ES2991086T3 - Anticuerpos y composiciones anti-PD-1 - Google Patents

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Abstract

Esta invención se refiere a anticuerpos anti-PD-1 y métodos para usarlos en el tratamiento de enfermedades y afecciones relacionadas con la actividad de PD-1, por ejemplo, cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos y composiciones anti-PD-1
Antecedentes de la invención
PD-1, también conocida como proteína de muerte celular programada 1 y CD279, es un receptor de superficie celular de 268 aminoácidos que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. PD-1 es un miembro de la familia CD28 de reguladores de linfocitos T y se expresa en linfocitos T, linfocitos B y macrófagos. Se une a los ligandos PD-L1 (también conocido como homólogo B7) y PD-L2 (también conocido como B7-DC).
PD-1 es una proteína de membrana tipo I cuya estructura incluye un dominio IgV extracelular, una región transmembrana y una cola intracelular que contiene dos sitios de fosforilación. Conocida como proteína de punto de control inmunitario, PD-1 funciona como un receptor inmunomodulador inducible, jugando un papel en, por ejemplo, la regulación negativa de las respuestas de los linfocitos T a la estimulación del antígeno.
PD-L1 es el ligando predominante para PD-1. La unión de PD-L1 a PD-1 inhibe la actividad de los linfocitos T, lo que reduce la producción de citocinas y suprime la proliferación de linfocitos T. Las células cancerosas que expresan PD-L1 pueden explotar este mecanismo para desactivar la actividad antitumoral de los linfocitos T a través de la unión de PD-L1 al receptor PD-1.
En vista de sus propiedades reguladoras de la respuesta inmunitaria, se ha investigado la PD-1 como un objetivo potencial para la inmunoterapia, que incluye el tratamiento del cáncer y enfermedades autoinmunitarias. Dos anticuerpos anti-PD-1, pembrolizumab y nivolumab, han sido aprobados en Estados Unidos y Europa para el tratamiento de determinados tipos de cáncer.
Lee et al.(Nature Communications(2016):7:13354) se refiere a las estructuras cristalinas de los anticuerpos anti-PD-1 en complejo con sus dianas. Fernwick et al.(Journal of Clinical Oncology(2016) 34(15):3072) se refiere a anticuerpos anti-PD-1 antagonistas que no bloquean la interacción PD-1/PD-L1. Las publicaciones de patente PCT WO 2006/121168, WO 2016/092419, WO 2016/014688, WO 2015/112800, WO 2015/035606, WO 2008/156712 y WO 2015/112900 se refieren a anticuerpos anti-PD-1. Scapin et al.(Nature Structural & Molecular Biology(2015) 22(12):953-8) se refiere a la estructura del anticuerpo anti-PD-1 pembrolizumab.
En vista del papel fundamental de la PD-1 como inmunomodulador, existe una necesidad de inmunoterapias nuevas y mejoradas que se dirijan al receptor PD-1 para tratar cánceres y determinados trastornos del sistema inmunitario.
Sumario de la invención
La presente invención está dirigida a nuevos anticuerpos recombinantes dirigidos a PD-1 como se define en las reivindicaciones, así como composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de estos anticuerpos, y los anticuerpos y composiciones farmacéuticas para su uso en la mejora de la inmunidad en un paciente, y para su uso en el tratamiento de cánceres originados en tejidos tales como piel, pulmón, intestino, colon, ovario, cerebro, próstata, riñón, tejidos blandos, el sistema hematopoyético, cabeza y cuello, hígado, vejiga, mama, estómago, útero y páncreas. En comparación con los tratamientos actualmente disponibles para estos tipos de cáncer, incluidos los tratamientos con anticuerpos, se contempla que los anticuerpos de la invención pueden proporcionar una respuesta clínica superior ya sea solos o junto con otro tratamiento terapéutico contra el cáncer, tal como un anticuerpo dirigido a otra proteína de punto de control inmunitario.
El anticuerpo anti-PD-1 tiene un VH y un VL que comprenden o consisten en las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo, es decir, el VH comprende o consiste en SEQ ID NO: 9 y el VL comprende o consiste en SEQ ID NO: 10; el VH comprende o consiste en SEQ ID NO: 78 y el VL comprende o consiste en SEQ ID NO: 10; el VH comprende o consiste en SEQ ID NO: 9 y el VL comprende o consiste en SEQ ID NO: 88; o el VH comprende o consiste en SEQ ID NO: 78 y el VL comprende o consiste en SEQ ID NO: 88, en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 tiene una HC y una LC que comprenden o consisten en las secuencias de aminoácidos de HC y LC, respectivamente, del anticuerpo, es decir, la HC comprende o consiste en SEQ ID NO: 9 y 26 y la LC comprende o consiste en SEQ ID NO: 10 y 28; la HC comprende o consiste en SEQ ID NO: 78 y 26 y la LC comprende o consiste en SEQ ID NO: 10 y 28; la HC comprende o consiste en SEQ ID NO: 9 y 26 y la LC comprende o consiste en SEQ ID NO: 88 y 28; o la HC comprende o consiste en SEQ ID NO: 78 y 26 y la LC comprende o consiste en SEQ ID NO: 88 y 28, en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 tiene (1) una HC que comprende la secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo 18201, es decir, el VH comprende SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 78, en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L, y la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada de s Eq ID NO: 26; y (2) una LC que comprende la secuencia de aminoácidos de VL de ese anticuerpo, es decir, el VL comprende SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 88, y la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera de SEQ ID NO: 28.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-PD-1 de la invención o una parte de unión a antígeno del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un tratamiento adicional, tal como un anticuerpo terapéutico anticancerígeno.
La presente invención proporciona además moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada, o una parte de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera, o una parte de unión a antígeno de la misma, o ambas, de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención.
La presente invención también proporciona vectores que comprenden dicha molécula de ácido nucleico aislada, en donde dicho vector puede comprender además una secuencia de control de expresión.
La presente invención también proporciona células hospedadoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada, o una parte de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera, o una parte de unión a antígeno de la misma, o ambas, de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención.
La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo de la invención, que comprende proporcionar una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada, o una parte de unión a antígeno de la misma, y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera, o una parte de unión a antígeno de la misma, de un anticuerpo anti-PD-1 como se describe en el presente documento, cultivando dicha célula hospedadora en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o parte, y aislando el anticuerpo o parte resultante.
La presente invención también proporciona una molécula de unión biespecífica que tiene el dominio de unión de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención.
La presente invención proporciona además un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno del mismo, una composición farmacéutica o una molécula de unión biespecífica de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente. En algunas realizaciones, el cáncer se origina en un tejido seleccionado entre piel, pulmón, intestino, colon, ovario, cerebro, próstata, riñón, tejidos blandos, sistema hematopoyético, cabeza y cuello, hígado, vejiga, mama, estómago, útero y páncreas. El cáncer puede ser, por ejemplo, melanoma avanzado o metastásico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal o linfoma de Hodgkin.
Cualquiera de los usos médicos anteriores puede comprender además la administración de, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico, un agente antiangiogénico, un inhibidor de la tirosina cinasa, un inhibidor de la vía de PD-1 o radioterapia.
La presente invención proporciona además un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente y/o en la mejora de la inmunidad en un paciente, por ejemplo, en el método de tratamiento descrito en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-1D muestran gráficos de puntos de citometría de flujo representativos para cuatro clones de anticuerpos anti-PD-1 que presentan diferente reactividad hacia los ortólogos de PD-1.
Las figuras 2A-2H muestran el bloqueo de la unión de PD-L1 a PD-1 expresado en células para los anticuerpos anti-PD-1 de la invención.
Las figuras 3A-3F muestran curvas de dosis-respuesta de doce anticuerpos anti-PD-1 en el ensayo de sangre completa con SEB.
Las figuras 4A-4F muestran curvas de dosis-respuesta de doce anticuerpos anti-PD-1 en el ensayo MLR (reacción linfocítica mixta unidireccional).
La figura 5 muestra una visión general de los grupos de epítopos ("epitope bins") identificados para los anticuerpos anti-PD-1 probados y los análogos de nivolumab y pembrolizumab. Los anticuerpos conectados por líneas negras indican actividad de bloqueo cruzado. Los anticuerpos se agrupan de acuerdo con los patrones de competencia con otros anticuerpos anti-PD-1. Nivo: análogo de nivolumab; Pembro: análogo de pembrolizumab.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona nuevos anticuerpos anti-PD-1 humana como se define en las reivindicaciones que pueden usarse para mejorar el sistema inmunitario en un paciente humano, tal como un paciente con cáncer. Salvo que se especifique lo contrario, como se usa en el presente documento, "PD-1" se refiere a la PD-1 humana. Una secuencia polipeptídica de PD-1 humana está disponible bajo el número de acceso de Uniprot Q15116 (PDCD1_HUMAN).
El término "anticuerpo" (Ab) o "inmunoglobulina" (Ig), como se usa en el presente documento, se refiere a un tetrámero que comprende dos cadenas pesadas (H) (aproximadamente 50-70 kDa) y dos cadenas ligeras (L) (aproximadamente 25 kDa) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Los dominios VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones estructurales" (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR (H-CDR designa en el presente documento una CDR de la cadena pesada; y L-CDR designa en el presente documento una CDR de la cadena ligera) y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de números de aminoácidos en la cadena pesada o ligera puede realizarse de acuerdo con definiciones de IMGT® (Lefranc et al.,Dev. Comp. Immunol.27(1):55-77 (2003)); o las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 y 1991)); Chothia y Lesk,J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); o Chothia et al.,Nature342:878-883 (1989).
La expresión "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que se expresa a partir de una célula o línea celular que comprende la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) el anticuerpo, en donde dicha(s) secuencia(s) de nucleótido(s) no está(n) asociada(s) naturalmente con la célula.
La expresión "proteína aislada", "polipéptido aislado" o "anticuerpo aislado" se refiere a una proteína, polinucleótido o anticuerpo que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con componentes asociados de manera natural que la acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente y/o (4) no se encuentra en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o que se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula a partir de la que se origina de forma natural se "aislará" de sus componentes asociados de forma natural. Una proteína también puede volverse esencialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante el aislamiento, usando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la materia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "línea germinal" se refiere a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los genes de anticuerpos y segmentos de genes tal como se transmiten de padres a hijos a través de las células germinales. Las secuencias de la línea germinal se distinguen de las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos en los linfocitos B maduros, que han sido alterados por eventos de recombinación e hipermutación durante el curso de la maduración de los linfocitos B. Un anticuerpo que "utiliza" una secuencia de línea germinal particular tiene una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que se alinea con esa secuencia de nucleótidos de la línea germinal o con la secuencia de aminoácidos que especifica más de cerca que con cualquier otra secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la línea germinal.
El término "afinidad" se refiere a una medida de la atracción entre un antígeno y un anticuerpo. El atractivo intrínseco del anticuerpo para el antígeno se expresa normalmente como la constante de equilibrio de afinidad de unión (Kd) de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la K<d>es < 1 mM, preferentemente < 100 nM. Una constante de afinidad de unión K<d>se puede medir, por ejemplo, por resonancia plasmónica de superficie (SPR) (BIAcore™) o interferometría de biocapa, por ejemplo, utilizando el sistema IBIS MX96 SPR de IBIS Technologies, el sistema ProteOn™ SPR XPR36 de Bio-Rad, o el sistema Octet™ de ForteBio.
El término "koff" se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Una constante de velocidad de disociación koff se puede medir mediante SPR o interferometría de biocapa, por ejemplo, utilizando uno de los sistemas enumerados anteriormente.
El término "epítopo" como se utiliza en el presente documento se refiere a una parte (determinante) de un antígeno que se une específicamente a un anticuerpo o una molécula relacionada, tal como una molécula de unión biespecífica. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o hidratos de carbono o azúcares y, generalmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional". En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre una proteína (por ejemplo, un antígeno) y una molécula interactuante (tal como un anticuerpo) ocurren linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción ocurren a través de residuos de aminoácidos de la proteína que están separados unos de otros en la secuencia primaria de aminoácidos. Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos contra ese epítopo utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo contra un epítopo lineal, por ejemplo, inmunizando un animal con un péptido que tiene los residuos de aminoácidos del epítopo lineal. Se puede generar un anticuerpo contra un epítopo conformacional, por ejemplo, inmunizando un animal con un minidominio que contiene los residuos de aminoácidos relevantes del epítopo conformacional. También se puede generar un anticuerpo contra un epítopo particular, por ejemplo, inmunizando un animal con la molécula diana de interés (por ejemplo, PD-1) o una parte relevante de la misma, a continuación, cribando según su unión al epítopo.
Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que o compite por la unión con un anticuerpo anti-PD-1 de la invención utilizando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, ensayos competitivos, preclasificación ("binning") de epítopos y exploración de alanina. En algunas realizaciones, el anticuerpo de prueba y un anticuerpo anti-PD-1 de la invención se unen a al menos un residuo común (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis residuos comunes) en PD-1. En realizaciones adicionales, los residuos de contacto en PD-1 son completamente idénticos entre el anticuerpo de prueba y el anticuerpo anti-PD-1 de la invención. En una realización, uno permite que el anticuerpo anti-PD-1 de la invención se una a PD-1 en condiciones de saturación y, a continuación, mide la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a PD-1. Si el anticuerpo de prueba puede unirse a PD-1 a la vez que el anticuerpo anti-PD-1 de referencia, entonces, el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente al del anticuerpo anti-PD-1 de referencia. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a PD-1 al mismo tiempo, entonces, el anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo, un epítopo superpuesto, o un epítopo que está en estrecha proximidad al epítopo unido por el anticuerpo anti-PD-1 de la invención. Este experimento se puede realizar utilizando, por ejemplo, ELISA, RIA, BIACORE™, RPS, Interferometría de biocapa o citometría de flujo. Para probar si un anticuerpo anti-PD-1 compite de forma cruzada con otro anticuerpo anti-PD-1, se puede utilizar el método de competencia descrito anteriormente en dos direcciones, es decir, determinar si el anticuerpo conocido bloquea el anticuerpo de prueba y viceversa. Se pueden realizar estos experimentos de competencia cruzada, por ejemplo, utilizando un instrumento IBIS MX96 SPR o el sistema Octet™.
En determinados casos, también puede ser deseable alterar uno o más residuos de aminoácidos de CDR para mejorar la afinidad de unión al epítopo diana. Esto se conoce como "maduración de la afinidad" y puede realizarse opcionalmente en conexión con la humanización, por ejemplo, en situaciones en las que la humanización de un anticuerpo conduce a una reducción de la especificidad o afinidad de unión y no es posible mejorar suficientemente la especificidad o afinidad de unión únicamente mediante retromutaciones. En la técnica se conocen diferentes métodos de maduración de afinidad, por ejemplo, el método de mutagénesis de saturación por barridoin vitrodescrita por Burks et al.,Proc. Nati. Acad. Sci.USA, 94:412-417 (1997), y el método de maduración de afinidad paso a pasoin vitrode Wu et al.,Proc. Nati. Acad. Sci.USA 95:6037-6042 (1998).
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden ser quiméricos, humanizados o completamente humanos. Aunque no es posible predecir con precisión la inmunogenicidad de un anticuerpo en particular, los anticuerpos no humanos tienden a ser más inmunogénicos en los seres humanos que los anticuerpos humanos. Los anticuerpos quiméricos, donde las regiones constantes extrañas (por ejemplo, de roedores o aves) han sido reemplazadas por secuencias de origen humano, se ha demostrado que son generalmente menos inmunogénicas que los anticuerpos de origen totalmente extraño. La tendencia en los anticuerpos terapéuticos es hacia anticuerpos humanizados o totalmente humanos.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de dos especies animales diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede contener los dominios variables de un anticuerpo murino (es decir, un anticuerpo codificado por genes de anticuerpos murinos tales como un anticuerpo obtenido de un ratón inmunizado utilizando tecnología de hibridoma) vinculados a las regiones constantes de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo, ser humano, conejo o rata). En el caso de un anticuerpo quimérico, las partes no humanas pueden ser sometidas a alteraciones adicionales para humanizar el anticuerpo.
El término "humanizar" se refiere a modificar un anticuerpo que es total o parcialmente de origen no humano (por ejemplo, un anticuerpo murino o de pollo obtenido a partir de la inmunización de ratones o pollos, respectivamente, con un antígeno de interés, o un anticuerpo quimérico basado en dicho anticuerpo murino o de pollo), mediante la sustitución de determinadas secuencias de aminoácidos, en particular, en las regiones estructurales (FR) y las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras, con las correspondientes secuencias de aminoácidos de la región constante y FR humanas, con el fin de evitar o minimizar una respuesta de anticuerpos antifármaco en pacientes humanos. Por tanto, los anticuerpos de origen no humano pueden humanizarse para reducir el riesgo de una respuesta de anticuerpos antifármaco humanos.
La expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el que las secuencias del dominio variable y de la región constante se derivan de secuencias humanas. La expresión abarca anticuerpos con secuencias que se derivan de genes humanos pero que han sido modificados, por ejemplo, para disminuir la inmunogenicidad, aumentar la afinidad y/o aumentar la estabilidad. Asimismo, la expresión abarca los anticuerpos producidos de forma recombinante en células no humanas, que pueden impartir una glicosilación no típica de las células humanas. La expresión también abarca los anticuerpos producidos en organismos transgénicos no humanos con genes de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratas OmniRat®).
La expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a una o más partes o fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, PD-1 humana, o una parte de la misma). Se ha demostrado que determinados fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión al antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados en la expresión "parte de unión a antígeno" de un Ab incluyen (i) un fragmento Fab: un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2: un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada capaz de unirse específicamente a un antígeno. Por otro lado, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la que los dominios VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv)). También dentro de la invención se encuentran moléculas de unión a antígeno que comprenden un VH y/o un VL. En el caso de un VH, la molécula también puede comprender una o más de una región CH1, bisagra, CH2 o CH3. También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios se incluyan en la expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se comprenden otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno.
Las partes de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')<2>, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina de anticuerpos completos. Más aún, se pueden obtener anticuerpos, partes de anticuerpos y moléculas de inmunoadhesión utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
La clase (isotipo) y la subclase de anticuerpos anti-PD-1 pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se pueden determinar utilizando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Dichos anticuerpos están disponibles en el mercado. La clase y subclase se pueden determinar mediante ELISA, Western Blot así como otras técnicas. Como alternativa, la clase y subclase pueden determinarse secuenciando la totalidad o una parte de las regiones constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.
Cuando se hace referencia a residuos de aminoácidos particulares en una posición determinada de una secuencia de anticuerpos, una indicación de, por ejemplo, "35S" se refiere a la posición y al residuo, es decir, en este caso se indica que un residuo de serina (S) está presente en la posición 35 de la secuencia. De forma similar, una indicación de, por ejemplo, "13Q+35S" se refiere a los dos residuos en las respectivas posiciones. Salvo que se indique de otro modo, todos los números de residuos de aminoácidos de anticuerpos a los que se hace referencia en esta divulgación son los que figuran en el esquema de numeración de IMGT®.
Anticuerpos anti-PD-1
La presente invención proporciona anticuerpos dirigidos contra PD-1 como se define en las reivindicaciones, y partes de unión a antígeno de los mismos. En una realización particular, los anticuerpos divulgados en el presente documento son anticuerpos humanos, por ejemplo, generados a partir de ratas transgénicas con genes de anticuerpos humanos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos humanos pueden contener determinadas mutaciones, por ejemplo, para mutar las mutaciones derivadas del cebador de nuevo a la secuencia de la línea germinal (véase, por ejemplo, las secuencias variantes "corregidas por Symplex" a continuación) o para cambiar las mutaciones en las regiones estructurales de nuevo a la secuencia de la línea germinal V o J más cercana (véase, por ejemplo, las secuencias variantes "germinales" que aparecen a continuación).
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29-31, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y 26; e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 32-34, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 34, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y cuyo VL es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 35-37, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y 26; e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 38-40, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 40, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y cuyo VL es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 41-43, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y 26; e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 44-46, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 46, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y cuyo VL es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 47 y 48, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y 26; e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 49-51, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 47, 48 y 49-51, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y cuyo VL es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y 28.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; y
b) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:
9 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y 28, en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 56 y 48, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, 33 y 51, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, 56 y 48 y 57, 33 y 51, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y cuyo V<l>es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 58-60, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, 33 y 34, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 60 y 57, 33 y 34, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y cuyo Vl es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, 62 y 43, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 44-46, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, 62 y 43 y 44-46, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y cuyo Vl es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 63-65, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 32-34, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 65 y 32-34, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y cuyo V<l>es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 66-68, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 45 y 55, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 68 y 38, 45 y 55, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y cuyo V<l>es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 69-71, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, 45 y 73, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 71 y 72, 45 y 73, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y cuyo V<l>es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo cuya H-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 74-76, respectivamente;
b) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena pesada (VH) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23;
c) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23;
d) un anticuerpo cuya cadena pesada (HC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y 26;
e) un anticuerpo cuya L-CDR1-3 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, 33 y 34, respectivamente;
f) un anticuerpo cuyo dominio variable de cadena ligera (VL) es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
g) un anticuerpo cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
h) un anticuerpo cuya cadena ligera (LC) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y 28; i) un anticuerpo cuyas H-CDR1-3 y L-CDR1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 76 y 57, 33 y 34, respectivamente;
j) un anticuerpo cuyo VH es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y cuyo V<l>es al menos un 90 % idéntico en secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;
k) un anticuerpo cuyo VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y cuyo VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y
l) un anticuerpo cuya HC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y 26 y cuya LC comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y 28.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que son al menos un 90 % idénticos en secuencia de aminoácidos al VH y al VL, respectivamente, de uno cualquiera de los anticuerpos 18040, 18049, 18098, 18113, 18201, 18247, 18250, 18325, 18366, 18400, 18413 y 18483, por ejemplo, al menos un 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico en secuencia al VH y VL de cualquiera de dichos anticuerpos. En algunas realizaciones, una parte de unión a antígeno del anticuerpo anti-PD-1 tiene dichos VH y VL.
El anticuerpo anti-PD-1 tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18201. En algunas realizaciones, una parte de unión a antígeno del anticuerpo anti-PD-1 tiene dichos VH y VL.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 o una parte de unión a antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de:
a) SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34, respectivamente;
b) SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 y 40, respectivamente;
c) SEQ ID NO: 41,42, 43, 44, 45 y 46, respectivamente;
d) SEQ ID NO: 29, 47, 48, 49, 50 y 51, respectivamente;
e) SEQ ID NO: 52, 53, 54, 38, 45 y 55, respectivamente;
f) SEQ ID NO: 29, 56, 48, 57, 33 y 51, respectivamente;
g) SEQ ID NO: 58, 59, 60, 57, 33 y 34, respectivamente;
h) SEQ ID NO: 61,62, 43, 44, 45 y 46, respectivamente;
i) SEQ ID NO: 63, 64, 65, 32, 33 y 34, respectivamente;
j) SEQ ID NO: 66, 67, 68, 38, 45 y 55, respectivamente;
k) SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 45 y 73, respectivamente; o
l) SEQ ID NO: 74, 75, 76, 57, 33 y 34, respectivamente.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1, o una parte de unión a antígeno, que comprende un VH y un VL que son un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, o 99% idénticos a las secuencias de aminoácidos de:
a) SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente;
b) SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente;
c) SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente;
d) SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente;
e) SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente;
f) SEQ ID NO: 11 y 12, respectivamente;
g) SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente;
h) SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente;
i) SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente;
j) SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente;
k) SEQ ID NO: 21 y 22, respectivamente; o
l) SEQ ID NO: 23 y 24, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, de la invención comprende un VH y un VL que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente, en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende:
e) una HC con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 26 y una LC con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y 28,
en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18040, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y el VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde X en la posición 35 es S, y/o X en la posición 84 es N. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en donde X en la posición 40 es A, y/o X en la posición 55 es Y.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18049, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde X en la posición 1 es D, y/o X en la posición 3. El VL puede comprender D en la posición 1 y Q en la posición 3. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde X en la posición 53 es S.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18098, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, en donde: X en la posición 1 es E, y/o X en la posición 5 es V. El VH puede comprender E en la posición 1 y V en la posición 5. El VH también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, en donde X en la posición 13 es Q, X en la posición 35 es S, X en la posición 46 es E, X en la posición 50 es A, X en la posición 77 es N, X en la posición 80 es Y, y/o X en la posición 115 es M. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, en donde X en la posición 4 es M.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18113, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, en donde X en la posición 64 es V. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en donde X en la posición 3 es V, y/o X en la posición 4 es M. El VL puede comprender V en la posición 3 y M en la posición 4. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 en donde X en la posición 69 es S.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18201, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 9 y el VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 10, en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, en la posición 59 está T, en la posición 76 está R o K, y en la posición 83 está M o L.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18247, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, en donde X en la posición 10 es G, y/o X en la posición 16 es G. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, en donde: X en la posición 1 es D, y/o X en la posición 4 es M. El VL puede comprender D en la posición 1 y M en la posición 4. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, en donde X en la posición 55 es Y, y/o X en la posición 93 es Y.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18250, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde X en la posición 5 es V. El VH también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde X en la posición 50 es Y, X en la posición 59 es Y, y/o X en la posición 61 es A. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 3 es V, y/o X en la posición 4 es M. El VL puede comprender V en la posición 3 y M en la posición 4. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 en donde X en la posición 55 es Y.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18325, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, en donde X en la posición 1 es E, X en la posición 5 es V, y/o X en la posición 6 es E. El VH puede comprender E en la posición 1, V en la posición 5 y E en la posición 6. El VH también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: La posición 35 es S, X en la posición 49 es S, X en la posición 50 es A, X en la posición 73 es D, y/o X en la posición 78 es T. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, en donde X en la posición 1 es D, X en la posición 3 es Q, y/o X en la posición 4 es M. El VL puede comprender D en la posición 1, Q en la posición 3 y M en la posición 4.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18366, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, en donde X en la posición 1 es E, y/o X en la posición 6 es E. El VH puede comprender E en la posición 1 y E en la posición 6. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 en donde X en la posición 1 es D. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 en donde X en la posición 40 es A, y/o X en la posición 55 es Y.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18400, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, en donde X en la posición 2 es V. El VH también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, en donde X en la posición 43 es G, X en la posición 49 es I, X en la posición 59 es N, X en la posición 70 es I, y/o X en la posición 111 es Q. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, en donde X en la posición 1 es A, y/o X en la posición 3 es Q. El VL puede comprender A en la posición 1 y Q en la posición 3. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, en donde X en la posición 10 es S.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18413, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, en donde X en la posición 48 es V, y/o X en la posición 50 es A. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 en donde X en la posición 4 es M. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, en donde X en la posición 12 es S.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 que tiene un VH y un VL que comprenden las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 18483, es decir, donde el VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y el VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. El VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, en donde X en la posición 1 es E, X en la posición 5 es V, y/o X en la posición 6 es E. El VL puede comprender E en la posición 1, V en la posición 5 y E en la posición 6. El VH también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, en donde X en la posición 35 es S. El VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 en donde X en la posición 3 es V. El VL también puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, en donde X en la posición 40 es A, y/o X en la posición 55 es Y.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 o una parte de unión a antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de un anticuerpo seleccionado entre 18040, 18049, 18098, 18113, 18201, 18247, 18250, 18325, 18366, 18400, 18413 y 18483, y además utiliza las mismas secuencias de línea germinal de cadena pesada y/o ligera que el anticuerpo seleccionado.
En el presente documento, se divulga, pero no se reivindica, un anticuerpo anti-PD-1 o una parte de unión a antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de H-CDR1-3 y L-CDR1-3 de un anticuerpo seleccionado entre 18040, 18049, 18098, 18113, 18201, 18247, 18250, 18325, 18366, 18400, 18413 y 18483, y comprende además regiones estructurales (FR) que son un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idénticas a las FR del anticuerpo seleccionado.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1, o partes de unión a antígeno, pueden inhibir la unión de PD-L1 o PD-L2, o ambos, a PD-1.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1, o partes de unión a antígeno, pueden tener al menos una de las siguientes propiedades:
a) se une a PD-1 de cynomolgus con una K<d>de, por ejemplo, 4 * 10'8 M o menos;
b) se une a PD-1 de ratón con una Kd de, por ejemplo, 2 * 10'8 M o menos;
c) se une a PD-1 humana con una K<d>de 3 * 10-9 M o menos;
d) inhibe la interacción de PD-1 con PD-L1 a una concentración de 10 |jg/ml;
e) estimula la producción de IL-2 en un ensayo de sangre completa con SEB; y
f) estimula la producción de IFN-y en un ensayo de reacción linfocítica mixta unidireccional.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-PD1, o partes de unión a antígeno, pueden unirse a la PD-1 humana con una Kd de 5 * 10-9 M o menos, 4 * 10-9 M o menos, 3 * 10-9 M o menos, 2 * 10-9 M o menos, 1 * 10'9 M o menos, 9 * 1°'1° M o menos, 8 * 1°'1° M o menos, 7 * 1°'1° M o menos, 6 * 1°'1° M o menos, 5 * 10 10 M o menos, 4 * 1°'1° M o menos, 3 * 1°'1° M o menos, 2 * 1°'1° M o menos o 1 x 1°'1° M o menos. En determinadas realizaciones, la Kd se determina mediante resonancia de plasmón de superficie.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-PD1, o partes de unión a antígeno, pueden inhibir la interacción de PD-1 con PD-L1 a una concentración de 5°, 4°, 3°, 2°, 1°, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 jg/ml.
La clase de un anticuerpo anti-PD-1 obtenido mediante los métodos descritos en el presente documento puede cambiarse o intercambiarse con otra clase o subclase. Una molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH se puede aislar utilizando métodos bien conocidos en la técnica de modo que no incluya secuencias de ácido nucleico que codifiquen CL o CH. Las moléculas de ácido nucleico que codifican VL o VH, entonces, se unen operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una CL o C<h>, respectivamente, de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto puede conseguirse mediante un vector o una molécula de ácido nucleico que comprenda una cadena CL o CH, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 que originalmente era IgM puede cambiar de clase a IgG. Asimismo, puede usarse el cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de IgG1 a IgG2. Se puede cambiar una región constante de cadena ligera k, por ejemplo, a una región constante de cadena ligera A. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención con un isotipo de Ig deseado comprende las etapas de aislar una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1, obtener el dominio variable de la cadena pesada, ligar el dominio variable de la cadena pesada con la región constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una célula y recolectar el anticuerpo anti-PD-1 con el isotipo deseado.
El anticuerpo anti-PD-1 de la invención puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, pero es normalmente del isotipo IgG, por ejemplo, de la subclase de IgG IgG1, IgG2a o IgG2b, IgG3 o IgG4. En una realización, el anticuerpo es una IgG1. En otra realización, el anticuerpo es una IgG4.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender al menos una mutación en la región Fc. Se conocen varias mutaciones diferentes de Fc, donde estas mutaciones proporcionan una función efectora alterada. Por ejemplo, en muchos casos será deseable reducir o eliminar la función efectora, por ejemplo, donde las interacciones ligando/receptor no son deseadas o en el caso de conjugados anticuerpo-fármaco.
En una realización, un anticuerpo anti-PD-1 comprende al menos una mutación en la región Fc que reduce la función efectora. Las posiciones de aminoácidos de la región Fc que pueden ser ventajosas para mutar con el fin de reducir la función efectora incluyen una o más de las posiciones 228, 233, 234 y 235, donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el esquema de numeración de IMGT.
En una realización, uno o ambos residuos de aminoácidos en las posiciones 234 y 235 pueden estar mutados, por ejemplo, de Leu a Ala (L234A/L235A). Estas mutaciones reducen la función efectora de la región Fc de los anticuerpos IgG1. Adicionalmente, o como alternativa, el residuo de aminoácido en la posición 228 puede estar mutado, por ejemplo, a Pro. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 233 puede estar mutado, por ejemplo, a Pro, el residuo de aminoácido en la posición 234 puede estar mutado, por ejemplo, a Val, y/o el residuo de aminoácido en la posición 235 puede estar mutado, por ejemplo, a Ala. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas de acuerdo con el esquema de numeración de IMGT®.
En algunas realizaciones, donde el anticuerpo es de la subclase IgG4, puede comprender la mutación S228P, es decir, que tiene una prolina en la posición 228, donde la posición del aminoácido está numerada de acuerdo con el esquema de numeración de IMGT®. Se sabe que esta mutación reduce el intercambio no deseado del brazo Fab.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, puede formar parte de una molécula de inmunoadhesión de mayor tamaño, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o de la parte de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región núcleo de estreptavidina para formar una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al., (1995)Human Antibodies and Hybridomas6:93-1 °1) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para producir moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al.,Mol. Immunol.31:1°47-1°58 (1994)).
En otra realización, se puede elaborar un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprenda todo o una parte de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención unido a otro polipéptido. En determinadas realizaciones, solo los dominios variables del anticuerpo anti-PD-1 están unidos al polipéptido. En determinadas realizaciones, el dominio VH de un anticuerpo anti-PD-1 está unido a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-PD-1 está vinculado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de tal manera que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí para formar un sitio de unión al antígeno. En otra realización preferida, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador de modo que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios). A continuación, el anticuerpo VH-enlazador-VL se une al polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos monocatenarios están unidos entre sí. Esto es útil si uno desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una sola cadena polipeptídica, o si uno desea crear un anticuerpo biespecífico.
Para crear un anticuerpo monocatenario (scFv), los fragmentos de ADN codificantes de VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3 (SEQ ID NO: 115), de modo que las secuencias de Vh y Vl pueden expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con los dominios VL y VH unidos por el enlazador flexible. Véase, por ejemplo, Bird et al.,Science242:423-426 (1988); Huston et al.,Proc. Nati. Acad. Sci.USA 85:5879-5883 (1988); y McCafferty et al.,Nature348:552-554 (1990). El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si solo se utilizan un único VH y VL; bivalente, si se utilizan dos VH y VL; o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL. Pueden generarse anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente a la PD-1 humana y a otra molécula, por ejemplo.
En otras realizaciones, se pueden preparar otros anticuerpos modificados utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-PD-1. Por ejemplo, "cuerpos kappa" (III et al.,Protein Eng.10:949-57 (1997)), "minicuerpos" (Martin et al.,EMBO J.13:5303-9 (1994)), "diacuerpos" (Holliger et al.,Proc. Nati. Acad. Sci.USA 90:6444-6448 (1993)), o "Janusinas" (Trauneckeret ai., EMBO J.10:3655-3659 (1991) y Trauneckeret ai., Int. J. Cancer(Suppl.) 7:51-52 (1992)) se pueden preparar utilizando técnicas de biología molecular convencionales siguiendo los hallazgos de la especificación.
Un anticuerpo anti-PD-1, o una parte de unión a antígeno, de la invención se puede derivatizar o unir a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o partes de los mismos se derivatizan de tal manera que la unión de PD-1 no se ve afectada negativamente por la derivatización o el etiquetado. En consecuencia, los anticuerpos y partes de anticuerpos de la invención pretenden incluir formas tanto intactas como modificadas de los anticuerpos anti-PD-1 humanos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención puede estar unido funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o parte de anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos que reaccionan de manera distinta separados por un espaciador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidrosuccinimida) u homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Estos enlazadores están comercializados, por ejemplo, por Pierce Chemical Company, Rockford, II.
Un anticuerpo anti-PD-1 también se puede derivatizar con un grupo químico tal como el polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo hidrato de carbono. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida en suero.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención también puede estar etiquetado. Como se usa en el presente documento, los términos "etiqueta" o "etiquetado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, la etiqueta es un marcador detectable, por ejemplo, mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de fragmentos de biotina que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En otra realización, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina. Diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glucoproteínas son conocidos en la técnica y pueden usarse. Ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como la toxina de la tos ferina, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas realizaciones, las etiquetas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden estar presentes en una forma neutra (incluidas las formas iónicas zwitter) o como una especie cargada positiva o negativamente. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden formar complejos con un contraión para formar una sal farmacéuticamente aceptable.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a un complejo que comprende uno o más anticuerpos y uno o más contraiones, en donde los contraiones se derivan de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables.
Moléculas de unión biespecíficas
En un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de unión biespecífica que tiene el dominio de unión de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención y la especificidad de unión de otro anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, otro anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento) o un anticuerpo que se dirige a una proteína diferente, tal como otra proteína de punto de control inmunitario, un antígeno del cáncer u otra molécula de la superficie celular cuya actividad media una enfermedad tal como el cáncer. Dichas moléculas de unión biespecíficas se conocen en la técnica y en otras partes del presente documento se dan ejemplos de diferentes tipos de moléculas de unión biespecíficas.
Moléculas y vectores de ácido nucleico
La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-PD-1 o partes de los mismos de la invención. En algunas realizaciones, diferentes moléculas de ácido nucleico codifican las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1 o una parte de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, la misma molécula de ácido nucleico codifica las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1, o una parte de unión a antígeno del mismo.
Una referencia a una secuencia de nucleótidos abarca su complemento salvo que se especifique lo contrario. Por tanto, una referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular debe entenderse que abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. El término "polinucleótido" como se refiere en el presente documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, las moléculas de ácido nucleico pueden aislarse.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector adecuado para expresar una de las cadenas de un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, de la invención. El término "vector", como se usa en el presente documento, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido, es decir, un pedazo circular de ADN bicatenario en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. En algunas realizaciones, el vector es un vector vírico, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. En algunas realizaciones, los vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). En otras realizaciones, los vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Más aún, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión").
La invención proporciona vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención, o una parte de unión a antígeno del mismo, la cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención, o una parte de unión a antígeno del mismo, o tanto la cadena pesada como la ligera de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención, o una parte de unión a antígeno del mismo. La invención proporciona además vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos y sondas de los mismos.
Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-PD-1 o una parte de unión a antígeno del mismo de la invención se puede aislar de cualquier fuente que produzca dicho anticuerpo o parte. En diversas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se aíslan de linfocitos B que expresan un anticuerpo anti-PD-1 aislado de un animal inmunizado con un antígeno PD-1 humano, o de una célula inmortalizada producida a partir de dicho linfocito B. Los métodos para aislar ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo son bien conocidos en la técnica. El ARNm se puede aislar y utilizar para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o en la clonación de ADNc de genes de anticuerpos. En determinadas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la invención puede sintetizarse en lugar de aislarse.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VH de un anticuerpo anti-PD-1, o una parte de unión a antígeno, de la invención unida en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena pesada de cualquier fuente. De forma similar, una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VL de un anticuerpo anti-PD-1, o una parte de unión a antígeno, de la invención unida en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena ligera de cualquier fuente.
En un aspecto adicional de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio variable de la cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) se pueden "convertir" en genes de anticuerpo de longitud completa. En una realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH o VL se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa mediante inserción en un vector de expresión que ya codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH) o constantes de la cadena ligera (CL), respectivamente, de modo que el segmento VH esté unido de forma funcional al uno o más segmentos CH dentro del vector y/o el segmento VL está unido de forma funcional al segmento CL dentro del vector. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa por unión, por ejemplo, ligamiento, de una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VH y/o VL a una molécula de ácido nucleico que codifica una región CH y/o CL usando técnicas convencionales de biología molecular. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa, a continuación, pueden expresarse a partir de una célula en la que se han introducido y puede aislarse el anticuerpo anti-PD-1.
Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar de forma recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-PD-1. Las moléculas de ácido nucleico también pueden usarse para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monocatenarios, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpo, como se describe en el presente documento.
En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención se utiliza como sonda o cebador de PCR para una secuencia de anticuerpo específica. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede utilizar como sonda en métodos de diagnóstico o como cebador de PCR para amplificar regiones de ADN que podrían utilizarse, entre otros, para aislar moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican dominios variables de anticuerpos anti-PD-1. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos provienen de dominios altamente variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de interés.
Las moléculas de ácido nucleico y los vectores pueden usarse para producir anticuerpos anti-PD-1 mutados. Los anticuerpos pueden estar mutados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar una mutación en una o más de las CDR para aumentar o disminuir la K<d>del anticuerpo anti-PD-1, para aumentar o disminuir koff, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Se pueden realizar una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe que ha cambiado en comparación con la línea germinal en un anticuerpo monoclonal de la invención. Las mutaciones pueden realizarse en una CDR o región estructural de un dominio variable, o en una región constante. Las mutaciones pueden realizarse en un dominio variable. Se pueden realizar una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe que ha cambiado en comparación con la línea germinal en una CDR o región estructural de un dominio variable de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la invención.
La(s) región(es) estructural(es) puede(n) mutarse para que las región(es)estructural(es) resultante(s) tenga(n) la secuencia de aminoácidos del gen de la línea germinal correspondiente. Se puede realizar una mutación en una región estructural o región constante para aumentar la semivida del anticuerpo anti-PD-1. Véase, por ejemplo, la Publicación de PCT WO 00/09560. También se puede realizar una mutación en una región estructural o región constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo y/o para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula. Un solo anticuerpo puede tener mutaciones en una o más de las CDR o regiones estructurales del dominio variable o en la región constante.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-1 de la invención, o partes de unión a antígeno de los mismos, se expresan insertando ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, obtenido como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresión de modo que los genes estén vinculados operativamente a secuencias de control de expresión necesarias, tales como secuencias de control transcripcional y traduccional. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus vegetales tales como el virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares. La secuencia codificante del anticuerpo se puede ligar a un vector de tal manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector cumplan su función prevista de regular la transcripción y la traducción de la secuencia codificante del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se pueden elegir para que sean compatibles con la célula de expresión hospedadora utilizada. La secuencia codificante de la cadena ligera del anticuerpo y la secuencia codificante de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados y se pueden unir operativamente a la misma o diferentes secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores). En una realización, ambas secuencias codificantes se insertan en el mismo vector de expresión y pueden estar vinculadas operativamente a las mismas secuencias de control de expresión (por ejemplo, un promotor común), para separar secuencias de control de expresión idénticas (por ejemplo, promotores), o para diferentes secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores). Las secuencias codificantes de anticuerpo se pueden insertar en el vector de expresión mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y en el vector o unión de extremos romos si no hay sitios de restricción).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia CH o CL de inmunoglobulina humana funcionalmente completa, con sitios de restricción adecuados modificados por ingeniería genética, de tal forma que puede insertarse y expresarse fácilmente cualquier secuencia de VH o VL, como se ha descrito anteriormente. Los genes que codifican HC y LC en dichos vectores pueden contener secuencias de intrones que darán como resultado rendimientos mejorados de proteínas de anticuerpos generales al estabilizar el ARNm relacionado. Las secuencias de intrones están flanqueadas por sitios donantes y aceptores de corte y empalme, que determinan dónde ocurrirá el corte y empalme del ARN. La ubicación de las secuencias de intrones puede ser en regiones variables o constantes de las cadenas de anticuerpos, o en regiones variables y constantes cuando se utilizan múltiples intrones. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en sitios cromosómicos nativos en dirección 3' de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de tal manera que el péptido señal se une en marco al extremo amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no de inmunoglobulina).
Además de los genes de cadenas de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes divulgados de la invención pueden portar secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadenas de anticuerpos en una célula hospedadora. Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador del CMV), virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores mamíferos fuertes tal como la inmunoglobulina nativa y los promotores de actina. Para una descripción adicional de los elementos reguladores víricos y las secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 5.168.062, 4.510.245 y 4.968.615. Los métodos para expresar anticuerpos en plantas, que incluyen una descripción de promotores y vectores, así como la transformación de plantas, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6.517.529. Los métodos de expresión de polipéptidos en células bacterianas o fúngicas, por ejemplo, células de levadura, también son bien conocidos en la técnica.
Además de los genes de cadenas de anticuerpos y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, el gen marcador seleccionable confiere normalmente resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula hospedadora en donde se ha introducido el vector. Por ejemplo, los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras-dhfr con selección/amplificación de metotrexato), el gen neo (para la selección de G418) y el gen de la glutamato sintetasa.
La expresión "secuencia de control de la expresión", como se usa en el presente documento, significa secuencias de polinucleótidos que son necesarias y/o suficientes para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, promotor y potenciador adecuadas; señales de procesamiento del ARN eficaces, tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia de consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" tiene por objeto incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.
Células hospedadoras y métodos de producción de anticuerpos y composiciones de anticuerpo
Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para producir las composiciones de anticuerpo y los anticuerpos y partes de unión a antígeno de los mismos de la invención. Una realización de este aspecto de la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo de la invención, que comprende proporcionar una célula hospedadora recombinante capaz de expresar el anticuerpo, cultivar dicha célula hospedadora en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y aislar el anticuerpo resultante. Los anticuerpos producidos mediante dicha expresión en dichas células hospedadoras recombinantes se denominan en el presente documento "anticuerpos recombinantes". La invención también proporciona células de descendencia de dichas células hospedadoras y anticuerpos producidos por las mismas.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, significa una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. La invención proporciona células hospedadoras que pueden comprender, por ejemplo, un vector de acuerdo con la invención descrita anteriormente. La invención también proporciona células hospedadoras que comprenden, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una parte de unión a antígeno de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o una parte de unión a antígeno de la misma, o ambas, de un anticuerpo anti-PD-1 o la parte de unión a antígeno del mismo de la invención. Debe entenderse que "célula hospedadora recombinante" y "célula hospedadora" significan no sólo la célula en cuestión sino también la descendencia de dicha célula. Debido a que en generaciones sucesivas pueden producirse determinadas modificaciones debido a mutaciones o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, ser idéntica a la célula precursora, pero aun así se incluye en el alcance de la expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-PD-1 y los vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden utilizar para la transfección de una adecuada célula hospedadora mamífera, vegetal, bacteriana o de levadura. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido de introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(de los) polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero mediante vectores víricos. Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 y 4.959.455. Los métodos de transformación de células vegetales son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, transformación mediada porAgrobacterium,transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación vírica. Los métodos de transformación de células bacterianas y de levadura también son bien conocidos en la técnica.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, células SP2, células HEK-293T, células 293 Freestyle (Invitrogen), células NIH-3T3, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549 y varias otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan mediante la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como las células Sf9 o Sf21. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde crecen las células hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Las células hospedadoras de las plantas incluyen, por ejemplo,Nicotiana, Arabidopsis,lenteja de agua, maíz, trigo, patata, etc. Las células hospedadoras bacterianas incluyenE. coliy especies deStreptomyces.Las células hospedadoras de levadura incluyenSchizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiaeyPichia pastoris.
Asimismo, la expresión de los anticuerpos de la invención, o partes de unión a antígeno de los mismos, a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse usando diversas técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es una estrategia habitual para potenciar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza total o parcialmente en relación con las patentes EP 0216 846, 0256055, 0323997 y 0338841.
Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos tengan patrones de glicosilación diferentes entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas del ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento, forman parte de la presente invención, independientemente del estado de glicosilación de los anticuerpos y, de manera más general, independientemente de la presencia o ausencia de modificación(es) postraduccional(es).
Composiciones farmacéuticas
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende como principio activo (o como único principio activo) un anticuerpo anti-PD-1, o una parte de unión a antígeno del mismo, o una composición de anticuerpo anti-PD-1 de la invención. La composición farmacéutica puede comprender cualquier composición de anticuerpo anti-PD-1, o anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, de la invención. En algunas realizaciones, las composiciones están destinadas a la mejora, prevención y/o tratamiento de un trastorno relacionado con PD-1 y/o cáncer. Como se usa en el presente documento, un trastorno relacionado o mediado por PD-1 se refiere a un trastorno, enfermedad o condición que mejora o se ralentiza en su progresión, por modulación de la actividad PD-1. En algunas realizaciones, las composiciones están destinadas a la activación del sistema inmunitario. En determinadas realizaciones, las composiciones están destinadas a la mejora, prevención y/o tratamiento del cáncer originado en tejidos como piel, pulmón, intestino, colon, ovario, cerebro, próstata, riñón, tejidos blandos, el sistema hematopoyético, cabeza y cuello, hígado, vejiga, mama, estómago, útero y páncreas.
Generalmente, los anticuerpos, las porciones de unión a antígeno de los mismos y las moléculas de unión biespecíficas de la invención son adecuadas para ser administradas como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, como se describe a continuación.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán uno o más anticuerpos anti-PD-1, o partes de unión, o moléculas de unión biespecíficas de la invención, por ejemplo, uno o dos anticuerpos anti-PD-1, partes de unión, o moléculas de unión biespecíficas. En una realización, la composición comprende un único anticuerpo anti-PD-1 de la invención, o parte de unión del mismo.
En otra realización, la composición farmacéutica puede comprender al menos un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 o parte, y uno o más anticuerpos adicionales que se dirigen a uno o más receptores de superficie celular relevantes, por ejemplo, uno o más receptores relevantes para el cáncer.
El término "excipiente" se usa en el presente documento para describir cualquier ingrediente distinto al(a los) compuesto(s) de la invención. La elección del(de los) excipiente(s) dependerá en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad, y la naturaleza de la forma farmacéutica. Como se usa en el presente documento, un "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Otros ejemplos de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y los métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Se pueden encontrar dichas composiciones y métodos para su preparación, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición (Mack Publishing Company, 1995). Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP (normas correctas de fabricación).
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o comercializarse en grandes cantidades, como una dosis unitaria individual o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad aislada de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosificación del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de una dosificación de este tipo.
Cualquier método para administrar péptidos, proteínas o anticuerpos aceptado en la técnica pueden emplearse adecuadamente para los anticuerpos y partes de unión a antígeno de la invención.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son normalmente adecuadas para la administración parenteral. Como se usa en el presente documento, la "administración parenteral" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la ruptura física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la ruptura del tejido, lo que, en general, da lugar a la administración directa en el torrente sanguíneo, en el músculo, o en un órgano interno. La administración parenteral incluye, por tanto, pero sin limitación, la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra en el tejido y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluya, pero sin limitación, inyecciones subcutáneas, intraperitoneales, intramusculares, intraesternales, intravenosas, intraarteriales, intratecales, intraventriculares, intrauretrales, intracraneales, intratumorales e intrasinoviales o infusiones; y técnicas de infusión dialítica renal. También se contempla la perfusión regional. Las realizaciones particulares incluyen las vías intravenosas y subcutáneas.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración oral comprenden normalmente el principio activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Tales formulaciones se pueden preparar, envasar o comercializar en una forma adecuada para la administración en embolada o para la administración continua. Las formulaciones inyectables se pueden preparar, envasar o comercializar en formas farmacéuticas unitarias, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contengan un conservante. Las formulaciones para la administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y similares. Dichas formulaciones pueden comprender adicionalmente uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. En una realización de una formulación para la administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, polvo o granulado) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las formulaciones parenterales también incluyen soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, hidratos de carbono y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de 3 a 9) pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse de forma más adecuada como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para utilizar junto con un vehículo adecuado, tal como agua apirógena, estéril. Las formas de administración parenteral ilustrativas incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas de propilenglicol o dextrosa. Dichas formas farmacéuticas pueden tamponarse adecuadamente, si se desea. Otras formulaciones administrables por vía parenteral que son útiles incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina o en una preparación liposómica. Las formulaciones para la administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Por ejemplo, en un aspecto, se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el anticuerpo anti-PD-1, o su parte de unión a antígeno, la molécula de unión biespecífica o la composición de anticuerpo anti-PD-1 en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones mediante la incorporación del principio activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución del mismo previamente esterilizada por filtración. Puede mantenerse la fluidez adecuada de una solución, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Se puede lograr la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina, y/o mediante el uso de recubrimientos de liberación modificada (por ejemplo, recubrimientos de liberación lenta).
Los anticuerpos de la invención también se pueden administrar por vía intranasal o por inhalación, normalmente en forma de polvo seco (solo, como una mezcla, o como una partícula componente mixta, por ejemplo, mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado) de un inhalador de polvo seco, como un aerosol pulverizado desde un envase, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente, un atomizador que utiliza la electrohidrodinámica para producir una niebla fina) o nebulizador presurizado, con o sin el uso de un propulsor adecuado, o como gotas nasales.
El envase, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador presurizado generalmente contiene una solución o suspensión de un anticuerpo de la invención que comprende, por ejemplo, un agente adecuado para dispersar, solubilizar o prolongar la liberación del principio activo, un propulsor(es) como disolvente.
Antes de usar en una formulación de polvo seco o suspensión, el producto farmacéutico generalmente se microniza a un tamaño adecuado para su administración por inhalación (normalmente menos de 5 micrones). Esto puede lograrse mediante cualquier método de trituración adecuado, tal como la molienda por chorro en espiral, la molienda por chorro en lecho fluido, el procesamiento por fluido supercrítico para formar nanopartículas, la homogeneización a alta presión o el secado por pulverización.
Las cápsulas, los blísteres y los cartuchos para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para que contengan una mezcla en polvo del compuesto de la invención, una base de polvo adecuada y un modificador de rendimiento.
Una formulación de solución adecuada para su uso en un atomizador que utiliza electrohidrodinámica para producir una niebla fina puede contener una dosis adecuada del anticuerpo de la invención por actuación y el volumen de actuación puede variar, por ejemplo, de 1 pl a 100 pl.
Las formulaciones para la administración inhalada/intranasal pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
En el caso de inhaladores de polvo seco y aerosoles, la unidad de dosificación se determina mediante una válvula que suministra una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con la invención generalmente están dispuestas para administrar una dosis medida o "bocanada" de un anticuerpo de la invención. La dosis diaria total normalmente se administrará en una dosis única o, más habitualmente, en dosis divididas a lo largo del día.
Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la invención también pueden formularse para una administración por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, para que el compuesto entre en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto ingresa al torrente sanguíneo directamente desde la boca.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen sistemas sólidos, semisólidos y líquidos tales como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen partículas múltiples o nanopartículas, líquidos o polvos; pastillas para chupar (incluida las rellenas de líquido); chicles; geles; formas farmacéuticas de rápida dispersión; películas; óvulos; pulverizadores; y parches bucales o mucoadhesivos.
Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, soluciones, jarabes y elixires. Estas formulaciones pueden emplearse como rellenos en cápsulas blandas o duras (fabricadas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) y normalmente comprenden un vehículo, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa, o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. Las formulaciones líquidas también pueden prepararse mediante la reconstitución de un sólido, por ejemplo, de un sobre.
Usos terapéuticos de los anticuerpos y composiciones de la invención
En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1, y partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones anti-PD-1 y las moléculas de unión biespecíficas de la invención se utilizan para mejorar o activar el sistema inmunitario en un ser humano que lo necesita. En algunas realizaciones, el paciente está inmunodeprimido. Por ejemplo, un médico puede aumentar la actividad anticancerígena del sistema inmunitario del propio paciente administrándole un anticuerpo anti-PD-1, una parte de unión a anticuerpo, una composición o una molécula de unión biespecífica de la presente invención, solo o junto con otros agentes terapéuticos (secuencial o concurrentemente). El anticuerpo anti-PD-1 o parte, la composición o la molécula de unión biespecífica modula la actividad de PD-1 en células inmunitarias, lo que da como resultado una mejora de la inmunidad anticancerígena. En determinadas realizaciones, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, la composición o la molécula de unión biespecífica se utiliza en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cánceres que se originan en tejidos tales como piel, pulmón, intestino, colon, ovario, cerebro, próstata, riñón, tejidos blandos, el sistema hematopoyético, cabeza y cuello, hígado, vejiga, mama, estómago, útero y páncreas, y cualquier cáncer u otra afección que dependa de la actividad de PD-1 y/o en la que el paciente exprese o sobreexprese PD1, PD-L1 y/o PD-L2. Los cánceres tratados con los anticuerpos anti-PD-1, las partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones anti-PD-1 y/o las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden incluir, por ejemplo, melanoma (tal como melanoma avanzado o melanoma irresecable o metastásico), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de vejiga, carcinoma escamocelular de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer con alta inestabilidad de microsatélites, carcinoma hepatocelular, mesotelioma, carcinoma de células de Merkel, glioma, mieloma múltiple, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Hodgkin y carcinoma de células renales (RCC).
En algunas realizaciones, los cánceres tratados con los anticuerpos anti-PD-1, las partes de unión a antígeno, las composiciones anti-PD-1 y/o las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden incluir, por ejemplo, melanoma avanzado o metastásico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, glioblastoma, glioma, tumores neuroendocrinos, cáncer pulmonar de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma hepatocelular, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario superior, cáncer esofágico, cáncer de la unión gastroesofágica, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de colon, carcinoma colorrectal, mieloma múltiple, sarcomas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, síndrome mielodisplásico, cáncer nasofaríngeo, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma linfocítico pequeño, cáncer de ovario, cáncer gastrointestinal, cáncer peritoneal primario, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer urotelial, leucemia/linfoma de linfocito T asociado al HTLV, cáncer de próstata, cáncer urogenital, meningioma, cáncer adrenocortical, gliosarcoma, cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, carcinoma de células basales de la piel, cáncer del apéndice, cáncer de las vías biliares, cáncer de glándulas salivales, cáncer de células de Merkel avanzado, cáncer urológico, cáncer de huesos, cáncer torácico, cáncer del tracto respiratorio, carcinoma adenoideo quístico, cáncer de cuello uterino, astrocitoma, cordoma, neoplasias hemáticas, neuroblastoma, cáncer de la cavidad oral, carcinoma cutáneo de células escamosas, cáncer de tiroides, sarcoma de Kaposi, cáncer de ano, cáncer de vesícula biliar, cáncer tímico, cáncer uterino, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, mesotelioma o tumores sólidos. El cáncer puede ser, por ejemplo, en un estadio temprano, intermedio, tardío o con metástasis.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-1, las partes de unión a antígeno, las composiciones y/o las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden utilizarse para tratar infecciones virales y/o parasitarias, por ejemplo, donde los patógenos inhiben la respuesta inmunitaria del hospedador. Por ejemplo, el patógeno puede ser, por ejemplo, VIH, hepatitis (A, B o C), virus del papiloma humano (HPV), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), adenovirus, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sincicial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus variolovacunal, virus linfotrófico de linfocitos T humano (HTLV), virus del dengue, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus de John Cunningham (JC), virus de la encefalitis arboviral, virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), gripe, herpes,Giardia,paludismo,Leishmania, Staphylococcus aureus,oPseudomonas aeruginosa.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-1, las partes de unión a antígeno, las composiciones y/o las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden utilizarse para tratar a un paciente que es, o está en riesgo de ser, inmunodeprimido (por ejemplo, debido a quimioterapia o radioterapia).
"Tratar", "que trata" y "tratamiento" se refieren a un método para aliviar o eliminar un trastorno biológico y/o al menos uno de sus síntomas concomitantes. Como se usa en el presente documento, "aliviar" una enfermedad, trastorno o afección significa reducir la gravedad y/o frecuencia de aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. Asimismo, las referencias en el presente documento a "tratamiento" incluyen referencias a tratamiento curativo, paliativo y profiláctico.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del agente terapéutico que se está administrando que aliviará hasta cierto punto uno o más de los síntomas del trastorno que se está tratando. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anticancerígeno puede, por ejemplo, dar como resultado reducción del tumor, aumento de la supervivencia, eliminación de células cancerosas, disminución de la progresión de la enfermedad, reversión de la metástasis u otros criterios clínicos deseados por los profesionales sanitarios.
Los anticuerpos anti-PD-1, o partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones o las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden administrarse solas o junto con uno o más fármacos o anticuerpos (o como cualquier combinación de los mismos). Las composiciones farmacéuticas, los métodos y usos de la invención también abarcan realizaciones de combinaciones (administración conjunta) con otros agentes activos, como se detalla a continuación.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "administración conjunta", "coadministrado" y "junto con", que se refieren a los anticuerpos, y partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones y las moléculas de unión biespecíficas de la invención con uno o más agentes terapéuticos adicionales, pretenden significar, y se refieren e incluyen lo siguiente:
- administración simultánea de dicha combinación de anticuerpo/parte de unión a antígeno/composición de anticuerpo/molécula de unión biespecífica de la invención y agente(s) terapéutico(s) a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma farmacéutica única que libera dichos componentes sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente,
- administración sustancialmente simultánea de dicha combinación de anticuerpo/parte de unión a antígeno/composición de anticuerpo/molécula de unión biespecífica de la invención y agente(s) terapéutico(s) a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan separados entre sí en formas farmacéuticas separadas que son tomadas sustancialmente al mismo tiempo por dicho paciente, tras lo cual dichos componentes se liberan sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente,
- administración secuencial de dicha combinación de anticuerpo/parte de unión a antígeno/composición de anticuerpo/molécula de unión biespecífica de la invención y agente(s) terapéutico(s) a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan separados entre sí en formas farmacéuticas separadas que dicho paciente toma en momentos consecutivos con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, tras lo cual dichos componentes se liberan en momentos sustancialmente diferentes a dicho paciente; y
- administración secuencial de dicha combinación de anticuerpo/parte de unión a antígeno/composición de anticuerpo/molécula de unión biespecífica de la invención y agente(s) terapéutico(s) a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma farmacéutica única que libera dichos componentes de una manera controlada, tras lo cual se liberan de manera concurrente, consecutiva y/o superpuesta en el mismo momento y/o en momentos diferentes a dicho paciente, donde cada parte puede administrarse por la misma vía o por una diferente.
Los anticuerpos, y partes de unión a antígeno del mismo, las composiciones de anticuerpo y las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden administrarse sin tratamientos terapéuticos adicionales, es decir, como terapia independiente (monoterapia). Como alternativa, el tratamiento con los anticuerpos, y partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones y las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden incluir al menos un tratamiento terapéutico adicional (terapia combinada), por ejemplo, otro agente inmunoestimulante, un agente anticancerígeno, un agente antivírico o una vacuna (por ejemplo, una vacuna contra un tumor). En algunas realizaciones, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, la composición o la molécula de unión biespecífica puede coadministrarse o formularse con otro medicamento/fármaco para el tratamiento del cáncer. El tratamiento terapéutico adicional puede comprender, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, antineoplásico o antiangiogénico, un anticuerpo anticancerígeno diferente y/o radioterapia.
Al combinar los anticuerpos, las partes de unión a antígeno, las composiciones o las moléculas de unión biespecíficas de la invención con agentes que se sabe que inducen la diferenciación terminal de células cancerosas, el efecto puede mejorarse aún más. Dichos compuestos pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en ácido málico, ácidos trans-retinoicos, ácidos cis-retinoicos, fenilbutirato, factor de crecimiento nervioso, dimetilsulfóxido, vitamina D3 en forma activa, receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma, 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato, hexametilen-bis-acetamida, factor de crecimiento transformante beta, ácido butírico, AMP cíclico y vesnarinona. En algunas realizaciones, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácido retinoico, fenilbutirato, ácido todo-trans-retinoico y vitamina D en forma activa.
Artículos farmacéuticos que comprenden un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno del mismo, una composición o una molécula de unión biespecífica de la invención y al menos otro agente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, antineoplásico o antiangiogénico) se puede utilizar como tratamiento combinado para la administración simultánea, separada o sucesiva en la terapia del cáncer. El otro agente puede ser cualquier agente adecuado para el tratamiento del cáncer particular en cuestión, por ejemplo, un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes alquilantes, por ejemplo, derivados de platino, tales como cisplatino, carboplatino y/u oxaliplatino; alcoides vegetales, por ejemplo, paclitaxel, docetaxel y/o irinotecán; antibióticos antitumorales, por ejemplo, doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, bleomicina, actinomicina, luteomicina y/o mitomicina; inhibidores de la topoisomerasa, tales como topotecán; y/o antimetabolitos, por ejemplo, fluorouracilo y/u otras fluoropirimidinas.
Un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno del mismo, una composición de anticuerpo o una molécula de unión biespecífica de la invención también se pueden usar junto con otras terapias anticancerígenas, tales como vacunas, citocinas, inhibidores enzimáticos, compuestos inmunoestimulantes y terapias con linfocitos T. En el caso de una vacuna, puede ser, por ejemplo, una vacuna proteica, peptídica o de ADN que contiene uno o más antígenos que son relevantes para el cáncer que se está tratando, o una vacuna que comprende células dendríticas junto con un antígeno. Las citocinas adecuadas incluyen, por ejemplo, IL-2, IFN-gamma y GM-CSF. Un ejemplo de un tipo de inhibidor enzimático que tiene actividad anticancerígena es un inhibidor de la indol-2,3-dioxigenasa (IDO), por ejemplo, 1-metil-D-triptófano (1-D-MT). La terapia de linfocitos T adoptivos se refiere a diversas técnicas de inmunoterapia que implican la expansión o ingeniería de los propios linfocitos T de los pacientes para que reconozcan y ataquen sus tumores.
También se contempla que un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno del mismo, una composición de anticuerpo o una molécula de unión biespecífica de la invención se puede utilizar en terapia complementaria en relación con inhibidores de la tirosina quinasa. Estos son moléculas sintéticas, principalmente derivadas de quinazolina, de bajo peso molecular que interactúan con el dominio de tirosina quinasa intracelular de los receptores e inhiben la fosforilación del receptor inducida por ligando al competir por el sitio de unión intracelular de Mg-ATP.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, la composición o la molécula de unión biespecífica se puede utilizar junto con otro medicamento/fármaco que media la activación del sistema inmunitario, que incluye, pero sin limitación, un agente que modula la expresión o actividad de A2AR, BTLA, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, CD27, CD28, CD40, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1 y/o CEACAM-5), GAL9, GITR, HVEM, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, LAG-3, OX40, TIGIT, TIM-3, TG<f>R beta, VISTA, LILRB2, CMTM6 y/o 2B4. En determinadas realizaciones, el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una de las moléculas anteriores. En determinadas realizaciones, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, la composición o la molécula de unión biespecífica de la invención se puede administrar junto con un inhibidor de CTLA-4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 tal como tremelimumab o ipilimumab). En una realización, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, la composición o la molécula de unión biespecífica de la invención se puede administrar junto con ipilimumab.
En determinados aspectos, los anticuerpos, y partes de unión a antígeno, las composiciones y las moléculas de unión biespecíficas de la invención se pueden administrar junto con otro inhibidor de la vía de PD-1, que puede dirigirse a PD-1 o a uno o más de sus ligandos. Ejemplos de dichos inhibidores incluyen otros anticuerpos anti-PD1, anticuerpos anti-PD-LI y anticuerpos anti-PD-L2. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD1, o parte de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo biespecífico o una composición de anticuerpo de la invención se pueden administrar junto con pembrolizumab y/o nivolumab.
Se entiende que los anticuerpos, y partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones de anticuerpo y las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden usarse en un tratamiento como se describe en el presente documento. La invención también proporciona kits y artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos, y partes de unión a antígeno de los mismos, las composiciones de anticuerpo y/o las moléculas de unión biespecíficas descritos en el presente documento.
Dosis y vía de administración
Los anticuerpos, o partes de unión a antígeno del mismo, las composiciones y las moléculas de unión biespecíficas de la invención se administrarán en una cantidad eficaz para el tratamiento de la afección en cuestión, es decir, a las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios para lograr un resultado deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con los factores tal como la afección particular que se esté tratando, la edad, el sexo y el peso del paciente, y si los anticuerpos se administran como tratamiento independiente o junto con uno o más tratamientos adicionales contra el cáncer.
Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección en embolada, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos/pacientes que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención está dictada generalmente por y depende directamente de (a) las características únicas del agente quimioterapéutico y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Por tanto, el experto en la materia apreciaría, en función de la divulgación proporcionada en el presente documento, que la dosis y la pauta posológica se ajustan de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica terapéutica. Es decir, la dosis máxima tolerable se puede establecer fácilmente, y también se puede determinar la cantidad eficaz que proporciona un beneficio terapéutico detectable para un paciente, al igual que los requisitos temporales para administrar cada agente para proporcionar un beneficio terapéutico detectable al paciente.
Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la intensidad de la afección a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Cabe entender además que, para cualquier sujeto en particular, deben ajustarse las pautas posológicas específicas con el paso del tiempo de acuerdo con las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. Asimismo, la pauta posológica con las composiciones de esta invención puede basarse en una diversidad de factores, incluido el tipo de enfermedad, la edad, el peso, el sexo, la afección médica del paciente, la gravedad de la afección, la vía de administración y el anticuerpo particular empleado. Por tanto, la pauta posológica puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera rutinaria usando métodos convencionales. Por ejemplo, las dosis pueden ajustarse en función de los parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. Por tanto, la presente invención abarca el aumento escalonado de la dosis intrapaciente según lo determine el experto en la materia. La determinación de las dosis y los regímenes adecuados son bien conocidos en la técnica relevante y se entenderá que los expertos en la materia lo abarcarán una vez que se proporcionen los hallazgos divulgados en el presente documento.
Se contempla que una dosis adecuada de un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, una composición o una molécula de unión biespecífica de la invención estará en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0,5-50 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 1-20 mg/kg. El anticuerpo, la parte de unión a antígeno, la composición o la molécula de unión biespecífica puede administrarse, por ejemplo, en una dosis de al menos 0,25 mg/kg, por ejemplo, al menos 0,5 mg/kg, tal como al menos 1 mg/kg, por ejemplo, al menos 1,5 mg/kg, tal como al menos 2 mg/kg, por ejemplo, al menos 3 mg/kg, tal como al menos 4 mg/kg, por ejemplo, al menos 5 mg/kg; y, por ejemplo, hasta un máximo de 50 mg/kg, tal como hasta un máximo de 30 mg/kg, por ejemplo, hasta un máximo de 20 mg/kg, tal como hasta un máximo de 15 mg/kg. La administración normalmente se repetirá a intervalos adecuados, por ejemplo, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas, y durante el tiempo que considere apropiado el médico responsable, quien podrá opcionalmente aumentar o disminuir la dosis según sea necesario.
Una cantidad eficaz para la terapia tumoral puede medirse por su capacidad para estabilizar la progresión de la enfermedad y/o mejorar los síntomas en un paciente, y preferentemente para revertir la progresión de la enfermedad, por ejemplo, reduciendo el tamaño del tumor. La capacidad de un anticuerpo, una parte de unión a antígeno, una composición o una molécula de unión biespecífica de la invención para inhibir el cáncer se puede evaluar mediante ensayos¡n vitro,por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, así como en modelos animales adecuados que sean predictivos de la eficacia en tumores humanos. Se seleccionarán regímenes posológicos adecuados para proporcionar una respuesta terapéutica óptima en cada situación particular, por ejemplo, administración en bolo único o en infusión continua, con posibilidad de ajustarse la dosis según las exigencias de cada caso.
Usos y composiciones de diagnóstico
Los anticuerpos de la presente invención también son útiles en procesos de diagnóstico (por ejemplo,in vitro, ex vivo).Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar para detectar y/o medir el nivel de PD-1 en una muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, saliva u orina). Los métodos de detección y medición adecuados incluyen métodos inmunológicos tales como citometría de flujo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistología. La invención abarca además kits (por ejemplo, kits de diagnóstico) que comprenden los anticuerpos de la invención.
Salvo que se definan de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. A continuación, se describen métodos y/o materiales ilustrativos. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.
Generalmente, la nomenclatura usada en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química analítica, química orgánica sintética, química médica y farmacéutica, y química de proteína y ácido nucleico e hibridación que se describen en el presente documento son las ya conocidas y usadas frecuentemente en la técnica. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en la técnica o como se describen en el presente documento.
Asimismo, salvo que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. A lo largo de esta especificación y realizaciones, las palabras "tienen" y "comprenden", o variaciones tales como "tiene", "que tiene/n", "comprende", o "que comprende/n", implican la inclusión de un elemento integrante o grupo de elementos integrantes declarado, pero no la exclusión de cualquier otro elemento integrante o grupo de elementos integrantes.
Aunque en el presente documento se citan varios documentos, dicha citación no constituye una admisión de que alguno de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica.
Para que esta invención pueda ser mejor comprendida, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1. Generación y cribado de repertorios de anticuerpos anti-PD-1
Materiales y métodos
Ratas OmniRat® (Osborn et al.,J. Inmunol.2013, 190(4):1481-90), una cepa de rata modificada genéticamente de OMT (Open Monoclonal Technology, Inc.) capaz de producir anticuerpos humanos, se inmunizaron con antígenos PD-1 humanos, de cynomolgus o de ratón. La clonación de genes de anticuerpos a partir de linfocitos B secretores de anticuerpos (ASC) clasificados por células individuales derivados de ratas se realizó mediante tecnología de investigación de anticuerpos Symplex™ (Meijer et al.,J. Mol. Biol.2006, 358(3):764-72; US 7.749.697; WO 2008/104184).
Una biblioteca de anticuerpos Symplex™ se preparó a partir de linfocitos B clasificados de una sola célula de ratas OMT inmunizadas, donde la biblioteca contiene pares codificantes de VH y VL cognados para cada linfocito B clasificado. Las construcciones de expresión del repertorio de anticuerpos codificaron inmunoglobulinas completamente humanas en formato IgG1 que presentaban dos mutaciones (L234A/L235A) que se sabe que reducen la función efectora de la región Fc de los anticuerpos IgG1 (Hezareh et al.,J. Virol.75(24): 12161-8 (2001)).
Las células CHO-S se sometieron a transfección en formato de 384 pocillos con construcciones de expresión para mostrar expresión de PD-1 humana, de cynomolgus o ratón utilizando el reactivo MAX Freestyle™ (Invitrogen). Por otro lado, otra población celular se sometió a transfección con un vector de control que codifica la proteína irrelevante humana VEGFR2 y posteriormente se utilizó como control negativo. Para permitir una configuración de cribado multiplexada, células de control etiquetadas con succinimidil éster de carboxifluoresceína de intensidad intermedia (CFSEinter), células transfectadas con cyno PD-1 etiquetadas con CFSE de alta intensidad (CFSEalta) y células transfectadas con PD-1 humana no etiquetadas, se mezclaron en una proporción de 1:1:1, a una densidad de 1x10E6 células por ml. En placas de 384 pocillos, se mezclaron 40 pl de esta mezcla de células con 10 pl de sobrenadante que contenía anticuerpos y el anticuerpo unido a las células se reveló mediante la adición de anticuerpo secundario AF647 de cabra anti-IgG humana (H+L) (Molecular Probes, Cat. N.° A21445). En paralelo, se cribaron los anticuerpos según su unión a PD-1 humana (CFSEpos) y de ratón (CFSEneg) en una configuración similar. Las muestras se adquirieron mediante citometría de flujo de alto rendimiento (dispositivo de cribado iQue®, Intellicyt) y los datos se analizaron utilizando el programa informático ForeCyt® mediante el trazado de CFSE frente a la unión de IgG (AF647). Las coincidencias ("hits") primarias específicas de PD-1 se identificaron como clones de anticuerpo que se unen tanto a células transfectadas con PD-1 humana (CSFEneg) como de cynomolgus (CFSEalta), pero no a células control (CFSEinter), y se recopilaron números de placa y coordenadas de placa para la selección de coincidencias y el posterior análisis de secuencia. Una serie de coincidencias primarias que muestran una reactividad adicional hacia la PD-1 de ratón en el segundo cribado (CFSEneg) también se seleccionaron para un análisis más detallado.
Resultados
Las figuras 1(a) - 1(d) muestran gráficos de puntos de citometría de flujo representativos para cuatro clones de anticuerpos que presentan diferente reactividad hacia los ortólogos de PD-1:
(a) un clon de anticuerpo que se une de forma no específica a las células CHO-S,
(b) un clon de anticuerpo que se une específicamente a las células humanas transfectadas con PD-1 únicamente,
(c) un clon de anticuerpo que se une específicamente a la PD-1 humana y de cynomolgus, y
(d) un clon de anticuerpo que se une a las tres especies de PD-1 probadas en el cribado.
Los gráficos de puntos superiores en cada uno de (a), (b), (c) y (d) representan una primera ronda de cribado que prueba los anticuerpos para la unión a PD-1 humana (huPD1) y PD-1 de cynomolgus (cynoP01) en comparación con células de control negativo (neg). Los gráficos de puntos inferiores representan una segunda ronda de cribado de anticuerpos para su unión a la PD-1 de ratón (moPD1) y a la PD-1 humana (huPD1). El eje x (horizontal) muestra CFSE y el eje y (vertical) muestra la unión de IgG humana.
Ejemplo 2. Secuencias de anticuerpos
Las coincidencias del cribado se analizaron mediante secuenciación de ADN y se extrajeron las secuencias de ADN que codificaban los anticuerpos. Se secuenciaron 488 coincidencias primarias que presentaron reactividad cruzada con PD-1 humana y de cynomolgus. Esto reveló que el repertorio de coincidencias de anti-PD-1 contenía 254 anticuerpos únicos que representaban 140 grupos genéticos. Los clones de anticuerpos seleccionados se expresaron individualmente y se probaron funcionalmente como se describe a continuación. Doce anticuerpos que presentan actividad funcional en ensayosin vitrose describen a continuación en el presente documento. La numeración de las secuencias proteicas de los doce dominios VH y VL del anticuerpo se muestra en la Tabla 1. La numeración de secuencia de las regiones constantes de inmunoglobulina (cadena pesada de Ig (IgHC) con mutaciones L234A/L235A y cadena ligera kappa de Ig (IgKV)) utilizadas para clonar los genes de VH y VL variables se muestra en la Tabla 2. La numeración de secuencia de las CDR de los doce anticuerpos funcionales se muestra en la Tabla 3. Las secuencias de CDR en el presente documento se determinaron de acuerdo con las definiciones de IMGT® para CDR1 y CDR2. Para la<c>DR3 de la cadena pesada y ligera, las definiciones en el presente documento incluyen un residuo de aminoácido adicional en el extremo amino de IMGT-CDR3 (Cys).
continuación
Tabla 2. Numeración de las secuencias de aminoácidos y ADN de la región constante del anticuerpoNombre de la secuencia SEQ ID NO. de ADN SEQ ID NO. de proteína
Tabla 3. SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y las DR1 DR l n li r l ni r ni-PD-1
Ejemplo 3. Mutaciones de la región estructural en las secuencias del anticuerpo
Se realizó la alineación de las secuencias de aminoácidos de VH y VL del Ejemplo 2 con las secuencias de la línea germinal humana para revelar los genes de la línea germinal de los que se originan las secuencias de VH y VL. La Tabla 4 muestra la asignación del gen de la línea germinal V y J más cercana para VH y VL de cada clon, así como la información sobre mutaciones de la región estructural como se describe a continuación.
Dado que los genes de anticuerpos se aislaron mediante RT-PCR utilizando tecnología de investigación de anticuerpos Symplex™ (Mejier et al.,J. Mol. Biol.358:764-772 (2006); WO 2005/042774) con cebadores degenerados, los seis aminoácidos iniciales son propensos a mutaciones que no surgen durante la maduración de la secuencia del anticuerpo. Por consiguiente, estas mutaciones derivadas del cebador se pueden mutar nuevamente a la secuencia de la línea germinal sin riesgo de reducir la afinidad de unión. Los números y sustituciones de aminoácidos específicos de VH y VL en estas secuencias variantes "corregidas por Symplex" se muestran en la Tabla 4. Por otro lado, los anticuerpos que albergan hipermutaciones somáticas en las regiones estructurales de dominios variables, es decir, mutaciones en VH o VL fuera de las CDR, se pueden cambiar de nuevo a la secuencia de la línea germinal V o J más cercana. Los números y sustituciones de aminoácidos específicos en las regiones estructurales del anticuerpo que pueden cambiarse a los de la línea germinal en estas secuencias variantes "germinales" también se muestran en la Tabla 4. Será evidente que las mutaciones de la variante "germinal" indicadas en la Tabla 4 (véase las columnas "Número de mutaciones de la región estructural de VH en la variante germinal" y "Mutaciones de mutaciones de la región estructural de VH en la variante germinal") incluyen cualquier mutación "corregida por Symplex", así como las mutaciones fuera de las seis posiciones iniciales de aminoácidos.
Como se ha indicado anteriormente, no se espera que la alteración de mutaciones derivadas de cebadores degenerados en los primeros seis aminoácidos de cada secuencia de VH o VL deteriore las propiedades de unión en comparación con el anticuerpo original. Por lo tanto, se prefiere que los anticuerpos anti-PD-1 de la invención incluyan las mutaciones "corregidas por Symplex" indicadas en las siguientes tablas.
En cuanto a las mutaciones de "variante germinal" que están fuera de las seis posiciones iniciales de aminoácidos de cada secuencia, se pueden seleccionar una cualquiera o más de estas mutaciones. La determinación de si una mutación individual tiene un efecto negativo sobre las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar preparando secuencias de VH y VL variantes germinales con la mutación indicada y comparando las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo con las del progenitor con las secuencias originales o corregidas por Symplex correspondientes. En el caso de que se observe una reducción en la afinidad de unión u otra propiedad de unión alterada, las variantes se pueden, por ejemplo, probar utilizando una matriz VH/VL 2x2 con una variante corregida por Symplex y una variante germinal de las cadenas pesada y ligera de cada anticuerpo, es decir, en este caso cuatro combinaciones para cada anticuerpo. Esto permite determinar si una u otra, o ambas, de las secuencias de VH y VL germinales contribuyen a cualquier propiedad de unión alterada observada. Como alternativa o adicionalmente, se puede probar una serie de anticuerpos correspondientes en los que se evitan las mutaciones de la variante germinal única para determinar mutaciones específicas que influyen en la unión de la variante germinal que tiene todas las mutaciones enumeradas.
La Tabla 5 muestra los números de la secuencia de VH y VL para las secuencias originales, así como las variantes germinales y corregidas por Symplex correspondientes. De los números de la Tabla 5 se desprende claramente que en algunos casos no hay diferencia entre la secuencia original y la secuencia corregida por Symplex, o entre la secuencia corregida por Symplex y la secuencia germinal. Las mutaciones en los residuos estructurales de la línea germinal se basan en las definiciones de IMGT. En la lista de secuencias adjunta, las sustituciones de aminoácidos resultantes están subrayadas y marcadas en negrita.
T l 4 r 1: M i n l r i n r r l l n i VH
continuación
T l 4 r 2: M i n l r i n r r l l n i VL
Tabla 5. SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de VH y VL de los anticuerpos anti-PD-1, incluidas las v ri n rmin l rr i r m l x
continuación
Ejemplo 4. Análisis citométrico de flujo de anticuerpos anti-PD-1 para la actividad de bloqueo de PD-L1
Este ejemplo describe el ensayo de los anticuerpos anti-PD-1 para la actividad de bloqueo de PD-L1 mediante citometría de flujo.
Métodos
Se investigó la actividad de bloqueo del ligando PD-L1 en un ensayo celular, en el que se expresó de forma recombinante PD-1 humana en células CHO-S y se analizó la unión de la proteína quimérica PD-L1-Fc humana etiquetada con R-PE (R-ficoeritrina) mediante citometría de flujo. La proteína quimérica PD-L1-Fc recombinante disponible en el mercado (R&D Systems, EE. UU.) se conjugó con R-PE utilizando el kit de conjugación de R-ficoeritrina Lightning-Link® (Innova Biosciences, Reino Unido). Las células CHO-S fueron sometidas a transfección transitoriamente para expresar PD-1 humana. A continuación, las células se incubaron con 50 pl de anticuerpo anti-PD-1 a 20 pg/ml en hielo, seguido de la adición de 50 pl de PD-L1 -Fc etiquetado con R-PE a aproximadamente 3,4 pg/ml (concentración final de 16,4 nM) con incubación adicional durante 2o minutos adicionales (concentración final de anticuerpo anti-PD-1: 10 pg/ml). El anticuerpo unido se detectó utilizando el anticuerpo de cadena ligera anti-IgG humana conjugado con APC (aloficocianina). La unión de PD-L1 y el anticuerpo anti-PD-1 se cuantificó mediante citometría de flujo detectando la fluorescencia de R-PE y APC, respectivamente.
Resultados
Los resultados del experimento de competencia se presentan en las figuras 2(a) -2(h), donde el eje X (horizontal) muestra la unión de PD-L1 y el eje Y (vertical) muestra la unión de IgG humana. Todos los anticuerpos anti-PD-1 probados fueron capaces de inhibir la interacción de PD-1 con PD-L1 a una concentración final de anticuerpos de 10 pg/ml. La unión de PD-L1 a las células que expresaban PD-1 en presencia de un anticuerpo no específico se utilizó como control negativo para el bloqueo de PD-L1. Además, se presenta un gráfico representativo de la unión de PD-L1 en presencia de un anticuerpo no bloqueante.
Ejemplo 5. Medición de las afinidades del anticuerpo de PD-1 contra el antígeno de ECD de PD-1 humana y de cynomolgus
Este ejemplo demuestra cómo doce anticuerpos anti-PD-1 funcionales presentan una fuerte afinidad de unión por la PD-1 humana, con K<d>en el intervalo de nM bajo a pM intermedio. Los mismos anticuerpos también reaccionan de forma cruzada con la PD-1 de cynomolgus con Kd en el intervalo de nM intermedio a bajo. Los anticuerpos 18201 y 18400 también reaccionan de forma cruzada con PD-1 de ratón con K<d>en el intervalo de nM intermedio o bajo.
Métodos
El análisis de unión cinética se realizó mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) utilizando un Microspotter de flujo continuo (CFM, Wasatch Microfluidics, EE. UU.) combinado con un instrumento Ibis MX96 SPR (IBIS Technologies, Países Bajos). El análisis de imágenes por resonancia de plasmón de superficie se realizó en sensores SPR Ga-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Países Bajos). Se diluyeron anticuerpos anti-PD-1 expresados en formato IgG<1>LALA (es decir, que tiene las mutaciones L234A/L235A) hasta 2,5 nM en PBS-T (1x PBS con Tween 20 al 0,05 %, pH 7,4). Los anticuerpos se capturaron en un Ga-hu-IgG Fc SensEye® durante 15 minutos utilizando un Microspotter de flujo continuo (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, US). Después de la captura, el SensEye® se colocó en el biosensor IBIS MX96 y los anticuerpos se fijaron químicamente a la superficie del sensor utilizando el kit FixIt (Ssens BV, Países Bajos). El análisis cinético se realizó aplicando una serie de titulación cinética (Karlsson et. al.,Anal. Biochem.349(1):136-47 (2006)), donde se inyectó el antígeno PD-1 monomérico en concentraciones crecientes de 2 nM a 100 nM sin aplicación de etapas de regeneración de superficie después de cada inyección de antígeno. Se probó la unión al eCd de PD-1 humana (Acro Biosystems, n.° de cat. PD1-H52219), al ECD de PD-1 de ratón (Sino Biological, n.° de cat. 50124-M08H) y al ECD de PD-1 de cynomolgus (Acro Biosystems, n.° de cat. PD1-C5223) en tres experimentos separados. La asociación del antígeno se realizó durante 15 minutos y la disociación del antígeno se realizó durante 60 minutos. El análisis cinético se realizó a 25 °C. Una vez finalizado, las respuestas de unión registradas se ajustaron a un modelo de unión Langmuir 1:1 simple con el programa informático Scrubber 2 para el cálculo de las constantes de la velocidad de asociación (kon). o ka), la velocidad de disociación (koff o kü) y la afinidad (K<d>).
Resultados
Los resultados de la resonancia plasmónica de superficie (SPR) se muestran a continuación en la Tabla 6. Generalmente, los anticuerpos fueron de alta afinidad y todos los anticuerpos probados reaccionaron de forma cruzada con la PD-1 de cynomolgus. Los anticuerpos 18201 y 18400 también reaccionaron de forma cruzada con PD-1 de ratón, lo que indica que los epítopos reconocidos por estos dos anticuerpos eran únicos en comparación con los otros anticuerpos de PD-1, incluidos los anticuerpos de referencia, pembrolizumab y nivolumab, que no reaccionaron de forma cruzada con la PD-1 de ratón. Estas propiedades son ventajosas debido a que permiten que los anticuerpos se prueben directamente en modelos murinos o primates no humanos antes de probarlos en sujetos humanos.
Tabla 6. Cinética de la unión de los anticuerpos anti-PD-1 a ECD de PD-1 humana, de cynomolgus o de ratónm i rr n n i l m n rfi i PR . N. . = n ni n
continuación
Ejemplo 6. Evaluación funcional in vitro de anticuerpos monoclonales anti-PD-1
Este ejemplo demuestra cómo funcionan los doce anticuerpos anti-PD-1 en dos ensayos funcionales diferentes: el ensayo de sangre completa con enterotoxina estafilocócica B (SEB) y una reacción linfocítica mixta unidireccional (MLR). La capacidad de los doce mAb anti-PD-1 para estimular la producción de IL-2 en el ensayo de sangre completa tratada con SEB o la producción de interferón gamma (IFN-y) en el ensayo MLR unidireccional se evaluó como se describe a continuación.
Métodos
SEB es un superantígeno que se une a las moléculas de MHC de clase II y a regiones Vp específicas de los receptores de linfocitos T (TCR) e impulsa la estimulación no específica de los linfocitos T. Esto da como resultado la activación/proliferación de linfocitos T policlonales y la liberación de citocinas, incluidas IL-2 y IFN-y. Se añadió SEB a 1 |jg/ml a la sangre completa y, después de dos días de cultivo, se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de IL-2 mediante
ELISA regular.
En el ensayo MLR unidireccional, las células dendríticas (CD) y los linfocitos T CD4-positivos (CD4+) aislados de dos donantes sanos diferentes se cocultivaron para inducir una reacción específica de aloantígeno, lo que da como resultado la producción de citocinas y la activación/proliferación de linfocitos T. Las células dendríticas se diferenciaron de monocitos CD14+ a los seis días de cultivo con 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 20 ng/ml de interleucina-4 (IL-4), y se mezclaron en una proporción de 1:10 con linfocitos T CD4+ aislados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de material de donante sano. Después de 5 días de cultivo, se recolectaron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de IFN-<y>utilizando el ensayo de citocinas de electroquimioluminiscencia a escala meso (MSD).
Las curvas de dosis-respuesta se generaron mediante diluciones dobles de los anticuerpos con una concentración inicial de 50 jg/ml.
Resultados
Las curvas de dosis-respuesta de los doce anticuerpos en el ensayo de sangre completa con SEB y el ensayo

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-PD-1 o una parte de unión a antígeno del mismo, en donde dicho anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de
a) SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente;
b) SEQ ID NO: 78 y 10, respectivamente;
c) SEQ ID NO: 9 y 88, respectivamente; o
d) SEQ ID NO: 78 y 88, respectivamente;
en donde en SEQ ID NO: 9, X en la posición 5 es V o Q, X en la posición 59 es T, X en la posición 76 es R o K y X en la posición 83 es M o L.
2. El anticuerpo anti-PD-1 de la reivindicación 1, en donde:
a) el anticuerpo es del isotipo IgG subclase IgG1, opcionalmente en donde uno o ambos residuos de aminoácido en las posiciones 234 y 235 están mutados a Ala, o
b) el anticuerpo es del isotipo IgG subclase IgG4, opcionalmente en donde el residuo de aminoácido en la posición 228 está mutado a Pro,
en donde los residuos se han numerado de acuerdo con el sistema de numeración Eu.
3. El anticuerpo anti-PD-1 de la reivindicación 1, que comprende:
a) una cadena pesada (HC) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 26 y una cadena ligera (LC) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y 28;
b) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y 26 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y 28;
c) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 26 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y 28; o
d) una HC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y 26 y una LC que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y 28.
4. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. Molécula(s) de ácido nucleico aislada(s) que comprende(n) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la cadena ligera, del anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. Vector(es) que comprende(n) la(s) molécula(s) de ácido nucleico aislada(s) de la reivindicación 5, en donde dicho(s) vector(es) comprende(n) además una secuencia de control de expresión.
7. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la cadena ligera, del anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
8. Un método para producir el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende proporcionar una célula hospedadora de la reivindicación 7, cultivar dicha célula hospedadora en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, o parte de unión a antígeno, y aislar el anticuerpo, o parte de unión a antígeno, resultante.
9. Molécula de unión biespecífica que tiene un dominio de unión que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, de la reivindicación 1.
10. El anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la molécula de unión biespecífica de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente.
11. El anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, o la molécula de unión biespecífica para su uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal y linfoma de Hodgkin.
12. El anticuerpo anti-PD-1, o parte de unión a antígeno, o la molécula de unión biespecífica para su uso de la reivindicación 10 u 11, en donde dicho uso es junto con la administración al paciente de un agente inmunoestimulante, una vacuna, un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico, un agente antiangiogénico, un inhibidor de la tirosina cinasa, un agente que media la activación del sistema inmunitario, un inhibidor de la vía de PD-1 o radioterapia.
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