ES2991349T3 - Preparación de anticuerpos monoclonales marcados con 212Pb - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la generación de plomo-212 para uso terapéutico. En concreto, se trata de métodos relacionados con la generación de proteínas radiomarcadas basadas en plomo-212, como radioinmunoconjugados, realizaciones de la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de anticuerpos monoclonales marcados con 212Pb

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la generación de plomo-212 para uso terapéutico. Específicamente, son métodos relacionados con la generación de proteínas radiomarcadas basadas en plomo-212, tales como radioinmunoconjugados, realizaciones de la presente invención.

Antecedentes de la invención

El plomo-212 (212Pb) es un radionúclido terapéutico prometedor ya que se desintegra a través de hijas emisoras de alfa de vida corta, lo que da como resultado un promedio de una partícula alfa por desintegración de 212Pb. El documento EP 3061464 A1 describe métodos y soluciones mediante los cuales se añaden soluciones radiofarmacéuticas de Radio 224 complejas para eliminar el nucleido hijo.

Ruble et al. (Int. J. of Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 34, No. 3, 1 de enero de 1996, págs. 609-616) divulgan el uso de un anticuerpo marcado con 212Pb en el tratamiento de la eritroleucemia murina.

Milenic et al. (Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, Vol. 20, No. 5, 1 de octubre de 2005, pág. 557) divulgan el uso de Herceptin marcado con 212Pb en la terapia dirigida de la enfermedad peritoneal diseminada. El documento WO2021/032042 divulga composiciones radiofarmacéuticas que comprenden radioisótopos de plomo (212Pb) en combinación con un producto farmacéutico, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un agente quelante.

La vida media del 212Pb de 10,6 horas es una limitación para su uso y existe la necesidad de procedimientos de producción y purificación rápidos y seguros. El radioinmunoconjugado basado en plomo-212 se encuentra actualmente en pruebas clínicas contra el cáncer peritoneal utilizando 212Pb separado de 224Ra en una columna de intercambio catiónico y eluido en ácido mineral que debe reconstituirse antes del radiomarcaje.

El método actual conduce a pérdidas debido a un resultado de elución inferior al cuantitativo y al tiempo entre la elución y el marcado.

Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos métodos que tengan en cuenta estas cuestiones.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un método para generar una proteína marcada con radionúclidos, comprendiendo el método: a) proporcionar una solución acuosa que comprende 224Ra y 212Pb, y una solución acuosa o formulación fácilmente soluble que comprende una proteína con una masa molecular superior a 300 conjugada con un quelante, en donde la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa está entre 0,5 y 2 y la radiactividad generada a partir de 224Ra y 212Pb es de 1 kBq a 10000 MBq, b) mezclar e incubar las soluciones proporcionadas en a) para proporcionar una solución de reacción que comprende una proteína marcada con radionúclidos, c) purificar la solución de reacción mediante cromatografía de filtración en gel, y d) recuperar la proteína marcada con radionúclidos de la purificación en la etapa c).

La proteína puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, una proteína sintética y un péptido.

La proteína marcada con radionúclido recuperada en la etapa d) puede comprender 212Bi así como 212Pb. En una realización de la presente invención, la solución que comprende 224Ra y 212Pb en la etapa a) tiene una radiactividad generada a partir de 224Ra y 212Pb de 50 a 1000 MBq por, 1 kBq a 1 GBq, tal como 10 kBq a 100 MBq, tal como 100 kBq a 10 MBq, tal como 10 MBq a 200 MBq.

En otra realización de la presente invención, la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa en la etapa a) está entre 0,5 y 2, tal como 0,8 - 1,5, o tal como 0,8 - 1,3, o preferiblemente tal como 0,9 - 1,15.

En otra realización más de la presente invención, la proteína conjugada con un quelante recuperado en la etapa d) está presente en una cantidad de 0,01-50 mg, tal como 0,1-25 mg, tal como 0,5-10 mg, tal como 1-5 mg.

En una realización adicional de la presente invención, la solución en la etapa a) está en un volumen de 10 pL a 1000 mL, tal como 500 pL a 100 mL, tal como 1 mL a 10 mL.

En otra realización de la presente invención, la solución que comprende una proteína conjugada con un quelante en la etapa a) tiene una concentración de 0,1 a 4 mg/ml, tal como 0,25 a 2 mg/ml, tal como 0,5 a 1,5 mg/ml, tal como 0,1 a 10 mg/ml de anticuerpo conjugado con un quelante.

En otra realización más de la presente invención, la mezcla y la incubación en el paso b) se realizan en 1-180 minutos, tal como 5-120 minutos, tal como 15-60 minutos, tal como 20-40 minutos, tal como 30-60 minutos.

En otra realización de la presente invención, la cromatografía de filtración en gel en la etapa c) se selecciona del grupo que consiste en purificación por desalinización, desalinización e intercambio de tampón, y separación por exclusión en gel por desalinización.

En otra realización de la presente invención, se repite la desalinización para mejorar la pureza.

En otra realización, a la solución cruda que se va a purificar se le añade un quelante para complejar los radionucleidos no complejados para aumentar aún más la pureza del radioconjugado final recuperado de la etapa de desalinización.

En una realización adicional de la presente invención, la purificación en la etapa c) es impulsada por uno de los métodos seleccionados del grupo que consiste en impulsada por centrifugación, impulsada por presión, impulsada por vacío o impulsada por gravedad.

En otra realización de la presente invención, el quelante es TCMC.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo se selecciona de uno o más del grupo que consiste en trastuzumab, rituximab, HH1, cetuximab, bevacizumab, daratumumab, alemtuzumab, pembrolizumab, epratuzumab, L19, F8, F16, galiximab, toralizumab, alemtuzumab, ofatumumab, veltuzumab, afutuzumab, tositumomab, Reditux e ibritumomab.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo es específico para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD45, CD74, CD138, PSMA, HER-2, EGFR, MUC-1, MUC-18, CEA, FBP, NG2, EPCAM, Syndecan-1, Ca-125, LK-26, HMFG, CS-1 y BCMA.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína marcada con radionúclido recuperada a partir de un método según la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para la generación de una proteína marcada con radionúclido que comprende una solución acuosa que comprende 224Ra y 212Pb, en donde la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa está entre 0,5 y 2, una solución acuosa que comprende una proteína con una masa molecular superior a 300 conjugada con un quelante, medios para cromatografía de filtración en gel y, opcionalmente, instrucciones para la generación de una proteína marcada con radionúclido.

Descripción detallada de la invención

Los métodos actuales para la generación de proteína marcada con 224Ra, tal como un anticuerpo, conducen a pérdidas debido a un resultado de elución menor que el cuantitativo y al tiempo entre la elución y el marcado.

El objeto de la presente invención es un método alternativo nuevo e inventivo que tiene en cuenta estas cuestiones.

Una solución es un método de marcajein situde proteína monoclonal, tal como un anticuerpo, con 212Pb en solución de 224Ra y posterior eliminación de 224Ra como una estrategia alternativa para preparar una proteína radiomarcada basada en 212Pb, tal como un radioinmunoconjugado.

En el presente contexto, un radioinmunoconjugado se define como una sustancia que comprende un radionúclido, un conjugador y una proteína, tal como un anticuerpo. Esto también se conoce como proteína marcada con radionúclidos o anticuerpo marcado con radionúclidos.

La presente invención se refiere a un método para generar una proteína marcada con radionúclidos, comprendiendo el método: a) proporcionar una solución acuosa que comprende 224Ra y 212Pb, y una solución acuosa o formulación fácilmente soluble que comprende una proteína con una masa molecular superior a 300 conjugada con un quelante, en donde la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa está entre 0,5 y 2 y la radiactividad generada a partir de 224Ra y 212Pb es de 1 kBq a 10000 MBq, b) mezclar e incubar las soluciones proporcionadas en a) para proporcionar una solución de reacción que comprende una proteína marcada con radionúclidos, c) purificar la solución de reacción mediante cromatografía de filtración en gel, y d) recuperar la proteína marcada con radionúclidos de la purificación en la etapa c).

La proteína se puede seleccionar del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, una proteína sintética y un péptido.

La proteína también puede ser un motivo Glu-urea. El motivo Glu-urea se dirige al PSMA. El motivo Glu-urea dirigido a PSMA puede seleccionarse del grupo que consiste en PSMA-617, PSMA-11, MIP-1427. La proteína también puede seleccionarse del grupo que consiste en biotina o avidina o similares, y folato y derivados.

El tamaño de la proteína de la presente invención puede ser cualquiera que sea mayor que 224Ra debido a la discriminación por exclusión de tamaño de la presente invención. Por lo tanto, el tamaño de la proteína es mayor que aproximadamente 300 en masa molecular, Mr. En una realización de la presente invención el tamaño de la proteína es de 500-500.000 en masa molecular, Mr. El tamaño también puede ser de 40.000 200.000 o de 500-5000 en masa molecular, Mr.

En una realización preferida de la presente invención la proteína es un anticuerpo.

En una realización de la presente invención, el 224Ra utilizado en los métodos de la presente invención se puede producir utilizando cromatografía de intercambio iónico, 228Th unido a resina quelante, por ejemplo, resina Ac o resina TRU, o a partir de suspensión de ThO. La suspensión de ThO se describe, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos 7,887,782.

Los presentes ejemplos muestran que una proteína conjugada con TCMC, ejemplificada por un anticuerpo monoclonal, puede marcarse eficientemente con 212Pb en soluciones de 224Ra en equilibrio con 212Pb.

Posteriormente, el conjugado marcado con 212Pb se puede separar del 224Ra catiónico utilizando, por ejemplo, separación por exclusión en gel de desalinización. Esto significa que una solución de 224Ra/212Pb lista para usar se puede enviar desde un proveedor centralizado al usuario final.

Las ventajas de utilizar 224Ra en solución son dobles (1) lleva menos tiempo realizar los procedimientos ya que se evita el paso de extracción de ácido, y (2) es menos laborioso y no requiere evaporación de ácidos, etc. El rendimiento también es mayor.

Se sabe a partir de estudios sobre el uso de 224Ra en el tratamiento de la espondilitis anquilosante que se pueden administrar cantidades modestas (normalmente menos de 10 MBq) a pacientes sin una toxicidad considerable de la médula ósea, lo que indica que un contenido de 1-2 % en un producto a base de 212Pb, por ejemplo, de 100 MBq, sería aceptable siempre que el producto de 212Pb no produzca un alto grado de toxicidad de la médula ósea.

Si se necesitara un producto más puro en términos de 224Ra, una purificación repetida en una segunda columna PD-10 podría lograrlo. En comparación con los generadores actuales basados en intercambio iónico, que pueden "ordeñarse" varias veces (aunque con una capacidad que disminuye rápidamente), el generador basado en solución de 224Ra descrito será para un solo uso.

También añadir un segundo quelante, preferiblemente de bajo peso molecular, por ejemplo, EDTMP para complejar los radionucleidos no complejados en la solución cruda al final de la reacción con el conjugado y antes de realizar el paso de desalinización puede mejorar aún más la pureza del producto final.

Por lo tanto, los ejemplos presentes demuestran una forma alternativa de utilizar 224Ra como un generador transportable para producir proteína radioconjugada basada en 212Pb que es más simple y requiere menos tiempo en comparación con los métodos actuales basados en intercambio iónico.

Concentraciones, proporciones y cantidades

La radiactividad en las soluciones de los métodos de la presente invención puede ser de diferente intensidad dependiendo del uso previsto. En una realización de la presente invención, la solución que comprende 224Ra y 212Pb en la etapa a) tiene una radiactividad generada a partir de 224Ra y 212Pb de 1 kBq a 1 GBq, de 10 kBq a 100 MBq, de 100 kBq a 10 MBq o de 10 MBq a 200 MBq.

La radiactividad es en una realización de 10 kBq a 10 MBq.

La radiactividad es en una realización preferida de 10 kBq a 100 MBq.

Las soluciones de la presente invención que comprenden 224Ra y 212Pb pueden generarse a partir de 228Th.

La proteína marcada con radionúclido recuperada puede comprender 212Bi debido a una mayor desintegración de 212Pb. De esta forma, la relación 212Bi/212Pb de la proteína de la composición de la presente invención puede ser 212Bi/224Ra en una relación de 1/1 dentro de /- 30%. La radio también puede ser 1/1 dentro de /- 20% o 1/1 dentro de /- 10%.

En una realización de la presente invención, la proteína marcada con radionúclido recuperada, tal como un anticuerpo, se escala de acuerdo con las cantidades necesarias para la administración y la dosificación.

Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la proteína marcada con radionúclido recuperada, tal como un anticuerpo, se formula posteriormente como una composición farmacéutica.

Una composición farmacéutica comprende una proteína marcada con radionúclido recuperada, tal como un anticuerpo, según la invención y un diluyente, vehículo, surfactante y/o excipiente.

Los vehículos farmacéuticos aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampones no tóxicos, rellenos, soluciones isotónicas, disolventes y cosolventes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes humectantes, agentes antiespumantes y agentes espesantes, etc. Más específicamente, el vehículo farmacéutico puede ser, entre otros, solución salina normal (0,9 %), solución salina seminormal, lactato de Ringer, sacarosa disuelta, dextrosa, por ejemplo, 3,3 % de dextrosa/0,3 % de solución salina. El vehículo fisiológicamente aceptable puede contener un estabilizador radiolítico, por ejemplo, ácido ascórbico o albúmina sérica humana, que protege la integridad del radiofármaco durante el almacenamiento y el envío.

En una realización, la formulación como una composición farmacéutica se realiza después de la etapa de recuperación d).

Dado que la serie de desintegración de 224Ra incluye una hija de radón, que puede difundirse en el aire, los viales que contienen los productos deben estar bien sellados para evitar el escape de 220Rn.

Debido a la naturaleza altamente localizada de la irradiación alfa, la radiólisis debe considerarse como un problema potencial y el radiofármaco debe diseñarse para minimizarlo. De acuerdo con los conocimientos en este campo, las proteínas radiomarcadas, tal como los anticuerpos, son sensibles a la radiólisis y, por lo tanto, un sistema de kit puede ser ventajoso para soluciones de 224Ra, que se combinarán con anticuerpos conjugados con quelantes para eliminar 212Pb y/o 212Bi.

Para un anticuerpo monoclonal, generalmente es aconsejable mantener la autodosis de la solución radiofarmacéutica productora de partículas alfa por debajo de 0,5 kGy para evitar propiedades de unión reducidas debido a la radiólisis. Por lo tanto, se recomienda un sistema de kit mediante el cual se añade proteína conjugada con quelante, como un anticuerpo, a la solución de 224Ra (incluidas las hijas) unas horas a 10 minutos antes de la inyección para soluciones concentradas destinadas al envío remoto.

La composición farmacéutica preparada con una cantidad de radionúclido que es de 1 kBq a 10 GBq por dosificación.

En otra realización de la presente invención, la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa en la etapa a) está entre 0,5 y 2, tal como 0,8 - 1,5, o tal como 0,8 - 1,3, o preferiblemente tal como 0,9 - 1,15. La relación de actividad es preferiblemente de 0,5 y 2.

El término "relación de actividad", por ejemplo entre 212Pb y 224Ra, se relaciona con la relación de MBq de 212Pb a 224Ra.

En otra realización más de la presente invención, la proteína, tal como el anticuerpo, conjugado con un quelante recuperado en la etapa d) está presente en una cantidad de 0,05-50 mg, tal como 0,1-25 mg, tal como 0,5-10 mg, tal como 1-5 mg. La cantidad preferiblemente es de 0,05-50 mg.

En una realización adicional de la presente invención, la solución en la etapa a) está en un volumen de 100 pL a 1000 mL, tal como 500 pL a 100 mL, tal como 1 mL a 10 mL. El volumen es preferiblemente de 100 pL a 1000 mL.

En otra realización de la presente invención, la solución que comprende una proteína, tal como un anticuerpo, conjugado con un quelante en la etapa a) tiene una concentración de 0,1 a 4 mg/ml, tal como de 0,25 a 2 mg/ml, tal como de 0,5 a 1,5 mg/ml, tal como de 0,1 a 10 mg/ml de proteína, tal como un anticuerpo, conjugado con un quelante. La concentración es preferiblemente de 0,1 a 4 mg/ml.

Mezcla e incubación

En otra realización más de la presente invención, la mezcla y la incubación en la etapa b) se realizan en 1-180 minutos, tal como 5-120 minutos, tal como 15-60 minutos, tal como 20-40 minutos, tal como 30-60 minutos. El tiempo preferible es 30-60 minutos.

La mezcla se puede realizar mediante un agitador automático. La temperatura es preferiblemente de 30-40°C, y más preferiblemente de 37°C.

Cromatografía de filtración en gel

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), también conocida como cromatografía de tamiz molecular, es un método cromatográfico en el que las moléculas en solución se separan por su tamaño y, en algunos casos, por su peso molecular. Normalmente se aplica a moléculas grandes o complejos macromoleculares, tales como proteínas y polímeros industriales. Normalmente, cuando se utiliza una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica se conoce como cromatografía de filtración en gel, a diferencia del nombre cromatografía de permeación en gel, que se utiliza cuando se utiliza un disolvente orgánico como fase móvil. La SEC es un método de caracterización de polímeros ampliamente utilizado debido a su capacidad de proporcionar buenos resultados de distribución de masa molar (Mw) para polímeros.

Por tanto, en otra realización de la presente invención, la cromatografía de filtración en gel en la etapa c) se selecciona del grupo que consiste en purificación por desalinización, desalinización e intercambio de tampón, y separación por exclusión en gel por desalinización.

Por lo tanto, la cromatografía de filtración en gel de la presente invención también se conoce como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con uso de una solución acuosa para el transporte a través de la columna.

En otra realización de la presente invención, se repite la desalinización para mejorar la pureza. La desalinización se puede repetir una, dos, tres o más veces.

En otra realización, se añade un segundo quelante, preferiblemente de bajo peso molecular, por ejemplo EDTMP, a los radionucleidos no complejados complejos en la solución cruda al final de la reacción con el conjugado y antes de realizar el paso de desalinización para mejorar aún más la pureza del producto final.

Los ejemplos de columnas incluyen la columna de desalinización PD10 (columna Sephadex G-25 PD-10) y la columna de desalinización Econo-Pac 10DG (BioRad).

Los intervalos de tamaño para la purificación en el método presentado en el presente documento pueden variar. En una realización, el intervalo de masa molecular es 1000-500000, Mr.

El intervalo seleccionado garantiza que las proteínas radiomarcadas, tales como los radioinmunoconjugados, de la presente invención estén purificadas. Se pueden elegir otros intervalos para una purificación óptima, por ejemplo, 500-5000 en masa molecular, Mr, 1000-10000 en masa molecular, Mr.

En una realización adicional de la presente invención, la purificación en la etapa c) es impulsada por uno de los métodos seleccionados del grupo que consiste en impulsada por centrifugación, impulsada por presión, impulsada por vacío o impulsada por gravedad.

Quelante

Los radionucleidos en la presente invención se conjugarán preferiblemente con una proteína, tal como un anticuerpo, mediante el uso de un quelante, o más preferiblemente, quelantes bifuncionales.

Estos podrían ser quelantes cíclicos, lineales o ramificados. Se puede hacer especial referencia a los quelantes de poliaminopoliácidos que comprenden una cadena principal de poliazaalcano lineal, cíclica o ramificada con grupos ácidos (por ejemplo, carboxialquilo) unidos a los nitrógenos de la cadena principal.

El quelante de la presente invención es adecuado para la unión de 212Pb. Puede conjugarse a la proteína mediante cualquier enlace convencional conocido por el experto en la materia, incluyendo el covalente y el electrostático.

Los ejemplos de quelantes adecuados incluyen DOTA y derivados de DOTA tales como ácido pisotiocianatobencil-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (p-SCN-Bz-DOTA) y derivados de DTPA tales como ácido p-isotiocianatobencil-dietilentriaminopentaacético (p-SCN-Bz-DTPA), siendo los primeros quelantes cíclicos, los segundos quelantes lineales.

En una realización, el quelante es EDTMP o DOTMP.

En otra realización de la presente invención, el quelante es (2-(4-isotiocianatobencil-1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10,tetra-(2-carbamoilmetil)-ciclododecano) también conocido como TCMC.

Anticuerpo

Los anticuerpos usados para la presente invención pueden ser tanto monoclonales como policlonales.

En una realización de la presente invención, el anticuerpo se selecciona de uno o más del grupo que consiste en trastuzumab, rituximab, HH1, cetuximab, bevacizumab, daratumumab, alemtuzumab, pembrolizumab, epratuzumab, L19, F8, F16, galiximab, toralizumab, alemtuzumab, ofatumumab, veltuzumab, afutuzumab, tositumomab, Reditux e ibritumomab.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo es específico para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD45, CD74, CD138, PSMA, HER-2, EGFR, MUC-1, MUC-18, CEA, FBP, NG2, EPCAM, Syndecan-1, Ca-125, LK-26, HMFG, CS-1 y BCMA.

Proteína marcada con radionucleótidos

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína marcada con radionúclido, tal como un anticuerpo marcado con radionúclido, recuperado a partir de un método según la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína marcada con radionúclido, tal como una composición de anticuerpo marcada con radionúclido que comprende 224Ra libre y 212Pb conjugados con un anticuerpo.

En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 10 % de 224Ra libre.

En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 5 % de 224Ra libre. En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 4 % de 224Ra libre. En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 3 % de 224Ra libre. En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 2 % de 224Ra libre. En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 1 % de 224Ra libre. En una realización de la presente invención, esta composición comprende menos del 0,1 % de 224Ra libre.

La composición también puede comprender entre 0,1-3 % de 224Ra libre. Este intervalo también puede ser 0,1

2 % de 224Ra libre o 0,1-1 % de 224Ra libre.

La composición puede comprender menos del 50 % de 212Bi libre. Esta cantidad también puede ser del 10-50

% o del 30-50 %.

Parte del 212Pb también puede estar libre y no conjugado con el anticuerpo quelante. Por lo tanto, la cantidad de 212Pb libre puede ser inferior al 20 %, por ejemplo inferior al 10 %.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a una composición de proteína marcada con radionúclido que comprende: 212Pb conjugado con una proteína, 212Bi conjugado con una proteína, 0,1 % - 2

% de 224Ra libre, menos del 50 % de 212Bi libre y menos del 20 % de 212Pb libre.

El término "libre" se refiere a un radionúclido que no está unido al anticuerpo quelante. Puede medirse mediante las técnicas descritas en el presente documento y conocidas por una persona experta en la materia.

Kits

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para la generación de una proteína marcada con radionúclido, tal como un anticuerpo marcado con radionúclido que comprende una solución acuosa que comprende 224Ra y 212Pb, una solución acuosa que comprende una proteína, tal como un anticuerpo, conjugada con un quelante, medios para cromatografía de filtración en gel y, opcionalmente, instrucciones para la generación de una proteína marcada con radionúclido, tal como un anticuerpo marcado con radionúclido.

En una realización, el kit comprende un vial que comprende una solución neutralizante para ajustar el pH y/o la isotonicidad de la solución radiofarmacéutica antes de la administración a un paciente.

En una realización de la presente invención, la proteína conjugada quelante, tal como un anticuerpo, se añade a la solución de 224Ra y 212Pb de 30 minutos a 60 minutos antes de la recuperación de la proteína radioconjugada o radioinmunoconjugado.

En una realización de la presente invención, la proteína conjugada quelante, tal como un anticuerpo, se añade a la solución de 224Ra y 212Pb de 1 minuto a 45 minutos antes de la recuperación de la proteína radioconjugada o radioinmunoconjugado.

En una realización de la presente invención, la proteína conjugada quelante, tal como un anticuerpo, se añade a la solución de 224Ra y 212Pb de 20 minutos a 45 minutos antes de la recuperación de la proteína radioconjugada o radioinmunoconjugado.

General

Debe entenderse que cualquier característica y/o aspecto discutido anteriormente en relación con los compuestos según la invención se aplica por analogía a los métodos descritos en el presente documento.

Los términosXeYse utilizan indistintamente.

Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a continuación para ilustrar la invención. Se pretende que sean ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1-Mediciones de radiactividad

La espectroscopia y se realizó con un sistema detector de pozo de germanio de alta pureza enfriado con nitrógeno líquido (GWC6021, Canberra Industries, Meriden CT, EE. UU.) acoplado a un analizador de señal digital DSA 1000. Los espectros se analizaron con el software Genie 2000 (versión 3.1, Canberra Industries, Meriden CT, EE. UU.).

Se utilizó un calibrador de radioisótopos (CRC-25R, Capintec Inc., Ramsey, NJ, EE. UU.) para medir cantidades más altas de radiactividad.

Las muestras radiactivas se contaron en un contador Autogamma Cobra II (Packard Instruments, Downer Grove, IL, EE. UU.) o en un contador gamma automático Hidex (Hidex, Turku, Finlandia).

Ejemplo 2-El generador de 224Ra

El generador de 224Ra consistió en una fuente de 228Th empaquetada junto con una resina de actínido en una columna. La columna retiene 228Th mientras que 224Ra (más sus derivados) se puede eluir con HCl 1 M. Todo el trabajo con preparados radiactivos concentrados, incluyendo la evaporación del disolvente, se realizó en una caja de guantes.

Se adquirió una fuente de 228Th en HNO<3>1M de un proveedor comercial y una resina de actínido basada en el Extractante DIPEX® se obtuvo de Eichrom Technologies LLC (Lisle, IL, EE. UU.) en forma de cartuchos preenvasados de 2 ml. Se extrajo el material de un cartucho de resina actínida y la resina se acondicionó previamente con HCl 1 M. Para utilizar un volumen menor de disolvente, aproximadamente el 25 % (0,5 ml) de la resina se reempaquetó en una columna más pequeña de 1 ml, Isolute SPE, Biotage AB, Uppsala, Suecia). La resina inactiva se introdujo en la parte inferior de la columna para servir como capa receptora de pequeñas cantidades de 228Th en caso de que se produjera alguna liberación de 228Th durante el funcionamiento del generador. Se preparó una suspensión de aproximadamente el 40 % (0,4 ml) del contenido del cartucho y 600 pl de 228Th en HNO<3>0,1 M en un vial (vial de 4 ml, muestra E-C, Wheaton, Millville, NJ, EE. UU.) y se incubó con agitación suave para la inmovilización de 228Th durante al menos 4 horas. Posteriormente, la suspensión radiactiva se cargó en la columna.

El radio se puede eluir regularmente de esta columna con 2 ml de HCl 1 M. Para una purificación adicional, se utilizaron 2 ml de HCl 1 M crudo sin evaporación y se cargaron en un segundo cartucho de resina actínida que se lavó con 0,5 ml adicionales de HCl 1 M para producir un eluato de 2,5 ml que contenía 224Ra. Esta solución se evaporó hasta sequedad, utilizando un bloque calefactor y enjuagando el vial con gas N<2>a través de una entrada y salida de tubo de teflón en el septo de goma/teflón del vial y conduciendo el vapor ácido a un vaso de precipitados de NaOH saturado mediante una corriente de gas N<2>. El residuo después de la evaporación se disolvió en 0,2 ml o más de HCl 0,1 M.

Se investigó la posible irrupción de 228Th en eluidos almacenando muestras del eluido durante un mínimo de 10 vidas medias de 224Ra (36 días) y luego se analizó la actividad.

Pureza de soluciones de 224Ra

Al almacenar muestras del 5 % de la solución de 224Ra producida, se pudo evaluar la pureza de 224Ra frente a 228Th. Se utilizaron cinco muestras seleccionadas al azar que habían estado almacenadas durante al menos tres meses y cualquier 228Th presente estaría en equilibrio con 224Ra y sus hijas en el momento de la medición. Las mediciones se realizaron utilizando el contador gamma Hidex que había sido calibrado para 228Th.

Ejemplo 3- Radiomarcaje de anticuerpos

El anticuerpo monoclonal anti-HER2 IgG1 humanizado trastuzumab (Herceptin, Roche, Basilea, Suiza) conjugado con un quelante, TCMC (2-(4-isotiocianatobencil-1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10,tetra-(2-carbamonilmetil)-ciclododecano) se utilizó para el radiomarcaje con 212Pb. Antes de la conjugación con TCMC, el tampón de una muestra de trastuzumab se intercambió por un tampón de carbonato (NaHCO<3>0,1 M y Na2CO35 mM en agua libre de metales) lavando 4 veces con un concentrador centrífugo (Vivaspin 15R, 50 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Alemania). Después del intercambio de tampón, se determinó la concentración de anticuerpos mediante espectrofotometría. Se añadió una solución de TCMC disuelta en HCl 5 mM a trastuzumab en tampón de carbonato en un exceso molar de 5 veces de quelante al anticuerpo. La mezcla se dejó reaccionar durante 2 h con agitación suave a temperatura ambiente. Para separar el quelante no conjugado del TCMC-trastuzumab y al mismo tiempo intercambiar el tampón de carbonato a NaCl al 0,9 %, se utilizó un cartucho de filtrado de centrífuga (Vivaspin 15R, 50 kDa MWCO). La muestra se diluyó 1:10 con NaCl al 0,9 % y el conjugado de anticuerpos se concentró 10 veces por centrifugación. Este procedimiento se repitió un total de tres veces. El conjugado TCMC-trastuzumab se almacenó a 4 °C hasta el radiomarcaje.

Una solución de 224Ra en equilibrio con nucleidos hijos se tamponó con NH<4>OAc 5 M al 10 %. Se verificó que el pH de la solución estuviera entre 5-6 utilizando el pH. El TCMC-trastuzumab y la solución radiactiva se mezclaron y se incubaron durante un mínimo de 30 minutos en un agitador térmico a 750 rpm y 37 °C. En lo sucesivo, esta solución compuesta por trastuzumab marcado con 212Pb y 224Ra libres y nucleidos hijos se denominará "mezcla de reacción". El marcaje se realizó con diferentes concentraciones de TCMC-trastuzumab en la mezcla de reacción final, que variarom de 0,1 a 4 mg/ml.

Ejemplo 4-Procedimiento de ensayo de cromatografía de capa fina instantánea

La pureza radioquímica del anticuerpo marcado con 212Pb en la mezcla de reacción se evaluó con tiras de cromatografía de capa fina instantánea (ITLC) (modelo n.° 150-772, Biodex Medical Systems Inc, Shirley, NY, EE. UU.). Se mezcló una alícuota de la mezcla de reacción con un exceso de dos veces (por volumen) de tampón de formulación que consistía en albúmina sérica humana al 7,5 % y EDTA 5 mM en DPBS y se ajustó a un pH de aproximadamente 7 con NaOH. La mezcla se agitó durante 4-5 segundos y se dejó reposar otros 5-10 minutos. Se colocó una tira con típicamente 1-4 gl de muestra en la línea de origen y se colocó en un vaso pequeño con aproximadamente 0,5 ml de NaCl al 0,9 % para el desarrollo. Después de que el frente del disolvente se movió a la línea de frente de disolvente designada, la tira se cortó por la mitad en la línea de corte y cada mitad se colocó en un tubo de ensayo de 5 ml para el conteo. En este sistema, el anticuerpo marcado con 212Pb no migra desde la mitad inferior, mientras que el 212Pb complejado con EDTA migra a la mitad superior.

Ejemplo 5 - Purificación de anticuerpos radiomarcados

El producto final deseado del proceso descrito en este estudio es una solución pura de TCMC-trastuzumab marcado con 212Pb. Para lograr esto, nuestra mezcla de reacción debe purificarse para eliminar el 224Ra libre y otros nucleidos hijos no conjugados. Se evaluaron dos métodos de purificación diferentes: purificación por concentración centrífuga y purificación con una columna de desalinización.

La purificación por concentración centrífuga se realizó con Vivaspin4 con MWCO de 50 kDa. La mezcla de reacción se cargó en el tubo de centrifugado del concentrador y se diluyó con NaCl al 0,9 % hasta que el volumen total fue de 4 ml. El contenido se concentró aún más aproximadamente 10 veces por centrifugación. Se recogió tanto el filtrado como la solución de anticuerpo purificado y se midió la radiactividad. A partir de estas mediciones se estimó el rendimiento del proceso:

Ac cpm después de concentrar

% 212Pb-TMC-trastuzumab recuperado=

cpm total aplicado en columna espinal

Después se dejó que las muestras se desintegraran durante un mínimo de 48 horas para establecer el equilibrio entre 224Ra y 212Pb, antes de volver a medirlas y calcular el porcentaje de 224 Ra en la solución de anticuerpo purificado:

Ac cpm después de concentrar en el eq.

% fia en Ac recuperado = ------------ :— - — :----------:---------------:— :------ :------cpm total aplicado en columna espinal en el eq.

Se utilizó una columna Sephadex G-25 PD-10 (Amersham Biosciences; Uppsala, Suecia) para la purificación de la mezcla de reacción. En primer lugar, la columna se equilibró según el protocolo del fabricante utilizando PBS de Dulbecco suplementado con BSA al 0,5 % como tampón de elución. La purificación de PD10 se realizó tanto en la mezcla de reacción bruta como en la mezcla de reacción a la que se añadió un exceso de 10 veces (por volumen) de tampón de formulación.

El tampón de formulación contenía EDTA para formar complejos con radionúclidos libres y la mezcla se dejó reaccionar durante un mínimo de 10 minutos antes de su aplicación en la columna de PD10. La mezcla de reacción se cargó en la parte superior de la columna y se dejó ingresar a la columna por completo antes de añadir más tampón de elución. El proceso de elución continuó hasta que se recogieron 7 fracciones de 1 ml cada una en tubos Eppendorf para realizar más mediciones de radiactividad. El anticuerpo radiomarcado se eluyó típicamente en las fracciones 3-5, y el rendimiento del proceso se estimó a partir de las mediciones:

cpm en fracción 3-5

% 212Pb-TMC-trastuzumab en fracción 3-5=

cpm total aplicado a columna PD10xRCP

El RCP del producto en la fracción 4 se determinó mediante el procedimiento ITLC descrito anteriormente. Después se dejó que las muestras se desintegraran durante un mínimo de 48 horas para establecer el equilibrio entre 224Ra y 212Pb, antes de volver a medirlas y calcular el porcentaje de 224Ra en la fracción 3-5:

cpm en fracción 3-5

% 224Ra en fracción 3-5=

cpm total aplicado a columna PD10

Ejemplo 6-Resultados

Pureza radioquímica del 224Ra

Para las cinco muestras medidas retrospectivamente, el 228Th estuvo por debajo del límite de detección estimado en 1 Bq por MBq de 224Ra (desintegración corregida). Por lo tanto, el método de purificación parece adecuado para preparar 224Ra para aplicaciones biomédicas.

Marcaje de TCMC-trastuzumab con plomo-212.

El marcado de 212Pb en soluciones con presencia de 224Ra funcionó bien con un rendimiento superior al 90 % a 0,15 mg por ml, y superior, de conjugado de anticuerpo (Tabla 1).

Purificación del conjugado de anticuerpo marcado con 212Pb a partir de los cationes 224Ra presentes utilizando un dispositivo de centrifugación de microconcentración. Los datos de concentración y separación de trastuzumab marcado con 212Pb para 224Ra catiónico se presentan en la Tabla 2. Como se puede observar, hay una pérdida significativa de aproximadamente un tercio del trastuzumab marcado con 212Pb debido al procedimiento. La separación de 224Ra del radioconjugado se ha completado en un 75%, lo que indica que la relación entre trastuzumab marcado con 212Pb y 224Ra mejora de 1:1 a aproximadamente 3:1, lo que no es satisfactorio para el uso biomédico de radioinmunoconjugados marcados con 212Pb.

Purificación del conjugado de anticuerpo marcado con 212Pb a partir de los cationes 224Ra presentes mediante desalinización con una columna de un solo uso de filtración en gel PD-10.

Los datos de concentración y separación de trastuzumab marcado con 212Pb para 224Ra catiónico se presentan en la Tabla 2. La recuperación de trastuzumab con 212Pb es típicamente del 80 % o mejor, lo que es bastante favorable. Además, el RCP de 212Pb-trastuzumab tiende a aumentar hasta superar el 95 %. Además, la eliminación de 224Ra de la solución es muy eficaz, ya que normalmente se eluye menos del 2 % en las fracciones de 212Pb-trastuzumab cuando se utiliza EDTA para apagar la mezcla de reacción. Por lo tanto, el uso de 212Pb-trastuzumab purificado con PD-10 preparado a partir de mezclas de 224Ra/212Pb podría ser factible.

Tabla 1. Mareae del conu ado de anticuer o TCMC con 212Pb en solución de 224Ra

Tabla 2. Purificación del conjugado TCMC-anticuerpo marcado con 212Pb para solución de 224Ra utilizando un microconcentrador de centrifu ación.

PD10:

Tabla 3. Purificación del conjugado TCMC-anticuerpo marcado con 212Pb para solución de 224Ra utilizando l mn liniz i n r filr i n n l^ n l h x -2 PD 1 .

Ejemplo 7-Discusión

El estudio actual muestra que un anticuerpo monoclonal conjugado con TCMC se puede marcar de manera eficiente con 212Pb en soluciones de 224Ra en equilibrio con 212Pb. Posteriormente, el conjugado marcado con 212Pb se puede separar del 224Ra catiónico utilizando, por ejemplo, separación por exclusión en gel de desalinización. Esto significa que una solución de 224Ra/212Pb lista para usar se puede enviar desde un proveedor centralizado al usuario final. Las ventajas de utilizar 224Ra en solución son dobles (1) lleva menos tiempo realizar los procedimientos ya que se evita la etapa de extracción de ácido, y (2) es menos laborioso y no requiere evaporación de ácidos, etc. Se conoce a partir de estudios sobre el uso de 224Ra en el tratamiento de la espondilitis anquilosante que se pueden administrar cantidades modestas (normalmente menos de 10 MBq) a pacientes sin una toxicidad considerable de la médula ósea (3) lo que indica que un contenido de 1 -2 % en un producto a base de 212Pb, por ejemplo, de 100 MBq, sería aceptable siempre que el producto de 212Pb no produzca un alto grado de toxicidad de la médula ósea. Si se necesitara un producto más puro en términos de 224Ra, una purificación repetida en una segunda columna PD-10 podría lograrlo. En comparación con los generadores actuales basados en intercambio iónico, que pueden "ordeñarse" varias veces (aunque con una capacidad que disminuye rápidamente), el generador basado en solución de 224Ra descrito será para un solo uso. En conclusión, el trabajo actual demuestra una forma alternativa de utilizar 224Ra como un generador transportable para producir radioinmunoconjugado basado en 212Pb que puede ser más simple y consumir menos tiempo en comparación con los métodos actuales basados en intercambio iónico.

Ejemplo 8-Preparación de un anticuerpo monoclonal marcado con 212Pb utilizando una nueva solución generadora basada en 224Ra

Métodos

Mediciones de radiactividad

Las muestras radiactivas se midieron en la ventana de 70-80 keV en un contador Autogamma Cobra II (Packard Instruments, Downer Grove, IL, EE. UU.) o en las ventanas de 60-110 keV y 520-640 keV en un contador gamma automático Hidex (Hidex, Turku, Finlandia). Se asumió que los intervalos de energía por debajo de 110 keV contaban principalmente con radiación y de 212Pb con una contribución muy pequeña de otros radionucleidos en las series. Dado que la desintegración de 224Ra tiene una emisión<y>modesta en una región de energía con y más abundante de 212Pb, la actividad de 224Ra se determinó indirectamente a partir de los conteos en la ventana de 70-80 keV o 60-110 keV. Esto se realizó volviendo a medir las muestras después de 3 días o más, cuando el 212Pb inicial presente en la muestra se había desintegrado y se había alcanzado el equilibrio entre el 224Ra y el 212Pb recién producido. Se evaluó la ventana de 520-640 keV para determinar 212Bi indirectamente a partir del altamente abundante 208TI<y>. Las muestras de 212Bi se mantuvieron durante aproximadamente 20 minutos y luego se midieron para obtener un equilibrio transitorio entre 212Pb y 208TI 212Bi. En la Tabla 1 se presentan los rayos y de la serie 224Ra con abundancia superior al 1 %. Muestra una descripción general de los radionucleidos que tienen rayos X y/o y dentro de las ventanas de 60-110 y 520-640 keV. Las cantidades de radiactividad superiores a 50 kBq se midieron mediante un calibrador de radioisótopos (CRC-25R, Capintec Inc., Ramsey, NJ, EE. UU.).

El generador de 224Ra

El torio-228 (Eckert & Ziegler, Braunschweig, Alemania) se inmovilizó en una resina actínida DIPEX® (Eichrom Technologies LLC, Lisle, IL, EE. UU.) dentro de un cartucho de columna. Al eluir el cartucho con HCl, se extrajo 224Ra del generador. Los detalles de la configuración del generador de 224Ra se han presentado en otra parte (Patente N2: US9433690 B1).

Radiomarcaje de anticuerpos

El anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin, Roche, Basilea, Suiza) se conjugó con un quelante, TCMC (Macrocyclics Inc., Dallas, TX, EE. UU.), y se utilizó para radiomarcaje con 212Pb.

El tampón original de trastuzumab se intercambió con tampón de carbonato (NaHCÜ30,1M y Na2CÜ35mM en agua libre de metales de grado pH Eur) antes del marcado con TCMC. La solución de trastuzumab se lavó y se concentró cuatro veces con tampón de carbonato utilizando un concentrador centrífugo (Vivaspin 15R, 30 o 50 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Alemania). Durante cada etapa repetida, el trastuzumab se concentró en un factor de diez. Para las mediciones de concentración se utilizó espectrofotometría UV (Hitachi U-1900, Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japón) utilizando el valor de absorbancia estándar de 1,4 para inmunoglobulinas a 280 nm para soluciones al 0,1 %. Para conjugar el TCMC con el anticuerpo, se añadió una solución de TCMC disuelta en 5 mM HCl a trastuzumab en tampón de carbonato en un exceso molar de cinco a diez veces. Después de que la mezcla hubo reaccionado durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave, el quelante no conjugado se separó de TCMC-trastuzumab y se redujo el pH intercambiando el tampón de carbonato con NaCl al 0,9 %, utilizando un cartucho concentrador centrífugo (Vivaspin 15R, 30 o 50 kDa MWCO) de manera repetida como se describió anteriormente. El conjugado TCMC-trastuzumab se almacenó en un refrigerador hasta el radiomarcaje.

Se utilizó radio-224 en equilibrio con la progenie en 0,1 M HCl y 0,5 M NH4OAc para el radiomarcaje. Se verificó que el pH de la solución fuera aproximadamente 5-6 utilizando papel indicador de pH (papel indicador de pH general Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El TCMC-trastuzumab se incubó con solución de 224Ra durante un mínimo de 30 minutos en un ThermoMixerR (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) a 37 °C y 750 rpm. Esta solución se refiere a la "mezcla de reacción". Se probaron diferentes concentraciones de conjugado TCMC-trastuzumab (en el intervalo de 0,1 a 6 mg/mL) en solución de 224Ra con el método descrito. Normalmente, el volumen de la mezcla de reacción estaba entre 30-130 |uL.

En un experimento especial para evaluar el marcaje de 212Pb y 212Bi de TCMC-trastuzumab (4 mg/ml), se retiraron muestras del vial de reacción después de 5 minutos, 15 minutos y 25 minutos y se analizaron mediante cromatografía de capa fina instantánea.

Además, se realizó un experimento de radiólisis dejando incubar la mezcla de reacción durante la noche para obtener una dosis de radiación elevada para el producto radiomarcado. Posteriormente el producto fue analizado mediante cromatografía líquida de alta resolución. Además, se determinó la fracción inmunorreactiva utilizando células tumorales positivas al antígeno mediante un ensayo de un punto como se describió anteriormente (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27776176).

Ejemplo 4 - Procedimiento de ensayo de cromatografía de capa fina instantánea

El rendimiento del marcaje también denotó pureza radioquímica (RCP) del anticuerpo marcado con 212Pb en la mezcla de reacción, que se midió mediante tiras de cromatografía de capa fina instantánea (ITLC) (modelo n.° 150-772, Biodex Medical Systems Inc, Shirley, NY, EE. UU.). Se mezcló una muestra de la mezcla de reacción con un exceso doble de tampón de formulación (FB) que consistía en 7,5 % de albúmina sérica humana, 5 mM de EDTA en PBS de Dulbecco y se ajustó a pH 7 con NaOH. La mezcla de reacción/FB se agitó durante aproximadamente 5 segundos y se dejó reposar durante al menos 5 minutos para permitir que los radioisótopos no unidos se complejaran con EDTA. Se colocó una tira de ITLC con típicamente 3 pL de muestra en la línea de origen en un vaso de precipitados pequeño con una pequeña cantidad de NaCl al 0,9 % para el desarrollo. Después de que el frente del disolvente se hubo movido casi hasta la parte superior, se retiró la tira y se cortó por la mitad en la línea de corte y cada mitad se colocó en un tubo de vidrio para contar. En este sistema, el 212Pb-TCMC-trastuzumab permanece inmóvil en la mitad inferior (B), mientras que el 212Pb (y otros radionúclidos libres) complejado con EDTA migra a la mitad superior (U). La fracción de 212Pb como porcentaje unido al anticuerpo se determinó como:

CPM(B)

% RCP = x 100

CPM(B) CPM(U)

donde CPM representa la tasa de conteo por minuto.

Determinación de la fracción inmunorreactiva

La fracción inmunorreactiva de 212Pb-TCMC-trastuzumab se determinó en un ensayo de unión celular de un solo punto, realizado como se publicó previamente (Westrom et al 2016). En resumen, muestras de 16-20 x 106 células de osteosarcoma humano que expresan HER2, OHS, incubadas a temperatura ambiente con 212Pb-TCMC-trastuzumab o bloqueadas con un exceso de trastuzumab antes de añadir 212Pb-TCMC-trastuzumab. Se determinó la actividad total aplicada antes del lavado y la actividad ligada después del lavado para cada muestra, y se estimó que la fracción inmunorreactiva de 212Pb-TCMC-trastuzumab era la fracción determinada por el total ligado después del lavado dividido por el total aplicado antes y menos la misma fracción determinada para las muestras bloqueadas.

Cromatografía líquida de alta resolución

El sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) consistió en un sistema 1260 Infinity VL combinado con una columna de exclusión por tamaño TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, número de producto 08541), un detector UV (220 y 280 nm) y un detector radiométrico (analizador de centelleo de flujo Radiomatic 150TR, Perkin Elmer). La fase móvil se constituyó a partir de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 250 mM. Se utilizó una velocidad de flujo de 0,8 ml/min.

Purificación de anticuerpos radiomarcados

La purificación se realizó utilizando un concentrador centrífugo y una columna de purificación o de desalinización. Cuando se utilizó concentración centrífuga, la mezcla de reacción se cargó en un tubo concentrador (Vivaspin 4, 50 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Alemania) y se diluyó con NaCl al 0,9 % hasta que el volumen total fue de 4 mL. El contenido se concentró diez veces por centrifugación. El concentrado (C) se recogió y midió inmediatamente (t = 0). El rendimiento (Y) del proceso de purificación se estimó como el porcentaje de actividad de 212Pb unida al anticuerpo en el concentrado:

CPM (C)t=0

%Y (224Pb-TCMC-trastuzumab) x100

CPM (T)t=0x RCPmezcla de reacción

La actividad total (T) cargada en el concentrador centrífugo se determinó a partir de una muestra extraída de la mezcla de reacción tomada antes de la purificación que estaba sellada. Un mínimo de 3 días después de la primera medición (t = eq), cuando se había alcanzado el equilibrio entre 224Ra y 212Pb, se midieron nuevamente todas las muestras y se calculó el porcentaje de 224Ra restante en el concentrado:

224 CPM(C)t

% 224 Ra = * q x 100

CPM(T)t_eq

En el método de purificación alternativo evaluado se utilizó una columna Sephadex G-25 PD-10 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) para la separación del TCMC-trastuzumab radiomarcado de los radionúclidos no unidos. La columna se lavó con al menos 20 ml de PBS de Dulbecco suplementado con 0,5 % de albúmina de suero bovino antes de usarse para fines de purificación. La mezcla de reacción cruda así como el tampón de formulación agregado a la mezcla de reacción se purificaron con PD-10. La mezcla de reacción se hizo reaccionar con el tampón de formulación durante al menos 10 minutos para permitir que el EDTA formara complejos con radioisótopos no unidos antes de la aplicación.

Cuando se utilizan columnas PD-10 para la purificación, la muestra se cargó en la parte superior de la columna y se dejó entrar completamente en el lecho de la columna antes de añadir más tampón de elución. El proceso de elución continuó hasta que se recogieron al menos siete fracciones de 1 mL cada una en tubos Eppendorf. La actividad en todas las fracciones se midió inmediatamente. El anticuerpo radiomarcado generalmente se eluyó en las fracciones 3-5 (F3-F5). Esto se confirmó con análisis de TLC. Se estimó que el rendimiento del proceso era el porcentaje de actividad de 212Pb unida al anticuerpo en estas fracciones frente a la actividad total de 212Pb aplicada:

CPM (F3+F4+F5)t=0

%Y (212Pb-TCMC-trastuzumab):

CPM (T)t<=0>x RCPmezcla de reacción

La actividad total aplicada de 212Pb (T) cargada en la columna PD-10 se determinó a partir de una muestra de referencia sellada preparada a partir de una alícuota de la mezcla de reacción tomada antes de la purificación. El RCP del producto en la fracción 4 se determinó mediante el procedimiento ITLC descrito anteriormente. Después de al menos 3 días, se volvieron a medir las muestras y se calculó el porcentaje de 224Ra restante en la fracción 3-5:

Para evaluar la coelución de radionucleidos con las fracciones de proteína, se realizó un experimento donde el radiomarcaje y la purificación de PD-10 se realizaron como se describió anteriormente, pero se utilizó trastuzumab no conjugado en lugar de trastuzumab conjugado con TCMC. La presencia de 212Pb y 212Bi en las siete fracciones recolectadas se determinó mediante medición en las ventanas de 60-110 y 520-640 keV. Al medir las muestras 5 min, 20 min, 1 h, 1 día y 5 días después de finalizada la purificación de PD-10, también se pudo evaluar la tasa de desintegración. Esto fue necesario para determinar si la actividad y en la ventana de 520-640 keV reflejaba la presencia de 212Bi además de 208TI. A partir de las mediciones del día 5, cuando todas las muestras habían alcanzado el equilibrio, se determinó la cantidad de 224Ra.

Retención de la hija 212Bi del 212Pb emisor de o por el quelante TCMC

En una solución de 224Ra en equilibrio, la relación entre la actividad de 212Bi y la actividad de 212Pb es aproximadamente igual a uno. Se utilizó una muestra sellada de 224Ra en equilibrio con la progenie como referencia para determinar un factor de eficiencia (Bq/cpm) para las ventanas de 60-110 y 520-640 keV. Después de la purificación con PD-10 de la mezcla de reacción extinguida con EDTA, la fracción 4 se midió 10 min, 20 min, 60 min y 22 h después del final de la purificación. La relación 212Bi a 212Pb en los diferentes puntos de tiempo se estimó utilizando los factores de eficiencia. Se utilizó una calculadora de desintegración universal en línea (http://www.wise-uranium.org/rcc.html) para determinar las relaciones teóricas de 212Bi a 212Pb en función del tiempo basándose en diferentes relaciones iniciales de 212Bi a 212Pb, que van desde una muestra de 212Pb puro sin 212Bi presente hasta una muestra donde la relación de actividad es igual a uno. Suponiendo que toda la actividad en la fracción 4 inmediatamente después de la purificación estaba unida al anticuerpo conjugado, se podría deducir una estimación de la porción de 212Bi retenida en el quelante TCMC comparando las proporciones determinadas experimentalmente con gráficos de crecimiento interno para diferentes proporciones teóricas de 212Bi a 212Pb.

Resultados y discusión

El radiomarcaje de TCMC-trastuzumab con 212Pb en una solución de 224Ra en equilibrio con nucleidos hijos tuvo éxito. El procedimiento produjo un producto con RCP superior al 90 % ya a 0,15 mg/mL de conjugado de anticuerpo, y superior al 95 % a partir de 1 mg/mL y a concentraciones superiores. En tres de los experimentos de etiquetado, se determinó la fracción inmunorreactiva del producto. El intervalo fue del 57-66 %, lo que está en línea con resultados publicados previamente sobre la inmunorreactividad de 212Pb-TCMC-trastuzumab.

Debido a que el etiquetado se realizó en una solución de 224Ra en equilibrio con las hijas, 212Bi estará presente durante la incubación. Por lo tanto, el RCP también se midió en la ventana 208TI después de alcanzar el equilibrio secular para tener en cuenta el 212Bi. Esto dio como resultado valores que variaron entre 50-80. A una concentración de 4 mg por ml de TCMC-trastuzumab se encontró que el 212Pb se había complejado cuantitativamente ya después de 5 minutos de reacción y que más del 80 % del 212Bi también se había complejado.

El etiquetado exitoso de 212Pb en un intervalo de concentraciones de anticuerpos demuestra que se puede lograr una variedad de actividades específicas del radioinmunoconjugado.

Dado que este estudio tenía como objetivo principal demostrar una prueba de concepto, se utilizaron niveles de actividad relativamente bajos en comparación con lo que se espera en un entorno clínico. Por lo tanto, el radiomarcaje se realizó en volúmenes bastante pequeños, normalmente de 30-130 pL, para simular concentraciones de actividad clínica relevantes. Gracias a los bajos volúmenes, fue posible lograr actividades específicas relativamente altas del producto final, a pesar de la baja actividad utilizada. La actividad específica más alta de 212Pb-TCMC-trastuzumab lograda en este estudio fue de aproximadamente 30 MBq/mg, lo que es comparable a lo que se utilizó en un estudio clínico reciente con 212Pb-TCMC-trastuzumab.

Tras la desintegración completa de 224Ra, se forma 208Pb estable, que puede competir con 212Pb en la conjugación con el quelante TCMC. Con los niveles de actividad utilizados aquí, no hubo indicios de que la presencia de 208Pb influyera en el rendimiento del radiomarcaje debido a la actividad específica relativamente alta que fue posible lograr. Sin embargo, la situación podría ser diferente cuando se utiliza una actividad mayor de 224Ra y se realizó la siguiente estimación: suponga 1 mg de anticuerpo marcado en una solución de 100 MBq de 224Ra. Esto corresponde a 4 x 1015 moléculas, donde podemos suponer 2-5 quelantes TCMC por anticuerpo, lo que da 8-20 x 1015 sitios de unión disponibles para el plomo. La desintegración completa de 100 MBq de 224Ra formará aproximadamente 4,5 x 1013 átomos de 208Pb. Estos números indican que la presencia de 208Pb no debería influir significativamente en el rendimiento del radiomarcaje.

El producto final deseado del proceso descrito en este estudio es una solución pura de TCMC-trastuzumab marcado con 212Pb. Para lograr el producto final deseado, se purificó la solución con el conjugado de anticuerpo marcado con 212Pb para eliminar el 224Ra libre y otros nucleidos hijos no conjugados. Se evaluaron dos métodos de purificación diferentes: purificación por concentración centrífuga y purificación con una columna de desalinización. Ambos métodos se basan en una separación dependiente del tamaño del anticuerpo-conjugado de compuestos de bajo peso molecular, tales como iones libres, moléculas quelantes no unidas y sales.

El uso del concentrador centrífugo para la separación de 212Pb-TCMC-trastuzumab de 224Ra catiónico y otros nucleidos hijos no conjugados produjo 70,5 ± 9,6 % (n = 6) de la actividad de 212Pb unida al anticuerpo en el concentrado. La pérdida de aproximadamente un tercio del trastuzumab marcado con 212Pb debido al procedimiento es significativa, pero aún está en línea con los rendimientos informados (73 ± 3 %) de 212Pb-TCMC-trastuzumab después de la purificación en columna PD-10. La cantidad de 224Ra restante en el concentrado fue de 25,9 ± 13,1 % (n = 6), es decir, la separación de 224Ra del radioinmunoconjugado solo se completó en un 75 %. La proporción de 212Pb-TCMC-trastuzumab a 224Ra mejoró de 1:1 a solo alrededor de 3:1, lo que no es un resultado satisfactorio para el uso biomédico de radioinmunoconjugados marcados con 212Pb. Observamos además una ligera tendencia hacia un mayor porcentaje de 224Ra restante en el concentrado después de la purificación cuando se aplicaron mayores cantidades de conjugado de anticuerpo. Esta observación podría indicar una saturación u obstrucción de la membrana con proteínas, lo que disminuye la eficiencia de filtración de iones a través de la membrana.

La separación de 212Pb-TCMC-trastuzumab de 224Ra y otros nucleidos hijos no conjugados fue más exitosa cuando se utilizó una columna de filtración en gel PD-10. El uso de columnas de filtración en gel como PD-10 es común para la purificación de anticuerpos radiomarcados y permite la eliminación rápida de sustancias de bajo peso molecular, tal como radionúclidos no conjugados, de las soluciones que contienen anticuerpos. La recuperación de 212Pb-trastuzumab fue muy favorable, con un rendimiento de aproximadamente 80 % en la fracción 3-5, independientemente del enfriamiento de la mezcla de reacción con EDTA. De la Tabla 3 también se desprende claramente que la mayoría (aproximadamente el 70 %) del conjugado de proteína se eluyó de 3 a 4 ml (fracción 4). Esto es consistente con Baidoo et. al. que informan un rendimiento del 73 % en el eluato PD-10 recolectado de 2,5 a 4,2 ml (1,7 mL). La eliminación de 224Ra de la solución que contenía 212Pb-TCMC-trastuzumab fue bastante eficaz, quedando típicamente menos del 4 % de 224Ra en la fracción 3-5, con una tendencia hacia una separación más eficiente cuando se utilizó EDTA para apagar la mezcla de reacción. Se observó en algunos de los experimentos que el 224Ra comenzó a eluirse después de 4,5 ml y, para minimizar la cantidad de 224Ra, se decidió excluir la fracción 5 del análisis. El avance de 224Ra pudo entonces reducirse a 0,9 ± 0,8 % y 2,7 ± 3,6 % con y sin EDTA, pero se produjo a expensas de una modesta reducción en el rendimiento de 212Pb-TCMC-trastuzumab de aproximadamente 5 %, a 76,7 ± 11,7 % y 76,1 ± 5,9 % respectivamente. Los análisis de ITLC de la fracción 4 dieron un aumento de RCP de 212Pb-trastuzumab en comparación con antes de la purificación, con un promedio de 98 ± 1 % (n = 8). Los resultados en conjunto indican que es factible el uso de PD-10 212Pb-trastuzumab purificado preparado a partir de mezclas de 224Ra/212Pb.

Para examinar si alguno de los radionucleidos en la solución de 224Ra se une de manera no específica a trastuzumab y por lo tanto coeluye con las fracciones de proteína, se realizó un experimento donde el protocolo de radiomarcado y la purificación de PD-10 se realizaron como de costumbre, excepto que el TCMC-trastuzumab se reemplazó con trastuzumab. La presencia de 212Bi, 212Pb y 224Ra se evaluó midiendo las siete fracciones recolectadas en diferentes puntos de tiempo después de finalizar la purificación de PD-10. Se probó un porcentaje de las actividades totales en las ventanas de 60-110 y 520-640 keV, respectivamente. Una cantidad significativa (32 %) de 212Bi coeluyó con el anticuerpo en las fracciones 4 y 5 cuando no había EDTA presente. Se puede ver a partir de la tasa de desintegración que la actividad medida en esta ventana (520-640 keV) claramente se origina a partir del crecimiento interno de 208TI desde 212Bi a medida que se desintegra con la vida media de la madre 212Bi.

Cuando se utilizó EDTA para apagar la mezcla de reacción, la coelución de 212Bi se redujo al 1,3 % en las mismas fracciones. La coelución de 212Pb fue insignificante en las fracciones 3 y 4 del eluato PD-10 cuando estaba presente EDTA, y por debajo del 2 % en la fracción 5. Sin EDTA presente, aproximadamente el 5 % de la actividad total de 212Pb coeluyó con el anticuerpo en las fracciones 3-5. Como se puede observar en las mediciones del día 5, la coelución de 224Ra fue insignificante (menos del 0,7 %) en ambos casos. En conjunto, los resultados muestran claramente que el uso de EDTA para apagar la mezcla de reacción antes de la purificación en la columna PD-10 maximiza la pureza del producto cuando se utiliza una solución de 224Ra para preparar radioinmunoconjugados basados en 212Pb. Esta medida elimina los enlaces no específicos de 212Bi y 212Pb de las fracciones de anticuerpos y, al mismo tiempo, deja menos 224Ra restante en el producto final.

Es interesante tener conocimiento sobre el destino del 212Bi formado cuando el 212Pb quelado con TCMC se desintegra. Para evitar la radiotoxicidad causada por el 212Bi libre, es deseable que el quelante TCMC retenga una fracción sustancial de 212Bi durante la desintegración. Mirzadeh y sus colegas descubrieron que el 36 % del 212Bi se liberó del quelante DOTA cuando el 212Pb se descompuso y afirmaron que la ruptura del complejo se debió a la conversión interna de los rayos y emitidos por los núcleos excitados de 212Bi. No hemos encontrado ningún examen correspondiente para la retención de 212Bi por el quelante TCMC cuando se desintegra 212Pb y, por lo tanto, hicimos una estimación basada en nuestros datos. Determinamos la relación 212Bi a 212Pb en la fracción 4 del producto purificado PD-10 en diferentes puntos de tiempo después de finalizar la purificación. Dependiendo de la cantidad inicial de 212Bi presente, la relación 212Bi/212Pb aumenta en distintos grados antes de alcanzar una meseta máxima donde los nucleidos están en equilibrio transitorio. Suponiendo que toda la actividad en la fracción 4 está unida al anticuerpo conjugado inmediatamente después de la purificación y teniendo en cuenta el crecimiento interno de 212Bi desde 212Pb durante el tiempo desde la finalización de la purificación hasta el momento de la medición, se estimó que un mínimo del 60 % del 212Bi estaba asociado con el quelante TCMC después de la descomposición del 212Pb. El valor que encontramos concuerda con los datos mencionados anteriormente sobre la retención de 212Bi por el quelante DOTA. Se ha afirmado que los cuatro átomos donantes de N y los cuatro átomos donantes de O del quelante de TCMC proporcionarán buenas capacidades de unión con el bismuto y, por lo tanto, no es improbable que haya una retención relativamente alta de 212Bi en el quelante de TCMC.

El estudio actual demuestra que un anticuerpo monoclonal conjugado con TCMC se puede marcar de manera eficiente con 212Pb a partir de soluciones de 224Ra en equilibrio con la progenie. Cuando se utilizó una concentración de 4 mg por ml de TCMC-trastuzumab, el marcaje con 212Pb se realizó cuantitativamente después de tan sólo 5 minutos. A esta concentración también se observó que la mayor parte del 212Bi quedaría quelado por el conjugado de anticuerpos. Posteriormente, el conjugado marcado con 212Pb se puede separar del 224Ra catiónico utilizando, por ejemplo, separación por exclusión en gel de desalinización. A diferencia de los generadores actuales basados en intercambio iónico, que pueden eluirse varias veces (durante un período de hasta 2 semanas), el generador de 212Pb líquido descrito aquí está diseñado para la preparación de una sola dosis únicamente.

Con nuestro método propuesto, se puede enviar una solución de 224Ra lista para usar desde un proveedor centralizado al usuario final. Esto es beneficioso tanto desde el punto de vista logístico como porque se reduce y simplifica el trabajo requerido por el usuario final. Creemos que una ventaja de nuestro método es que los pasos que implican la manipulación y evaporación de soluciones ácidas concentradas con altos niveles de radiactividad se pueden evitar por completo en el ámbito hospitalario o de radiofarmacia. Un beneficio adicional de eliminar los procedimientos de digestión ácida es que el tiempo total de preparación en el hospital será más corto, ya que solo es necesario realizar el etiquetado y la purificación de los anticuerpos. Baidoo et al. informaron que esta parte del proceso requirió solo 80 minutos del tiempo total de preparación de una dosis inyectable de aproximadamente 210 minutos. Un tiempo de preparación más corto reduce la pérdida de actividad causada por la descomposición y, por lo tanto, dará lugar a una mayor cantidad de 212Pb administrada a los pacientes. Esto es beneficioso tanto para limitar la cantidad de nucleidos hijos libres en el producto en el momento de la inyección como para minimizar el riesgo de posibles problemas con la radiólisis del anticuerpo.

Al evaluar nuestro método propuesto para el radiomarcaje de anticuerpos, también es importante abordar los requisitos de seguridad radiológica. Como en todos los procedimientos que involucran fuentes abiertas de radionucleidos emisores de O, se deben tomar precauciones para evitar la inhalación o la ingestión. Por lo tanto, toda manipulación debe realizarse en un banco de bioseguridad o en una caja de guantes bajo presión negativa para proteger al trabajador. Esto es especialmente importante cuando se maneja la serie 224Ra, porque 220Rn es una de sus hijas. El espacio de trabajo también debe estar adecuadamente protegido. Una de las 224Ra hijas de es 208TI, que tiene un rayo gamma altamente energético de 2,6 MeV con una abundancia del 36 %, lo que básicamente determinará el espesor del blindaje requerido. Baidoo et al. han descrito que el blindaje adecuado para actividades de hasta 740 MBq de 224Ra es de aproximadamente 15 cm de plomo. La tasa de dosis a 30 cm de distancia de una fuente puntual de 224Ra con esta actividad en equilibrio con las hijas se reducirá de aproximadamente 1600 a 3 pSv/h cuando se utiliza un blindaje de plomo de 15 cm. Dado que la solución generadora de 212Pb que hemos presentado aquí está destinada a la preparación de una dosis única para el paciente, no creemos que sea plausible que los requisitos de protección superen lo descrito por Baidoo et al. Incluso si el 224Ra está presente hasta la purificación con nuestro método, en lugar de solo en la columna cuando se trabaja según el método presentado por Baidoo et al., esto no alterará los requisitos de protección porque el 99 % de la actividad y en la serie se origina a partir del 212Pb y sus derivados, y especialmente los rayos y de alta energía mencionados anteriormente del 208TI. Las etapas de evaporación incluidos en el método descrito por Baidoo et al. deben realizarse en una caja de guantes o en algún tipo de sistema cerrado donde se recoja el vapor para minimizar el riesgo de crear contaminantes radiactivos en el aire y, por lo tanto, requerirán equipo dedicado para este proceso. No se requerirá tal equipo para nuestro método propuesto.

Como se mencionó anteriormente en la discusión, el estudio actual se llevó a cabo con niveles de actividad relativamente bajos y pueden surgir problemas radiolíticos cuando se utiliza una actividad clínicamente relevante más alta de la solución de 224Ra. Una posible desventaja de utilizar 224Ra en equilibrio con 212Pb en lugar de 212Pb puro en la reacción de radiomarcaje es la elevada dosis de radiación a la solución de reacción debido a una mayor actividad de las partículas a. Es probable que la exposición a la radiación del anticuerpo conjugado sea máxima durante el procedimiento de radiomarcaje. En ese momento, 224Ra y toda su progenie contribuirán a la dosis, mientras que después de la purificación, la dosis será principalmente aportada por 212Pb y sus hijas. La energía de desintegración total (excluyendo los fotones) del 224Ra y sus hijos es de 27,8 MeV, en comparación con solo 8,8 MeV liberados por la desintegración del 212Pb y sus hijos. Para exponer el anticuerpo a una alta dosis de radiación, después del período de incubación de 30 minutos, continuamos almacenando el TCMC-trastuzumab marcado con 212Pb en la solución de 224Ra en equilibrio hasta que se logró una dosis de aproximadamente 700 Gy. El análisis con HPLC de exclusión por tamaño mostró un pico que incluía el 96 % de la radiactividad total en un momento consistente con TCMC-trastuzumab intacto, con menos del 1,3 y el 2,9 % asociado con compuestos de mayor y menor peso molecular respectivamente. El 212Pb-TCMC-trastuzumab expuesto a 700 Gy también se comparó con TCMC-trastuzumab no marcado con detección de absorción a 280 nm. Los resultados mostraron un pico de compuestos de peso molecular inferior a la IgG cuando se analizó el anticuerpo radiomarcado.

Este pico comprendió aproximadamente el 11 % y no se observó con el TCMC-trastuzumab no marcado y, por lo tanto, es probable que sea causado por la degradación radiolítica de la proteína. La cantidad de especies de alto peso molecular fue similar entre las dos muestras (menos del 1,6 %). Sin embargo, el daño radiolítico aparente a una fracción del anticuerpo no pareció influir en la fracción inmunorreactiva del producto. Se purificaron dos muestras de TCMC-trastuzumab marcado con 212Pb expuestas a 100 y 700 Gy con una columna PD-10 y se determinó que la inmunorreactividad de la fracción 4 era del 60 y 57 % respectivamente, con una unión no específica baja (menos del 3 %) en ambos casos. Esto concuerda con los resultados de la literatura, donde se toleró una exposición de hasta 1000 Gy sin reducir significativamente la fracción de unión celular de un anticuerpo.

En conjunto, el examen de los posibles efectos radiolíticos a dosis de radiación más altas indica que la dosis de radiación al anticuerpo debe mantenerse por debajo de 700 Gy. En el estudio de fase I de 212Pb-TCMC-trastuzumab administrado por vía intraperitoneal, la dosis más alta que recibieron los pacientes fue de 27,4 MBq/m2. Utilizando una superficie corporal media de 1,79 m2 encontrada en un estudio de pacientes adultos con cáncer, esta dosis corresponde a 49 MBq por paciente. Para preparar una dosis para el paciente con esta actividad, es razonable suponer que una actividad de 100 MBq de 224Ra debería ser suficiente, ya que corresponde aproximadamente al doble de la dosis más alta de 212Pb-TCMC-trastuzumab administrada a los pacientes en el ensayo de fase I. La dosis de radiación a la solución de anticuerpos durante un marcaje de 30 min con 100 MBq de 224Ra en un volumen de reacción de 1,5 mL, que es compatible con el formato de purificación por exclusión en gel PD-10, se estimó en 534 Gy. Con base en estos cálculos, se predice que el método descrito en el presente documento podría ser útil también en un entorno clínico donde se utilizan altos niveles de actividad.

La pureza de 212Pb frente a 224Ra es un parámetro de calidad importante para el radioinmunoconjugado marcado con 212Pb. Para que el método de etiquetado in situ propuesto en este artículo sea una alternativa viable al protocolo existente, se debe considerar cuidadosamente la definición de límites aceptables de 224Ra en el producto final. Afortunadamente, el 224Ra se ha estudiado ampliamente tanto en animales como en humanos, y su perfil de toxicidad es bien conocido. Al igual que ocurre con otros isótopos del radio, después de la inyección intravenosa, el 224Ra se deposita principalmente en el hueso. Por sus propiedades naturales para fortalecer los huesos, se introdujo como tratamiento paliativo de la espondilitis anquilosante ya en la década de 1940. Se utilizó durante varias décadas (hasta 1990) y luego fue reintroducido brevemente para la misma indicación por un fabricante diferente entre 2000 y 2005. Los cálculos dosimétricos, realizados según el modelo propuesto por la Comisión Internacional de Protección Radiológica, mostraron que las dosis absorbidas después de la inyección intravenosa de dicloruro de 224Ra fueron más altas en la superficie ósea y la médula ósea roja desde su introducción, se han utilizado inyecciones semanales de 1 MBq, hasta un total de diez inyecciones, como régimen de tratamiento en pacientes adultos. Los informes que incluyen alrededor de 1000 pacientes que recibieron esta dosis han demostrado que tales cantidades de dicloruro de 224Ra pueden administrarse sin una toxicidad considerable en la médula ósea. Estos datos históricos indican que una dosis de 1 MBq de 224Ra, o un total de 10 MBq acumulativos, podría ser aceptable en pacientes adultos siempre que el producto 212Pb por sí solo no produzca un alto grado de toxicidad en la médula ósea.

En el estudio de fase I de 212Pb-TCMC-trastuzumab administrado por vía intraperitoneal, no se encontró mielosupresión significativa. A partir de los resultados obtenidos aquí, cuando se utilizó EDTA para apagar la mezcla de reacción antes de la purificación de PD-10, la cantidad restante de 224Ra en el producto final se pudo mantener por debajo del 1 %. Esto corresponde a 0,5 MBq de 224Ra administrados a un paciente al que se le administraron 50 MBq de un producto a base de 212Pb. La dosis máxima de 212Pb-TCMC-trastuzumab (27,4 MBq/m2) administrada en el ensayo de fase I mencionado anteriormente fue de aproximadamente 49 MBq al paciente. En conjunto, estas estimaciones indican que se podría lograr una pureza suficiente de 212Pb frente a 224Ra en el producto final de un radioinmunoconjugado marcado con 212Pb preparado a partir de una solución de 224Ra, suponiendo que hasta 1 MBq de 224Ra por dosis es una cantidad tolerable.

Conclusiones

El trabajo actual demuestra la conveniencia de una solución de 224Racomo una solución generadora transportable para producir radioinmunoconjugados basados en 212Pb. La generación de conjugados marcados con 212Pb es más sencilla y requiere menos tiempo para el usuario final en comparación con los métodos actuales basados en intercambio iónico.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1.Un método para generar una proteína marcada con radionúclidos, comprendiendo el método:

a) proporcionar una solución acuosa que comprende 224Ra y 212Pb, y una solución acuosa que comprende una proteína con una masa molecular superior a 300 conjugada con un quelante, en donde la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa está entre 0,5 y 2 y la radiactividad generada a partir de 224Ra y 212Pb es de 1 kBq a 10000 MBq,

b) mezclar e incubar las soluciones proporcionadas en a) para proporcionar una solución de reacción que comprende una proteína marcada con radionúclido,

c) purificación de la solución de reacción mediante cromatografía de filtración en gel, y

d) recuperar la proteína marcada con radionúclido de la purificación en la etapa c).

2. El método según la reivindicación 1, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, una proteína sintética y un péptido.

3. El método según la reivindicación 1, en donde la proteína tiene un tamaño de 500-500.000 Dalton.

4. El método según las reivindicaciones 1-3, en donde la solución que comprende 224Ra y 212Pb en la etapa a) tiene una radiactividad generada a partir de 224Ra y 212Pb de 1 kBq a 1 GBq, de 10 kBq a 100 MBq, de 100 kBq a 10 MBq o de 10 MBq a 200 MBq.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo conjugado con un quelante recuperado en la etapa d) está presente en una cantidad de 0,05-50 mg, 0,1-25 mg, 0,5-10 mg o 1-5 mg.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la solución en la etapa a) está en un volumen de 100 pL a 1000 mL, 500 pL a 100 mL, o 1 mL a 10 mL.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la solución que comprende un anticuerpo conjugado con un quelante en la etapa a) tiene una concentración de 0,1 a 4 mg/ml, 0,25 a 2 mg/ml, 0,5 a 1,5 mg/ml o 0,1 a 10 mg/ml de anticuerpo conjugado con un quelante.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la mezcla y la incubación en la etapa b) se realizan en 1-180 minutos, 5-120 minutos, 15-60 minutos, 20-40 minutos o 30-60 minutos.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la cromatografía de filtración en gel en la etapa c) se selecciona del grupo que consiste en purificación por desalinización, desalinización e intercambio de tampón, y separación por exclusión en gel por desalinización.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la cromatografía de filtración en gel es una purificación por desalinización, y la desalinización se repite para mejorar la pureza.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la purificación en la etapa c) es impulsada por uno de los métodos seleccionados del grupo que consiste en impulsada por centrifugación, impulsada por presión, impulsada por vacío o impulsada por gravedad.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el quelante es (2-(4-isotiocianatobencil-1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10,tetra-(2-carbamoilmetil)-ciclododecano) (TCMC).

13. El método según las reivindicaciones 1-12, en donde el anticuerpo se selecciona de uno o más del grupo que consiste en trastuzumab, rituximab, HH1, cetuximab, bevacizumab, daratumumab, alemtuzumab, Pembrolizumab, Epratuzumab, L19, F8, F16, Galiximab, Toralizumab, Alemtuzumab, Ofatumumab, Veltuzumab, Afutuzumab, Tositumomab, Reditux y Ibritumomab.

14. El método según las reivindicaciones 1-13, en donde la proteína es un anticuerpo que es específico para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD45, CD74, CD138, PSMA, HER-2, EGFR, MUC-1, MUC-18, CEA, FBP, NG2, EPCAM, Syndecan-1, Ca-125, LK-26, HMFG, CS-1 y BCMA.

15. Un kit para la generación de una proteína marcada con radionúclidos que comprende:

(i) una solución acuosa que comprende 224Ra y 212Pb, en donde la relación de actividad en MBq entre 212Pb y 224Ra en la solución acuosa está entre 0,5 y 2,

(ii) una solución acuosa que comprende una proteína con una masa molecular superior a 300 conjugada con un quelante,

(ii) medios para cromatografía de filtración en gel, y

(iv) opcionalmente, instrucciones para la generación de una proteína marcada con radionúclido.