ES2971956T3 - Métodos y composiciones para eliminar la interferencia de biotina de ensayos usando trampas moleculares conjugadas - Google Patents
Métodos y composiciones para eliminar la interferencia de biotina de ensayos usando trampas moleculares conjugadas Download PDFInfo
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Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para eliminar la interferencia de biotina de ensayos usando trampas moleculares conjugadas
La solicitud en estudio reclama el beneficio bajo 35 uso § 119(e) de la Solicitud Provisional estadounidense Núm.
62/735,913, presentada el 25 de septiembre del 2018.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para ensayos y para eliminar interferencias, particularmente interferencia de biotina de tales ensayos.
Antecedentes de la invención
En el diagnóstico clínico in vitro moderno, se utilizan diversos métodos para la detección de analitos en una muestra. En una forma de método de diagnóstico, un inmunoensayo, se utilizan una o más especies de unión específica. Ejemplos típicos son el inmunoensayo tipo sándwich, donde dos especies que se unen específicamente (anticuerpo o antígeno) se unen al analito de interés, y el inmunoensayo competitivo, donde el analito de interés y un análogo de este analito compiten por unirse a una especie que se une específicamente. En un inmunoensayo competitivo, el antígeno también suele denominarse hapteno o ligando. Una de las especies que se unen específicamente se une comúnmente a un denominado marcador o etiqueta, que puede ser un átomo (por ejemplo, radiactivo), una molécula (por ejemplo, una enzima, un compuesto fluorescente o luminiscente) o una partícula (magnética o de látex). Este marcador permite la detección del analito de interés a través de una variedad de métodos de detección correspondientes al marcador utilizado. En un ensayo competitivo, la especie que se une específicamente o el análogo del analito pueden llevar el marcador. La otra especie que se une específicamente está frecuentemente asociada a un sustrato sólido o suspendible ("la fase sólida") de forma covalente o mediante adsorción. Alternativamente, la especie que se une específicamente se puede unir a un primer miembro de un segundo par de unión (por ejemplo, biotina), mientras que el segundo miembro del segundo par de unión (por ejemplo, estreptavidina) se une a la fase sólida. Esto permite que las especies que se unen específicamente se unan a la fase sólida mediante la interacción del segundo par de unión (por ejemplo, biotina-estreptavidina).
Los haptenos como la biotina y la fluoresceína se utilizan a menudo para conjugar con anticuerpos u otras moléculas pequeñas de fármacos en reactivos de ensayo. Su estrecha unión a moléculas de proteínas grandes (por ejemplo, estreptavidina a biotina y anticuerpo anti-FITC a fluoresceína) recubiertas sobre un soporte sólido proporciona una forma conveniente de inmovilizar hapteno-Ab o hapteno-fármaco en la superficie sólida. Dado que la fuerza de unión entre biotina y estreptavidina o avidina muestra una de las constantes más altas para las moléculas biológicas, muy frecuentemente se utiliza biotina como ligando y estreptavidina como compañero de unión específico para la misma.
Es importante para la estabilidad y reproducibilidad del ensayo de diagnóstico que la capacidad de unión de la especie unida en fase sólida a su compañero de unión no se deteriore con el tiempo. Esto puede resultar en una menor confiabilidad y una menor sensibilidad del ensayo. Un mecanismo que puede conducir a tal deterioro (aparente como inestabilidad) es la expulsión de una porción de las especies unidas a la fase sólida al medio circundante. La especie libre compite con la especie unida a la fase sólida por unirse al objetivo y generalmente tiene una ventaja cinética significativa debido a su difusión más rápida. Por lo tanto, es ventajoso mantener la cantidad de especies libres que compiten con las especies unidas a la fase sólida en una constante del reactivo, preferiblemente muy cercana a cero. Esto permitiría la detección sensible de analitos de manera estable y reproducible. La forma preferida de eliminar especies libres es encontrar un método de unión que elimine la disociación. El enlace covalente, a diferencia de la asociación adsortiva, podría ser el método de elección, debido a su mayor fuerza de enlace. Sin embargo, en muchos casos esto puede resultar imposible o poco práctico por diversas razones.
La biotina ha encontrado utilidad como complemento. La biotina como complemento alimenticio, por ejemplo, tiene como objetivo promover el crecimiento saludable del cabello y las uñas y tratar otras enfermedades. Por tanto, las cantidades de biotina en el suero pueden ser bastante elevadas. Debido a que moléculas como la biotina se utilizan en muchos ensayos de diagnóstico para recubrir soportes sólidos, unirse a anticuerpos o análogos de hapteno, estos altos niveles de biotina en la sangre pueden interferir con la señal del ensayo. Por lo tanto, si la biotina está presente en las soluciones de muestra en forma libre, ocupa sitios de unión y, por tanto, puede dar lugar a resultados falsos de la prueba. Esto es especialmente crítico en el caso de pacientes que recibieron altas dosis de biotina. Se supone que la biotina en una cantidad superior a 30 ng/ml de muestra ya produce resultados falsos. En el caso de pacientes tratados con biotina, pueden aparecer valores séricos de hasta 180 ng/ml o incluso hasta 1500 ng/ml y valores duraderos de aproximadamente 70 ng/ml.
Un método para mitigar dicha interferencia se relaciona con el uso de reactivo preformado, es decir, componente de ensayo biotinilado preunido con el soporte sólido recubierto de estreptavidina durante la producción del reactivo. Debido a la estrecha unión y la lenta tasa de salida entre la estreptavidina y la biotina, reemplazar la biotina ya unida de la estreptavidina por la biotina entrante en la muestra del paciente no es un proceso predominante.
La segunda forma es aumentar los sitios de unión de estreptavidina en el soporte sólido, de modo que haya sitios de unión adicionales disponibles para las moléculas de biotina de muestra además de los componentes del ensayo biotinilados. La tercera forma es la combinación de las dos anteriores. Pero nada de lo anterior resuelve realmente el problema de la interferencia de la biotina a menos que evitemos por completo el uso de biotina-estreptavidina como componentes activos del ensayo.
Un problema importante con todas las soluciones anteriores es que los componentes del ensayo están involucrados en la prevención de interferencias, lo que puede afectar fácilmente la magnitud de la señal del ensayo en sí. Los componentes de los ensayos utilizados en tales casos se alejan de las condiciones óptimas para detectar los analitos previstos. Algunos ejemplo se proporciona en US 8252605.
Otro método se divulga en la Patente estadounidense 5212063. Revela el uso de partículas de polímero con un núcleo de unión a biotina y una capa de cobertura de proteína, carbohidrato o copolímero para filtrar a través de biotina libre pero no conjugada con biotina a moléculas grandes.
Este enfoque puede ser eficaz para algunos formatos de ensayo, pero la introducción de partículas puede generar absorbancia adicional que podría interferir con las señales del ensayo.
El artículo de J.E. Morris et al., Affinity Precipitation of Proteins by Polyligands, en: Biotecnología y Bioingeniería 41 [1993] 991 - 997 describe una técnica para precipitación por afinidad donde se precipitan proteínas diana multiméricas como resultado de la formación de redes mediante ligandos conjugados con polímeros. EP 2479 268 A1 describe un método para disociar eficazmente avidina o estreptavidina de un derivado de biotina que se une a avidina con menor afinidad que la biotina. El método incluye una etapa de mezclar una combinación de avidina con el derivado de biotina (que forma un complejo de avidina-biotina) con un polímero soluble en agua al que está unida la biotina. Un polímero soluble en agua preferido es la albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés), un derivado de biotina preferido es la 2-iminobiotina.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar medios mejorados para la mitigación de tales sustancias en ensayos de modo que no se perturbe el proceso de detección. Por lo tanto, se necesita una trampa molecular para eliminar la biotina y evitar que se produzcan alteraciones en la prueba.
El uso del término "un" o "una", cuando se utiliza junto con el término "que comprende/comprendiendo" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno/una", pero también es consistente con el significado de "uno/una o más", "al menos uno/una" y "uno/una o más de uno/una". Tal como, los términos “uno”, “una”, y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" puede referirse a uno o más compuestos, dos o más compuestos, tres o más compuestos, cuatro o más compuestos o un mayor número de compuestos. El término “pluralidad” se refiere a “dos o más.”
Se entenderá que el uso del término "al menos uno" incluye uno, así como cualquier cantidad más de uno, incluidos, entre otros, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, etc. El término “al menos uno” podrá extenderse hasta 100 o 1000 o más, según el término al que esté adscrito; Además, las cantidades de 100/1000 no deben considerarse limitantes, ya que límites más altos también pueden producir resultados satisfactorios. Además, se entenderá que el uso del término "al menos uno de X, Y y Z" incluye X solo, Y solo y Z solo, así como cualquier combinación de X, Y y Z. El uso de la terminología de números ordinales (es decir, "primero", "segundo", "tercero", "cuarto", etc.) tiene únicamente el propósito de diferenciar entre dos o más elementos y no implica ninguna secuencia, orden o importancia a un elemento sobre otro o cualquier orden de adición, por ejemplo.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar un "y/o" inclusivo a menos que se indique explícitamente que se refiere únicamente a alternativas o a menos que las alternativas sean mutuamente excluyentes. Por ejemplo, una condición "A o B" se cumple mediante cualquiera de las siguientes condiciones: A es verdadera (o presente) y B es falsa (o no está presente), A es falsa (o no está presente) y B es verdadera (o está presente), y tanto A como B son verdaderas (o están presentes).
Como se usa en el presente documento, cualquier referencia a "una realización", "algunas realizaciones", "un ejemplo", o "por ejemplo” significa que un elemento, característica, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en al menos una realización. La aparición de la frase "en algunas realizaciones" o "un ejemplo" en varios lugares de la especificación no se refiere necesariamente a la misma realización, por ejemplo. Además, todas las referencias a una o más realizaciones o ejemplos deben considerarse no limitativas de las reivindicaciones.
A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para una composición/aparato/dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, cuando se utiliza el término "aproximadamente", el valor designado puede variar en más o menos veinte por ciento, quince por ciento, doce por ciento, once por ciento, diez por ciento o nueve por ciento, u ocho por ciento, o siete por ciento, o seis por ciento, o cinco por ciento, o cuatro por ciento, o tres por ciento, o dos por ciento, o uno por ciento del valor especificado, según dichas variaciones sean apropiadas para realizar los métodos divulgados y según se entienda por personas con conocimientos habituales en la técnica.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicación(es), las palabras “que comprende/comprendiendo” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene/teniendo” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye/incluyendo” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “que contiene/conteniendo” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son incluyentes o abiertos, y no excluyen elementos o pasos de método adicionales no recitados.
El término “o combinaciones de los mismos” como se utiliza en la presente se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enlistados que preceden al término. Por ejemplo, “A, B, C, o combinaciones de los mismos” pretende a incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC y, si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. El experto en la técnica entenderá que típicamente no hay límite en el número de artículos o términos en cualquier combinación, a menos que se demuestre lo contrario en el contexto.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente ocurre completamente o que el evento o circunstancia descrito posteriormente ocurre en gran medida o grado. Por ejemplo, cuando se asocia con un evento o circunstancia particular, el término "sustancialmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente ocurre al menos el 80% del tiempo, o al menos el 85% del tiempo, o al menos el 90% del tiempo. tiempo, o al menos el 95% del tiempo. El término "sustancialmente adyacente" puede significar que dos elementos son 100% adyacentes entre sí, o que los dos elementos están muy próximos entre sí, pero no 100% adyacentes entre sí, o que una parte de uno de los dos elementos no está 100% adyacente al otro elemento, pero está muy cerca del otro elemento.
Tal como se utilizan en el presente documento, las frases "asociado con" y "acoplado a" incluyen tanto la asociación/unión directa de dos restos entre sí como también la asociación/unión indirecta de dos restos entre sí. Los ejemplos no limitantes de asociaciones/acoplamientos incluyen unión covalente de un resto a otro resto ya sea mediante un enlace directo o a través de un grupo espaciador, unión no covalente de un resto a otro resto ya sea directamente o mediante miembros de un par de unión específica unidos a los restos, incorporación de un resto en otro resto tal como disolviendo un resto en otro resto o mediante síntesis, y recubriendo un resto sobre otro resto, por ejemplo.
Los términos "análogo" y "derivado" se usan aquí indistintamente y se refieren a una sustancia que comprende el mismo esqueleto carbonado básico y la misma funcionalidad carbonada en su estructura que un compuesto dado, pero que también puede contener una o más sustituciones del mismo. Se entenderá que el término "sustitución" como se usa en el presente documento se refiere a la sustitución de al menos un sustituyente en un compuesto con un residuo R. En ciertas realizaciones no limitantes, R puede incluir H, hidroxilo, tiol, un halogenuro seleccionado de fluoruro, bromuro de cloruro o yodo, un compuesto C1-C4 seleccionado uno de los siguientes: alquilo lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido, y alquenilo lineal, ramificado o cíclico, donde los sustituyentes opcionales se seleccionan de uno o más alquenilalquilo, alquinilalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilalquilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, heterocicloalquilo, heterocicloalquenilalquilo opcionalmente sustituido, arilcicloalquilo y arilheterocicloalquilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido donde los sustituyentes opcionales se seleccionan de uno o más de alquenilalquilo, alquinilalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilalquilo, arilalquilo, alquilarilo, heteroarilalquilo, heterocicloalquilo, heterocicloalquenilalquilo, arilcicloalquilo y arilheterocicloalquilo opcionalmente sustituidos, fenilo, ciano, hidroxilo, alquilo, arilo, cicloalquilo, ciano, alcoxi, alquiltio, amino, -NH(alquilo), -NH(cicloalquilo)2, carboxi y -C(O))-alquilo.
Se entenderá que el término "muestra", tal como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier tipo de muestra biológica que pueda utilizarse de acuerdo con la presente divulgación. Ejemplos de muestras biológicas fluídicas que se pueden utilizar incluyen, entre otros, sangre completa o cualquier porción de la misma (es decir, plasma o suero), orina, saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo (CFS, por sus siglas en inglés), piel, líquido intestinal, líquido intraperitoneal, líquido quístico, sudor, líquido intersticial, líquido extracelular, lágrimas, moco, lavado de vejiga, semen, heces, líquido pleural, líquido nasofaríngeo, combinaciones de los mismos y similares.
Se entenderá que el término "compañero de unión específico" o "sbp, por sus siglas en inglés" tal como se usa en particular (pero no a modo de limitación) en el presente documento en los términos "compañero de unión específico de biotina" o "compañero de unión específico del analito objetivo", se refiere a cualquier molécula capaz de asociarse específicamente con biotina o el analito diana, respectivamente. Por ejemplo, pero sin limitación, la pareja de unión puede ser un anticuerpo, un receptor, un ligando, aptámeros, polímeros de impresión molecular (es decir, matrices inorgánicas), combinaciones o derivados de los mismos, así como cualquier otra molécula capaz de unión específica. a biotina o al analito objetivo, respectivamente.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y se refiere, por ejemplo, a anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos y conjugados de los mismos que exhiben la actividad biológica deseada de la unión de analito (tales como, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, diacuerpos, anticuerpos monocatenarios y otros fragmentos de anticuerpos y conjugados de los mismos que retienen al menos una porción de la región variable de un anticuerpo intacto), proteínas o péptidos sustitutos de anticuerpos (es decir, proteínas/péptidos de unión diseñados) y combinaciones o derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser de cualquier tipo o clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, y IgA2).
El término "hapteno", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un pequeño determinante antigénico proteico o no proteico (o "epítopo") que es capaz de ser reconocido por una pareja de unión específica del analito diana, tal como (pero sin limitarse a) un anticuerpo. Se entenderá que el término "polihapteno", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula sintética que contiene múltiples epítopos/determinantes antigénicos unidos a la misma.
Un "analito" es una macromolécula que es capaz de ser reconocida por una pareja de unión específica del analito, tal como (pero sin limitarse a) un anticuerpo. Tanto los analitos como los haptenos comprenden al menos un determinante antigénico o "epítopo", que es la región del antígeno o hapteno que se une a la pareja de unión específica del analito (es decir, anticuerpo). Normalmente, el epítopo de un hapteno es la molécula completa.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1 representa esquemáticamente las estructuras de aminoácidos de avidina y estreptavidina.
FIG. 2 representa esquemáticamente la química de la maleimida para posibles mutaciones.
Descripción detallada
Según la presente invención, se añade una trampa de hapteno en la formulación del reactivo para minimizar la interferencia del hapteno de su compañero de unión sin la participación de los componentes del ensayo que generan la señal del ensayo y sin generar absorbancia adicional que pueda interferir con la señal verdadera del ensayo.
La trampa podrá tener las siguientes características:
a) No es un agente particulado o en fase sólida sino estructuras moleculares solubles en solución acuosa.
b) Sólo debe unirse al hapteno libre pero no a moléculas grandes como los conjugados hapteno-Ab.
Las características descritas en a) y b) son suficientes para constituir una trampa de hapteno molecular. Como alternativa, las siguientes características también se consideran suficientes para la trampa de hapteno molecular:
c) Tiene una velocidad de liberación más lenta para la unión, de modo que el hapteno unido queda prácticamente bloqueado en su lugar. La ventaja de esta característica es que la biotina atrapada (o encerrada) no se disociará fácilmente ni competirá con el hapteno conjugado por la señal del ensayo que genera la pareja de unión al hapteno.
d) Debe tener una velocidad de unión más lenta de modo que el hapteno conjugado se una preferentemente al compañero de unión del hapteno que genera la señal del ensayo.
Las trampas de hapteno molecular pueden funcionar suficientemente con las características a) y b) o con las características c) y d) solas o en combinación.
Tomando como ejemplo la biotina-avidina (o estreptavidina), la avidina o la estreptavidina se pueden decorar químicamente con dexal u otras moléculas espaciadoras mediante enlaces covalentes para formar una capa superficial que solo es permeable a la biotina libre, pero no al resto de biotina del anticuerpo biotinilado. La traptavidina es una molécula que tiene la mitad de la tasa de activación y 1/10 de la tasa de desactivación para la unión de biotina, lo que la convierte en una buena trampa de biotina al preincubarla con la muestra que contiene biotina. Un ejemplo de ensayo propuesto para el ensayo LOCi PCT es el siguiente:
1) Incubar la muestra que contiene biotina con reactivo chemibeads recubierto de Ab de captura que contiene una trampa de biotina molecular soluble (por ejemplo, estreptavidina o traptavidina decorada con dexal o traptavidina sin decorar). La biotina libre en la muestra se unirá a la trampa de biotina.
2) Añadir anticuerpos biotinilados seguidos de sensibeads recubiertas de estreptavidina. Si se utiliza traptavidina nativa (sin decorar) en el paso 1), será necesario agregar sensibeads recubiertas de estreptavidina poco después de la adición de anticuerpos biotinilados. Esto es para garantizar que el anticuerpo biotinilado se una preferentemente a la estreptavidina recubierta en las perlas sensibles, no a la traptavidina, que tiene una velocidad de unión de biotina más lenta que la estreptavidina. Si se utiliza traptavidina decorada en la superficie que no se une a la biotina conjugada, las moléculas de biotina libres unidas de la muestra no competirán con el anticuerpo biotinilado por la unión a las perlas sensibles de estreptavidina porque están encerradas en moléculas de traptavidina.
El campo del diagnóstico médico utiliza muchas formas diferentes de tecnologías de ensayo. Un ejemplo de un ensayo utilizado comercialmente es la tecnología del ensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI®). El ensayo de quimioluminiscencia avanzado LOCI ®se describe, por ejemplo, en Patente de EE.UU. Núm. 5,340,716 (Ullman et al.). La tecnología LOCI® disponible actualmente tiene alta sensibilidad y utiliza varios reactivos. En particular, el ensayo LOCI® requiere que dos de estos reactivos (denominados "sensibead" y "chemibead") estén sujetos a otros reactivos de ensayo de unión específica de manera que sensibead y chemibead estén muy cerca uno del otro para lograr una señal. Tras la exposición a la luz a una determinada longitud de onda, la sensibead libera oxígeno singlete y, si las dos perlas están muy próximas, el oxígeno singlete se transfiere a la chemibead; esto provoca una reacción química que hace que la chemibead emita luz que se puede medir en una longitud de onda diferente.
Ejemplos particulares, no limitantes, de compuestos quimioluminiscentes y fotosensibilizadores que pueden utilizarse de acuerdo con la presente divulgación se establecen en Patente de EE.UU. Núm. 5,340,716 (Ullman, et al.).
Por consiguiente, la invención comprende una trampa molecular para reducir la interferencia de hapteno libre en un ensayo, comprendiendo la trampa molecular: una estructura molecular soluble en una solución de ensayo para unir selectivamente hapteno libre, comprendiendo la estructura molecular una pareja de unión específica modificada (sbp) al hapteno libre. El sbp modificado comprende uno o más de un componente de aldehído de dextrano, un polímero con impedimento estérico unido y características de velocidad de unión de hapteno libre específicas más lentas que otros reactivos de ensayo de socios de unión específicos de hapteno libre (sbps).
Dicha estructura molecular puede comprender además un recubrimiento, comprendiendo el recubrimiento uno o más de un material selectivamente permeable para el hapteno libre, una carga iónica para uno o ambos de atraer el hapteno libre y repeler otras moléculas de ensayo en la solución de ensayo, y una polaridad para facilitar una o ambas de la retención selectiva del hapteno libre y la repelencia estérica de las otras moléculas de ensayo en la solución de ensayo.
El recubrimiento puede comprender una o más proteínas o péptidos tales como albúmina de suero bovino, polímeros tales como aldehído de dextrano o aminodextrano, compuestos tales como etilendiamina, tetraetilenpentaamina, un resto cargado iónicamente, un resto hidrofóbico (acetato de sulfo-N- hidroxisuccinimida), etc. La característica de velocidad de salida de unión de hapteno libre específica del sbp modificado es más lenta que la característica de velocidad de activación de unión de hapteno libre específica del sbp modificado.
En algunas realizaciones, el hapteno libre es biotina libre, el sbp modificado es traptavidina que tiene una tasa de unión de hapteno libre específica más lenta que otros sbp de hapteno libre en la solución de ensayo, siendo los otros sbp de hapteno libre en la solución de ensayo. seleccionados entre estreptavidina y avidina.
El sbp modificado puede comprender uno o ambos de un componente de aldehído de dextrano y un polímero con impedimento estérico que impide selectivamente la unión con los componentes del ensayo y los conjugados del ensayo en la solución de ensayo y que son relativamente más grandes que el hapteno libre.
En algunas realizaciones, el hapteno libre en la solución de ensayo se selecciona del grupo que consiste en biotina libre y fluoresceína libre, donde el sbp modificado a biotina libre es uno de una estreptavidina modificada, una avidina modificada y una traptavidina y donde el sbp modificado para dar fluoresceína libre es una antifluoresceína modificada.
El sbp modificado puede ser un sbp modificado genéticamente que comprende el polímero con impedimento estérico conjugado con un aminoácido del sbp modificado adyacente a un sitio de unión específico para el hapteno libre, el polímero con impedimento estérico obstaculiza la unión específica de los conjugados de ensayo de hapteno correspondientes. al hapteno libre.
El polímero con impedimento estérico se selecciona del grupo que consiste en aminodextrano y albúmina de suero bovino.
Los conjugados de ensayo de hapteno se seleccionan de un grupo que consiste en uno o más de conjugados de haptenoanticuerpo, conjugados de hapteno-antígeno, conjugados de enzima marcadora de hapteno, conjugados de haptenoanalito bajo prueba, conjugados de hapteno-marcador y conjugados de hapteno-receptor.
La creación de una trampa de hapteno a nivel molecular que sea soluble en una mezcla de reacción acuosa debería permitir aplicaciones mucho más amplias que las partículas de trampa de hapteno. El mecanismo de bloqueo de biotina proporcionado por moléculas similares a la traptavidina reduce en gran medida la posibilidad de que la biotina libre se disocie de la trampa de hapteno y compita por la unión de las perlas sensibles con los anticuerpos biotinilados. En tercer lugar, la unión más lenta a la traptavidina permite que los anticuerpos biotinilados se unan preferentemente a las perlas sensibles en caso de que se utilice traptavidina nativa (sin decorar).
En otra realización más, la trampa de hapteno es una proteína de unión a hapteno diseñada genéticamente (trampa de hapteno libre). La trampa de hapteno genéticamente modificada se agrega a la formulación del reactivo para eliminar el hapteno libre que interfiere de su compañero de unión sin la participación de los componentes del ensayo que generan la señal del ensayo y sin generar absorbancia adicional que pueda interferir con la señal del ensayo. La preparación de la trampa de hapteno implica lo siguiente:
a) la mutagénesis dirigida al sitio cambia un residuo de aminoácido cerca del sitio de unión de la biotina, lo que permite la conjugación de otra proteína o polímero cerca del sitio de unión para proporcionar un impedimento estérico para que el anticuerpo biotinilado grande, pero no el hapteno libre más pequeño, entre en los sitios de unión.
b) otras técnicas de ingeniería genética producen mutaciones similares a las de a)
c) la estreptavidina genéticamente modificada todavía se une a la biotina libre con alta afinidad.
d) conjugar una proteína (como BSA) o un polímero con la estreptavidina diseñada para completar la fabricación de la trampa de biotina libre.
e) modificados genéticamente mediante mutagénesis dirigida cambian un residuo de aminoácido a un aminoácido único que no está en la secuencia actual. Por ejemplo, cambio de un residuo de aminoácido en las secciones de conexión entre {37- {37, {35- {36 o {33-{34 (ver Figura 2) a Metionina (Met o M). Debido a que la mutación está cerca del sitio de unión, la conjugación de una proteína usando SMCC (química de maleimida) y/u otros polímeros proporcionará un impedimento estérico para el reactivo de anticuerpo biotinilado (consulte la Figura 3).
Por consiguiente, la invención comprende una trampa molecular para reducir la interferencia de hapteno libre en un ensayo, comprendiendo la trampa molecular un complejo molecular soluble en una solución de ensayo para proporcionar selectivamente unión específica competitiva de hapteno libre en el complejo molecular. El complejo molecular comprende un conjugado que comprende un análogo de hapteno, un polímero con impedimento estérico que es relativamente más grande que el análogo de hapteno, y un grupo de enlace para proporcionar una conexión de enlace flexible entre el análogo de hapteno y el polímero con impedimento estérico; y, además, una pareja de unión específica (sbp) anti-hapteno interconectada con el conjugado. El análogo de hapteno tiene características de unión específicas más débiles al sbp antihapteno que el hapteno libre, la conexión de enlace flexible proporciona un grado de libertad entre el análogo de hapteno y un sitio de unión específico en el sbp anti-hapteno para el hapteno, el polímero con impedimento estérico que impide que los conjugados de ensayo de hapteno en la solución de ensayo accedan al sitio de unión específico.
En la trampa molecular anterior, el hapteno es biotina, el análogo del hapteno se selecciona del grupo que consiste en ácido 4'-hidroxiazobenceno-2-carboxílico (HABA) y 2-imino biotina, y el sbp anti-hapteno se selecciona del grupo formado por estreptavidina, avidina y traptavidina.
Las características de unión específica más débiles del análogo de hapteno en relación con el hapteno libre pueden comprender una unión específica dependiente del pH. El polímero con impedimento estérico de la trampa molecular es la albúmina sérica bovina o aminodextrano.
Claims (2)
1. Una trampa molecular para reducir la interferencia de hapteno libre en un ensayo, comprendiendo la trampa molecular: un complejo molecular soluble en una solución de ensayo para proporcionar selectivamente unión específica competitiva de hapteno libre en el complejo molecular, comprendiendo el complejo molecular:
un conjugado que comprende un análogo de hapteno, un polímero con impedimento estérico que es relativamente más grande que el análogo de hapteno, y un grupo de enlace para proporcionar una conexión de enlace flexible entre el análogo de hapteno y el polímero con impedimento estérico; y
una pareja de unión específica (sbp) anti-hapteno interconectada con el conjugado, teniendo el análogo de hapteno características de unión específicas más débiles al sbp anti-hapteno que el hapteno libre, proporcionando la conexión de enlace flexible un grado de libertad entre el análogo de hapteno y un sitio de unión específico en el sbp anti-hapteno para el hapteno, el polímero con impedimento estérico que impide que los conjugados de ensayo de hapteno en la solución de ensayo accedan al sitio de unión específico; donde el polímero con impedimento estérico se selecciona del grupo que consiste en aminodextrano y albúmina de suero bovino,
el hapteno es biotina, el análogo del hapteno se selecciona del grupo que consiste en ácido 4'-hidroxiazobenceno-2-carboxílico (HABA) y 2-imino biotina, y el sbp anti-hapteno se selecciona del grupo que consiste en estreptavidina, avidina y traptavidina.
2. La trampa molecular de la reivindicación 1, donde las características de unión específica más débiles del análogo de hapteno en relación con el hapteno libre comprenden una unión específica dependiente del pH.
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