ES2986469T3 - Tratamiento y prevención de glioblastoma - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de un antagonista selectivo del receptor β2 adrenérgico para el tratamiento de gliomas. En particular, la invención se refiere al uso de un derivado de alcanolamina o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento de un glioblastoma en un paciente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento y prevención de glioblastoma

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al campo de los productos terapéuticos ya la prevención de glioma, más específicamente al tratamiento ya la prevención de glioblastoma.

Antecedentes de la invención

Un glioma es un tipo de cáncer que comienza en el cerebro o la columna vertebral. Se denomina glioma porque surge a partir de células gliales y/o sus precursores. El sitio más común de los gliomas es el cerebro. Los gliomas se clasifican por el tipo de célula, el grado y la ubicación. Los gliomas se nombran según el tipo específico de célula al que se asemejan más estrechamente. Los principales tipos de gliomas son:

- Ependimomas, gliomas derivados de ependimocitos.

- Astrocitomas, gliomas derivados de astrocitos; el glioblastoma multiforme (GBM) es el astrocitoma más común.

- Oligodendrogliomas, gliomas derivados de oligodendrocitos.

- Gliomas mixtos, tales como oligoastrocitomas, que contienen células de diferentes tipos de glía.

Los gliomas se categorizan adicionalmente según su grado, que viene determinado por la evaluación patológica del tumor. Por tanto, puede distinguirse entre gliomas de bajo grado que son bien diferenciados (no anaplásicos), benignos y presagian un mejor pronóstico para el paciente; y gliomas de alto grado, que son indiferenciados o anaplásicos, malignos y conllevan un peor pronóstico.

De los numerosos sistemas de clasificación en uso, el más común es el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el astrocitoma.

El tratamiento para gliomas cerebrales depende de la ubicación, del tipo de célula y del grado de malignidad. A menudo, el tratamiento es un enfoque combinado, que usa cirugía, radioterapia y quimioterapia. La radioterapia es en forma de radiación de haz externo o el enfoque estereotáctico usado radiocirugía. Los tumores de médula espinal pueden tratarse mediante cirugía y radiación. La temozolomida es un fármaco quimioterápico que puede atravesar eficazmente la barrera hematoencefálica y está usándose en terapia. A pesar de estos enfoques, la mayoría de los pacientes con glioma de alto grado sucumben a su enfermedad. Son necesarias nuevas intervenciones terapéuticas contra dianas críticas para mejorar el desenlace en esta población de pacientes.

El glioblastoma multiforme (GBM, grado IV según la OMS) es un tumor cerebral altamente agresivo que se presenta como uno de los dos subtipos con historiales clínicos y perfiles moleculares distintos. El GBM primario se presenta de manera aguda como enfermedad de alto grado y el subtipo de GBM secundario evoluciona a partir de la lenta progresión de una enfermedad de bajo grado (Dolecek T.A.et al.2012. Neuro Oncol 14 (supl. 5):v1-v49.

Los gliomas malignos, tales como el GBM, son con diferencia el cáncer cerebral más común encontrado en adultos y uno de los más difíciles de tratar. Incluso con opciones agresivas de tratamiento simple y multimodal tales como cirugía, quimioterapia, radiación e inhibidores de molécula pequeña, la supervivencia ha permanecido sin cambios durante las últimas tres décadas con una mediana de supervivencia de menos de un año después del diagnóstico. Los motivos para el fracaso de los tratamientos convencionales son multifactoriales, incluyendo la naturaleza altamente infiltrativa/invasiva del GBM, la limitación de la administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica y el parénquima neural, y la heterogeneidad genética que da como resultado una resistencia intrínseca a los tratamientos disponibles y el aumento de clones resistentes agresivos. Por tanto, existe el requisito de nuevas opciones de tratamiento.

Breve descripción de la invención

Los inventores de la presente invención han hallado que ICI 118.551 disminuye la viabilidad de la línea celular de glioblastoma U-87 (figura 1) e inhibe la formación y la expansión de glioesferas, bajo los procedimientos de cultivo aceptados para la subpoblación de células madre cancerosas, a partir de glioblastoma humano (figura 2). Adicionalmente, los inventores han demostrado que ICI 118.551 disminuye la expresión de biomarcadores de“stemness"(adquisición de las propiedades que caracterizan a una célula madre: autorrenovación y pluripotencia) en glioblastoma, y aumenta los marcadores de diferenciación neural (figura 3) y retrasa la progresión tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón (figura 4).

Por tanto, la invención se refiere a un antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso en el tratamiento y/o la prevención de glioma.

Descripción detallada de las figuras

Figura 1.- ICI 118.551 es activo como agente antitumoral que disminuye la viabilidad celular en la línea celular de glioblastoma y que incluye la subpoblación de células madre. A: la línea celular U-87 expresa receptores betaadrenérgicos de tipo 2 , tal como se muestra mediante microscopía confocal usando un anticuerpo monoclonal contra receptores P2-adrenérgicos humanos (Abcam). B: ICI 118.551 disminuye la viabilidad de la línea celular de glioblastoma humano U-87, o bien cuando se cultiva en suspensión líquida como oncoesferas (glioesferas, células madre) o bien en adhesión. La viabilidad se cuantificó mediante luminiscencia usando el kit ATP-Glo de Promega. C: la expresión del receptor P2-adrenérgico en la línea celular de glioblastoma humano U-87 se confirmó por la expresión de ARNm mediante PCR cuantitativa en cultivos 3D como glioesferas (HUVEC como control positivo para la expresión del receptor P2-adrenérgico).

Figura 2.- ICI 118.551 inhibe la formación y la expansión de glioesferas a partir de la línea celular de glioblastoma humano U-87. A: fotografías de la formación de glioesferas después de 72 horas de tratamiento farmacológico. Las células U-87 se cultivaron en medio para la formación de glioesferas, y se trataron con vehículo (control, parte izquierda), o con ICI 118.551, y propranolol a diferentes concentraciones desde 10 hasta 100 |iM. Cuando las células se trataron con bloqueantes beta, hay una inhibición progresiva de la formación de glioesferas, que es patente desde 10 |iM en adelante. B: experimento de ensayo de dilución límite (ELDA) para la formación de oncoesferas en presencia de diferentes concentraciones de<i>C<i>118.551 y propranolol. A partir de los diagramas, resulta claro que el factor de dilución aumenta después del tratamiento con ICI118.551 y con propranolol, en comparación con el control. Esto puede ser muy bien una consecuencia de la sensibilidad de células madre de las células madre de U-87 a ICI 118.551 ya propranolol.

Figura 3.- ICI 118.551 y propranolol disminuyeron la expresión de biomarcadores de“stemness"en la línea celular de glioblastoma U-87, pero aumentaron los marcadores de diferenciación neural. A: el tratamiento de U-87 con ICI 118.551 y propranolol durante 48 horas disminuye la expresión de genes asociados a la“stemness"como GD3 sintasa, ALDH1, prominina (CD133), Sox2 y Nanog, mientras que B: favorece la expresión de genes implicados en la diferenciación de células neurales (MAP2, GFAP y nestina). La expresión de los ARNm correspondientes se midió mediante RT-qPCR.

Figura 4.- ICI 118.551 y propranolol retrasan la progresión tumoral de xenoinjertos de U-87 en ratones inmunodeprimidos NSG. A: xenoinjerto usando células adherentes de U-87: a los ratones (n=30) se les inocularon 106 células de la línea celular de glioblastoma U-87, en el flanco, como xenoinjertos. El volumen tumoral se midió cada 3 días. En A, cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en 3 grupos (n= 9-10). Un grupo se trató diariamente con 10 mg/kg de peso corporal de propranolol, otro grupo con la misma dosis de ICI118.551, y el tercer grupo sólo con vehículo (DMSO). Los fármacos se inyectaron por vía intraperitoneal. No se observaron efectos adversos. B: xenoinjerto usando glioesferas de U-87: a los ratones se les inocularon 105 esferoides a partir de la línea celular de glioblastoma U-87. Los ratones se dividieron en 3 grupos de 9-10 animales y se trataron inmediatamente después del xenoinjerto durante 5 días consecutivos con 3 mg/kg de peso corporal de propranolol, o ICI 118.551, o sólo vehículo. Los tumores se midieron desde el momento en que eran lo suficientemente grandes como para dimensionarse.

Figura 5.- Las células U-87 se cultivaron en DMEM-FCS al 10 % y se incubaron durante 48 horas con cantidades crecientes de ICI y propranolol durante 48 horas. La expresión de ARNm-21 disminuye notablemente después de la incubación con ICI en comparación con propranolol (parte izquierda). Además, ICI aumenta los niveles de expresión de dianas de ARNm-21 tales como PDCD4, un agente proapoptótico (parte central), y PTEN, un supresor de glioblastoma (parte derecha).

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso en el tratamiento y/o la prevención de glioma.

Alternativamente, la invención se refiere a un antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de glioma en un paciente que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico.

El término “receptor P2-adrenérgico” o “P2AR”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una clase A de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que responde a hormonas y neurotransmisores difundibles y reside predominantemente en los músculos lisos. Hay dos grupos principales de receptores adrenérgicos, a y P, con varios subtipos:

- Los receptores a tienen los subtipos a1 (un receptor acoplado a Gq) y a2 (un receptor acoplado a Gi).

- Los receptores P tienen los subtipos P1, P2 y P3. Los tres están vinculados a las proteínas Gs, que a su vez están vinculadas a la adenilato ciclasa. La unión de agonistas a estos receptores provoca un aumento de la concentración intracelular del segundo mensajero AMPc. La unión de agonistas al receptor P2-adrenérgico da como resultado la relajación de los músculos lisos.

El término “antagonista del receptor P2-adrenérgico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que se une a un receptor P2-adrenérgico y carece de cualquier capacidad sustancial para activar el propio receptor. El término “antagonista del receptor P2-adrenérgico” incluye tanto antagonistas neutros como agonistas inversos. Un “antagonista neutro” es un compuesto que bloquea la acción del agonista pero no tiene ningún efecto sobre la actividad intrínseca o espontánea del receptor. Un “agonista inverso” puede tanto bloquear la acción del agonista en el receptor como atenuar la actividad constitutiva del receptor. El término “antagonista” también incluye antagonistas competitivos, que son fármacos que se unen al mismo sitio que el ligando natural; antagonistas no competitivos, que se unen a un sitio diferente en el receptor que el ligando natural; antagonistas reversibles, que se unen a y desunen del receptor a velocidades determinadas por la cinética del receptor-ligando; y antagonistas irreversibles, que se unen permanentemente al receptor o bien formando un enlace covalente con el sitio activo o bien simplemente uniéndose tan fuertemente que la velocidad de disociación es efectivamente nula.

El término “antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico”, tal como se usa en el presente documento, significa un antagonista que es selectivo para los receptores P2-adrenérgicos con respecto a los receptores Pi-adrenérgicos. En una realización particular, un antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico muestra una potencia al menos 10 veces mayor en la unión a los receptores P2-adrenérgicos que a los Pi-adrenérgicos, es decir, tiene una razón de selectividad P2/P1 de al menos 10. Más preferiblemente, el antagonista selectivo del receptor P2 tendrá una razón de selectividad P2/P1 de al menos 50. Todavía más preferiblemente, el antagonista selectivo del receptor P2 tendrá una razón de selectividad P2/P1 de al menos 123. La afinidad de diversos agentes activos por los receptores P2-adrenérgicos y P1-adrenérgicos puede determinarse evaluando subtipos de células y/o tejidos que contienen una mayoría de receptores P2 (por ejemplo, proceso ciliar de conejo, hígado de rata, pulmón o plexo coroideo de gato), tejidos que contienen una mayoría de receptores P1 (por ejemplo, corazón de gato y cobaya), y tejidos que contienen una mezcla (por ejemplo, tráquea de cobaya). Los métodos para determinar la selectividad de unión relativa para estos diferentes tipos de tejidos se dan a conocer extensamente en O'Donnell y Wanstall, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmaco., 308, 183-190 (1979), Nathanson, Science. 204, 843-844 (1979), Nathanson, Life Sciences, 26, 1793-1799 (1980), Minnemanet al.,Mol. Pharmacol., 15, 21-33 (1979a), y Minnemanet al.,Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 211, 502-508 (1979).

Se conocen un número significativo de compuestos que tienen actividad antagonista selectiva del receptor P2-adrenérgico adecuados para su uso en esta invención. En una realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico es el derivado de alcanolamina de fórmula I

en la que R1 es un grupo alquilo de hasta 6 átomos de carbono que está ramificado en el átomo de carbono a,

en la que R2 es un alquilo de hasta 3 átomos de carbono,

en la que R3 es hidrógeno, un halógeno o un alquilo de hasta tres átomos de carbono y

en la que n es 1 ó 2 ,

o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo.

El término “grupo alquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a grupos lineales y ramificados acíclicos que pueden derivarse de alcanos, y que tienen la fórmula --CnH2n+1 mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno.

El término “halógeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.

R1 puede ser, por ejemplo, isopropilo ot-butilo. En una realización particular, R1 es isopropilo.

R2 puede ser, por ejemplo, metilo o etilo. En una realización particular, R2 es metilo.

R3 puede ser, por ejemplo, hidrógeno, cloro, bromo, metilo o etilo. En una realización particular, R3 es metilo.

En una realización particular, n es 1.

En una realización particular, R1 es isopropilo y R2 es metilo. En una realización particular, R1 es isopropilo y R3 es metilo. En una realización particular, R1 es isopropilo y n es 1. En una realización particular, R2 es metilo y R3 es metilo. En una realización particular, R2 es metilo y n es 1. En una realización particular, R3 es metilo y n es 1.

En una realización particular, R1 es isopropilo y R2 y R3 son metilo. En otra realización particular, R1 es isopropilo, R2 es metilo y n es 1. En otra realización particular, R1 es isopropilo, R3 es metilo y n es 1. En una realización particular, R2 y R3 son metilo y n es 1.

En una realización más particular, R1 es isopropilo, R2 y/o R3 son metilo y n es 1.

En una realización incluso más particular, el derivado de alcanolamina tiene la fórmula II:

Este compuesto de fórmula II también se conoce como ICI 118.551 y su nombre químico es eritro-D,L-1-(metilinden-4-iloxi)-3-isopropilaminobutan-2-ol. ICI 118.551 tiene una razón de selectividad P2/P1 de al menos 123, tal como se determina y notifica en Life Sciences, 27, 671 (1980) y Bilskiet al.,J. Cardiovasc. Pharmacol., 5, 430-437 (1983).

Se observará que el derivado de alcanolamina de fórmula I presenta dos átomos de carbono asimétricos, concretamente aquellos del grupo -CHOH- y del grupo -CHR2-, y que, por tanto, puede existir en dos formas diastereoisoméricas racémicas, las formastreoyeritro,y cuatro formas ópticamente activas, que son los isómeros (+) y (-) de cada una de las formas racémicas. Debe entenderse que esta invención abarca una cualquiera de estas formas isoméricas que presentan una actividad antagonista selectiva del receptor P2-adrenérgico tal como se definió anteriormente, siendo una cuestión de conocimiento general común cómo puede aislarse cualquier isómero particular y cómo puede medirse cualquier actividad bloqueante selectiva del receptor P2-adrenérgico que pueda presentar.

Debe entenderse que, en general, un isómero óptico que tiene la configuración absoluta {S) del grupo -CHOH- es más activo como agente bloqueante P2-adrenérgico que el isómero correspondiente que tiene la configuración absoluta {R). También se sabe que, en general, el isómeroeritroes más selectivo por P2 que el isómerotreocorrespondiente, pero que ambos isómerostreo y eritrode los compuestos de la presente invención presentan la selectividad requerida.

El término “sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier sal de adición de ácido que, tras su administración al receptor, puede proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto tal como se describe en el presente documento. Preferiblemente, tal como se usa en el presente documento, el término “sal farmacéuticamente aceptable” significa aprobada por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerada en la Farmacopea de EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. La preparación de sales puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos e ilustrativos de una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del derivado de alcanolamina de fórmula I son, por ejemplo, una sal derivada de un ácido inorgánico, por ejemplo, un clorhidrato, bromhidrato, fosfato o sulfato, o una sal derivada de un ácido orgánico, por ejemplo un oxalato, lactato, tartrato, acetato, salicilato, citrato, benzoato, p-naftoato, adipato o 1,1-metilen-bis(2-hidroxi-3-naftoato), o una sal derivada de una resina sintética ácida, por ejemplo, una resina de poliestireno sulfonado. En una realización particular, la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable es clorhidrato. En una realización más particular, el antagonista selectivo del antagonista del receptor P2-adrenérgico es la sal de clorhidrato del compuesto de fórmula II.

En otra realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se selecciona de una lista que comprende los siguientes compuestos:

- Butoxamina, correspondiente a un compuesto que tiene el nombre químico clorhidrato de DL-eritro-a-(2,5-dimetoxifenil)-p-t-butilaminopropanol. La determinación de la selectividad de la butoxamina por P2 se notifica en O'Donnell y Wanstall, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmaco., 308, 183-190 (1979), que notifica una razón de selectividad P2/P1 de al menos 17.

- H35/25, correspondiente a 1-(4’-metilfenil)-b-2,2-1-isopropilaminopropanol.

- Prenalterol, que tiene la fórmula estructural

La actividad antagonista selectiva del receptor p2-adrenérgico se describe por Johansson y Waldeck, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 32(9), 659-660.

- Diversos 4- y 5-[2-hidroxi-3-(isopropilamino)propoxi]bencimidazoles tal como se describe por Crookset al.,J. Med. Chem., 22(2), 210-214 (1979).

- 1-(t-butil-amino-3-ol-2-propil)oximino-9-fluoreno, tal como se describe por Imbset al.,Br. J. Pharmacol.

60(3), 357-362 (1977).

- Diversas 2-(alfa-hidroxiarilmetil)-3,3-dimetilaziridinas tal como se describe por Jainet al.,J. Med. Chem., 21(1), 68-72 (1978).

El término “tratamiento”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier procedimiento, acción, aplicación, terapia, o similar, en el que a un sujeto (o paciente), incluyendo un ser humano, se le proporciona ayuda médica con el objetivo de mejorar el estado del sujeto, directa o indirectamente, o ralentizar la progresión de una afección o un trastorno en el sujeto, o aliviar al menos un síntoma de la enfermedad o el trastorno bajo tratamiento. El término “prevención”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de un compuesto de la invención en una fase inicial o temprana de la enfermedad, o también para prevenir su aparición.

El término “glioma”, tal como se usa en el presente documento, es un tipo común de tumor que se origina en el cerebro. Los gliomas se originan en las células gliales que rodean y mantienen a las neuronas en el cerebro, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos y ependimocitos. Los gliomas pueden clasificarse según el tipo específico de célula con el que comparten características histológicas, pero no necesariamente a partir del cual se originan. Los principales tipos de gliomas son:

- Ependimomas: ependimocitos.

- Astrocitomas: astrocitos (el glioblastoma multiforme es un astrocitoma maligno y el tumor cerebral primario más común entre los adultos).

- Oligodendrogliomas: oligodendrocitos.

- Glioma de tronco encefálico: se desarrolla en el tronco encefálico.

- Glioma de nervio óptico: se desarrolla en o alrededor del nervio óptico.

Los gliomas mixtos, tales como los oligoastrocitomas, contienen células de diferentes tipos de glía.

El término “glioma”, tal como se usa en el presente documento, abarca todos los tipos de gliomas, incluyendo ependimomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, glioma de tronco encefálico, glioma de nervio óptico y oligoastrocitomas. En una realización particular, el glioma comprende una subpoblación de células madre cancerosas. Tal como se da a conocer en el presente documento, las células madre cancerosas (CSC) son una pequeña subpoblación de células dentro de los tumores con capacidades de autorrenovación, diferenciación y tumorigenicidad. En la técnica se sabe que pueden usarse diferentes biomarcadores para identificar CSC, tales como CD-44, gremlina-1, Id-1, TGFb2, BMP, OLIG2, SOX-2, ZEB1, Wnt5a, Pax-6 , miRNSA-451, GD3S, ALDH1. En una realización particular, el glioma es un astrocitoma. El término “astrocitoma” incluye astrocitomas de grado I, II, III y IV, según la clasificación de tumores del sistema nervioso central de la OMS. En una realización más particular, el astrocitoma es astrocitoma de grado IV, también conocido como “glioma” o “glioblastoma multiforme”. Los gliomas también pueden categorizarse adicionalmente según su grado, que vienen determinado por la evaluación patológica del tumor. La evaluación neuropatológica y el diagnóstico de muestras de tumores cerebrales se realizan según la clasificación de tumores del sistema nervioso central de la OMS. Según su grado, pueden clasificarse como:

• Los gliomas de bajo grado [grado II según la OMS] son bien diferenciados (no anaplásicos); estos tienden a mostrar tendencias benignas y presagian un mejor pronóstico para el paciente.

• Los gliomas de alto grado [grados III-IV según la OMS] son indiferenciados o anaplásicos; estos son malignos y conllevan un peor pronóstico.

En una realización particular, el glioma es un glioma de alto grado.

El glioma puede ser un tumor primario o un tumor recurrente. El término “primario” o “no recurrente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tumor que aparece por primera vez en un sujeto, es decir, un tumor que no se ha detectado y tratado previamente. El término “recurrente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tumor que ha aparecido después de un periodo libre de enfermedad, después del tratamiento y después de un periodo de tiempo durante el cual no se detectaba el cáncer. En una realización particular, el glioma es un glioma primario o no recurrente.

En una realización preferida, el glioma se caracteriza por tener una expresión aumentada del receptor P2-adrenérgico en comparación con un valor de referencia.

“Valor de referencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un valor de laboratorio usado como referencia para los valores/datos obtenidos a partir de las muestras. El valor de referencia (o nivel de referencia) puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior y/o inferior, una serie de valores, un valor promedio, una mediana, un valor medio o un valor expresado por referencia a un valor de control o referencia. Un valor de referencia puede basarse en el valor obtenido a partir de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido a partir de una muestra de estudio pero obtenido en un punto de tiempo previo. El valor de referencia puede basarse en un gran número de muestras, tal como los valores obtenidos en una población de muestras, o basarse en un conjunto de muestras que incluye o excluye la muestra que va a someterse a prueba. En una realización particular, el valor de referencia es la expresión del receptor P2-adrenérgico en un sujeto sano. En otra realización particular, el valor de referencia es la expresión del receptor P2-adrenérgico en un sujeto que no padece glioma.

El aumento de la expresión del receptor P2-adrenérgico puede ser de al menos el 2 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 % con respecto a un valor de referencia.

Los métodos adecuados para determinar la expresión del receptor P2-adrenérgico incluyen, sin limitación, ensayos convencionales para determinar los niveles de expresión de ARNm, tales como qPCR, RT-PCR, análisis de protección de<a>R<n>, transferencia de tipo Northern, inmunotransferencia por puntos de ARN, hibridaciónin situ,tecnología de microalineamientos, métodos basados en etiquetas tales como análisis en serie de la expresión génica (SAGE), incluyendo variantes tales como LongSAGE y SuperSAGE, microalineamientos, hibridaciónin situcon fluorescencia (FISH), incluyendo variantes tales como Flow-FISH, qFiSH y FISH de doble fusión (D-FISH), y similares.

El término “paciente” o “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal, preferiblemente un mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano de cualquier edad o raza. En la presente invención, el paciente padece un glioma, más particularmente astrocitoma, incluso más particularmente glioblastoma.

El término “paciente con glioma”, tal como se usa en el presente documento, significa que el paciente ha sido diagnosticado con glioma. El diagnóstico de glioma puede implicar:

• Historial médico y examen físico: incluye preguntas sobre los síntomas del paciente, historial de salud personal y familiar.

• Examen neurológico: este examen somete a prueba la visión, la audición, el habla, la fuerza, la sensación, el equilibrio, la coordinación, los reflejos y la capacidad para pensar y recordar. También puede incluir un examen de los ojos del paciente en busca de cualquier hinchazón provocada por la presión en el nervio óptico, que conecta los ojos al cerebro.

• Exploraciones del cerebro: la obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) y la tomografía computarizada (TAC), que usan ordenadores para crear imágenes detalladas del cerebro, son las exploraciones más comunes usadas para diagnosticar tumores cerebrales.

• Biopsia: este es un procedimiento para retirar una pequeña muestra del tumor para su examen bajo un microscopio. Dependiendo de la ubicación del tumor, la biopsia y la extirpación del tumor pueden realizarse al mismo tiempo.

Para su administración al paciente, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico de la invención, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, puede formularse en una composición farmacéutica.

El término “composición farmacéutica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico de la invención, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad suficiente del compuesto para proporcionar el efecto deseado y generalmente vendrá determinada, entre otras cosas, por las características del propio compuesto y el efecto terapéutico que va a lograrse. También dependerá del sujeto que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad que padece dicho sujeto, la forma de dosificación elegida, la vía de administración, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben considerarse únicamente como guías para el experto en la técnica, que debe ajustar las dosis dependiendo de las variables mencionadas anteriormente.

Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos para cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos para su uso según la invención pertenece a la experiencia común de los expertos en la técnica. En general, la dosificación necesaria para proporcionar un tratamiento eficaz, que puede ser ajustada por un experto en la técnica, variará dependiendo de la edad, la salud, el estado físico, el sexo, la dieta, el peso, el grado de alteración del receptor, la frecuencia de tratamiento, la naturaleza y el estado de la lesión, la naturaleza y el grado de deterioro o enfermedad, el estado patológico del sujeto, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como la actividad, la eficacia, el perfil farmacocinético y toxicológico del compuesto particular usado, si se usa un sistema de administración de fármacos y si el compuesto se administra como parte de una combinación de fármacos. La cantidad del compuesto para su uso según la invención que es terapéuticamente eficaz en la prevención y/o el tratamiento de lesión por isquemia/reperfusión en un sujeto puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales (véanse, por ejemplo, The Physician's Desk Reference, Medical Economics Company, Inc., Oradell, NJ, 1995, y Drug Facts and Comparisons, Inc., St. Louis, MO, 1993).

En una realización particular, la cantidad terapéuticamente eficaz produce el alivio de uno o más síntomas del glioma. En una realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a una dosis de desde aproximadamente 0,2 mg/kg/día hasta aproximadamente 5 mg/kg/día, preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mg/kg/día, aproximadamente 0,7 mg/kg/día, aproximadamente 1 mg/kg/día, aproximadamente 1,5 mg/kg/día aproximadamente 1,7 mg/kg/día, aproximadamente 1,9 mg/kg/día, aproximadamente 2,1 mg/kg/día, aproximadamente 2,2 mg/kg/día, aproximadamente 2,5 mg/kg/día, aproximadamente 2,7 mg/kg/día, aproximadamente 2,9 mg/kg/día hasta aproximadamente 4,9 mg/kg/día, aproximadamente 4,7 mg/kg/día, aproximadamente 4,5 mg/kg/día aproximadamente 4,3 mg/kg/día, aproximadamente 4,1 mg/kg/día, aproximadamente 3,9 mg/kg/día, aproximadamente 3,7 mg/kg/día aproximadamente 3,5 mg/kg/día, aproximadamente 3,3 mg/kg/día, aproximadamente 3,1 mg/kg/día, aproximadamente 3 mg/kg/día. En una realización más particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a una dosis de entre 2 mg/kg de peso corporal/día y 3 mg/kg de peso corporal/día. En una realización incluso más particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a una dosis de 2,4 mg/kg de peso corporal/día.

Las dosis de los compuestos de la invención pueden expresarse o bien en mg del antagonista por kg de peso corporal o bien en mg del antagonista por metro cuadrado de superficie corporal. El experto sabe cómo determinar la dosis para un animal particular, en particular la dosis para seres humanos, a partir de las dosis sometidas a ensayo experimentalmente en ratones. Por ejemplo, el artículo de Reagan-Shaw S.et al.(Reagan-Shaw S.et al.“Dose translation from animal to human studies revisited”. FASEB J 2008, 22(3):659-661) proporciona los factores de conversión convencionales usados para convertir mg/kg en mg/m2.

Dosis (mg/kg) x Km = Dosis (mg/m2)

El artículo también explica que esta conversión es la base para convertir la dosis en una primera especie animal en la dosis en una segunda especie animal (traducción de dosis alométrica). Por tanto, la dosis en animal (AD) en mg/kg puede convertirse en la dosis equivalente en ser humano (HED) en mg/kg usando la siguiente fórmula: Kmde animal

HED (mg/kg) = AD (mg/kg) X ---------------------

Kmde ser humano

en la que Km para cada especie se muestra en la tabla 1 (datos extraídos de Reagan-Shaw S.et al.“Dose translation from animal to human studies revisited”. FASEB J 2008, 22(3):659-661).

Tabla 1. Factor Km para la conversión de AD en HED

Por tanto, los experimentos con dosis de 30 mg/kg en ratones corresponden a dosis generales en seres humanos de 2.4 mg/kg.

En otra realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en seres humanos, a una dosis en la que cada administración oscila desde 0,2 mg/kg hasta 5 mg/kg. preferiblemente desde aproximadamente 0,2 mg/kg/día, aproximadamente 0,25 mg/kg/día, aproximadamente 0,3 mg/kg/día, aproximadamente 0,35 mg/kg/día, aproximadamente 0,4 mg/kg/día, aproximadamente 0,45 mg/kg/día, aproximadamente 0,50 mg/kg/día, aproximadamente 0,55 mg/kg/día, aproximadamente 0,6 mg/kg/día, aproximadamente 0,65 mg/kg/día, aproximadamente 0,7 mg/kg/día, aproximadamente 0,75 mg/kg/día, aproximadamente 0,8 mg/kg/día, aproximadamente 0,85 mg/kg/día, aproximadamente 0,90 mg/kg/día, aproximadamente 0,95 mg/kg/día, aproximadamente 1 mg/kg/día, aproximadamente 1,2 mg/kg/día, aproximadamente 1,4 mg/kg/día, aproximadamente 1,6 mg/kg/día, aproximadamente 1,8 mg/kg/día, aproximadamente 2 mg/kg/día aproximadamente 2,2 mg/kg/día, aproximadamente 2,4 mg/kg/día, aproximadamente 2,6 mg/kg/día, aproximadamente 2,8 mg/kg/día, aproximadamente 3 mg/kg/día, aproximadamente 3,2 mg/kg/día hasta aproximadamente 3,4 mg/kg/día, aproximadamente 3,6 mg/kg/día, aproximadamente 3,8 mg/kg/día, aproximadamente 4 mg/kg/día, aproximadamente 4.5 mg/kg/día, aproximadamente 5 mg/kg/día. En una realización más preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a una dosis de entre 2 mg/kg de peso corporal/día y 3 mg/kg de peso corporal/día. En una realización todavía más preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a una dosis de 2,4 mg/kg de peso corporal/día.

En otra realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra diariamente, preferiblemente 1 vez al día, 2 veces al día, 3 veces al día. En una realización más preferida, se administra 1 vez al día. En otra realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 9 días 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses o más de 12 meses, preferiblemente durante 5 días, incluso más preferiblemente durante 5 días consecutivos.

Los términos “excipiente farmacéuticamente aceptable” o “portador farmacéuticamente aceptable” se refieren a cualquier compuesto o combinación de compuestos que es esencialmente no tóxico para el sujeto a la dosificación y a la concentración empleadas, y es compatible con los demás componentes de una composición farmacéutica. Por tanto, un excipiente es una sustancia inactiva formulada junto con el principio activo (es decir, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo) de una composición farmacéutica, con el propósito de aumentar el volumen de las composiciones que contienen dichos principios activos. El aumento de volumen permite una dispensación conveniente y precisa de una sustancia farmacéutica cuando se produce una forma de dosificación. Los excipientes también pueden servir para diversos propósitos de potenciación terapéutica, tales como facilitar la absorción o solubilidad del compuesto (fármaco), u otras consideraciones farmacocinéticas. Los excipientes también pueden ser útiles en el procedimiento de fabricación, para ayudar en la manipulación de la sustancia activa en cuestión tal como facilitando la fluidez del polvo o las propiedades antiadherentes, además de ayudar a la estabilidadin vitrotal como la prevención de desnaturalización a lo largo de la vida útil esperada. La selección de excipientes apropiados depende de la vía de administración y de la forma de dosificación, así como del principio activo y otros factores. Un excipiente puede ser una carga, un diluyente, un material de encapsulación o un agente auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido y no tóxico de cualquier tipo convencional. Los ejemplos no limitativos e ilustrativos de excipientes o portadores incluyen agua, disoluciones de sales (solución salina), alcohol, dextrosa, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de petroetral, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, y similares.

El antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico de la invención, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse por cualquier vía de administración adecuada, tal como, pero sin limitarse a, las vías parenteral, oral, tópica, nasal, rectal, intravítrea. En una realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico de la invención, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra por vía intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravítrea. En una realización preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico de la invención, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra por vía oral o intravenosa o intravítrea. En una realización más preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico de la invención, preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula I, más preferiblemente el derivado de alcanolamina de fórmula II, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra por vía intraperitoneal.

En una realización preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra junto con un compuesto antitumoral. El término “tumor” o “cáncer”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un amplio grupo de enfermedades que implican un crecimiento celular desregulado y que también se denominan neoplasias malignas. El término se aplica habitualmente a una enfermedad caracterizada por una división celular descontrolada (o por un aumento de resistencia a la apoptosis o supervivencia) y por la capacidad de dichas células para invadir otros tejidos vecinos (invasión) y diseminarse a otras zonas del cuerpo donde las células no se ubican normalmente (metástasis) a través de los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente circulatorio y luego invadir tejidos normales en otras partes del cuerpo. En una realización particular, el cáncer aparece como un tumor benigno, es decir, tumores que no pueden diseminarse por invasión o metástasis, es decir, sólo crecen localmente. En otra realización particular, el cáncer aparece como un tumor maligno, es decir, un tumor que puede diseminarse mediante invasión y metástasis.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “agente antitumoral”, “agente anticancerígeno” o “agente antineoplásico” (usados indistintamente en esta descripción), generalmente se refieren a sustancias que inhiben o suprimen el crecimiento y la proliferación de las células cancerosas. Los agentes antitumorales también pueden incluir compuestos que destruyen las células cancerosas o interfieren con la división celular, compuestos que bloquean determinadas hormonas implicadas en el cáncer, compuestos que inhiben o impiden el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (por ejemplo, inhibidores de la angiogénesis), agentes que dañan al ADN (por ejemplo, agentes alquilantes, tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino; antimetabolitos; e inhibidores de topoisomerasas) y compuestos con propiedades anticancerígenas (por ejemplo, taxanos, alcaloides de la vinca y alcaloides vegetales). El término “agente antitumoral” también incluye radioterapia. Un agente antitumoral también puede incluir un agente específico para proteínas desreguladas de células cancerosas. En una realización preferida, el compuesto antitumoral se selecciona de leptomicina B (LMB, número CAS 87081-35-4), temozolomida (número CAS 85622-93-1 ), capecitabina (número CAS 154361-50-9) y un agente alquilante, intercalante o dañante del ADN. En una realización más preferida, el compuesto antitumoral es propranolol (número CAS: 525-66-6).

Tal como se da a conocer en el presente documento, un “agente alquilante” es un compuesto que une un grupo alquilo a la base guanina de la molécula de ADN, impidiendo que las cadenas de la doble hélice se unan como deben y provocando una rotura de las cadenas de ADN, lo que afecta a la capacidad de multiplicación de la célula cancerosa.

Tal como se da a conocer en el presente documento, un “agente intercalante” es un compuesto que por sí mismo se inserta en la estructura de ADN de una célula y se une al ADN, provocando daño al ADN. En el tratamiento del cáncer, los agente intercalantes del ADN pueden destruir las células cancerosas dañando su ADN y deteniendo su división.

Tal como se da a conocer en el presente documento, un “agente dañante del ADN” es un agente que daña al ADN afectando a la estructura primaria de la doble hélice; es decir, se modifican químicamente las propias bases. Los ejemplos no limitativos de agentes dañantes incluyen: especies reactivas del oxígeno, radiación ultravioleta, rayos X y rayos gamma.

El término “administrado junto con un compuesto antitumoral” significa que el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico puede administrarse simultánea o secuencialmente con el compuesto antitumoral. Cuando el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico y el compuesto antitumoral se administran simultáneamente, pueden encontrarse en una única composición farmacéutica, o en composiciones farmacéuticas diferentes. Cuando el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico y el compuesto antitumoral se administran secuencialmente, pueden administrarse en cualquier orden, es decir, la administración del antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico puede comenzar antes de la administración del compuesto antitumoral o la administración del compuesto antitumoral puede comenzar antes de la administración del antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico.

En una realización preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra después de la primera línea de terapia a pacientes que ya no son susceptibles de continuar la primera línea de terapia debido a una recidiva de la enfermedad o a efectos secundarios demasiado graves. En una realización preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra como segunda línea de terapia. Tal como se da a conocer en el presente documento, “segunda línea de terapia” se refiere a un tratamiento que se administra a pacientes que han recibido previamente una primera terapia, conocida como “primera línea de terapia”. A menudo, la primera línea de terapia forma parte de un conjunto convencional de tratamientos, tales como cirugía seguida de quimioterapia y radiación. También se denomina terapia de inducción, terapia primaria y tratamiento primario. Tal como se da a conocer en el presente documento, puede usarse cualquier primera línea de terapia. Los ejemplos no limitativos de primera línea de terapia para el glioma incluyen: extirpación quirúrgica máxima, radioterapia, o bien usada individualmente o bien radioterapia más tratamiento concomitante y de mantenimiento con temozolomida (TMZ). Otros ejemplos de primera línea de terapia para el glioma incluyen compuestos anticancerígenos tal como se definió anteriormente, tales como agentes que dañan al ADN tales como agentes alquilantes (por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino); antimetabolitos; inhibidores de topoisomerasas, otros compuestos con propiedades anticancerígenas (por ejemplo, taxanos, alcaloides de la vinca y alcaloides vegetales). En una realización preferida, el compuesto antitumoral se selecciona de leptomicina B (LMB, número CAS 87081-35-4), temozolomida (número CAS 85622-93-1), capecitabina (número CAS 154361-50-9) y un agente alquilante, intercalante o dañante del ADN. En una realización más preferida, el compuesto antitumoral es propranolol (número CAS: 525-66-6).

En una realización particular, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra como primera línea de terapia, es decir, como primer tratamiento para el glioma.

En una realización preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra durante un periodo libre de enfermedad. El término “periodo libre de enfermedad”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un periodo durante y/o después del tratamiento en el que un paciente está viviendo con una enfermedad que no empeora. En una realización preferida, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra durante el periodo libre de enfermedad que se produce después del tratamiento con una primera línea de terapia, aunque la invención también contempla que la administración del antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se realice durante otros periodos libres de enfermedad que puede experimentar el paciente después de diferentes líneas de terapia (después de una segunda línea de terapia, después de una tercera línea de terapia o líneas adicionales de terapia). En otra realización, el antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico se administra después de la segunda línea de terapia, después de la tercera línea de terapia o después de cualquier línea de terapia una vez que el paciente ya no es susceptible de continuar la línea de terapia debido a una recidiva de la enfermedad o a efectos secundarios demasiado graves.

La invención se describirá a modo de los siguientes ejemplos que deben considerarse como meramente ilustrativos.

Ejemplos

Materiales y métodos

Cultivo de oncoesferas y ensayo de dilución límite extrema (ELDA)

Siguiendo el protocolo descrito en otras partes (Díaz-Guerra, E.; Lillo, M. A.; Santamaría, S.; García-Sanz, J. A., Intrinsic cues and hormones control mouse mammary epithelial tree size. FASEB J 2012, 26 (9), 3844-53). Las células se desprendieron de la placa con tripsina (Invitrogen) y se sembraron en medio completo (medio DMEM/F-12 con GlutaMAX) complementado con B27 (Gibco), factor de crecimiento epidérmico (EGF: Invitrogen) 10 ng/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF: Millipore) 10 ng/ml y se mantuvieron a 37 °C en el 5 % de CO2. Para el ensayo ELDA, las células se disociaron para dar células individuales con tripsina, y se sembraron a diferentes diluciones (desde 100 hasta 10 para células U-87) en medio completo de esferas siguiendo los procedimientos descritos en Ponti, D.et al.(Cancer Res 2005, 65 (13), 5506-11). El número final de esferas se cuantificó a los 14 días, y los datos finales y la significación estadística se obtuvieron con el software ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/limdil/index.html y (Hu, Y.et al.,J Immunol Methods 2009, 347 (1-2), 70-8).

Extracción de ARN y cuantificación relativa de miARN y ARNm

Se aisló ARNt usando el kit de minipreparación de ARN Direct-zol (ZymoResearch) a partir de células U-87 lavadas con PBS, raspadas de las placas y centrifugadas. El sedimento se trató con el reactivo Tris y se homogeneizó durante 5 min a temperatura ambiente antes de usar el kit de minipreparación según las instrucciones. Se evaluaron la calidad y la concentración del ARNt midiendo la absorbancia a 260, 230 y 280 nm con un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.). En todos los casos, se obtuvieron los valores de razón 260/280 (~2,0) y 260/230 (2,0-2,2) esperados aceptados para ARN puro. Para detectar los dos miR diana, se usaron 0,5 |ig del ARNt extraído a partir de las células para la hibridación antes de la medición en la plataforma amperométrica dual.

Se usó el sistema de cuantificación de microARN qScript (Quanta BioSciences, Inc., Gaithersburg, MD, EE. UU.) para evaluar la expresión de miR-21 y miR-205. Brevemente, se sintetizó ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de microARN qScript, usando 10 ng de ARN inicial por reacción de PCR. Las condiciones de PCR consistieron en una activación inicial a 50 °C durante 2 min, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s en el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480 (Roche). El valor de Ct (ciclo umbral) para cada cebador se normalizó con respecto al de RNU6. Para evaluar la expresión génica, se sintetizó ADNc con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Transcriptor (Roche) en las siguientes condiciones de PCR: 40 ciclos de amplificación de 95 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos. Se usó ACTB como gen de referencia para la normalización y las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado usando PerfeCTa SYBR Green SuperMix (Quanta BioSciences) para los miARN y FastStart Universal SY<b>R Green Master (Roche) para la expresión génica. El nivel de expresión de cada gen se determinó mediante el método de curva de calibración relativa y las secuencias de cebadores para los genes diana se obtuvieron a partir del Centro de Diseño de Ensayos Universal ProbeLibrary (https://qpcr.probefinder.com/organism.isp).

Microscopía con focal

Las células se sembraron y cultivaron en cubreobjetos en placas de pocillos P-24, en DMEM que contenía FBS al 10 %. Después del crecimiento, durante al menos 24 horas, las células se fijaron en los cubreobjetos durante 1 hora a 4 °C en PFA al 3,5%/PBS. A continuación, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 30 min a TA. Después de eso, se incubó un anticuerpo primario monoclonal de conejo contra el receptor P2-adrenérgico humano (Abcam) a una dilución 1:50 en PBS durante 60 minutos, seguido de 3 lavados con PBS, y la incubación con anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con Alexa-488 diluido 1:100 en PBS durante 1 hora. Los cubreobjetos se montaron con Prolong Gold con 4,6-diamidino-2-fenilindol (Invitrogen) y se observaron con un microscopio confocal espectral Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Inc., Wetzlar, Alemania).

Xenoinjertos de glioesferas o células de glioblastoma U-87

A ratones macho NOD scid gamma (NSG) de 7-8 semanas de edad se les inyectó en el flanco dorsal un total de 106 células de la línea celular U-87 (A) o 105 células procedentes de glioesferas desagregadas (B). En el caso de A, cuando el tamaño tumoral alcanzó un volumen de 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos, de 9/10 ratones cada uno. Un grupo se trató con inyección intraperitoneal diaria de 10mg/kg de peso corporal de propranolol, otro grupo con la misma cantidad de ICI118.551 y, finalmente, a un grupo de control se le inyectó vehículo. El tamaño tumoral se midió mediante un compás calibrador cada 2-3 días. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen tumoral promedio del grupo de control alcanzó un punto final establecido en los procedimientos éticos de los presentes inventores.

En el caso de B, los ratones se dividieron en 3 grupos de 10 ratones, y se trataron los primeros 5 días después del establecimiento del xenoinjerto con inyección intraperitoneal de propranolol o ICI118.551 a 3 mg/kg de peso corporal, o vehículo. Se realizó un seguimiento a los ratones hasta que aparecieron los tumores y pudieron dimensionarse. A partir de este momento, el tamaño tumoral se midió cada 2-3 días durante 4 semanas, y luego se sacrificaron los ratones.

Análisis estadístico

Los valores presentados son medias ± EEM o ± DE, y los datos de dos grupos se compararon con una prueba de latusando GraphPad Prism 5. Se usó análisis de la varianza (ANOVA) unilateral para determinar las diferencias de las medias para comparaciones múltiples de datos emparejados, considerándose significativo p < 0,05.

RESULTADOSICI 118.551 disminuye la viabilidad y aumenta la apoptosis de células U-87 (glioblastoma humano)in vitro.

Puesto que ICI 118.551 es un bloqueante P2 selectivo, lo primero que se sometió a ensayo fue la expresión de receptores beta-adrenérgicos de tipo 2 en la línea celular U-87. Tal como se muestra en la figura 1A, el uso de microscopía confocal con un anticuerpo monoclonal contra receptores P2-adrenérgicos humanos (Abcam) demuestra que U-87 expresa este tipo de receptor adrenérgico (figura 1A, células teñidas), permitiendo de ese modo que el fármaco ejerza su mecanismo de acción en este modelo celular de glioblastoma. También se confirmó la expresión de ARNm de receptor P2-adrenérgico mediante PCR cuantitativa en cultivos 3D como glioesferas (figura 1C).

Una vez corroborado el mecanismo de ICI 118.551 en U-87, se trataron las células a diferentes dosis y resultó evidente que este fármaco disminuía la viabilidad de este modelo de línea celular de glioblastoma humano, cuantificado mediante luminiscencia usando el kit ATP-Glo de Promega, o bien cuando se cultiva en suspensión líquida como oncoesferas (glioesferas, células madre) o bien en adhesión (figura 1B). A partir de la figura 1B, los resultados muestran que ICI 118.551 disminuye la viabilidad de U-87 de una manera diferente en comparación con el cultivo líquido tratado de glioesferas 3D con las células U-87 2D cultivadas en adhesión. La sensibilidad deferencial al fármaco se muestra en la figura 1B, siendo más sensibles las células cultivadas en adhesión que las glioesferas 3D formadas en suspensión. Este último es un comportamiento general en la mayoría de los fármacos anticancerígenos, pero lo que es relevante es que ICI 118.551 afecta fuertemente a la viabilidad de las células madre cancerosas a bajas concentraciones |iM, que se encuentra en la base de los procesos de metástasis y reaparición de la enfermedad oncológica.

ICI 118.551 inhibe la formación y la expansión de glioesferas, el procedimiento de cultivo bien aceptado para las células madre cancerosas, en la línea celular de glioblastoma humano U-87.

Se cultivaron glioesferas de U-87 en condiciones específicas descritas en otras partes (Gupta, P. B.et al.2009. Cell, 138, 645; Seymour, T.et al.2015. Front. Oncol. 5:159. doi: 10.3389/fonc.2015.00159; Peñuelaset al.2009. Cancer Cell 15, 315-327; Lee, J.et al.2006. Cancer Cell 9, 391-403). Tal como se muestra en la figura 2A, U-87 formó glioesferas maduras redondeadas que muestran estructuras bien definidas. Se cultivaron células U-87 en medio para la formación de glioesferas, y se trataron con vehículo (control, parte izquierda), ICI 118.551 y propranolol, a diferentes concentraciones desde 10 hasta 100 |iM. Cuando las células se trataron con bloqueantes beta, hubo una inhibición dependiente de la dosis en la formación de glioesferas, que es patente desde 10 |iM en adelante en ambos fármacos, propranolol y ICI 118.551. B: experimento de ensayo de dilución límite (ELDA) para la formación de oncoesferas en presencia de diferentes concentraciones de ICI 118.551 y propranolol. A partir de los diagramas, resulta claro que el factor de dilución aumenta después del tratamiento con ICI 118.551 y con propranolol, en comparación con el control. Esto es una consecuencia de la sensibilidad de células madre de las células madre de U-87 a ICI 118.551 y a propranolol.

ICI 118.551 y propranolol disminuyeron la expresión de ARNm de la expresión de biomarcadores de“stemness"en la línea celular de glioblastoma U-87.

Cuando las células U-87 se trataron con ICI 118.551 y propranolol durante 48 horas, la expresión de los genes asociados a la“stemness"GD3 sintasa, ALDH1, prominina (CD 133), Sox2 y Nanog disminuyó significativamente (figura 3A). Sin embargo, aumentó la expresión del ARNm de genes implicados en la diferenciación de células neurales, tales como MAP2, GFAP y nestina (figura 3B). La expresión de los ARNm correspondientes se midió mediante RT-qPCR. La conclusión fue que mientras que la expresión de los biomarcadores de“stemness"elegidos estaba aumentando, las asociadas con la diferenciación celular estaban aumentando, todas ellas de manera dependiente de la dosis, lo que sugiere en general un papel de ICI 118.551 en el destino celular.

ICI 118.551 y propranolol retardan la progresión tumoral de xenoinjertos de U-87 en ratones inmunodeprimidos NSG.

Se prepararon xenoinjertos usando células adherentes de U-87: a los ratones (n=30) se les inocularon 106 células de la línea celular de glioblastoma U-87, en el flanco, como xenoinjertos. El volumen tumoral se midió cada 3 días. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en 3 grupos (n= 9-10). Un grupo se trató diariamente con 10mg/kg de peso corporal de propranolol, otro grupo con la misma dosis de ICI118.551, y el tercer grupo sólo con vehículo (DMSO). Los fármacos se inyectaron por vía intraperitoneal. No se observaron efectos adversos. Tal como se muestra en la figura 4A, hubo una disminución significativa del volumen tumoral, de aproximadamente el 30 %, en los grupos de ratones tratados con 10 mg/kg de peso corporal de propranolol o ICI118.551.

Por otro lado, también se usaron xenoinjertos usando glioesferas de U-87. Estas glioesferas están enriquecidas en CSC (células madre cancerosas). A los ratones se les inocularon 105 esferoides a partir de la línea celular de glioblastoma U-87. Los ratones se dividieron en 3 grupos de 9-10 animales cada uno, y se trataron inmediatamente después del xenoinjerto durante 5 días consecutivos con 3 mg/kg de peso corporal de propranolol, o ICI 118.551, o sólo vehículo. Los tumores se midieron desde el momento en que eran lo suficientemente grandes como para dimensionarse. Tal como puede observarse en la figura 4B, hubo un retardo significativo en la tasa de crecimiento tumoral entre los ratones tratados frente a los ratones tratados con vehículo durante los primeros 5 días.

ICI 118.551 induce una mayor reducción en la expresión de ARNm-21 que propranolol en la línea celular de glioblastoma U-87.

El mecanismo subyacente a los efectos de miR-21 sobre la tumorigénesis sigue siendo desconocido, no menos porque sólo se han verificado experimentalmente algunas dianas para este miR. Se sabe que oncomiR miR-21 ejerce un control transcripcional sobre PDCD4 en células malignas y que su proteína endógena está regulada por incremento 3,5 veces por la inhibición de miR-21. La expresión de PDCD4 está regulada por disminución o perdida en varios tipos de tumores, lo que la convierte en una diana molecular prometedora para el tratamiento de algunos cánceres (Frankel, L.B.et al.,J Biol Chem, 2008. 283(2): págs. 1026-33). La reexpresión de miR-21 se ha asociado con la adquisición de transición epitelial-mesenquimatosa en cáncer de mama y glioblastoma (Zhou Q, Liu J, Quan J, Liu W, Tan H, Li W. Cancer Sci. Septiembre de 2018; 109(9):2651-2659).

Las células U-87 se cultivaron en DMEM-FCS al 10 % y se incubaron durante 48 horas con cantidades crecientes de ICI y propranolol durante 48 horas. La expresión de ARNm-21 disminuyó notablemente después de la incubación con ICI en comparación con propranolol (figura 5, parte izquierda). Además, ICI aumenta los niveles de expresión de dianas de ARNm-21 tales como PDCD4, un agente proapoptótico (parte central), y PTEN, un supresor de glioblastoma (parte derecha).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso en el tratamiento y/o la prevención de glioma.
2. 2. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según la reivindicación 1, en el que el glioma se caracteriza por tener una expresión aumentada del receptor p2-adrenérgico en comparación con un valor de referencia.
3. 3. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 , en el que el antagonista es un derivado de alcanolamina de fórmula

   en la que R1 es un grupo alquilo de hasta 6 átomos de carbono que está ramificado en el átomo de carbono a, en la que R2 es un alquilo de hasta 3 átomos de carbono, en la que R3 es hidrógeno, un halógeno o un alquilo de hasta tres átomos de carbono y en la que n es 1 ó 2 , 0 una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. 4. Antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antagonista se administra junto con un compuesto antitumoral seleccionado de propranolol, temozolomida, leptomicina B, capecitabina y un agente alquilante, intercalante o dañante del ADN.
5. 5. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según la reivindicación 4, en el que el compuesto antitumoral es propranolol.
6. 6. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el glioma comprende una subpoblación de células madre cancerosas.
7. 7. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en el que el glioma es un glioma de alto grado, y/o en el que el glioma es un glioma no recurrente, y/o en el que el glioma es un astrocitoma.
8. 8. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según la reivindicación 7, en el que el astrocitoma es glioblastoma.
9. 9. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que n es 1.
10. 10. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que R1 es isopropilo, R2 es metilo y/o R3 es metilo.
11. 11. Antagonista selectivo del receptor p2-adrenérgico para su uso según la reivindicación 10, en el que el derivado de alcanolamina tiene la fórmula
12. 12. Antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable es clorhidrato.
13. 13. Antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el derivado de alcanolamina o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a una dosis de entre 1 mg/kg de peso corporal/día y 4,5 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente de entre 2 mg/kg de peso corporal/día y 3 mg/kg de peso corporal/día.
14. 14. Antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso según la reivindicación 13, en el que el derivado de alcanolamina o la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a una dosis de 2,4 mg/kg de peso corporal/día.
15. 15. Antagonista selectivo del receptor P2-adrenérgico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el antagonista se administra a un paciente como primera línea de terapia o después de la primera línea de terapia.