CN111684081A

CN111684081A - 用具有新颖引物组的lamp测定检测草坪草中真菌的方法

Info

Publication number: CN111684081A
Application number: CN201980011873.3A
Authority: CN
Inventors: M·帕尔米萨诺; C·沃勒
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2019-02-05
Publication date: 2020-09-18
Also published as: CA3089803A1; KR20200118071A; ES2978313T3; JP7352557B2; AU2019213482A1; US20230340621A1; MA51800A; EP3749786B1; US11634783B2; US20200362424A1; EP3749786A1; JP2021512609A; EP4368731A2; EP3749786C0; JP2023171395A; WO2019149963A1

Abstract

本发明提供了一种用环介导等温扩增(LAMP)测定检测草坪草样品中真菌DNA的方法，该测定含有用于至少一种草坪病原性真菌的真菌DNA的引物，这些草坪病原性真菌选自：币斑病核盘菌、立枯丝核菌物种、瓜果腐霉菌、禾顶囊壳菌物种、雪霉叶枯菌物种、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和终极腐霉菌终极变种，该方法包括：使草坪样品经受LAMP反应，其中该LAMP反应使用四个或更多个核酸序列的引物组，该组中的每个引物具有15个到50个核酸。可用于本方法的引物选自靶标真菌的特异性选择的内部转录间隔区或基因，以提供改进的测定结果。

Description

用具有新颖引物组的LAMP测定检测草坪草中真菌的方法

本发明涉及检测由真菌病原体引起的草坪草中病害的方法，该方法用环介导等温扩增(LAMP)测定这样的草坪草样品以检测来自一种或多种真菌的核酸。

如在例如US 6410278(Eiken公司)中所述，LAMP或环介导等温扩增是一种DNA扩增方法，其特征在于使用至少4个或更多个不同的引物(参见，例如，http:// loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html)，这些引物被特异性设计以识别靶基因上的6个不同区域，并且反应过程在恒定的温度下通过链置换反应进行。通过将生物样品或其核酸提取物、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、和底物的混合物在恒定的温度下(大约65℃)孵育，可在单个步骤中完成目的靶核酸的扩增和检测。它提供了高扩增效率，其中DNA在15-60分钟内被多次扩增。由于其高特异性，扩增产物的存在可以表明靶基因的存在(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html)。

草坪草管理者在将草坪草保持在用户所期望的质量标准方面面临着许多问题。虽然问题很多，但与病害有关(包括由真菌病原体引起的病害)的那些问题对管理和控制特别具有挑战性。例如，病害可以影响高尔夫球场上的草坪草植物，从而引起由质量降低(包括可玩性)造成的收入损失。对于高尔夫球场管理者而言，常见问题的一个实例是知道存在哪种病害，以便可以采取适当的和及时的管理技术。草坪病原性微生物引起的草坪病害包括例如炭疽病、全蚀病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病(pythium blight)、褐斑病、币斑病(dollar spot)等。

用于控制病原体的农业活性化学品，例如杀真菌剂，通常根据病害压力的程度、病原体群体、天气等需要施用于高尔夫球场。然而，杀真菌剂的施用受球场预算、适当设备可用性、以及施用农业活性化学品的合格人员的可用性高度控制。

考虑到这些问题，建立快速且可靠的草坪病原性真菌检测方法将是非常有用的。已知的PCR测定对于高尔夫球场或其他集中管理的草坪草或专业景观环境没有实用意义，因为PCR需要专业的实验室技能和仪器。例如，在WO 2009147017中已知并描述了用于检测草坪草中真菌病害的某些其他分子生物学方法，其涉及TRFLP方法。

因此，本发明涉及用于检测草坪样品中DNA的存在的LAMP测定，该DNA与引起相关草坪病害的选择的真菌病原体相关联，这些草坪病害包括例如炭疽病、全蚀病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病、褐斑病和币斑病。

为了便于及时地和有效检测草坪草病害病原体，并提高草坪草病害治疗的成本和的有效性，根据本发明的LAMP测定可用于早期检测与引起相关草坪病害的真菌病原体相关联的DNA。根据本发明，LAMP方法适合使用衍生自靶病害病原体的至少四个且优选地六个或更多个核酸序列的引物组。更特别地，本发明方法提供了：用于LAMP测定选择的引物组中使用的每个引物具有15个到50个核酸，并且其中该组中的引物选自靶标真菌内的特定DNA基因座。

根据本发明，提供了用环介导等温扩增(LAMP)测定检测草坪草样品中真菌DNA的方法，该测定含有用于草坪病原性真菌的真菌DNA(核酸)的引物，这些草坪病原性真菌选自由以下组成的组：币斑病核盘菌(Sclerotinia homoeocarpa)、立枯丝核菌物种(Rhizoctonia solani spp.)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、禾顶囊壳菌物种(Gaeumannomyces graminis spp.)、雪霉叶枯菌物种(Microdochium nivale spp.)、夏季斑枯病菌(Magnaporthe poae)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、谷物炭疽菌(Colletotrichum cereale)和终极腐霉菌终极变种(Pythium ultimum var.ultimum)(靶标真菌)。本发明的LAMP测定使用至少四个且优选地六个或更多个核酸序列的引物组，其中该组中的每个引物具有15个到50个核酸，并且其中待检测的真菌DNA获得自靶标真菌病原体。本LAMP测定方法中可用的引物选自靶标真菌的特定的内部转录间隔区或基因，以提供改进的测定结果。

在一个特别的实施例中，雪霉叶枯菌物种靶标真菌选自雪霉叶枯菌雪霉变种(Microdochium nivale var.nivale)和雪霉叶枯菌大孢变种(Microdochium nivalevar.majus)。在另一个实施例中，禾顶囊壳菌物种靶标真菌选自禾顶囊壳菌燕麦变种(Gaeumannomyces graminis var.avenae)、禾顶囊壳菌水稻变种(Gaeumannomycesgraminis var.graminis)和禾顶囊壳菌小麦变种(Gaeumannomyces graminisvar.tritici)。在其它实施例中，立枯丝核菌物种靶标真菌选自立枯丝核菌AG2-2IV和立枯丝核菌AG2-2IIIB。

在本发明的上下文中，用本发明的LAMP测定检测草坪样品中的真菌DNA可以指示真菌病原体的存在，并且还可以协助评估如下的草坪病害病症的发生或存在：

在一个实施例中，

(a)用于币斑病核盘菌DNA的引物组选自SEQ ID NO:1的DNA内；

(b)用于立枯丝核菌DNA的引物组选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的DNA内；

(c)用于雪霉叶枯菌物种DNA(优选地雪霉叶枯菌雪霉变种)的引物组选自SEQ IDNO:3的DNA内；

(d)用于瓜果腐霉菌DNA的引物组选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的DNA内；

(e)用于禾顶囊壳菌物种DNA(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)的引物组选自SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的DNA内；

(f)用于雪霉叶枯菌物种DNA(优选地雪霉叶枯菌大孢变种)的引物组选自SEQ IDNO:6的DNA内；

(g)用于夏季斑枯病菌DNA的引物组选自SEQ ID NO:7的DNA内；

(h)用于禾生炭疽菌DNA的引物组选自SEQ ID NO:11的DNA内；

(i)用于谷物炭疽菌DNA的引物组选自SEQ ID NO:12的DNA内；以及

(j)用于终极腐霉菌终极变种DNA的引物组选自SEQ ID NO:13的DNA内。

优选地，根据本发明的适用于在检测草坪样品中真菌DNA中使用的LAMP引物组包含四个引物，这些引物包括：一对正向(FIP)和反向(BIP)内引物，以及一对正向(F3)和反向(B3)外引物。更优选地，适用于在本发明中使用的LAMP引物组包括添加正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)，以加速草坪样品中存在的核酸的扩增，并减少可能存在于这样的草坪样品中的任何靶标真菌的检测时间。下面列出的LAMP引物组实施例涉及根据本发明的方法检测草坪样品中的靶标真菌DNA。

在以下与根据本发明的SEQ ID No 14-91的引物相关联的实施例的描述中，将理解的是可用于本发明的引物各自独立地且分别地具有与14-91的SEQ ID的引物至少90％、优选地至少95％、更优选地至少96％和甚至更优选地至少97％同一的序列。

在一个特别优选的实施例中，可用于本发明的引物各自独立地且分别地具有与14-91的SEQ ID的引物至少98％、更优选地至少99％同一的序列。最优选地，可用于本发明的引物各自独立地且分别地具有与14-91的SEQ ID同一的序列。

因此，本发明提供了用环介导等温扩增(LAMP)测定检测草坪草样品中真菌DNA的方法，该测定含有用于至少一种草坪病原性真菌的真菌DNA的引物，这些草坪病原性真菌选自：币斑病核盘菌、立枯丝核菌物种、瓜果腐霉菌、禾顶囊壳菌物种、雪霉叶枯菌物种、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和终极腐霉菌终极变种，该方法包括：使草坪样品经受LAMP反应，其中该LAMP反应使用四个或更多个核酸序列的引物组，该组中的每个引物具有15个到50个核酸，并且其中引物的组包含至少一个如下所述的引物组。

在一个实施例中，用于检测币斑病核盘菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:15和27。

在另一个实施例中，用于检测币斑病核盘菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:14、15、16和17。

在其它实施例中，用于检测币斑病核盘菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18和19。

在其它实施例中，用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:23。

在另一个实施例中，用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:63、64和65。

在另一个实施例中，用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:20、21、22和23。

在另一个实施例中，用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:62、63、66和67。

在又另一个实施例中，用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:62、63、64、65、66和67。

在另一个实施例中，用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:20、21、22、23、24和25。

在另一个实施例中，用于检测雪霉叶枯菌物种(优选地雪霉叶枯菌雪霉变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:27、28和29。

在另一个实施例中，用于检测雪霉叶枯菌物种(优选地雪霉叶枯菌雪霉变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:26、27、28和29。

在其它实施例中，用于检测雪霉叶枯菌物种(优选地雪霉叶枯菌雪霉变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID No:26、27、28、29、30和31。

在一个实施例中，用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:33、36和37。

在另一个实施例中，用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:32、33、36和37。

在另一个实施例中，用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:32、33、34、35、36和37。

在另一个实施例中，用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:69、70和71。

在另一个实施例中，用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:68、69、72和73。

在另一个实施例中，用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:68、69、70、71、72和73。

在一个实施例中，用于检测禾顶囊壳菌物种(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:60。

在另一个实施例中，用于检测禾顶囊壳菌物种(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:42和43。

在其它实施例中，用于检测禾顶囊壳菌物种(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:38、39、42和43。

在其它实施例中，用于检测禾顶囊壳菌物种(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:56、57、60和61。

在另一个实施例中，用于检测禾顶囊壳菌物种(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:38、39、40、41、42和43。

在另一个实施例中，用于检测禾顶囊壳菌物种(优选地禾顶囊壳菌燕麦变种、禾顶囊壳菌水稻变种或禾顶囊壳菌小麦变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:56、57、58、59、60和61。

在一个实施例中，用于检测雪霉叶枯菌物种(优选地雪霉叶枯菌大孢变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:48和49。

在其它实施例中，用于检测雪霉叶枯菌物种(优选地雪霉叶枯菌大孢变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:44、45、48和49。

在又另一个实施例中，用于检测雪霉叶枯菌物种(优选地雪霉叶枯菌大孢变种)DNA的引物组包含或选自SEQ ID No:44、45、46、47、48和49。

在另一个实施例中，用于检测夏季斑枯病菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:54和55。

在其它实施例中，用于检测夏季斑枯病菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:50、51、54和55。

在另一个实施例中，用于检测夏季斑枯病菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:50、51、52、53、54和55。

在一个实施例中，用于检测禾生炭疽菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:74、76和77。

在其它实施例中，用于检测禾生炭疽菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:7475、78和79。

在另一个实施例中，用于检测禾生炭疽菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:74、75、76、77、78和79。

在另一个实施例中，用于检测谷物炭疽菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID No 80、82和83。

在其它实施例中，用于检测谷物炭疽菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:80、81、84和85。

在另一个实施例中，用于检测谷物炭疽菌DNA的引物组包含或选自SEQ ID No:80、81、82、83、84和85。

在一个实施例中，用于检测终极腐霉菌终极变种ldin-rc DNA的引物组包含或选自SEQ ID No:86、88和89。

在其它实施例中，用于检测终极腐霉菌终极变种ldin-rc DNA的引物组包含或选自SEQ ID NO:86、87、90和91。

在另一个实施例中，用于检测终极腐霉菌终极变种ldin-rc DNA的引物组包含或选自SEQ ID No:86、87、88、89、90和91。

本发明的LAMP测定可用于检测(包括早期检测)来自草坪真菌的DNA，其易于获得并允许对草坪草的管理和/或维持做相应地调整，这些草坪真菌选自由以下组成的组：草坪样品中的币斑病核盘菌、立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、禾顶囊壳菌物种、雪霉叶枯菌物种、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和终极腐霉菌终极变种。

根据本发明，“草坪草”被理解为一年生或多年生禾本科。所述禾本科优选地属于以下属中的一种或多种：冰草属、剪股颖属、地毯草属、雀麦属、野牛草属、狗牙根属、假俭草属、羊茅属、黑麦草属、雀稗属、狼尾草属、梯牧草属、早熟禾属、钝叶草属或结缕草属。更优选地，所述禾本科属于以下属中的一种或多种：剪股颖属、野牛草属、狗牙根属、假俭草属、羊茅属、黑麦草属、雀稗属、狼尾草属、早熟禾属、钝叶草属或结缕草属。

在一个实施例中，根据本发明的“草坪”被理解为一组草坪草，其覆盖了地面的表面面积并且经受定期维持。

本发明可以与所有的草坪草一起实践，包括冷季型草坪草以及暖季型草坪草。

冷季型草坪草的实例为：早熟禾(Poa L.)，例如草地早熟禾(Poa pratensis L.)、粗茎早熟禾(Poa trivialis L.)、加拿大早熟禾(Poa compressa L.)和一年生早熟禾(Poaannua L.)；剪股颖(Agrostis L.)，例如匍匐剪股颖(Agrostis palustris Huds.)、细弱剪股颖(Agrostis tenius Sibth.)、绒毛剪股颖(Agrostis canina L.)和小糠草(Agrostisalba L.)；羊茅属(Festuca L.)，例如匍匐紫羊茅(Festuca rubra L.)、细羊茅(Festucarubra var.commutata Gaud.)、羊茅(Festuca ovina L.)、硬羊茅(Festuca longifolia)、高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)、草地羊茅(Festuca elatior L.)；黑麦草(Lolium L.)，例如多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、多花黑麦草(Lolium multiflorumLam.)；冰草(Agropyron Gaertn.)，例如扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)、蓝茎冰草(Western Wheatgrass，Agropyron smithii Rydb.)。其他冷季型草坪草包括无芒雀麦草(Bromus inermis Leyss.)；以及梯牧草(Phleum L.)。

暖季型草坪草的实例是百慕大草(Cynodon L.C.Rich)、结缕草(Zoysia Willd.)、圣奥古斯丁草(Stenotaphrum secundatum(Walt.)Kuntze)、假俭草(Eremochloaophiuroides(Munro.)Hack.)、地毯草(Axonopus Beauv.)、百喜草(Paspalum notatumFlugge.)、铺地狼尾草(Pennisetum clandestinum Hochst.ex Chiov.)、野牛草(Buchloedactyloides(Nutt.)Engelm.)和海滨雀稗(Paspalum vaginatum swartz)。

LAMP方法发明还考虑使用LAMP测定检测草坪草样品中真菌的试剂盒。如本文所述，可以使用含有一个或多于一个的引物组的测试条。在一个实施例中，多个引物组在用于检测来自草坪草样品(采集自特定基因座)的多种病害的测试条上是多重化的。

例如，提供了具有滚珠轴承和适合量的裂解缓冲液的bijou管，其中有1立方厘米均质化的草坪样品，并将其剧烈振荡1分钟。测试条的样品孔含所有重悬浮缓冲液，并且将此测试溶液的液滴放置于测试条的样品孔中，其中这些孔具有进行LAMP反应所需的所有成分(例如，引物组和试剂，如获得自Optigene公司的等温预混合液(isothermal mastermix，目录号iso-001)。在一个实施例中，测试条是多重化的。在另一个实施例中，测试条包括8个孔(两个对照和6个用于目的草坪病害)。在一个实施例中，测试条与诊断仪器(例如获得自OptiGene公司的

II或III)相关联。

引物设计

使用高度保守的基因来设计LAMP引物以检测来自选择的草坪草病原体的DNA(表3第1列)。使用NucleoSpin Plant II(马歇雷-纳格尔公司(MACHEREY-NAGEL))获得来自所有目的真菌的纯的基因组DNA。结合PCR技术，使用公开的引物对并随后用Sanger测序来扩增目的序列。对以下DNA基因座(基因和区域)进行测序：内部转录间隔区(ITS)、延伸因子1-α(EF)、β-微管蛋白(Tub)、细胞色素c氧化酶亚基1(Cox)、超氧化物歧化酶(SOD1)和大亚基核核糖体RNA(LSU)。使用ClustalW比对方法(CLC Main Workbench软件)对原始序列进行比对。使用BLAST与来自GenBank(NCBI)的序列进行比较来鉴定基因同源物。理想地，好的序列定义为针对所有靶标分类群的成功PCR扩增并且与其他分类群不具有同源性。

然后使用LAMP Designer 1.14(普莱美生物软件公司(PREMIER Biosoft))，将来自测序的DNA基因座的最佳序列(SEQ ID No 1-13)用于针对每个选择的草坪草病原体设计LAMP引物。因此，对不同的参数进行测试，以得到每个生物体和每个基因座的不同引物组(对于草坪病原体、选择的基因座和用于引物设计的最佳序列的SEQ ID的相关性，参见表3)。然后对表1中所示设计的引物组进行特异性(表3)和灵敏度(表4)测试。

表1

特异性

为了检查反应的特异性(参见以下文献)，对测定(使用设计的引物组的)用表2中所述来自真菌分离株的纯基因组DNA提取物进行测试。收集了来自不同地理来源的不同草坪草病原体的全面集合，并在不同培养基(马铃薯葡萄糖/麦芽/玉米粉/樱桃/V8)上生长。使用10日龄的真菌培养物从菌丝体(NucleoSpin Plant II-马歇雷-纳格尔公司(MACHEREY-NAGEL))提取DNA。用无核酸酶水稀释基因组DNA至5ng/μl，并使用2.5μl的一部分进行特异性测试。

在64℃下，在LightCycler 480(罗氏公司(Roche))上在96孔板中进行LAMP特异性测试持续55min。在从98℃冷却到65℃期间，以-0.1℃/秒的变化速率确定扩增子特异性退火温度。实时LAMP测定在10μl的反应混合物中进行，这些反应混合物含有5μl的1x浓度的等温预混合液(master mix，Optigene公司)、0.4μM每种外部引物、1.6μM每种内部引物、和0.8μM每种环引物(由Microsynth公司合成)以及2.5μl的基因组DNA。

所有反应一式两份在不同的两天进行。

进行特异性的文献：

Besuschio,S.A.,Murcia,M.L.,Benatar,A.F.,Monnerat,S.,Cruz,I.,Picado,A.,Schijman,A.G.(2017).Analytical sensitivity and specificity of a loop-mediated isothermal amplification(LAMP)kit prototype for detection ofTrypanosoma cruzi DNA in human blood samples.[环介导等温扩增(LAMP)试剂盒原型用于检测人血液样品中克氏锥虫DNA的分析灵敏度和特异性]PLOS Neglected TropicalDiseases[被忽视的热带病],11(7),e0005779.https://doi.org/10.1371/ journal.pntd.0005779

Kitamura,M.,Aragane,M.,Nakamura,K.,Watanabe,K.,和Sasaki,Y.(2016).Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)Assay for RapidDetection of Cannabis sativa.[开发用于快速检测大麻的环介导等温扩增(LAMP)测定]Biological and Pharmaceutical Bulletin[生物和医药学报],39(7),1144-1149.https://doi.org/10.1248/bpb.b16-00090

Seki,M.,Kilgore,P.E.,Kim,E.J.,Ohnishi,M.,Hayakawa,S.,和Kim,D.W.(2018).Loop-Mediated Isothermal Amplification Methods for Diagnosis ofBacterial Meningitis.[用于诊断细菌性脑膜炎的环介导等温扩增方法]Frontiers inPediatrics[儿科前沿],6.https://doi.org/10.3389/fped.2018.00057

Wang,D.-G.,Brewster,J.D.,Paul,M.,和Tomasula,P.M.(2015).Two Methodsfor Increased Specificity and Sensitivity in Loop-Mediated IsothermalAmplification.[环介导等温扩增中增加特异性和灵敏度的两种方法]Molecules[分子],20(4),6048-6059.https://doi.org/10.3390/molecules20046048

表2：

Stein和SYN菌株：先正达公司(Syngenta)，CH-4332Stein，瑞士

CBS菌株：韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(Westerdijk Fungal BiodiversityInstitute)，乌得勒支，荷兰

ZHAW菌株：苏黎世应用科学大学(Zurich University of Applied Sciences)，邮政信箱8820，韦登斯维尔，瑞士

结果解释：

如表3中所总结的，针对表2中列出的真菌菌株所设计的特异性靶标检查LAMP测定的特异性。作为特异性的附加确认，还如在表3中所示针对不同的扩增产物观察到匹配解链温度为82.6℃-89.9℃±0.5℃。

使用所有目的真菌的基因组DNA的连续稀释液(1ng至100fg)确定与Seq ID No.1-13(表1)的DNA相对应的所描述的引物组的灵敏度，其中每个反应一式两份在不同的两天进行。使用NucleoSpin Plant II(马歇雷-纳格尔公司(MACHEREY-NAGEL))获得来自所有真菌的纯的基因组DNA。在64℃下，在LightCycler 480(罗氏公司)上在96孔板中进行LAMP灵敏度测试持续55min。在从98℃冷却到65℃期间，以-0.1℃/秒的变化速率确定扩增子特异性退火温度。实时LAMP测定在10μl的反应混合物中进行，这些反应混合物含有5μl的1x浓度的等温预混合液(master mix，Optigene公司)、0.4μM每种外部引物、1.6μM每种内部引物、和0.8μM每种环引物(由Microsynth公司合成)以及2.5μl的基因组DNA。

表4

草坪草样品中真菌病原体的检测方法

样品收集

在预期有真菌病原体的位置收集一簇包括草根的草坪样品。草坪草也可能显示症状。将草坪样品放置在干净的50ml管(Corning(康宁))中，并在-20℃下储存，直到使用。使用植物材料裂解试剂盒(Plant Material Lysis Kit，Optigene公司)提取DNA。将1cm³的草坪样品放置于含有1ml裂解缓冲液(Optigene公司)的Bijou管中。通过振荡Bijou管持续1min进行草坪样品的均质化。将10μl体积的裂解物转移到提供的稀释管(Optigene公司)中，并通过振荡剧烈混合。随后将稀释的裂解物定义为模板。

LAMP反应

在一些实施例中，在约60℃至约70℃(例如，约64℃至约67℃，或约64℃至约66℃)下进行LAMP反应。在特定实例中，在64℃下进行LAMP反应。

在一些实施例中，允许LAMP反应进行约15至约45分钟，例如约20分钟至约40分钟，或约25分钟至约35分钟。

在一些实施例中，根据本发明的LAMP反应中的引物浓度；对于正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)为1.4-1.8μM，更特别地为1.6μM；对于正向外引物(F3)和反向外引物(B3)为0.2-0.4μM，更特别地为0.4μM；以及对于正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)为0.4-0.8μM，更特别地为0.8μM，这些引物浓度可用于加速草坪样品中存在的核酸的扩增，并降低可能存在于这样的草坪样品中的任何靶标真菌DNA的检测时间。

可用于LAMP测定的反应的合适缓冲系统包括：

来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的1X等温扩增缓冲液套装

20mM Tris-HCl

10mM(NH₄)₂SO₄

50mM KCl

2mM MgSO₄

0.1％

20

(在25℃下，pH 8.8)

来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的1X等温扩增缓冲液II套装

20mM Tris-HCl

10mM(NH₄)₂SO₄

150mM KCl

2mM MgSO₄

0.1％

20

(在25℃下，pH 8.8)

可用于LAMP测定的反应的合适酶系统(DNA聚合酶等)包括：

在一个实施例中，在具有干燥试剂(Optigene公司)的测试条中的Genie仪器(Optigene公司)上进行LAMP反应。在一个实施例中，这些条具有八个150μl的孔(2个对照和6个用于测试)。实时LAMP测定在25μl的反应混合物中进行，这些反应混合物含有15μl的1x浓度的等温预混合液(master mix，Optigene公司)、0.4μM每种外部引物、1.6μM每种内部引物、和0.8μM每种环引物(由Microsynth公司合成)，选自表1的引物组中的至少一个。在添加模板之前，将冻干的反应条在22μl重悬浮缓冲液(Optigene公司)中重悬浮。所有测试条都包括阴性对照和由Optigene公司提供的阳性植物对照引物组。对于所有测定，每个反应和孔添加3μl模板。将反应在64℃下保持30-55min，随后进行退火程序。在从98℃冷却到65℃期间，以-0.1℃/秒的变化速率确定退火程序的温度曲线。

等温预混合液含有荧光双链DNA结合染料，以允许实时检测扩增子。在反应时间、温度和每个反应添加的DNA体积方面，对测定进行了优化。

将在64℃下的扩增期期间获得的荧光数据报告为扩增时间。将在退火期期间获得的荧光推算数据报告为退火温度。

可替代地，LAMP测定反应不包括退火程序，在这种情况下，可以使用pH敏感指示剂染料来评估靶标真菌DNA的存在。在一些实例中，pH敏感指示剂染料是在可见光下可检测的有色染料。在特别的实例中，有色染料包含甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝或萘酚酞。在其他实例中，pH敏感指示剂染料是荧光指示剂染料。在特别的实例中，荧光染料包含2',7'-双-(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素、5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素、5(6)-羧基荧光素、3,6-二乙酰氧基邻苯二甲腈、6,8-二羟基-l,3-芘二磺酸或5-(和-6)-羧基半萘酚罗丹荧类(seminaphthorhodafluor)。

按照上述程序，检测草坪样品中真菌病原体DNA(表3)的存在可以指示可能导致相关草坪病害(包括例如炭疽病、全蚀病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病、褐斑病和币斑病)的草坪真菌病原体的存在。早期且有效的检测提供了可进行的合适的草坪草管理决策。

序列表

<110> Syngenta

ZHAW

Palmisano, Marilena

Wohler, Christian

<120> 用具有新颖引物组的LAMP测定检测草坪草中真菌的方法

<130> SYN-ZHAW

<160> 91

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 币斑病核盘菌

<400> 1

tagatctaca catggttctt acattatatt taggtcactt gatctacaag tgcggtggaa 60

ttgacaagcg tactattgaa aagttcgaga cggtatgact tctccacctt tctcttgcta 120

tcttttcccg tccttctcat cgagatcagt gtctgcgatc ttggtgctga tggatttatc 180

gggttgcgtt ttctctcatg cgcggagcat acatccgaat tctcaaccct ttgaacatta 240

ccacattgcc tttccagaat ccctttgcta acccgttaat aggaagccaa ggagatggga 300

aagggttcct tcaagtacgc atgggttttg gacaagttga aggctgagcg tgagcgtggt 360

atcaccatcg acattgccct ctggaagttc gagacaccta agtacaatgt tactgtcatt 420

ggtatgtgta cgaattcttt atgccaactg aagtatatta acccattcgc agatgccccc 480

ggtcatcgtg atttcatcaa gaacatgatc actggtacct cccaagctga ttgtgccatt 540

cttatcatcg ctgccggtgt tggtgagttc gaggctggta tctccaagga tggtcagacc 600

cgtgagcacg ctcttcttgc gtacactctt ggtgttaagc aacttatcgt tgccatcaac 660

aagatggaca ccaccaagtg gtccaaggat cgtttcgagg aaatcatcaa ggagacaacc 720

aacttcatca agaaggttgg ctacaacgcc aagactgttc ccttcgtgcc gatctctgga 780

ttcgagggtg ataacatgat tgagccctca actaactgcc catggtacaa gggctgggag 840

agagagtcca aggagtctgg caaacacacc ggcaagaccc ttcttgaggc catcgacagc 900

atggacctgc ct 912

<210> 2

<211> 629

<212> DNA

<213> 立枯丝核菌AG2-2IIIB

<400> 2

tgtagctggc tccattagtt tggagcatgt gcacaccttt tgctcttttt ttaatccaca 60

cacacctgtg aacctgtgag gcagagacat ggatgggaga acttttattt actttaaaat 120

gaatgattgg gacccctacc cccccccccc tctgtctact caactctaat ataaacccaa 180

tttattttaa aatgaatgta atggatgtaa cgcatctaat actaagtttc aacaacggat 240

ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag 300

aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc accttgcgct ccttggtatt ccttggagca 360

tgcctgtttg agtatcatga aatcttcaaa gtaaaccttt ttgttaactc aatttggttt 420

cactttggta ttggaggttc ttgcagcttc acacgctgct cctctttgtt cattagctgg 480

atctcagtgt tatgcttggt tcctctcggc gtgataaatt atctatcgct gaggactccc 540

gataaaaagg ttggccaagg taaatgcaga tgaaccgctt ctaatagtcc attgacttgg 600

acaataaaat aattattatt ttacgatct 629

<210> 3

<211> 613

<212> DNA

<213> 雪霉叶枯菌雪霉变种

<400> 3

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttctggtgc gtacacctcg actcgaagac gaccacgacc 60

ttcgcgacga aaatgaactc ggcagccaaa aaccgtgccg tcgagaatct ttagtcgcag 120

aggaatctaa cataagggtg gagaccggca aggctaacac tatcttccct gatacaggca 180

gaccatctcc ggcgagcacg gtcttgacag cgatggagtg taagttcaat aaccgactcg 240

cagttccttg cgagagaccg cttccctgac ggcttctcgg gccagatgaa atgcaacagt 300

actgacattc tgccaatagc tacaacggca actctgagct ccagctcgag cgcatgagcg 360

tctacttcaa cgaggtatgt caccatgggc gacttcgggc ttcacacatt cggccagcta 420

ctaactgacc acccacataa cttaggcttc cggcaacaag tacgttcccc gcgccgtcct 480

cgtcgatctc gagcccggta ccatggatgc cgtccgtgct ggtcccttcg gccagctgtt 540

ccgtcccgac aacttcgtct tcggtcagtc cggtgctggc aacaattggg ccaagggtca 600

ctacactgag ggt 613

<210> 4

<211> 455

<212> DNA

<213> 瓜果腐霉菌

<400> 4

cttcagtgaa ctccatctcg tccataccct caccagtgta ccagtgcaag aaggccttac 60

gacggaacat ggccgtgaac tgctcgctga cacgcttgaa catctcctgg atggcagtcg 120

agttaccgat gaacgtggcg ctcatcttga gaccctttgg tgggatgtca caaacgctgg 180

ccttgatgtt gttcgggatc cactcaacga agtacgacga gttcttgttc tgaacgttga 240

gcatctgctc gtcgacctcc ttggtgctca tacgaccacg gaacatacaa gcggcggtca 300

ggtaacgacc gtgacgagga tcagcggcac acatcatgtt cttggcgtcg aactgctgct 360

gggtcagctc tggcaccgta agggcacggt actgctgcga gccgcgcgag gtgagcggag 420

cgaaaccgac catgaagaag tggaacgggg gaaaa 455

<210> 5

<211> 518

<212> DNA

<213> 禾顶囊壳菌燕麦变种

<400> 5

ttagtgaccc ttggcccagt tgttgccagc accagactgg ccgaaaacga agttgtcggg 60

gcggaacagc tggccgaagg gaccggcacg aacggcgtcc atggtgccgg gctcgagatc 120

gacgaggacg gcacggggga catgcttgtt gccggaggcc tggagcggaa aggttatggg 180

tcagaataca tgatacgaag gtgggaaata ccggctgcta atgccggaca gaagcttcaa 240

ctcagggcct gtctgcatac ctcgttgaag tagacgctca tgcgctcgag ctggagctcc 300

gaggtgccgt tgtacctgta tcaatatgtc agagcggtga acggacggcg ggccgagcca 360

caagcaggac gaaatacgta cacgccattg ctgtcgagac cgtgctcgct agaaatggtc 420

tgcctgtcaa agaagtcagt acgggtcacg ggcagtggca gtcgtggtcg gcggcggatc 480

gtcgcgcggc gtcgtttcat accagaaagc agcaccgt 518

<210> 6

<211> 550

<212> DNA

<213> 雪霉叶枯菌大孢变种

<400> 6

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttctggtgc gtacaactcc gatactcaac gacggccgca 60

gtgacctttg cgacgaaaac aaactcggcg gtcaaacccg tatcgccgaa aatcttcggt 120

cgcagaggaa tctggcaaaa gggtggaaat aaacaagcaa ggctaacact ctcttccccg 180

acacaggcaa accatctcca gtgagcacgg tctcgacagc aatggcgtgt aagttcaata 240

accgactcgc acttcttgcg aaaggccact tccctgatgg cgtatcacgc cagatgaaat 300

acacaagtac tgacatcctg tcaatagcta caacggcacc tccgagctcc agctcgagcg 360

catgagtgtc tacttcaatg aggcttccgg caacaagtac gttcctcgtg ccgtccttgt 420

cgatctcgag cccggtacca tggatgccgt ccgtgctggt cccttcggcc agctgttccg 480

ccccgacaac ttcgtcttcg gtcagtccgg tgctggcaac aactgggcca agggtcacta 540

cactgagggt 550

<210> 7

<211> 485

<212> DNA

<213> 夏季斑枯病菌

<400> 7

ttagtgaccc ttggcccagt tgttgccagc accggactgg ccgaaaacga agttgtcggg 60

gcggaacagc tggccgaagg gaccagcacg gacagcatcc atggtgccgg gctcgagatc 120

gaccaggacg gcacggggga catgcttgtt gccggaggcc tagagcgcgg ggaggcaatg 180

gtgtcagaaa aacaacacgt ggttgcgaaa gagagacgcg ttcggagtct atctgcatac 240

ctcgttgaag tagacgctca tgcgctcgag ctggagctcc gaggtaccgt tgtaactgca 300

ccaatatgtc agagcggtga acggacatgt ggccgaggat ctcccaaaca gaatacatac 360

actccattgc tgtcgagacc gtgctcgctg gagatggttt gcctgcccag gaagtcagta 420

tcaatgatgg atgatcacgg tcgtggtggg tgcgagcggt ggttcgtacc agaaagcagc 480

accgt 485

<210> 8

<211> 539

<212> DNA

<213> 禾顶囊壳菌燕麦变种

<400> 8

cctcagtgaa ctccatctcg tccataccct cgccagtgta ccaatgaagg aaagccttgc 60

gcctgaacat ggcagtgaac tgctcaccaa cacgcttgaa gagctcttgt atggcagtcg 120

agtttccgat gaaggtcgac gacatcttca ggccccgggg agggattgag cagagggcgg 180

tctggatgtt gttgggaatc cactcgacga agtacgacga gttcttgttc tggatgttgc 240

gcatctggtc ctcgacctcc ttcatggaga ccttaccacg gctatcgcac acagggatgg 300

ttagttagtg ccttctaggt tgggcatatt aaatgggcca gataaataag cccaatgcct 360

agatgcaaga ctcacaaaat agcagagcag gtcaggtagc gaccgttgcg gaagtccgag 420

gcagccatca tgttcttggg gtcgaacatc tgctgggtca actcgggcac cgtgacggcg 480

cggaatgagt gggcgccgcg gctagtcagg ggagcgaagc cgaccatgaa gaagtggag 539

<210> 9

<211> 236

<212> DNA

<213> 立枯丝核菌AG2-2IV

<400> 9

gttgtagggc tcaacaaccg tgtcggagac cttgggggaa ggaacgaccg agaatgtgca 60

catcatacga tcggggtatt cttcacggat cttggagatc aaaagggtgc ccataccggc 120

accggttcct ccaccgagcg agtgggtaat ctggaagccc tgaagacact cgcatccctc 180

ggcctctttg cgcgcgacat cgagaactgc gtcaacaagc tcggcacctt cggtgt 236

<210> 10

<211> 604

<212> DNA

<213> 瓜果腐霉菌

<400> 10

tgctttttca ggtgtagttg gtacaacttt atctgtttta attagaatgg aattagcaca 60

acctggtaat caaattttta tgggaaatca tcaattatat aatgttgttg taacagcaca 120

tgcttttata atgattttct tcatggttat gcctgtatta attggtggtt ttggtaactg 180

gtttattcct ttaatgattg gtgctccaga tatggctttt cctagaatga ataatattag 240

tttttggtta ttacctcctt cattattatt attagtatca tctgctatag tagaatcagg 300

tgctggtaca ggttggactg tatatccacc attatcaagt gtacaagcac actcaggacc 360

ttcagtagat ttagctattt ttagtttaca tttatctggt atttcttcat tattaggtgc 420

tattaatttt ttatcaacta tttataatat gagagctcct ggattaagtt ttcatagatt 480

gccattattt gtttggtctg tttttattac agctttttta ttattgttaa cattaccagt 540

attagcaggt gctattacaa tgttattaac agatagaaat ttaaatactt ctttttatga 600

tcct 604

<210> 11

<211> 657

<212> DNA

<213> 禾生炭疽菌

<400> 11

aatattctcg acatatgcag cctttccgtt gagatactat gtacgatcac tgttagcatc 60

tcttttcaaa aaaggtcttg ttggtgtcca cgaacctgaa ggtagtacgc gtgctcccac 120

atgtcaatac caaagatggg cacgcccttg gtgacagggt cctggtcttt cgtcgtgata 180

atgctgaggc ccgttatgtc atccttaaca agccaccccc agccgctacc ggtgataccc 240

agcagcgtgg tgttgaaagc ctgcttgaac tggtcgagcc cgccccagac gcgggtgatc 300

tcggcgacga gctttggcgc cgcatcgggc gaggcatcac cgctcgaggc tggggaaagg 360

ttctcccaga atagggaatg gttgatgtgg ccgccgccgt tgaagtttag ggccgcgagg 420

acggcgatgc gattctggag cgggtttgca ttgtaagtct cgatggcctt gttcagattt 480

gtaacgtatg cttgatggct gtaggtggct tcatgtcaac tctcttcttc gctgcttcat 540

atttcatggt tatctcactg tttgctgtgg tgcagctcca tgatctgagc tgagatgtga 600

ggctcgaggg cctgcaggag gggtcagcgg gcgcgatcgc gagcacgagt aagggat 657

<210> 12

<211> 663

<212> DNA

<213> 谷物炭疽菌

<400> 12

cgttccagat gttctcgacg tacgccgctt ttccattgag gtactgaggc cgagcattgt 60

tagtaccttc caacaaagca gatccgtcag tgtttacgaa cctggaggta gtacgcgtgc 120

tcccacatgt ccacgccgaa gatgggcacg cccttggtga cagggtcctg gtctttcgtc 180

gtgatgatgc tcagacccgt tacgtcgtcc ttgaccagcc atccccagcc gctgccggtg 240

atacccagaa gcgtggcgtt gaaagcctgc ttgaactggt cgagcccgcc ccagacccgg 300

gcgatctcag cgacgagctt cggcgcggcg tctggcgagg cgtctgggct cgaggcaggg 360

gacaggtttt cccagaagag ggagtggttg atgtggccgc cgccgttgaa gttgagggct 420

gggaggacgg cgatgcggtt ctggaggggg ttcgcgttgt aggtctcgac ggccttgttt 480

agatttgtaa cgtatgcttc gtgactgcga tggtttgatt tcaaccctgt tcttctttgg 540

tttctagtgc ctagctctct tactgtttgc tgtggtgcag ctccatgatc tgggctgaga 600

tgtgcggctc gagagcctgg aagaggggtc agcgggtgcg accgcgaaca caagtacggg 660

gat 663

<210> 13

<211> 703

<212> DNA

<213> 终极腐霉菌终极变种

<400> 13

tcagaagaaa ggtttcctac ctcagacagc gtacgccatc ctttactttc atttcgcgct 60

ggggtttcca caccctaaca cttgcacaca tgttagactc cttggtccgt gtttcaagac 120

gggccgaatc gctccatttc gtcaaagtcc cgaacggcaa aagttactct agatctcaat 180

cgaccaatca ctccgtcagc atagcaagct atccaaacag gtaaccaaac gagagtccca 240

aacactttaa agcacattgt aggcacctca gtcccaacca cgacaactaa ctaccaagat 300

ataacagcca agagcaagct cctaacctac ctcctcagta gccatttctc acagcatacg 360

aactgactct gacgtcccac cgcaacacag ggcaccaaca agcaaacgca gaacagcaca 420

aagagcagaa aaccacttct tacatactgc acgcacctac tcgccaatga aatatgctac 480

agattataga cactggatac gattcgcttc cctttcagca gtttcaggta ctctttaact 540

ctcttttcaa agttcttttc atctttccct cacggtactt gttcgctatc ggtctcgcac 600

caatatttag ctttagatgg aatttaccac ctactttgcg ctgcagtccc aaacaacgcg 660

actcaaagaa aacgtgtcgt acgcacaagc tactcaggca caa 703

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 14

gctcagcctt caacttgt 18

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 15

gcctttccag aatccctttg ctttttgaag gaaccctttc ccatc 45

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 16

ggtggaattg acaagcgta 19

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 17

atgctccgcg catgagagtt ttcttctcat cgagatcagt gtc 43

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 18

ccgttaatag gaagccaagg a 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 19

tccatcagca ccaagatcg 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 20

atttaccttg gccaaccttt 20

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 21

gcttcacacg ctgctccttt ttggagtcct cagcgataga t 41

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 22

tgtagctggc tccattagt 19

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 23

ggggtagggg tcccaatcat ttttgcacac cttttgctct t 41

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 24

tagctggatc tcagtgttat gc 22

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 25

ctcccatcca tgtctctgc 19

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 26

aatgtgtgaa gcccgaag 18

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 27

gcttccctga cggcttctct tttctcagag ttgccgttgt ag 42

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 28

gtcgcagagg aatctaacat aa 22

<210> 29

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 29

aggaactgcg agtcggttat tgtttttaca ggcagaccat ctcc 44

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 30

acagtactga cattctgcca at 22

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 31

acactccatc gctgtcaag 19

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 32

tgaactccat ctcgtccata 20

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 33

tcgtatgagc accaagga 18

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 34

gatgttcaag cgtgtcagc 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 35

gctggccttg atgttgttc 19

<210> 36

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 36

cggtaactcg actgccatcc ttttccttac gacggaacat gg 42

<210> 37

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 37

ccctttggtg ggatgtcaca attttctcgt cgtacttcgt tgag 44

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 38

ttgaagtaga cgctcatgc 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 39

gtgctgcttt ctggtatga 19

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 40

cgttcaccgc tctgacat 18

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 41

cgctagaaat ggtctgcct 19

<210> 42

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 42

ttcgtcctgc ttgtggctct tttgccgttg tacctgtatc aat 43

<210> 43

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 43

ttgctgtcga gaccgtgctt tttgacccgt actgacttct t 41

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 44

ggtaaccaaa tcggtgct 18

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 45

gcgagtcggt tattgaact 19

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 46

tttcgtcgca aaggtcact 19

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 47

aacaagcaag gctaacactc t 21

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 48

gggtttgacc gccgagtttt ttgcgtacaa ctccgatact c 41

<210> 49

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 49

ggaatctggc aaaagggtgg atttttgctc actggagatg gtt 43

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 50

ttgaagtaga cgctcatgc 19

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 51

gctgctttct ggtacgaa 18

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 52

tcaccgctct gacatattgg 20

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 53

gctggagatg gtttgcct 18

<210> 54

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 54

ggagatcctc ggccacatgt tttcgaggta ccgttgtaac tg 42

<210> 55

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 55

ttgctgtcga gaccgtgctt ttaccgtgat catccatcat tg 42

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 56

gacgaagtac gacgagttc 19

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 57

ctccacttct tcatggtcg 19

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 58

cgatagccgt ggtaaggtc 19

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 59

aggcagccat catgttctt 19

<210> 60

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 60

gcccaaccta gaaggcacta actttttcct cgacctcctt catg 44

<210> 61

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 61

ggtcaggtag cgaccgttgt tttgagttga cccagcagat g 41

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 62

ttgtagggct caacaacc 18

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 63

gacgcagttc tcgatgtc 18

<210> 64

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 64

ggcacccttt tgatctccaa gattttggaa cgaccgagaa tgtg 44

<210> 65

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 65

ataccggcac cggttccttt ttgatgcgag tgtcttcagg 40

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 66

ccgtgaagaa taccccgatc 20

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 67

ccgagcgagt gggtaatc 18

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 68

aattagcaca acctggtaat ca 22

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 69

acttaatcca ggagctctca ta 22

<210> 70

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 70

gccatatctg gagcaccaat cattttaatg ttgttgtaac agcacatg 48

<210> 71

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 71

aatcaggtgc tggtacaggt tgttttaatc tactgaaggt cctgagt 47

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 72

aaccaccaat taatacaggc at 22

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 73

accattatca agtgtacaag ca 22

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 74

tgtacgatca ctgttagcat c 21

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 75

ctcgaccagt tcaagcag 18

<210> 76

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 76

ggcgtgccca tctttggtat tttgtgtcca cgaacctgaa g 41

<210> 77

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 77

ggtgacaggg tcctggtctt tttgtggctt gttaaggatg aca 43

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 78

ttgacatgtg ggagcacg 18

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 79

tcgtcgtgat aatgctgagg 20

<210> 80

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 80

cgttccagat gttctcgac 19

<210> 81

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 81

gtcaaggacg acgtaacg 18

<210> 82

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 82

gcgtactacc tccaggttcg tattttgagc attgttagta ccttcca 47

<210> 83

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 83

atgtccacgc cgaagatggt tttctgagca tcatcacgac g 41

<210> 84

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 84

aacactgacg gatctgctt 19

<210> 85

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 85

tgacagggtc ctggtctt 18

<210> 86

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 86

caaacgagag tcccaaac 18

<210> 87

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 87

atccagtgtc tataatctgt ag 22

<210> 88

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 88

gagtcagttc gtatgctgtg agtttttaac agccaagagc aagc 44

<210> 89

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 89

cgcaacacag ggcaccaact tttgtgcagt atgtaagaag tggt 44

<210> 90

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 90

ggctactgag gaggtaggt 19

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于真菌检测的引物

<400> 91

agaacagcac aaagagcaga 20

Claims

1.一种用环介导等温扩增(LAMP)测定来检测草坪草样品中真菌DNA的方法，该测定含有用于至少一种草坪病原性真菌的真菌DNA的引物，这些草坪病原性真菌选自：币斑病核盘菌、立枯丝核菌物种、瓜果腐霉菌、禾顶囊壳菌物种、雪霉叶枯菌物种、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和终极腐霉菌终极变种，该方法包括：

使草坪样品经受LAMP反应，其中该LAMP反应使用四个或更多个核酸序列的引物组，该组中的每个引物具有15个到50个核酸，并且其中引物的组包含至少一个选自以下的引物组：

(a)用于检测币斑病核盘菌DNA的引物组，该币斑病核盘菌DNA包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:14、15、16和17至少90％同一的序列的引物；

(b)用于检测立枯丝核菌DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ IDNO:20、21、22和23至少90％同一的序列的引物，或包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:62、63、66和67至少90％同一的序列的引物；

(c)用于检测雪霉叶枯菌雪霉变种DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:26、27、28和29至少90％同一的序列的引物；

(d)用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ IDNO:32、33、36和37至少90％同一的序列的引物；

(e)用于检测禾顶囊壳菌燕麦变种DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:38、39、42和43至少90％同一的序列的引物；

(f)用于检测雪霉叶枯菌大孢变种DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:44、45、48和49至少90％同一的序列的引物；

(g)用于检测夏季斑枯病菌DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ IDNO:50、51、54和55至少90％同一的序列的引物；

(h)用于检测禾生炭疽菌DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ IDNO:74 75、78和79至少90％同一的序列的引物；

(i)用于检测谷物炭疽菌DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ IDNO:80、81、84和85至少90％同一的序列的引物；以及

(j)用于检测终极腐霉菌终极变种DNA的引物组，该引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:86、87、90和91至少90％同一的序列的引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测币斑病核盘菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:14、15、16、17、18和19至少90％同一的序列的引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:62、63、64、65、66和67至少90％同一的序列的引物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测立枯丝核菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:20、21、22、23、24和25至少90％同一的序列的引物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测雪霉叶枯菌雪霉变种DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:26、27、28、29、30和31至少90％同一的序列的引物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:32、33、34、35、36和37至少90％同一的序列的引物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测瓜果腐霉菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:68、69、70、71、72和73至少90％同一的序列的引物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测禾顶囊壳菌燕麦变种DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:38、39、40、41、42和43至少90％同一的序列的引物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测禾顶囊壳菌燕麦变种DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:56、57、58、59、60和61至少90％同一的序列的引物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测雪霉叶枯菌大孢变种DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:44、45、46、47、48和49至少90％同一的序列的引物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测夏季斑枯病菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:50、51、52、53、54和55至少90％同一的序列的引物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测禾生炭疽菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:74、75、76、77、78和79至少90％同一的序列的引物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测谷物炭疽菌DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID No 80、81、82、83、84和85至少90％同一的序列的引物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，该用于检测终极腐霉菌终极变种DNA的引物组包含或选自各自分别具有与SEQ ID NO:86、87、88、89、90和91至少90％同一的序列的引物。

15.一种使用LAMP测定检测草坪草样品中真菌DNA的试剂盒，该试剂盒包含一个或多于一个权利要求1-14中鉴定的引物组。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括缓冲液、DNA聚合酶。