ES2969968T3

ES2969968T3 - Uso de anticuerpos anti-CD40 para tratamiento de nefritis lúpica

Info

Publication number: ES2969968T3
Application number: ES16763663T
Authority: ES
Inventors: Scott Ronald Brodeur; Thomas B Freeman; Gerald Henry Nabozny; Meera RAMANUJAM; Paul Scholl; Juergen STEFFGEN
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2024-05-23
Anticipated expiration: 2036-08-31
Also published as: US20230265203A1; JP2021185169A; PH12018500445A1; MX2018002447A; WO2017040566A1; CN107922501A; PL3344655T3; US20190177420A1; AU2016317028B2; US20170058038A1; EP3344655B1; EP3344655A1; HUE063528T2; KR20180039172A; DK3344655T3; AU2016317028A1; CL2018000317A1; BR112018001907A2; CA2993996A1; JP2018529661A

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos anti-CD40 antagonistas humanizados y a métodos y composiciones terapéuticos y de diagnóstico para usar los mismos para tratar y/o prevenir la nefritis lúpica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de anticuerpos anti-CD40 para tratamiento de nefritis lúpica

Campo de la invención

Esta invención generalmente se refiere al uso de anticuerpos anti-CD40 humanizados para el tratamiento y/o la prevención de nefritis lúpica.

Antecedentes de la invención

CD40 es una glicoproteína de membrana integral de tipo I de 48 kDa y un miembro de la superfamilia de receptores de factor de necrosis tumoral (TNF). CD40 se expresa en una variedad de tipos celulares incluyendo células B normales y neoplásicas, células interdigitantes, carcinomas, células epiteliales (por ejemplo, queratinocitos), fibroblastos (por ejemplo, sinoviocitos) y plaquetas. También está presente en monocitos, macrófagos, algunas células endoteliales y células dendríticas foliculares. CD40 se expresa de manera temprana en la ontogenia de células B, apareciendo en precursores de células B tras la aparición de CD10 y CD19, pero antes de la expresión de CD21, CD23, CD24 y la aparición de inmunoglobulina M de superficie (slgM) (Uckunet al.,1990, Blood 15:2449). También se ha detectado CD40 en células plasmáticas derivadas de médula ósea y amígdalas (Pellat-Decounyncket al.,1994, Blood 84:2597).

El ligando de CD40 es CD40L (también denominado CD154, gp39 y TRAP), un miembro de la superfamilia de TNF. CD40L es una proteína transmembrana expresada predominantemente en células T CD4+ activadas y un pequeño subconjunto de células T CD8+ (revisado por (Van Kooten C. y Banchereau, 2000).

La interacción de CD40 con CD40L induce respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células. CD40 regula este par de ligando-receptor para activar células B y otras células presentadoras de antígeno (APC) incluyendo células dendríticas (DC) (revisado por (Toubi y Shoenfeld, 2004); (Kiener,et al.,1995). La función de CD40 sobre células B se ha estudiado extensamente. La activación de CD40 en células B induce la proliferación, diferenciación para dar células secretoras de anticuerpos y cambio de isotipo en centros germinales de órganos linfoides secundarios. Estudiosin vitrohan mostrado efectos directos de la activación de CD40 sobre la producción de citocinas (IL-6, IL-10, TNF-a, LT-a), expresión de moléculas de adhesión y receptores coestimulantes (ICAM, CD23, CD80 y CD86) y aumento de la expresión de MHC de clase I, MHC de clase II y transportador<t>A<p>por linfocitos B (Liu,et al.,1996). Para la mayoría de estos procesos, CD40 actúa en sintonía o bien con otras citocinas o bien con otras interacciones de receptor-ligando.

La señalización de CD40 en monocitos y DC da como resultado una supervivencia potenciada así como la secreción de citocinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-a yMIP-1a). La ligación de CD40 sobre estas APC también conduce a la regulación por incremento de moléculas coestimulantes tales como (ICAM-1, LFA-3, CD80 y CD86). La activación de receptores de CD40 es una de las señales críticas que permiten la completa maduración de DC para dar APC eficientes que impulsan la activación de células T (Banchereau y Steinman, 1998) (Van Kooten C. y Banchereau, 2000).

Recientes estudios en modelos de ratón mostraron que la señalización de CD40 en células dendríticas también desempeña una función importante en la generación de células TH17 que se considera que son mediadores de la autoinmunidad en enfermedades tales como artritis y esclerosis múltiple (lezzi,et al.,2009) (Perona-Wright,et al.,2009).

La disponibilidad de ratones deficientes en CD40 y CD40L así como anticuerpos anti-ratón agonistas y antagonistas ofreció la posibilidad de estudiar la función de las interacciones de CD40-CD40L en varios modelos de enfermedad. Se ha demostrado que la administración de anticuerpo anti-CD40L bloqueante es beneficiosa en varios modelos de autoinmunidad incluyendo enfermedades espontáneas tales como nefritis lúpica en ratones SNF1 o diabetes en ratones NOD o en formas de enfermedad inducidas experimentalmente tales como artritis inducida por colágeno (CIA) o encefalomielitis autoinmunitaria experimental (eAe ) (Toubi y Shoenfeld, 2004). Se inhibió CIA en ratones mediante un AcM anti-CD40L que bloqueó el desarrollo de la inflamación de las articulaciones, títulos de anticuerpo en suero frente a colágeno, la infiltración de células inflamatorias en el tejido subsinovial además de la erosión de cartílago y hueso (Durie,et al.,1993). Tanto para nefritis lúpica como para EAE, se demostró que el anticuerpo anti-CD40L también podía aliviar la enfermedad en curso, confirmando la función de CD40-CD40L en la fase efectora de la enfermedad (Kalled,et al.,1998); (Howard,et al.,1999). Se dan a conocer adicionalmente anticuerpos que interfieren con la interacción de CD40-CD40L en los documentos WO 2007/124299 A2, WO 2012, 149356 A<2>, US 2003/059427 A1, WO 2006/073443 A2, WO 2006/128103 y en Mohanet al.,(The American Association of Immunologists, US, 1995, 154 (3): 1470-1480).

Por tanto, estudios preclínicos que proporcionan evidencia para la función crucial de la díada de CD40-CD40L en el impulso de una respuesta inmunitaria dependiente de células T eficiente. Por tanto, se reconoce el bloqueo de la señalización de CD40 como una estrategia terapéutica adecuada y necesaria para suprimir una respuesta autoinmunitaria patógena en enfermedades tales como nefritis lúpica.

La Sociedad Internacional de Nefrología (ISN)/Sociedad de Patología Renal proporcionó una clasificación para la nefritis lúpica basándose en parte en el grado de insuficiencia renal (véase J.J. Weeninget al.,“The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revisited”, J. Am. Soc. Nephrol 15: 241-250, 2004).

Biopsias renales de pacientes con SLE con nefritis lúpica muestran un espectro de lesiones vasculares, glomerulares y tubulointersticiales. La lesión glomerular se determina mediante localización de inmunocomplejo en células mesangiales, endoteliales y epiteliales. Dependiendo de estos cambios, la nefritis lúpica puede dividirse en 6 clases que oscilan desde insuficiencia relativamente leve que sólo muestra deposición de inmunocomplejo en la matriz mesangial (clase I) o hipercelularidad mesangial (clase II) hasta esclerosis global en >90% de los glomérulos (clase VI). Los pacientes con nefritis lúpica de clase I o II sólo muestran proteinuria asintomática y ninguna disminución de la GFR. Los cambios endocapilares se clasifican como o bien proliferativos focales (clase III) o bien proliferativos difusos (>50% de glomérulos afectados, clase IV). Los hallazgos clínicos en estos pacientes son hematuria, proteinuria sintomática y pérdida de GFR. El daño epitelial puro (clase V) da como resultado deposición de inmunocomplejo a lo largo de la membrana basal glomerular sin lesiones inflamatorias. Estos pacientes padecen principalmente proteinuria nefrótica.

No hay ninguna necesidad de tratamiento inmunosupresor de clase I y II y no hay ningún efecto del tratamiento tras el daño irreversible en la clase VI, mientras que la nefritis lúpica III-V son accesibles para terapia inmunosupresora. Aproximadamente el 25% de los pacientes con nefritis lúpica son de clase III, el 40% de clase IV y el 10% de clase V. Aproximadamente 1/6 de los pacientes de clase III y IV también tendrán clase 5 (solapamiento).

El tratamiento inmunosupresor debe estar guiado por biopsia renal y tener como objetivo una respuesta renal completa (proteinuria <0,5 g/24 h con función renal normal o casi normal). Además de glucocorticoides, no hay ninguna terapia aprobada para nefritis lúpica, sin embargo, se ha mostrado que ciclofosfamida o micofenolato (MMF), cada uno en combinación con glucocorticoides, inducen mejora de síntomas clínicos de nefritis lúpica activa y reducen el riesgo de progresión hasta ESRD. Aproximadamente el 20-30% de los pacientes tratados con MMF o ciclofosfamida muestran una respuesta renal completa (proteinuria <0,5 g/d, sin sedimento activo, sin empeoramiento de GFR) y aproximadamente otro 20% muestran al menos una respuesta parcial (reducción de proteinuria de > 50%).

Por tanto, la combinación de glucocorticosteroides o bien con MMF o bien con ciclofosfamida se considera las normas asistenciales actuales para la nefritis lúpica, lo cual se refleja también en las recomendaciones de la asociación de la Liga europea contra el reumatismo y la Asociación Renal Europea-Asociación Europea de Trasplante y Diálisis (EULAR/ERAEDTA). Estas recomendaciones también incluyen hidroxicloroquina para todos los pacientes con nefritis lúpica para reducir el número de crisis y el uso de inhibidores de ACE o ARB.

Sin embargo, todos los tratamientos disponibles para nefritis lúpica pueden estar asociados con toxicidad significativa (por ejemplo, infertilidad, infección, tumores malignos). Además, las tasas de respuesta completa siguen siendo bajas y, dentro de los pacientes que responden al tratamiento, hay una alta tasa de recidivas que justifica la terapia de mantenimiento a largo plazo. Ensayos de fase III recientemente llevados a cabo sobre nefritis lúpica (por ejemplo, rituximab, abatacept) no han logrado cumplir sus criterios de valoración primarios. Se ha notificado que el silenciamiento génico de<c>D40 modula la progresión de SLE que conduce a nefritis lúpica en ratones NZB/W F1 sin mostrar ningún efecto local sobre las células renales o del riñón o interferencia extracelular con la interacción con CD40. Tomado en conjunto, hay una alta necesidad no cubierta de nuevas terapias para nefritis lúpica. Esta necesidad puede abordarse mediante los anticuerpos anti-CD40 humanizados descritos en el presente documento y en el documento US20110243932 que se unen específicamente a CD40 y que muestran la especificidad de unión a antígeno, afinidad y propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas que permiten el uso de los mismos en la intervención terapéutica de nefritis lúpica.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado para su uso en un método para tratar y/o prevenir la nefritis lúpica (“el método de la invención”). En todos los aspectos y realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal humanizado es tal como se especifica en las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado que se une específicamente a CD40 humano para su uso en el tratamiento o la prevención de nefritis lúpica, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de SEQ Id NO: 53 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 52. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG1 y opcionalmente el anticuerpo tiene una mutación Leu234Ala y Leu235Ala en la región de Fc y comprende una cadena ligera kappa.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo usado en el método de tratamiento o prevención de nefritis lúpica es un anticuerpo humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de<s>E<q>ID NO: 35 o s Eq ID NO: 53, y el anticuerpo usado en el método de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 52.

También se contempla el anticuerpo anti-CD40 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de nefritis lúpica, en el que el anticuerpo anti-CD40 comprende un anticuerpo humanizado que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 31.

En otra realización, el anticuerpo humanizado usado en el método de tratamiento o prevención de nefritis lúpica comprende un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

Otra realización, el anticuerpo se refiere al tratamiento y/o la prevención de nefritis lúpica usando un anticuerpo aislado que se une específicamente a un CD40 humano, en el que el anticuerpo aislado comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región de entramado que tiene una secuencia de aminoácidos de la región de entramado de la secuencia de aminoácidos de dominio variable cadena pesada humano de SEQ ID NO: 35, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 31. También se describe en el presente documento el uso del anticuerpo monoclonal humanizado descrito en el presente documento para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir la nefritis lúpica (“el método de la invención”).

Dicho de otro modo, la presente descripción se refiere al uso del anticuerpo monoclonal humanizado descrito en el presente documento en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de nefritis lúpica.

Expresado una vez más de manera diferente, la presente invención se refiere al anticuerpo monoclonal humanizado descrito en el presente documento para su uso en el tratamiento y/o la prevención de nefritis lúpica. El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre dentro de las reivindicaciones se proporciona únicamente para información.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

La figura 1 muestra el efecto de la ligación de CD40 sobre células endoteliales humanas (HUVEC) en un medio que comprende 100 ng/ml de sCD40L y o bien anticuerpo B (•) o bien control de isotipo (anticuerpo humano de IgG1) (▲).

La figura 2 muestra el efecto de la ligación de CD40 sobre células epiteliales de túbulo proximal (PTEC) humanas de tres donantes diferentes (D1, D2, D3) en un medio que contiene 50 ng/ml de anticuerpo B frente a sCD40.

Descripción detallada de la invención

Ahora se reconoce que la señalización mediada por CD40 está implicada en una variedad de trastornos diana. A pesar de la disponibilidad de una variedad de datos preclínicos que muestran que la intervención en estos trastornos resultaría terapéuticamente beneficiosa, sigue existiendo una necesidad de anticuerpos anti-CD40 antagonistas que puedan usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como nefritis lúpica.

Los términos “CD40” y “antígeno de superficie de CD40” se refieren a una glicoproteína de aproximadamente 48 kD expresada en la superficie de células B normales y neoplásicas, que actúa como receptor para señales implicadas en la proliferación y diferenciación celular (Ledbetteret al.,1987, J. Immunol. 138:788-785). Se ha aislado una molécula de ADNc que codifica para CD40 a partir de una biblioteca preparada a partir de la línea celular Raji de linfoma de Burkitt (Stamenkovicet al.,1989, EMBO J. 8:1403).

Tal como se usa en el presente documento, una célula que expresa CD40 de manera endógena es cualquier célula caracterizada por la expresión en superficie de CD40, incluyendo, pero sin limitarse a, células B normales y neoplásicas, células interdigitantes, células epiteliales basales, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliales, células dendríticas foliculares, células de amígdalas y células plasmáticas derivadas de médula ósea. En algunas realizaciones, la molécula de CD40 es una molécula de CD40 humano.

Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a CD40 humano recombinante y nativo. Un anticuerpo monoclonal humanizado en el que dicho anticuerpo se une específicamente a CD40 humano que tiene una actividad antagonista de CI50 de menos de 1 nM y no tiene agonismo hasta 100 |ig/ml en proliferación de células B y en el que dicho anticuerpo está caracterizado además porque el anticuerpo tiene una semividain vivoen primates no humanos que es de al menos 10 días.

La estructura generalizada de anticuerpos o inmunoglobulina la conocen bien los expertos en la técnica, estas moléculas son glicoproteínas heterotetraméricas, normalmente de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida de manera covalente a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro para formar un heterodímero, y la molécula heterotramérica está formada mediante un enlace disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de los heterodímeros. Aunque las cadenas ligeras y pesadas están unidas entre sí mediante un enlace disulfuro, el número de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía mediante el isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre cadenas separados de manera regular. Cada cadena pesada tiene en el extremo de extremo terminal amino un dominio variable (V<h>), seguido por tres o cuatro dominios constantes (Cm, Ch<2>, Ch3 y Ch<4>), así como una región bisagra entre Ch<1>y Ch<2>. Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable de extremo terminal amino (V<l>) y un dominio constante de extremo terminal carboxilo

(C<l>). El dominio V<l>se asocia de manera no covalente con el dominio V<h>, mientras que el dominio C<l>está habitualmente unido de manera covalente al dominio C<h1>mediante un enlace disulfuro. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothiaet al.,1985, J. Mol. Biol. 186:651-663).

Determinados dominios dentro de los dominios variables difieren extensamente entre diferentes anticuerpos, es decir, son “hipervariables”. Estos dominios hipervariables contienen residuos que participan directamente en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su determinante antigénico específico. La hipervariabilidad, en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada, está concentrada en tres segmentos conocidos como regiones determinantes de la complementariedad (c Dr ) o bucles hipervariables (HVL). Las CDR se definen mediante comparación de secuencias en Kabatet al.,1991, en: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., mientras que los HVL se definen estructuralmente según la estructura tridimensional del dominio variable, tal como se describe por Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Cuando estos dos métodos dan como resultado identificaciones ligeramente diferentes de una CDR, se prefiere la definición estructural. Tal como se define por Kabat, CDR-L1 está posicionada aproximadamente en los residuos 24-34, CDR-L2 aproximadamente en los residuos 50-56, y CDR-L3 aproximadamente en los residuos 89-97 en el dominio variable de cadena ligera; CDR-H1 está posicionada aproximadamente en los residuos 31-35, CDR-H2 aproximadamente en los residuos 50-65, y CDR-H3 aproximadamente en los residuos 95-102 en el dominio variable de cadena pesada. Por tanto, CDR1,<c>DR2, CDR3 de las cadenas pesadas y ligeras definen propiedades únicas y funcionales específicas para un anticuerpo dado.

Las tres CDR dentro de cada una de las cadenas pesadas y ligera están separadas por regiones de entramado (FR), que contienen secuencias que tienden a ser menos variables. Desde el extremo de extremo terminal amino hasta el extremo de extremo terminal carboxilo de los dominios variables de cadena pesada y ligera, las FR y las CDR están dispuestas en el orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La configuración en gran medida en láminas p de las FR pone las CDR dentro de cada una de las cadenas en estrecha proximidad entre sí así como a las CDR de la otra cadena. La conformación resultante contribuye al sitio de unión a antígeno (véase Kabatet al.,1991, n.° de pub. de NIH 91-3242, vol. I, páginas 647-669), aunque no todos los residuos de CDR participan necesariamente de manera directa en la unión a antígeno.

Los residuos de FR y los dominios constantes de Ig no participan directamente en la unión a antígeno, pero contribuyen a la unión a antígeno y/o median en la función efectora del anticuerpo. Se piensa que algunos residuos de FR tienen un efecto significativo sobre la unión a antígeno al menos de tres maneras: mediante unión no covalente directamente a un epítopo, mediante interacción con uno o más residuos de CDR y afectando a la superficie de contacto entre las cadenas pesadas y ligeras. Los dominios constantes no participan directamente en la unión a antígeno pero median en diversas funciones efectoras de Ig.

Las cadenas ligeras de inmunoglobulinas de vertebrados se asignan a una de dos clases claramente distintas, kappa (k) y lambda (X), basándose en la secuencia de aminoácidos del dominio constante. Por comparación, las cadenas pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos se asignan a una de cinco clases principales, según la secuencia de los dominios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA se dividen adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, e, y y H, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de las clases de inmunoglobulinas nativas son muy conocidas.

Los términos “anticuerpo”, “anticuerpo anti-CD40”, “anticuerpo anti-CD40 humanizado” y “anticuerpo anti-CD40 humanizado variante” se usan en el presente documento en el sentido más amplio y abarcan específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo tales como dominios variables y otras porciones de anticuerpos que muestran una actividad biológica deseada, por ejemplo, unión a CD40.

El término “anticuerpo monoclonal” (AcM) se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; es decir, los anticuerpos individuales en esa población son idénticos excepto por mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único determinante antigénico, un “epítopo”. Por tanto, el modificador “monoclonal” es indicativo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos dirigidos hacia el epítopo idéntico y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Debe entenderse que pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica; incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (Kohleret al.,1975, Nature 256:495), o métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.816.567), o métodos de aislamiento de monoclonales producidos de manera recombinante usando bibliotecas de anticuerpos de fagos, usando técnicas descritas en Clacksonet al.,1991, Nature 352: 624-628, y Markset al.,1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597.

Los anticuerpos quiméricos consisten en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo a partir de una especie (por ejemplo, un mamífero no humano tal como un ratón) y las regiones constantes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo, ser humano) y pueden obtenerse uniendo las secuencias de ADN que codifican para las regiones variables del anticuerpo de la primera especie (por ejemplo, ratón) a las secuencias de ADN para las regiones constantes del anticuerpo de la segunda especie (por ejemplo, ser humano) y transformando un huésped con un vector de expresión que contiene las secuencias unidas para permitirle producir un anticuerpo quimérico. Alternativamente, el anticuerpo quimérico también puede ser uno en el que una o más regiones o dominios de la cadena pesada y/o ligera son idénticos a, homólogos a o una variante de la secuencia correspondiente en un anticuerpo monoclonal de otra clase o isotipo de inmunoglobulina, o de una secuencia consenso o de línea germinal. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir fragmentos de tales anticuerpos, siempre que el fragmento de anticuerpo muestre la actividad biológica deseada de su anticuerpo parental, por ejemplo unión al mismo epítopo (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.816.567; y Morrisonet al.,1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Los términos “fragmento de anticuerpo”, “fragmento de anticuerpo anti-CD40”, “fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado”, “fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado variante” se refieren a una porción de un anticuerpo anti-CD40 de longitud completa, en la que se conserva una región variable o una capacidad funcional, por ejemplo, unión a epítopo de CD40 específica. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, un fragmento Fab, Fab', F(ab')<2>, Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, un diacuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo de cadena sencilla, un minicuerpo, un diacuerpo formado a partir de fragmentos de anticuerpo, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Los anticuerpos de longitud completa pueden tratarse con enzimas tales como papaína o pepsina para generar fragmentos de anticuerpo útiles. La digestión con papaína se usa para producir dos fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno idénticos denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio C<h1>de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab<')2>que tiene dos sitios de unión a antígeno y todavía puede unirse de manera cruzada a antígeno.

Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la presencia de residuos adicionales incluyendo una o más cisteínas a partir de la región bisagra de anticuerpo en el extremo terminal C del dominio Cm. Los fragmentos de anticuerpo F(ab<')2>son pares de fragmentos Fab' unidos mediante residuos de cisteína en la región bisagra. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

El fragmento “Fv” contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo que consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. De manera colectiva, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo.

Un fragmento de anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” es una variante de Fv de cadena sencilla que comprende los dominios Vh y Vl de un anticuerpo en el que los dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Fv de cadena sencilla puede reconocer y unirse a antígeno. El polipéptido de scFv también puede contener opcionalmente un grupo de unión de polipéptido posicionado entre los dominios V<h>y V<l>con el fin de facilitar la formación de una estructura tridimensional deseada para la unión a antígeno mediante scFv (véase, por ejemplo, Pluckthun, 1994, en The Pharmacology of monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315).

Otros fragmentos de anticuerpo reconocidos incluyen los que comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (Vh-Ch<1>-Vh-Ch<1>) para formar un de regiones de unión a antígeno. Estos “anticuerpos lineales” pueden ser biespecíficos o monoespecíficos tal como se describe, por ejemplo, en Zapataet al.1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062.

Un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado es un tipo específico de anticuerpo quimérico que incluye una variante de secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina, o fragmento de la misma, que puede unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una o más FR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una o más CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Esta secuencia de aminoácidos no humana, denominada con frecuencia secuencia de “importación”, se toma normalmente de un dominio de anticuerpo de “importación”, particularmente un dominio variable. En general, un anticuerpo humanizado incluye al menos las CDR o HVL de un anticuerpo no humano, insertadas entre las FR de un dominio variable de cadena pesada o ligera humano. La presente divulgación describe anticuerpos anti-CD40 humanizados específicos que contienen CDR derivadas de los anticuerpos monoclonales murinos mostradas en las tablas 3 y 4 insertadas entre las FR de dominios variables de cadena pesada y ligera de secuencia de línea germinal humana. Se entenderá que determinados residuos de FR murina pueden ser importantes para la función de los anticuerpos humanizados y, por tanto, algunos de los residuos de dominios variables de cadena pesada y ligera de secuencia de línea germinal humana se modifican para ser iguales que los de la secuencia murina correspondiente.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-CD40 humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (tal como están contenidos, por ejemplo, en fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>, Fabc y Fv) en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y específicamente en el presente documento, la totalidad de las CDR son secuencias murinas tal como se detalla en las tablas 1 a 4 a continuación en el presente documento y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las FR son las de una secuencia consenso o de línea germinal de inmunoglobulina humana. En otro aspecto, un anticuerpo anti-CD40 humanizado también incluye al menos una porción de una región de Fc de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Habitualmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como también al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir una o más de las regiones Ch<1>, bisagra, Ch<2>, Ch<3>y/o Ch<4>de la cadena pesada, según sea apropiado.

Un anticuerpo anti-CD40 humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGi, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgAi e IgA<2>. Un anticuerpo anti-CD40 humanizado alternativo puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo de inmunoglobulina, y seleccionar dominios constantes particulares para optimizar funciones efectoras deseadas está dentro de las capacidades habituales en la técnica. En realizaciones específicas, la presente invención proporciona anticuerpos que son anticuerpos de IgGi y, más particularmente, son anticuerpos de IgGi en los que hay una desactivación de funciones efectoras.

No es necesario que las FR y CDR, o HVL, de un anticuerpo anti-CD40 humanizado correspondan con precisión a las secuencias parentales. Por ejemplo, uno o más residuos en la CDR, o HVL, de importación o la secuencia de FR consenso o de línea germinal pueden alterarse (por ejemplo, mutagenizarse) mediante sustitución, inserción o deleción de tal manera que el residuo de aminoácido resultante ya no es idéntico al residuo original en la posición correspondiente en ninguna de las secuencias parentales, pero el anticuerpo conserva no obstante la función de unión a CD40. Normalmente tal alteración no será extensiva y serán alteraciones conservativas. Habitualmente, al menos el 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias de CDR de importación y FR consenso o de línea germinal parentales, más frecuentemente al menos el 90% y lo más frecuentemente más del 95% o más del 98% o más del 99%.

Los residuos de inmunoglobulina que afectan a la superficie de contacto entre regiones variables de cadena pesada y ligera (“la superficie de contacto Vl-Vh”) son aquellos que afectan a la proximidad u orientación de las dos cadenas una con respecto a la otra. Determinados residuos que pueden participar en las interacciones entra cadenas incluyen los residuos de V<l>34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 y 98 y los residuos de V<h>35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 y 103 (usando el sistema de numeración expuesto en Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). La patente estadounidense n.° 6.407.213 también comenta que residuos tales como los residuos de V<l>43 y 85, y los residuos de V<h>43 y 60 también pueden participar en esta interacción. Aunque estos residuos sólo se indican para IgG humana, son aplicables entre especies. Los residuos de anticuerpo importantes que se espera razonablemente que participen en interacciones entre cadenas se seleccionan para su sustitución en la secuencia consenso.

Los términos “secuencia consenso” y “anticuerpo consenso” se refieren a una secuencia de aminoácidos que comprende el residuo de aminoácido que se produce con la mayor frecuencia en cada ubicación en todas las inmunoglobulinas de cualquier clase, isotipo o estructura de subunidad particular, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina humana. La secuencia consenso puede basarse en inmunoglobulinas de una especie particular o de muchas especies. Se entiende que una secuencia, estructura o anticuerpo “consenso” abarca una secuencia humana consenso tal como se describe en determinadas realizaciones, y que se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácido que se producen con la mayor frecuencia en cada ubicación en todas las inmunoglobulinas humanas de cualquier clase, isotipo o estructura de subunidad particular. Por tanto, la secuencia consenso contiene una secuencia de aminoácidos que tiene, en cada posición, un aminoácido que está presente en una o más inmunoglobulinas conocidas, pero que puede no duplicar exactamente toda la secuencia de aminoácidos de cualquier inmunoglobulina individual. La secuencia consenso de región variable no se obtiene a partir de ningún anticuerpo o inmunoglobulina producido de manera natural. Kabatet al.,1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., y variantes del mismo. Las FR de secuencias consenso de cadena pesada y ligera, y variantes de las mismas, proporcionan secuencias útiles para la preparación de anticuerpos anti-CD40 humanizados. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.037.454 y 6.054.297.

Las secuencias de línea germinal humana se encuentran en la población humana. Una combinación de esos genes de línea germinal genera diversidad de anticuerpos. Las secuencias de anticuerpos de línea germinal para la cadena ligera del anticuerpo proceden de genes v y genes j kappa o lambda de línea germinal humana conservados. De manera similar, las secuencias de cadena pesada proceden de genes v, d y j de línea germinal (LeFranc, M-P, y LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001).

Tal como se usa en el presente documento, “variante”, “variante anti-CD40”, “variante anti-CD40 humanizada” o “anticuerpo anti-CD40 humanizado variante” se refieren, cada uno, a un anticuerpo anti-CD40 humanizado que tiene al menos una CDR murina variable de cadena pesada de cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 4 o una secuencia de CDR murina de cadena ligera derivada del anticuerpo monoclonal murino tal como se muestra en cualquiera de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 8 y secuencias de F<r>derivadas a partir de secuencias consenso humanas. Las variantes incluyen aquellas que tienen uno o más cambios de aminoácido en uno o ambos dominios variables de cadena ligera o cadena pesada, siempre que el cambio de aminoácido no afecte sustancialmente a la unión del anticuerpo a CD40. Los anticuerpos humanizados a modo de ejemplo producidos en el presente documento incluyen los denominados anticuerpo A, anticuerpo B y anticuerpo C y las diversas secuencias de cadena pesada y ligera de los mismos tal como se muestran en SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 40.

Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes del entorno natural del anticuerpo son aquellos materiales que pueden interferir con usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo y pueden ser enzimas, hormonas u otros solutos proteináceos o no proteináceos. En un aspecto, el anticuerpo se purificará hasta un aislamiento al menos mayor del 95% en peso de anticuerpo.

Un anticuerpo aislado incluye un anticuerpoin situdentro de células recombinantes en las que se produce, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, habitualmente, un anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación en la que se retira el material celular recombinante.

El término “rendimiento de anticuerpo” se refiere a factores que contribuyen al reconocimiento por el anticuerpo de antígeno o a la eficacia de un anticuerpoin vivo.Cambios en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden afectar a las propiedades de anticuerpo tales como plegamiento y pueden influir en factores físicos tales como tasa inicial de unión de anticuerpo a antígeno (ka), constante de disociación del anticuerpo a partir del antígeno (kd), constante de afinidad del anticuerpo para el antígeno (Kd), conformación del anticuerpo, estabilidad de proteína y semivida del anticuerpo.

El término “marcado con etiqueta de epítopo”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo anti-CD40 fusionado a una “etiqueta de epítopo”. Una “etiqueta de epítopo” es un polipéptido que tiene un número suficiente de aminoácidos para proporcionar un epítopo para la producción de anticuerpo, pero está diseñado de tal manera que no interfiere con la actividad deseada del anticuerpo anti-CD40 humanizado. Habitualmente, la etiqueta de epítopo es lo suficientemente única de tal manera que un anticuerpo producido contra una etiqueta de epítopo no presenta reacción cruzada sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos de etiqueta adecuados contienen generalmente al menos 6 residuos de aminoácido y habitualmente contienen aproximadamente de 8 a 50 residuos de aminoácido, o aproximadamente de 9 a 30 residuos. Los ejemplos de etiquetas de epítopo y el anticuerpo que se une al epítopo incluyen el polipéptido de etiqueta de HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Fieldet al.,1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; etiqueta de c-myc y anticuerpos 8F9, 3C7,<6>E<10>, G4, B7 y 9E10 frente a la misma (Evanet al.,1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616; y etiqueta de glicoproteína D (gD) de virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborskyet al.1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). En determinadas realizaciones, la etiqueta de epítopo es un “epítopo de unión a receptor de rescate”. Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo de unión a receptor de rescate” se refiere a un epítopo de la región de Fc de una molécula de IgG (tal como IgG-i, IgG<2>, IgG<3>o IgG<4>) que es responsable de aumentar la semivida en sueroin vivode la molécula de IgG.

Los anticuerpos también pueden conjugarse a profármacos. Un “profármaco” es una forma de precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa. Véase, por ejemplo, Wilman, 1986, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy”, en Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615th Meeting Belfast y Stellaet al.,1985, “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, en: “Directed Drug Delivery”, Borchardtet al.,(ed.), págs. 247-267, Humana Press.

Con fines de monitorización de diagnóstico así como de tratamiento, los anticuerpos usados en el método de la invención también pueden conjugarse a un marcador, ya sea un marcador solo o un marcador y un segundo agente adicional (profármaco y similares). Un marcador, según se distingue de los otros segundos agentes, se refiere a un agente que es un compuesto o composición detectable y puede conjugarse directa o indirectamente a un anticuerpo humanizado de la presente invención. El marcador puede ser detectable en sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. El anticuerpo anti-CD40 humanizado marcado puede prepararse y usarse en diversas aplicaciones incluyendo diagnósticosin vitroein vivo.

Los anticuerpos usados en el método de la presente invención pueden formularse como parte de una preparación liposómica con el fin de producir la administración de los mismosin vivo.Un “liposoma” es una vesícula pequeña compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo. Los liposomas son útiles para la administración a un mamífero de un compuesto o formulación, tal como un anticuerpo anti-CD40 humanizado dado a conocer en el presente documento, opcionalmente, acoplado a, o en combinación con, uno o más marcadores y/o agentes farmacéuticamente activos. Los componentes del liposoma están habitualmente dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas.

El término “mamífero” con fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domesticados y de granja, y animales de zoológicos, para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

Un “trastorno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a nefritis lúpica.

El término “bolo intravenoso” o “inyección intravenosa lenta” se refiere a la administración de fármaco en una vena de un animal o ser humano de tal manera que el cuerpo recibe el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, generalmente 5 minutos o menos.

El término “administración subcutánea” se refiere a la introducción de un agente bajo la piel de un animal o paciente humano, preferiblemente dentro de una cavidad entre la piel y el tejido subyacente, mediante administración sostenida, relativamente lenta, a partir de un receptáculo de fármaco. Pellizcar o tirar de la piel hacia arriba y alejándola del tejido subyacente puede crear la cavidad.

El término “infusión subcutánea” se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un animal o paciente humano, preferiblemente dentro de una cavidad entre la piel y el tejido subyacente, mediante administración sostenida, relativamente lenta, a partir de un receptáculo de fármaco durante un periodo de tiempo incluyendo, pero sin limitarse a, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión puede realizarse mediante implantación subcutánea de una bomba de administración de fármaco implantada bajo la piel del animal o paciente humano, en la que la bomba administra una cantidad predeterminada de fármaco durante un periodo de tiempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos o un periodo de tiempo que abarca la longitud del régimen de tratamiento.

El término “bolo subcutáneo” se refiere a la administración de fármaco por debajo de la piel de un animal o paciente humano, en la que una administración de fármaco en bolo tarda menos de aproximadamente 15 minutos; en otro aspecto, menos de 5 minutos, y en todavía otro aspecto, menos de 60 segundos. En incluso aún otro aspecto, la administración se realiza dentro de una cavidad entre la piel y el tejido subyacente, en la que la cavidad puede crearse pellizcando o tirando de la piel hacia arriba y alejándola del tejido subyacente.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se usa para referirse a una cantidad de un agente activo que alivia o mejora uno o más de los síntomas del trastorno que está tratándose. Al hacer esto, es la cantidad que tiene un desenlace beneficioso para el paciente, por ejemplo, un efecto de detención del crecimiento o provoca la eliminación de la célula. En un aspecto, la cantidad terapéuticamente eficaz tiene una actividad apoptótica o puede inducir la muerte celular. En otro aspecto, la cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una concentración en suero objetivo que se ha mostrado que es eficaz, por ejemplo, para ralentizar la progresión de la enfermedad. La eficacia puede medirse de maneras convencionales, dependiendo del estado que va a tratarse. Por ejemplo, en enfermedades o trastornos neoplásicos caracterizados por células que expresan CD40, la eficacia puede medirse evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad o determinando las tasas de respuesta.

Se pretende que los términos “tratamiento” y “terapia” y similares, tal como se usan en el presente documento, incluyan medidas terapéuticas así como profilácticas, o medidas supresoras para una enfermedad o trastorno que conducen a cualquier efecto clínicamente deseable o beneficioso, incluyendo, pero sin limitarse a, alivio o reducción de uno o más síntomas, regresión, ralentización o cese de la progresión de la enfermedad o trastorno. Por tanto, por ejemplo, el término tratamiento incluye la administración de un agente antes de, o tras, la aparición de un síntoma de una enfermedad o trastorno, previniendo o eliminando de ese modo uno o más signos de la enfermedad o trastorno. Como otro ejemplo, el término incluye la administración de un agente tras la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad. Además, la administración de un agente tras la aparición y tras haberse desarrollado síntomas clínicos, en la que la administración afecta a parámetros clínicos de la enfermedad o trastorno, tales como el grado de lesión tisular o la cantidad o alcance de metástasis, tanto si el tratamiento conduce a una mejora de la enfermedad como si no, comprende “tratamiento” o “terapia” tal como se usa en el presente documento. Además, siempre que las composiciones de la invención, o bien solas o bien en combinación con otro agente terapéutico, alivien o mejoren al menos un síntoma de un trastorno que está tratándose en comparación con ese síntoma en ausencia de uso de la composición de anticuerpo frente a CD40 humanizado, debe considerarse que el resultado es un tratamiento eficaz del trastorno subyacente independientemente de si se alivian todos los síntomas del trastorno o no.

El término “prospecto” se usa para hacer referencia a instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos.

A menos que se defina otra cosa en el presente documento, los términos “composición farmacéutica”, “formulación farmacéutica” y “formulación” pueden usarse de manera intercambiable.

Anticuerpos

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados y agentes de unión pueden usarse en el tratamiento y/o la prevención de una variedad de enfermedades o trastornos caracterizados por la proliferación de células que expresan el antígeno de superficie de CD40, tales como nefritis lúpica. Un anticuerpo anti-CD40 humanizado y un agente de unión a CD40 incluyen, cada uno, al menos una porción que reconoce específicamente un epítopo de CD40 (es decir, un fragmento de unión a antígeno).

Métodos para producir los anticuerpos anti-CD40 se han descrito anteriormente en el documento US20110243932. Tal como se describió anteriormente en el documento US20110243932, los anticuerpos murinos de caracterización inicial se seleccionaron basándose en caracterización de unión a CD40.

A partir de estos estudios iniciales, se seleccionaron anticuerpos murinos que tenían las siguientes regiones variables de cadena pesada mostradas en la tabla 1 y las regiones variables de cadena ligera mostradas en la tabla 2.

Tabla 1: secuencias líder - VH murinas de CD40

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGR

IDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY

2H11 YVGTYGYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:1)

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEKGLEWIGR

IDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY

10F2 YVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:2)

EVQLQQSGAELVRPGASVQLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGR

IDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSSNTVYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY

19B10 YVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:3)

EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAY

ISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTALYYCARQD

20E2 GYRYAMDYWGQGTSVTVSSfSEQ ID NO:4)

Tabla 2: secuencias líder - VK murinas de CD40

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYST

SNLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG

2H11 TKLEIK (SEQ ID NO:5)

QIVLTQSPTIMSASPGEKVIITCSATSSVSYILWFQQKPGTSPKLWIYST

SNLASGVPARFSGSGSGASYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG

10F2 TKLEIK (SEQ ID NO:6)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYST

SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG

19B10 TKLEIK (SEQ ID NO:7)

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPP

KLLIYWTSTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNLQAEDLAVYYCQNDYTY

20E2 PLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:8)

Se seleccionaron secuencias de entramado humanas para cada una de las secuencias líder de ratón basándose en la homología de entramado, estructura de CDR, residuos canónicos conservados, residuos de empaquetamiento de superficie de contacto conservados y otros parámetros.

Las CDR de cadena pesada y cadena ligera murinas de los diversos anticuerpos murinos, anticuerpos seleccionados, se muestran en la tabla 3 y la tabla 4, respectivamente:

Tabla 3:

Secuencias de CDR de cadena pesada

Nombre de H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3

constructo

2H11GFNIKDYYVH RIDPEDGDSKYAPKFQG SYYVG TYG Y

SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 16

10F2 GFNIKDYYIH RIDPEDGDTKYDPKFQG SYYVGTYGY

19B10 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 16

GFNIKDYYVH RIDPEDGDTKFAPKFQG SYYVGTYGY

20E2 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16

GFTFSDYGMH YISSGNRIIYYADTVKG QDGYRYAMDYSEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17

La H-CDR1 indicada anteriormente es usando la secuencia que usa el sistema de numeración de Chothia (Al-Lazikaniet al.,(1997) JMB 273,927-948). La numeración de Kabat para las secuencias se designa mediante I texto en negrita y en cursiva y la numeración de IMGT se muestra mediante el texto subrayado de los residuos en la tabla anterior para CDR1 y CDR2. Las secuencias para H-CDR3 para cada uno de 2H11, 10F2 y 19B10 es TTSYYVGTYGY (SEQ ID NO: 77) y para 20E2 es ARQDGYRYAMDY (SEQ ID NO: 78).

Tabla 4:

Secuencias de CDR de cadena ligera

Nombre de constructo L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3

2H11SASSSVSYML STSNLAS QQRTFYPYT

10F2 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24

SATSSVSYIL STSNLAS QQRTFYPYT

19B10 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24

SASSSVSYML STSNLAS QQRTFYPYT

20E2 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24

KSSQSLLNSGNQKNYLT WTSTRES QNDYTYPLTSEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25

De nuevo, se usa el sistema de numeración de Chothia en la tabla 4, designándose la numeración de Kabat para las secuencias mediante el texto en negrita y en cursiva y la numeración de IMGT se muestra mediante el texto subrayado.

Los Fab que mostraron una unión mejor o igual en comparación con el Fab parental quimérico se seleccionaron para su conversión en IgG. Se convirtieron clones de la serie de 20E2 en dos formatos de IgG diferentes: a) IgG4DM (doble mutante) tiene dos mutaciones en la región de Fc / bisagra, Ser228Pro que reduce la formación de media molécula y Leu235Glu que reduce adicionalmente la unión de FcyR. b) IgG1KO (desactivación de funciones efectoras) tiene dos mutaciones en la región de Fc, Leu234Ala y Leu235Ala, que reducen la función efectora tal como unión de FcyR y complemento. Ambos formatos de IgG se describen en la bibliografía. El ejemplo 1 describe con más detalle la humanización de tres candidatos. Los resultados de tal humanización dieron como resultado secuencias de anticuerpo humanizado, que tienen las secuencias de cadena pesada y ligera mostradas a continuación:

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados descritos en el presente documento, incluyendo fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como dominios variables de cadena pesada y ligera, comprenden una secuencia de aminoácidos de los residuos derivados de las CDR de anticuerpo A (secuencia de cadena pesada = SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30; secuencia de cadena ligera = SEQ ID NO: 26), anticuerpo B (secuencia de cadena pesada = SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; o SEQ ID NO: 35; secuencia de cadena ligera = SEQ ID NO: 31) y anticuerpo C (secuencia de cadena pesada = SEQ ID NO: 37; s Eq ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40; secuencia de cadena ligera = S<e>Q ID NO: 36) descritas anteriormente en el presente documento y residuos de aminoácido derivados de regiones de entramado de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados incluyen opcionalmente sustituciones de aminoácidos específicas en las regiones de entramado consenso o de línea germinal.

La sustitución específica de residuos de aminoácido en estas posiciones de entramado puede mejorar diversos aspectos del rendimiento de anticuerpo incluyendo afinidad de unión y/o estabilidad, con respecto al demostrado en anticuerpos humanizados formados mediante “intercambio directo” de CDR o HVL en las regiones de entramado de línea germinal humanas, tal como se muestra en los siguientes ejemplos.

En el presente documento también se describen otros anticuerpos monoclonales con secuencias de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4 y secuencias de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 8 (véanse las tablas 1 y 2 anteriores). La secuencia de CDR de estos anticuerpos murinos se muestran en las tablas 3 y 4 colocar tales CDR en FR de los dominios variables de cadena pesada y ligera consenso humanos proporcionará anticuerpos humanizados útiles.

En algunas realizaciones específicas, los anticuerpos anti-CD40 humanizados dados a conocer en el presente documento comprenden al menos un dominio variable de cadena pesada o ligera que comprende las CDR o HVL de los anticuerpos monoclonales murinos tal como se muestran en las tablas 1 a 4 anteriores y las FR de los dominios variables de cadena pesada y ligera de línea germinal humanos. En realizaciones a modo de ejemplo, los anticuerpos humanizados creados en el presente documento son: anticuerpo A, anticuerpo B y anticuerpo C y las diversas secuencias de cadena pesada y ligera de los mismos se muestran en SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 40.

En realizaciones específicas, se dan a conocer anticuerpos en el presente documento que tienen una secuencia de cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SeQ ID NO: 30 en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 26. Los anticuerpos según la invención incluyen aquellos que tienen una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 35, en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En realizaciones todavía adicionales, en el presente documento se dan a conocer anticuerpos humanizados que tienen una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 36.

Las CDR de estas secuencias se muestran en las tablas 3 y 4. En realizaciones específicas, se contempla que anticuerpos quiméricos con regiones de CDR intercambiadas (es decir, por ejemplo intercambiar una o dos CDR del anticuerpo A con la CDR análoga del anticuerpo C) entre estas inmunoglobulinas a modo de ejemplo pueden proporcionar anticuerpos útiles.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 humanizado es un fragmento de anticuerpo. Anteriormente se han comentado de manera general diversos fragmentos de anticuerpo y hay técnicas que se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos pueden derivarse mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimotoet al.,1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; y Brennanet al.,1985, Science 229:81). Alternativamente, los fragmentos pueden producirse directamente en células huésped recombinantes. Por ejemplo, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH directamente deE. coliy acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab<')2>(véase, por ejemplo, Carteret al.,1992, Bio/Technology 10:163-167). Mediante otro enfoque, pueden aislarse fragmentos F(ab<')2>directamente a partir de cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el experto.

En el presente documento también se describe un fragmento F(ab<')2>de un anticuerpo anti-CD40 humanizado que comprende una secuencia de cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30 en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 26. Los anticuerpos alternativos incluyen los que tienen una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ iD NO: 34 o SEQ ID NO: 35, en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En realizaciones todavía adicionales, en el presente documento se dan a conocer anticuerpos humanizados que tienen una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 36. Tales realizaciones pueden incluir un anticuerpo intacto que comprende un F(ab<')2>de este tipo.

El dominio efector de un anticuerpo puede ser de cualquier isotipo y especie de animal vertebrado adecuado. Los isotipos de diferentes especies de animales difieren en cuanto a las capacidades para mediar en funciones efectoras. Por ejemplo, la capacidad de una inmunoglobulina humana para mediar en CDC y ADCC/ADCP está generalmente en el orden de IgM“ IgG-HgG<3>>IgG<2>>IgG<4>y IgG-i=IgG<3>>IgG<2>/IgM/IgG<4>, respectivamente. Las inmunoglobulinas murinas median en CDC y ADCC/ADCP generalmente en el orden de IgM=IgG<3>>>IgG<2>b>IgG<2>a>>IgG<1>y IgG<2>b>IgG<2>a>IgG-i>>IgG<3>murinas, respectivamente. En otro ejemplo, IgG<2>a media en ADCC mientras que tanto IgG<2>a como IgM murinas median en CDC.

Modificaciones de anticuerpos

Los agentes y anticuerpos anti-CD40 humanizados pueden incluir modificaciones del anticuerpo anti-CD40 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Pueden producirse conjugados del anticuerpo anti-CD40 humanizado mediante métodos conocidos, usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanediamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitettaet al.,1987, Science 238:1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. También pueden formarse conjugados con un agente de unión escindible.

Los anticuerpos anti-CD40 humanizados dados a conocer en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Se preparan liposomas que contienen el anticuerpo mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epsteinet al.,1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwanget al.,1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; y las patentes estadounidenses n.os 4.485.045 y 4.544.545. Se dan a conocer liposomas que tienen un tiempo de circulación potenciado, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Se extruyen liposomas a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab' de un anticuerpo dado a conocer en el presente documento a los liposomas tal como se describe en Martinet al.,1982, J. Biol. Chem. 257:286-288 mediante reacción de intercambio de enlaces disulfuro.

En otras realizaciones, también se incluyen modificaciones covalentes del anticuerpo anti-CD40 humanizado. Las modificaciones covalentes incluyen modificación de residuos de cisteinilo, residuos de histidilo, residuos de lisinilo y de extremos terminales amino, residuos de arginilo, residuos de tirosilo, grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo), residuos de glutaminilo y asparaginilo, o serilo, o residuos de treonilo. Otro tipo de modificación covalente implica acoplar de manera química o enzimática glicósidos al anticuerpo. Tales modificaciones pueden realizarse mediante síntesis química o mediante escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo pueden introducirse en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos amino o de extremos terminales carboxilo.

La retirada de cualquier resto de hidrato de carbono presente en el anticuerpo puede lograrse de manera química o enzimática. La desglicosilación química se describe por Hakimuddinet al.,1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edgeet al.,1981, Anal. Biochem., 118:131. La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono en anticuerpos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas tal como se describe por Thotakuraet al.,1987, Meth. Enzymol 138:350.

Otro tipo de modificación covalente útil comprende unir el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en una o más de la patente estadounidense n.° 4.640.835, la patente estadounidense n.° 4.496.689, la patente estadounidense n.° 4.301.144, la patente estadounidense n.° 4.670.417, la patente estadounidense n.° 4.791.192 y la patente estadounidense n.° 4.179.337.

Humanización y variantes de secuencias de aminoácidos

Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD40 introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de anticuerpo anti-CD40, o mediante síntesis de péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-CD40 de los ejemplos en el presente documento. Cualquier combinación de deleciones, inserciones y sustituciones se realiza para llegar al constructo final, siempre que el constructo final presente las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales del anticuerpo anti-CD40 humanizado o variante, tal como cambiar el número o la posición de sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo anti-CD40 que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina “mutagénesis por barrido con alanina”, tal como se describe por Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). En este caso, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (normalmente alanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con antígeno CD40. Después, las ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional frente a las sustituciones se refinan introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí misma puede no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo mutagénesis por barrido con alanina o aleatoria en el codón o región diana y se examinan las variantes de anticuerpo anti-CD40 expresadas para determinar la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o de extremos terminales carboxilo cuya longitud oscila desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de una secuencia de un único o múltiples residuos de aminoácido. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-CD40 fusionado a una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-CD40 incluyen una fusión en el extremo terminal N o C del anticuerpo anti-CD40 de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. En estas variantes se retira al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-CD40 y se inserta un residuo diferente en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. En la tabla 5 se muestran sustituciones conservativas bajo el título de “sustituciones preferidas”. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo”, o tal como se describe adicionalmente a continuación con referencia a clases de aminoácidos, y examinarse los productos.

Residuo original Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones preferidas Ala (A) val; leu; ile val

Arg (R) lys; gln; asn lys

Asn(N) gln; his; asp, lys; arg gln

Asp(D) glu; asn glu

Cys (C) ser; ala ser

Gln (Q) asn; glu asn

Glu (E) asp; gln asp

Gly (G) ala ala

His (H) arg; asn; gln; lys; arg

Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L) ile; norleucina; val; met; ala; phe ile

Lys (K) arg; gln; asn arg

Met (M) leu; phe; ile leu

Phe (F) tyr; leu; val; ile; ala; tyr

Pro (P) ala ala

Ser (S) thr thr

Thr (T) ser ser

Trp (W) tyr; phe tyr

Tyr (Y) phe; trp; thr; ser phe

Val (V) leu; ile; met; phe ala; norleucina; leu

En la química de proteínas, generalmente se acepta que pueden lograrse las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en cuanto a su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en láminas o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se producen de manera natural se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gin, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo de cisteína que no participa en mantener la conformación apropiada del anticuerpo anti-CD40 humanizado o variante también puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula, prevenir la reticulación aberrante o proporcionar puntos establecidos de conjugación a un compuesto diana. A la inversa, puede(n) añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una manera conveniente de generar tales variantes de sustitución es la maduración por afinidad usando presentación en fagos. En resumen, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se presentan de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Después se examinan las variantes presentadas en fagos para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Con el fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para la modificación, puede realizarse mutagénesis por barrido con alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y CD40 humano. Tales residuos de contacto y residuos contiguos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez generadas tales variantes, se somete el panel de variantes a examen tal como se describe en el presente documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por “alterar” quiere decirse delecionar uno o más restos de hidratos de carbono encontrados en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar los anticuerpos de la invención para añadir sitios de glicosilaciones. La glicosilación de anticuerpos está normalmente o bien unida a N o bien unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Por tanto, con el fin de glicosilar una proteína dada, por ejemplo, un anticuerpo, se modifica la secuencia de aminoácidos de la proteína por ingeniería para contener una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de glicosilación unida a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unida a O).

Moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD40 se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se producen de manera natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis mediante PCR y mutagénesis por casete de una variante anteriormente preparada o una versión no variante del anticuerpo anti-CD40.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “idéntico” o “porcentaje de identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácido que son iguales, cuando se comparan y se alinean para obtener una correspondencia máxima. Para determinar el porcentaje de identidad, se alinean las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Después se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.° de posiciones idénticas / n.° total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes)x100). En algunas realizaciones, las dos secuencias que se comparan tienen la misma longitud después de introducirse huecos dentro de las secuencias, según sea apropiado (por ejemplo, excluyendo secuencia adicional que se extiende más allá de las secuencias que están comparándose). Por ejemplo, cuando se comparan secuencias de región variable, no se consideran las secuencias líder y/o de dominio constante. Para comparaciones de secuencias entre dos secuencias, una CDR “correspondiente” se refiere a una CDR en la misma ubicación en ambas secuencias (por ejemplo, CDR-H1 de cada secuencia).

La determinación de porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas N<b>LAST y XBLAST de Altschulet al.,1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos de BLAST con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico que codifica para una proteína de interés. Pueden realizarse búsquedas de proteínas de BLAST con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra= 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína de interés. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede usarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschulet al.,1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda con iteraciones que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias de GCG. Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. En la técnica se conocen algoritmos adicionales para análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM tal como se describe en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda. Si ktup=2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que están comparándose analizando pares de residuos alineados; si ktup=1, se examinan aminoácidos alineados individuales. ktup puede establecerse a 2 ó 1 para secuencias de proteínas, o desde 1 hasta 6 para secuencias de ADN. El valor por defecto, si no se especifica ktup, es 2 para proteínas y 6 para ADN. Alternativamente, puede llevarse a cabo una alineación de secuencias de proteínas usando el algoritmo CLUSTAL W, tal como se describe por Higginset al.,1996, Methods Enzymol. 266:383-402.

Usos terapéuticos

El agente o anticuerpo anti-CD40 humanizado se administra mediante cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional (incluyendo perfusión o puesta en contacto de otro modo del injerto con el anticuerpo antes del trasplante). El agente o anticuerpo anti-CD40 humanizado puede administrarse, por ejemplo, como infusión o como bolo. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-CD40 humanizado se administra de manera adecuada mediante infusión pulsada, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. En un aspecto, la dosificación se administra mediante inyecciones, lo más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Para la prevención o el tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá de una variedad de factores tales como el tipo de enfermedad que va a tratarse, tal como se definió anteriormente, la gravedad y transcurso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia anterior, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico encargado. El anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente en una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 |ig/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0,1 15 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones independientes, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 1 |ig/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden resultar útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos y técnicas convencionales. Una pauta posológica a modo de ejemplo es la dada a conocer en el documento WO 94/04188.

El término “supresión” se usa en el presente documento en el mismo contexto que “mejora” y “alivio” para referirse a una reducción de una o más características de la enfermedad.

La composición de anticuerpo se formulará, dosificará y administrará de una manera compatible con la buena práctica médica. Los factores para tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que está tratándose, el mamífero particular que está tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la planificación de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. La “cantidad terapéuticamente eficaz” del anticuerpo que va a administrarse estará regida por tales consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar el trastorno asociado con la expresión de CD40.

El anticuerpo no se formula necesariamente, pero opcionalmente se formula, con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar nefritis lúpica. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-CD40 humanizado presente en la formulación y de otros factores comentados anteriormente. Generalmente se usan en las mismas dosificaciones y con vías de administración tal como se usaron anteriormente en el presente documento o aproximadamente desde el 1 hasta el 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

El tratamiento o la prevención de nefritis lúpica según los métodos descritos en el presente documento se logra administrando a un sujeto que necesita tal tratamiento o prevención una cantidad eficaz del agente o anticuerpo anti-CD40, mediante lo cual el anticuerpo (i) se une a células inmunitarias activadas que expresan CD40 y que están asociadas con el estado patológico y (ii) ejerce un efecto inmunosupresor sobre las células inmunitarias activadas.

Composiciones farmacéuticas y administración de las mismas

Una composición que comprende un agente de unión a CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) puede administrarse a un sujeto que tiene o corre el riesgo de tener nefritis lúpica. La divulgación proporciona además el uso de un agente de unión a CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de nefritis lúpica. El término “sujeto” tal como se usa en el presente documento significa cualquier paciente mamífero al que se le puede administrar un agente de unión a<c>D40, incluyendo, por ejemplo, seres humanos y mamíferos no humanos, tales como primates, roedores y perros. Los sujetos específicamente destinados para el tratamiento usando los métodos descritos en el presente documento incluyen seres humanos. Los anticuerpos o agentes pueden administrarse o bien solos o bien en combinación con otras composiciones en la prevención o el tratamiento de nefritis lúpica.

Los anticuerpos preferidos para su uso en tales composiciones farmacéuticas son aquellos que comprenden anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35.

En realizaciones específicas, la composición de agente de unión a CD40 se administra mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo una membrana, tal como una membrana sialástica o una fibra. Normalmente, cuando se administra la composición, se usan materiales en los que no se absorbe el agente o anticuerpo anti-CD40.

En otras realizaciones, el agente o anticuerpo anti-CD40 se administra en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase, por ejemplo, Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldet al.,1980, Surgery 88:507; Saudeket al.,1989, N. Engl. J. Med.

321:574). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Flo., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, Nueva York, 1984); Ranger y Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Véase también Levyet al.,1985, Science 228:190; Duringet al.,1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardet al.,1989, J. Neurosurg. 71:105). Otros sistemas de liberación controlada se comentan, por ejemplo, en Langer, citado anteriormente.

Un agente de unión a CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) puede administrarse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de unión y uno o más compuestos farmacéuticamente compatibles.

En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se formula según procedimientos de rutina como composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa o subcutánea a seres humanos. Normalmente, las composiciones para su administración mediante inyección son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, el producto farmacéutico también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los componentes se suministran o bien por separado o bien mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando el producto farmacéutico tiene que administrarse mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando el producto farmacéutico se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de solución salina o agua para inyección estéril de modo que los componentes pueden mezclarse antes de la administración.

Además, la composición farmacéutica puede proporcionarse como un kit farmacéutico que comprende (a) un recipiente que contiene un agente de unión a<c>D40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) en forma liofilizada y (b) un segundo recipiente que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua estéril) para inyección. El diluyente farmacéuticamente aceptable puede usarse para la reconstitución o dilución del agente o anticuerpo anti-CD40 liofilizado. Opcionalmente asociado con tal(es) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma recomendada por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso y comercialización de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o comercialización para administración a seres humanos.

En una realización, la composición farmacéutica comprende una composición acuosa que tiene una concentración de anticuerpo anti-CD40 de desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 200 mg/ml; o desde aproximadamente 100 mg/ml hasta aproximadamente 200 mg/ml; o desde aproximadamente 120 mg/ml hasta aproximadamente 180 mg/ml; o de aproximadamente 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml o 200 mg/ml.

Además del anticuerpo anti-CD40, la composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un tampón, un agente estabilizante y, opcionalmente, un agente de ajuste del pH. Los ejemplos no limitativos de agentes tamponantes incluyen una o más sales tales como cloruro de sodio, clorhidrato de arginina, tiocianato de sodio, tiocianato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, cloruro de calcio, cloruro de cinc y acetato de sodio; o las sales de ácidos adecuados tales como ácido acético y aminoácidos. El agente tamponante se añade en una cantidad suficiente para proporcionar una viscosidad adecuada para administrar la formulación al paciente, por ejemplo, mediante inyección. La composición farmacéutica puede comprender desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200 mM de sal o tampón, o desde aproximadamente 120 mM hasta aproximadamente 180 mM de sal o tampón. En una realización, la composición farmacéutica comprende un tampón que comprende acetato de sodio a una concentración de desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 30 mM y cloruro de sodio a una concentración de desde aproximadamente 120 mM hasta aproximadamente 140 mM. En otra realización, la composición farmacéutica comprende un tampón que comprende acetato de sodio a una concentración de aproximadamente 25 mM y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM. Un ejemplo no limitativo de un agente estabilizante adecuado es polisorbato 20 (Tween 20). El agente estabilizante está presente en una cantidad suficiente para mantener la estabilidad química y física de la composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender desde aproximadamente el 0,001% hasta aproximadamente el 0,1% (p/v) de agente estabilizante; o desde aproximadamente el 0,0015% hasta aproximadamente el 0,015% (p/v) de agente estabilizante; o aproximadamente el 0,01% (p/v) de agente estabilizante.

En una realización, la composición farmacéutica comprende el anticuerpo anti-CD40 en una cantidad de desde aproximadamente 120 mg/ml hasta aproximadamente 180 mg/ml; un tampón que comprende acetato de sodio a una concentración de desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 30 mM y cloruro de sodio a una concentración de desde aproximadamente 120 mM hasta aproximadamente 140 mM; y un tensioactivo que es polisorbato 20 a una concentración de desde aproximadamente el 0,0015 hasta aproximadamente el 0,015% (p/v). En otra realización, la formulación de anticuerpo anti-CD40 comprende el anticuerpo anti-CD40 en una cantidad de aproximadamente 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml o 200 mg/ml; un tampón que comprende acetato de sodio a una concentración de aproximadamente 25 mM y cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 130 mM; y un tensioactivo que es polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente el 0,01% (p/v).

En otra realización, cada una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente puede comprender desde aproximadamente 70 mg hasta aproximadamente 250 mg del anticuerpo anti-CD40; o desde aproximadamente 80 hasta 240 mg del anticuerpo anti-CD40. En otra realización, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente comprenden 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg, 230 mg, 240 mg o 250 mg del anticuerpo anti-CD40.

Cada una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente tiene un pH de desde aproximadamente 4,0 hasta aproximadamente 12,0; o desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 6,0; o de aproximadamente 5,5. El pH puede ajustarse mediante adición de una cantidad suficiente de un agente de ajuste del pH adecuado tal como un ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico) o una base (por ejemplo, hidróxido de sodio).

En otra realización, la invención se refiere a un método de usar uno cualquiera de las composiciones farmacéuticas de anticuerpo anti-CD40 descritas en el presente documento para el tratamiento o la prevención de nefritis lúpica. La cantidad del agente de unión a CD40 (por ejemplo, anticuerpo anti-CD40) que es eficaz en el tratamiento o la prevención de nefritis lúpica puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayosin vitropara ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que va a emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración y el estadio de la nefritis lúpica, y debe decidirse según el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. Pueden extrapolarse dosis eficaces a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas a partir de sistemas de pruebain vitroo de modelo animal.

Por ejemplo, la toxicidad y la eficacia terapéutica del agente o anticuerpo anti-CD40 pueden determinarse en cultivos celulares o animales experimentales mediante procedimientos farmacéuticos convencionales para determinar la DE<50>(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). Se prefiere un agente de unión a CD40 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40) que muestra un gran índice terapéutico. Cuando un agente de unión a c D40 muestra efectos secundarios tóxicos, puede usarse un sistema de administración que dirige el agente de unión a CD40 al sitio de tejido afectado para minimizar el posible daño a células que no expresan CD40 y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación del agente de unión a CD40 se encuentra normalmente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la DE<50>con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración usada. Para cualquier agente de unión a CD40 usado en el método, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos de animales para alcanzar un intervalo de concentración en plasma en circulación que incluye la CI<50>(es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, ELISA y similares.

Generalmente, la dosificación de un anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40 administrado a un paciente con nefritis lúpica es normalmente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosificación administrada a un sujeto es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto.

Las dosis a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, desde 1 ng/kg hasta 100 mg/kg. En algunas realizaciones, una dosis es de aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg o aproximadamente 16 mg/kg. La dosis puede administrarse, por ejemplo, diariamente, una vez por (semanalmente), dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, cada dos semanas o mensualmente, cada dos meses o cada tres meses. En realizaciones específicas, la dosis es de aproximadamente 0,5 mg/kg/semana, aproximadamente 1 mg/kg/semana, aproximadamente 2 mg/kg/semana, aproximadamente 3 mg/kg/semana, aproximadamente 4 mg/kg/semana, aproximadamente 5 mg/kg/semana, aproximadamente 6 mg/kg/semana, aproximadamente 7 mg/kg/semana, aproximadamente 8 mg/kg/semana, aproximadamente 9 mg/kg/semana, aproximadamente 10 mg/kg/semana, aproximadamente 11 mg/kg/semana, aproximadamente 12 mg/kg/semana, aproximadamente 13 mg/kg/semana, aproximadamente 14 mg/kg/semana, aproximadamente 15 mg/kg/semana o aproximadamente 16 mg/kg/semana. En algunas realizaciones, la dosis oscila desde aproximadamente 1 mg/kg/semana hasta aproximadamente 15 mg/kg/semana.

En otra realización, la dosis es de desde aproximadamente 70 mg hasta aproximadamente 250 mg por semana; o desde aproximadamente 80 hasta 240 mg por semana. En otra realización, la dosis es de aproximadamente 80 mg por semana, 120 mg por semana, 130 mg por semana, 140 mg por semana, 160 mg por semana, 170 mg por semana, 180 mg por semana, 200 mg por semana, 210 mg por semana, 220 mg por semana, mg por semana, 240 mg por semana o 250 mg por semana.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a CD40 pueden comprender además un agente terapéutico, o bien conjugado o bien no conjugado al agente de unión. El anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40 puede administrarse conjuntamente en combinación con uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento o la prevención de nefritis lúpica.

Tal administración de terapia de combinación puede tener un efecto aditivo o sinérgico sobre parámetros de la enfermedad (por ejemplo, intensidad de un síntoma, el número de síntomas o la frecuencia de recidiva).

Con respecto a los regímenes terapéuticos para la administración combinatoria, en una realización específica, un anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40 se administra simultáneamente con un agente terapéutico. En otra realización específica, el agente terapéutico se administra antes o posteriormente a la administración del anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40, en al menos una hora y hasta varios meses, por ejemplo al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes o tres meses, antes o posteriormente a la administración del anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, micofenolato (MMF), ciclofosfamida (CyP), azatioprina, hidroxicloroquina, mizoribina, micofenolato de mofetilo o metotrexato. Alternativamente, el agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide (por ejemplo, cortisol o aldosterona) o un análogo de glucocorticoide (por ejemplo, prednisona o dexametasona). En otra realización, el agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril, quinapril o enalapril) o un bloqueador de receptor de angiotensina II (ARB) (por ejemplo, losartán o candesartán).

En otra realización, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en micofenolato (MMF), ciclofosfamida (CyP), un glucocorticoide (GC) y corticosteroides, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el agente terapéutico adicional es micofenolato (MMF).

En otra realización, el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida (CyP).

En otra realización, el agente terapéutico adicional es un glucocorticoide (GC).

En otra realización, el agente terapéutico adicional es un corticosteroide.

Artículos de fabricación

En otro aspecto, se incluye un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar el estado y puede tener un orificio de acceso estéril. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica. El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-CD40 humanizado. La etiqueta sobre o asociada con el recipiente indica que la composición se usa para tratar el estado de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: producción de anticuerpo anti-CD40 humanizado

Los anticuerpos anti-CD4 humanizados de la invención pueden prepararse según los procedimientos descritos en el documento US20110243932. El anticuerpo A, el anticuerpo B y el anticuerpo C eran anticuerpos humanizados derivados a partir de anticuerpo de ratón 20E2 (anticuerpo A y anticuerpo B) o 2H11 (anticuerpo C) clonados en una estructura principal de IgG1-KO (KO=desactivado)/kappa humana. IgG1-KO tiene dos mutaciones en la región de Fc, Leu234Ala y Leu235Ala para reducir la unión de FcyR y complemento.

Los resultados de tal humanización dieron como resultado diversas secuencias variables de cadena pesada y ligera humanizadas mostradas a continuación:

SEQ ID NO: 41 (secuencia de cadena ligera variable):

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 42 (secuencia de cadena pesada variable):

EVQLVKSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 43 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 44 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS SEQ ID NO: 45 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK SEQ ID NO: 46 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO: 47 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 48 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 49 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK SEQ ID NO: 50 (secuencia de cadena ligera variable) EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 51 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK.

SEQ ID NO: 52 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 53 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 54 (secuencia de cadena ligera variable) QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 55 (secuencia de cadena ligera variable) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 56 (secuencia de cadena ligera variable) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 57 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO: 58 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 59 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKVTMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO: 60 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 61 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 62 (secuencia pesada variable):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 63 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKVTMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 64 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 65 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 66 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 67 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 68 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 69 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGKVTMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 70 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 71 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 72 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWIGRIDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 73 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 74 (secuencia ligera variable) 1 del anticuerpo 10F2Hum:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 75 (secuencia ligera variable) 2 del anticuerpo 10F2Hum:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 76 (secuencia ligera variable) QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

Los anticuerpos humanizados a modo de ejemplo son aquellos que tienen las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas en la siguiente tabla. Las secuencias subrayadas y en negrita en la siguiente tabla son los dominios variables, mientras que las secuencias normales no subrayadas son los dominios constantes:

Se subclonaron las regiones variables en uno o dos vectores de expresión de IgG adecuados diferentes:

A) un formato de IgG1-KO (desactivado)/kappa humana con una doble mutación Leu234Ala, Leu235Ala en la región de Fc para reducir la función efectora tal como unión de FcyR y complemento

B) un formato de IgG4-DM (doble mutante)/kappa humana con una mutación Ser228Pro en la región bisagra para reducir la aparición de medias moléculas de IgG4 y una mutación Leu235Glu para reducir adicionalmente la unión de FcyR

Se purificaron el anticuerpo A y el anticuerpo B y se evaluaron mediante los siguientes criterios:

- Aparición de CCF (turbidez)

- Propiedades de filtración de CCF

- Rendimiento de rProteínaA

- Turbidez tras la elución y neutralización

- Agregados solubles (SEC)

- Pureza / patrón de contaminación (SDS)

- Patrón de carga (IEF)

Ejemplo 2:

SLE es una enfermedad autoinmunitaria sistémica caracterizada por pérdida de tolerancia de células B frente a diversos auto-antígenos, particularmente ácidos nucleicos y sus proteínas de unión. Estos auto-anticuerpos forman inmunocomplejos que se depositan en diversos tejidos a lo largo del organismo y en parte con otros factores, impulsan el reclutamiento de células inflamatorias y mediadores en el riñón lo que da como resultado nefritis lúpica. La generación de los auto-anticuerpos depende de interacciones de células T-células B dentro del ganglio linfático y requiere CD40-CD40L para impulsar la proliferación de células B y la formación de centros germinales. Dentro del centro germinal, las interacciones de CD40-CD40L median en la maduración de células B mediante intercambio de isotipo de Ig, mutación somática, expansión clonal de células B de alta afinidad y diferenciación terminal para dar células plasmáticas (Tarlington, 1998). La expresión aberrante de CD40L en células T y plaquetas en pacientes con lupus (Koshyet al.,1996 y Maneaet al.,2009) también puede servir como mecanismo para impulsar células B autorreactivas. Finalmente, el aumento de la expresión de CD40L en células B de SLE da como resultado la producción espontánea de auto-anticuerpos de una manera independiente de células T (Grammeret al.,2003). Véase también el documento US20110243932.

Evidencias adicionales implican que la ruta de CD40 en la nefritis lúpica es mediante un aumento de niveles y expresión de CD40 y CD40L en pacientes enfermos. Junto con un aumento de CD40L unido a membrana, CD40L soluble aumenta en la circulación de pacientes con SLE (Gouleset al.,2006) y este aumento se correlaciona con actividad de la enfermedad. El aumento de la expresión de CD40 en monocitos también se correlaciona con actividad de la enfermedad en nefritis lúpica (Kuroiwaet al.,2003). Además de la función de la ruta de CD40 en la generación de auto-anticuerpos y la inflamación en el riñón, los datos implican una función para esta ruta en la modulación de células no inmunitarias que impulsan la inflamación en nefritis lúpica. Por ejemplo, la activación de células endoteliales mediante interacción de CD40-CD154 desencadena la producción de quimiocinas y citocinas proinflamatorias, expresión de metaloproteinasa de la matriz y factor tisular y aumento de la densidad de moléculas de adhesión a leucocitos CD62E, CD106 y CD54 (Pulivenetet al,2008). Estos acontecimientos desempeñan una función importante en la promoción de extravasación y acumulación de células T activadas en los sitios de inflamación. Las células mesangiales de riñón humanas expresan bajos niveles de CD40 y regulan por incremento este receptor en respuesta al tratamiento con IFN-y y plaquetas CD154+ activadas de pacientes con SLE (Delamsetal.,2005). Asimismo, en células epiteliales de túbulo proximal (PTEC), se observa la inducción mediada por CD40L de citocinas tales como IL-6, IL-8.

Los efectos de la ligación de CD40 sobre células endoteliales humanas (HUVEC) y células epiteliales de túbulo proximal (PTEC) humanas pueden evaluarse estimulando las células con CD40L. Se adquirieron HUVEC de Lonza Allendale, NJ HUVEC P901 (cat. C2519A, lote 0000220212). Se cultivaron células en medio de HUVEC (medio EBM-2 de Lonza con suplementos Singlebullet) y reactivos de subcultivo: (Lonza Allendale, NJ, cat. CC-3156, lote 0000243756). Se hicieron crecer células en matraces T75 de colágeno I de BD Biocoat (BD Biosciences San Jose, CA, cat. 356485, lote 1108951). Se subcultivaron células usando un kit de subcultivo de Lonza según las instrucciones del fabricante.

La figura 1 muestra que CD40L soluble induce citocinas inflamatorias tales como MCP-1 en HUVEC que se bloquea eficazmente mediante el anticuerpo B a modo de ejemplo (•) o control de isotipo (anticuerpo humano de IgG1) (A) de una manera dependiente de la dosis.

La figura 2 muestra la respuesta frente a sCD40L en PTEC de los tres donantes humanos diferentes. Se adquirieron PTEC de Lonza, n.° de cat. CC-2553, e incluyeron tres donantes diferentes (D1, D2, D3). Se hicieron crecer células en un medio de crecimiento de células renales (REGM) que contenía 50 ng/ml de sCD40L (mega-CD40L humano recombinante, Alexis Biochemical-Enzo Life Science Farmingdale, NY, cat. 522-110-C010, lote 26945, 10 ug/ml). El kit REGM SingleQuot (Lonza, n.° de cat. CC-4127, n.° de lote 0000193027) proporcionó un medio que comprendía suero bovino fetal (FBS) al 0,5%, hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF), epinefrina, insulina, triyodotironina, transferrina, gentamicina/anfotericina B. Los resultados en la figura 2 muestran que las PTEC de los tres donantes humanos diferentes producen IL-6 en respuesta a la estimulación con sCD40L y esta respuesta puede inhibirse de manera dependiente de la dosis mediante anticuerpo B (concentraciones de anticuerpo A de desde 0 ng/ml hasta 2000 ng/ml).

El solicitante cree que los resultados y otras divulgaciones descritas en el presente documento establecen un fuerte fundamento para que la ruta de CD40 desempeñe una función central en la patogénesis de nefritis lúpica.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Anticuerpo humanizado que se une específicamente a CD40 humano para su uso en el tratamiento o la prevención de nefritis lúpica, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 y una región variable de cadena ligera de SeQ ID NO: 52.
2. Anticuerpo monoclonal humanizado para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de IgG1.
3. Anticuerpo monoclonal humanizado para su uso según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo tiene una mutación Leu234Ala y Leu235Ala en la región de Fc y comprende una cadena ligera kappa.
4. Anticuerpo monoclonal humanizado para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 31.
5. Anticuerpo humanizado para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo va a administrarse mediante una vía parenteral, vía intravenosa o vía subcutánea de administración.