ES2991142T3 - Receptores de linfocitos T - Google Patents

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ES2991142T3 ES17723015T ES17723015T ES2991142T3 ES 2991142 T3 ES2991142 T3 ES 2991142T3 ES 17723015 T ES17723015 T ES 17723015T ES 17723015 T ES17723015 T ES 17723015T ES 2991142 T3 ES2991142 T3 ES 2991142T3
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William Lawrance
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Abstract

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido restringido por HLA-A*0201 GVYDGEEHSV (SEQ ID NO: 1) derivado de la proteína MAGE-B2. Los TCR de la invención demuestran excelentes perfiles de especificidad para este epítopo MAGE. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los TCR, células diseñadas para presentar los TCR, células que albergan vectores de expresión que codifican los TCR y composiciones farmacéuticas que comprenden los TCR, ácidos nucleicos o células de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de linfocitos T
La presente invención se refiere a receptores de linfocitos T (TCR) que se unen al decapéptido restringido del HLA-A*0201 GVYDGEEHSV derivado de la proteína B2 del antígeno asociado al melanoma (MAGE) (aminoácidos 230 239). Los TCR de la invención presentan unos excelentes perfiles de especificidad para este epítopo del MAGE.
Antecedentes de la invención
Los antígenos del cáncer de testículo (CTA) son una subclase de antígeno asociado a tumores (TAA) codificados por aproximadamente 140 genes. La expresión de estos antígenos está restringida a sitios inmunitarios privilegiados tales como los testículos, la placenta y el ovario fetal; normalmente no se expresan en otros tejidos. La expresión de estos genes se ha observado en tumores malignos. La inmunogenicidad de los CTA ha conducido al desarrollo generalizado de vacunas contra el cáncer dirigidas a estos antígenos en muchos tumores sólidos. Dentro de esta gran clase de TAA, los antígenos asociados al melanoma (MAGE) se han convertido en candidatos prometedores para la inmunoterapia contra el cáncer.
Se han notificado más de 30 genes de cáncer de testículo (CT) como miembros de familias de múltiples genes que están organizados en grupos de genes en el cromosoma X (antígenos CT-X). Los grupos de genes CT están ubicados entre Xq24 y Xq28, e incluyen familias de genes tales como MAGE y NY-ESO-1. Los grupos de genes MAGE de tipo I son los más ampliamente caracterizados e incluyen las familias MAGE-A, MAGE-B y MAGE-C. Las proteínas MAGE-A están codificadas por 12 miembros diferentes de la familia de genes MAGE-A (de MAGE-A1 a MAGE-A12), y se definen por una base conservada de 165-171 aminoácidos, denominada dominio de homología MAGE (MHD). El MHD corresponde a la única región de aminoácidos compartidos por todos los miembros de la familia MAGE-A.
Los linfocitos T reconocen e interactúan con complejos de moléculas de la superficie celular, denominados antígenos leucocitarios humanos ("HLA"), o complejos principales de histocompatibilidad ("MHC"), y péptidos. Los péptidos se derivan de moléculas más grandes, que son procesadas por las células que también presentan la molécula HLA/MHC. La interacción de los linfocitos T con los complejos HLA/péptido está restringida, requiriendo un linfocito T específico para una combinación particular de una molécula de HLA y un péptido. Si un linfocito T específico no está presente, no hay respuesta de los linfocitos T incluso si su complejo asociado está presente. De forma similar, no hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero el linfocito T está presente. El mecanismo está involucrado en la respuesta del sistema inmunitario a la infección, en enfermedades autoinmunitarias y en respuestas a anomalías tales como los tumores.
Algunas proteínas de la familia de genes MAGE se expresan únicamente en células germinales y en cáncer (familias MAGE-A a MAGE-C). Otras se expresan ampliamente en los tejidos normales (MAGE-D hasta<m>A<g>E-H). Todas estas familias de proteínas MAGE tienen una región homóloga que coincide estrechamente con la secuencia de las otras proteínas MAGE, y comprende péptidos que se muestran como complejos de HLA/péptido en el reconocimiento inmunitario. En consecuencia, es importante seleccionar candidatos clínicos de TCR que sean muy específicos para el péptido MAGE/antígeno HLA-A2 deseado.
El MAGE B2 es un miembro CTA de la familia de genes MAGE B. La función es desconocida, aunque se cree que puede desempeñar un papel en el desarrollo embrionario. En la patogenia del tumor, parece estar involucrado en la transformación tumoral o en aspectos de la progresión tumoral. El MAGE B2 ha sido implicado en una gran cantidad de tumores. El péptido GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1) corresponde a los restos de aminoácidos números 231-241 de la proteína MAGE-B2 conocida.
El MAGE A4 es un CTA de la familia de genes MAGE A. El MAGE A4 se expresa en los testículos y la placenta, y en una fracción significativa de tumores de diferentes tipos histológicos. El péptido GVYDGREHTV (SEQ ID No. 2) muestra reactividad cruzada con el MAGE B2, de modo que ciertos TCR son capaces de unirse a las moléculas HLA que muestren ambos péptidos.
La publicación de patente de EE. UU. 2007/077045 describe péptidos MAGE que incluyen MAGE A4 y MAGE B2, y TCR que son específicos para dichos antígenos.
La solicitud de patente internacional WO02/094981 describe los péptidos GVYDGEEHSV y GVYDGREHTV del MAGE.
Hilliget al.,2001 J. Mol. Biol. 310: 1167-1176 describe un complejo heterotrimérico de HLA-A*0201 humano, GVYDGREHTV y microglobulina beta-2.
Zheng-Caiet al.,2010 Clin. Dev. Immunol. 2010: 107 identifica como un epítopo CTL de Mage-A4. Wahlet al.,2010 Human Immunology, Nueva York, 71: 14-22 identificó GVYDGEEHSV unido a HLA-A*0201.
Sumario de la invención
Hemos desarrollado un TCR que se une a moléculas HLA que muestran el péptido GVYDGEEHSV del MAGE B2 con preferencia respecto al MAGE A4. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de linfocitos T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGEEHSV (Se Q ID No: 1) en un complejo con HLA-A*0201, con una constante de disociación de aproximadamente 0,05 pM a aproximadamente 20,0 pM cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial a 25 °C y a un pH de entre 7,1 y 7,5 utilizando una forma soluble del TCR, y tiene una selectividad de unión al menos diez veces mayor a la SEQ ID No: 1 en el complejo con HLA-A*0201 sobre la unión a GVYDGREHTV (SEQ ID No 2) en el complejo con HLA-A*0201, en donde el TCR comprende (A) el dominio variable de la cadena alfa del TCR de una secuencia en la que: (i) los restos de aminoácidos 1-27 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-26 de la SEQ ID No: 3 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); (ii) los restos de aminoácidos 28-33 son VSPFSN; (iii) los restos de aminoácidos 34-47 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 34-47 de la SEQ ID NO: 3 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); (iv) los restos de aminoácidos 48-53 son LTIMTF o LTRMTF; (v) los restos de aminoácidos 54 90 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 54-90 de la SEQ ID No: 3 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); y (vi) los restos de aminoácidos 91-105 son CWSGGTDSWGKLQF; y (B) el dominio variable de la cadena beta del TCR de una secuencia en la que: (i) los restos de aminoácidos 1-45 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de los restos 1-45 de la SEQ ID No: 4 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); (ii) los restos de aminoácidos 46-50 son KGHDR o KGRDR; (iii) los restos de aminoácidos 51-67 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 51-67 de la SEQ ID NO: 4 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); (iv) los restos de aminoácidos 68-72 son SFDVK; (v) los restos de aminoácidos 73-109 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 73-109 de la SEQ ID NO: 4 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); y (vi) los restos de aminoácidos 110-123 son CATSGQGAYREQFF o CATSGQGAYKEQFF o CATSGQGAYNEQFF; y en donde los dominios variables de TCR forman contactos con al menos los restos V2, Y3 y D4 de GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1).
La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un TCR de la invención. La invención proporciona además una célula aislada o de origen no natural, especialmente un linfocito T, que presenta un TCR de la invención. La invención también proporciona una célula que porta (a) un vector de expresión de TCR que comprende un ácido nucleico de la invención en un único marco abierto de lectura, o dos marcos abiertos de lectura distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta respectivamente; o (b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un TCR de la invención, un ácido nucleico de la invención o una célula de la invención, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. La invención también proporciona un TCR de la invención para usar en un método de tratamiento del cáncer.
Los siguientes aspectos y realizaciones se limitan a la invención tal como se define en las reivindicaciones.
En las realizaciones, el TCR de acuerdo con la invención tiene la propiedad de unirse a GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1) en el complejo con HLA-A*0201 con una constante de disociación de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 50 pM cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial a 25 °C y a un pH de entre 7,1 y 7,5 utilizando una forma soluble del TCR, en donde el TCR comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR. En algunas realizaciones, la constante de disociación es superior a 50 microM, tal como 100 pM, 200 pM, 500 pM o más.
Por consiguiente, un TCR de acuerdo con la invención es capaz de unirse eficazmente a un HLA que muestre GVYDGEEHSV pero no a un HLA que muestre GVYDGREHTV.
El complejo de GVYDGEEHSV y HLA-A2 proporciona un marcador de cáncer al que pueden dirigirse los TCR de la invención. La presente invención proporciona dichos TCR útiles para el fin de administrar agentes efectores citotóxicos o inmunitarios a las células cancerosas y/o útiles para su uso en terapia adoptiva.
Los TCR se describen utilizando la nomenclatura de TCR de International Immunogenetics (IMGT) y enlaces a la base de datos pública de IMGT de secuencias de TCR. Los TCR heterodiméricos alfa-beta naturales tienen una cadena alfa y una cadena beta. En términos generales, cada cadena comprende las regiones variable, de unión y constante, y la cadena beta también suele contener una corta región de diversidad entre las regiones variable y de unión, pero esta región de diversidad a menudo se considera parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDR (regiones determinantes de la complementariedad) integradas en una secuencia marco, una es la región hipervariable denominada CDR3. Hay varios tipos de regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de la cadena beta (Vp) que se distinguen por su marco, las secuencias CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los tipos Va se denominan en la nomenclatura IMGT mediante un número TRAV único. Así, "TRAV21" define una región Va del TCR que tiene un marco único y secuencias CDR1 y CDR2, y una secuencia CDR3 que está definida en parte por una secuencia de aminoácidos que está conservada de un TCR a otro pero que también incluye una secuencia de aminoácidos que varía de un TCR a otro. De la misma manera, "TRBV5-1" define una región Vp del TCR que tiene un marco único y secuencias CDR1 y CDR2, pero con una única secuencia CDR3 parcialmente definida.
Las regiones de unión del TCR están definidas de manera similar por la nomenclatura única IMGT TRAJ y TRBJ, y las regiones constantes por la nomenclatura IMGT TRAC y TRBC.
La región de diversidad de la cadena beta se denomina en la nomenclatura IMGT con la abreviatura TRBD y, como se ha mencionado, las regiones TRBD/TRBJ concatenadas a menudo se consideran con conjunto como la región de unión.
Generalmente se considera que las cadenas a y p de los TCR ap tienen dos "dominios" cada una, a saber, los dominios variable y constante. El dominio variable consiste en una concatenación de la región variable y la región de unión. En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "dominio variable alfa del TCR" se refiere, por tanto, a la concatenación de regiones TRAV y TRAJ, y la expresión "dominio constante alfa del TCR" se refiere a la región TRAC extracelular, o a una secuencia TRAC truncada carboxiterminal. Asimismo, la expresión "dominio variable beta del TCR" se refiere a la concatenación de regiones TRBV y TRBD/TRBJ, y la expresión "dominio constante beta de TCR" se refiere a la región TRBC extracelular, o a una secuencia TRBC truncada carboxiterminal.
Las secuencias únicas definidas por la nomenclatura IMGT son ampliamente conocidas y accesibles para quienes trabajan en el campo de los TCR. Por ejemplo, se pueden encontrar en la base de datos pública IMGT. El "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc y LeFranc, Academic Press, El ISBN 0-12-441352-8, también divulga secuencias definidas por la nomenclatura IMGT, pero debido a su fecha de publicación y el consiguiente desfase temporal, a veces es necesario confirmar la información contenida en el mismo mediante referencia a la base de datos IMGT.
Un TCR de acuerdo con la invención comprende un dominio extracelular de cadena alfa como se muestra en la SEQ ID No: 3 (TRAV10+TRAC) y un dominio extracelular de cadena beta como se muestra en la SEQ ID No: 4 (TRBV24-1+TRBC-2). Las expresiones "TCR progenitor", "TCR MAGE-A4 progenitor", se utilizan como sinónimos en el presente documento para referirse a este TCR que comprende las cadenas alfa y beta extracelulares de las SEQ ID Nos: 3 y 4 respectivamente. Es deseable proporcionar TCR que estén mutados o modificados con respecto al TCR progenitor que tengan una mayor afinidad y/o una tasa de disociación más lenta por el complejo péptido-HLA que el TCR progenitor.
Con el fin de proporcionar un TCR de referencia con el que se pueda comparar el perfil de unión de dichos TCR mutados o modificados, es conveniente utilizar un TCR soluble de acuerdo con la invención que tenga la secuencia extracelular de la cadena alfa del TCR MAGE-A4 progenitor proporcionada en la SEQ ID No. 3 y la secuencia extracelular de la cadena beta del TCR MAGE-A4 progenitor proporcionada en la SEQ ID No: 4. Ese TCR se denomina en el presente documento "TCR de referencia" o "TCR MAGE-A4 de referencia". Cabe destacar que la SEQ ID No: 5 comprende la secuencia extracelular de la cadena alfa progenitora de la SEQ ID No: 3 y que la C l62 ha sido sustituida por una T162 (es decir, la T48 de TRAC). Asimismo, la SEQ ID No: 6 es la secuencia extracelular de la cadena beta progenitora de la SEQ ID No: 4 y que la C169 ha sido sustituida por una S169 (es decir, la S57 de TRBC2), la A187 ha sido sustituida por una C187 y el D201 ha sido sustituido por una N201. Estas sustituciones de cisteína con respecto a las secuencias extracelulares de las cadenas alfa y beta progenitoras permiten la formación de un puente de disulfuro intercatenario que estabiliza el TCR soluble replegado, es decir, el TCR formado por el replegamiento de las cadenas alfa y beta extracelulares. El uso del TCR soluble unido por disulfuro estable como TCR de referencia permite una evaluación más conveniente de la afinidad de unión y la semivida de unión. Los TCR de la invención pueden comprender las mutaciones descritas anteriormente.
Los TCR de la invención pueden ser de origen no natural y/o purificados y/o genotecnológicos. Los TCR de la invención pueden tener más de una mutación presente en el dominio variable de la cadena alfa y/o el dominio variable de la cadena beta con respecto al TCR progenitor. "TCR genotecnológico" y "TCR mutante" se usan como sinónimos en el presente documento y generalmente significan un TCR que tiene una o más mutaciones introducidas con respecto al TCR progenitor, en particular en el dominio variable de la cadena alfa y/o el dominio variable de la cadena beta del mismo. Estas mutaciones pueden mejorar la afinidad de unión por GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1) en el complejo con HLA-A*020101. En ciertas realizaciones, hay 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 mutaciones en el dominio variable de la cadena alfa, por ejemplo, 4 u 8 mutaciones, y/o 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones en el dominio variable de la cadena beta, por ejemplo, 5 mutaciones. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena a del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-105 de la SEQ ID No: 3. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena p del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-123 de la SEQ ID No: 4.
Un aspecto divulgado en el presente documento con fines ilustrativos proporciona un TCR en el que el dominio variable de la cadena alfa puede tener la siguiente mutación:
con referencia a la numeración que se muestra en la SEQ ID No: 3, y/o
el dominio variable de la cadena beta puede tener al menos una de las siguientes mutaciones:
con referencia a la numeración que se muestra en la SEQ ID No: 4.
El TCR de la invención puede comprender un dominio variable de la cadena alfa de una secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 1-105 de la SEQ ID No: 3 o 7
o una secuencia de aminoácidos en la que los restos de aminoácidos 1-27, 34-47 y 54-90 de la misma tienen al menos un 90 % o un 95 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-27, 34-47 y 54- 90, respectivamente, de las SEQ ID No: 3 o 5 o 7, y en la que los restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105 son los restos de aminoácidos 28-33, 48-53 y 91-105, respectivamente, de la SEQ ID No: 3 o 5 o 7.
El TCR comprende el dominio variable de la cadena alfa de una secuencia en la que:
(i) los restos de aminoácidos 1-27 de la misma tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-27 de la SEQ ID No: 3 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 28-33 son VSPFSN
(iii) los restos de aminoácidos 34-47 de la misma tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 34-47 de la SEQ ID NO: 3 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 48-53 pueden ser LTIMTF o LTRMTF
(v) los restos de aminoácidos 54-90 de la misma tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 54-90 de la SEQ ID No: 3 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a la secuencia de (a); y
(vi) los restos de aminoácidos 91-105 pueden ser CWSGGTDSWGKLQF
El TCR de la invención puede comprender un dominio variable de la cadena beta de una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID No: 4 u 8-10
o una secuencia de aminoácidos en la que los restos de aminoácidos 1-45, 51-67, 73-109 de la misma tienen al menos un 90 % o un 95 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-45, 51-67, 73-109, respectivamente, de las SEQ ID No: 4 u 8-10, y en la que los restos de aminoácidos 46-50, 68-72 y 110-123 tienen al menos un 90 % o un 95 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 46-50, 68-72 y 110-123, respectivamente, de las SEQ ID No: 4 u 8-10.
El TCR comprende el dominio variable de la cadena beta de una secuencia en la que:
(i) los restos de aminoácidos 1-45 de la misma tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de los restos 1-45 de la SEQ ID No: 4 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 46-50 pueden ser KGHDR o KGRDR
(iii) los restos de aminoácidos 51-67 de la misma tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 51-67 de la SEQ ID NO: 4 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 68-72 pueden ser SVFDK;
(v) los restos de aminoácidos 73-109 de la misma pueden tener (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 73-109 de la<s>E<q>ID NO: 4 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); y
(vi) los restos de aminoácidos 110-123 son CATSGQGAYREQFF o CATSGQGAYKEQFF o CATSGQGAYNEQFF.
Un TCR de la invención puede tener una de las siguientes combinaciones de dominios variables de cadena alfa y beta:
Dentro del alcance de la invención se encuentran variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier TCR de la invención divulgado en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, se entiende que la expresión "variantes fenotípicamente silenciosas" se refiere a un TCR que incorpora uno o más cambios de aminoácidos adicionales además de los establecidos anteriormente, TCR que tiene un fenotipo similar al TCR correspondiente sin dichos cambios. Para los fines de esta solicitud, el fenotipo del TCR comprende especificidad de unión al antígeno (K<d>y/o semivida de unión) y especificidad del antígeno. Una variante fenotípicamente silenciosa puede tener una K<d>y/o una semivida de unión para el complejo de GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1) y HLA-A*0201 dentro del 10 % de la K<d>y/o la semivida de unión medidas del TCR correspondiente sin dichos cambios, cuando se miden en condiciones idénticas (por ejemplo, a 25 °C y en el mismo chip de RPS). Las condiciones adecuadas se definen con más detalle en el Ejemplo 3. La especificidad del antígeno se define con más detalle a continuación. Como es conocido por los expertos en la materia, puede ser posible producir TCR que incorporen cambios en los dominios constantes y/o variables de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad por la interacción con el complejo de HLA-A*0201 y GVYDGEEHSV (SEQ ID n°: 1). En particular, dichas mutaciones silenciosas pueden incorporarse dentro de partes de la secuencia que se sabe que no están directamente involucradas en la unión al antígeno (por ejemplo, fuera de las CDR). Estas variantes triviales están incluidas en el alcance de esta invención. También forman parte de esta invención aquellos TCR en los que se han realizado una o más sustituciones conservadoras.
Las mutaciones pueden llevarse a cabo utilizando cualquier método apropiado que incluye, pero sin limitación, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), procedimientos de clonación basados en enzimas de restricción o de clonación independiente de ligación (LIC). Estos métodos se detallan en muchos de los textos de biología molecular habituales. Para obtener más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.) CSHL Press. Se puede encontrar más información sobre los procedimientos de clonación independiente de ligadura (LIC) en Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30-6.
Los TCR de la invención tienen la propiedad de unirse al péptido MAGE-B2, el complejo de GVYDGEEHSV (SEQ ID n°: 1) y HLA-A2. Se ha descubierto que los TCR de la invención son muy específicos para esos epítopos del MAGE en relación con otros epítopos irrelevantes, por lo que son especialmente adecuados como vectores de direccionamiento para la administración de agentes terapéuticos o marcadores detectables a células y tejidos que presenten esos epítopos. La especificidad en el contexto de los TCR de la invención se refiere a su capacidad para reconocer las células objetivo h LA-A*0201 que son positivas para el péptido GVYDGEEHSV, mientras que tienen una capacidad mínima para reconocer células objetivo HLA-A*0201 que son negativas para el péptido, o células HLA que muestran el péptido GVYDGREHTV del MAGE A4. Para probar la especificidad, los<t>C<r>pueden estar en forma soluble y/o pueden expresarse en la superficie de los linfocitos T. El reconocimiento puede determinarse midiendo el nivel de activación de los linfocitos T en presencia de un TCR y células objetivo. En este caso, el reconocimiento mínimo de péptido negativo o de células objetivo MAGE A4 se define como un nivel de activación de los linfocitos T inferior al 10 %, preferentemente inferior al 5 % y aún más preferentemente inferior al 1 %, del nivel producido en presencia de las células objetivo positivas para el péptido, cuando se miden en las mismas condiciones. Para los TCR solubles de la invención, la especificidad puede determinarse a una concentración de TCR terapéuticamente relevante. Una concentración terapéuticamente relevante puede definirse como una concentración de TCR de 10-9 M o inferior, y/o una concentración de hasta 100, preferentemente hasta 1000, veces mayor que el valor de la CE50 correspondiente. Las células positivas para el péptido pueden obtenerse mediante pulsación de péptidos o, más preferentemente, pueden presentar de forma natural dicho péptido. Preferentemente, tanto las células positivas para el péptido como las células negativas para el péptido son células humanas.
Se ha descubierto que ciertos TCR de la invención son muy adecuados para usar en terapia adoptiva. Dichos TCR pueden tener una K<d>para el complejo de menos de 200 |jM, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 |jM a aproximadamente 20 j M o aproximadamente 100 j M, y/o tener una semivida de unión (T1^ ) para el complejo en el intervalo de aproximadamente 0,5 segundos a aproximadamente 12 minutos. En algunas realizaciones, los TCR de la invención pueden tener una K<d>para el complejo de aproximadamente 0,05 j M a aproximadamente 20 j M, de aproximadamente 0,1 j M a aproximadamente 5 j M o de aproximadamente 0,1 j M a aproximadamente 2 j M. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, parece haber una ventana óptima de afinidad para los TCR con uso terapéutico en la terapia celular adoptiva. Los TCR de origen natural que reconocen epítopos de antígenos tumorales generalmente tienen una afinidad demasiado baja (de 20 microM a 50 microM), y los TCR con una afinidad muy alta (en el intervalo nanomolar o superior) presentan problemas de reactividad cruzada (Robbins et al (2008) J. Immunol.
1806116-6131; Zhao et al (2007) J. Immunol. 1795845-5854; Scmid et al (2010) J. Immunol 184, 4936-4946).
Los TCR de la invención pueden ser heterodímeros ap o pueden estar en formato de cadena única. Los formatos de cadena única incluyen polipéptidos ap de TCR de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp o Va-L-Vp-Cp, en donde Va y Vp son las regiones variables a y p del TCR, respectivamente, Ca y Cp son las regiones constantes a y p del TCR, respectivamente, y L es una secuencia conectora. Para usar como agente de direccionamiento para la administración de agentes terapéuticos a la célula presentadora del antígeno, el TCR puede estar en forma soluble (es decir, sin dominios transmembranarios ni citoplásmicos). Para la estabilidad, los TCR heterodiméricos ap solubles tienen preferentemente un puente de disulfuro introducido entre los restos de los respectivos dominios constantes, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Uno o ambos de los dominios constantes presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en el extremo carboxílico o en los extremos carboxílicos, por ejemplo, en hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. Para usar en terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap puede, por ejemplo, transfectarse como cadenas completas que tengan dominios tanto citoplásmicos como transmembranarios. Los TCR para usar en terapia adoptiva pueden contener un puente de disulfuro correspondiente al que se encuentra en la naturaleza entre los respectivos dominios constantes alfa y beta, adicional o alternativamente puede estar presente un puente de disulfuro no natural.
Como será obvio para los expertos en la materia, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el extremo carboxílico y/o en el extremo amínico de los mismos, en 1, 2, 3, 4, 5 o más restos, sin que se alteren sustancialmente las características de unión del TCR. Todas estas variantes triviales están abarcadas por la presente invención.
Los TCR heterodiméricos alfa-beta de la invención normalmente comprenden una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta. Las secuencias de los dominios constantes de las cadenas alfa y beta pueden modificarse mediante truncamiento o sustitución para eliminar el puente de disulfuro natural entre la Cys4 del exón 2 de TRAC y la Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. Las secuencias de los dominios constantes de las cadenas alfa y beta también pueden modificarse mediante la sustitución de restos de cisteína por la Thr 48 de TRAC y la Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un puente de disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
Algunos TCR de la invención tienen una afinidad de unión y/o una semivida de unión por el complejo de GVYDGEEHSV-HLA-A2 sustancialmente mayor que la del TCR de MAGE-B2 de referencia, El aumento de la afinidad de unión de un TCR natural a menudo reduce la especificidad del TCR por su ligando péptido-MHC, y esto se demuestra en Zhao Yangbinget al.,The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, Estados Unidos, vol. 179, n.° 9, 1 de noviembre de 2007, 5845-5854. Sin embargo, los TCR de la invención que derivan del TCR progenitor siguen siendo específicos para el complejo de GVYDGEEHSV-HLA-A2, a pesar de tener una afinidad de unión sustancialmente mayor que el TCR progenitor. Además, son significativamente más selectivos (por ejemplo, al menos diez veces) por el MAGE-B2 que por el MAGE-A4 que el TCR progenitor.
La afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio K<d>) y la semivida de unión (expresada como T1^ ) se pueden determinar mediante el método de resonancia de plasmón superficial (BIAcore) del Ejemplo 3 del presente documento. Las mediciones pueden realizarse a 25 °C y a un pH de entre 7,1 y 7,5 utilizando una versión soluble del TCR. Se apreciará que la duplicación de la afinidad de un TCR da como resultado una reducción a la mitad de la K<d>. La T1^ se calcula como el In2 dividido por la tasa de disociación (koff). Por tanto, la duplicación de T1^ da como resultado una reducción a la mitad de la koff. Los valores de la K<d>y la koff del TCR generalmente se miden para las formas solubles de TCR, es decir, aquellas formas que se truncan para eliminar restos hidrófobos del dominio transmembranario. Por lo tanto, debe entenderse que un TCR dado cumple el requisito de tener una afinidad de unión y/o una semivida de unión por el complejo de GVYDGREHTV-HLA-A2 si una forma soluble de ese TCR cumple ese requisito. Preferentemente, la afinidad de unión o la semivida de unión de un TCR dado se mide varias veces, por ejemplo, 3 o más veces, utilizando el mismo protocolo de ensayo, y se toma un promedio de los resultados. El TCR de referencia tiene una K<d>de aproximadamente 17 pM medida con ese método, y la T1^ es de aproximadamente 1,6 S
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un TCR de la invención. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADNc. En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena a de un TCR de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena p de un TCR de la invención. El ácido nucleico puede ser de origen no natural y/o purificado y/o genotecnológico.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la invención. Preferentemente, el vector es un vector de expresión del TCR.
La invención también proporciona una célula que porta un vector de la invención, preferentemente un vector de expresión del TCR. El vector puede comprender un ácido nucleico de la invención que codifica en un único marco abierto de lectura, o dos marcos abiertos de lectura distintos, la cadena alfa y la cadena beta, respectivamente. Otro aspecto proporciona una célula que porta un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. Dichas células son particularmente útiles en la terapia adoptiva. Las células de la invención pueden estar aisladas y/o ser recombinantes y/o de origen no natural y/o genotecnológicas.
Dado que los TCR de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula no natural y/o purificada y/o genotecnológica, especialmente un linfocito T, que presenta un TCR de la invención. La invención también proporciona una población ampliada de linfocitos T que presentan un TCR de la invención. Hay varios métodos adecuados para la transfección de linfocitos T con un ácido nucleico (tal como ADN, ADNc o ARN) que codifica los TCR de la invención (véase, por ejemplo, Robbinset al.,(2008) J Immunol. 180: 6116-6131). Los linfocitos T que expresan los TCR de la invención serán adecuados para usar en el tratamiento del cáncer basado en una terapia adoptiva. Como será conocido por los expertos en la materia, existen varios métodos adecuados mediante los cuales se puede llevar a cabo la terapia adoptiva (véase, por ejemplo, Rosenberget al.,(2008) Nat Rev Cancer 8 (4): 299 308).
Los TCR solubles de la invención son útiles para administrar marcadores detectables o agentes terapéuticos a las células presentadoras del antígeno y a los tejidos que contienen las células presentadoras del antígeno. Por lo tanto, pueden estar asociados (covalentemente o de otro modo) con un marcador detectable (con fines de diagnóstico en donde el TCR se utiliza para detectar la presencia de células que presentan el complejo de GVYDGEEHSV-HLA-A2); un agente terapéutico; o un resto modificador de la PK (por ejemplo mediante PEGilación).
Algunos marcadores detectables con fines de diagnóstico incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.
Algunos agentes terapéuticos que pueden asociarse con los TCR de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radiactivos, enzimas (por ejemplo, perforina) o antineoplásicos (por ejemplo, cisplatino). Para garantizar que los efectos tóxicos se ejercen en la ubicación deseada, la toxina podría estar dentro de un liposoma unida al TCR, de forma que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará los efectos dañinos durante el transporte en el cuerpo y garantizará que la toxina tenga un efecto máximo después de la unión del TCR a las células presentadoras del antígeno pertinentes.
Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:
• agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con la capacidad de destruir células de mamífero que tengan un peso molecular de menos de 700 daltons. Dichos compuestos también podrían contener metales tóxicos que tienen la capacidad de tener un efecto citotóxico. Asimismo, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Algunos ejemplos de dichos agentes incluyen cisplatino, derivados de maitansina, rachelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, sorfímero de sodio Photofrin II, temozolomida, topotecán, glucuronato de trimetreato, auristatina E, vincristina y doxorubicina;
• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con la capacidad de destruir células de mamífero. Por ejemplo, ricina, toxina diftérica, exotoxina A bacteriana dePseudomonas,DNasa y RNasa;
• radionúclidos, es decir, isótopos inestables de elementos que se desintegran con la emisión concomitante de una o más de partículas a o p, o rayos y. Por ejemplo, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213; se pueden usar agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos a los TCR de alta afinidad, o multímeros de los mismos;
• inmunoestimulantes, es decir, moléculas efectoras inmunitarias que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citocinas tales como IL-2 e IFN-<y>,
• Superantígenos y mutantes de los mismos;
• Fusiones TCR-HLA;
• quimiocinas tales como IL-8, factor plaquetario 4, proteína estimulante del crecimiento del melanoma, etc.;
• anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos determinantes anti-linfocitos T o linfocitos T citotóxicos (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16);
• estructuras de soporte proteicas alternativas con características de unión similares a las de los anticuerpos • activadores del complemento;
• xenodominios proteicos, alodominios proteicos, dominios de proteínas víricas/bacterianas, péptidos víricos/bacterianos.
Una realización preferida la proporciona un TCR de la invención asociado (normalmente mediante fusión a un extremo amínico o carboxílico de la cadena alfa o beta) con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento funcional o una variante de dicho anticuerpo anti-CD3. Los fragmentos de anticuerpos y las variantes/análogos que son adecuados para usar en las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fvbc y Fvmc, Nanocuerpos™ (estas construcciones son comercializadas por Ablynx (Bélgica), comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina único sintético derivado de un anticuerpo de camélido (por ejemplo, camello o llama) y anticuerpos de dominio (Domantis (Bélgica), que comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina único madurado por afinidad o un dominio ligero variable de inmunoglobulina) o estructuras de soporte de proteínas alternativas que presentan características de unión similares a anticuerpos, tales como Affibodies (Affibody (Suecia), que comprenden una estructura de soporte de proteína A genotecnológica) o Anticalins (Pieris (alemán), que comprenden anticalinas genotecnológicas), por nombrar solo algunos.
Para algunos fines, los TCR de la invención se pueden agregar en un complejo que comprende varios TCR para formar un complejo de TCR multivalente. Hay varias proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que puede usarse en la producción de complejos de TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53 que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpo Fvmc que mostraron una mayor persistencia en suero y una constante de disociación significativamente reducida, en comparación con el fragmento monomérico de FVmc. (Willudaet al.(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que podría utilizarse potencialmente para este tipo de aplicación. Un complejo de TCR multivalente de la invención puede tener una capacidad de unión potenciada para el complejo de GVYDGREHTV y HLA-A2, en comparación con un heterodímero no multimérico natural o un receptor de linfocitos T de la invención. Por lo tanto, también se incluyen dentro de la invención complejos multivalentes de los TCR de la invención. Dichos complejos de TCR multivalentes de acuerdo con la invención son particularmente útiles para el rastreo o el direccionamiento a células que presentan antígenosin vitrooin vivoparticulares, y también son útiles como intermedios para la producción de complejos de TCR multivalentes adicionales que tengan dichos usos.
Como es bien conocido en la técnica, los TCR pueden estar sujetos a modificaciones postraduccionales. La glicosilación es una de dichas modificaciones, que comprende la unión covalente de restos de oligosacáridos a aminoácidos definidos en la cadena de TCR. Por ejemplo, los restos de asparagina o los restos de serina/treonina son ubicaciones bien conocidas para la unión de oligosacáridos. El estado de glicosilación de una proteína particular depende de varios factores, que incluyen la secuencia de proteínas, la conformación de proteínas y la disponibilidad de ciertas enzimas. Asimismo, el estado de glicosilación (es decir, tipo de oligosacárido, enlace covalente y número total de uniones) puede influir en la función de la proteína. Por tanto, al producir proteínas recombinantes, a menudo es deseable controlar la glicosilación. La glicosilación controlada se ha utilizado para mejorar las terapias basadas en anticuerpos. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. marzo de 2009;8 (3): 226-34.). Para los TCR solubles de la invención, la glicosilación puede controlarsein vivo,mediante el uso de estirpes celulares particulares, por ejemplo, oin vitro,mediante una modificación química. Dichas modificaciones son deseables, dado que la glicosilación puede mejorar la farmacocinética, reducir la inmunogenicidad e imitar más estrechamente una proteína humana natural (Sinclair AM y Elliott S., Pharm Sci., agosto de 2005; 94 (8): 1626-35).
Para la administración a pacientes, los TCR, los ácidos nucleicos y/o las células de la invención (generalmente asociados con un marcador detectable o agente terapéutico), pueden proporcionarse en una composición farmacéutica junto con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los TCR terapéuticos o de imagen de acuerdo con la invención normalmente se suministrarán como parte de un envase estéril, una composición farmacéutica que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del método deseado de administración a un paciente). Se puede proporcionar en una forma farmacéutica unitaria, generalmente se proporcionará en un recipiente sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Dicho kit normalmente incluiría (aunque no necesariamente) las instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas farmacéuticas unitarias.
La composición farmacéutica puede adaptarse para su administración por cualquier vía apropiada, preferentemente por vía parenteral (incluida subcutánea, intramuscular o, preferentemente, intravenosa). Dichas composiciones pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de la Farmacia, por ejemplo, mezclando el principio activo con el portador o portadores, o el excipiente o excipientes, en condiciones estériles.
Las pautas posológicas de las sustancias de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o el trastorno que se va a tratar, la edad y el estado del individuo que se va a tratar, etc., y un médico determinará en última instancia las pautas posológicas apropiadas que se van a utilizar.
Los TCR, las composiciones farmacéuticas, los vectores, los ácidos nucleicos y las células de la invención pueden proporcionarse en una forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % pura.
También son proporcionados por la invención:
• Un TCR, un ácido nucleico o una célula de la invención para usar en medicina, preferentemente para usar en un método de tratamiento del cáncer, tal como tumores sólidos (por ejemplo, metástasis pulmonares, hepáticas y gástricas) y/o carcinomas epidermoides.
• el uso de un TCR, un ácido nucleico o una célula de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectosmutatis mutandis.
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.
Se hace referencia a las secuencias adjuntas, en las que:
la SEQ ID No. 1 es el péptido MAGE B2
la SEQ ID No. 2 es el péptido MAGE A4
la SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena alfa de un TCR específico de MAGE-A4 progenitor, y la SEQ ID No: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena beta de la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de un TCR específico de MAGE-A4 progenitor.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena alfa de un TCR Lenti natural (denominado en el presente documento "TCR de referencia"). La secuencia es la misma que la del TCR progenitor excepto porque se sustituye la T162 por una cisteína (es decir, la T48 de la región constante TRAC). la SEQ ID NO: 6 es la cadena beta de un TCR Lenti natural (denominado en el presente documento "TCR de referencia"). La secuencia es la misma que la del TCR progenitor excepto porque se sustituye una cisteína por una S169 (es decir, la S57 de la región constante TRBC2) y la A187 se sustituye por la C187 y el D201 se sustituye por la N201.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de cadenas alfa que pueden estar presentes en los TCR de la invención. Las subsecuencias que forman las regiones CDR, o partes sustanciales de las regiones CDR, están subrayadas.
Las SEQ ID NO: 8, 9 y 10 muestran la secuencia de la cadena beta que puede estar presente en los TCR de la invención. Las subsecuencias que forman las regiones CDR, o partes sustanciales de las regiones CDR, están subrayadas.
Las SEQ ID Nos 11-16 muestran las secuencias de los TCR que no podrían mejorarse mediante selección y mutación de acuerdo con la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: clonación de las secuencias de la región variable de la cadena alfa y beta del TCR MAGE-A4 de referencia en plásmidos de expresión basados en pGMT7
Los dominios alfa variables del TCR MAGE-A4 progenitor y los dominios beta variables del TCR de las SEQ ID NOS: 3 y 4, respectivamente, se clonaron en plásmidos de expresión basados en pGMT7 que contenían Ca o Cp mediante métodos convencionales descritos en Molecular Cloning a Laboratory Manual, tercera edición, de Sambrook y Russell. Los plásmidos se secuenciaron utilizando un analizador de ADN Applied Biosystems 3730xl. Los dominios alfa variables del TCR MAGE-A4 de referencia y beta variables del TCR de la SEQ ID NOS: 3 y 4, respectivamente, se clonaron de la misma manera.
La secuencia de ADN que codifica la región variable de la cadena alfa del TCR se ligó en pEX956, que se cortó con enzimas de restricción. La secuencia de ADN que codifica la región variable de la cadena beta del TCR se ligó en pEXb21, que también se cortó con enzimas de restricción.
Los plásmidos ligados se transformaron en células competentes deE. colicepa XL1-blue, y se sembraron en placas de LB/agar que contenían 100 pg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, se recogieron colonias individuales y se cultivaron en 5 ml de LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina durante una noche a 37 °C con agitación. Los plásmidos clonados se purificaron utilizando un kit Miniprep (Qiagen), y los plásmidos se secuenciaron utilizando un analizador de ADN Applied Biosystems 3730xl.
Ejemplo 2: expresión, replegamiento y purificación del TCR MAGE-A4 soluble de referencia
Los plásmidos de expresión que contienen la cadena a y la cadena p del TCR de referencia, respectivamente, preparados en el Ejemplo 1, se transformaron por separado en la cepa deE. coliBL21pLysS, y se cultivaron colonias individuales resistentes a la ampicilina a 37 °C en medio TYP (100 |jg/ml de ampicilina) hasta una DO600 de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de proteínas con IPTG 0,5 mM. Las células se recogieron tres horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se lisaron con 25 ml de Bug Buster (NovaGen) en presencia de MgCh y DNasel. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. A continuación se realizaron tres lavados con detergente para eliminar los restos celulares y los componentes de las membranas. En cada ocasión, el sedimento de cuerpos de inclusión se homogeneizó en un tampón Triton (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, 0,5 % de Triton-X100, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM) antes de ser sedimentado por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en una Beckman J2-21. A continuación, se eliminaron el detergente y la sal mediante un lavado similar con el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70 °C. El rendimiento proteico de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y se realizó una medición de la DO con un espectrofotómetro Hitachi U-2001. A continuación se calculó la concentración proteica utilizando el coeficiente de extinción.
Se descongelaron aproximadamente 15 mg de cadena a del TCR y 15 mg de cuerpos de inclusión solubilizados de cadena p del TCR a partir de soluciones madre congeladas, y se diluyeron en 10 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM), para asegurar la desnaturalización completa de las cadenas. La solución de guanidina que contiene las cadenas de TCR completamente reducidas y desnaturalizadas se inyectó a continuación en 0,5 litros del siguiente tampón de replegamiento: Tris 100 mM a pH 8,1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a unas concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM, respectivamente, se añadió aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas del TCR desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum; n.° de producto 132670) contra 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió dos veces a Tris 10 mM recién preparado, a pH 8,1 (10 l) y la diálisis se continuó a 5 °C ± 3 °C durante otras ~8 horas. El TCR soluble se separó de los productos de degradación y las impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl de 0-500 mM en Tris 10 mM a pH 8,1 con 50 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta (GE Healthcare). Las fracciones del pico se combinaron y se añadió un cóctel de inhibidores de proteasas (Calbiochem). Las fracciones agrupadas se almacenaron a continuación a 4 °C y se analizaron mediante una SDS-PAGE con tinción de Coomassie antes de agruparlas y concentrarlas. Finalmente, el TCR soluble se purificó y caracterizó utilizando una columna de filtración en gel GE Healthcare Superdex 75HR preequilibrada con tampón de PBS (Sigma). El pico que eluyó a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se agrupó y se concentró antes de la caracterización mediante un análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.
Ejemplo 3: caracterización de la unión
Análisis BIAcore
Puede utilizarse un biosensor de resonancia de plasmón superficial (Biacore 3000™) para analizar la unión de un TCR a su ligando de péptido-MHC. Esto se facilita mediante la producción de complejos solubles de péptido biotinilado-HLA ("pHLA") que pueden inmovilizarse en una superficie de unión recubierta de estreptavidina (chip sensor). Los chips sensores comprenden cuatro celdas de flujo individuales que permiten la medición simultánea de la unión del receptor de linfocitos T a cuatro complejos pHLA diferentes. La inyección manual del complejo de pHLA permite manipular fácilmente el nivel preciso de moléculas de clase I inmovilizadas.
Las moléculas de HLA-A*0201 de clase I biotiniladas se replegaronin vitroa partir de cuerpos de inclusión expresados en bacterias que contenían las proteínas de la subunidad constituyente y el péptido sintético, seguido de una purificación y una biotinilación enzimáticain vitro(O'Callaghanet al.(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). La cadena pesada de HLA-A*0201 se expresó con un marcador de biotinilación carboxiterminal que reemplaza los dominios transmembranario y citoplásmico de la proteína, en una construcción apropiada. Se obtuvieron unos niveles de expresión de cuerpos de inclusión de ~75 mg/litro de cultivo bacteriano. La cadena ligera del MHC, o microglobulina p2, también se expresó como cuerpos de inclusión enE. colia partir de una construcción apropiada, a un nivel de ~500 mg/litro de cultivo bacteriano.
Las células deE. colise lisaron y los cuerpos de inclusión se purificaron hasta aproximadamente un 80 % de pureza. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizó con guanidina-HCl 6 M, Tris 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM, y se replegó a una concentración de 30 mg/litro de cadena pesada, 30 mg/litro de p2m en L-arginina 0,4 M, Tris 100 mM a pH 8,1, diclorhidrato de cistamina 3,7 mM, clorhidrato de cisteamina 6,6 mM, 4 mg/l del péptido GVYDGREHTV de MAGE-A4 o GVYDGEEHSV de MAGE-B2 que debe ser cargado por la molécula HLAA*02, mediante la adición de un único pulso de proteína desnaturalizada en un tampón de replegamiento a <5 °C. Se permitió que el replegamiento finalizara a 4 °C durante al menos 1 hora.
El tampón se cambió por diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM a pH 8,1. Fueron necesarios dos cambios de tampón para reducir suficientemente la fuerza iónica de la solución. La solución de proteína se filtró a continuación a través de un filtro de acetato de celulosa de 1,5 pm y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (8 ml de volumen de lecho). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 500 mM en Tris 10 mM a pH 8,1, utilizando un purificador Akta (GE Healthcare). El complejo de HLA-A*0201-péptido se eluyó a aproximadamente NaCl 250 mM y se recogieron las fracciones de pico, se añadió un cóctel de inhibidores de proteasas (Calbiochem) y las fracciones se enfriaron en hielo.
Se les cambió el tampón a las moléculas de pHLA etiquetadas con biotina por tampón Tris 10 mM a pH 8,1, NaCl 5 mM, utilizando una columna de desalación rápida de Pharmacia equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la elución, las fracciones que contenían proteína se enfriaron en hielo y se añadió cóctel inhibidor de proteasas (Calbiochem). A continuación, se añadieron los reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado a pH 8), MgCb 7,5 mM y 5 pg/ml de enzima BirA (purificada de acuerdo con O'Callaghanet al.(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). A continuación, la mezcla de reacción se dejó incubar a la temperatura ambiente durante una noche.
Las moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas se purificaron mediante una cromatografía de filtración en gel. La columna AGE Healthcare Superdex 75 HR 10/30 se preequilibró con PBS filtrado y se cargó 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación, y la columna se eluyó con PBS a 0,5 ml/min utilizando un purificador Akta (GE Healthcare). Las moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas eluyeron como un único pico a aproximadamente 15 ml. Las fracciones que contenían proteína se agruparon, se enfriaron en hielo y se añadió cóctel inhibidor de proteasas. La concentración de proteína se determinó utilizando un ensayo de unión de Coomassie (PerBio) y se almacenaron congeladas a -20 °C alícuotas de moléculas de pHLA-A*01 biotiniladas.
Dichos complejos inmovilizados tienen la capacidad de unirse tanto a los receptores de linfocitos T como al correceptor CD8aa, los cuales pueden inyectarse en la fase soluble. Se observa que las propiedades de unión al pHLA de los TCR solubles son cualitativa y cuantitativamente similares si el TCR se usa en la fase soluble o inmovilizado. Este es un control importante para la actividad parcial de las especies solubles, y también sugiere que los complejos de pHLA biotinilados son biológicamente tan activos como los complejos no biotinilados.
El biosensor BIAcore 3000™ de resonancia de plasmón superficial (RPS) mide los cambios en el índice de refracción expresado en unidades de respuesta (UR) cerca de la superficie del sensor dentro de una pequeña celda de flujo, un principio que puede utilizarse para detectar las interacciones entre el ligando y el receptor, y para analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Los experimentos BIAcore se realizaron a una temperatura de 25 °C, utilizando tampón PBS (Sigma, pH 7,1-7,5) como tampón de ejecución y en la preparación de diluciones de muestras de proteínas. La estreptavidina se inmovilizó en las celdas de flujo mediante métodos convencionales de acoplamiento de aminas. Los complejos pHLA se inmovilizaron a través de la etiqueta de biotina. A continuación, el ensayo se realizó pasando el TCR soluble sobre las superficies de las distintas celdas de flujo a un caudal constante, midiendo la respuesta de RPS al hacerlo.
Constante de unión en equilibrio
Se utilizaron los anteriores métodos de análisis BIAcore para determinar las constantes de unión en equilibrio. Se prepararon diluciones en serie de la forma heterodímera soluble unida por puentes disulfuro del TCR de MAGE-A4 de referencia, y se inyectaron a un caudal constante de 5 pl min-' en dos celdas de flujo diferentes; una recubierta con ~1000 UR del complejo específico de HLA-A*0201 y GVYDGREHTV, y la segunda recubierta con ~1000 UR de complejo no específico. La respuesta se normalizó para cada concentración utilizando la medición de la celda de control. Los datos normalizados de la respuesta se representaron frente a la concentración de la muestra de TCR y se ajustaron a un modelo de ajuste a una curva no lineal para calcular la constante de unión en equilibrio, K<d>. (Price 6 Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2a Edición) 1979, Clarendon Press, Oxford). La forma soluble unida por disulfuro del TCR de MAGE-A4 de referencia (Ejemplo 2) mostró una K<d>de aproximadamente 2,00 pM. Según los mismos datos de BIAcore, la T ^ fue de aproximadamente 0,95 s.
Parámetros cinéticos
Los anteriores métodos de análisis BIAcore también se utilizaron para determinar las constantes de unión y de disociación en equilibrio.
Para los TCR de alta afinidad (véase el siguiente Ejemplo 4), la K<d>se determinó midiendo experimentalmente la tasa de la constante de disociación, la koff y la tasa de la constante de asociación, kon. La constante en equilibrio K<d>se calculó como koff/kon.
El TCR se inyectó en dos células diferentes, una recubierta con ~1000 UR de complejo específico de GVYDGREHTV y HLA-A*0201,
y la segunda recubierta con ~1000 UR de complejo no específico. El caudal se fijó a 50 pl/min. Normalmente, se inyectaron 250 pl de TCR a ~1 pM. A continuación se hizo fluir el tampón hasta que la respuesta volvió al valor inicial o cuando transcurrieron >2 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el programa informático BIAevaluation. La fase de disociación se ajustó a una única ecuación de descenso exponencial, lo que permite el cálculo de la semivida.
Ejemplo 4: preparación de los TCR de alta afinidad de la invención
Los plásmidos de expresión que contienen la cadena a y la cadena p del TCR, respectivamente, se prepararon como en el Ejemplo 1:
Los plásmidos se transformaron por separado en la cepaE. coliBL21pLysS y colonias individuales resistentes a la ampicilina cultivadas a 37 °C en medio TYP (100 pg/ml de ampicilina) hasta una DO600 de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de proteínas con IPTG 0,5 mM. Las células se recogieron tres horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se lisaron con 25 ml de Bug Buster (Novagen) en presencia de MgCb y DNasel. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. A continuación se realizaron tres lavados con detergente para eliminar los restos celulares y los componentes de las membranas. En cada ocasión, el sedimento de cuerpos de inclusión se homogeneizó en un tampón Triton (Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, Triton-X100 al 0,5 %, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM), antes de sedimentarlos por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en una Beckman J2-21. A continuación, se eliminaron el detergente y la sal mediante un lavado similar con el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70 °C. El rendimiento proteico de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y se realizó una medición de la DO con un espectrofotómetro Hitachi U-2001. A continuación se calculó la concentración proteica utilizando el coeficiente de extinción.
Se diluyeron aproximadamente 10 mg de cadena a de TCR y 10 mg de cuerpos de inclusión solubilizados de cadena p de TCR para cada TCR de la invención en 10 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM), para asegurar la desnaturalización completa de las cadenas. La solución de guanidina que contiene las cadenas de TCR completamente reducidas y desnaturalizadas se inyectó a continuación en 0,5 litros del siguiente tampón de replegamiento: T ris 100 mM a pH 8,1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a unas concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM, respectivamente, se agregó aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de TCR desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum; n.° de producto 132670) contra 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió dos veces a Tris 10 mM recién preparado, a pH 8,1 (10 l) y la diálisis se continuó a 5 °C ± 3 °C durante otras ~8 horas.
El TCR soluble se separó de los productos de degradación y las impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl de 0 500 mM en Tris 10 mM a pH 8,1 con 15 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta (GE Healthcare). Las fracciones agrupadas se almacenaron a continuación a 4 °C y se analizaron mediante una SDS-PAGE con tinción de Coomassie antes de agruparlas y concentrarlas. Finalmente, los TCR solubles se purificaron y caracterizaron utilizando una columna de filtración en gel GE Healthcare Superdex 75HR preequilibrada con tampón PBS (Sigma). El pico que eluyó a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se agrupó y se concentró antes de la caracterización mediante un análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.
Los perfiles de afinidad de los TCR así preparados para el epítopo MAGE-A4 o el epítopo MAGE-B2 se evaluaron utilizando el método del Ejemplo 3 y se compararon con el TCR de referencia. Los resultados se exponen en la siguiente tabla:
continuación
También se hicieron intentos para preparar TCR de alta afinidad basados en combinaciones de las SEQ ID Nos 11/12, 13/14, 15/16.
En el caso del TCR A, que combina la cadena alfa de la SEQ ID No. 11 y la cadena beta de la SEQ ID No. 12, se observó reactividad cruzada entre MAGE-A1, MAGE-A10 y PRAME. No fue posible eliminar esta reactividad cruzada mediante mutación y selección.
El TCR B combina la cadena alfa de la SEQ ID No. 12 y la cadena beta de la SEQ ID No. 14. El TCR B no se pudo plegar para formar un TCR soluble, por lo que no fue posible una caracterización de la unión.
El TCR C combina la cadena alfa de la SEQ ID NO 15 y la cadena beta de la SEQ ID NO 16. Este TCR era soluble cuando se expresaba y podía unirse al antígeno. Sin embargo, cuando se expresaba en linfocitos T, el TCR C no mostró actividad.
Ejemplo 5: transfección de linfocitos T con TCR MAGE-A4 progenitores y variantes
(a) Preparación de vectores lentivíricos mediante transfección temporal mediada por Express-In de células 293T
Se utilizó un sistema de empaquetado lentivírico de tercera generación para empaquetar vectores lentivíricos que contenían el gen que codifica el TCR deseado. Se transfectaron células 293T con 4 plásmidos (un vector lentivírico que contiene el gen ORF único de la cadena alfa del TCR-P2A-cadena beta del TCR descrito en el Ejemplo 5c (a continuación), y 3 plásmidos que contienen los otros componentes necesarios para construir partículas lentivíricas infecciosas pero no replicativas) utilizando una transfección mediada por Express-In (Open Biosystems).
Para la transfección se tomó un matraz T150 de células 293T en fase de crecimiento exponencial con las células distribuidas uniformemente en la placa y ligeramente confluentes en más del 50 %. Las alícuotas de Express-In se llevaron hasta la temperatura ambiente. Se colocaron 3 ml de medio sin suero (RPMI 1640 HEPES 10 mM) en un tubo cónico estéril de 15 ml. Se añadieron 174 pl de reactivo Express-In directamente al medio sin suero (esto proporciona una relación ponderal entre el reactivo y el ADN de 3,6:1). Esto se mezcló completamente invirtiendo los tubos 3-4 veces y se incubó a la temperatura ambiente durante 5-20 minutos.
En un microtubo de 1,5 ml aparte se agregaron 15 pg de ADN plasmídico a alícuotas de mezcla de empaquetamiento premezclada (que contenían 18 pg de pRSV.REV (plásmido de expresión Rev), 18 pg de pMDLg/p.RRE (plásmido de expresión Gag/Pol), 7 pg de pVSV-G (plásmido de expresión de la glicoproteína del VSV), generalmente ~22 pl, y se pipetean arriba y abajo para asegurar la homogeneidad de la mezcla de ADN. Se añadió aproximadamente 1 ml de medio Express-In/Serum-Free a la mezcla de ADN gota a gota, y a continuación se pipeteó arriba y abajo suavemente antes de transferirlo nuevamente al resto del medio Express-In/Serum-Free. El tubo se invirtió 3-4 veces y se incubó a la temperatura ambiente durante 15-30 minutos. El medio de cultivo antiguo se retiró del matraz de células. Se añadió directamente el complejo Express-In/medio/ADN (3 ml) en el fondo de un matraz vertical de células 293T. Lentamente, el matraz se colocó plano para cubrir las células y se agitó muy suavemente para asegurar una distribución uniforme. Después de 1 minuto, se añadieron 22 ml de medio de cultivo nuevo (R10+HEPES: RPMI 1640, 10 % de FBS inactivado por calor, 1 % de penicilina/estreptomicina/L-glutamina, HEPES 10 mM) y el matraz se devolvió con cuidado a la estufa de incubación. Esto se incubó durante la noche a 37 °C/5 % de CO2. Después de 24 horas, se recogió el medio que contenía los vectores lentivíricos empaquetados.
Para recoger los vectores lentivíricos empaquetados, el sobrenadante del cultivo celular se filtró a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 micras, el medio de cultivo se centrifugó a 10000 g durante 18 horas (o a 112000 g durante 2 horas), se eliminó la mayor parte del sobrenadante (teniendo cuidado de no alterar el sedimento), y el sedimento se resuspendió en los pocos ml restantes de sobrenadante (generalmente aproximadamente 2 ml de un volumen inicial de 31 ml por tubo). Esto se congeló instantáneamente en hielo seco en alícuotas de 1 ml y se almacenó a -80 °C.
(b) Transducción de linfocitos T con los vectores lentivíricos empaquetados que contienen el gen de interés
Antes de la transducción con los vectores lentivíricos empaquetados, se aislaron linfocitos T humanos (CD8 o CD4 o ambos, según las necesidades) a partir de sangre de voluntarios sanos. Estas células se contaron y se incubaron durante la noche en R10 que contenía 50 U/ml de IL-2 a 1 * 106 células por ml (0,5 ml/pocillo) en placas de 48 pocillos con microesferas recubiertas de anticuerpo anti-CD3/CD28 prelavadas (expansor de linfocitos T Dynabeads®, Invitrogen) en una relación de 3 microesferas por célula.
Después de estimular durante la noche, se añadieron 0,5 ml de vector lentivírico empaquetado puro a las células deseadas. Esto se incubó a 37 °C/5 % CO2 durante 3 días. 3 días después de la transducción, las células se contaron y se diluyeron a 0,5 * 106 células/ml. Se añadió medio nuevo que contenía IL-2 según fuera necesario. Las microesferas se retiraron 5-7 días después de la transducción. Se contaron las células y se reemplazó o añadió medio nuevo que contenía IL-2 a intervalos de 2 días. Las células se mantuvieron entre 0,5 * 106 y 1 * 106 células/ml. Las células se analizaron mediante citometría de flujo desde el día 3 y se utilizaron para ensayos funcionales (por ejemplo, ELISpot para la liberación de IFNy, véase el Ejemplo 6) a partir del día el día 5. A partir del día 10, o cuando las células están ralentizando su división y reducen su tamaño, las células se congelan en alícuotas de al menos 4 * 106 células/vial (a 1 * 107 células/ml en 90 % de FBS/10 % de DMSO) para su conservación.
Ejemplo 6: activación de los linfocitos T genotecnológicos con TCR de MAGE B2
El siguiente ensayo se llevó a cabo para demostrar la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) transducidos con TCR en respuesta a estirpes celulares tumorales. La producción de IFN-y, medida mediante el ensayo ELISPOT, se utilizó como una lectura de la activación de los linfocitos T citotóxicos (CTL).
ELISPOT
Reactivos
Medios de ensayo: 10 % de FCS (Gibco, n.° de catálogo 2011-09), 88 % de RPMI 1640 (Gibco, n.° de catálogo 42401), 1 % de glutamina (Gibco, n.° de catálogo 25030) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco, n.° de catálogo 15070 063).
Tampón de lavado: PBS 0,01 M/0,05 % de Tween 20
PBS (Gibco, n.° de catálogo 10010)
El kit Human IFNy ELISPOT (BD Bioscience; n.° de catálogo 551849) que contiene anticuerpos de captura y de detección, y placas de 96 pocillos de PVDF ELISPOT de IFN-<y>humano, con conjunto de sustratos AEC asociado (BD Bioscience, n.° de catálogo 551951)
Métodos
Preparación de las células objetivo
Las células objetivo utilizadas en este método eran células presentadoras de epítopos naturales: células de melanoma humano A375, que son ambas HLA-A2+ MAGE A10+. Como control negativo se utilizó cáncer de colon humano HCT116, que son HLA-A2+ MAGE A10\ Se lavaron suficientes células objetivo (50000 células/pocillo) mediante centrifugación tres veces a 1200 rpm, 10 min en una Megafuga® 1.0 (Heraeus). A continuación, las células se resuspendieron en medios de ensayo a 106 células/ml.
Preparación de las células efectoras
Las células efectoras (linfocitos T) utilizadas en este método eran linfocitos de sangre periférica (PBL), obtenidos mediante selección negativa utilizando kits de microesferas CD14 y CD25 (Miltenyi Biotech, n.° de catálogo 130-050 201 y 130-092-983, respectivamente) de monomorfonucleares periféricos (PBMC) recién aislados a partir de la sangre venosa de voluntarios sanos. Las células se estimularon con microesferas recubiertas con antiCD3/CD28 (expansor de linfocitos T Dynabeads®, Invitrogen), transducidas con lentivirus portadores del gen que codifica el TCR ap completo de interés (basado en la construcción descrita en el Ejemplo 5) y expandidos en medios de ensayo que contenían 50 U/ml de IL-2 hasta entre 10 y 13 días después de la transducción. A continuación, estas células se colocaron en medios de ensayo antes de lavarlas mediante centrifugación a 1200 rpm, 10 min en una Megafuga® 1.0 (Heraeus). A continuación, las células se resuspendieron en medios de ensayo a 4 veces la concentración final necesaria.
Las placas se prepararon de la siguiente manera: se diluyeron 100 pl de anticuerpo de captura anti-IFN-Y en 10 ml de PBS estéril por placa. A continuación, se dispensaron 100 pl del anticuerpo de captura diluido en cada pocillo. A continuación, las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavaron (programa 1, placa de tipo 2, lavaplacas de 96 pocillos Ultrawash Plus; Dynex) para eliminar el anticuerpo de captura. A continuación, las placas se bloquearon añadiendo 200 pl de medios de ensayo a cada pocillo y se incubaron a la temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, los medios de ensayo se eliminaron de las placas mediante un lavado (programa 1, placa de tipo 2, lavaplacas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) y cualquier medio restante se eliminó moviendo y golpeando las placas ELISPOT sobre una toallita de papel.
A continuación, se añadieron los constituyentes del ensayo a la placa ELISPOT en el siguiente orden:
50 pl de células objetivo, 106 células/ml (dando un total de 50000 células objetivo/pocillo)
50 |jl de medios (medios de ensayo)
50 j l de células efectoras (20000 células PBL transducidas con TCR/pocillo)
A continuación, las placas se incubaron durante la noche (37 °C/5 % de CO2). Al día siguiente las placas se lavaron tres veces (programa 1, placa de tipo 2, lavaplacas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado y secaron con golpecitos sobre una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 j l de anticuerpo de detección primaria. El anticuerpo de detección primaria se diluyó en 10 ml de tampón de dilución (el volumen requerido para una única placa) utilizando la dilución especificada en las instrucciones del fabricante. A continuación, las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de lavarlas tres veces (programa 1, placa de tipo 2, lavaplacas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado; el exceso de tampón de lavado se eliminó golpeando la placa sobre una toallita de papel.
La detección secundaria se realizó añadiendo 100 j l de estreptavidina-HRP diluida a cada pocillo e incubando la placa a la temperatura ambiente durante 1 hora. La estreptavidina-HRP se diluyó en 10 ml de tampón de dilución (el volumen requerido para una única placa), utilizando la dilución especificada en las instrucciones del fabricante. A continuación, las placas se lavaron tres veces (programa 1, placa de tipo 2, lavaplacas de 96 pocillos Ultrawash Plus, Dynex) con tampón de lavado, y se golpeó ligeramente sobre una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. A continuación, las placas se lavaron dos veces con PBS añadiendo 200 j l a cada pocillo, retirando el tampón y golpeando sobre una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón. No más de 15 min antes de su uso, se añadió una gota (20 j l ) de cromógeno AEC a cada 1 ml de sustrato AEC, y se mezcló. Se prepararon 10 ml de esta solución para cada placa; se añadieron 100 j l por pocillo. A continuación, se protegió la placa de la luz con papel de aluminio y se controló periódicamente el desarrollo de las manchas, que se produce generalmente entre los 5 y 20 min. Las placas se lavaron con agua del grifo para finalizar la reacción de desarrollo y se secaron con agitación antes de su desmontaje en tres partes constituyentes. A continuación, las placas se dejaron secar a la temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de contar las manchas usando un lector de placas Immunospot® (CTL; Celular Technology Limited).
Ejemplo 7: identificación del motivo de unión mediante sustitución con todos los aminoácidos alternativos
Se obtuvieron variantes del péptido MAGE-B2 natural en las que el resto de aminoácido de cada posición se reemplazó secuencialmente por los 19 aminoácidos alternativos naturales, de modo que se prepararon 171 péptidos en total. Los péptidos naturales y los sustituidos por aminoácidos se introdujeron mediante pulsos en células presentadoras del antígeno, y la producción de interferón y (IFNy), medida mediante el ensayo ELISpot, se utilizó como lectura de la activación de los linfocitos T transducidos con TCR1. Las posiciones esenciales se definieron por una reducción superior al 50 % en la actividad de los linfocitos T con respecto al péptido natural.
Los ensayos ELISpot se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 6.
Los restos tolerados en cada posición del péptido se muestran a continuación. Los aminoácidos subrayados representan el resto natural en la posición correspondiente del péptido.
Por lo tanto, es evidente que el TCR4 MAGE B2 hace contacto con al menos V2 Y3 y D4 del péptido (SEQ ID no: 1) cuando está en un complejo con HLA-A*0201 en la superficie de células presentadoras del antígeno.
SEQ ID No. 1 Epítopo MAGE B2
GVYDGEEHSV
SEQ ID No.2 Epítopo MAGE A4
GVYDGREHTV
SEQ ID n° 3 cadena variable alfa
MKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKS
NGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQF
SEQ ID n° 4 cadena variable beta
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP
GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYN
EQFF
SEQ ID n° 5 forma soluble de la cadena alfa
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQD
TGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSW
GKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYI
TDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS SEQ ID No 6 forma soluble de la cadena beta
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP
GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYN
EQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWV
NGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSE
NDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD SEQ ID n° 7 cadena variable alfa mutante
MKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTRMTFSENTKS
NGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQF
SEQ ID n° 8 cadena variable beta mutante
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGRDRMYWYRQDP
GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYN
EQFF
SEQ ID n° 9 cadena variable beta mutante
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP
GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYR
EQFF
SEQ ID n° 10 cadena variable beta mutante
MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDP
GLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYK
EQFF
SEQ ID n° 11 forma soluble de la cadena alfa
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPG
KGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVGGYSTLTFG
KGTVLLVSPDNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVL
DMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTN
LNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID No 12 forma soluble de la cadena beta
MSISLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRILKIGQSMTLQCAQDMNHNYMYWYRQDP
GMGLKLIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASSYSRW
SPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWW
VNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLS
ENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVS
ALVLMAMVKRKDF SEQ ID n° 13 forma soluble de la cadena alfa
MQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKED
GRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKMANQAGTALIFGKGTTLSVSSNIQNP
DPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVA
WSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS SEQ ID No 14 forma soluble de la cadena beta
MQDGGITQSPKFQVLRTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITD
QGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPSQTSVYFCASLGGLADEQFFGPGTRLTVLEDL
KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQP
LKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQI
VSAEAWGRAD SEQ ID n° 15 forma soluble de la cadena alfa
MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQE
PGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAERNSGAGS
YQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYIT
DKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID No 16 forma soluble de la cadena beta
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTL
GQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLFS
GVNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVEL
SWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF
YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA
VLVSALVLMAMVKRKDF

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de linfocitos T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1) en un complejo con HLA-A*0201 con una constante de disociación desde 0,05 pM hasta 20,0 pM cuando se mide con resonancia de plasmón superficial a 25 °C y a un pH de entre 7,1 y 7,5 utilizando una forma soluble del TCR, y tiene al menos al menos una selectividad diez veces mayor de unión a la SEQ ID No: 1 en un complejo con HLA-A*0201 sobre la unión a GVYDGREHTV (SEQ ID No 2) en un complejo con HLA-A*0201, en donde el Tc R comprende
(A) el dominio variable de la cadena alfa del TCR de una secuencia en la que:
(i) los restos de aminoácidos 1-27 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 1-27 de la SEQ ID No: 3 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 28-33 son VSPFSN;
(iii) los restos de aminoácidos 34-47 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 34-47 de la SEQ ID NO: 3 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 48-53 son LTIMTF o LTRMTF;
(v) los restos de aminoácidos 54-90 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 54-90 de la SEQ ID No: 3 o (b) una, dos o tres inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); y
(vi) los restos de aminoácidos 91-105 son CVVs Gg TDSWGKLQF; y
(B) el dominio variable de la cadena beta del TCR de una secuencia en la que:
(i) los restos de aminoácidos 1-45 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de los restos 1-45 de la SEQ ID No: 4 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(ii) los restos de aminoácidos 46-50 son KGHDR o KGRDR;
(iii) los restos de aminoácidos 51-67 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 51-67 de la SEQ ID NO: 4 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a);
(iv) los restos de aminoácidos 68-72 son SFDVK;
(v) los restos de aminoácidos 73-109 tienen (a) al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los restos de aminoácidos 73-109 de la SEQ ID NO: 4 o (b) una, dos o tres inserciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de (a); y
(vi) los restos de aminoácidos 110-123 son CATSGQGAYREQFF o CATSGQGAYKEQFF o CATSGQGAYNEQFF;
y en donde los dominios variables de TCR forman contactos con al menos los restos V2, Y3 y D4 de GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 1).
2. Un TCR de acuerdo con la reivindicación 1, que está en formato de cadena única del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp o Va-L-Vp-Cp, en donde Va y Vp son las regiones variables a y p del TCR, respectivamente, Ca y Cp son las regiones constantes a y p del TCR, respectivamente, y L es una secuencia conectora.
3. Un TCR de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que está asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico o un resto modificador de la PK.
4. Un TCR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el dominio variable de la cadena alfa del TCR está comprendido en la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 1-105 de la SEQ ID No: 3 o 7.
5. Un TCR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el dominio variable de la cadena beta del TCR está comprendido en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID No: 4 u 8-10.
6. Ácido nucleico que codifica un TCR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Una célula aislada o de origen no natural, especialmente un linfocito T, que presenta un TCR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Una célula que porta
(a) un vector de expresión de TCR que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 en un único marco abierto de lectura, o dos marcos abiertos de lectura distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta, respectivamente; o
(b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Una composición farmacéutica que comprende un TCR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un ácido nucleico de la reivindicación 6 o una célula de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
10. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el ácido nucleico de la reivindicación 6 o la célula de la reivindicación 7 o la reivindicación 8 para usar en medicina.
11. El TCR, el ácido nucleico o la célula para usar de acuerdo con la reivindicación 10, para usar en un método de tratamiento del cáncer.
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