KR20200118071A - 신규한 프라이머 세트를 갖는 lamp 검정으로 터프 그래스에서 진균을 검출하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 리족토니아 솔라니 종(Rhizoctonia solani spp.), 피시움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 게우만노마이세스 그라미니스 종(Gaeumannomyces graminis spp.), 미크로도키움 니발레 종(Microdochium nivale spp.), 마그나포르테 포아에(Magnaporthe poae), 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola), 콜레토트리쿰 세레알레(Colletotrichum cereale) 및 피시움 울티뭄 변종 울티뭄(Pythium ultimum var. ultimum)으로부터 선택되는 적어도 하나의 터프 병원성 진균의 진균 DNA에 대한 프라이머를 함유하는 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 검정으로 터프 그래스(turf grass) 샘플에서 진균 DNA를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 터프 샘플을 LAMP 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 LAMP 반응은 4개 이상의 핵산 서열의 프라이머 세트를 사용하고, 상기 세트의 각 프라이머는 15 내지 50개의 핵산을 갖는다. 본 발명의 방법에 유용한 프라이머는 개선된 검정 결과를 제공하기 위해 표적 진균의 특이적으로 선택된 내부 전사 스페이서 영역 또는 유전자로부터 선택된다.
Description
본 발명은 진균 병원체에 의해 유발되는 터프 그래스에서의 질병을 상기 터프 그래스(turf grass)의 샘플의 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 검정으로 검출하여 하나 이상의 진균으로부터 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, US 6410278호(Eiken)에 기재된 바와 같은 LAMP 또는 루프-매개 등온 증폭은 표적 유전자 상의 6개의 별개의 영역을 인지하도록 특이적으로 설계된 적어도 4개 이상의 상이한 프라이머(예를 들어, http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html 참조)의 사용을 특징으로 하는 DNA 증폭 방법이며, 상기 반응 과정은 가닥 치환 반응을 사용하여 일정한 온도에서 진행된다. 관심 표적 핵산의 증폭 및 검출은 일정한 온도(약 65'C)에서 생물학적 샘플 또는 이의 핵산 추출물, 프라이머, 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 기질의 혼합물을 인큐베이션함으로써 단일 단계로 완료될 수 있다. 이는 높은 증폭 효율을 제공하며, DNA는 15 내지 60분 내에 여러번 증폭된다. 이의 높은 특이성으로 인해, 증폭된 생성물의 존재는 표적 유전자의 존재를 나타낼 수 있다(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html).
사용자가 기대하는 표준 품질로 터프 그래스를 유지시키는 데 터프 그래스 관리자가 직면하는 여러 문제가 있다. 많은 문제가 있지만, 특히 질병(진균 병원체에 의해 유발되는 질병을 포함함)과 관련된 문제는 관리 및 방제하기가 어렵다. 예를 들어, 질병은 골프 코스 상의 터프 그래스 식물에 영향을 미쳐 플레이어빌리티(playability)를 포함하는 품질의 감소로 인한 수입 손실을 초래할 수 있다. 골프 코스 관리자에게 일반적인 문제 중 하나의 예는 적당하고 시의적절한 관리 기법을 취할 수 있도록 어떠한 질병이 존재하는지 아는 것이다. 터프 병원성 미생물에 의해 유발되는 관련 터프 질병은, 예를 들어 탄저병, 테이크-올 패치(take-all patch), 썸머 패치(summer patch), 설부병(snow mold), 피시움 마름병(pythium blight), 브라운 패치(brown patch) 및 달라 스팟(dollar spot)을 포함한다.
살진균제와 같은 병원체를 방제하기 위한 농업용 활성 화학물질은 전형적으로 질병 압력의 정도, 병원체 집단, 날씨 등에 따라, 필요한 경우 골프 코스에 시용된다. 그러나, 살진균제 시용은 코스 예산, 적당한 장비의 이용 가능성, 및 농업용 활성 화학물질을 시용하기 위한 자격을 갖춘 인력의 이용 가능성에 의해 고도로 제어된다.
이들 문제점을 고려하여, 터프 병원성 진균의 검출을 위한 신속하고 신뢰성 있는 검정이 매우 유용할 것이다. 공지된 PCR 검정은 골프 코스 또는 기타 집중적으로 관리되는 터프 그래스 또는 전문적인 조경 환경에서 사용하기에 실용적이지 않은데, 이는 PCR이 전문적인 실험실 기술 및 도구를 필요로 하기 때문이다. 터프 그래스에서 진균 질병을 검출하기 위한 특정한 다른 분자생물학 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 TRFLP 방법론과 관련된 WO2009147017호에 기재되어 있다.
따라서 본 발명은, 예를 들어 탄저병, 테이크-올 패치, 썸머 패치, 설부병, 피시움 마름병, 브라운 패치 및 달라 스팟을 포함하는 관련 터프 질병을 유발하는 선택된 진균 병원체와 관련된 터프 샘플 내의 DNA의 존재를 검출하기 위한 LAMP 검정에 관한 것이다.
터프 그래스 질병 병원체의 시의적절하고 효율적인 검출을 촉진하고, 터프 그래스 질병 치료의 비용 및 효과를 개선시키기 위해, 본 발명에 따른 LAMP 검정은 관련 터프 질병을 유발하는 진균 병원체와 관련된 DNA를 조기에 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명에 따르면, LAMP 방법은 적합하게는 표적 질병 병원체로부터 유래된 적어도 4개, 및 바람직하게는 6개 이상의 핵산 서열의 프라이머 세트를 사용한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법에서는 LAMP 검정을 위해 선택된 프라이머 세트에 사용된 각각의 프라이머가 15 내지 50개의 핵산을 가지며, 세트의 프라이머가 표적 진균 내의 특정 DNA 유전자좌로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 리족토니아 솔라니 종(Rhizoctonia solani spp.), 피시움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 게우만노마이세스 그라미니스 종(Gaeumannomyces graminis spp.), 미크로도키움 니발레 종(Microdochium nivale spp.), 마그나포르테 포아에(Magnaporthe poae), 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola), 콜레토트리쿰 세레알레(Colletotrichum cereale) 및 피시움 울티뭄 변종 울티뭄(Pythium ultimum var. ultimum)(표적 진균)으로 구성된 군으로부터 선택되는 터프 병원성 진균의 진균 DNA(핵산)에 대한 프라이머를 함유하는 루프-매개 등온 증폭(LAMP) 검정으로 터프 그래스 샘플에서 진균 DNA를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 본 발명의 LAMP 검정은 15 내지 50개의 핵산을 갖는 세트의 각 프라이머와 함께 적어도 4개, 및 바람직하게는 6개 이상의 핵산 서열의 프라이머 세트를 사용하며, 검출될 진균 DNA는 표적 진균 병원체로부터 획득된다. 본 발명의 LAMP 검정 방법에 유용한 프라이머는 개선된 검정 결과를 제공하기 위해 표적 진균의 특정 내부 전사 스페이서 영역 또는 유전자로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종 표적 진균은 미크로도키움 니발레 변종 니발레(Microdochium nivale var. nivale) 및 미크로도키움 니발레 변종 마주스(Microdochium nivale var. majus)로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종 표적 진균은 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에(Gaeumannomyces graminis var. avenae), 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스(Gaeumannomyces graminis var. graminis) 및 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 리족토니아 솔라니 종 표적 진균은 리족토니아 솔라니 AG2-2IV 및 리족토니아 솔라니 AG2-2IIIB로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서, 터프 샘플에서 본 발명의 LAMP 검정을 이용한 진균 DNA의 검출은 진균 병원체의 존재를 나타낼 수 있고, 또한 하기와 같은 터프 질병 상태의 개시 또는 존재를 평가하는 데 도움을 줄 수 있다:
일 구현예에서,
(a) 스클레로티니아 호모에오카르파 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 1의 DNA 내로부터 선택되고;
(b) 리족토니아 솔라니 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 9의 DNA 내로부터 선택되고;
(c) 미크로도키움 니발레 종 DNA(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 니발레)에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 3의 DNA 내로부터 선택되고;
(d) 피시움 아파니더마툼 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 10의 DNA 내로부터 선택되고;
(e) 게우만노마이세스 그라미니스 종 DNA(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시)에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 8의 DNA 내로부터 선택되고;
(f) 미크로도키움 니발레 종 DNA(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 마주스)에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 6의 DNA 내로부터 선택되고;
(g) 마그나포르테 포아에 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 7의 DNA 내로부터 선택되고;
(h) 콜레토트리쿰 그라미니콜라 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 11의 DNA 내로부터 선택되고;
(i) 콜레토트리쿰 세레알레 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 12의 DNA 내로부터 선택되고;
(j) 피시움 울티뭄 변종 울티뭄 DNA에 대한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 13의 DNA 내로부터 선택된다
바람직하게는, 본 발명에 따른 터프 샘플에서 진균 DNA를 검출하는 데 사용하기에 적합한 LAMP 프라이머 세트는 한 쌍의 정방향(FIP) 및 역방향(BIP) 내부 프라이머, 및 한 쌍의 정방향(F3) 및 역방향(B3) 외부 프라이머를 포함하는 4개의 프라이머를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기에 적합한 LAMP 프라이머 세트는 터프 샘플에 존재하는 핵산의 증폭을 가속화하기 위해, 그리고 이러한 터프 샘플에 존재할 수 있는 임의의 표적 진균의 검출 시간을 감소시키기 위해, 루프 정방향(LF) 및/또는 루프 역방향(LB) 프라이머의 첨가를 포함한다. 하기 열거된 LAMP 프라이머 세트 구현예는 본 발명의 방법에 따른 터프 샘플에서의 표적 진균 DNA의 검출에 관한 것이다.
본 발명에 따른 SEQ ID No. 14 내지 91의 프라이머와 관련된 하기 구현예의 기재에서, 본 발명에 유용한 프라이머는 각각 독립적 및 개별적으로 14 내지 91의 SEQ ID의 프라이머와 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97% 동일한 서열을 갖는다는 것이 이해될 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 유용한 프라이머는 각각 독립적 및 개별적으로 14 내지 91의 SEQ ID의 프라이머와 적어도 적어도 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 유용한 프라이머는 각각 독립적 및 개별적으로 14 내지 91의 SEQ ID와 동일한 서열을 갖는다.
따라서, 본 발명은 스클레로티니아 호모에오카르파, 리족토니아 솔라니 종, 피시움 아파니더마툼, 게우만노마이세스 그라미니스 종, 미크로도키움 니발레 종, 마그나포르테 포아에, 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 콜레토트리쿰 세레알레 및 피시움 울티뭄 변종 울티뭄으로부터 선택되는 적어도 하나의 터프 병원성 진균의 진균 DNA에 대한 프라이머를 함유하는 루프-매개 등온 증폭(LAMP) 검정으로 터프 그래스 샘플에서 진균 DNA를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 터프 샘플을 LAMP 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 LAMP 반응은 4개 이상의 핵산 서열의 프라이머 세트를 사용하고, 상기 세트의 각 프라이머는 15 내지 50개의 핵산을 갖고, 상기 프라이머의 세트는 하기 기재되는 바와 같은 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함한다.
일 구현예에서, 스클레로티니아 호모에오카르파 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 15 및 27을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 스클레로티니아 호모에오카르파 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 14, 15, 16 및 17을 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 스클레로티니아 호모에오카르파 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 및 19를 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 23을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 63, 64 및 65를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 20, 21, 22 및 23을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 62, 63. 66 및 67을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 62, 63, 64, 65, 66 및 67을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 20, 21, 22, 23, 24 및 25를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 니발레) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 27, 28 및 29를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 니발레) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 26, 27, 28 및 29를 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 니발레) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 26, 27, 28, 29, 30 및 31을 포함하거나 이로부터 선택된다.
일 구현예에서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 33, 36 및 37을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 32, 33, 36 및 37을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 및 37을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 69, 70 및 71을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 68, 69, 72 및 73을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72 및 73을 포함하거나 이로부터 선택된다.
일 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 60을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 42 및 43을 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 38, 39, 42 및 43을 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 56, 57, 60 및 61을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42 및 43을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 게우만노마이세스 그라미니스 종(바람직하게는, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 그라미니스 또는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 및 61을 포함하거나 이로부터 선택된다.
일 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 마주스) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 48 및 49를 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 마주스) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 44, 45, 48 및 49를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 미크로도키움 니발레 종(바람직하게는, 미크로도키움 니발레 변종 마주스) DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 44, 45, 46, 47, 48 및 49를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 마그나포르테 포아에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 54 및 55를 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 마그나포르테 포아에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 50, 51, 54 및 55를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 마그나포르테 포아에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54 및 55를 포함하거나 이로부터 선택된다.
일 구현예에서, 콜레토트리쿰 그라미니콜라 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 74, 76 및 77을 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 콜레토트리쿰 그라미니콜라 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 74 75, 78 및 79를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 콜레토트리쿰 그라미니콜라 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78 및 79를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 콜레토트리쿰 세레알레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No 80, 82 및 83을 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 콜레토트리쿰 세레알레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 80, 81, 84 및 85를 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 콜레토트리쿰 세레알레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No 80, 81, 82, 83, 84 및 85를 포함하거나 이로부터 선택된다.
일 구현예에서, 피시움 울티뭄 변종 울티뭄 ldin-rc DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 86, 88 및 89를 포함하거나 이로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 피시움 울티뭄 변종 울티뭄 ldin-rc DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 86, 87, 90 및 91을 포함하거나 이로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 피시움 울티뭄 변종 울티뭄 ldin-rc DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 86, 87, 88, 89, 90 및 91을 포함하거나 이로부터 선택된다.
본 발명의 LAMP 검정은, 획득하기 용이하고 그에 따라 맞춤화될 터프 그래스의 관리 및/또는 유지를 가능하게 하는, 터프 샘플에서 스클레로티니아 호모에오카르파, 리족토니아 솔라니, 피시움 아파니더마툼, 게우만노마이세스 그라미니스 종, 미크로도키움 니발레 종, 마그나포르테 포아에, 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 콜레토트리쿰 세레알레 및 피시움 울티뭄 변종 울티뭄으로 구성된 군으로부터 선택되는 터프 진균으로부터의 DNA의 조기 검출을 포함하는 검출에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, "터프 그래스"는 일년생 또는 다년생 벼과(Gramineae)로 이해된다. 상기 벼과는 바람직하게는 아그로피론(Agropyron), 아그로스티스(Agrostis), 악소노푸스(Axonopus), 브로무스(Bromus), 부클로외(Buchloё), 시노돈(Cynodon), 에레모클로아(Eremochloa), 페스투카(Festuca), 롤리움(Lolium), 파스풀룸(Paspulum), 페니세툼(Pennisetum), 플륨(Phleum), 포아(Poa), 스테노타프룸(Stenotaphrum) 또는 조이시아(Zoysia) 속 중 하나 이상에 속한다. 보다 바람직하게는, 상기 벼과는 아그로스티스, 부클로외, 시노돈, 에레모클로아, 페스투카, 롤리움, 파스풀룸, 페니세툼, 포아, 스테노타프룸 또는 조이시아 속 중 하나 이상에 속한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따르면, "터프"는 땅의 표면적을 덮고, 규칙적인 유지의 대상인 터프 그래스의 그룹으로 이해된다.
본 발명은 한지형 터프 그래스(cool season turf grass) 및 난지형 터프 그래스(warm season turf grass)를 포함하는 모든 터프 그래스로 실시될 수 있다.
한지형 터프 그래스의 예는 블루그래스(Bluegrass)(포아 L.(Poa L.)), 예컨대 켄터키 블루그래스(Kentucky Bluegrass)(포아 프라텐시스 L.(Poa pratensis L.)), 러프 블루그래스(Rough Bluegrass)(포아 트리비알리스 L.(Poa trivialis L.)), 캐나다 블루그래스(Canada Bluegrass)(포아 콤프레사 L.(Poa compressa L.)) 및 일년생 블루그래스(Annual Bluegrass)(포아 안누아 L.(Poa annua L.)); 벤트그래스(Bentgrass)(아그로스티스 L.(Agrostis L.)), 예컨대 크리핑 벤트그래스(Creeping Bentgrass)(아그로스티스 팔루스트리스 후즈.(Agrostis palustris Huds.)), 콜로니얼 벤트그래스(Colonial Bentgrass)(아그로스티스 테니우스 시브쓰.(Agrostis tenius Sibth.)), 벨벳 벤트그래스(Velvet Bentgrass)(아그로스티스 카니나 L.(Agrostis canina L.)) 및 레드탑(Redtop)(아그로스티스 알바 L.(Agrostis alba L.)); 페스큐(Fescue)(페스투카 L.(Festuca L.)), 예컨대 크리핑 레드 페스큐(Creeping Red Fescue)(페스투카 루브라 L.(Festuca rubra L.)), 츄잉스 페스큐(Chewings Fescue)(페스투카 루브라 변종 콤무타타 가우드.(Festuca rubra var. commutata Gaud.)), 쉬프 페스큐(Sheep Fescue)(페스투카 오비나 L.(Festuca ovina L.)), 하드 페스큐(Hard Fescue)(페스투카 롱기폴리아(Festuca longifolia)), 톨 페스큐(Tall Fescue)(페스투카 아룬디나세아 쉬레브.(Festuca arundinacea Schreb.)), 메도우 페스큐(Meadow Fescue)(페스투카 엘라티오르 L.(Festuca elatior L.)); 라이그래스(Ryegrass)(롤리움 L.(Lolium L.)), 예컨대 다년생 라이그래스(Perennial Ryegrass)(롤리움 페렌네 L.(Lolium perenne L.)), 일년생(이탈리아) 라이그래스(롤리움 멀티플로룸 램.(Lolium multiflorum Lam.)); 휘트그래스(Wheatgrass)(아그로피론 게르튼.(Agropyron Gaertn.)), 예컨대 페어웨이 휘트그래스(Fairway Wheatgrass)(아그로피론 크리스타툼 (L.) 게르튼(Agropyron cristatum (L.) Gaertn.)), 웨스턴 휘트그래스(Western Wheatgrass)(아그로피론 스미티이 리드브.(Agropyron smithii Rydb.))이다. 다른 한지형 터프 그래스는 스무스 브롬(Smooth Brome)(브로무스 이너미스 레이스.(Bromus inermis Leyss.)) 및 티모시(Timothy)(플륨 L.(Phleum L.))를 포함한다.
난지형 터프 그래스의 예는 버뮤다그래스(Bermudagrass)(시노돈 L. C. 리치(Cynodon L. C. Rich)), 조이시아그래스(Zoysiagrass)(조이시아 윌드.(Zoysia Willd.)), 세인트 오거스틴그래스(St. Augustinegrass)(스테노타프룸 세쿤다툼 (왈트.) 쿤트제(Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze)), 센티페데그래스(Centipedegrass)(에레모클로아 오피우로이데스 (먼로.) 핵크.(Eremochloa ophiuroides (Munro.) Hack.)), 카펫그래스(Carpetgrass)(악소노푸스 뷰브.(Axonopus Beauv.)), 바히아그래스(Bahiagrass)(파스팔룸 노타툼 플루게.(Paspalum notatum Flugge.)), 키쿠유그래스(Kikuyugrass)(페니세툼 클란데스티눔 호크스트. 엑스 키오브.(Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov.)), 버팔로그래스(Buffalograss)(부클로에 닥틸로이데스 (너트.) 엔겔름.(Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm.)) 및 시쇼어 파스팔룸(Seashore paspalum)(파스팔룸 바기나툼 슈와르츠(Paspalum vaginatum swartz))이다.
LAMP 방법 발명은 또한 LAMP 검정을 이용하여 터프 그래스 샘플에서 진균을 검출하기 위한 키트를 고려한다. 본원에 기재된 바와 같은 프라이머 세트 중 하나 이상을 함유하는 시험 스트립이 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 특정 유전자좌로부터 수집된 터프 그래스 샘플로부터 다수의 질병을 검출하기 위해 다수의 프라이머 세트가 시험 스트립 상에서 다중화된다.
예를 들어, 볼 베어링 및 적합한 양의 용해 완충액을 갖는 비쥬(bijou) 튜브에 1 cm3의 균질화된 터프 샘플이 제공되고, 1분 동안 격렬히 진탕된다. 재현탁 완충액 및 이러한 시험 용액의 점적 모두를 함유하는 샘플 웰을 갖는 시험 스트립이 시험 스트립 상의 샘플 웰에 배치되고, 웰은 LAMP 반응을 수행하는 데 필요한 모든 성분(예컨대, 프라이머 세트 및 시약, 예를 들어, Optigene로부터 이용 가능한 등온 마스터 믹스 카탈로그 번호 iso-001)을 갖는다. 일 구현예에서, 시험 스트립은 다중화된다. 또 다른 구현예에서, 시험 스트립은 8개의 웰(2개의 대조군, 및 관심 터프 질병에 대해 6개)을 포함한다. 일 구현예에서, 시험 스트립은 OptiGene으로부터 이용 가능한 Genie®II 또는 III와 같은 진단 기구와 관련된다.
프라이머 설계
선택된 터프 그래스 병원체로부터의 DNA의 검출을 위한 LAMP 프라이머의 설계를 위해 고도로 보존된 유전자를 사용하였다(표 3의 컬럼 1). 모든 관심 진균으로부터의 순수한 유전체 DNA를 NucleoSpin Plant II(MACHEREY-NAGEL)를 사용하여 획득하였다. PCR 기술을 사용하여, 공개된 프라이머 쌍을 사용하여 관심 서열을 증폭시킨 후, 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 수행하였다. 다음의 DNA 유전자좌(유전자 및 영역)를 시퀀싱하였다: 내부 전사된 스페이서(ITS), 신장 인자 1-알파(EF), 베타-튜불린(Tub), 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 1(Cox), 초과산화물 디스뮤타제(SOD1) 및 큰 서브유닛 핵 리보솜 RNA(LSU). 미가공 서열은 ClustalW 정렬 방법(CLC Main Workbench Software)을 사용하여 정렬되었다. GenBank(NCBI)로부터의 서열과의 BLAST 비교를 사용하여 유전자 동족체를 확인하였다. 이상적으로, 우수한 서열은 모든 표적 분류균에 대한 성공적인 PCR 증폭, 및 다른 분류균과의 상동성 없음에 의해 정의된다.
이후, 시퀀싱된 DNA 유전자좌로부터의 최상의 서열(SEQ ID No 1 내지 13)은 LAMP Designer 1.14(PREMIER Biosoft)를 사용하여 선택된 터프 그래스 병원체 각각에 대한 LAMP 프라이머의 설계에 사용되었다. 따라서, 유기체 및 유전자좌 당 상이한 프라이머 세트를 획득하기 위해 상이한 파라미터를 시험하였다(터프 병원체, 선택된 유전자좌, 및 프라이머 설계에 사용되는 최상의 서열의 SEQ ID의 상관관계에 대해서는 표 3 참조). 표 1에 제시되어 있는 설계된 프라이머 세트는 이후 이의 특이성(표 3) 및 민감성(표 4)에 대해 시험되었다.
특이성
반응의 특이성을 시험하기 위해(하기 문헌 참조), 설계된 프라이머 세트를 사용하는 검정은 표 2에 기재된 진균 분리물로부터의 순수한 유전체 DNA 추출물을 사용하여 시험된다. 별개의 지리적 기원의 상이한 터프 그래스 병원체의 종합적인 수집물이 수집되었고, 상이한 배지(감자 덱스트로스/맥아/옥수수/체리/V8)에서 성장하였다. 균사체로부터 DNA를 추출하기 위해 10일된 진균 배양물이 사용되었다(NucleoSpin Plant II - MACHEREY-NAGEL). 유전체 DNA는 뉴클레아제 비함유 물을 이용하여 5 ng/㎕로 희석되었고, 2.5 ㎕ 분량이 특이성 시험에 사용되었다.
LAMP 특이성 시험은 55분 동안 64℃에서 96 웰 플레이트에서 LightCycler 480(Roche)에서 수행되었다. 앰플리콘 특이적 어닐링 온도는 초 당 -0.1℃의 램프 속도로 98℃로부터 65℃까지 냉각되는 동안 결정되었다. 1x 농도의 5 ㎕의 등온 마스터 믹스(Optigene), 각각 0.4 μM의 외부 프라이머, 각각 1.6 μM의 내부 프라이머, 및 각각 0.8 μM의 루프 프라이머(Microsynth에 의해 합성됨) 및 2.5 ㎕의 유전체 DNA를 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물에서 실시간 LAMP 검정이 수행되었다.
모든 반응은 이중으로 및 2개의 상이한 날에 수행되었다.
특이성을 수행하기 위한 문헌:
Stein 및 SYN 균주: Syngenta, CH-4332 Stein, Switzerland
CBS 균주: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, The Netherlands
ZHAW 균주: Zurich University of Applied Sciences, Postfach 8820, 
, Switzerland
결과의 해석:
표 3에 요약된 바와 같이, LAMP 검정의 특이성은 표 2에 열거된 진균 균주에 대해 설계된 특정 표적에 대해 확인되었다. 특이성의 추가 확인으로서, 표 3에 또한 제시된 바와 같이 상이한 증폭된 생성물에 대해 82.6 내지 89.9℃ ± 0.5℃의 일치하는 용융 온도가 관찰되었다.
Seq ID No 1 내지 13(표 1)의 DNA에 해당하는 기재된 프라이머 세트의 민감성은 모든 관심 진균의 유전체 DNA의 연속 희석액(1 ng 내지 100 fg)을 이용하여 결정되었으며, 각각의 반응은 2개의 상이한 날에 이중으로 이루어졌다. 모든 진균으로부터의 순수한 유전체 DNA를 NucleoSpin Plant II(MACHEREY-NAGEL)를 사용하여 획득하였다. LAMP 민감성 시험은 55분 동안 64℃에서 96 웰 플레이트에서 LightCycler 480(Roche)에서 수행되었다. 앰플리콘 특이적 어닐링 온도는 초 당 -0.1℃의 램프 속도로 98℃로부터 65℃까지 냉각되는 동안 결정되었다. 1x 농도의 5 ㎕의 등온 마스터 믹스(Optigene), 각각 0.4 μM의 외부 프라이머, 각각 1.6 μM의 내부 프라이머, 및 각각 0.8 μM의 루프 프라이머(Microsynth에 의해 합성됨) 및 2.5 ㎕의 유전체 DNA를 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물에서 실시간 LAMP 검정이 수행되었다.
터프 그래스 샘플에서 진균 병원체를 검출하는 방법
샘플 수집
잔디 뿌리를 포함하는 터프 샘플의 터프는 진균 병원체가 예상되는 위치에서 수집된다. 터프 그래스는 또한 증상을 나타낼 수 있다. 터프 샘플을 깨끗한 50 ㎖ 튜브(Corning) 내에 두고, 사용할 때까지 -20℃에 보관한다. DNA는 Plant Material Lysis Kit(Optigene)를 사용하여 추출된다. 터프 샘플의 1 cm3 입방체는 1 ㎖의 용해 완충액(Optigene)을 함유하는 비쥬 튜브 내에 놓인다. 터프 샘플의 균질화는 비쥬 튜브를 1분 동안 진탕시킴으로써 수행된다. 10 ㎕ 부피의 용해질은 제공된 희석 튜브(Optigene)로 옮겨지고, 진탕에 의해 격렬히 혼합된다. 희석된 용해질은 후속하여 주형으로 정의된다.
LAMP 반응
일부 구현예에서, LAMP 반응은 약 60℃ 내지 약 70℃, 예컨대, 약 64℃ 내지 약 67℃, 또는 약 64℃ 내지 약 66℃에서 수행된다. 특정 예에서, LAMP 반응은 64℃에서 수행된다.
일부 구현예에서, LAMP 반응은 약 15 내지 약 45분, 예컨대, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 25분 내지 약 35분 동안 진행된다.
일부 구현예에서, 터프 샘플에 존재하는 핵산의 증폭을 가속화시키고, 상기 터프 샘플에 존재할 수 있는 임의의 표적 진균 DNA의 검출 시간을 감소시키는 데 유용한, 본 발명에 따른 LAMP 반응에서의 프라이머의 농도는 정방향(FIP) 및 역방향(BIP) 내부 프라이머에 대해 1.4 내지 1.8 μM, 보다 구체적으로 1.6 μM, 정방향(F3) 및 역방향(B3) 외부 프라이머에 대해 0.2 내지 0.4 μM, 보다 구체적으로 0.4 μM, 및 루프 정방향(LF) 및/또는 루프 역방향(LB) 프라이머에 대해 0.4 내지 0.8 μM, 보다 구체적으로 0.8 μM이다.
LAMP 검정의 반응에 유용한 적합한 완충액 시스템은 하기를 포함한다:
New England Biolabs로부터의 1X 등온 증폭 완충액 팩
20 mM Tris-HCl
10 mM (NH4)2SO4
50 mM KCl
2 mM MgSO4
0.1% Tween® 20
(25℃에서 pH 8.8)
New England Biolabs로부터의 1X 등온 증폭 완충액 II 팩
20 mM Tris-HCl
10 mM (NH4)2SO4
150 mM KCl
2 mM MgSO4
0.1% Tween® 20
(25℃에서 pH 8.8)
LAMP 검정의 반응에 유용한 적합한 효소 시스템(DNA 중합효소 등)은 하기를 포함한다:
일 구현예에서, LAMP 반응은 건조 시약(Optigene)을 갖는 시험 스트립에서 Genie 기기(Optigene) 상에서 수행된다. 일 구현예에서, 스트립은 8개의 150 ㎕ 웰(2개의 대조군, 및 검정을 위해 6개)을 갖는다. 실시간 LAMP 검정은 1x 농도의 15 ㎕의 등온 마스터 믹스(Optigene), 표 1의 프라이머 세트 중 적어도 하나로부터 선택되는 각각 0.4 μM의 외부 프라이머, 각각 1.6 μM의 내부 프라이머, 및 각각 0.8 μM의 루프 프라이머(Microsynth에 의해 합성됨)를 함유하는 25 ㎕ 반응 혼합물에서 수행된다. 주형을 첨가하기 전에, 동결건조된 반응 스트립은 22 ㎕ 재현탁 완충액(Optigene)에 재현탁된다. 모든 시험 스트립은 Optigene에 의해 제공되는 음성 대조군 및 양성 식물 대조군 프라이머 세트를 포함한다. 모든 검정에 대해, 반응 및 웰 당 3 ㎕의 주형이 첨가된다. 반응은 30 내지 55분 동안 64℃에서 유지된 후, 어닐링 프로그램이 수행된다. 어닐링 프로그램의 온도 프로파일은 초 당 -0.1℃의 램프 속도로 98℃로부터 65℃까지 냉각되는 동안 결정된다.
등온 마스터 믹스는 앰플리콘의 실시간 검출을 가능하게 하는 형광 이중-가닥 DNA 결합 염료를 함유한다. 검정은 반응 시간, 온도, 및 반응 당 첨가되는 DNA의 부피라는 측면에서 최적화된다.
64℃에서 증폭 단계 동안 획득되는 형광 데이터는 증폭 시간으로 보고된다. 어닐링 단계 동안 획득되는 형광 유도체 데이터는 어닐링 온도로 보고된다.
대안적으로, LAMP 검정 반응은 어닐링 프로그램을 포함하지 않으며, 이 경우 pH-민감성 지시제 염료는 표적 진균 DNA의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, pH-민감성 지시제 염료는 가시 광선에서 검출 가능한 착색된 염료이다. 특정 예에서, 착색된 염료는 크레졸 레드, 페놀 레드, m-크레졸 퍼플, 브로모크레졸 퍼플, 중성 레드, 나프톨프탈레인(naphtholphthalein), 티몰 블루 또는 나프톨프탈레인(naphtolphthalein)을 포함한다. 다른 예에서, pH-민감성 지시제 염료는 형광 지시제 염료이다. 특정 예에서, 형광 염료는 2',7'-비스-(2-카르복시에틸)-5(6)-카르복시플루오레세인, 5(6)-카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인, 5(6)-카르복시플루오레세인, 3,6-디아세톡시프탈로니트릴, 6,8-디하이드록시-l,3-피렌디설폰산, 또는 5-(및-6)-카르복실 세미나프토로다플루오르를 포함한다.
전술한 절차에 따라, 터프 샘플에서의 진균 병원체 DNA의 존재의 검출(표 3)은 관련된 터프 질병(예를 들어, 탄저병, 테이크-올 패치, 썸머 패치, 설부병, 피시움 마름병, 브라운 패치 및 달라 스팟을 포함함)을 유발할 수 있는 터프 진균 병원체의 존재를 나타낼 수 있다. 조기의 효율적인 검출은 수행될 적합한 터프 그래스 질병 관리 결정을 제공한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Syngenta
ZHAW
Palmisano, Marilena
Wohler, Christian
<120> Turf Health Check
<130> SYN-ZHAW
<160> 91
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> Sclerotinia homoeocarpa
<400> 1
tagatctaca catggttctt acattatatt taggtcactt gatctacaag tgcggtggaa 60
ttgacaagcg tactattgaa aagttcgaga cggtatgact tctccacctt tctcttgcta 120
tcttttcccg tccttctcat cgagatcagt gtctgcgatc ttggtgctga tggatttatc 180
gggttgcgtt ttctctcatg cgcggagcat acatccgaat tctcaaccct ttgaacatta 240
ccacattgcc tttccagaat ccctttgcta acccgttaat aggaagccaa ggagatggga 300
aagggttcct tcaagtacgc atgggttttg gacaagttga aggctgagcg tgagcgtggt 360
atcaccatcg acattgccct ctggaagttc gagacaccta agtacaatgt tactgtcatt 420
ggtatgtgta cgaattcttt atgccaactg aagtatatta acccattcgc agatgccccc 480
ggtcatcgtg atttcatcaa gaacatgatc actggtacct cccaagctga ttgtgccatt 540
cttatcatcg ctgccggtgt tggtgagttc gaggctggta tctccaagga tggtcagacc 600
cgtgagcacg ctcttcttgc gtacactctt ggtgttaagc aacttatcgt tgccatcaac 660
aagatggaca ccaccaagtg gtccaaggat cgtttcgagg aaatcatcaa ggagacaacc 720
aacttcatca agaaggttgg ctacaacgcc aagactgttc ccttcgtgcc gatctctgga 780
ttcgagggtg ataacatgat tgagccctca actaactgcc catggtacaa gggctgggag 840
agagagtcca aggagtctgg caaacacacc ggcaagaccc ttcttgaggc catcgacagc 900
atggacctgc ct 912
<210> 2
<211> 629
<212> DNA
<213> Rhizoctonia solani AG2-2IIIB
<400> 2
tgtagctggc tccattagtt tggagcatgt gcacaccttt tgctcttttt ttaatccaca 60
cacacctgtg aacctgtgag gcagagacat ggatgggaga acttttattt actttaaaat 120
gaatgattgg gacccctacc cccccccccc tctgtctact caactctaat ataaacccaa 180
tttattttaa aatgaatgta atggatgtaa cgcatctaat actaagtttc aacaacggat 240
ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag 300
aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc accttgcgct ccttggtatt ccttggagca 360
tgcctgtttg agtatcatga aatcttcaaa gtaaaccttt ttgttaactc aatttggttt 420
cactttggta ttggaggttc ttgcagcttc acacgctgct cctctttgtt cattagctgg 480
atctcagtgt tatgcttggt tcctctcggc gtgataaatt atctatcgct gaggactccc 540
gataaaaagg ttggccaagg taaatgcaga tgaaccgctt ctaatagtcc attgacttgg 600
acaataaaat aattattatt ttacgatct 629
<210> 3
<211> 613
<212> DNA
<213> Microdochium nivale var. nivale
<400> 3
ggtaaccaaa tcggtgctgc tttctggtgc gtacacctcg actcgaagac gaccacgacc 60
ttcgcgacga aaatgaactc ggcagccaaa aaccgtgccg tcgagaatct ttagtcgcag 120
aggaatctaa cataagggtg gagaccggca aggctaacac tatcttccct gatacaggca 180
gaccatctcc ggcgagcacg gtcttgacag cgatggagtg taagttcaat aaccgactcg 240
cagttccttg cgagagaccg cttccctgac ggcttctcgg gccagatgaa atgcaacagt 300
actgacattc tgccaatagc tacaacggca actctgagct ccagctcgag cgcatgagcg 360
tctacttcaa cgaggtatgt caccatgggc gacttcgggc ttcacacatt cggccagcta 420
ctaactgacc acccacataa cttaggcttc cggcaacaag tacgttcccc gcgccgtcct 480
cgtcgatctc gagcccggta ccatggatgc cgtccgtgct ggtcccttcg gccagctgtt 540
ccgtcccgac aacttcgtct tcggtcagtc cggtgctggc aacaattggg ccaagggtca 600
ctacactgag ggt 613
<210> 4
<211> 455
<212> DNA
<213> Pythium aphanidermatum
<400> 4
cttcagtgaa ctccatctcg tccataccct caccagtgta ccagtgcaag aaggccttac 60
gacggaacat ggccgtgaac tgctcgctga cacgcttgaa catctcctgg atggcagtcg 120
agttaccgat gaacgtggcg ctcatcttga gaccctttgg tgggatgtca caaacgctgg 180
ccttgatgtt gttcgggatc cactcaacga agtacgacga gttcttgttc tgaacgttga 240
gcatctgctc gtcgacctcc ttggtgctca tacgaccacg gaacatacaa gcggcggtca 300
ggtaacgacc gtgacgagga tcagcggcac acatcatgtt cttggcgtcg aactgctgct 360
gggtcagctc tggcaccgta agggcacggt actgctgcga gccgcgcgag gtgagcggag 420
cgaaaccgac catgaagaag tggaacgggg gaaaa 455
<210> 5
<211> 518
<212> DNA
<213> Gaeumannomyces graminis var. avenae
<400> 5
ttagtgaccc ttggcccagt tgttgccagc accagactgg ccgaaaacga agttgtcggg 60
gcggaacagc tggccgaagg gaccggcacg aacggcgtcc atggtgccgg gctcgagatc 120
gacgaggacg gcacggggga catgcttgtt gccggaggcc tggagcggaa aggttatggg 180
tcagaataca tgatacgaag gtgggaaata ccggctgcta atgccggaca gaagcttcaa 240
ctcagggcct gtctgcatac ctcgttgaag tagacgctca tgcgctcgag ctggagctcc 300
gaggtgccgt tgtacctgta tcaatatgtc agagcggtga acggacggcg ggccgagcca 360
caagcaggac gaaatacgta cacgccattg ctgtcgagac cgtgctcgct agaaatggtc 420
tgcctgtcaa agaagtcagt acgggtcacg ggcagtggca gtcgtggtcg gcggcggatc 480
gtcgcgcggc gtcgtttcat accagaaagc agcaccgt 518
<210> 6
<211> 550
<212> DNA
<213> Microdochium nivale var. majus
<400> 6
ggtaaccaaa tcggtgctgc tttctggtgc gtacaactcc gatactcaac gacggccgca 60
gtgacctttg cgacgaaaac aaactcggcg gtcaaacccg tatcgccgaa aatcttcggt 120
cgcagaggaa tctggcaaaa gggtggaaat aaacaagcaa ggctaacact ctcttccccg 180
acacaggcaa accatctcca gtgagcacgg tctcgacagc aatggcgtgt aagttcaata 240
accgactcgc acttcttgcg aaaggccact tccctgatgg cgtatcacgc cagatgaaat 300
acacaagtac tgacatcctg tcaatagcta caacggcacc tccgagctcc agctcgagcg 360
catgagtgtc tacttcaatg aggcttccgg caacaagtac gttcctcgtg ccgtccttgt 420
cgatctcgag cccggtacca tggatgccgt ccgtgctggt cccttcggcc agctgttccg 480
ccccgacaac ttcgtcttcg gtcagtccgg tgctggcaac aactgggcca agggtcacta 540
cactgagggt 550
<210> 7
<211> 485
<212> DNA
<213> Magnaporthe poae
<400> 7
ttagtgaccc ttggcccagt tgttgccagc accggactgg ccgaaaacga agttgtcggg 60
gcggaacagc tggccgaagg gaccagcacg gacagcatcc atggtgccgg gctcgagatc 120
gaccaggacg gcacggggga catgcttgtt gccggaggcc tagagcgcgg ggaggcaatg 180
gtgtcagaaa aacaacacgt ggttgcgaaa gagagacgcg ttcggagtct atctgcatac 240
ctcgttgaag tagacgctca tgcgctcgag ctggagctcc gaggtaccgt tgtaactgca 300
ccaatatgtc agagcggtga acggacatgt ggccgaggat ctcccaaaca gaatacatac 360
actccattgc tgtcgagacc gtgctcgctg gagatggttt gcctgcccag gaagtcagta 420
tcaatgatgg atgatcacgg tcgtggtggg tgcgagcggt ggttcgtacc agaaagcagc 480
accgt 485
<210> 8
<211> 539
<212> DNA
<213> Gaeumannomyces graminis var. avenae
<400> 8
cctcagtgaa ctccatctcg tccataccct cgccagtgta ccaatgaagg aaagccttgc 60
gcctgaacat ggcagtgaac tgctcaccaa cacgcttgaa gagctcttgt atggcagtcg 120
agtttccgat gaaggtcgac gacatcttca ggccccgggg agggattgag cagagggcgg 180
tctggatgtt gttgggaatc cactcgacga agtacgacga gttcttgttc tggatgttgc 240
gcatctggtc ctcgacctcc ttcatggaga ccttaccacg gctatcgcac acagggatgg 300
ttagttagtg ccttctaggt tgggcatatt aaatgggcca gataaataag cccaatgcct 360
agatgcaaga ctcacaaaat agcagagcag gtcaggtagc gaccgttgcg gaagtccgag 420
gcagccatca tgttcttggg gtcgaacatc tgctgggtca actcgggcac cgtgacggcg 480
cggaatgagt gggcgccgcg gctagtcagg ggagcgaagc cgaccatgaa gaagtggag 539
<210> 9
<211> 236
<212> DNA
<213> Rhizoctonia solani AG2-2IV
<400> 9
gttgtagggc tcaacaaccg tgtcggagac cttgggggaa ggaacgaccg agaatgtgca 60
catcatacga tcggggtatt cttcacggat cttggagatc aaaagggtgc ccataccggc 120
accggttcct ccaccgagcg agtgggtaat ctggaagccc tgaagacact cgcatccctc 180
ggcctctttg cgcgcgacat cgagaactgc gtcaacaagc tcggcacctt cggtgt 236
<210> 10
<211> 604
<212> DNA
<213> Pythium aphanidermatum
<400> 10
tgctttttca ggtgtagttg gtacaacttt atctgtttta attagaatgg aattagcaca 60
acctggtaat caaattttta tgggaaatca tcaattatat aatgttgttg taacagcaca 120
tgcttttata atgattttct tcatggttat gcctgtatta attggtggtt ttggtaactg 180
gtttattcct ttaatgattg gtgctccaga tatggctttt cctagaatga ataatattag 240
tttttggtta ttacctcctt cattattatt attagtatca tctgctatag tagaatcagg 300
tgctggtaca ggttggactg tatatccacc attatcaagt gtacaagcac actcaggacc 360
ttcagtagat ttagctattt ttagtttaca tttatctggt atttcttcat tattaggtgc 420
tattaatttt ttatcaacta tttataatat gagagctcct ggattaagtt ttcatagatt 480
gccattattt gtttggtctg tttttattac agctttttta ttattgttaa cattaccagt 540
attagcaggt gctattacaa tgttattaac agatagaaat ttaaatactt ctttttatga 600
tcct 604
<210> 11
<211> 657
<212> DNA
<213> Colletotrichum graminicola
<400> 11
aatattctcg acatatgcag cctttccgtt gagatactat gtacgatcac tgttagcatc 60
tcttttcaaa aaaggtcttg ttggtgtcca cgaacctgaa ggtagtacgc gtgctcccac 120
atgtcaatac caaagatggg cacgcccttg gtgacagggt cctggtcttt cgtcgtgata 180
atgctgaggc ccgttatgtc atccttaaca agccaccccc agccgctacc ggtgataccc 240
agcagcgtgg tgttgaaagc ctgcttgaac tggtcgagcc cgccccagac gcgggtgatc 300
tcggcgacga gctttggcgc cgcatcgggc gaggcatcac cgctcgaggc tggggaaagg 360
ttctcccaga atagggaatg gttgatgtgg ccgccgccgt tgaagtttag ggccgcgagg 420
acggcgatgc gattctggag cgggtttgca ttgtaagtct cgatggcctt gttcagattt 480
gtaacgtatg cttgatggct gtaggtggct tcatgtcaac tctcttcttc gctgcttcat 540
atttcatggt tatctcactg tttgctgtgg tgcagctcca tgatctgagc tgagatgtga 600
ggctcgaggg cctgcaggag gggtcagcgg gcgcgatcgc gagcacgagt aagggat 657
<210> 12
<211> 663
<212> DNA
<213> Colletotrichum cereale
<400> 12
cgttccagat gttctcgacg tacgccgctt ttccattgag gtactgaggc cgagcattgt 60
tagtaccttc caacaaagca gatccgtcag tgtttacgaa cctggaggta gtacgcgtgc 120
tcccacatgt ccacgccgaa gatgggcacg cccttggtga cagggtcctg gtctttcgtc 180
gtgatgatgc tcagacccgt tacgtcgtcc ttgaccagcc atccccagcc gctgccggtg 240
atacccagaa gcgtggcgtt gaaagcctgc ttgaactggt cgagcccgcc ccagacccgg 300
gcgatctcag cgacgagctt cggcgcggcg tctggcgagg cgtctgggct cgaggcaggg 360
gacaggtttt cccagaagag ggagtggttg atgtggccgc cgccgttgaa gttgagggct 420
gggaggacgg cgatgcggtt ctggaggggg ttcgcgttgt aggtctcgac ggccttgttt 480
agatttgtaa cgtatgcttc gtgactgcga tggtttgatt tcaaccctgt tcttctttgg 540
tttctagtgc ctagctctct tactgtttgc tgtggtgcag ctccatgatc tgggctgaga 600
tgtgcggctc gagagcctgg aagaggggtc agcgggtgcg accgcgaaca caagtacggg 660
gat 663
<210> 13
<211> 703
<212> DNA
<213> Pythium ultimum var. ultimum
<400> 13
tcagaagaaa ggtttcctac ctcagacagc gtacgccatc ctttactttc atttcgcgct 60
ggggtttcca caccctaaca cttgcacaca tgttagactc cttggtccgt gtttcaagac 120
gggccgaatc gctccatttc gtcaaagtcc cgaacggcaa aagttactct agatctcaat 180
cgaccaatca ctccgtcagc atagcaagct atccaaacag gtaaccaaac gagagtccca 240
aacactttaa agcacattgt aggcacctca gtcccaacca cgacaactaa ctaccaagat 300
ataacagcca agagcaagct cctaacctac ctcctcagta gccatttctc acagcatacg 360
aactgactct gacgtcccac cgcaacacag ggcaccaaca agcaaacgca gaacagcaca 420
aagagcagaa aaccacttct tacatactgc acgcacctac tcgccaatga aatatgctac 480
agattataga cactggatac gattcgcttc cctttcagca gtttcaggta ctctttaact 540
ctcttttcaa agttcttttc atctttccct cacggtactt gttcgctatc ggtctcgcac 600
caatatttag ctttagatgg aatttaccac ctactttgcg ctgcagtccc aaacaacgcg 660
actcaaagaa aacgtgtcgt acgcacaagc tactcaggca caa 703
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 14
gctcagcctt caacttgt 18
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 15
gcctttccag aatccctttg ctttttgaag gaaccctttc ccatc 45
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 16
ggtggaattg acaagcgta 19
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 17
atgctccgcg catgagagtt ttcttctcat cgagatcagt gtc 43
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 18
ccgttaatag gaagccaagg a 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 19
tccatcagca ccaagatcg 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 20
atttaccttg gccaaccttt 20
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 21
gcttcacacg ctgctccttt ttggagtcct cagcgataga t 41
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 22
tgtagctggc tccattagt 19
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 23
ggggtagggg tcccaatcat ttttgcacac cttttgctct t 41
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 24
tagctggatc tcagtgttat gc 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 25
ctcccatcca tgtctctgc 19
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 26
aatgtgtgaa gcccgaag 18
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 27
gcttccctga cggcttctct tttctcagag ttgccgttgt ag 42
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 28
gtcgcagagg aatctaacat aa 22
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 29
aggaactgcg agtcggttat tgtttttaca ggcagaccat ctcc 44
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 30
acagtactga cattctgcca at 22
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 31
acactccatc gctgtcaag 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 32
tgaactccat ctcgtccata 20
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 33
tcgtatgagc accaagga 18
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 34
gatgttcaag cgtgtcagc 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 35
gctggccttg atgttgttc 19
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 36
cggtaactcg actgccatcc ttttccttac gacggaacat gg 42
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 37
ccctttggtg ggatgtcaca attttctcgt cgtacttcgt tgag 44
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 38
ttgaagtaga cgctcatgc 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 39
gtgctgcttt ctggtatga 19
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 40
cgttcaccgc tctgacat 18
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 41
cgctagaaat ggtctgcct 19
<210> 42
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 42
ttcgtcctgc ttgtggctct tttgccgttg tacctgtatc aat 43
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 43
ttgctgtcga gaccgtgctt tttgacccgt actgacttct t 41
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 44
ggtaaccaaa tcggtgct 18
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 45
gcgagtcggt tattgaact 19
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 46
tttcgtcgca aaggtcact 19
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 47
aacaagcaag gctaacactc t 21
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 48
gggtttgacc gccgagtttt ttgcgtacaa ctccgatact c 41
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 49
ggaatctggc aaaagggtgg atttttgctc actggagatg gtt 43
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 50
ttgaagtaga cgctcatgc 19
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 51
gctgctttct ggtacgaa 18
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 52
tcaccgctct gacatattgg 20
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 53
gctggagatg gtttgcct 18
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 54
ggagatcctc ggccacatgt tttcgaggta ccgttgtaac tg 42
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 55
ttgctgtcga gaccgtgctt ttaccgtgat catccatcat tg 42
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 56
gacgaagtac gacgagttc 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 57
ctccacttct tcatggtcg 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 58
cgatagccgt ggtaaggtc 19
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 59
aggcagccat catgttctt 19
<210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 60
gcccaaccta gaaggcacta actttttcct cgacctcctt catg 44
<210> 61
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 61
ggtcaggtag cgaccgttgt tttgagttga cccagcagat g 41
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 62
ttgtagggct caacaacc 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 63
gacgcagttc tcgatgtc 18
<210> 64
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 64
ggcacccttt tgatctccaa gattttggaa cgaccgagaa tgtg 44
<210> 65
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 65
ataccggcac cggttccttt ttgatgcgag tgtcttcagg 40
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 66
ccgtgaagaa taccccgatc 20
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 67
ccgagcgagt gggtaatc 18
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 68
aattagcaca acctggtaat ca 22
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 69
acttaatcca ggagctctca ta 22
<210> 70
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 70
gccatatctg gagcaccaat cattttaatg ttgttgtaac agcacatg 48
<210> 71
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 71
aatcaggtgc tggtacaggt tgttttaatc tactgaaggt cctgagt 47
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 72
aaccaccaat taatacaggc at 22
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 73
accattatca agtgtacaag ca 22
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 74
tgtacgatca ctgttagcat c 21
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 75
ctcgaccagt tcaagcag 18
<210> 76
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 76
ggcgtgccca tctttggtat tttgtgtcca cgaacctgaa g 41
<210> 77
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 77
ggtgacaggg tcctggtctt tttgtggctt gttaaggatg aca 43
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 78
ttgacatgtg ggagcacg 18
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 79
tcgtcgtgat aatgctgagg 20
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 80
cgttccagat gttctcgac 19
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for fungal detection
<400> 81
gtcaaggacg acgtaacg 18
<210> 82
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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Claims (16)
- 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 리족토니아 솔라니 종(Rhizoctonia solani spp.), 피시움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum), 게우만노마이세스 그라미니스 종(Gaeumannomyces graminis spp.), 미크로도키움 니발레 종(Microdochium nivale spp.), 마그나포르테 포아에(Magnaporthe poae), 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola), 콜레토트리쿰 세레알레(Colletotrichum cereale) 및 피시움 울티뭄 변종 울티뭄(Pythium ultimum var. ultimum)으로부터 선택되는 적어도 하나의 터프 병원성 진균의 진균 DNA에 대한 프라이머를 함유하는 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 검정으로 터프 그래스(turf grass) 샘플에서 진균 DNA를 검출하기 위한 방법으로서,
상기 방법은 터프 샘플을 LAMP 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 LAMP 반응은 4개 이상의 핵산 서열의 프라이머 세트를 사용하고, 상기 세트의 각 프라이머는 15 내지 50개의 핵산을 갖고, 상기 프라이머의 세트는
(a) SEQ ID NO: 14, 15, 16 및 17과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 스클레로티니아 호모에오카르파 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(b) SEQ ID NO: 20, 21, 22 및 23과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되거나, SEQ ID NO: 62, 63. 66 및 67과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(c) SEQ ID NO: 26, 27, 28 및 29와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 미크로도키움 니발레 변종 니발레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(d) SEQ ID NO: 32, 33, 36 및 37과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(e) SEQ ID NO: 38, 39, 42 및 43과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트
(f) SEQ ID NO: 44, 45, 48 및 49와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 미크로도키움 니발레 변종 마주스 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(g) SEQ ID NO: 50, 51, 54 및 55와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 마그나포르테 포아에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(h) SEQ ID NO: 74 75, 78 및 79와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 콜레토트리쿰 그라미니콜라 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트;
(i) SEQ ID NO: 80, 81, 84 및 85와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 콜레토트리쿰 세레알레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
(j) SEQ ID NO: 86, 87, 90 및 91과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는 피시움 울티뭄 변종 울티뭄 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트
로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 스클레로티니아 호모에오카르파 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 및 19와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 62, 63, 64, 65, 66 및 67과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 리족토니아 솔라니 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 20, 21, 22, 23, 24 및 25와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 미크로도키움 니발레 변종 니발레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 26, 27, 28, 29, 30 및 31과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 및 37과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 피시움 아파니더마툼 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72 및 73과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42 및 43과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 아베나에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 및 61과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 미크로도키움 니발레 변종 마주스 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 44, 45, 46, 47, 48 및 49와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 마그나포르테 포아에 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54 및 55와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 콜레토트리쿰 그라미니콜라 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78 및 79와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 콜레토트리쿰 세레알레 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No 80, 81, 82, 83, 84 및 85와 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 피시움 울티뭄 변종 울티뭄 DNA를 검출하기 위한 프라이머 세트는 SEQ ID No: 86, 87, 88, 89, 90 및 91과 적어도 90% 동일한 서열을 각각 개별적으로 갖는 프라이머를 포함하거나 이로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제14항에서 확인된 프라이머 세트 중 하나 이상을 포함하는, LAMP 검정을 사용하여 터프 그래스 샘플에서 진균 DNA를 검출하기 위한 키트.
- 제15항에 있어서, 완충액, DNA 중합효소를 추가로 포함하는 키트,
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