciega una puntuación individual en una escala de 0-4 para cada uno de los parámetros individuales: infiltrados de la retina, cambios en el disco óptico, vascularidad y daño estructural. Las puntuaciones clínicas se calcularon promediando la puntuación de cada uno de estos cuatro criterios (Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326).

Ejemplo 11: Histopatología

Los ojos para examen histológico de todos los grupos se cosecharon 24 días después de la inmunización y se fijaron en formalina amortiguada al 10%. Después de la fijación durante dos días, las muestras se deshidrataron mediante pasos graduados de alcohol y se embebieron en bloques de parafina. Se cortaron seis secciones verticales (5 pm) en seis planos diferentes, incluyendo la región del nervio óptico, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. La gravedad detallada de la EAU se evaluó en una escala de 0-4 para daño a los fotorreceptores, infiltración y vasculitis como se describió anteriormente en Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 14901495. Con base en estos criterios, la puntuación de daño a los fotorreceptores se calculó como una puntuación combinada de pérdida de fotorreceptores, pliegues de la retina y desprendimiento de la retina. De manera similar, la puntuación de infiltración se compuso de una combinación de granuloma, hemorragia, nódulo DF e infiltrados. La puntuación de vasculitis representa la inflamación perivascular y la infiltración de células CD4 alrededor de la vasculatura, la formación de trombos y la extensión de la vasculatura afectada en la retina.

Ejemplo 12: Análisis estadístico

Los resultados se muestran como media ± SEM. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para una puntuación clínica, una puntuación histológica y un análisis de FACS. Las diferencias estadísticas entre dos grupos se analizaron mediante una prueba de t no pareada. Para la comparación entre más de dos grupos, se realizó un ANOVA de una vía. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p menor o igual a 0.05.

Ejemplo 13: Deposición del MAC en la EAU

Un paso final en la activación del complemento resulta en la deposición del MAC en la superficie de las células. El reclutamiento de múltiples moléculas de C9 en el complejo preformado C5b-8 es el paso final y necesario en el ensamblaje del MAC (C5b-9). Por lo tanto, los ratones deficientes en C9 no pueden formar complejos MAC funcionales.

Con la finalidad de determinar si el MAC se forma en la superficie de las células de la retina en la EAU, se examinaron secciones de retina congeladas 24 días después de la inducción de la EAU en ratones C57Bl/6J mediante tinción con anticuerpo contra C5b-9. Se observó que la deposición del MAC en la retina de ratones con EAU era 70% mayor en comparación con la deposición del MAC en la retina de ratones de control normales. Se observó que la deposición del MAC en la superficie de la retina C9-/- con EAU no era significativa (Figura 1A y Figura 9). Los datos obtenidos indicaron que el complemento se activa en la EAU y que la reacción llega a completarse para formar MAC en los tejidos de la retina. Los datos también indican que los ratones C9-/- con EAU no fueron capaces de formar MAC en la retina.

Ejemplo 14: Activación del inflamasoma en la EAU

La deposición del MAC en la superficie de las células conduce a la formación de un poro el cual resulta en un aumento en el calcio intracelular. En los ejemplos en la presente memoria se examinó si la deposición del MAC desencadenaba la activación del inflamasoma NLRP3 y la posterior secreción de IL-1 p.

Los datos obtenidos encontraron que la EAU en ratones C57Bl/6J condujo a 112% más proteína IL-1 p y un ARNm de IL-1 p 45 veces mayor correspondiente que los controles de ratones normales. Por el contrario, se observó que los ratones C9-/- con EAU lograron 37% más proteína IL-1 p y un ARNm de IL-1 p 3.8 veces mayor correspondiente (Figura 1B y C). Los análisis de inmunotransferencia tipo Western indicaron una proteína NLRP3200% mayor en ratones con EAU, y los ratones C9-/- con EAU tenían 8% más proteína NLRP3 (Figura 1D).

Un componente importante del complejo del inflamasoma es la caspasa-1, la cual generalmente se presenta en forma de zimógeno inactivo, activado por el complejo NLRP3 mediante proteólisis en subunidades p10 y p20 activas para formar el complejo del inflamasoma multimérico final. Los análisis de inmunotransferencia tipo Western mostraron una activación 80% mayor de la caspasa-1 (p20) en las retinas de ratones con EAU que los normales; sin embargo, se observó una activación 25% mayor de la caspasa-1 (p20) en las retinas de ratones C9-/- con EAU en comparación con los normales (Figura 1E). Se midió la expresión de la proteína ASC, la cual es una proteína adaptadora del inflamasoma en las retinas de ratones con EAU mediante inmunotransferencia tipo Western. Los análisis de inmunotransferencia tipo Western indicaron que se observó 44% más de proteína ASC en ratones con EAU y 18% más de proteína ASC en ratones C9-/- con EAU que los normales (Figura 1F).

Por lo tanto, se observó que cada uno de IL1- p, NLRP3, Caspasa1 y ASC estaban elevados en EAU, y los ratones C9-/- con EAU estaban parcialmente protegidos de dicho aumento, lo cual indica que la deposición del MAC es un jugador importante en la activación del inflamasoma en la EAU.

Ejemplo 15: Papel del MAC en la función de la retina en la EAU

La función de la retina en ratones con EAU y C9-/- con EAU se midió utilizando el electrorretinograma (ERG). Se observó que la función de la retina de los ratones con EAU tenía amplitudes de ondas a adaptadas a la oscuridad que se redujeron en 33%, 50% y 41% a intensidades de destello de -20dB, -10dB y OdB respectivamente en comparación con los ratones de control C57Bl/6J. Se observó que la función de la retina de los ratones C9-/- con EAU tenía amplitudes de onda a menores, específicamente en 9%, 40% y 27% a intensidades de destello de -20dB, -10dB y OdB respectivamente, que los ratones de control normales C57Bl/6J (Figura 2A y Figura 2B).

Se observó que las amplitudes de onda b adaptadas a la oscuridad en los ratones con EAU se reducían un 47%, 52% y 49% a intensidades de destello de -20dB, -10dB y OdB respectivamente, en comparación con los ratones de control C57Bl/6J. Se observó que los ratones C9-/- con EAU tenían amplitudes de onda b adaptadas a la oscuridad que eran menores, específicamente en 32%, 33% y 17% a intensidades de destello de -20dB, -10dB y OdB respectivamente, en comparación con los ratones de control C57Bl/6J. Aunque se observaron diferencias en los ERGs adaptados a la oscuridad tanto de onda a como de onda b, se observó que la OdB era estadísticamente significativa (p < 0.05) (Figura 2A y Figura 2B).

Se observó que los ratones con EAU tenían amplitudes de onda b adaptadas a la luz que se redujeron un 44% y 37% en intensidades de destello de 0dB y 1dB respectivamente, en comparación con los ratones de control C57Bl/6J. Se observó que los ratones C9-/- con EAU tenían amplitudes de onda b que se redujeron un 5% y 15% en intensidades de destello de 0dB y 1dB respectivamente, en comparación con los ratones de control C57Bl/6J. Aunque se observaron diferencias en las amplitudes de onda b adaptadas a la luz, se observó que la OdB era estadísticamente significativa (p < 0.05) (Figura 2A y Figura 2B).

Ejemplo 16: Sin preservación significativa de la estructura de la retina en C9-/- con UEA

La estructura de la retina y la gravedad patológica de la enfermedad en ratones con EAU y C9-/- con EAU se cuantificaron utilizando imágenes de fondo de ojo, OCT e histología 24 días después de la inducción de la EAU. Basado en criterios de puntuación clínica desarrollados por Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326, las imágenes de fondo de ojo indicaron que los ratones con EAU tenían una inflamación grave, específicamente una puntuación clínica general 16 veces mayor que el grupo de control, incluida una inflamación vascular 38 veces mayor, una infiltración de células inmunes 8 veces mayor, un daño 13 veces mayor al disco óptico y un daño estructural 34 veces mayor en comparación con los ratones de control C57Bl/6J. Inesperadamente, se observó que los ratones C9-/- sometidos a uveítis tenían resultados patológicos estadísticamente equivalentes a los de los ratones con EAU (Figura 3).

Veinticuatro días después de la inmunización, se observó que los ratones con EAU presentaban una infiltración celular inflamatoria grave en el vítreo y la coroides, vasculitis de la retina, edema de la retina y un plegamiento de la retina de moderado a grave e infiltrados en comparación con los ratones de control C57Bl/6J, como se observó mediante imágenes de OCT e histopatología (Figura 4A y Figura 4B). Se realizó un análisis histológico detallado en secciones embebidas en parafina de retinas de ratones de control, con EAU y C9-/- con EAU y se puntuó de acuerdo con los criterios descritos en Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495. Se observó que los ratones con EAU tenían al menos alrededor de 27 veces más infiltrados (Figura 4C), vasculitis aumentada (Figura 4D) y 78 veces más daño a los fotorreceptores (Figura 4D) que los ratones de control C57Bl/6J. Aunque la puntuación histológica en ratones C9-/- con EAU tuvo 28% menos infiltración, 35% menos daño a los fotorreceptores y 31% menos vasculitis en comparación con los ratones con EAU, no se observó que las diferencias fueran estadísticamente significativas (Figura 4B y C).

La puntuación del daño al fotorreceptor se calculó de acuerdo con los criterios descritos en Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495 como una puntuación combinada de pérdida de fotorreceptores, pliegues de la retina y desprendimiento de la retina. De manera similar, la puntuación de infiltración se compuso de una combinación de granuloma, hemorragia, nódulo DF e infiltrados. La puntuación de vasculitis representa la inflamación perivascular y la infiltración de células CD4 alrededor de la vasculatura, la formación de trombos y la extensión de la vasculatura afectada en la retina.

Ejemplo 17: Inhibición de la deposición del MAC mediada por CD59 soluble en la EAU

Los datos obtenidos en los ejemplos en la presente memoria indican que los ratones C9'/_ no pudieron formar MAC debido a un defecto genético en c 9, tampoco pueden activar el inflamasoma y están protegidos de algunas de las características de la uveítis. Sin embargo, se observó que la retina de los ratones C9'/_con EAU no estaba protegida de la patología histológica asociada con la EAU.

CD59 es una proteína anclada a GPI que se encuentra en la membrana de la mayoría de las células nucleadas. La función principal de CD59 es evitar el reclutamiento de C9 en el complejo preformado C5b-8. Se describió un vector viral adenoasociado recombinante que expresa una CD59 truncada (AAVCAGsCD59) que tiene su señal de anclaje a GPI eliminada, lo que le permite secretarse y difundirse a través de la retina en Cashman, S. M., et al. (2011) PLoS One 6, e19078.

A los ratones se les inyectó por vía intravítrea con AAVCAGsCD59 y una semana después (para permitir niveles óptimos de expresión del transgén) los ratones fueron desafiados con EAU como se describe en los ejemplos en la presente memoria. Para los controles negativos, a los ratones se les inyectó intravítreamente con AAVCAGGFP, un virus que expresa proteína fluorescente verde (GFP) y que fueron desafiados de manera similar con EAU. A los 24 días posteriores de la inducción de la EAU, se examinaron las secciones de la retina congeladas de ambos grupos de ratones mediante tinción con anticuerpo C5b-9. La inyección intravítrea de AAVCAGGFP en ratones que posteriormente fueron desafiados con EAU condujo a la expresión del transgén en la capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna y la capa nuclear interna (Figura 14B). En ratones con EAU fenotípicamente más grave, también se pudo observar la expresión del transgén en el RPE y los fotorreceptores (Figura 14B, fila inferior). Se observó que los ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 tenían aproximadamente 45% menos deposición del MAC en relación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP (Figura 5A y Figura 12). Por lo tanto, se observó que AAVCAGsCD59 inyectado intravítreamente inhibía la formación del MAC en la retina de ratones con EAU.

Ejemplo 18: Inhibición del inflamasoma en EAU mediada por CD59 soluble

En los ejemplos en la presente memoria, se observó que los ratones C9-/- con EAU tenían una reducción significativa de la activación del inflamasoma en comparación con los ratones C57Bl/6J de control sometidos a EAU. La secreción de IL-1p mediada por NLRP3/Caspasa-1 en ratones con EAU que fueron pre inyectados con ya sea AAVCAGsCD59 o AAVCAGGFP se midió como se describe en los ejemplos en la presente memoria.

Se observó que los ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 tenían 40% menos de proteína IL-1p y 70% menos de ARNm de IL-1p en comparación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59, de acuerdo con lo medido mediante ELISA y RT-PCR (Figura 5B y Figura 5C). De manera similar, los niveles de la proteína NLRP3, así como de Caspasa 1 p20 se redujeron en 60% en los ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los ratones con EAU de control inyectados con AAVCAGGFP (Figura 5D y Figura 5E). No se observó una diferencia sustancial entre las cantidades de ASC en ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control (Figura 5F). Por lo tanto, los datos obtenidos indican que sCD59 inhibe la producción de IL-1 p mediada por NLRP3 al inhibir la deposición del MAC en la uveítis.

Ejemplo 19: Papel de la activación del inflamasoma NLRP3 mediada por MAC en la diferenciación de células T en la EAU

Las células T CD4+ infiltrantes ingresan a la retina en ya sea un estado diferenciado o en un estado no diferenciado en Th1, las cuales son células productoras de IFN-<y>, y Th17, las cuales son células productoras de IL-17. Para examinar el papel potencial del MAC en la diferenciación de las células T, se midieron los niveles de IFN-<y>e IL-17 en las retinas de ratones con EAU y C9-/- con EAU respectivamente.

Utilizando ELISA, se observó una cantidad de 102% de proteína IFN-y en las retinas con EAU en comparación con las retinas C57Bl/6J de control. Por el contrario, se observó 14% menos proteína IFN-y en retinas C9'/_ con EAU comparadas con retinas C57Bl/6J de control. Los datos de RT-PCR indicaron un aumento de más de 200 veces y 14 veces, respectivamente, en el ARNm de IFN-<y>en las retinas con EAU y C9'/_ con EAU, respectivamente, en comparación con las retinas C57Bl/6J de control (Figura 10A y Figura 10B). De manera similar, se observó que la expresión de la proteína IL-17 era 99% mayor en las retinas con EAU en comparación con las retinas C57Bl/6J de control; sin embargo, se observó que la expresión de la proteína IL-17 era solo 44% mayor en retinas C9'/_ con EAU en comparación con las retinas C57Bl/6J de control. No se observó diferencia estadística entre los niveles de expresión del ARNm de IL-17 en retinas con EAU y C9'/_ con EAU. Se observó que los niveles del ARNm de IL-17 permanecieron por debajo del límite de detección en las retinas de C57Bl/6J (Figura 10C y Figura 10D). Estos datos indican que el MAC juega un papel en la diferenciación de las células T en la EAU.

Se midieron los niveles de células CD4+ Th1 y células CD4+ Th17 en los ganglios linfáticos de drenaje (DLN) a los 24 días posteriores a la EAU en los ratones de control C57Bl/6J, con EAU y C9'/_ con EAU. Se observó un mayor número de células CD4+ positivas para IL-17 e IFN-<y>en los DLNs de ratones con EAU en comparación con los ratones de control C57Bl/6J (Figura 11A- Figura 11C). Una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de células CD4+ positivas para IFN-y e IL-17 en los DLNs entre ratones con EAU y C9'/_ con EAU (Figura 11A-Figura 11C). Estos datos indican que MAC juega un papel importante en la diferenciación de células T en la retina en la EAU y que MAC puede no jugar un papel importante en los DLNs.

Ejemplo 20: El impacto de CD59 soluble en la diferenciación de células T en la EAU

Para investigar los posibles efectos sobre la diferenciación de células T en ojos que expresan sCD59 sometidos a EAU, se midieron los niveles de proteína IFN-y e IL-17 y ARNm en ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 y ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP.

Los niveles de proteína IFN-<y>e IL-17 fueron significativamente menores en cantidad en más del 25% y 35% en las retinas con EAU inyectadas con AAVCAGsCD59 en comparación con las retinas con EAU inyectadas con AAVCAGGFP de control (Figura 13A y Figura 13C). Adicionalmente, se observó que los niveles del ARNm de IFN-<y>y IL-17 en retinas con EAU inyectadas con AAVCAGsCD59 recién aisladas eran 47% y 10% menores respectivamente en comparación con las retinas con EAU inyectadas con AAVCAGGFP de control. No se observó que las diferencias en el ARNm fueran estadísticamente significativas (Figura 13B y Figura 13D).

Ejemplo 21: Preservación de la función de la retina mediada por CD59 soluble en la EAU

Para determinar si sCD59 podría preservar la función de la retina en EAU, se realizaron ERGs en ratones inyectados con AAVCAGsCD59 o inyectados con AAVCAGGFP sometidos a uveítis. Se observó que los ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 tenían amplitudes de onda a adaptadas a la oscuridad mayores en 45%, 49% y 51% a intensidades de destello de -20 dB, -10 dB y OdB respectivamente, en comparación con los ratones inyectados con AAVCAGGFP de control. De manera similar, se observó que las amplitudes de onda b adaptadas a la oscuridad en los ratones inyectados con AAVCAGsCD59 eran mayores en 55%, 48% y 40% a intensidades de destellos de -20 dB, -10 dB y OdB, respectivamente, en comparación con los ojos de control con EAU inyectados con AAVCAGGFP (Figura 6). Adicionalmente, la amplitud de onda b adaptada a la luz a una intensidad de destello de OdB y 1dB en los ojos con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 se preservó en 12% y 39% en comparación con los ojos con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control (Figura 6). Se observó un importante papel potencialmente terapéutico de sCD59 recombinante en la preservación de la función de la retina en la retina interna y externa en la uveítis.

Ejemplo 22: Preservación de la estructura de la retina y patología mediada por CD59 soluble en la EAU

Para determinar si sCD59 podría preservar la estructura de la retina y reducir la patología asociada con la uveítis, se realizaron imágenes de fondo de ojo de ratones con eAu inyectados con AAVCAGsCD59 o inyectados con AAVCAGGFP. Basado en los criterios de puntuación descritos por Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye. Res. 87, 319-326, se determinó que la puntuación clínica general en ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 fue 22% menor en comparación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control. La puntuación clínica general incluyó la aparición de 24% menos infiltrados inflamatorios, 27% menos daño estructural, una reducción del 22% de vasculitis y el abultamiento de vasos y 13% menos daño al disco óptico en ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 en comparación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP (Figura 7A- Figura 7F). No se observaron diferencias significativas entre el vehículo de control con PBS y las retinas con EAU inyectadas con AAVCAGGFP Se observó que cada una de las puntuaciones de vasculares, de infiltración y de daño estructural eran estadísticamente significativamente diferentes (p<0.05), sin embargo, el puntaje del disco óptico no alcanzó significancia estadística (p=0.1). Por lo tanto, los datos obtenidos indican que la expresión de sCD59 redujo la inflamación de la retina y la infiltración de las células inmunes en la uveítis.

Se observó que la progresión y la gravedad de la EAU fueron mayores en los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP en comparación con AAVCAGsCD59, como se registró y observó en los escaneos de OCT (Figura 8A). Se realizó un análisis histológico detallado de secciones de parafina tomadas de la retina de ratones con EAU inyectados con AAVCAGsCD59 o de ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control. De manera similar, con base en los criterios descritos por Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495, se observó que los ratones con EAU inyectados con AAVC AGsCD59 tenían aproximadamente 76% menos infiltrados, 69% menos daño a los fotorreceptores y 78% menos vasculitis en comparación con los ratones con EAU inyectados con AAVCAGGFP de control (Figura 8B-Figura 8E). Se observó que las diferencias en el daño a y la infiltración de los fotorreceptores eran estadísticamente significativas (p = 0.03 y p = 0.01 respectivamente), sin embargo, la puntuación de la vasculitis no fue estadísticamente significativa (p = 0.2).

Ejemplo 23: Tratamiento de un individuo con aterosclerosis utilizando una composición de proteína CD59 soluble y monitoreo posterior

Se le diagnostica a un individuo con una enfermedad vascular aterosclerótica basándose en una ecografía que indica un aumento del espesor íntimo medial (IMT), posteriormente se le administra al individuo una composición que comprende una proteína CD59 soluble mediante infusión intravenosa. El paciente recibe tres dosis posteriores una vez por semana. Después de la dosificación, se vuelve a evaluar al individuo mediante una ecografía, que no indica cambios en el IMT, entonces, el individuo recibe cuatro dosis adicionales de proteína CD59 por vía intravenosa semanalmente, seguido de una reevaluación. Durante el seguimiento, el espesor del IMT se reduce a un intervalo aceptable y no se administran tratamientos adicionales con CD59.

Ejemplo 24: Tratamiento de un individuo con sarcoidosis utilizando una composición de proteína CD59 soluble y monitoreo posterior

Un individuo se presenta a su médico de atención primaria con síntomas consistentes con sarcoidosis, rayos X de pulmón muestran crecimientos consistentes con dicho diagnóstico, se toma una muestra de biopsia y se determinan niveles elevados de caspasa-1 activada en comparación con un tejido sano de control. Posteriormente se le administra al individuo una composición que comprende una proteína CD59 soluble mediante infusión intravenosa. Después de la dosificación, se vuelve a evaluar al individuo mediante rayos X, indicando una reducción parcial de la sarcoidosis. Se le administra al paciente una composición de proteína CD59 soluble una segunda vez, la reevaluación mediante rayos X indica una respuesta completa y no se administran tratamientos con CD59 adicionales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "individuo", "paciente" o "sujeto" se refiere a individuos diagnosticados con, sospechosos de padecer o en riesgo de desarrollar al menos una enfermedad para la cual las composiciones y el método descritos son útiles para tratamiento. En ciertas realizaciones, el individuo es un mamífero. En ciertas realizaciones, el mamífero es un ratón, rata, conejo, perro, gato, caballo, vaca, oveja, cerdo, cabra, llama, alpaca o yak. En ciertas realizaciones, el individuo es un humano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para uso en la inhibición de la activación del inflamasoma en células de un sujeto afectado por la inflamación que padece uveítis autoinmune que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del sujeto afectado por la inflamación; o una proteína CD59 soluble; en la que la composición inhibe la activación del inflamasoma, y en la que el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma.

2. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir en las células del sujeto un marcador de actividad del inflamasoma después de la administración de la composición que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59 independiente de membrana unida operativamente al promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de membrana; o la proteína CD59 soluble.

3. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que los resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma es la expresión o actividad elevada de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en comparación con la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en un individuo no diagnosticado o afectado por una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática o una sarcoidosis.

4. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el uso de la composición comprende

a. medir en el sujeto un marcador de actividad del inflamasoma; y

b. si el marcador de actividad del inflamasoma es positivo, administrar al sujeto la composición.

5. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el marcador de actividad del inflamasoma se mide en un ojo del sujeto.

6. Una composición para uso en la inhibición de la activación del inflamasoma en células de un ojo afectado por la inflamación en un sujeto que padece uveítis autoinmune que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente a un promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana en las células del ojo afectado por la inflamación del sujeto; o una proteína CD59 soluble; en la que la composición inhibe la activación del inflamasoma, en la que el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma.

7. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el sujeto ha mostrado resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en un ojo del sujeto.

8. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, que comprende adicionalmente medir en el sujeto afectado por la inflamación un marcador de actividad del inflamasoma después de la administración de la composición que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CD59 independiente de la membrana unida operativamente al promotor para la expresión y secreción de la proteína CD59 independiente de la membrana.

9. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el marcador de actividad del inflamasoma se selecciona de: caspasa 1; caspasa 5; IL-1p; IL-p17; IL-18; proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un CARD (PYCARD/ASC); una proteína que contiene los dominios NACHT, LRR y pYD (NALP), tal como la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NLRP3); IFN-y; un marcador de células T Th1 o citocina; un marcador de células T Th17; o citocina; y CD4+.

10. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que al sujeto se le ha diagnosticado con o se sospecha que padece una enfermedad sistémica seleccionada de un penfigoide de membrana mucosa, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, un lupus eritematoso sistémico, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada y una oftalmía simpática.

11. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el marcador de actividad del inflamasoma positivo o los resultados positivos para la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en el sujeto afectado por la inflamación es una expresión o actividad elevada de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en comparación con la expresión o actividad de al menos un marcador de actividad del inflamasoma en un individuo no diagnosticado o afectado por una uveítis, una conjuntivitis alérgica, una blefaritis, una conjuntivitis crónica, una epiescleritis, una queratitis, una retinitis, un penfigoide cicatricial ocular, un penfigoide de membrana mucosa, una escleritis de pterigión, un síndrome de Stevens-Johnson, una enfermedad de Eales, una enfermedad de Behcet, una sarcoidosis, una poliarteritis nodosa, una granulomatosis de Wegener, una enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada, una oftalmía simpática o una sarcoidosis.