ES2978313T3 - Procedimientos para detectar hongos en hierba de césped con un ensayo LAMP que comprende conjuntos de cebadores novedosos - Google Patents

Procedimientos para detectar hongos en hierba de césped con un ensayo LAMP que comprende conjuntos de cebadores novedosos Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona un método para detectar ADN fúngico en una muestra de césped con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que contiene cebadores para ADN fúngico de al menos un hongo patógeno del césped seleccionado entre Sclerotinia homoeocarpa, Rhizoctonia solani spp., Pythium aphanidermatum, Gaeumannomyces graminis spp., Microdochium nivale spp., Magnaporthe poae, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum cereale y Pythium ultimum var. ultimum, que comprende: someter la muestra de césped a una reacción LAMP en la que la reacción LAMP utiliza un conjunto de cebadores de cuatro o más secuencias de ácidos nucleicos y cada cebador del conjunto tiene de 15 a 50 ácidos nucleicos. Los cebadores útiles en el presente método se seleccionan de regiones espaciadoras transcritas internas específicamente seleccionadas o genes de los hongos objetivo para proporcionar resultados de ensayo mejorados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para detectar hongos en hierba de césped con un ensayo LAMP que comprende conjuntos de cebadores novedosos
La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar enfermedades en hierba de césped provocadas por el hongo patógeno Sclerotinia homoeocarpa con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) de una muestra de dicha hierba de césped para detectar ácidos nucleicos de este hongo.
La LAMP o amplificación isotérmica mediada por bucle tal como se describe en el documento US 6410278 (Eiken) es un procedimiento de amplificación de ADN caracterizado por el uso de al menos 4 o más cebadores diferentes (véase, por ejemplo, http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html) que están diseñados específicamente para reconocer 6 regiones distintas en el gen diana y el proceso de reacción se desarrolla a una temperatura constante mediante una reacción de desplazamiento de cadena. La amplificación y detección del ácido nucleico diana de interés se puede completar en una única etapa, mediante la incubación de la mezcla de la muestra biológica o un extracto de ácido nucleico de la misma, cebadores, ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena y sustratos a una temperatura constante (aproximadamente 65 °C). Proporciona una alta eficacia de amplificación, amplificándose ADN numerosas veces en 15-60 minutos. Debido a su alta especificidad, la presencia del producto amplificado puede indicar la presencia del gen diana (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html).
Existen numerosos problemas que afrontan los administradores de la hierba del césped para mantener la hierba del césped con el nivel de calidad esperado por los usuarios. Si bien los problemas son numerosos, los relacionados con enfermedades (incluidas las enfermedades provocadas por hongos patógenos) son particularmente difíciles de gestionar y controlar. Por ejemplo, las enfermedades pueden afectar a las plantas herbáceas del césped en los campos de golf, provocando una pérdida de ingresos debido a la reducción de la calidad, incluida la jugabilidad. Un ejemplo de un problema común para los administradores de campos de golf es saber qué enfermedad está presente para poder adoptar técnicas de gestión adecuadas y oportunas. Las enfermedades relevantes del césped provocadas por microorganismos patógenos del césped incluyen, por ejemplo, antracnosis, pudrición radicular, mancha de verano, moho de la nieve, quemazón por pythium, mancha marrón y mancha dólar.
Los productos químicos agrícolas activos para controlar patógenos, tales como fungicidas, normalmente se aplican en campos de golf según sea necesario en función del nivel de presión de la enfermedad, la población de patógenos, el clima y similares. Sin embargo, las aplicaciones de fungicidas están muy controladas por el presupuesto del campo, la disponibilidad de equipo apropiado y la disponibilidad de personal calificado para aplicar los productos químicos agrícolas activos.
En vista de estos problemas, sería extremadamente útil un ensayo rápido y fiable para la detección de hongos patógenos del césped. El uso de ensayos PCR conocidos no es práctico en campos de golf u otras hierbas de césped utilizadas de forma intensiva o en entornos de jardín profesionales, ya que la PCR requiere capacidades e instrumentos de laboratorio especializados. Se conocen otros determinados procedimientos de biología molecular para detectar enfermedades fúngicas en hierba de césped, y se describen, por ejemplo, en el documento WO2009147017, que se refiere a una metodología TRFLP.
Ahmed Abd-Elmagid et al. divulgan un procedimiento para detectar Sclerotinia homoeocarpa en una muestra de hierba de césped por PCR (Journal of microbiological technologies 92 (2013), páginas 293-300, "Discriminatory simplex and multiplex PCR for four species of the genus Sclerotinia").
En consecuencia, la presente divulgación se refiere a un ensayo LAMP para detectar la presencia de ADN en una muestra de césped que está asociada con patógenos fúngicos seleccionados que provocan enfermedades relevantes del césped que incluyen, por ejemplo, antracnosis, pudrición radicular, mancha de verano, moho de la nieve, quemazón por pythium, mancha marrón y mancha dólar. La presente invención se refiere a un procedimiento y a un kit para detectar Sclerotinia homeocarpa en una muestra de hierba de césped tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
Para facilitar la detección oportuna y eficaz de patógenos de enfermedades de hierbas de césped y para mejorar el coste y la eficacia de los tratamientos de enfermedades hierbas de césped se puede utilizar un ensayo LAMP según la invención para detectar de forma más temprana el ADN asociado con el patógeno fúngico Sclerotinia homeocarpa que provoca enfermedades relevantes en el césped. Según la invención, el procedimiento LAMP utiliza de forma adecuada un conjunto de cebadores de seis cebadores tal como se define en la reivindicación 1.
Se divulga también, pero no forma parte de la presente invención, un procedimiento para detectar ADN fúngico en una muestra de césped con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que contiene cebadores para ADN fúngico (ácidos nucleicos) de un hongo patógeno de césped seleccionado del grupo que consiste en Rhizoctonia solani spp., Pythium aphanidermatum, Gaeumannomyces graminis spp., Microdochium nivale spp., Magnaporthe poae, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum cereale y Pythium ultimum var. ultimum (hongos diana). El ensayo LAMP utiliza un conjunto de cebadores de al menos cuatro y preferentemente seis o más secuencias de ácidos nucleicos, teniendo cada cebador del conjunto de 15 a 50 ácidos nucleicos, y en el que el ADN fúngico que hay que detectar se obtiene de un patógeno fúngico diana. Los cebadores útiles en el presente procedimiento de ensayo LAMP se seleccionan a partir de regiones espaciadoras transcritas internas específicas o genes de los hongos diana para proporcionar resultados de ensayo mejorados.
En una forma de realización particular, los hongos diana Microdochium nivale spp. se seleccionan de Microdochium nivale var. nivale y Microdochium nivale var. majus. En otra forma de realización, los hongos diana Gaeumannomyces graminis spp. se seleccionan de Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis y Gaeumannomyces graminis var. tritici. En otra forma de realización, los hongos diana Rhizoctonia solani spp. se seleccionan de Rhizoctonia solani AG2-2IV y Rhizoctonia solani AG2-2MIB.
En el contexto de la presente divulgación, la detección de ADN fúngico con el ensayo LAMP divulgado en una muestra de césped puede ser indicativo de la presencia de patógenos fúngicos y también puede ayudar a evaluar la aparición o la presencia de una afección patológica del césped de la forma siguiente:
En una forma de realización
(a) el conjunto de cebadores para ADN de Sclerotinia homeocarpa se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO:
1;
(b) el conjunto de cebadores para ADN de Rhizoctonia solani se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 9;
(c) el conjunto de cebadores para ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var.
nivale) se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 3;
(d) el conjunto de cebadores para ADN de Pythium aphanidermatum se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10;
(e) el conjunto de cebadores para ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8;
(f) el conjunto de cebadores para ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var.
majus) se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 6;
(g) el conjunto de cebadores para el ADN de Magnaporthe poae se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO:
7;
(h) el conjunto de cebadores para ADN de Colletotrichum graminicola se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 11;
(i) el conjunto de cebadores para ADN de Colletotrichum cereale se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO:
12; y
(j) el conjunto de cebadores para ADN de Pythium ultimum var. Ultimum se selecciona de entre el ADN de SEQ ID NO: 13
Preferentemente, los conjuntos de cebadores LAMP adecuados para su uso en la detección de ADN de hongos en muestras de césped según la presente divulgación comprenden cuatro cebadores que incluyen: un par de cebadores internos directos (FIP) e inversos (BIP), y un par de cebadores externos directos (F3) e inversos (B3). De forma más preferida, los conjuntos de cebadores LAMP adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen la adición de cebadores de bucle hacia adelante (LF) y/o de bucle hacia atrás (LB) para acelerar la amplificación del ácido nucleico presente en la muestra de césped y reducir el tiempo de detección de cualquier hongo diana que pueda estar presente en dicha muestra de césped. Las formas de realización del conjunto de cebadores LAMP enumeradas a continuación se refieren a la detección del ADN del hongo diana en muestras de césped según el procedimiento de la divulgación. En la descripción de las formas de realización siguientes que están asociadas con los cebadores de SEQ ID NO: 14 -91, se entenderá que cada uno de los cebadores independientemente y respectivamente tiene una secuencia que es al menos el 90%, preferentemente al menos el 95%, de forma más preferida al menos el 96% y de forma incluso más preferida al menos el 97% idéntica a los cebadores de SEQ ID NO: 14 - 91.
En una forma de realización particularmente preferida, cada uno de los cebadores independientemente y respectivamente tiene una secuencia que es al menos el 98%, de forma más preferida al menos el 99% idéntica a los cebadores de SEQ ID NO: 14 - 91. De la forma más preferida, cada uno de los cebadores independientemente y respectivamente tiene una secuencia que es idéntica a las SEQ ID NO: 14 - 91.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona un procedimiento para detectar ADN fúngico en una muestra de hierba de césped con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que contiene cebadores para ADN fúngico de al menos un hongo patógeno del césped seleccionado de Sclerotinia homoeocarpa, Rhizoctonia solani spp., Pythium aphanidermatum, Gaeumannomyces graminis spp., Microdochium nivale spp., Magnaporthe poae, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum cereale y Pythium ultimum var. ultimum, que comprende: someter la muestra de césped a una reacción LAMP, en el que la reacción LAMP utiliza un conjunto de cebadores de cuatro o más secuencias de ácido nucleico, en el que cada cebador del conjunto tiene de 15 a 50 ácidos nucleicos, y en el que el conjunto de cebadores comprende al menos un conjunto de cebadores tal como se describe a continuación. En una forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Sclerotinia homeeocarpa comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 15 y 27.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Sclerotinia homeeocarpa comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 14, 15, 16 y 17.
En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar el ADN de Sclerotinia homeocarpa comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 y 19.
En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de la SEQ ID NO: 23.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 63, 64 y 65.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 20, 21,22 y 23.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 62, 63, 66 y 67.
En otra forma de realización más, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 66 y 67.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 20, 21,22, 23, 24 y 25.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var. nivale) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 27, 28 y 29. En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var. nivale) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 26, 27, 28 y 29. En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var. nivale) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 y 31.
En una forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium aphanidermatum comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 33, 36 y 37.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium aphanidermatum comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 32, 33, 36 y 37.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium aphanidermatum comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 y 37.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium aphanidermatum comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium aphanidermatum comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 68, 69, 72 y 73.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium aphanidermatum comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71,72 y 73.
En una forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) comprende o se selecciona de la SEQ ID NO: 60.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 42 y 43.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 38, 39, 42 y 43.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 56, 57, 60 y 61.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41,42 y 43.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Gaeumannomyces graminis spp. (preferentemente Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis o Gaeumannomyces graminis var. tritici) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 y 61.
En una forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar el ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var. majus) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 48 y 49.
En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar el ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var. majus) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 44, 45, 48 y 49.
En otra forma de realización más, el conjunto de cebadores para detectar el ADN de Microdochium nivale spp. (preferentemente Microdochium nivale var. majus) comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 44, 45, 46, 47, 48 y 49.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Magnaporthe poae comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 54 y 55.
En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Rhizoctonia solani comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 50, 51, 54 y 55.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Magnaporthe poae comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 50, 51,52, 53, 54 y 55.
En una forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Colletotrichum graminicola comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 74, 76 y 77.
En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Colletotrichum graminicola comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 74, 75, 78 y 79.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Colletotrichum graminicola comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78 y 79.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Colletotrichum cereale comprende o se selecciona de las SEQ ID n O: 80, 82 y 83.
En una forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Colletotrichum cereale comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 80, 81,84 y 85.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Colletotrichum cereale comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 80, 81,82, 83, 84 y 85.
En una forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium ultimum var. Ultimum Idin-rc comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 86, 88 y 89.
En otra forma de realización adicional, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium ultimum var. Ultimum Idin-rc comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 86, 87, 90 y 91.
En otra forma de realización, el conjunto de cebadores para detectar ADN de Pythium ultimum var. Ultimum Idin-rc comprende o se selecciona de las SEQ ID NO: 86, 87, 88, 89, 90 y 91.
Los ensayos LAMP de la divulgación se pueden usar para la detección, incluida la detección temprana, de ADN de hongos del césped seleccionados del grupo que consiste en Sclerotinia homoeocarpa, Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum, Gaeumannomyces graminis spp., Microdochium nivale spp., Magnaporthe poae, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum cereale y Pythium ultimum var. Ultimum en muestras de césped que es fácil de obtener y permite adaptar en consecuencia la gestión y/o el mantenimiento de las hierbas del césped.
Según la invención, por "hierba de césped" se entiende una Gramineae anual o perenne. Dichas gramíneas pertenecen preferentemente a uno o más de los géneros Agropyron, Agrostis, Axonopus, Bromus, Buchloé, Cynodon, Eremochloa, Festuca, Lolium, Paspulum, Pennisetum, Phleum, Poa, Stenotaphrum o Zoysia. De forma más preferida, dichas gramíneas pertenecen a uno o más de los géneros Agrostis, Buchloé, Cynodon, Eremochloa, Festuca, Lolium, Paspulum, Pennisetum, Poa, Stenotaphrum o Zoysia.
En una forma de realización, según la invención se entiende por "césped" un conjunto de hierbas de césped que cubren una superficie de terreno y están sujetas a un mantenimiento regular.
La presente invención se puede poner en práctica con todas las hierbas de césped, incluidas hierbas de césped de estación fría y hierbas de césped de estación cálida.
Ejemplos de hierbas de césped de estación fría son: poas (Poa L.),tales como poa de los prados (Poa pratensis L.),poa común(Poa trivialis L.),pasto azul de Canadá(Poa compressa L.)y poa anual(Poa annuaL.); agróstides(Agrostis L.),tales como agróstide rastrera(Agrostis palustris Huds.),agróstide común(Agrostis tenius Sibth.),agróstide canina(Agrostis canina L.)y agróstide blanca(Agrostis alba L.);festucas(Festuca L.),tales como festuca roja(Festuca rubraL.), festuca roja encespedante(Festuca rubra var, commutataGaud.), festuca ovina(Festuca ovina L.)y festuca dura(Festuca longifolia),festuca alta(Festuca arundinaceaSchreb.), festuca de los prados(Festuca elatiorL.); ballicos(Lolium L.),tales como ballico inglés(Lolium perenne L.),ballico italiano (Italiano)(Lolium multiflorumLam.); agropiros (Agropyron Gaertn.), tales como agropiro crestado (Agropyron cristatum (L.) Gaertn.), agropiro del oeste (Agropyron smithii Rydb.);Otras hierbas de césped de estación cálida incluyen bromo inerme(Bromus inermis Leyss.);y hierba timotea(PhleumL.).
Las hierbas de césped de estación cálida incluyen, por ejemplo, pasto bermuda(CynodonL. C. Rich), zoisías(ZoysiaWilld.), pasto de San Agustín(Stenotaphrum secundatum(Walt.) Kuntze), hierba ciempiés(Eremochloa ophiuroides(Munro.) Hack.), pasto de alfombra(AxonopusBeauv.), pasto bahía(Paspalum notatumFlugge.), pasto kikuyo(Pennisetum clandestinumHochst. ex Chiov.), hierba búfalo(Buchloe dactyloides(Nutt.) Engelm.) y grama de agua(Paspalum vaginatumswartz).
El procedimiento LAMP de la invención también contempla un kit para la detección de hongos en una muestra de hierba de césped usando un ensayo LAMP, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Se puede utilizar una tira reactiva que contenga uno o más de los conjuntos de cebadores descritos en el presente documento. En una forma de realización, se multiplexan múltiples conjuntos de cebadores en una tira reactiva para la detección de múltiples enfermedades a partir de muestras de hierba de césped recolectadas de un sitio particular.
Por ejemplo, se proporciona un tubo Bijou con un rodamiento de bolas y una cantidad adecuada de tampón de lisis con una muestra de césped homogeneizada de 1 cm cúbico y se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se coloca una tira reactiva con un pocillo de muestra que contiene todo el tampón de resuspensión y gotas de esta solución de ensayo en pocillos de muestra en una tira reactiva en la que los pocillos tienen todos los ingredientes necesarios para realizar una reacción LAMP (por ejemplo, los conjuntos de cebadores y un reactivo tal como una mezcla maestra isotérmica, disponible de Optigene con el N° de catálogo iso-001). En una forma de realización, las tiras reactivas están multiplexadas. En otra forma de realización, la tira reactiva incluye 8 pocillos, dos de control y 6 para enfermedades de interés del césped. En una forma de realización, la tira reactiva está asociada con un instrumento de diagnóstico tal como un Genie®II o III disponibles de OptiGene.
Diseño de cebadores
Se utilizaron genes altamente conservados para el diseño de los cebadores LAMP para la detección de ADN de patógenos de hierba de césped seleccionados (columna 1 de la TABLA 3). Se obtuvo ADN genómico puro de todos los hongos de interés utilizando NucleoSpin Plant II (MACHEREY-NAGEL). Con tecnología de PCR, la secuencia de interés se amplificó utilizando pares de cebadores publicados seguidos de una secuenciación de Sanger. Se secuenciaron los siguientes loci de ADN (genes y regiones): espaciador transcrito interno (ITS), factor de elongación 1 -alfa (EF), beta-tubulina (Tub), subunidad 1 de citocromo c oxidasa (Cox), superóxido dismutasa (SOD1) y ARN ribosómico nuclear de subunidad grande (LSU). Las secuencias sin procesar se alinearon utilizando el procedimiento de alineamiento ClustalW (programa informático CLC Main Workbench). Se utilizaron las comparaciones BLAST con secuencias de GenBank (NCBI) para identificar homólogos de genes. De forma ideal, una buena secuencia se define por una amplificación por PCR exitosa para todos los taxones diana y sin homología con otros taxones.
Las mejores secuencias (SEQ ID NO: 1 - 13) de los loci de ADN secuenciados se usaron después para el diseño de los cebadores LAMP para cada uno de los patógenos de hierba de césped seleccionados usando LAMP Designer 1.14 (PREMIER Biosoft). Por lo tanto, se analizaron diferentes parámetros para obtener diferentes conjuntos de cebadores por organismos y loci (véase la TABLA 3 para obtener una correlación del patógeno del césped, los loci seleccionados y la SEQ ID de las mejores secuencias utilizadas para el diseño de cebadores). Después se analizaron los conjuntos de cebadores diseñados que se muestran en la TABLA 1 para determinar su especificidad (TABLA 3) y su sensibilidad (TABLA 4).
TABLA 1
Especificidad
Para examinar la especificidad de la reacción (véase la literatura, a continuación), los ensayos que utilizan los conjuntos de cebadores diseñados se analizan utilizando extractos de ADN genómico puro de los aislados fúngicos descritos en la TABLA 2. Se recopiló una colección completa de diferentes patógenos de hierba de césped de distintos orígenes geográficos y se cultivaron en diferentes medios (dextrosa de patata / malta / harina de maíz / cereza / V8). Se utilizó un cultivo fúngico de diez días para extraer el ADN del micelio (NucleoSpin Plant II - MACHEREY-NAGEL). El ADN genómico se diluyó con agua carente de nucleasas a 5 ng/pl y se usó una porción de 2,5 pl para los ensayos de especificidad.
Los ensayos de especificidad de LAMP se realizaron en un LightCycler 480 (Roche) en placas de 96 pocillos a 64 °C durante 55 min. La temperatura de hibridación específica del amplicón se determinó durante el enfriamiento de 98 °C a 65 °C con una velocidad de rampa de -0,1 °C por segundo. Los ensayos LAMP en tiempo real se llevaron a cabo en mezclas de reacción de 10 pl que contenían 5 pl de mezcla maestra isotérmica a una concentración 1x (Optigene), 0,4 pM de cada cebador externo, 1,6 pM de cada cebador interno y 0,8 pM de cada cebador de bucle (sintetizados por Microsynth) y 2,5 pl de ADN genómico.
Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado y en dos días diferentes.
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TABLA 2
Cepas Stein y SYN: Syngenta, CH-4332 Stein, Suiza
Cepas CBS: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, Países Bajos
Cepas ZHAW: Zurich University of Applied Sciences, Postfach 8820, Wadenswil, SuizaInterpretación de los resultados
Tal como se resume en la TABLA 3, la especificidad del ensayo LAMP se comparó con la diana específica diseñada para las cepas de hongos enumeradas en la TABLA 2. Como confirmación adicional de la especificidad, se observó una temperatura de fusión coincidente de 82,6-89,9 °C ± 0,5 °C. para los diferentes productos amplificados como también se muestra en la TABLA 3.
La sensibilidad de los conjuntos de cebadores descritos correspondientes al ADN de las SEQ ID NO: 1-13 (Tabla 1) se determinó usando diluciones en serie de ADN genómico (1 ng a 100 fg) de todos los hongos de interés, realizándose cada reacción por duplicado en dos días diferentes. Se obtuvo ADN genómico puro de todos los hongos utilizando NucleoSpin Plant II (Ma CHEREY-NAGEL). Los ensayos de sensibilidad LAMP se realizaron en un LightCycler 480 (Roche) en placas de 96 pocillos a 64 °C durante 55 min. La temperatura de hibridación específica del amplicón se determinó durante el enfriamiento de 98 °C a 65 °C con una velocidad de rampa de -0,1 °C por segundo. Los ensayos LAMP en tiempo real se llevaron a cabo en mezclas de reacción de 10 pl que contenían 5 pl de mezcla maestra isotérmica a una concentración 1 x (Optigene), 0,4 pM de cada cebador externo, 1,6 pM de cada cebador interno y 0,8 pM de cada cebador de bucle (sintetizados por Microsynth) y 2,5 pl de ADN genómico.
TABLA 4
Procedimiento de detección de patógenos fúngicos en una muestra de hierba de césped
Recolección de muestra
Se recolecta una muestra de un mechón de césped, incluidas raíces de las hierbas, en un lugar en el que se espera la presencia de un patógeno fúngico. La hierba de césped también puede mostrar síntomas. La muestra de césped se coloca en un tubo limpio de 50 ml (Corning) y se almacena a -20 °C hasta su uso. Se extrae ADN utilizando el kit de lisis de material vegetal (Optigene). Se coloca un cubo de muestra de césped de 1cm3 en un tubo Bijou que contiene 1 ml de tampón de lisis (Optigene). La homogeneización de la muestra de césped se realiza agitando el tubo Bijou durante 1 min. Se transfiere un volumen de 10 gl del lisado a un tubo de dilución proporcionado (Optigene) y se mezcla vigorosamente mediante agitación. El lisado diluido se define posteriormente como plantilla.
Reacción LAMP
En algunas formas de realización, la reacción LAMP se realiza a de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 70 °C, tal como de aproximadamente 64 °C a aproximadamente 67 °C, o de aproximadamente 64 °C a aproximadamente 66 °C. En ejemplos específicos, la reacción LAMP se realiza a 64 °C.
En algunas formas de realización, se deja que la reacción LAMP discurra durante aproximadamente 15 a aproximadamente 45 minutos, tal como aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos, o aproximadamente 25 minutos a aproximadamente 35 minutos.
En algunas formas de realización, la concentración de cebadores en la reacción LAMP según la presente divulgación es de 1,4-1,8 gM, más específicamente de 1,6 gM para los cebadores internos directos (FIP) e inversos (BIP), de 0,2 0,4 gM, más específicamente de 0,4 gM, para cebadores externos directos (F3) e inversos (B3), y de 0,4-0,8 gM, más específicamente de 0,8 gM, para cebadores de bucle hacia adelante (LF) y/o de bucle hacia atrás (LB) que son útiles para acelerar la amplificación del ácido nucleico presente en la muestra de césped y reducir el tiempo de detección de cualquier ADN de hongo diana que pueda estar presente en dicha muestra de césped.
Los sistemas tampón adecuados útiles en la reacción del ensayo LAMP incluyen:
Paquete de tampón de amplificación isotérmica 1Xde New England Biolabs
Tris-HCl 20 mM
(NH4)2SO410 mM
KCl 50 mM
MgSO42 mM
Tween® 20 al 0,1%
(pH 8,8 a 252C)
Paquete II de tampón de amplificación isotérmica 1Xde New England Biolabs
Tris-HCl 20 mM
(NH4)2SO410 mM
KCl 150 mM
MgSO42 mM
Tween® 20 al 0,1%
(pH 8,8 a 25 °C)
Los sistemas enzimáticos adecuados (ADN polimerasa, etc.) útiles en la reacción del ensayo LAMP incluyen:
En una forma de realización, las reacciones LAMP se realizan en un instrumento Genie (Optigene) en una tira reactiva con reactivos secados (Optigene). En una forma de realización, las tiras tienen ocho pocillos de 150 gl (2 de control y 6 para ensayos). Los ensayos LAMP en tiempo real se llevan a cabo en mezclas de reacción de 25 gl que contienen 15 gl de mezcla maestra isotérmica a una concentración 1x (Optigene), 0,4 gM de cada cebador externo, 1,6 gM de cada cebador interno y 0,8 gM de cada cebador de bucle (sintetizados por Microsynth) seleccionados de al menos uno de los conjuntos de cebadores de la Tabla 1. Antes de añadir la plantilla, la tira de reacción liofilizada se resuspende en 22 gl de tampón de resuspensión (Optigene). Todas las tiras reactivas incluyen un control negativo y un conjunto de cebadores de control positivo de plantas proporcionados por Optigene. Para todos los ensayos, se añaden 3 gl de plantilla por reacción y pocillo. La reacción se mantiene a 64 °C durante 30-55 minutos seguido de un programa de hibridación. El perfil de temperatura del programa de hibridación se determina durante el enfriamiento de 98 °C a 65 °C con una velocidad de rampa de -0,1 °C por segundo.
La mezcla maestra isotérmica contiene un tinte fluorescente de unión a ADN bicatenario para permitir la detección en tiempo real de los amplicones. Los ensayos están optimizados en términos de tiempo de reacción, temperatura y volumen de ADN añadido por reacción.
Los datos de fluorescencia adquiridos durante la fase de amplificación a 64 °C se notifican como tiempo de amplificación. Los datos del derivado de fluorescencia que se adquieren durante la fase de hibridación se notifican como temperatura de hibridación.
Alternativamente, la reacción del ensayo LAMP no incluye un programa de hibridación, en cuyo caso se puede utilizar un tinte indicador sensible al pH para evaluar la presencia del ADN fúngico diana. En algunos ejemplos, el tinte indicador sensible al pH es un tinte coloreado detectable en luz visible. En ejemplos particulares, el tinte coloreado comprende rojo cresol, rojo fenol, púrpura de m-cresol, púrpura de bromocresol, rojo neutro, naftolftaleína, azul de timol o naftolftaleína. En otros ejemplos, el tinte indicador sensible al pH es un tinte indicador fluorescente. En ejemplos particulares, el tinte fluorescente comprende 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5(6)-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 3,6-diacetoxiftalonitrilo, ácido 6,8-dihidroxi-1,3-pirenodisulfónico o 5-(y-6)-carboxil seminaftorrodafluor.
Siguiendo los procedimientos anteriores, la detección de la presencia de ADN de patógeno fúngico (Tabla 3) en una muestra de césped puede indicar la presencia de un patógeno fúngico del césped que puede causar enfermedades relevantes del césped (incluyendo, por ejemplo, antracnosis, pudrición radicular, mancha de verano, moho de la nieve, quemazón por pythium, mancha marrón y mancha dólar). La detección temprana y eficaz permite tomar decisiones adecuadas sobre la gestión de enfermedades de hierba de césped.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para detectar ADN fúngico en una muestra de hierba de césped con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que contiene seis cebadores para ADN fúngico de Sclerotinia homoeocarpa que comprende: someter la muestra de césped a una reacción LAMP en el que la reacción LAMP utiliza un conjunto de cebadores de secuencias de ácido nucleico que comprende: una secuencia que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO:14, una secuencia que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 15, una secuencia que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 16, una secuencia que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 17, una secuencia que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 18 y una secuencia que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 19.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende la SEQ ID NO SEQ ID NO:14, la SEQ ID NO:15, la SEQ ID NO:16, la SEQ ID NO:17, la SEQ ID NO:18 y la SEQ ID NO:19. .
3. Un kit para la detección de ADN fúngico en una muestra de hierba de césped por medio de un ensayo LAMP, que comprende los conjuntos de cebadores identificados en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
4. El kit de la reivindicación 3, que comprende además tampón y ADN polimerasa.
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