ES2969960T3 - Método para conjugar un polipéptido - Google Patents

Método para conjugar un polipéptido Download PDF

Info

Publication number
ES2969960T3
ES2969960T3 ES15782151T ES15782151T ES2969960T3 ES 2969960 T3 ES2969960 T3 ES 2969960T3 ES 15782151 T ES15782151 T ES 15782151T ES 15782151 T ES15782151 T ES 15782151T ES 2969960 T3 ES2969960 T3 ES 2969960T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
formula
group
maleimide
mab
alkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15782151T
Other languages
English (en)
Inventor
Ronald James Christie
Changshou Gao
Nazzareno Dimasi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune LLC
Original Assignee
MedImmune LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune LLC filed Critical MedImmune LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2969960T3 publication Critical patent/ES2969960T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

La presente divulgación se refiere a un método para conjugar un compuesto de fórmula (I) O 5 R1-Q-(ZL-COn-XN O (I) con un polipéptido que comprende al menos un grupo tiol y moléculas obtenidas de dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para conjugar un polipéptido
La presente divulgación se relaciona con un método para conjugar un anticuerpo como se define en las reivindicaciones anexas.
ANTECEDENTES
Las técnicas de conjugación son muy importantes en el contexto de los productos farmacéuticos; por ejemplo, varios fármacos/productos biológicos comercializados se conjugan con una molécula de polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés). El PEG tiene una de varias funciones, ya que se cree que reduce la inmunogenicidad de algunas moléculas y/o aumenta la vida media de las moléculas. Algunos ejemplos de terapias comercializadas incluyen: peginesatida, pegloticasa, certolizumab pegol (Cimzia), metoxipolietilenglicol-epoetina beta (Mircera), pegaptanib (Macugen), pegfilgrastim (Neulasta), pegvisomant (Somavert), peginterferón alfa-2a (Pegasys), Clorhidrato de doxorrubicina liposomal (Doxil/Caelyx), peginterferón alfa-2b (PegIntron), pegaspargasa (Oncaspar) y pegademasa bovina (Adagen).
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) también constituyen una importante categoría de moléculas terapéuticas. Son muy potentes y similares a un "misil dirigido", en el sentido de que un componente de anticuerpo se conjuga con una carga útil, por ejemplo, una citotoxina, que es guiada hasta el objetivo contemplado por el componente de anticuerpo. Algunos ejemplos de ADC son el brentuximab vedotin y el trastuzumab emtansina. El enlazador formado en la química de conjugación es de vital importancia en los ADC.
En una publicación de Liburdy, se mostró una reacción de acoplamiento específica entre una maleimida y una lisina libremente reactiva en un anticuerpo (Liburdyet al., J. o f Immunological Methods,1979, 28, 233-242). Muchas de las tecnologías de conjugación emplean un elemento maleimida en una reacción de adición 1,4 de Michael que da un componente succinimida en la molécula conjugada. Sin embargo, como se discute en WO2013/173337 esta reacción es reversible y parece existir como un equilibrio dinámico. Es decir, la purificación no resuelve el problema de proporcionar una única entidad pura.
Hay algunas publicaciones que sugieren que esto ocurre en el plasma y parte de la molécula conjugada se puede sustituir por albúmina sérica, Alleyet al., Bioconjugate Chem.,2008, 19, 759-765. Esto es un problema, sobre todo en el contexto de los ADC.
Una respuesta es hidrolizar la succinimida resultante. Sin embargo, esto requiere condiciones relativamente duras, por ejemplo, 50 mM de amortiguador de boratos a pH 9,2 y 45 °C por aproximadamente 12 horas. Esto puede causar la agregación/degradación de anticuerpos y también la degradación de la carga útil o la ojiva.
Una solución a este problema se describe en WO2013/173337 (Seattle Genetics Inc), que emplea un derivado de maleimida con un sustituyente amino en la posición beta del nitrógeno del anillo de maleimida. La succinimida resultante se puede hidrolizar en condiciones más suaves. Sin embargo, parece haber una hidrólisis significativa de maleimida antes del paso de conjugación del tiol. Además, el paso de conjugación se realiza a un pH básico de aproximadamente 8. Estas últimas condiciones pueden promover la agregación de materiales proteínicos, tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, provocando así la pérdida de este valioso material en el paso de conjugación. Asimismo, la proporción entre la carga útil y el anticuerpo generalmente se tiene que aumentar para garantizar la conjugación de todo el anticuerpo. Los mecanismos de desconjugación catalizados por aminas se analizan en el artículo de Md. Rowshon Alamet al. (Bioconjugate Chem,2011,22, 1673-1681), lo que demuestra que la estrategia de Seattle Genetics no es de aplicación universal (ver el esquema 2 en el mismo).
En WO2013/121175 se ofrece una solución alternativa que describe el uso de derivados bromados de maleimida en una reacción denominada SN2. Sin embargo, en condiciones de pH bajo se reforma una especie reactiva que es el anhídrido maleico, ver por ejemplo, la página 54:
"Posteriormente, se modificó el pH por ultrafiltración......a pH 4. 5. El conjugado de anticuerpos se incubó a 37 °C y se analizaron alícuotas a las 2, 6, 24, 48 y 72 horas por LCMS. La doxorrubicina se liberó al desensamblarse el enlazador y se formó el anhídrido Trastuzumab-Fab-maleico".
Los presentes inventores creen que esta inestabilidad en los conjugados, es decir, la capacidad de formar el anillo maleico, es una desventaja porque hay una serie de ambientes de pH bajo en el cuerpo y esto limita la utilidad de las moléculas de WO2013/1211175 porque la carga útil se puede desconectar.
La presente divulgación proporciona métodos que emplean condiciones suaves que proporcionan moléculas que son estables después de la preparación y, por lo tanto, adecuadas para la administraciónin vivoy, en particular, que son adecuadas para su uso en terapia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA DIVULGACIÓN
De este modo, se proporciona un método para preparar un anticuerpo conjugado a una carga útil que comprende el paso de:
a) realizar una reacción de adición de Michael con la entidad de maleimida de la molécula de fórmula (I):
y una molécula de anticuerpo que comprende al menos un grupo tiol
en donde en la fórmula (I):
n
es 0 o 1;
m
es 0 o 1;
p
es 0 o 1;
q
es 0 o un número entero en el rango de 1 a 12, por ejemplo, de 1 a 6, tal como 2 o 3;
Q
es una unión o un residuo de un componente de conjugación;
X
es alquileno de C<0-18>, arilo de C6-36, en donde el arilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>, -(OCH<2>CH<2>V O R<3>;
Y
es C(O);
Z
es una cadena de alquenilo de C<1-30>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos (tales como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más (tales como 1,2, 3 o 4) sustituyentes oxo;
R1
es H, una superficie sólida o una molécula de carga útil;
R3
es H o alquilo de C<1>-<6>;
R4
es H o alquilo de C<1>-<6>;
R5
es H o alquilo de C<1>-<6>; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos,
b) en donde R1 es una molécula de carga útil o una superficie sólida, el método incluye un paso adicional de hidrólisis de la entidad de tiosuccinimida resultante formada por la reacción del compuesto de fórmula (I) y el anticuerpo, o
c) en donde R1 es H, el método comprende el paso adicional de realizar una conjugación con una carga útil o superficie sólida seguida de la hidrólisis de la entidad de tiosuccinimida formada por la reacción del compuesto de fórmula (I) y el anticuerpo.
Ventajosamente, los conjugados de la presente divulgación se pueden preparar a pH ácidos, tal como aproximadamente pH 5, y la hidrólisis de tiosuccinimida se puede realizar en condiciones suaves. En ciertas realizaciones, la tiosuccinimida de los conjugados se puede hidrolizar rápidamente en condiciones suaves. Asimismo, una vez preparadas, las moléculas de la presente divulgación son estables en uso, por ejemplo, son estables en suero.
Sin querer limitarse a la teoría, la hipótesis es que las capacidades de resonancia de un sistema no saturado, tales como arilo, fenilo, vinilo, alquino o una combinación de los mismos, son importantes porque facilitan la hidrólisis suave. El diagrama esquemático de la Figura 1 muestra cómo un sistema insaturado unido al nitrógeno del anillo de succinimida puede facilitar el ataque nucleofílico del agua a cualquiera de los carbonilos del anillo.
En una realización, el arilo lleva 1, 2, 3 o 4 sustituyentes fluorados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.
Representación esquemática de la hidrólisis de los compuestos de la divulgación.
Figura 1A.
Espectros de mAb (por sus siglas en inglés) sin reaccionar.
Figura 1B.
Espectros del conjugado alquilmaleimida-PEG-biotina (por sus siglas en inglés).
Figura 2A.
Espectro de alquilmaleimida-PEG-biotina (comparativo).
Figura 2B.
Espectro de fenilmaleimida-PEG-biotina.
Figura 2C.
Espectro de fluorofenilmaleimida-PEG-biotina.
Figura 3.
Eficiencia de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C a 22 °C.
Figura 4.
Eficiencia de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C a 22 °C.
Figura 5.
Cinética de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C, pH 5,5, a 22 °C.
Figura 6.
Cinética de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C, pH 7,4, a 22 °C.
Figura 7.
Cinética de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C, pH 8,6, a 22 °C.
Figura 8.
Cinética de reacción de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C después de la preincubación: Medición indirecta de la hidrólisis de maleimida.
Figura 9.
Cinética de hidrólisis de maleimida pH 5,5, 22 °C.
Figura 10.
Cinética de hidrólisis de maleimida pH 7,4, 22 °C.
Figura 11.
Cinética de hidrólisis de maleimida pH 8,6, 22 °C.
Figura 12.
Hidrólisis de tiosuccinimida pH 7,4, 22 °C, para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina.
Figura 13.
Hidrólisis de tiosuccinimida pH 7,4, 37 °C, para mAb T289C y PEG-biotina.
Figura 14.
Hidrólisis de tiosuccinimida pH 8,6, 22 °C, para mAb T289C y PEG-biotina.
Figura 15.
Hidrólisis de x-tiosuccinimida para conjugados PEG-biotina y mAb T289C después de 1 hora de incubación, n = 3.
Figura 16.
Hidrólisis x-tiosuccinimida-PEG-biotina para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina en la presencia de molibdato de sodio.
Figura 17.
Sensibilidad de los conjugados con mAb T289C al intercambio de tioles en un amortiguador que contiene tioles.
Figura 18.
Estabilidad de los conjugados con mAb T289C y PEG-biotina en amortiguador con BME (por sus siglas en inglés).
Figura 19.
Hidrólisis de tiosuccinimida a pH 7,2, 37 °C para conjugados con mAb T289C de PEG-biotina observados en el ensayo de reto con BME.
Figura 20.
Relación entre la desconjugación de la tiosuccinimida y la hidrólisis observada en el ensayo de reto con BME.
Figura 21.
Sensibilidad de los conjugados con mAb T289C al intercambio de tioles en amortiguador después de una hidrólisis leve.
Figura 22.
Análisis de los ADC mc-PAB-MMAE y mAb T289C.
Figura 23.
Estabilidad de los conjugados con mAb T289C y MMAE en amortiguador que contiene tiol (BME).
Figura 24.
Hidrólisis de MMAE-tiosuccinimidas en conjugados con mAb T289C.
Figura 25.
Estabilidad de los conjugados con mAb T289C y MMAE en amortiguador que contiene tiol (BME).
Figura 26.
Comparación de la hidrólisis de PEG-biotina y tiosuccinimida MMAE observada en el reto con BME.
Figura 27.
Comparación de la desconjugación en presencia de p-mercaptoetanol: PEG-biotina contra carga útil de MMAE.
Figura 28.
Estabilidad de los ADC MMAE con T289C en suero de ratón.
Figura 29.
Estabilidad de los ADC MMAE con T289C en suero de ratón.
Figura 30.
Actividad de los ADC contra células cancerosas MDA-MB-361 después de la incubación en suero de ratón.Figura 31.
Formato alternativo para la estabilización de ADC enlazados a tioles.
Figura 32.
Análisis por espectrometría de masas del conjugado N-fenilmaleimida-PEG-BCN con mAb (por sus siglas en inglés).
Figura 33.
Análisis por espectrometría de masas del conjugado W-fluorofenilmaleimida-PEG-BCN con mAb.
Figura 34.
Análisis por espectrometría de masas del conjugado W-alquilmaleimida-PEG-BCN con mAb.
Figura 35.
Eficiencia de conjugación de x-maleimida-PEG-BCN con mAb T289C.
Figura 36.
Cinética de hidrólisis de tiosuccinimida para conjugados x-maleimida-PEG-BCN.
Figura 37.
Análisis de conjugados mAb-BCN-AC4GlcNAz.
Figura 38.
Reactividad del conjugado mAb-BCN después del almacenamiento.
Figura 39.
Análisis de conjugados con mAb-PBD.
Figura 40.
Actividadin vitrode ADC con mAb-BCN-PBD contra células de cáncer de mama MDA-MB-361.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN
En una realización, n es 0. En una realización, n es 1. En una realización, m es 0. En una realización, m es 1.
En una realización, X es alquileno de C<0-18>, arilo de C<6-10>
en donde el arilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>, y -(OCH<2>CH<2>)q-OR3.
En una realización, X es alquileno de C<0-15>, arilo de C<6-10>
en donde el arilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>, -(CH<2>-O-CH<2>)q-O-R3.
En una realización, X es alquileno de C<0-15>, arileno de C<6-10>, en donde el arileno tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>, y -(OCH<2>CH<2>)q-OR3.
En una realización, X es alquileno de C<0-15>, arilo de C<6-10>, por ejemplo, alquileno de C<0-6>, arilo de C<6-10>, tal como arilo de C<6-10>, en particular fenilo.
Z es una cadena de alquenilo de C<1-25>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos (tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más (tales como 1,2, 3 o 4) sustituyentes oxo.
Generalmente el arilo, tal como el fenilo, se enlazará por una unión covalente directamente al nitrógeno del anillo de maleimida.
En una realización, el arilo, como el fenilo, lleva el sustituyente que contiene "R1-Q-(Z)m" en la posiciónorto, metaopara,por ejemplo,metaopara,tal como la posiciónpara.
En una realización, el arilo, tal como el fenilo, se puede sustituir con uno, dos, tres o cuatro sustituyentes que se seleccionan independientemente entre sustituyentes donadores de electrones, aceptores de electrones y neutros. En una realización, el arilo, tal como el fenilo, está sustituido por uno, dos, tres o cuatro grupos que retiran electrones. En una realización, el arilo, tal como el fenilo, está sustituido por uno, dos, tres o cuatro grupos donadores de electrones. En una realización, el arilo, tal como el fenilo, está sustituido por uno, dos, tres o cuatro grupos con propiedades electrónicas neutras.
En una realización, el arilo, como el fenilo, está sustituido con uno, dos, tres o cuatro sustituyentes, por ejemplo, seleccionados independientemente de halógeno, alquilo de C<1-3>, trifluorometilo, tales como cloro o fluoro, en particular uno, dos, tres o cuatro átomos de fluoro. Las moléculas que contienen uno o más átomos de fluoro pueden ser útiles en técnicas de obtención de imágenes, tal como la tomografía por emisión de positrones.
En una realización, el arilo, tal como el fenilo, lleva un sustituyente en la posiciónorto, metaopara,por ejemplo, en la posiciónmetaoparadel anillo conectado a la maleimida.
En una realización, el arilo, tal como el fenilo, lleva dos sustituyentes, por ejemplo, en la posiciónmeta, para; meta, orto;
orto para; meta, meta;uorto, ortodel anillo conectado a la maleimida.
En una realización, el arilo, tal como el fenilo, lleva tres sustituyentes, por ejemplo, en las posicionesorto, metaypara;
orto, meta, meta; orto, orto, para;ometa, meta, paradel anillo conectado a la maleimida.
En una realización, el arilo, tal como el fenilo, no tiene sustituyentes.
La conjugación con una superficie sólida es un aspecto importante de la presente divulgación porque permite unir los polipéptidos a perlas o placas, por ejemplo, de material sintético, tales como plástico o resina, para facilitar la purificación
o la examinación, tal como la examinación de alto rendimiento.
En una realización, R1 es una molécula de carga útil, cuyos ejemplos se dan a continuación en la sección de definiciones.
En una realización, R1 es H. En una realización, R1 es una superficie sólida.
En una realización, el método de acuerdo con la presente divulgación, en donde n es 1, emplea un compuesto de fórmula
(II):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z, X y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
En una realización, el método de acuerdo con la presente divulgación, en donde n es 0, emplea un compuesto de fórmula
(III):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z, X y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
En una realización, la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula (IIa):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I), y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, (OCH2CH2)q-OR3.
En una realización, el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónparacomo se muestra en el compuesto de fórmula (IIaa):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH<2>CH<2>)q-OR3.
En una realización, el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónmetacomo se muestra en el compuesto de fórmula (Ilaa’):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH<2>CH<2>V O R<3>.
En una realización, la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula (llaaa):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I), el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -<c>N, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH<2>CH<2>V O R<3>, y Z’ es una cadena de alquileno de C<1-24>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más sustituyentes oxo. En una realización, el grupo R1Q(Z’)mNC(O)- está en posiciónpara.En una realización, el grupo R1Q(Z’)mNC(O)- está en la posiciónmeta.
En una realización, la entidad de maleimida se encuentra en una molécula de fórmula (llb):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH2CH2)q-OR3.
En una realización, el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónparacomo se muestra en el compuesto de fórmula (llbb):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde Q, Z, X, R1 y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
En una realización, el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónmetacomo se muestra en el compuesto de fórmula(Ilbb’):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde Q, Z, X, R1 y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
En una realización, la entidad de maleimida se encuentra en una molécula de fórmula(Ilbbb):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH2CH2)q-OR3,
Z’ es una cadena de alquenilo de C<1-24>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más sustituyentes oxo. En una realización, el grupo R1Q(Z’)mNC(O)- está en la posiciónparadel anillo fenilo. En una realización, el grupo R1Q(Z’)mNC(O)- está en la posiciónmetadel anillo fenilo.
En una realización, la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula(Illa):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I), y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH2CH2)q-OR3.
En una realización, el grupo R1Q(Z)m- está en la posiciónparacomo se muestra en el compuesto de fórmula(lllaa):
o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -<n>R4R5, (OCH2CH2)q-OR3.
En una realización, el grupo R1Q(Z)m- está en la posiciónmetacomo se muestra en el compuesto de fórmula(lllaa’):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -<n>R4R5, (OCH2CH2)q-OR3.
En una realización, la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula(Illaaa):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q y m se definen anteriormente para compuestos de
fórmula (I), el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH<2>CH<2>)q-OR3, y
Z’ es una cadena de alquenilo de C<1-24>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más sustituyentes oxo. En una realización, el R1Q(Z’)mNH- está en la posiciónparadel anillo fenilo. En una realización, el R1Q(Z’)mNH- está en la posiciónmetadel anillo fenilo.
En una realización, el fragmento -QZ (es decir, en donde m es 1) o -QZ’NH (en donde m es 1), como sea apropiado dentro
de la estructura dada, representa:
-QOC(O)(CH<2>CH<2>O)<1-8>(CH<2>)<o-1>NH, por ejemplo, -QOC(O)(CH<2>CH<2>O)<1-6>(CH<2>)<o-1>NH, tal como -QOC(O)(CH<2>CH<2>O)<2>,<3>,<4,5>(CH<2>)o<-1>NH, más específicamente -QOC(O)(CH<2>CH<2>O)<4>NH.
En una realización, Q es una unión. En una realización, Q es un componente de conjugación. Un componente de conjugación es una entidad que se puede emplear para conjugar una molécula o fragmento con otra molécula o fragmento.
En una realización, Q comprende o es un grupo funcional por ejemplo, seleccionado del grupo que comprende, tetrazina, tetrazina funcionalizada, éster NHS (éster de N-hidroxisuccimida, por sus siglas en inglés), éster de tetrafluorofenilo, y combinaciones de los mismos.
En una realización, Q es un grupo de función polimerizable, por ejemplo, seleccionado del grupo que comprende un alquino, tetrazina, tetrazina derivatizada, lípido, nanopartícula, dendrímero, quelante metálico, y combinaciones de los mismos.
En una realización, el componente de conjugación Q es un componente de química de clic. Entre los ejemplos de componentes de química de clic se incluyen residuos de la colección Click-mates™, tales como:
• Click-mates™ de alquiloque incluyen 5-propargiloxi-dU CEP, 5-octadiin il-dU CEP, a lqu in il-m od ificador-C6-dT CEP, 5 -(proparg iloxi)-2 /-desoxiuridina, 5-(1,7-octad iin -1-il)-2 /-desoxiuridina, 5-octadiinil-TM S-dU CEP, 5-octadiinil-TMS-dC CEP, 5-octadiinil-dC CEP, 5-octadiinil-TIPS-dU CEP (por sus siglas en
inglés, respectivam ente); y
• Click-easy® de alquinos (para modificaciones Click sin cobre)que incluyen BCN CEP I, BCN CEP II,
éster de BCN-N-hidroxisuccinim ida I, éster de BCN-N-hidroxisuccinim ida II, éster de MFCO-N-hidroxisuccin im ida y MFCO CEP (por sus siglas en inglés);
Los residuos, como se emplean en la presente, se refieren a la estructura que queda después de que haya tenido lugar la reacción pertinente para unir la molécula a uno o más fragmentos moleculares (componentes).
En una realización, el componente de conjugación es BCN.
En una realización, el componente de conjugación Q es biotina. En una realización, Q es el fragmento:
En una realización, Z se selecciona independientemente de alquileno de C<1-12>, -OC(O)(CH<2>CH<2>O)i<-8>(CH<2>)o-iNH, por ejemplo, -OC(O)(CH<2>CH<2>O)<1-6>(CH<2>)<0-1>NH, tal como -OC(O)(CH2CH2O)2,3,4,5(CH2)0-1NH, más específicamente -OC(O)(CH2CH2O)4NH.
En una realización, Z’ se selecciona independientemente de alquileno de C<1-12>, -OC(O)(CH<2>CH<2>O)<1-8>(CH<2>)<0-1>, por ejemplo, -OC(O)(CH<2>CH<2>O)<1-6>(CH<2>)<0-1>, tal como -Oc(O)(CH2CH2O)2,3,4,5(CH2)o-1, más específicamente -oC(O)(CH2CH2O)4. En una realización, Y-X en moléculas de fórmula (I) es C(O)CH<2>-fenil(maleimida o succinimida), y m es 0 y Q es una unión y la carga útil se enlaza mediante una unión amida con el grupo oxo en el fragmento Y-X.
En una realización, la carga útil se enlaza mediante una unión, por ejemplo, hidrazona (liberación a pH bajo), disulfuro, imina, o similar.
Las referencias dada en la presente para compuestos de fórmula (I) se aplican igualmente a compuestos de otras fórmulas descritas en la presente, como sea apropiado.
Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos. En una realización, la entidad de maleimida se conjuga mediante una cisteína nativa del anticuerpo. En una realización, la maleimida se conjuga mediante una cisteína modificada por ingeniería en el anticuerpo (también referida en la presente cisteína modificada por ingeniería). En una realización, la cisteína es una cisteína expuesta al disolvente.
En una realización, uno o más pasos de conjugación, por ejemplo, la conjugación de la maleimida con el anticuerpo se realiza a un pH en el rango de 5 a 9, por ejemplo, pH de 5,5 a 8,6, tales como de 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5 o 8,6, o una combinación de uno o más de dichos valores de pH.
En una realización, uno o más pasos de conjugación, por ejemplo, la conjugación de la maleimida con el anticuerpo se realiza a una temperatura en el rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 37 °C, por ejemplo, de 8 a 37 °C, de 8 a 30 °C, de 8 a 25 °C, o de 21 a 31 °C, tales como de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36 o 37 °C, o una combinación de una o más de dichas temperaturas. En una realización, uno o más pasos de conjugación se llevan a cabo en un amortiguador adecuado, por ejemplo, un amortiguador seleccionado del grupo que comprende amortiguador de fosfatos, amortiguador de citratos, amortiguador de boratos, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), MES (ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico)), PIPES (ácido piperazina-W,W-bis(2-etanosulfónico)), MOPS (ácido 3-(W-morfolino)propanesulfónico)), tal como el fosfato (por sus siglas en inglés, respectivamente).
En una realización, el amortiguador no comprende una amina primaria, por ejemplo, TRIS (por sus siglas en inglés) y similares.
En una realización, la eficiencia de una o más reacciones de conjugación, por ejemplo, la conjugación de maleimida con el anticuerpo es de 50 % o mayor, por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %. De este modo, en una realización, hay un bajo porcentaje de anticuerpo no conjugado después de la reacción, por ejemplo, 5 % o menos, tal como 4, 3, 2, 1 % o menos.
En una realización, la relación de un compuesto de fórmula (I) y de otras fórmulas descritas en la presente con respecto al anticuerpo en el paso de conjugación es de 1 a 1 respectivamente a 5 a 1, tal como 2 a 1, 3 a 1, o 4 a 1.
En una realización, el conjugado con tiol se hace reaccionar además con una carga útil, nanopartícula o superficie sólida por una cicloadición azida-alqueno catalizada por Cu(I) (CuAAC) usando sales de cobre, agentes reductores, tal como ascorbato de sodio y/o ligandos estabilizadores de Cu(I), tales como 2-[4-{(bis[(1-ferc-butil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amino)metil}-1H-1,2,3-triazol-1-il]hidrogenosulfato de etilo (BTTES); tris[(1-bencil- 1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (T<b>TA); tris[(1 -hidroxipropil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (THTPA), (por sus siglas en inglés, respectivamente), y similares para formar un enlace triazol.
En una realización, el conjugado con tiol se hace reaccionar además con una carga útil, nanopartícula o superficie sólida por cicloadición azida-alquino promovida por deformación (SPAAC) usando alquinos cíclicos, tales como la barilaciclooctina (BARAC); dibenzociclooctina (DBCO), biciclo[6.1.0]nonina (BCN), (por sus siglas en inglés, respectivamente) y similares para formar un enlace triazol.
En una realización, el conjugado con tiol se hace reaccionar además con una carga útil, nanopartícula o superficie sólida por la reacción de tetrazina-transcicloocteno para formar un enlace de dihidropirazina.
En una realización, un paso de hidrólisis empleado en el método, por ejemplo, la hidrólisis de la succinimida resultante se realiza a un pH en el rango de 7 a 12, por ejemplo, pH 7,4 a 9, tal como 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 o 9,0, o una combinación de uno o más de los mismos.
En una realización, se emplea un amortiguador en el paso de hidrólisis, por ejemplo, un amortiguador seleccionado del grupo que comprende amortiguador de fosfatos, amortiguador de citratos, amortiguador de boratos, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico)), PIPES (ácido piperazina-N,N-bis(2-etanosulfónico)), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanesulfónico)), tal como el fosfato.
En una realización, uno o más pasos de hidrólisis, por ejemplo, la hidrólisis de una succinimida, se realiza a una temperatura en el rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 37 °C, por ejemplo, de 8 a 37 °C, de 8 a 30 °C, de 8 a 25 °C o de 21 a 31 °C, tales como de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36 o 37 °C, o una combinación de una o más de dichas temperaturas.
En una realización, una o más reacciones del presente método, por ejemplo, la reacción de conjugación, se llevan a cabo en presencia de un catalizador. Los ejemplos de catalizadores incluyen catalizadores de metales de transición, tales como cobre, estaño, óxidos inorgánicos, tal como molibdato.
En una realización, una o más reacciones del presente método, por ejemplo, la reacción de conjugación, no emplean un catalizador.
También se debe tener en cuenta que, en una amplio rango de condiciones, la hidrólisis ocurre de manera muy eficiente después de la conjugación, por lo que las condiciones se pueden elegir fácilmente para que la conjugación y la hidrólisis tengan lugar secuencialmente en la misma reacción. De hecho, esto es deseable, ya que minimiza el número de pasos. Alternativa o adicionalmente, las condiciones para los pasos posteriores (por ejemplo, filtración, almacenamiento, intercambio de amortiguadores, purificación en columna) se pueden seleccionar para garantizar la hidrólisis del conjugado. En una realización, la hidrólisis no emplea una combinación de pH bajo y temperatura baja.
Las moléculas hidrolizadas, preparadas a partir del método de la divulgación incluyen las moléculas de fórmula (IV):
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde:
Q, R1, Z y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I) y
R6 es H o un residuo de anticuerpo, R7 es H o un residuo de anticuerpo, en donde al menos uno de R6 o R7 es un residuo de anticuerpo y el otro es H.
La hidrólisis puede ocurrir en una de las dos posiciones indicadas en el esquema 1:
en donde P representa un anticuerpo.
En una realización, las moléculas preparadas por el método de la divulgación son estables, por ejemplo, física, química y térmicamente estables. Una prueba de inestabilidad física es, por ejemplo, la agregación, que se puede medir por técnicas rutinarias, tal como la cromatografía de exclusión por tamaño. Una prueba de inestabilidad química es, por ejemplo, la degradación o desintegración de la molécula, tal como la desconexión de la carga útil. Una prueba de inestabilidad térmica es, por ejemplo, la desnaturalización.
En una realización, en moléculas hidrolizadas preparadas por el método de la presente divulgación hay 20 % de pérdida o menos de la carga útil después de la incubación con beta-mercaptoetanol, por ejemplo, 10 % de pérdida o menos, tal como 5 % de pérdida o menos. En una realización, la pérdida ocurre por un período de 1 a 36 horas, tal como de 2 a 24 horas.
En una realización, en las moléculas hidrolizadas preparadas por el método de la presente divulgación hay una pérdida de 20 % o menos de la carga útil después de la incubación con suero (por ejemplo, suero murino o suero bovino), por ejemplo, una pérdida de 10 % o menos, tal como una pérdida de 5 % o menos. En una realización, la pérdida ocurre por un período de 1 a 36 horas, tal como 24 horas.
En una realización, la reducción de la potencia, por ejemplo, medida por la IC<50>(por sus siglas en inglés), después de la incubación de suero, es de 20 % o menos, por ejemplo, de 10 % o menos, tal como de 5 % o menos, más específicamente de 4 %, 3 %, 2 % o 1 %.
DEFINICIONES
Una adición de Michael (también referida en la presente como adición 1,4 de Michael) es una adición nucleofílica de un carbanión u otro anión a un compuesto carbonílico alfa-beta insaturado.
El término alquilo, como se usa en la presente, se refiere a un alquilo de cadena recta o ramificada, tales como, sin limitación, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo y ferc-butilo. En una realización, alquilo se refiere a un alquilo de cadena lineal. El alquilo es un grupo terminal, es decir, al final de la cadena. Los alquilos de C<1-6>incluyen C<1>, C<2>, C<3>, C<4>, C<5>y C6.
Un alcoxilo, como se usa en la presente se refiere a alcoxilo de cadena lineal o ramificada, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, butoxilo. Un alcoxilo como se emplea en la presente también se extiende a realizaciones en las cuales el átomo de oxígeno está localizado dentro de la cadena de alquilo, por ejemplo, -CH<2>CH<2>OCH<3>o -CH<2>OCH<3>. En una realización, el alcoxi se enlaza a través del oxígeno al resto de la molécula. En una realización, la divulgación se refiere a un alcoxilo de cadena lineal.
El arilo, como se emplea en la presente, se refiere a un sistema carbocíclico de C6 a C<36>, por ejemplo, un sistema carbocíclico de C6 a C<10>que comprende al menos un anillo aromático, por ejemplo, naftileno, fenilo, indeno, indano, 1,2,3,4-tetrahidronaptileno, azuleno, por ejemplo, naftileno o fenilo, tal como fenilo.
Un heteroarilo es un anillo carbocílico aromático de<5-36>miembros o un sistema de anillos bicíclicos que comprende uno o más, (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) heteroátomos seleccionados independientemente entre O, N y S. Los ejemplos de heteroarilos son: pirrol, oxazol, tiazol, isotiazol, imidazol, pirazol, isoxazol, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, benzotiofeno, benzofurano, o 1,2,3- y 1,2,4-triazol. En un sistema de anillos bicíclicos, la definición de heteroarilo se cumplirá si al menos un anillo contiene un heteroátomo y al menos un anillo es aromático. El heteroarilo se puede enlazar al resto de la molécula a través de un anillo carbocíclico o un anillo que comprenda un heteroátomo.
Un oxo, como se usa en la presente, se refiere a C=O y habitualmente se representará como C(O).
En relación con una cadena de alquenilo de C<1-25>saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, en donde al menos un carbono (por ejemplo, 1, 2 o 3 carbonos, convenientemente 1 o 2, en particular 1) está sustituido por un heteroátomo seleccionado de O, N y dicha cadena está opcionalmente, sustituida por uno o más grupos oxo, grupos, será evidente para los expertos en la técnica que el heteroátomo puede sustituir a un carbono primario, secundario o terciario, es decir, CH<3>, -CH<2>- o un -CH- o un grupo carbono ramificado, como sea técnicamente apropiado. Esta definición también se aplica cuando este lenguaje se emplea en el contexto de cadenas de longitudes distintas de 1 a 25 carbonos.
El alquileno es un grupo de enlace, es decir, unido por cada extremo a otras partes/componentes de la molécula. El alquileno de C<1-25>incluye de C<1>, C<2>, C<3>, C<4>, C<5>, C6, C<7>, C8 or C<9>, C<10>, C<11>, C<12>, C<13>, C<14>, C<15>, C<16>, C<17>, C<18>, C<19>, C<20>, C<21>, C<22>, C<23>, C<24>, y C<25>.
Co es cuando el "atributo" está ausente.
Un halo o halógeno, como se emplea en la presente, se refiere a yodo, bromo, cloro o fluoro, tal como fluoro.
Un conjugado, como se emplea en la presente, se refiere a un compuesto/molécula formado al unir dos compuestos, moléculas o fragmentos.
La hidrólisis, como se emplea en la presente, se refiere a las reacciones que escinden anillos o moléculas por la adición de una molécula de agua.
Un grupo aceptor de electrones, como se emplea en la presente, se refiere a un sustituyente que retira electrones (o atrae electrones) de la entidad a la que se une.
Un grupo donador de electrones, como se emplea en la presente, se refiere a un sustituyente que da "dona" electrones a la entidad a la que se une.
Un grupo neutro en el contexto de la presente divulgación no se refiere a la carga como tal, sino a las propiedades de donación o retirada de electrones. Estos grupos no influyen en las propiedades electrónicas de la entidad a la que se unen.
Anticuerpos para su uso en la presente divulgación
Los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina", usados indistintamente en la presente, incluyen los anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas simples de los mismos.
Un anticuerpo típico comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes disulfuro (por sus siglas en inglés, respectivamente). Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH, región VH o dominio VH, por sus siglas en inglés) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de por tres o cuatro dominios constantes, CH1, CH2, CH3 y CH4 (por sus siglas en inglés). La región Fc (por sus siglas en inglés) incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante, y fragmentos de los mismos. Por tanto, para IgG, la "región Fc" se refiere a CH2 y CH3 y opcionalmente la totalidad o una porción de la región de bisagra flexible N-terminal respecto a estos dominios. El término "región Fc" se puede referir a esta región aislada, o esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fc.
Cada cadena ligera se compone por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL, región VL o dominio VL, por sus siglas en inglés) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se compone de por un dominio, CL (por sus siglas en inglés).
Las regiones VH y VL se pueden subdividir a su vez en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FW, por sus siglas en inglés). Cada VH y VL se forma por tres CDR y cuatro FW, dispuestas desde el amino-terminal al carboxilo-terminal en el siguiente orden: Fw 1, CDR1, Fw 2, CDR2, FW3, CDR3, fW4. Las regiones marco se pueden designar de acuerdo con sus respectivas regiones VH y VL. Por tanto, por ejemplo, VH-FW1 se referiría a la primera región marco de VH. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos huésped o factores, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno de la misma que reconoce y se une específicamente a un objetivo, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno (también referido como sitio de unión) dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como Fab (por sus siglas en inglés), Fab', F(ab<')2>y fragmentos Fv, (por sus siglas en inglés)), fragmentos de anticuerpos de cadena simple (scFv (por sus siglas en inglés) y scFv estabilizados por disulfuro (dsFv, por sus siglas en inglés)), anticuerpos multiespecíficos, tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos diferentes o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (ver, por ejemplo, las publicaciones PCT WO96/27011, WO2007/024715WO2009018386, WO2009/080251, WO2013006544, WO2013/070565, and WO2013/096291), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un fragmento de unión a antígeno, siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada.
Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b, o c), Am, Em y Km(1,2 o 3)), (por sus siglas en inglés, respectivamente). Las distintas clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos se pueden obtener de cualquier mamífero, que incluyen, pero no se limitan a, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc., u otros animales, tales como aves (por ejemplo, pollos).
El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento que comprende regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Se conoce en la técnica que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo usado en la presente invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa con cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento de la misma y puede ser, pero no se limita a, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')<2>, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL o VHH, por sus siglas en inglés), scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, combinaciones de ambos, combinaciones de los mismos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores.
Otros anticuerpos contemplados específicamente son anticuerpos "oligoclonales" que son una mezcla predeterminada de anticuerpos monoclonales distintos. Ver, por ejemplo, la publicación PCT WO 95/20401; la patente de EE. UU. No.
5,789,208 y 6,335,163. Preferiblemente, los anticuerpos oligoclonales consisten en una mezcla predeterminada de anticuerpos contra uno o más epítopos que se generan en una única célula. Más preferiblemente, los anticuerpos oligoclonales comprenden una pluralidad de cadenas pesadas capaces de emparejarse con una cadena ligera común para generar anticuerpos con especificidades múltiples (por ejemplo, publicación p Ct WO 04/009618). Los anticuerpos oligoclonales son particularmente útiles cuando se desea seleccionar como objetivo múltiples epítopos en una única molécula objetivo. Los expertos en la técnica sabrán o podrán determinar qué tipo de anticuerpo o mezcla de anticuerpos es aplicable para un fin contemplado y una necesidad deseada.
Otras moléculas contempladas específicamente para su uso en la presente divulgación son pequeños dominios proteicos modificados por ingeniería, tal como los andamiajes (ver, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU.
2003/0082630 y 2003/0157561). Los andamiajes se basan en familias conocidas de dominios no anticuerpos de origen natural, específicamente dominios extracelulares de proteínas, que típicamente son de pequeño tamaño (~100 a ~300 AA) y contienen un núcleo muy estructurado asociado a dominios variables de gran tolerancia conformacional que permiten inserciones, deleciones u otras sustituciones. Estos dominios variables pueden crear una interfaz de unión putativa para cualquier proteína objetivo. En general, el diseño de un andamio proteico genérico consiste en dos pasos principales: (i) selección de una proteína central adecuada con los atributos deseados y (ii) generación de bibliotecas combinatorias complejas al mutagenizar una porción o la totalidad de los dominios que aceptan una alta variabilidad estructural, visualización de estas bibliotecas en un formato apropiado (es decir, fago, ribosoma, bacteria o levadura) y examinación de la biblioteca para el andamiaje mutagenizado con las características de unión deseadas (por ejemplo, especificidad y/o afinidad objetivo). La estructura de los andamiajes parentales puede ser muy diversa e incluir dominios proteicos altamente estructurados, que incluyen, pero no se limitan a, dominios FnIII (por sus siglas en inglés), (por ejemplo, AdNectinas, ver, por ejemplo,Protein Eng. Des. Sel.18, 435-444 (2005), US2008/00139791, y WO 2005/056764, TN3, ver, por ejemplo,<w>O2009/058379 y WO2011/130324); dominios Z de la proteína A (Aficuerpos, ver, por ejemplo,Protein Eng. Des. Sel.17,455-462 (2004) y EP1641818A1); dominio A del receptor de lDl (por sus siglas en inglés), (Avímeros, ver, por ejemplo,Nature Biotechnology23(12), 1556-1561 (2005) yExpert Opinión on Investigational Drugs16(6), 909-917 (junio 2007)); dominios de repetición de anquirina (DARPinas (por sus siglas en inglés),J. Mol. Biol.
332,489-503 (2003),PNAS(2003) yBiol.369, (2007) y WO02/20565); dominios de lectina de tipo C (Tetranectinas, ver, por ejemplo, WO02/48189). Si se desea, se pueden unir dos o más de tales dominios de andamiaje modificados por ingeniería para formar una proteína de unión multivalente. Los dominios individuales se pueden dirigir a un único tipo de proteína o a varios, dependiendo de la indicación de uso/enfermedad.
Prácticamente cualquier molécula (o una parte de la misma, por ejemplo, subunidades, dominios, motivos o un epítopo) puede ser el objetivo de una molécula y/o incorporarse a una molécula, que incluyen, pero no se limitan a, proteínas integrales de membrana, incluidos canales iónicos, bombas de iones, receptores acoplados a proteínas G, proteínas estructurales; proteínas de adhesión, tal como las integrinas; transportadores; proteínas involucradas en la tranducción de señales y proteínas ancladas a lípidos, incluidas proteínas G, enzimas, tales como cinasas, incluidas cinasas ancladas a membrana, enzimas unidas a membrana, proteasas, lipasas, fosfatasas, sintetasas de ácidos grasos, enzimas digestivas, tales como pepsina, tripsina y quimotripsina, lisozima, polimerasas; receptores, tales como receptores hormonales, receptores de linfocinas, receptores de monocinas, receptores de factores de crecimiento, receptores de citocinas; citocinas; y más.
En algunos aspectos, un anticuerpo empleado en la presente divulgación se dirige y/o incorpora todas o una porción (por ejemplo, subunidades, dominios, motivos o un epítopo) de un factor de crecimiento, una citocina, una proteína relacionada con citocinas, un factor de crecimiento, un ligando receptor o un receptor seleccionado de, por ejemplo, BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI(M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (aFGF), FGF2 (pFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, FGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFRL1, FGFR6, IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNAR1, IFNAR2, IFNB1, IFNG, IFNW1, FIL1, FIL1 (EPSILON), FIL1 (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, IL2RA, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RD, IL18R1, IL20RA, IL20RB, IL21R, IL22R, IL22RA1, IL23R, IL27RA, IL28RA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, ACVRL1, GFRA1, LTA (TNF-beta), LTB, TNF (TNF-alfa), TNFSF4 (ligando de OX40), TNFSF5 (ligando de CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando de CD27), TNFSF8 (ligando de CD30), TNFSF9 (ligando de 4-1BB), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF10A (receptor de TRAIL), TNFRSF10B (receptor de TRAIL 2), TNFRSF10C (receptor de TRAIL 3), TNFRSF10D (receptor de TRAIL 4), FIGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, KDR, FLT1, FLT4, NRP1, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (leptina), PTN, ALK, y THPO (por sus siglas en inglés, respectivamente).
En algunos aspectos, un anticuerpo empleado en la presente divulgación se dirige y/o incorpora todas o una porción (por ejemplo, subunidades, dominios, motivos o un epítopo) de una quimiocina, un receptor de quimiocina o una proteína relacionada con quimiocinas seleccionada de, por ejemplo, CCL1(I-309), CCL2 (MCP-1/MCAF), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC/exodus-2), CCL22 (MDC/STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CXCL1(GRO1), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYD1), SCYE1, XCL1 (linfotactina), XCL2 (SCM-1b), BLR1 (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-1RB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 (CMKBR8/TER1/ CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HIF1A, IL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, y VHL.
En algunos aspectos, un anticuerpo empleado en la presente divulgación se dirige y/o incorpora todas o una porción (por ejemplo, subunidades, dominios, motivos o un epítopo) de una proteína seleccionada de, por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento, incluidas la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor liberador de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; insulina de cadena A; insulina de cadena B; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VII, factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes como la Proteína C; el factor natriurético auricular; el tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, como la urocinasa o el activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA) u orina humana; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral-alfa y -beta; encefalinasa; RANTES (regulada en la activación normalmente expresada y secretada por células T); proteína inflamatoria de macrófagos humana (MIP-1-alfa); una albúmina sérica, tal como la albúmina sérica humana; sustancia inhibidora muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como betalactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), como CTLA-4; inhibina; activina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3,-4,-5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento epidérmico (EGF); proteínas de unión a factores de crecimiento similares a la insulina; proteínas CD, como CD2, CD3, CD4, CD 8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 y CD147; eritropoyetina; factores osteoinductores inmunotoxinas; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerador de la desintegración; antígenos virales, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del virus del SIDA, por ejemplo, gp120; proteínas de transporte; receptores de homing; addressinas; proteínas reguladoras; moléculas de adhesión celular como LFA-1, Mac 1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 y VCAM, integrina a4/p7, e integrina (Xv/p3 incluyendo a o subunidades de las mismas, subunidades alfa de integrinas, tales como CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, alfa7, alfa8, alfa9, alfaD, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, alfalIb, alfalELb; subunidades beta de integrinas, tales como CD29, CD 18, CD61, CD104, beta5, beta6, beta7 y beta8; combinaciones de subunidades de integrina que incluyen, pero no se limitan a, aVp3, aVp5 y a4p7; miembro de una vía de apoptosis; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; Proteína C; un receptor Eph como EphA2, EphA4, EphB2, etc., un antígeno leucocitario humano (HLA) como HLA-DR; proteínas del complemento como el receptor del complemento CR1, CIRq y otros factores del complemento como C3 y C5; un receptor de glicoproteína, tales como GpIba, GPIIb/IIIa y CD200 (por sus siglas en inglés, respectivamente).
También se contemplan las moléculas que se unen específicamente y/o comprenden antígenos cancerígenos, incluidos, pero no limitados a, receptor ALK (receptor de pleiotrofina), pleiotrofina, antígeno de pancarcinoma KS 1/4; antígeno de carcinoma ovárico (CA125); fosfato ácido prostético; antígeno prostético específico (PSA); antígeno p97 asociado a melanoma; antígeno gp75 de melanoma; antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA); antígeno de membrana específico de próstata; antígeno carcinoembrionario (CEA); antígeno polimórfico de mucina epitelial; antígeno de glóbulos grasos de leche humana; antígenos asociados a tumores colorrectales, tales como: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 y LEA; antígeno de linfoma de Burkitt-38.13; CD19; antígeno de linfoma B humano-CD20; CD33; antígenos específicos de melanoma como gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido GM2 y gangliósido GM3; antígeno de superficie celular de tipo trasplante específico de tumor (TSTA); antígenos tumorales inducidos por virus, incluidos antígeno T, virus tumorales de ADN y antígenos de envoltura de virus tumorales de ARN; antígeno oncofetalalfa-fetoproteína, tales como CEA de colon, glicoproteína de trofoblasto oncofetal 5T4 y antígeno oncofetal de tumor de vejiga; antígeno de diferenciación, tales como antígenos de carcinoma pulmonar humano L6 y L20; antígenos de fibrosarcoma; antígeno de células T de leucemia humana-Gp37; neoglicoproteína; esfingolípidos; antígenos de cáncer de mama como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico); NY-BR-16, NY-BR-16, antígeno HER2 (p185HER2) y HER3; mucina epitelial polimórfica (PEM); antígeno de linfocitos humanos malignos-APO-1; antígeno de diferenciación como el antígeno I encontrado en eritrocitos fetales; antígeno I de endodermo primario encontrado en eritrocitos adultos; embriones de preimplantación; I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos; M18, M39 encontrados en epitelio mamario; SS<e>A-1 encontrado en células mieloides; VEP8; VEP9; Myl; VIM-D5; D156-22 en cáncer colorrectal; T<r>A-1-85 (grupo sanguíneo H); SCP-1 en cáncer de testículo y ovario; C14 en adenocarcinoma de colon; F3 en adenocarcinoma de pulmón; AH6 en cáncer gástrico; hapteno Y; Ley en células de carcinoma embrionario; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor EGF en células A431; serie E1 (grupo sanguíneo B) en cáncer de páncreas; FC10.2 encontrado en células de carcinoma embrionario; antígeno de adenocarcinoma gástrico; CO-5l4 (grupo sanguíneo Lea) encontrado en adenocarcinoma; NS-10 encontrado en adenocarcinomas; CO-43 (grupo sanguíneo Leb); G49 encontrado en receptor EGF de células A431; MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma colónico; 19.9 en cáncer de colon; mucinas de cáncer gástrico; T5A7 en células mieloides; R24 en melanoma; 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 y M1:22:25:8 encontrados en células de carcinoma embrionario y SSEA-3 y SSEA-4 encontrados en embriones en estadio de 4 a 8 células; antígeno de linfoma de células cutáneas; antígeno MART-1; antígeno Sialy Tn (STn); antígeno de cáncer de colon NY-CO-45; antígeno de cáncer de pulmón NY-LU-12 variante A; antígeno de adenocarcinoma ART1; antígeno de cáncer de testículo cerebral asociado a paraneoplasia (antígeno onconeuronal MA2; antígeno neuronal paraneoplásico); Antígeno ventral neuro-oncológico 2 (NOVA2); Gen 520 del antígeno del carcinoma hepatocelular; Antígeno asociado a tumores CO-029; Antígenos asociados a tumores MAGE-C1 (antígeno cáncer/testículo c T7), MAGE-B1 (antígeno MAGE-XP), MAGE-B2 (DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b y MAGE-X2; Antígeno cáncer/testículo (NY-EOS-1) y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos mencionados (por sus siglas en inglés, respectivamente).
En una realización, el polipéptido empleado es recombinante. Un polipéptido o proteína "recombinante" se refiere a un polipéptido o proteína producido mediante tecnología de ADN recombinante. Los polipéptidos producidos recombinantemente y las proteínas expresadas en células huésped modificadas por ingeniería se consideran aislados a efectos de la presente divulgación, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que se hayan separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada. Los polipéptidos divulgados en la presente se pueden producir recombinantemente por métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, las proteínas y péptidos divulgados en la presente pueden sintetizarse químicamente.
Moléculas de carga útil
La carga útil, como se emplea en la presente, se refiere a una molécula o componente destinado a ser "suministrado" en una región objetivo por conjugación con el anticuerpo. En general, la carga útil será generalmente una molécula efectora, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en una toxina, por ejemplo, una citotoxina, tal como un agente quimioterápico, un fármaco, un profármaco, una enzima, un inmunomodulador, un agente antiangiogénico, un agente proapoptótico, una citocina, una hormona, un anticuerpo o fragmento del mismo, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de los mismos (por ejemplo, una molécula antisentido o un gen), radionúclidos, en particular radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopia de NMR o ESR (por sus siglas en inglés, respectivamente).
En una realización, la carga útil se selecciona del grupo que comprende una toxina, fármaco, radionucleido, inmunomodulador, citocina, linfocina, quimiocina, factor de crecimiento, factor de necrosis tumoral, hormona, antagonista hormonal, enzima, oligonucleótido, a Dn , ARN, ARNip, ARNi, microARN, ácido nucleico peptídico, agente terapéutico fotoactivo, agente antiangiogénico, agente proapoptótico, aminoácido no natural, péptido, lípido, polímero, carbohidrato, molécula de andamiaje, etiqueta fluorescente, péptido de visualización, biotina, prolongador de la vida media sérica, etiqueta de captura, agente quelante, soporte sólido, o una combinación de los mismos.
En una realización, la carga útil es una molécula de fármaco (también referida en la presente "fármaco"). Los ejemplos de moléculas farmacológicas para su uso en la presente divulgación incluyen mostaza nitrogenada, derivado de etilenimina, sulfonato de alquilo, nitrosourea, gemcitabina, triazeno, análogo de ácido fólico, antraciclina, taxano, inhibidor de COX-2, análogo de pirimidina, análogo de purina, antibiótico, inhibidor de enzimas, epipodofilotoxina, complejo de coordinación de platino, alcaloide de vinca, urea sustituida, derivado de metilhidrazina, supresor corticosuprarrenal, antagonista hormonal, endostatina, taxol, camptotecina, doxorrubicina, análogo de doxorrubicina, antimetabolito, agente alquilante, antimitótico, agente antiangiogénico, inhibidor de tirosina cinasa, inhibidor de mTOR, inhibidor de proteína de choque térmico (HSP90), inhibidor de proteosoma, inhibidor de HDAC, agente proapoptótico, metotrexato, CPT-11, (por sus siglas en inglés, respectivamente), o una combinación de los mismos, y en donde la conjugación es.
En aspectos particulares, el fármaco es amifostina, cisplatino, dacarbazina, dactinomicina, mecloretamina, estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina, lomustina, doxorrubicina liposomal, gemcitabina, daunorrubicina, daunorrubicina liposomal, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel, docetaxel, aldesleucina, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cladribina, 10-hidroxi-7-etilcamptotequina (SN38), gefitinib, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferón alfa, interferón beta, irinotecán, mitoxantrona, topotecán, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromán, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, inhibidores de la aromatasa, y combinaciones de los mismos.
En una realización, el fármaco se selecciona del grupo que comprende alquilfosfocolinas, inhibidores de la topoisomerasa I, taxoides y suramina.
En una realización, las toxinas comprenden citotoxinas o agentes citotóxicos, incluido cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, que las destruya). Algunos ejemplos son aplidina, anastrozol, azacitidina, bortezomib, briostatina-1, busulfán, combrestatinas, carmustina, dolastatinas, epotelonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos.
En una realización, el fármaco (también una citotoxina en este caso) comprende antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU)). mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), carboplatino, antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina, cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina o glucurónido de doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), calicheamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina), (por sus siglas en inglés, respectivamente).
En algunos aspectos, el fármaco es una auristatina (patentes de EE. UU. No. 5,635,483; 5,780,588), por ejemplo, MMAE (monometilauristatina E) o MMAF (monometilauristatina F), (por sus siglas en inglés, respectivamente). En otros aspectos, el fármaco es una dolastatina o un análogo o derivado peptídico de dolastatina. Se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren en la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woykeet al., Antimicrob. Agents and Chemother.45:3580-3584 (2001)) y tienen actividad anticancerígena (patente de EE. U<u>. No. 5,663,149). El motivo de fármaco de dolastatina o auristatina se puede unir al compuesto de conjugado a través del N-terminal (amino) o el C-terminal (carboxilo) terminal del motivo de fármaco peptídico. Ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO2002/088172. En otros aspectos, el fármaco es un maitansinoide. En algunos aspectos, el maitansinoide es N2’-desacetil-N2’-(3-mercapto-1-oxopropil)maitansina (DM1), N2’-desacetil-N2’-(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM3) o N2’-desacetil-N2’(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)maitansina (DM4), (por sus siglas en inglés, respectivamente). Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África orientalMaytenus serrata(patente de EE. UU. No. 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de EE. UU. No. 4,151,042). Se dan a conocer maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. No. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.
Los motivos de fármaco maitansinoide son motivos de fármaco atractivos en conjugados de anticuerpo y fármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) susceptibles de derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de los enlazadores distintos de disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) efectivos contra una variedad de líneas de células tumorales. Se dan a conocer conjugados que contienen maitansinoides, métodos para fabricar los mismos y su uso terapéutico, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. No. 5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP0425235B1; Liuet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93:8618-8623 (1996) (inmunoconjugados descritos que comprenden un maitansinoide denominado DM1); y Chariet al., Cáncer Research,52:127-131 (1992).
Los maitansinoides se conocen bien en la técnica y se pueden sintetizar por técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se dan a conocer maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 5,208,020. Los motivos de fármaco maitansinoide a modo de ejemplo incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-decloro (patente de EE. UU. No. 4,256,746) preparado por reducción de ansamitocina P2 por hidruro de litio y aluminio); C-20-hidroxilo (o C-20-desmetilo)+/-C-19-decloro (patentes de EE. UU. No. 4,361,650 y 4,307,016) (preparado por desmetilación usandoStreptomycesoActinomyceso decloración usando LAH, por sus siglas en inglés); y C-20-desmetoxilo, C-20-alcoxilo (-OCOR), /- decloro (patente de EE. UU. No. 4,294,757), (preparado por acilación usando cloruros de acilo) y los que tienen modificaciones en otras posiciones. Los motivos de fármaco maitansinoide a modo de ejemplo también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-SH, preparado por la reacción de maitansinol con H<2>S o P<2>S<5>(patente de EE. UU. No. 4,424,219); C-14-alcoximetil(desmetoxilo/CH2OR) (patente de EE. UU. No. 4,331,598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH<2>OH o CH<2>OAc), preparado a partir deNocardia(patente de EE. UU. No. 4,450,254); C-15-hidroxilo/aciloxilo, preparado por la conversión de maitansinol porStreptomyces(patente de EE. UU. No. 4,364,866); C-15-metoxilo, aislado deTrewia nudiflora(patente de EE. UU. No. 4,313,946 y 4,315,929); C-18-N-desmetilo, preparado por desmetilación de maitansinol porStreptomyces(patente de EE. UU. No. 4,362,663 y 4,322,348); y 4,5-desoxilo, preparado por la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH (patente de EE. UU. No. 4,371,533). Se sabe que muchas posiciones en los compuestos de maitansina son útiles como posición de enlace, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, para formar una enlace de éster, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo son todas adecuadas.
En algunos aspectos, el fármaco es caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble hebra en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, ver, por ejemplo, las patentes de EE. UU. No. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296. Los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan,<y>1I, a2I, a3I, N-acetil-Y1I, PSAG y 011 (Hinmanet al., Cancer Research53:3336-3342 (1993), Lodeet al., Cancer Research58:2925-2928 (1998) y las patentes de EE. UU. mencionadas de American Cyanamid). En algunos aspectos, el fármaco es tubulisina. Las tubulisinas son miembros de una clase de productos naturales aislados de especies mixobacterianas (Sasseet al., J. Antibiot.53:879-885 (2000)). Como agentes de interacción con el citoesqueleto, las tubulisinas son venenos mitóticos que inhiben la polimerización de la tubulina y llevan a la detención del ciclo celular y la apoptosis (Steinmetzet al., Chem. Int. Ed.,43:4888-4892 (2004)); Khalilet al., ChemBioChem.,7:678-683 (2006); Kauret al., Biochem. J.,396: 235-242 (2006)). Las tubulisinas son moléculas citotóxicas extremadamente potentes, que superan la inhibición del crecimiento celular de cualquier agente quimioterápico tradicional clínicamente relevante, por ejemplo, epotilonas, paclitaxel y vinblastina. Asimismo, son potentes contra líneas celulares resistentes a múltiples fármacos (Domlinget al., Mol. Diversity,9:141-147 (2005)). Estos compuestos muestran una elevada citotoxicidad contra un panel de líneas celulares de cáncer, con valores de IC<50>en el rango picomolar bajo, por lo que resultan interesantes como terapéuticos anticancerígenos. Ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO/2012019123. Los conjugados de tubulisina se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 7,776,814.
En algunos aspectos, el fármaco es una pirrolobenzodiazepina (PBD, por sus siglas en inglés). Las PBD son moléculas relativamente pequeñas y algunas tienen la capacidad de reconocer y unirse covalentemente a secuencias específicas en el surco menor del ADN y, por tanto, presentan actividad antibiótica/antitumoral. En la técnica se conocen varias PBD y derivados de las mismas, por ejemplo, dímeros de PBD (por ejemplo, SJG-136 o SG2000), dímeros de PBD insaturados en C2, dímeros de pirrolobenzodiazepina que llevan sustituciones de arilo en C2 (por ejemplo, SG2285), profármacos de dímeros de PBD que se activan por hidrólisis (por ejemplo, SG2285) y polipirrol-PBD (por ejemplo, SG2274). Las PBD se describen adicionalmente en las publicaciones internacionales No. W02000/012507, WO2007/039752, WO2005/110423, WO2005/085251, y W02005/040170, y la patente de EE. UU. No. 7,612,062.
En algunos aspectos, la toxina comprende, por ejemplo, abrina, brucina, cicutoxina, toxina diftérica, toxina botulínica, toxina shiga, endotoxina, toxina tetánica, toxina pertúsica, toxina del ántrax, toxina del cólera, falcarinol, toxina alfa, geldanamicina, gelonina, lotaustralina, ricina, estricnina, tetrodotoxina, saponina, ribonucleasa (ARNasa), ADNasa I, enterotoxina estafilocócica A, proteína antiviral de la hierba carmín, exotoxina dePseudomonas,endotoxina dePseudomonas,o una combinación de las mismas. En otros aspectos, la toxina comprende, por ejemplo, modeccina de cadena A, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S, por sus siglas en inglés, respectivamente), inhibidor deMomordica charantia,curcina, crotina, inhibidor deSaponaria officinalis,mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina, tricotecenos o una combinación de los mismos. Ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO1993/021232. En algunos aspectos, el agente quelante es DTPA, EC, DMSA, EDTA, Cy-EDTA, EDTMP, DTPA, CyDTPA, Cy2DTPA, BOPTA, DTPA-MA, DTPA-BA, DTPMP, DOTA, TRITA, TETA, DOTMA, DOTA-MA, HP-DO3A, pNB-DOTA, DOTP, DOTMP, DOTEP, DOTPP, DOTBzP, DOTPME, HEDP, DTTP, un triamidotiol N<3>S, DADS, MAMA, DADT, un diaminetetiol N<2>S<4>, un ditiol-bisfosfina N<2>P<2>, un ácido 6-hidrazinonicotínico, una oxima de propileno-amina, una tetraamina, una ciclamina o una combinación de los mismos.
En una realización, el fármaco es una auristatina, una tubulisina o una pirrolobenzodiazepina (PBD).
En una realización, la auristatina es MMAE (monometilauristatina E) o MMAF (monometilauristatina F).
En una realización, el fármaco es un maitansinoide, por ejemplo, N2’-desacetil-N2’-(3-mercapto-1-oxopropil)maitansina (DM1), N2’-desacetil-N2-(4-mercapto- 1-oxopentil)maitansina (DM3) o N2’-desacetil-N2-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)maitansina (DM4).
Los ejemplos de radionucleidos incluyen 3H, 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 33P, 35S, 47Sc, 51Cr, 54Mn, 57Co, 58Co, 59Fe, 62Cu, 65Zn 67Cu, 67Ga, 68Ge, 75Br, 75Se, 76Br, 77Br, 77As, 80mBr, 85Sr, 89Sr, 90Y, 95Ru, 97Ru, 99Mo and 99mTc, 103Pd, 103m Rh, 103 Ru, 105Rh 105Ru 107Hg 109pd 109pt 11lAg 111|n 112|n 113m|n 113Sn 115|n 117Sn 119Sb 121mTe 1211122mTe 125mTe 125| 126| 1311133| 133Xe, 140La,' 142Pr, ’143Pr,’ 149Pm, 152Dy, 153Sm, 153Gd, 159Gd, 161Ho, 161Tb, 165Tm, 166Dy, ’166Ho, 167Tm, 168Tm, 169Er, 169Yb 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 188W, 189mOs, 189Re, 192Ir, 194Ir, 197Pt, 198Au, 199Au, 201T1, 203Hg, 211At, 211Bi, 211Pb, 212Pb, 212Bi 213Bi, 215Po, 217At, 219Rn, 221Fr, 223Ra, 224Ac, 225Ac, 225Fm, 252Cf, y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, el radionucleido se selecciona del grupo que comprende o consiste en cromo (51Cr), cobalto (57Co) flúor (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), germanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (115In, 113In, 112In, 111In), yodo (131I, 125I, 123I, 121|) lantano (140La), lutecio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr) prometio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rutenio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se) estroncio (85Sr), azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio (201Tl), estaño (113Sn, 117Sn), tritio (3H), xenón (133Xe), iterbio (169Yb 175Yb), itrio (90Y), zinc (65Zn), o una combinación de los mismos.
En una realización, el radionucleido se une al compuesto conjugado de la presente divulgación por un agente quelante.
En una realización, R1 es un prolongador de la vida media sérica, que comprende, por ejemplo, albúmina, polipéptido de unión a albúmina, PAS, la subunidad p del péptido C-terminal (CTP, por sus siglas en inglés) de la gonadotropina coriónica humana, polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES, por sus siglas en inglés), XTEN (por sus siglas en inglés), pequeñas moléculas de unión a albúmina, o una combinación de las mismas.
Cuando la molécula efectora es un polímero, puede ser, en general, un polímero sintético o natural, por ejemplo, un polímero de polialquileno, polialquileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo, un homo- o heteropolisacárido.
Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados incluyen uno o más grupos hidroxilo, metilo o metoxilo.
Entre los polímeros naturales específicos se incluyen lactosa, ácido hialurónico, heparán sulfato, condroitín sulfato, alginato, celulosa amilosa, dextrano, glucógeno, o derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, el polímero es polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, ácido polisialico (PSA), hidroxialquilalmidón (HAS), hidroxiletilalmidón (HES), carbohidrato, polisacáridos, pullulano, quitosano, ácido hialurónico, condroitín sulfato, dermatán sulfato, almidón, dextrano, carboximetilo de dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG) polioxazolina, poliacriloilmorfolina, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfazeno, polioxazolina, anhídrido de polietileno-co-ácido maleico, anhídrido de poliestireno-co-ácido maleico, poli-( 1 -hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), 2-metacriloiloxi-2'-etiltrimetilamoniofosfato (MPC), (por sus siglas en inglés, respectivamente). En algunas realizaciones, el polímero es polietilenglicol. En una realización, de la invención, el polietilenglicol tiene un rango de peso molecular de 300 a 10.000.000, de 500 a 100.000, de 1.000 a 50.000, de 1.500 a 30.000, de 2.000 a 20.000 Da, de 3.000 a 5.000 Da y de 4.000 a 5.000 Da. En otras realizaciones, el polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000 Da, aproximadamente 1.500 Da, aproximadamente 2.000 Da, aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 4.000 Da, aproximadamente 5.000 Da, aproximadamente 10.000 Da, o aproximadamente 20.000 Da.
En una realización, R1 o el anticuerpo (en particular R1) comprende una etiqueta de visualización. Las etiquetas de visualización incluyen, sin limitación, un cromóforo, un fluoróforo, una proteína fluorescente, un colorante fosforescente, un colorante en tándem, una partícula, un hapteno, una enzima, un radioisótopo, o una combinación de los mismos.
En una realización, la etiqueta de visualización es un péptido de visualización. En algunos aspectos, el péptido de visualización permite la visualización o localización del compuesto conjugadoin vitro, in vivo, ex vivo,o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, el péptido de visualización es, por ejemplo, un péptido aceptor de biotina, un péptido aceptor de ácido lipoico, una proteína fluorescente, un péptido que contiene cisteína para ligar un colorante biarsénico o para conjugar tecnecio metaestable, un péptido para conjugar clatratos de europio para ensayos de proximidad basados en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés), o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, la proteína fluorescente es, por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), proteína amarilla fluorescente mejorada (EYFP), (por sus siglas en inglés, respectivamente), o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, la proteína fluorescente es una ficobiliproteína o un derivado de la misma. Las proteínas fluorescentes, especialmente la ficobiliproteína, son útiles para crear reactivos de etiquetado etiquetados con colorantes en tándem. Estos colorantes en tándem comprenden una proteína fluorescente y un fluoróforo con el fin de obtener un mayor desplazamiento de Stokes en donde el espectro de emisión se desplaza más lejos de la longitud de onda del espectro de absorción de la proteína fluorescente. Esto puede ser efectivo para detectar una cantidad baja de una objetivo en una muestra, en donde la luz fluorescente emitida se optimiza al máximo, en otras palabras, poca o ninguna de la luz emitida es reabsorbida por la proteína fluorescente. Para que esto funcione, la proteína fluorescente y el fluoróforo funcionan como un par de transferencia de energía en donde la proteína fluorescente emite a la longitud de onda a la que absorbe el fluoróforo y el fluoróforo emite entonces a una longitud de onda más alejada de las proteínas fluorescentes que la que se podría haber obtenido solamente con la proteína fluorescente. Una combinación funcional puede ser ficobiliproteínas y fluoróforos de sulforodamina, o fluoróforos de cianina sulfonada como se conoce en la técnica. A veces, el fluoróforo funciona como donador de energía y la proteína fluorescente es el aceptor de energía.
En otros aspectos, el colorante biarsénico es 4',5'-bis(1,3,2-ditioarsolan-2-il)fluoresceína (FlAsH, por sus siglas en inglés). En algunos aspectos, el péptido aceptor de biotina facilita la conjugación de reactivos basados en avidina y estreptavidina. En algunos aspectos, el péptido aceptor de ácido lipoico facilita la conjugación de sondas reactivas a un tiol al ácido lipoico unido o la ligación directa de análogos fluorescentes del ácido lipoico.
En una realización, R1 o el anticuerpo (en particular R1) comprende una etiqueta fluorescente. En algunos aspectos, la etiqueta fluorescente comprende, por ejemplo, un colorante de tipo fluoresceína, un colorante de tipo rodamina, un colorante de tipo dansilo, un colorante de tipo lisamina, un colorante de tipo cianina, un colorante de tipo ficoeritrina, un colorante de tipo rojo Texas, o cualquier combinación de los mismos. Entre los fluoróforos adecuados para la conjugación con los anticuerpos con cisteína modificada por ingeniería o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en la presente se incluyen, sin limitación; un pireno (incluido cualquiera de los compuestos derivados correspondientes), un antraceno, un naftaleno, una acridina, un estilbeno, un indol o benzindol, un oxazol o benzoxazol, un tiazol o benzotiazol, un 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD, por sus siglas en inglés), una cianina (incluidos los compuestos correspondientes), una carbocianina (incluidos los compuestos correspondientes), un carboestirilo, una porfirina, un salicilato, un antranilato, un azuleno, un perileno, una piridina, una quinolina, un borapoliazaindaceno (incluidos los compuestos correspondientes), un xanteno (incluidos los compuestos correspondientes), una oxazina (incluidos los compuestos correspondientes) o una benzoxazina, una carbazina (incluidos los compuestos correspondientes), una fenalenona, una cumarina (incluidos los compuestos correspondientes divulgados), un benzofurano (incluidos los compuestos correspondientes) y una bencenfenalenona (incluidos los compuestos correspondientes) y derivados de los mismos. Como se usa en la presente, las oxazinas incluyen resorufinas (incluidos los compuestos correspondientes), aminooxazinonas, diaminooxazinas y sus análogos benzo-sustituidos, o cualquier combinación de los mismos.
En ciertos aspectos, los fluoróforos incluyen, por ejemplo, xanteno (rodol, rodamina, fluoresceína y derivados de los mismos) cumarina, cianina, pireno, oxazina, borapoliazaindaceno, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tales fluoróforos son, por ejemplo, xantenos sulfonados, xantenos fluorados, cumarinas sulfonadas, cumarinas fluoradas, cianinas sulfonadas, o cualquier combinación de las mismas. También se incluyen los tintes vendidos bajo las marcas comerciales y generalmente conocidos como ALEXA FLUOR®, DYLIGHT®, CY DYES®, BODIPY®, OREGON GREEN®, PACIFIC BLUE®, IRDYES®, FAM®, FITC® y ROX®.
La elección del fluoróforo unido mediante un enlazador "Z", como se divulga en la presente, determinará las propiedades de absorción y emisión de fluorescencia del compuesto final. Las propiedades físicas de un marcador de fluoróforo que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, características espectrales (absorción, emisión, y desplazamiento de Stokes), intensidad de fluorescencia, tiempo de vida, polarización y tasa de fotoblanqueo, o una combinación de los mismos. Todas estas propiedades físicas se pueden usar para distinguir un fluoróforo de otro y permitir de este modo el análisis multiplexado. En ciertos aspectos, el fluoróforo tiene un máximo de absorción a longitudes de onda mayores a 480 nm. En algunos aspectos, el fluoróforo absorbe en o cerca de 488 nm a 514 nm (particularmente adecuado para la excitación por la salida de la fuente de excitación láser de iones de argón) o cerca de 546 nm (particularmente adecuado para la excitación por una lámpara de arco de mercurio). En algunos aspectos, un fluoróforo puede emitir en el NIR (región del infrarrojo cercano, por sus siglas en inglés) para aplicaciones en tejidos o en todo el organismo. Otras propiedades deseables de la etiqueta fluorescente pueden ser la permeabilidad celular y la baja toxicidad, por ejemplo, si el etiquetado del anticuerpo se va a realizar en una célula o un organismo (por ejemplo, un animal vivo).
En una realización, R1 o el anticuerpo (en particular R1) comprende una etiqueta de captura. En algunos aspectos, la etiqueta de captura es biotina o una etiqueta His6. La biotina es útil porque puede funcionar en un sistema enzimático para amplificar aún más una señal detectable, y también puede funcionar como una etiqueta para ser usada en cromatografía de afinidad con fines de aislamiento. Para la detección, se puede usar un conjugado enzimático con afinidad por la biotina, como la avidina-HRP (por sus siglas en inglés).
Subsecuentemente, se puede adicionar un sustrato de peroxidasa para producir una señal detectable. Además de la biotina, se pueden usar otros haptenos, que incluyen hormonas, fármacos naturales y sintéticos, contaminantes, alérgenos, moléculas efectoras, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, linfocinas, aminoácidos, péptidos, productos químicos intermediarios, nucleótidos y similares.
En una realización, R1 comprende una enzima. Las enzimas son etiquetas efectivas porque pueden amplificar la señal detectable, lo que aumenta la sensibilidad del ensayo. A menudo, la enzima en sí no produce una respuesta detectable, sino que funciona para descomponer un sustrato cuando se pone en contacto con un sustrato adecuado, de modo tal que el sustrato convertido produce una señal fluorescente, colorimétrica o luminiscente. Las enzimas amplifican la señal detectable debido a que una enzima sobre un reactivo de marcaje puede resultar en múltiples sustratos que se convierten en una señal detectable. El sustrato enzimático se selecciona para obtener el producto medible, por ejemplo, colorimétrico, fluorescente o de quimioluminiscencia. Tales sustratos se usan ampliamente en la técnica y son conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el sustrato colorimétrico o fluorogénico y la combinación enzimática usan oxidorreductasas, tal como la peroxidasa de rábano picante y un sustrato como la 3,3'-diaminobencidina (DAB) y el 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), que producen un color distintivo (marrón y rojo, respectivamente), (por sus siglas en inglés, respectivamente). Otros sustratos colorimétricos de oxidorreductasa que producen productos detectables incluyen, pero no se limitan a: ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), o-fenilendiamina (OPD), 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, 4-cloro-1 -naftol (por sus siglas en inglés, respectivamente). Los sustratos fluorogénicos incluyen, pero no se limitan a, ácido homovanílico o ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluido el reactivo Amplex® Red y sus variantes, y dihidroxantenos reducidos, incluidas dihidrofluoresceínas y dihidrorodaminas, incluida dihidrorodamina 123.
La presente divulgación se extiende a emplear sustratos de peroxidasa que son tiramidas que representan una clase única de sustratos de peroxidasa en que pueden ser intrínsecamente detectables antes de la acción de la enzima pero son "fijadas en su lugar" por la acción de una peroxidasa en el proceso descrito como amplificación de señal de tiramida (TSA, por sus siglas en inglés). Estos sustratos se usan ampliamente para etiquetar objetivos en muestras que son células, tejidos o matrices para su subsecuente detección por microscopía, citometría de flujo, barrido óptico y fluorometría.
La presente divulgación se extiende a una combinación colorimétrica (y en algunos casos fluorogénica) de sustrato y enzima que a veces usa una enzima fosfatasa, tal como una fosfatasa ácida, una fosfatasa alcalina o una versión recombinante de tal fosfatasa en combinación con un sustrato colorimétrico, tales como fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (BCIP), fosfato de 6-cloro-3-indolilo, fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, fosfato de p-nitrofenilo, o fosfato de onitrofenilo o con un sustrato fluorogénico, tales como fosfato de 4-metilumbeliferilo, fosfato de 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarinilo (DiFMUP, patente de EE. UU. No. 5,830,912) difosfato de fluoresceína, fosfato de 3-O-metilfluoresceína, fosfato de resorufina, fosfato de 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona-7-ilo) (fosfato de DDAO), o ELF 97, ELF 39 o fosfatos relacionados (por sus siglas en inglés, respectivamente).
La divulgación también se extiende a R1 que comprende una glicosidasa, en particular beta-galactosidasa, betaglucuronidasa y beta-glucosidasa, son enzimas adecuadas adicionales. Los sustratos colorimétricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo beta-D-galactopiranósido (X-gal) y galactósidos, glucósidos y glucurónidos de indolilo similares, beta-D-galactopiranósido de o-nitrofenilo (ONPG) y beta-D-galactopiranósido de p-nitrofenilo (por sus siglas en inglés, respectivamente). En algunas realizaciones, los sustratos fluorogénicos incluyen el beta-D-galactopiranósido de resorufina, el digalactósido de fluoresceína (FDG, por sus siglas en inglés), el diglucurónido de fluoresceína y sus variantes estructurales, el beta-D-galactopiranósido de 4-metilumbeliferilo, el beta-D-galactopiranósido de carboxiumbeliferilo y los beta-D-galactopiranósidos de cumarina fluorados. Otras enzimas incluyen, pero no se limitan a, hidrolasas, tales como colinesterasas y peptidasas, oxidasas, tales como glucosa oxidasa y citocromo oxidasas, y reductasas para las que se conocen sustratos adecuados.
Las enzimas y sus sustratos apropiados que producen quimioluminiscencia son útiles para su incorporación en moléculas de la presente divulgación. Estos incluyen, pero no se limitan a, formas naturales y recombinantes de luciferasas y ecuorinas. También son adicionalmente productivos los sustratos productores de quimioluminiscencia para fosfatasas, glucosidasas y oxidasas, tales como los que contienen dioxetanos estables, luminol, isoluminol y ésteres de acridinio, en donde tal motivo heterólogo es un ácido nucleico. El ácido nucleico se puede seleccionar del grupo formado por ADN, ARN, ARN de interferencia pequeño (ARNip), microARN, horquillas o miméticos de ácidos nucleicos, tal como los ácidos nucleicos peptídicos. En ciertos aspectos, el ácido nucleico conjugado tiene al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60 al menos 100, al menos 200, al menos 500, al menos 1000, al menos 5000, o más pares de bases. El ácido nucleico conjugado puede ser de hebra única. En varios aspectos, el ácido nucleico conjugado puede ser de doble hebra. En algunos aspectos, el ácido nucleico conjugado codifica un marco de lectura abierto. En algunos aspectos, el marco de lectura abierto codificado por el ácido nucleico conjugado corresponde a una proteína inductora de apoptosis, una proteína viral, una enzima o una proteína supresora de tumores. Las técnicas para suministrar tales ácidos nucleicos a las células son conocidas en la técnica.
Otras definiciones
Antes de describir en detalle las realizaciones proporcionadas, se debe entender que esta divulgación no se limita a composiciones o pasos de proceso específicos y, como tal, puede variar. Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a", y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto claramente dicte lo contrario. En la presente los términos "un" (o "uno/a"), así como los términos "uno/a o más" y "al menos uno/a" se pueden usar indistintamente.
Asimismo, cuando en la presente se usa "y/o" se debe interpretar como la divulgación específica de cada una de los dos atributos o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A y/o B" en la presente contempla incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Igualmente, el término "y/o", como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" contempla abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto habitual en la técnica a la que se refiere la presente divulgación. Por ejemplo, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2° ed., 2002,CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3° ed., 1999,Academic Press;y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000,Oxford University Press,proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente divulgación.
Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo. Los títulos proporcionados en la presente no son limitaciones de los varios aspectos, que se pueden obtener al hacer referencia a la memoria descriptiva como un conjunto. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.
Se hace referencia a los aminoácidos en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (por sus siglas en inglés). Los nucleótidos, por su parte, son referidos por sus códigos de una única letra comúnmente aceptados.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal( por ejemplo, un mamífero), que incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se pueden usar indistintamente en referencia a un sujeto humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que tiene una forma tal que permite que la actividad biológica del principio activo (por ejemplo, un compuesto conjugado divulgado en la presente) sea efectivo, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la composición. Tal composición puede comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Tal composición puede ser estéril.
Una "cantidad efectiva" de un compuesto conjugado, como se divulga en la presente, es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" se puede determinar empíricamente y de una manera rutinaria, en relación con el fin indicado.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad del compuesto conjugado divulgado en la presente u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero.
La palabra "etiqueta" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con un anticuerpo modificado por ingeniería o un fragmento del mismo divulgado en la presente (por ejemplo, un anticuerpo con cisteína modificada por ingeniería o un fragmento del mismo) para generar un compuesto conjugado "etiquetado". La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, etiquetas radioisotópicas o fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que sea detectable.
Términos tales como "tratado" o "tratamiento" o "para tratar" se refieren tanto a (1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas de, y/o detienen la progresión de una condición o trastorno patológico diagnosticado, como a (2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o retrasan el desarrollo de una condición o trastorno patológico específico. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos en quienes se debe prevenir un trastorno. En ciertos aspectos, un sujeto es "tratado" con éxito de una enfermedad o condición, por ejemplo, cáncer, de acuerdo con los métodos de la presente divulgación si el paciente muestra, por ejemplo, remisión total, parcial o transitoria de la enfermedad o condición, por ejemplo, un cierto tipo de cáncer.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, incluidos el ADN y el ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero por una ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos.
Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a un constructo capaz de liberar y, en algunos aspectos, expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes condensadores catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.
Como se usa en la presente, el término "que comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva se debe interpretar como "que incluye".
"Empleado en la presente divulgación", como se usa en la presente, se refiere a empleado en el método divulgado en la presente, empleado en las moléculas que incluyen intermediarios divulgados en la presente o ambos, como sea apropiado con el contexto del término usado.
Se entiende que siempre que en la presente se describan aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Cualquier realización positiva o combinación de las mismas descrita en la presente puede ser la base de una exclusión negativa, es decir, de una exención de responsabilidad.
Composiciones
La presente divulgación se extiende a procesos para preparar composiciones que comprenden una molécula descrita en la presente (tales como moléculas hidrolizadas de la divulgación), por ejemplo, preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende adicionar y mezclar una molécula de la presente divulgación, tal como molécula hidrolizada de la divulgación de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, en particular una composición farmacéutica (o composición de diagnóstico) que comprende una molécula de la presente divulgación y excipiente, diluyente o portador farmacéutico.
La composición habitualmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable en el contexto de la formulación de vacunas.
El anticuerpo de la divulgación puede ser el único principio activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede ir acompañado de otros principios activos.
Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de acuerdo con la divulgación. El término "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición objetivo, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. La cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular o bien en modelos animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede usar para determinar el rango de concentración y la vía de administración apropiados. Posteriormente, tal información se puede usar para determinar dosis y vías útiles para la administración en humanos.
La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades a las reacciones y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar por experimentación rutinaria y queda a juicio del clínico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis. La dosis real a la que se administra una molécula de la presente divulgación depende de la naturaleza de la condición a tratar, por ejemplo, la extensión de la enfermedad/inflamación presente y de si la molécula se usa profilácticamente o para tratar una condición existente.
Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o en combinación(por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.
El portador farmacéuticamente aceptable no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en tales composiciones, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras de pH. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas y suspensiones, para su ingestión por parte del paciente.
Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes.
Alternativamente, la molécula de la divulgación puede estar en forma seca, para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.
Convenientemente, en las formulaciones de acuerdo con la presente divulgación, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo, por ejemplo, si el pH de la formulación es 7, entonces un pI (por sus siglas en inglés) de 8-9 o mayor puede ser apropiado. Si querer limitarse a la teoría, se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo permanece en solución. Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquiera de varias vías, incluidas, pero sin limitarse a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, ver WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipopulverizaciones para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, como o bien disoluciones líquidas o bien suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.
La administración directa de las composiciones generalmente se realizará por inyección por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar a una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.
Se apreciará que la composición comprende un anticuerpo y, como tal, puede ser susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. De este modo, si la composición se va a administrar por una vía que use el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que haya sido absorbido por el tracto gastrointestinal.
Está disponible una discusión detallada de los portadores farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J. 1991).
En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas, incluida la inhalación.
Los preparados inhalables adecuados incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propelentes o soluciones inhalables sin gases propelentes. Los polvos inhalables de acuerdo con la divulgación que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente en las sustancias activas mencionadas o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas con un excipiente fisiológicamente aceptable.
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacáridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de los mismos entre sí. Son adecuados los mono- o disacáridos, tales como la lactosa o la glucosa, en particular pero no exclusivamente en forma de sus hidratos. Las partículas para su deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula menor a 10 |jm, tal como de 1 a 9 |jm, por ejemplo, de 0,1 a 5 |jm, en particular de 1 a 5 |jm. El tamaño de las partículas del principio activo (tal como el anticuerpo) es de importancia primordial.
Los gases propulsores que se pueden usar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan de hidrocarburos como el n-propanol, el n-butano o el isobutano y los halohidrocarburos como los derivados clorados y/o fluorados del metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados se pueden usar solos o en mezclas de los mismos.
Los gases propelentes especialmente adecuados son los derivados de alcanos halogenados seleccionados de TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados, son especialmente adecuados el TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y el TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y mezclas de los mismos.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente también pueden contener otros ingredientes, tales como cosolventes, estabilizadores, agentes tensioactivos (surfactantes), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor de acuerdo con la invención pueden contener hasta 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5 % en peso, de 0,01 a 3 % en peso, de 0,015 a 2 % en peso, de 0,1 a 2 % en peso, de 0,5 a 2 % en peso, o de 0,5 a 1 % en peso de principio activo.
Alternativamente, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser por administración de una solución líquida o formulación de suspensión, por ejemplo, al emplear un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus® conectado a un compresor Pari Master® fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
Las moléculas de la presente divulgación se pueden suministrar dispersas en un disolvente, por ejemplo, en forma de solución o suspensión. Se puede suspender en una solución fisiológica adecuada, por ejemplo, solución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una solución amortiguadora.
Las suspensiones terapéuticas o las formulaciones en solución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de citratos, amortiguador de fosfatos, amortiguador de acetatos y amortiguador de bicarbonatos), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril al emplear procesos de fabricación estériles.
Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración del disolvente/solución amortiguadora usada para la formulación, la suspensión aséptica de la molécula en la solución estéril de disolvente amortiguador y la dispensación de la formulación en recipientes estériles mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.
EJEMPLOS
En los ejemplos siguientes se emplea el anticuerpo monoclonal referido en la presente como T289C.
AC4GlcNAz
N-azidoacetilglucosamina tetraacilada
ADC
Conjugado anticuerpo-fármaco.
BCN
biciclo[6.1.0]nonino
BME
p-mercaptoetanol
TDT
ditiotreitol
MMAE
tris(2-carboxietil )fosfi n a
PAB
alcohol paraaminobencílico
Ejemplo 1: Síntesis de male¡m¡dapropion¡l-PEG7-b¡ot¡na
A una solución agitada de biotina-PEG7 amina (1) (100 mg, 0,168 mmol) en diclorometano anhidro (7 mL) a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) bajo N<2>se le adicionó éster maleimidapropiónico NHS (2) (49,2 mg, 0,186 mmol, 1,1 eq). Después de agitar por 1 h, el análisis por TLC (por sus siglas en inglés) indicó la finalización de la reacción, después de lo cual se adicionó HCl 1 N (2 mL). La solución orgánica se separó, se lavó con salmuera y se secó sobre Na2SO4. El producto bruto obtenido después de evaporación al vacío se purificó por cromatografía flash en columna sobre gel de sílice, eluyendo con gradientes escalonados de MeOH en diclorometano (v/v = 1:30, 1:20 y 1:10), para obtener el compuesto objetivo, maleimidaproprionil-PEG7-biotina (3) (65 mg, 0,087 mmol, rendimiento de 52 %) como un sólido ceroso. 1H RMN (CDCl3) d 7,01 (s a, 1H), 6,96 (s a, 1H), 6,70 (s, 2H), 5,86 (s, 1H), 5,06 (s, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 3,84 (t, J= 7,2 Hz, 2H), 3,62-3,66 (m, 24H), 3,53 (m, 4H), 3,40 (m, 4H), 3,15 (m, 1H), 2,88-2,96 (m, 1H), 2,73 (d, J= 12,6 Hz, 1H), 2,52 (t, J= 7,2 Hz, 2H), 2,24 (t, J= 7,0 Hz, 2H), 1,66 (m, 4H), 1,45 (m, 2H).
Ejemplo 2: Síntesis de male¡m¡dafen¡lacet¡l-PEG7-b¡ot¡na
Una mezcla de biotina-PEG7-NH2 (1) (0,25 g, 0,42 mmol) y éster maleimidafenilacético NHS (4) (0,2 g, 0,609 mmol) en acetonitrilo (10 mL) se agitó durante una noche a temperatura ambiente bajo N<2>. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna flash sobre gel de sílice, eluyendo con gradientes escalonados de diclorometano a MeOH en diclorometano a una relación de v/v 1:30, 1:20, 1:10:1 y 1:5) para proporcionar el producto objetivo maleimidafenilacetil-PEG7-biotina (5) como un aceite (70 mg, 0,087 mmol, 21 % de rendimiento) junto con 190 mg de mezcla del producto deseado y la forma hidrolizada en una relación de 3:1 como muestra la 1H NMR, así como 15 mg de mezcla 1:2. 1H RMN (CDCla) d 7,41, 7,30 (Tipo AB,Jab= 8,3 Hz, 4H) [7,64, 7,24 (Tipo AB,Jab= 9,2 Hz, 4H) componente menor], 6,85 (s, 2h ) [6,23 (d,J=7,5Hz, 1H), 6,47 (d, J=7,5 Hz, 1H), componente menor], 6,63 (s a, 1H), 6,55 (s a, 1H), 5,83 (s, 1H), 5,18 (s, 1H), 4,49 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,63-3,40 (m, 34H), 3,15 (m, 1H), 2,90 (d-AB TipoJab=12,9, J = 4,7 Hz, 1H), 2,72 (Tipo AB, J<ab>=12,9H<z>, 1H), 2,22 (t, J= 7,1 Hz, 2H), 1,68 (m, 4H), 1,46 (m, 2H). MS (ESI) m/z 830 (M+Na), 825 (M+NH<4>, pico base), 808 (M+1).
Ejemplo 3: Síntesis de 2-fluoro-5-male¡m¡dafen¡l-PEG7-b¡ot¡na
Una mezcla de biotina-PEG7-NH2 (1) (0,1 g, 0,168 mmol, 1 eq) y éster NHS 2-fluoro-5-maleimidafenólico (6) (0,084 g, 0,252 mmol, 1,5 eq) en diclorometano<(1>mL) se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo N<2>. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) en una columna LH20, eluyendo con MeOH/diclorometano (v/v 1:1), para obtener el producto objetivo 2-fluoro-5-maleimidafenil-PEG7-biotina (7) como un aceite (28 mg, 0,034 mmol, 20,5 % de rendimiento) con aproximadamente 10 % de forma hidrolizada, como se muestra por HPLC (por sus siglas en inglés). También se obtuvo una mezcla adicional de 90 mg del producto deseado y de la forma hidrolizada en una relación de 3:2. 1H RMN (CDCl3) d 8,05 (dd, J=6,7, 2,9 Hz, 1H), 7,47 (dd, J=4,5, 2,7 Hz, 1H), 7,23 (m, 1H) [8,20 (m, 1H), 7,46 (m, 1H), 7,19 (m, 1H), componente menor], 6,88 (s, 2H) [6,45, 6,24 (Tipo AB, JAB=12,9 Hz, 2H), componente menor], 6,63 (s a, 1H), 6,05 (s, 1H), 4,49 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,66 3,54 (m, 32H), 3,43 (m, 2H), 3,14 (m, 1H), 2,90 (d-Tipo AB, JAB=12,7, J=5,0 Hz, 1H), 2,73 (Tipo AB, JAB=12,7 Hz, 1H), 2,22 (m, 2H), 1,73 (m, 4H), 1,44 (m, 2H). MS (ESI) m/z 835 (M+Na), 829 (M+NH4), 813 (M+1, pico base).
Ejemplo 4: Procedimiento genérico para conjugar x-maleimida-PEG-biotinas con mAbs
en donde x representa X como se ha definido anteriormente para los compuestos de fórmula (I) y opcionalmente comprende además Y como se ha definido para los compuestos de fórmula (I).
Las x-maleimida-PEG-biotinas se conjugaron con mAb (con una mutación T289C en Fc) en varios pasos. En primer lugar, los mAb se redujeron ligeramente para generar sulfhidrilos libres al combinar 5 mL de solución de mAb de 1,6 mg/mL en PBS 10 mM, pH 7,2 (8 mg de mAb, 53,3 nM, 1 eq) con 43 |<j>L de solución de TCEP 50 mM en agua (2,15 |jmol, 40 eq) seguido de una mezcla suave a 37 °C por 1 h. El mAb reducido se transfirió a un casete de diálisis de deslizamiento (10K MWCO) y se dializó contra PBS, 1 mM de EDTA, pH 7,2-7,8, 4 °C por 24 horas con varios cambios de amortiguador. El mAb reducido se oxidó para reformar los disulfuros internos por la adición de ácido dehidroascórbico (21 jiL de 50 mM de solución madre en DMS<o>, 1,1 jmol, 20 eq) seguido de una mezcla suave por 4 h a temperatura ambiente. La solución de mAb oxidado se ajustó al pH deseado por la adición de fosfato de sodio 1 M (monobásico para pH 5,5, dibásico para pH 8,6, o una solución madre ajustado a pH 7,4) hasta una concentración final de fosfato de 100 mM y una concentración de mAb de 1,3 mg/mL. A continuación, se alicuotaron 1,15 mL de solución de mAb (1,5 mg, 10 nmol, 1 eq) en un vial seguido de la adición de solución madre de x-maleimida-PEG-biotina (2<j>L de una solución madre 10 mM en DMAc, 20 nmol, 2 eq). La mezcla de reacción se agitó brevemente en vórtex y se incubó por el tiempo deseado, después de lo cual se adicionó N-acetliccisteína (10 j L de una solución 100 mM en agua, 1 jmol, 100 eq) y se incubó por 15 minutos para apagar la maleimida que no había reaccionado. Todas las reacciones de conjugación se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22 °C) bajo atmósfera ambiente. Cabe señalar que 2 eq x-maleimida-PEG-biotina en relación con el mAb = 1 eq x-maleimida-PEG-biotina en relación con la cisteína libre contenida en el mAb. Este procedimiento general se modificó de acuerdo con fuera necesario para lograr la estequiometría de reacción deseada (es decir, diferentes alimentaciones de maleimida:mAb).
Las muestras de ADC se analizaron usando un espectrómetro de masas Q-TOF Agilent 6520B equipado con una columna RP-HPLC (Agilent Poroshell 300SB-C3; 5 |jm, 2,1 mm * 75 mm; Part# 660750-909). Los parámetros de la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) fueron los siguientes: velocidad de flujo, 0,4 mL/min; la fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en H<2>O de calidad para HPLC, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. La columna se equilibró en 90 % de A/10 % de B, que también se usó para desalar las muestras de ADC, seguida de elución en 40 % de A/60 % de B. Se recolectaron datos de espectros de masas para 100-3000 m/z, polaridad positiva, una temperatura del gas de 350 °C, una presión del nebulizador de 3,37 kg/cm2 [48 lb/pulg2] y un voltaje capilar de 5.000 V. Los datos se analizaron usando el software de análisis cualitativo MassHunter suministrado por el proveedor (Agilent v.B.04.00) y las intensidades de pico de los espectros desconvolusionados se usaron para derivar la proporción relativa de reactivos y productos; y la cinética de reacción.
Ejemplo 5: Cálculo de la eficiencia de conjugación y del porcentaje de hidrólisis
Cálculo de la eficiencia de la conjugación
La eficiencia de la conjugación y la relación fármaco: anticuerpo (DAR) se calcularon a partir de las intensidades de pico de los espectros de masas desconvolusionados usando las ecuaciones siguientes:
Eficiencia de conjugación= —a+ba++tc>++dc—+ex iQO Ecuación 1
DAR= - a--+-b+c+ —d-+--e-x 2 E c u a c ió n 2
a =intensidad del pico G0+1
b =intensidad del pico G<0>+<1>+Na/H<2>O
c= intensidad del pico G0+1+Na/H2O+Na
d= intensidad del pico G0
e= intensidad del pico G<0>+Na/H<2>O
DAR = relación fármaco:anticuerpo. Para este estudio, cualquier molécula conjugada con un mAb se considera un "fármaco"
Método de cálculo del porcentaje de hidrólisis para mAb conjugado con T289C
Tiosuccinimidas
Los valores del porcentaje de hidrólisis se calcularon a partir de las intensidades de los picos de los espectros de masas desconvolusionados, usando la ecuación siguiente:
a= intensidad del pico del conjugado de cadena pesada = (HC+1)
b= intensidad del pico del conjugado de cadena pesada+H2O/Na=(HC+1+H2O/Na)
Nota: El conjugado de cadena pesada 23 amu (por sus siglas en inglés) y 18 amu se incluyeron en este valor. En valores intermedios de hidrólisis estos picos no se pudieron resolver y apareció un único pico entre los valores esperados para (HC+<1>+H<2>O) y (HC+1+Na).
c= intensidad del pico del conjugado de cadena pesada H<2>O+Na = (HC+1+H2O+Na).
l= b/a a T = 0
m= c/a a T = 0
Ejemplo 6: Cálculo de la vida media
Las vida medias se calcularon a partir de las constantes de velocidad derivadas usando la ecuación 4 para las reacciones de pseudo primer orden (hidrólisis y desconjugación) y la ecuación 5 para las reacciones de segundo orden (conjugación):
1/z—wEcuación 5
Ecuación 5
[SH<]0>= Concentración inicial de tiol
Ejemplo 7: Análisis de la conjugación x-maleimida-PEG-biotina a 1 eq de maleimida:t¡ol
Los conjugados con mAb y x-Maleimida-PEG-biotina se prepararon para el análisis LCMS al diluir a 0,2 mg/mL con PBS pH 7,2 seguido de la combinación de 50 |jL de solución mAb con 5 |jL de TCEP (0,5 M en agua). Esta mezcla se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente para reducir los puentes disulfuro antes de la inyección (15 jiL) en el LCMS. Se muestran datos representativos en las Figuras 1A y 1B.
Tabla 1:
Ejemplo 8: Análisis de la conjugación x-maleimida-PEG-biotina a 0,5 eq de maleimida:t¡ol
Los conjugados con mAb x-Maleimida-PEG-biotina se prepararon como se describe anteriormente en el Ejemplo 7, excepto que se usó 1 eq de maleimida:mAb. Cabe señalar que 1 eq de x-maleimida-PEG-biotina equivale a 0,5 eq de xmaleimida-PEG-biotina:tiol.
1) Alquilmaleimida-PEG-biotina (comparativo), ver Figura 2A
Tabla 2:
2) Fenilmaleimida-PEG-biotina, ver Figura 2B
Tabla 3:
3) Fluorofenilmaleimida-PEG-biotina, ver Figura 2C
Estos datos demuestran que el método analítico es fiable, es decir, 50%de la alimentación de la reacción nos dio ~ 50%de conjugación.
Ejemplo 9: Eficiencia de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C a 22 °C
Los conjugados con mAb y x-maleimida-PEG-biotina se prepararon como se describe anteriormente, usando 2 eq xmaleimida-PEG-biotina:mAb. Cabe señalar que 2 eq de x-maleimida-PEG-biotina:mAb equivalen a 1 eq de x-maleimida-PEG-biotina:tiol. Los productos de la reacción se analizaron por espectrometría de masas de glicosilación reducida y la eficiencia de la conjugación se calculó usando la ecuación 1. Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4.
Ejemplo 10: Cinética de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C, pH 5,5, 22 °C
Los datos de conjugación se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de segundo orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar 1/[SH] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 11: Cinética de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C, pH 7,4, 22 °C
Los datos de conjugación se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de segundo orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar 1/[SH] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 6.
Ejemplo 12: Cinética de conjugación de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C, pH 8,6, 22 °C
Los datos de conjugación se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de segundo orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar 1/[SH] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 7.
Resumen de la cinética de la x-maleimida-PEG-biotina para la conjugación con el mAb T289C
Tabla 4:
Comparaciones bibliográficas:
1) Reacción de N-etilmaleimida con cisteína a pH 7,0, k2= 1,62*103 M-1s-1
Li, J.; Xu, Q.; Cortes, D.;et al.,Reaction of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides.PNAS2002, 99(18), 11605-11610.
2) Reacción de N-etilmaleimida con p-mercaptoetanol a pH 7,0, k2= 0,71*103 M-1s-1
Mosser, G. N-Substituted maleimide inactivation of the response of taste cell stimulation.J. Neurobiol.1976, 7(5), 457 468.
Ejemplo 13: Cinética de reacción de x-maleimida-PEG-biotinas con mAb T289C después de la preincubación: Medición indirecta de la hidrólisis de maleimida
Las x-maleimida-PEG-biotinas se preincubaron en soluciones amortiguadoras de diferentes pH para evaluar su estabilidad y la eficiencia de la conjugación del tiol a lo largo del tiempo. Este ensayo controla indirectamente la hidrólisis de maleimidas porque las maleimidas hidrolizadas no son reactivas contra los tioles. El anticuerpo con la mutación T289C en Fc se redujo y oxidó como se describe anteriormente y se ajustó a 1,5 mg/mL en PBS con 50 mM de fosfato de sodio pH 7,4. Se prepararon soluciones de maleimida en amortiguador (fosfato de sodio 100 mM pH 5,5, 7,4, 8,6) al combinar 20 |jL de solución de x-maleimida-PEG-biotina (solución 10 mM en DMAc) con 180 |jL de amortiguador al pH deseado (concentración final de x-maleimida-PEG-biotina = 1 mM) y se incubaron a 22 °C por rangos de tiempo determinados antes de la reacción con el mAb. Para las reacciones de conjugación, se combinaron 267 jiL de mAb (1,5 mg/mL, 2,7 nmol, 1 eq) con 5,3 jiL de solución de x-maleimida-PEG-biotina incubada en amortiguador (5,4 nmol, 2 eq). La adición de solución de maleimida no afectó al pH de la solución de mAb. La reacción de conjugación prosiguió a 22 °C por 1,5 h a pH 7,4. Después de la reacción, las muestras se redujeron con DTT (por sus siglas en inglés) a temperatura ambiente por 5 min y se analizaron por espectrometría de masas. El porcentaje de conjugación se calculó usando la ecuación 1. Los resultados se muestran en la Figura 8.
Estos datos demuestran que la reactividad de la maleimida se pierde con el tiempo debido a la hidrólisis. La velocidad de hidrólisis de las maleimidas aumenta en el caso de las N-arilmaleimidas. En general, la hidrólisis de la maleimida es más lenta que la conjugación de tiol-maleimida, lo que explica por qué se observó una conjugación efectiva para las N-arilmaleimidas a pH 8,6. Las vidas medias se pueden comparar usando los datos que se indican a continuación.
Ejemplo 14: Cinética de hidrólisis de maleimida pH 5,5, 22 °C
Los datos de hidrólisis de maleimida también se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de pseudo 1er orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar el ln[maleimida] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 9.
Ejemplo 15: Cinética de hidrólisis de maleimida pH 7,4, 22 °C
Los datos de hidrólisis de maleimida también se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de pseudo 1er orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar el ln[maleimida] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Ejemplo 16: Cinética de hidrólisis de maleimida pH 8,6, 22 °C
Los datos de hidrólisis de maleimida también se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de pseudo 1er orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar el ln[maleimida] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 11.
Resumen de la cinética de hidrólisis de x-maleimida
Tabla 5:<C o n s ta n te s c in é t ic a s p a ra la h id ró lis is d e m a le im id a a 22 °C>
Comparaciones bibliográficas:
1) Hidrólisis de N-fenilmaleimida a pH 7,6, 25 °C kobs =7*10'5 s-1, Oleksandr, K.; Leriche, G.;et al.Selective Irreversible Chemical tagging of cysteine with 3-arylpropiolonitriles.Bioconjug. Chem.2014, 25, 202-206.
2) Hidrólisis de maleimida (sin sustituir) a pH 8,38, 30 °C, kobs = 1,51*10'4 s-1 Khan, M.N. Kinetics and mechanism of the alkaline hydrolysis of maleimide.J. Pharm. Sci.1984, 73(12), 1767-1171.
Estos datos demuestran que la hidrólisis de la maleimida es mucho más lenta que la conjugación de tiol-maleimida, por lo que las N-arilmaleimidas son reactivos útiles para la conjugación. Incluso en el caso más extremo de las F-fenilmaleimidas a pH 8,6, la vida media de hidrólisis de la maleimida es de 6 minutos, mientras que la conjugación con el tiol se completa en 15 segundos.
Ejemplo 17: Cinética de hidrólisis de tiosuccinimida para conjugados con mAb T289C de x-maleimida-PEG-biotina
Los conjugados de mAb x-maleimida-PEG-biotina se incubaron en soluciones amortiguadoras y se monitorizaron por LCMS a lo largo del tiempo para observar la hidrólisis de la tiosuccinimida. En primer lugar, el mAb con la mutación T289C en Fc (0,75 mg, 5 nmol, 1 eq) se hizo reaccionar con x-maleimida-PEG-biotina (50 nmol, 5 mL de una solución madre de 10 mM en DMAC, 10 eq) en 577 mL de PBS, pH 7,2. Se dejó que la reacción de conjugación prosiguiera por 5 minutos y posteriormente se apagó con N-acetilcisteína (500 nmol, 4 mL de 100 mM de solución madre en agua, 100 eq) y se incubó por 5 minutos más. Posteriormente, la mezcla de reacción se combinó con PBS con 0,5 mM de EDTA y 1 M de fosfato de sodio al pH deseado para alcanzar concentraciones finales de 0,65 mg/mL de mAb, 100 mM de fosfato, 0,5 M de EDTA y 150 mM de NaCl. Después de la preparación de la muestra, se extrajo una alícuota y se diluyó 1:3 con amortiguador de fosfato 75 mM pH 5,5 para obtener una muestra de punto temporal inicial. Posteriormente, las muestras se incubaron en las condiciones deseadas y se extrajeron alícuotas en puntos temporales determinados. Todas las muestras se diluyeron inmediatamente 1:3 con el amortiguador de fosfato 75 mM pH 5,5 para detener la reacción de hidrólisis. Posteriormente, las muestras se filtraron estérilmente, se redujeron con TCEP y se analizaron por LCMS. La hidrólisis de la tiosuccinimida se confirmó por la adición de 18 amu al pico del conjugado mAb en el espectro de masas. El análisis semicuantitativo de la hidrólisis se realizó usando las intensidades de los picos en los espectros de masas desconvolusionados y la ecuación 3, que incluye la sustracción de fondo usando la medición T = 0. Posteriormente, los datos se convirtieron en pérdida de tiosuccinimida (M) a lo largo del tiempo y se representaron gráficamente como ln[tiosuccinimida] contra segundos. La pendiente de la línea de mejor ajuste dio la constante de velocidad de primer orden para la hidrólisis de tiosuccinimida. Se realizaron experimentos adicionales para determinar la hidrólisis de la tiosuccinimida a 1 hora, n = 3.
Ejemplo 18: Hidrólisis de tiosuccinimida pH 7,4, 22 °C, para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina
Los datos de hidrólisis de la tiosuccinimida también se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de pseudo 1er orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar el ln[maleimida] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 12.
Ejemplo 19: Hidrólisis de tiosuccinimida pH 7,4, 37 °C, para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina
Los datos de hidrólisis de la tiosuccinimida también se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de pseudo 1er orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar el ln[maleimida] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 13.
Ejemplo 20: Hidrólisis de tiosuccinimida pH 8,6, 22 °C, para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina
Los datos de hidrólisis de la tiosuccinimida también se analizaron en unidades de concentración molar para determinar las constantes cinéticas. Las constantes de velocidad de pseudo 1er orden se determinaron a partir de las pendientes de las curvas generadas al trazar el ln[maleimida] contra el tiempo y el análisis de regresión lineal. Los resultados se muestran en la Figura 14.
Resumen de la cinética de hidrólisis de tiosuccinimida para mAb T289C con PEG-biotina
Conjugados
Tabla 6:Constantes cinéticas para la hidrólisis por tiosuccinimida de conjugados PEG-biotina en la posición T289C del mAb
Estos datos demuestran que la hidrólisis de las N-ariltiosuccinimidas ocurre en una escala de tiempo que se puede aplicar fácilmente a la fabricación, sin cambios drásticos en los procedimientos estándar de conjugación. Por ejemplo, realizar la conjugación de la carga útil a pH 7,4, 22 °C por 24 h permitiría tanto la conjugación como la hidrólisis de tiosuccinimida en un único paso.
Ejemplo 21: Hidrólisis de x-tiosuccinimida para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina después de 1 hora de incubación, n = 3
Los resultados se muestran en la Figura 15 como el promedio ± desviación estándar, n = 3. Estos datos confirman la tendencia observada con los experimentos cinéticos de muestra única, con un conjunto de muestras ampliado. La facilidad de hidrólisis de la tiosuccinimida depende de la química unida al nitrógeno de la cabeza anular, como se indica a continuación: N-alquilo << N-fenilo < N-fluorofenilo. El error relativo de estos experimentos fue típicamente menor a 5 %.
Ejemplo 22: Hidrólisis de x-tiosuccinimida para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina en presencia de molibdato de sodio
Los conjugados de mAb x-Maleimida-PEG-biotina se incubaron en soluciones amortiguador con molibdato de sodio para investigar si este compuesto es capaz de aumentar la hidrólisis de la tiosuccinimida. Las muestras se monitorearon por LCMS a lo largo del tiempo para observar la hidrólisis de la tiosuccinimida, como se describe anteriormente. En primer lugar, el mAb con la mutación T289C en Fc (0,5 mg, 3,3 nmol, 1 eq) se hizo reaccionar con x-maleimida-PEG-biotina (50 nmol, 5 mL de una solución madre de 10 mM en DMAC, 15 eq) en 0,365 mL de PBS, pH 7,2. Se dejó que la reacción de conjugación prosiguiera por 5 minutos y después se apagó con N-acetilcisteína (500 nmol, 4 mL de 100 mM en agua, 151 eq) y se incubó por 5 minutos más. Posteriormente, la mezcla de reacción se combinó con 1 M de PBS con 1 M de molibdato de sodio al pH deseado para alcanzar una concentración final de 100 mM de fosfato y 100 mM de molibdato. Después de adicionar el molibdato, la mezcla se incubó a 22 °C por 1 h. Después de 1 h, las muestras se diluyeron 1:5 con amortiguador de fosfatos 75 mM pH 6,5 para detener la hidrólisis. Posteriormente, las muestras se filtraron estérilmente, se redujeron con TCEP y se analizaron por LCMS. La hidrólisis de la tiosuccinimida se confirmó por la adición de 18 amu al pico del conjugado mAb en el espectro de masas. El análisis semicuantitativo de la hidrólisis se realizó usando las intensidades de los picos en los espectros de masas desconvolusionados y la ecuación 3. Los resultados se muestran en la Figura 16.
Se observaron mejoras notables en la hidrólisis de 2 muestras:
A) F-fenilmaleimida-PEG-biotina pH 5,5
B) F-fenilmaleimida-PEG-biotina pH 7,4
Tabla 7:
Estos datos muestran que solamente las N-fluorofeniltiosuccinimidas responden a la hidrólisis catalizada por molibdato, otras no. Además, los efectos del catalizador disminuyen a pH altos, como era de esperar.
Ejemplo 23: Sensibilidad de los conjugados con mAb T289C al intercambio de tiol en un amortiguador que contiene tioles
Los conjugados biotina-mAb se incubaron en amortiguador acuoso con p-mercaptoetanol (BME) para retar el enlace tiosuccinimida contra la desconjugación. x-Maleimida-PEG-biotinas se conjugaron con mAb con la mutación T289C como se describe anteriormente con una modificación menor. Las reacciones de conjugación se realizaron a 1 equivalente x-PEG-maleimida:tiol por 15 min a 22 °C seguido inmediatamente por dilución a 0,2 mg/mL (1,33 |jM de mAb) con 1X PBS pH 7,2 conteniendo 0,5 mM de EDTA. Se omitió el paso de enfriamiento de la N-acetilcisteína. Para las muestras con BME, se adicionó BME a una concentración final de 1 % v/v (143 mM). Las muestras se incubaron a 37 °C en atmósfera ambiente sin agitación. Se extrajeron alícuotas en distintos puntos temporales, se filtraron estérilmente, se redujeron con DTT y se analizaron por LCMS. Los porcentajes de mAb conjugado y de hidrólisis de tiosuccinimida se determinaron a partir de las alturas de pico de los espectros de masas usando la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente. Los datos de la hidrólisis del mAb desconjugado y de la tiosuccinimida se trazaron como ln[concentración] contra el tiempo (s) para obtener las constantes de velocidad de pseudo primer orden a partir de la pendiente de la línea de mejor ajuste. Los resultados se muestran en la Figura 17.
Ejemplo 24: Estabilidad de conjugados con mAb T289C y PEG-biotina en un amortiguador que contiene BME
Tabla 8:P r m r in i r l n i n PE - i in
Tabla 9:Resumen de los datos iniciales de hidrólisis desconu ación
Los resultados se muestran en la Figura 18. Estos datos muestran que 1) se observó una estabilidad variable entre los distintos tipos de tiosuccinimida en presencia de tiol libre. Las especies de hidrólisis más rápida mostraron menos desconjugación, 2) La N-alquiltiosuccinimida desconjugada en amortiguador simple, carece de un tiol libre.
Además, estos datos demuestran que se puede conseguir una rápida desestabilización inmediatamente después de la conjugación sin ningún tratamiento especial en el caso de la N-fluorofeniltiosuccinimida.
Ejemplo 25: Hidrólisis de tiosuccinimida a pH 7,2, 37 °C para conjugados con mAb T289C y PEG-biotina observados en el ensayo de reto con BME
Los resultados se muestran en la Figura 19.
Tabla 10:<C in é t ic a d e h id ró lis is d e t io s u c c in im id a p a ra c o n ju g a d o s c o n m A b T 289 C y P E G -B io t in a a pH 7 ,2 , 37 °C>
° °
Estos datos muestran que las N-fenil- y N-fluorofeniltiosuccinimidas se hidrolizan completamente en las primeras 24 horas, lo que concuerda con otros datos de hidrólisis. Las N-alquiltiosuccinimidas se hidrolizan mucho más lentamente.
Ejemplo 26: Relación entre la desconiugación de la tiosuccinimida y la hidrólisis observada en el ensayo de reto con BME
Los resultados se muestran en la Figura 20.
Tabla 11:Parámetros cinéticos para la hidrólisis y la desconjugación de la tiosuccinimida determinados a partir del ensayo con BME
Estos datos se representan como desconjugación en el eje izquierdo e hidrólisis en el derecho. La hidrólisis y la desconjugación están claramente relacionadas. La mayor velocidad de hidrólisis limita la cantidad máxima de desconjugación.
Ejemplo 27: Estabilidad de conjugados mAb-Biotina en presencia de tiol libre después de hidrólisis leve
Los conjugados biotina-mAb se incubaron en amortiguador acuoso con p-mercaptoetanol (BME) para retar el enlace tiosuccinimida contra la desconjugación. En este experimento, los conjugados de tiosuccinimida se sometieron a una breve incubación en condiciones ligeramente básicas para facilitar la hidrólisis de la tiosuccinimida antes de la prueba de estabilidad. Las x-maleimida-PEG-biotinas se conjugaron con mAb con la mutación T289C como se describe anteriormente con pequeñas modificaciones. Las reacciones de conjugación se realizaron a 1 equivalente x-PEG-maleimida:tiol por l5 min a 22 °C, seguido de un enfriamiento con N-acetilcisteína (100 eq en relación con el mAb) y una nueva reacción por 5 minutos. Las mezclas de reacción se ajustaron a pH 8,6 por la adición de 10 % v/v de fosfato de sodio (1 M, dibásico) y, posteriormente, se incubaron a 37 °C por 1 h. Posteriormente, las reacciones se dializaron con PBS (pH 7,2) con 0,5 mM de EDTA por 24 h a 4 °C. después de la diálisis, las concentraciones de mAb se confirmaron mediante medición A280 (NanoDrop) y las muestras se diluyeron a 0,2 mg/mL (1,33 |jM de mAb) con 1X PBS pH 7,2 con 0,5 mM de EDTA. Para las muestras con BME, se adicionó BME a una concentración final de 1 % v/v (143 mM). Las muestras se incubaron a 37 °C en atmósfera ambiente sin agitación. Se extrajeron alícuotas en distintos puntos temporales, se filtraron estérilmente, se redujeron con DTT y se analizaron por LCMS. El porcentaje de mAb conjugado y de hidrólisis de tiosuccinimida se determinó a partir de las alturas de pico de los espectros de masas usando la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente. Los datos de la hidrólisis del mAb desconjugado y de la tiosuccinimida se trazaron como ln[concentración] contra el tiempo (s) para obtener las constantes de velocidad de pseudo primer orden a partir de la pendiente de la línea de mejor ajuste.
Ejemplo 28: Sensibilidad de los conjugados mAb T289C al intercambio tiol en amortiguador después de hidrólisis leve
Tabla 12:<P a rá m e tro s c in é t ic o s p a ra la d e s c o n ju g a c ió n d e l c o n ju g a d o d e a lq u il t io s u c c in im id a>
Tabla 13:Resumen de los datos iniciales de hidrólisis desconu ación de los conu ados con mAb T289C PEG-biotina
Estos datos demuestran que 1) la hidrólisis suave estabilizó completamente las N-ariltiosuccinimidas pero no la N-alquiltiosuccinimida. Además, la constante de velocidad de pseudo primer orden para la desconjugación mediada por tiol de N-alquiltiosuccinidas de este experimento coincide estrechamente con el valor del experimento sin prehidrólisis (los datos fueron reproducibles).
Ejemplo 29: Síntesis de N-alquilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE
La maleimidacaproil-valina-citrulina-p-aminobencilcarbonil-mono-metil-Auristatina-E(mc-Val-Cit-PABC-MMAE) se preparó de acuerdo con el método bibliográfico con modificaciones.1 De este modo, se preparó una mezcla de pnitrofenilcarbonato de alcohol mc-Val-Cit-p-aminobencílico (8) recién preparado de acuerdo con el método de la bibliografía2 (265 mg, 0,36 mmol, 1,5 eq), MMAE (9) (169 mg, 0,24 mmol, 1 eq) y N-hidroxibenzotriazol (HOBt) (6,48 mg, 0,048 mmol, 0,2 eq) se agitaron en DMF (5 mL) a RT por 2 min, seguido de la adición de piridina (38 mg, 0,48 mmol, 2 eq). Después de agitar por 24 h, los orgánicos volátiles se eliminaron al vacío. El residuo obtenido se trituró con acetato de etilo y metanol (1 L) para obtener mc-Val-Cit-PAB-MMAE (10) como polvo blanco (220 mg, 0,17 mmol, 71 % de rendimiento) que en general fue > 95 % puro por análisis RP-HPLC. Si es necesario, se puede llevar a cabo una purificación adicional por HPLC preparativa en fase inversa C18 o cromatografía en columna de exclusión por tamaño. Electroaspersión (ES)-MS m/z 1339 (M+Na, pico base), 1317 (M 1).
Referencias:
1) Doronina SO, Toki BE, Torgov MY, Mendelsohn BA, Cerveny CG, Chace DF, DeBlanc RL, Gearing RP, Bovee TD, Siegall CB, Francisco JA, Wahl AF, Meyer DL, Senter PD. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.Nat Biotechnol.2003;21:778-784. 2) Dubowchik Gm , Firestone RA, Padilla L, Willner D, Hofstead SJ, Mosure K, Knipe JO, Lasch, SJ, Trail PA. Cathepsin B-labile dipeptide linkers for lysosomal release of doxorubicin from internalizing immunoconjugates: model studies of enzymatic drug release and antigen-specificin vitroanticancer activity.Bioconjug Chem.2002;13:855-869.
Ejemplo 30: Síntesis de N-fenilacetilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE
A la solución agitada de Val-Cit-PAB-MMAE (100 mg, 0,089 mmol) y éster maleimidafenilacético NHS (4) (43,8 mg, 0,133 mmol) en DMF (1 mL) a temperatura ambiente bajo N<2>se le adicionó DIPEA (57,5 mg, 0,445 mmol). Después de agitar durante toda la noche, el análisis MS indicó la formación del producto con una pequeña cantidad de material de partida presente. La mezcla se inició separada por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna LH-20, eluyendo con MeOH/diclorometano (v/v 1:1). Las fracciones se controlaron por MS y se combinaron las con el producto deseado. Después de evaporación a sequedad al vacío, se obtuvieron 25 mg (0,0187 mmol, 21 % de rendimiento) de un material aceitoso. La MS mostró un grupo de iones a m/z 1391 (M+Cl+Na), 1369 (M+Cl, pico base), 1360 (M+Na) y 1337 (M+1), mientras que la HPLC mostró dos picos a una relación de aproximadamente 2: 1. La purificación posterior por HPLC semipreparativa resultó en 2 fracciones principales de 5 mg y 6 mg, respectivamente, después de evaporación. Sin embargo, estas dos muestras mostraron esencialmente la misma HPLC y MS.
Ejemplo 31: Preparación de conjugados de N-fenilmaleimida Val-Cit-PAB-MMAE y mAb T289C
La N-fenilacetilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE se conjugó con mAb (con una mutación T289C en Fc) en varios pasos. En primer lugar, los mAb se redujeron ligeramente para generar sulfhidrilos libres al combinar 5 mL de solución de mAb de 1,6 mg/mL en PBS 10 mM, pH 7,2 (8 mg de mAb, 53,3 nM, 1 eq) con 43 |jL de solución de TCEP 50 mM en agua (2,15 |jmol, 40 eq) seguido de una mezcla suave a 37 °C por 1 h. El mAb reducido se transfirió a un casete de diálisis de deslizamiento (10K MWCO) y se dializó contra PBS, 1 mM de EDTA, pH 7,2-7,8, 4 °C por 24 horas con varios cambios de amortiguador. El mAb reducido se oxidó para reformar los disulfuros internos por la adición de ácido dehidroascórbico (21 jiL de 50 mM de solución madre en d Ms O, 1,1 jmol, 20 eq) seguido de una mezcla suave por 4 h a temperatura ambiente. La solución de mAb oxidada (2,5 mL, 27 nmol, 1 eq) se combinó con DMSO a 10 % v/v seguido de la adición de N-fenilacetilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE (27 j L de una solución madre de 10 mM en DMSO, 270 nmol, 10 eq). La reacción prosiguió a temperatura ambiente con agitación por 1 hora y, a continuación, se adicionó N-acetilcisteína (21<j>L de 100 mM de solución madre en agua, 2,2 jmol, 80 eq) para detener la reacción. Posteriormente, la mezcla de reacción se diluyó 3 veces con agua destilada y se sometió a cromatografía CHT (por sus siglas en inglés) para eliminar el fármaco libre no conjugado (columna de medios Bio-Scale Mini Cartridge CHT Type 1140 jm ). El ADC se eluyó con un gradiente de amortiguador A (10 mM de fosfato, pH 7,0) a amortiguador B (10 mM de fosfato pH 7,0 con 2 M de NaCl) por 25 minutos. Después de la cromatografía CHT, la muestra se intercambió a 1X PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA, pH 7,2, por diálisis en un casete de deslizamiento a 4 °C. Para las muestras sometidas a hidrólisis leve, se adicionó una solución de fosfato de sodio al 10 % v/v (1 M, dibásico) y la solución se incubó a 37 °C por 1 h. Posteriormente, las muestras hidrolizadas se amortiguaron por diálisis en 1X PBS (pH 7,2) con 0,5 mM de EDTA. Los ADC se caracterizaron por LCMS de glicosilación reducida como se describe anteriormente. La eficiencia de la conjugación y la DAR se calcularon usando la ecuación 1 y la ecuación 2, respectivamente.
La N-alquil maleimida-Val-Cit-PAB-MMAE se conjugó con mAb (que comprendía una mutación T289C en Fc) de la misma manera que N-fenilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE(vide supra).
Ejemplo 32: Análisis de los ADC mc-PAB-MMAE y mAb T289C
En la Figura 22 se muestran datos representativos de espectrometría de masas con glicosilación reducida para conjugados mAb x-maleimida-Val-Cit-PAB-MMAE-T289C.
Tabla 14:
Resumen de los datos de conjugación del mAb MMAE T289C
Tabla 15:<C o n ju g a c ió n 1>
Tabla 16:Conu ación 2
Tabla 17:n i n
Ejemplo 32: Estabilidad de conjugados mAb MMAE-T289C en amortiguador que contiene tiol
Los conjugados MMAE-mAb se incubaron en amortiguador acuoso con p-mercaptoetanol (BME) para retar el enlace tiosuccinimida hacia las reacciones de intercambio de tioles. Los MMAE se conjugaron con mAb con la mutación T289C como se describe anteriormente. Después de la conjugación, los conjugados se purificaron inmediatamente mediante cromatografía CHT para eliminar el fármaco no conjugado. Posteriormente, las muestras se sometieron a una breve diálisis (casete Slide-a-lizer, 10 kDa MWCO, 4 °C, 2 h) para cambiar el amortiguador a 1X PBS, pH 7,2 con 0,5 mM de EDTA. Después de la diálisis, las muestras se diluyeron a 0,2 mg/mL (1,33 |jM mAb) con 1X PBS pH 7,2 con 0,5 mM de EDTA. Para las muestras con BME, se adicionó BME a una concentración final de 1 % v/v (143 mM). Las muestras se incubaron a 37 °C en atmósfera ambiente sin agitación. Se extrajeron alícuotas en distintos puntos temporales, se filtraron estérilmente, se redujeron con DTT y se analizaron por LCMS. Los porcentajes de mAb conjugado y de hidrólisis de tiosuccinimida se determinaron a partir de las alturas de pico de los espectros de masas usando la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente. Los datos de la hidrólisis del mAb desconjugado y de la tiosuccinimida se trazaron como ln[concentración] contra el tiempo (s) para obtener las constantes de velocidad de pseudo primer orden a partir de la pendiente de la línea de mejor ajuste.
Ejemplo 33: Estabilidad de conjugados mAb MMAE T289C en amortiguador que contiene tiol (BME)
Los resultados se muestran en la Figura 23.
Tabla 18:Parámetros cinéticos ara la desconu ación del conu ado de al uiltiosuccinimida
Tabla 19:<R e s u m e n d e lo s d a to s in ic ia le s d e h id ró lis is y d e s c o n ju g a c ió n>
Estos datos muestran que la MMAE se desconjuga en un amortiguador que contiene tiol y que los conjugados preparados con una N-alquilmaleimida son menos estables que la MMAE conjugada con una N-fenilmaleimida.
Ejemplo 34: Hidrólisis de MMAE-tiosuccinimidas en conjugados mAb T289C
Los resultados se muestran en la Figura 24.
Tabla 20:P r m r in i r l n i n l n l ili inimi
Estos datos muestran que la MMAE conjugada con una N-alquilmaleimida es menos estable que la MMAE conjugada con una N-fenilmaleimida en presencia de tioles libres. No se muestran los gráficos de ln usados para calcular las constantes de velocidad.
Ejemplo 35: Estabilidad de conjugados mAb MMAE T289C en amortiguador que contiene tiol (BME)
Los resultados se muestran en la Figura 25.
Tabla 21:R m n l ini i l hi r li i n i n l n MMAE
Estos datos muestran que 1) la MMAE conjugada con una N-alquilmaleimida es menos estable que la MMAE conjugada con una N-fenilmaleimida en presencia de tioles libres, 2) los conjugados de N-alquilmaleimida-MMAE son menos sensibles a la hidrólisis leve que el análogo de PEG-biotina, 3) la hidrólisis leve no mejora la estabilidad de los conjugados de N-alquilmaleimida-MMAE, 4) los conjugados de N-fenilmaleimida-MMAE son muy sensibles a la hidrólisis suave, pero este paso no es necesario para conseguir una alta estabilidad, 5) la N-fenilmaleimida se hidroliza espontáneamente mucho más que la N-alquilmaleimida cuando se somete a procesos de purificación idénticos.
Ejemplo 36: Comparación de la hidrólisis de PEG-biotina y tiosuccinimida de MMAE observada en el reto con BME
Los resultados se muestran en la Figura 26.
Tabla 22:Cinética de hidrólisis de la tiosuccinimida para el conjugado mAb T289C
Estos datos demuestran que las tiosuccinimidas de hidrólisis lenta se ven afectadas significativamente por la química previa a la maleimida. La química hidrofílica PEG-biotina aumentó la velocidad de hidrólisis ~3 -5 veces en comparación con la carga útil hidrofóbica MMAE.
Ejemplo 37: Comparación de la desconiugación en presencia de B-mercaptoetanol: PEG-biotina contra carga útil de MMAE
Los resultados se muestran en la Figura 27.
Tabla 23:Parámetros cinéticos para la hidrólisis y la desconjugación de la tiosuccinimida determinados a partir del ensayo con BME
Ejemplo 38: Estabilidad de los ADC MMAE-T289C en suero de ratón
Los ADC de MMAE se incubaron en suero de ratón para retar el enlace de tiosuccinimida hacia la desconjugación. Las MMAE se conjugaron con mAb con la mutación T289C para producir el ADC deseado como se describe anteriormente. Después de la conjugación del fármaco, los ADC se purificaron inmediatamente por cromatografía CHT para eliminar el fármaco no conjugado. Posteriormente, las muestras se sometieron a una breve diálisis (casete slide-a-lyzer, 10 kDa MWCO, 4 °C, 2 h) para cambiar el amortiguador a 1X PBS, pH 7,2 con 0,5 mM de ED<t>A. Después de la diálisis, se determinaron las concentraciones de mAb mediante la medición A280 (NanoDrop) y, a continuación, se adicionaron al suero normal de ratón (Jackson Immunoresearch) para alcanzar una concentración final de 0,2 mg/mL (1,33 |jM mAb). El volumen total de ADC adicionado al suero fue menor a 10 %. La mezcla ADC-suero se filtró estérilmente y se incubó a 37 °C en un recipiente sellado sin agitación. Se extrajeron alícuotas en varios puntos temporales y se congelaron. El anticuerpo humano conjugado y no conjugado se recuperó del suero de ratón mediante inmunoprecipitación usando resina de agarosa anti-IgG humana específica para Fc (Sigma-Aldrich). En primer lugar, la resina se enjuagó dos veces con PBS, una vez con amortiguador de elución de IgG y, posteriormente, dos veces más con PBS. Posteriormente, las muestras de suero de ratón y ADC se combinaron con resina IgG antihumana (100<j>L de mezcla de suero y ADC, 50<j>L de suspensión de resina) y se mezclaron suavemente por 15 minutos a temperatura ambiente. Se recuperó la resina por centrifugación y posteriormente se lavó dos veces con PBS. El precipitado de resina se resuspendió en 100 j L de amortiguador de elución de IgG (Thermoscientific) y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. La resina se eliminó por centrifugación y, a continuación, se adicionaron 20<j>L de Tris 1 M, pH 8,0 al supernadante. La solución de anticuerpo humano recuperada se filtró estérilmente, se redujo con DTT y se analizó por LCMS. Los porcentajes de mAb conjugado y de hidrólisis de tiosuccinimida se determinaron a partir de las alturas de pico de los espectros de masas usando la Ecuación 1 y la Ecuación 2, respectivamente. Los datos de la hidrólisis del mAb desconjugado y de la tiosuccinimida se trazaron como ln[concentración] contra el tiempo (s) para obtener las constantes de velocidad de pseudo primer orden a partir de la pendiente de la línea de mejor ajuste.
Los resultados se muestran en la Figura 28.
Tabla 24:Parámetros cinéticos de la hidrólisis y la desconjugación de la tiosuccinimida determinados a partir del ensayo de estabilidad en suero de ratón
Estos datos muestran que 1) los ADC preparados con N-fenilmaleimida son más estables que los ADC preparados con N-alquilmaleimidas, 2) la hidrólisis de la N-feniltiosuccinida ocurre más rápidamente que la hidrólisis de la N-alquiltiosuccinimida, 3) la desconjugación del tiol ocurre ligeramente más lentamente que la hidrólisis de la tiosuccinimida para la N-alquiltiosuccinimida, por lo que no se observa una desconjugación completa, las tasas son similares para las cargas útiles solubles e insolubles. En el caso de las cargas útiles solubles, la desconjugación máxima observada es menor, presumiblemente debido a la mayor velocidad de hidrólisis de la tiosuccinimida.
La Figura 29A muestra la desconjugación e hidrólisis de alquil tiosuccinimida, pH 7,2 a 37 °C más BME. Estos datos demuestran que la desconjugación está enlazada a la hidrólisis de la tiosuccinimida. La desconjugación se estabiliza una vez alcanzada la hidrólisis máxima de tiosuccinimida, lo que concuerda con los experimentos de reto con BME.
La Figura 29B muestra la desconjugación de ADC en suero de ratón 7 días a37 °C como promedio /desviación estándar (n = 3). Este experimento es el mismo ensayo de estabilidad del suero descrito anteriormente, realizado por triplicado contra a un punto temporal. Los datos muestran que la N-alquilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE ADC es menos estable que la N-fenilmaleimida-Val-Cit-PAB-MMAE ADC. El error relativo de este experimento fue normalmente menor a 10 %.
Ejemplo 39: Actividad de los ADC contra a células cancerosas MDA-MB-361 después de incubación en suero de ratón
En estos estudios se usaron células de cáncer de mama MDA-MB-361 con alta expresión de 5T4. Las células se sembraron en 80 |<j>L de RPMI1640 con 10 % de FBS (por sus siglas en inglés) en placas de 96 pozos de fondo plano a razón de 2.000 células MDA-MB-361/pozo. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Se preparó una concentración 5X de cada ADC diluyendo los artículos de prueba en medio de cultivo. Se adicionaron 20 microlitros de cada artículo de ensayo a las células por duplicado de modo tal que la curva de dosis final oscilara entre 50 ng/mL y 0,76 pg/mL en una serie de diluciones seriadas 1:4 paso a paso. Las células tratadas se cultivaron a 37 °C/5 % de CO<2>por 6 días y la viabilidad celular se evaluó con el ensayo de viabilidad luminiscente CellTiter-Glo de Promega. Se adicionaron 100<j>L de reactivo CTG reconstituido a cada pozo, se agitó ligeramente por 10 minutos a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia de cada muestra a 560 nm usando un luminómetro Perkin Elmer EnVision. El porcentaje de viabilidad celular se calculó por la siguiente fórmula: (luminiscencia promedio de las muestras tratadas/luminiscencia promedio de las muestras de control no tratadas) x 100. Los valores de IC<50>se determinaron por análisis de regresión no lineal logística con el software GraphPad Prism.
Los resultados se muestran en la Figura 30 como promedio ± error relativo, n = 2. Estos datos demuestran que la potencia de los ADC se conserva en los ADC estables (N-fenilo) y se pierde en los ADC inestables (N-alquilmaleimida).
Ejemplo 40: Ligantes heterobifuncionales para estabilización de tiosuccinimida y conjugación de carga útil
1) N-fluorofenilmaleimida-PEG4-BCN
3) N-alquilmaleimida-PEG^BCN SynChem catálogo producto #SC5009495 % pureza
Se preparó una serie de enlazadores heterobifuncionales que comprendían maleimidas basadas en alquilo o N-arilo y funcionalidad PEG-BCN. El grupo BCN es reactivo contra a las azidas en una reacción conocida como "conjugación clic sin cobre".
Ejemplo 41: Síntesis de N-fluorofenilmaleimida-PEG-BCN
La reacción del anhídrido maleico (10a, 0,313 g, 3,19 mmol) y el ácido 5-amino-2-fluorobenzoico (11b, 0,5 g, 3,22 mmol) en AcOH glacial a reflujo proporcionó el crudo 9c (0,72 g) como sólido amarillo después del trabajo. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para obtener 0,21 g (0,89 mmol, 28 % de rendimiento) de 9c como sólido amarillo claro.
La maleimida activada por NHS (6) se preparóin situa partir de(13) y se usó sin purificar. De este modo, (13) (0,137 g, 0,582 mmol) se hizo reaccionar con N-hidroxisuccinimida (0,074 g, 0,64 mmol) en presencia de DCC (0,144 g, 0,698 mmol) en DME (5 mL) a temperatura ambiente por 1 h. después de eliminar el sólido precipitado (DCU) por filtración, el filtrado con el éster activado (6) se adicionó gota a gota a una solución de endo-2 (0,2 g, 0,485 mmol) en DME (2 mL) a temperatura ambiente mientras se agitaba con N<2>. Después de 1 h, los análisis por TLC y MS indicaron la finalización de la reacción. El exceso de DME se concentró al vacío y el residuo bruto obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice bajo N<2>, eluyendo con acetato de etilo seguido de MeOH al 4 % en DCM, para proporcionar (14) (0,24 g, 0,38 mmol, 78,6 % de rendimiento) como aceite amarillo claro. Los datos de 1H NMR y MS confirmaron la estructura química; la HPLC indicó una pureza de 94 %. MS (ESI) m/z 629,3 (M+1), 647,8 (M+H<2>O), 652,8 (M+Na, pico base).
Ejemplo 42: Síntesis de N-fenilmaleimida-PEG-BCN
La reacción entre (4) (0,191 g, 0,582 mmol) y endo-2 (0,2 g, 0,485 mmol) en DME (5 mL) se completó en 1 h a temperatura ambiente bajo N<2>, como indicaron tanto la TLC como la MS. El exceso de DME se eliminó al vacío y el residuo bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice bajo presión de N<2>, eluyendo con acetato de etilo seguido de MeOH al 4 % en DCM. Las fracciones con el producto se agruparon y se concentraron al vacío. El residuo se disolvió en DCM y se transfirió a un vial bajo N<2>. El exceso de disolvente se eliminó por burbujeo de N<2>para proporcionar (15) (0,26 g, 85 % de rendimiento) como aceite amarillo claro. Los datos de 1H NMR y EM confirmaron la estructura química, con contaminación de disolventes residuales. MS (ESI) m/z 626,5 (M+1), 643,5 (M+H<2>O), 648,8 (M+Na, pico base).
Ejemplo 43: Procedimiento general de conjugación de x-maleimida-PEG-BCN con mAbs
Las x-maleimida-PEG-BCN se conjugaron con mAb (con una mutación T289C en Fc) en varios pasos. En primer lugar, los mAb se redujeron ligeramente para generar sulfhidrilos libres al combinar 5 mL de solución de mAb de 1,6 mg/mL en PBS 10 mM, pH 7,2 (8 mg de mAb, 53,3 nM, 1 eq) con 43 pL de solución de TCEP 50 mM en agua (2,15 pmol, 40 eq) seguido de una mezcla suave a 37 °C por 1 h. El mAb reducido se transfirió a un casete de diálisis de deslizamiento (10K MWCO) y se dializó contra PBS, 1 mM de EDTA, pH 7,2-7,8, 4 °C por 24 horas con varios cambios de amortiguador. El mAb reducido se oxidó para reformar los disulfuros internos por la adición de ácido dehidroascórbico (21 pL de 50 mM de solución madre en DMS<o>, 1,1 pmol, 20 eq) seguido de una mezcla suave por 4 h a temperatura ambiente. La solución de mAb oxidada se ajustó a 1,3 mg/mL de mAb al adicionar PBS. A continuación, se alicuotaron 1,15 mL de solución de mAb (1,5 mg, 10 nmol, 1 eq) en un vial seguido de la adición de solución madre de x-maleimida-PEG-BCN (solución madre 10 mM en DMAc, 20 nmol, 2 eq). La mezcla de reacción se agitó brevemente en vórtex y se incubó por 1 h a 22 °C, después de lo cual se adicionó N-acetliccisteína (10 pL de una solución 100 mM en agua, 1 pmol, 100 eq) y se incubó por 15 minutos para apagar la maleimida que no había reaccionado. Todas las reacciones de conjugación se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22 °C) bajo atmósfera ambiente. Cabe señalar que 2 eq x-maleimida-PEG-BCN en relación con el mAb = 1 eq x-maleimida-PEG-BCN en relación con la cisteína libre contenida en el mAb. Este procedimiento general se modificó de acuerdo con fuera necesario para lograr la estequiometría de reacción deseada (es decir, diferentes alimentaciones de maleimida:mAb). Los conjugados se analizaron por espectrometría de masas con glicolilación reducida y la eficiencia de la conjugación se determinó usando la ecuación 1.
Ejemplo 44: Análisis por espectrometría de masas del conjugado N-fenilmaleimida-PEG-BCN-mAb
En la Figura 31 y la Tabla 25 se muestran datos representativos de espectrometría de masas para el conjugado W-fenil-PEG-BCN-mAb preparado con 4 equivalentes de reticulante:
Tabla 25:
La N-fenilmaleimida-PEG-BCN se conjugó eficiente y específicamente con el mAb con la mutación T289C. No se observó ninguna conjugación adicional en la cadena pesada ni en la cadena ligera hasta 10 equivalentes molares de reticulante.
Ejemplo 45: Análisis por espectrometría de masas del conjugado N-fluorofenilmaleimida-PEG-BCN-mAbLos datos representativos de espectrometría de masas para el conjugado N-fluorofenil-PEG-BCN-mAb preparado a 4 equivalentes de reticulante se muestran en la Figura 32 y la Tabla 26:
Tabla 26:
La N-fluorofenilmaleimida-PEG-BCN se conjugó efectiva y específicamente con el mAb con la mutación T289C. No se observó ninguna conjugación adicional en la cadena pesada ni en la cadena ligera hasta 10 equivalentes molares de reticulante.
Ejemplo 46: Análisis por espectrometría de masas del conjugado N-alquilmaleimida-PEG-BCN-mAbResumen de los datos de espectrometría de masas para el conjugado N-alquil-PEG-BCN-mAb preparado a 4 equivalentes de reticulante en la Figura 33 y a continuación:
Tabla 27:
La N-alquil-maleimida-PEG-BCN se conjugó efectiva y específicamente con el mAb con la mutación T289C. No se observó ninguna conjugación adicional en la cadena pesada ni en la cadena ligera hasta 10 equivalentes molares de reticulante.
Ejemplo 47: Eficiencia de conjugación de x-maleimida-PEG-BCNs con mAb T289C
Los resultados se muestran en la Figura 35. Todos los reticulantes se conjugaron efectivamente con el mAb con la mutación T289C. La conjugación completa se observa por encima de 2 equivalentes de maleimida.
Ejemplo 48: Cinética de hidrólisis de tiosuccinimida para conjugados PEG-BCN
Los conjugados de x-maleimida-PEG-BCN-mAb se incubaron en soluciones amortiguador y se monitorizaron mediante LCMS a lo largo del tiempo para observar la hidrólisis de la tiosuccinimida. Los mAbs T289C conjugados se diluyeron a 0,22 mg/mL con 1X PBS con 0,5 mM de EDTA, pH 7,2 y luego se adicionó ditiotreitol (0,5 M de solución madre en agua) para alcanzar una concentración final de 42 mM. Las muestras se colocaron en el automuestreador LCMS a 22 °C y se inyectaron periódicamente. La hidrólisis de la tiosuccinimida se confirmó por la adición de 18 amu al pico del conjugado mAb en el espectro de masas. El análisis semicuantitativo de la hidrólisis se realizó usando las intensidades de los picos en los espectros de masas desconvolusionados y la ecuación 3, que incluye la sustracción de fondo usando la medición T = 0. Posteriormente, los datos se convirtieron en pérdida de tiosuccinimida (M) a lo largo del tiempo y se representaron gráficamente como ln[tiosuccinimida] contra segundos. La pendiente de la línea de mejor ajuste dio la constante de velocidad de primer orden para la hidrólisis de tiosuccinimida. Los resultados se muestran en la Figura 36 y en la Tabla 28.
Tabla 28:Constantes cinéticas ara la hidrólisis con tiosuccinimida de conu ados de mAb T289C PEG-BCN
Los conjugados de x-maleimida-PEG-BCN se hidrolizan siguiendo una tendencia similar a la observada para los conjugados PEG-biotina; es decir, F-feniltiosuccinimida > feniltiosuccinimida >> alquiltiosuccinimida.
Ejemplo 49: Adición secuencial de cargas útiles al mAb T289C
El conjugado N-fenilmaleimida-PEG-BCN-mAb (100 pL de solución de 1,3, mg/mL en PBS con 0,5 mM de EDTA, 0,87 nmol) se combinó con AC4GlcNAz (1 pL de 500 mM de solución madre en DMSO, 500 nmol). La solución de reacción se incubó a temperatura ambiente sin agitación por 1 h a 22 °C. Para los estudios de reactividad a largo plazo, el conjugado mAb-BCN se almacenó a 4 °C en PBS con EDTA 0,5 mM, pH 7,2 y se extrajeron alícuotas que se hicieron reaccionar con AC4GlcNAz, como se ha descrito anteriormente. Los conjugados se analizaron por espectrometría de masas de glicosilación reducida y la eficiencia de la conjugación se determinó usando la ecuación 1.
Los análisis de los conjugados mAb-BCN-Ac4GlcNAz se muestran en la Figura 37. Los grupos BCN reaccionaron completamente con AC4GlcNAz.
Ejemplo 50: Reactividad del conjugado mAb-BCN después del almacenamiento
Los resultados se muestran en la Figura 38 y la Tabla 29.
Tabla 29:Resumen de la reactividad del BCN después de la conjugación del reticulante con el mAb y el almacenamiento a 4 °C
Se observó una reacción cuantitativa de BCN en todas las muestras. La espectrometría de masas no detectó mAb-BCN sin reaccionar. Los grupos BCN no muestran pérdida de reactividad por > 21 días después de la conjugación y el almacenamiento a 4 °C.
Ejemplo 51: Conjugación de azido-PBD con mAb modificado con BCN
Los conjugados de mAb N-fenilmale¡m¡da-PEG-BCN-T289C se prepararon como se describe anteriormente (a 1,5 mg/mL de mAb) y se almacenaron a 4 °C hasta la reacción con azido-PBD. Para la conjugación PBD, la solución mAb se combinó primero con DMSO para alcanzar una concentración final de 30 % v/v de DMSO y 1,05 mg/mL de mAb-BCN. A continuación, se transfirió la solución mAb-BCN/DMSO (1,89 mL, 13 nmol mAb, 1 eq) a un vial y se adicionó azido-PBD (16 |<j>L de 10 mM de solución madre en DMSO, 160 nmol, 12 eq). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C por una hora y después a 22 °C por 18 h. La mezcla de reacción se purificó primero por diálisis (casete de deslizamiento de 10K MWCO, 1X PBS con 0,5 mM de EDTA, pH 7,2, 4 °C, 18 h) y posteriormente por cromatografía CHT como se describe anteriormente. Los productos de la reacción se analizaron por espectrometría de masas de glicosilación reducida. La eficiencia de la conjugación y la DAR se calcularon usando la ecuación 1 y la ecuación 2, respectivamente.
Ejemplo 52: Análisis de conjugados mAb-PBD
En la Figura 38 se muestran datos representativos de espectrometría de masas para el mAb T289C dirigido a 5T4 -conjugado de N-fenilmaleimida-PEG-BCN.
Tabla 30:R m n n mA -PBD r r r i i n n i l T2
Ejemplo 53: Actividad in v itro de ADC mAb-BCN-PBD contra a células de cáncer de mama MDA-MB-361
En estos estudios se usaron células de cáncer de mama MDA-MB-361 con alta expresión de ST4. Las células se sembraron en 80<j>L de RPM11640 con 10 % de FBS en placas de 96 pozos de fondo plano a razón de 2.000 células MDA-MB-361/pozo. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Se preparó una concentración 5X de cada ADC diluyendo los artículos de prueba en medio de cultivo. Se adicionaron 20 microlitros de cada artículo de ensayo a las células por triplicado de modo tal que la curva de dosis final oscilara entre 50 ng/mL y 0,76 pg/mL en una serie de diluciones seriadas 1:4 paso a paso. Las células tratadas se cultivaron a 37 °C/5 % de CO<2>por 6 días y la viabilidad celular se evaluó con el ensayo de viabilidad luminiscente CellTiter-Glo de Promega. Se adicionaron 100 j L de reactivo CTG reconstituido a cada pozo, se agitó ligeramente por 10 minutos a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia de cada muestra a 560 nm usando un luminómetro Perkin Elmer EnVision. El porcentaje de viabilidad celular se calculó por la siguiente fórmula: (luminiscencia promedio de las muestras tratadas/luminiscencia promedio de las muestras de control no tratadas) x 100. Los valores de IC<50>se determinaron por análisis de regresión no lineal logística con el software GraphPad Prism.
Los resultados se muestran en la Figura 40 y la Tabla 25.
Tabla 31:Resumen de los valores DAR otenciain vitrodel conu ado PBD

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar un anticuerpo conjugado con una carga útil que comprende el paso de: a realizar una reacción de adición de Michael con la entidad de maleimida de la molécula de fórmula(I):
    y una molécula de anticuerpo que comprende al menos un grupo tiol, en donde: n es 0 o 1; m es 0 o 1; q es 0 o un número entero en el rango de 1 a 12, por ejemplo, de 1 a 6, tal como 2 o 3; Q es un enlace o un residuo de un componente de conjugación; X es alquileno de C<0-18>, arileno de C6-36, en donde el arilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>, y -(OCH<2>CH<2>V OR3; Y es C(O) Z es una cadena de alquenilo de C<1-30>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos (tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más (tales como 1,2, 3 o 4) sustituyentes C(O); R1 es H, una superficie sólida o una molécula de carga útil; R3 es H o alquilo de C<1-6>; R4 es H o alquilo de C<1-6>; R5 es H o alquilo de C<1-6>; b) en donde R1 es una molécula de carga útil o una superficie sólida que hidroliza la entidad de tiosuccinimida resultante formada por la reacción del compuesto de fórmula (I) y el anticuerpo, o c) en donde R1 es H realizando una conjugación con una carga útil, un componente de conjugación o una superficie sólida, seguida de la hidrólisis de la entidad de tiosuccinimida formada por la reacción del compuesto de fórmula (I) y el anticuerpo.
  2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X es alquileno de C<0-15>, arilo de C<6-10>.
  3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde n es 1 en la fórmula(II):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q, Z, X y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
  4. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde n es 0 de fórmula (III):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q, Z, X y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
  5. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en donde la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula (IIa):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I), y el fenilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de Ci-6, alcoxilo de Ci-6, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH2CH2)q-OR3.
  6. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónparacomo se muestra en el compuesto de fórmula (llaa):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH2CH2)q-OR3.
  7. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónmetacomo se muestra en el compuesto de fórmula (llaa’):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1,Q, Z y m s e definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH2CH2)q-OR3.
  8. 8. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1, 3 o 5, en donde la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula (llaaa):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I), el fenilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH<2>CH<2>V O R<3>, y Z’ es una cadena de alquenilo de C<1-24>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más sustituyentes C(O).
  9. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el grupo R1Q(Z’)mNC(O)- está en posiciónmetaopara.
  10. 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o -3 en donde la entidad de maleimida está en una molécula de fórmula (Mb):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH2CH2)q-OR3.
  11. 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónparacomo se muestra en el compuesto de fórmula(IIbb):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde n, Q, Z, X, R1 y m se definen anteriormente en la reivindicación 1.
  12. 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el grupo R1Q(Z)mC(O)- está en la posiciónmetacomo se muestra en el compuesto de fórmula (llbb’):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde Q, Z, X, R1 y m se definen anteriormente en la reivindicación 1.
  13. 13. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 3 o 10, en donde la entidad de maleimida está en una molécula de fórmula llbbb :
    en donde R1, Q y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula(I) y el fenilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH<2>CH<2>V O R<3>. Z’ es una cadena de alquileno de C<1-24>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más sustituyentes C(O).
  14. 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el grupo R1Q(Z’)mNC(O)- está en la posiciónmetaopara del anillo fenilo.
  15. 15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 4, en donde la molécula de maleimida se encuentra en un compuesto de fórmula Illa :
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I), y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -n R4R5, (OCH<2>CH<2>V O R<3>.
  16. 16. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 4, en donde el grupo R1Q(Z)m- está en la posiciónparacomo se muestra en el compuesto de fórmula (lllaa):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q, Z y m se definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH<2>CH<2>V O R<3>.
  17. 17. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 4, en donde el grupo R1Q(Z)m- está en la posiciónmetacomo se muestra en el compuesto de fórmula (lllaa’):
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1,Q, Z y m s e definen anteriormente para compuestos de fórmula (I) y el fenilo tiene 0, 1, 2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, (OCH2CH2)q-OR3.
  18. 18. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 3 o 14, en donde la molécula de maleimida está en un compuesto de fórmula lllaaa :
    y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde R1, Q y m se definen anteriormente para los compuestos de fórmula (I), el fenilo tiene 0, 1,2, 3 o 4 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que comprende halógeno, hidroxilo, alquilo de C<1-6>, alcoxilo de C<1-6>, -COOR3, -COR3, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -SO<2>, -SO<3>, -NR4R5, -PO<4>y -(OCH<2>CH<2>V O R<3>, y Z’ es una cadena de alquileno de C<1-24>ramificada o no ramificada, saturada o insaturada, en donde uno o más carbonos están opcionalmente sustituidos de forma independiente por -O-, N y la cadena lleva opcionalmente uno o más sustituyentes C(O).
  19. 19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde Z o Z’ representa un alquileno de C<1>-12- o -(CH2CH2O)1-8-.
  20. 20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde R1 se selecciona del grupo que comprende una toxina, una molécula de fármaco (como un agente citotóxico), un polímero, un anticuerpo o un fragmento de unión de los mismos.
  21. 21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la molécula de fármaco se selecciona del grupo que comprende una auristatina, por ejemplo, seleccionada del grupo que comprende una tubulisina, una pirrolobenzodiazepina (PBD), MMAE (monometilauristatina E) y MMAF (monometilauristatina F).
ES15782151T 2014-10-01 2015-10-01 Método para conjugar un polipéptido Active ES2969960T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462058502P 2014-10-01 2014-10-01
PCT/US2015/053397 WO2016054315A1 (en) 2014-10-01 2015-10-01 Method of conjugating a polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2969960T3 true ES2969960T3 (es) 2024-05-23

Family

ID=54337383

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15782151T Active ES2969960T3 (es) 2014-10-01 2015-10-01 Método para conjugar un polipéptido

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20170304460A1 (es)
EP (1) EP3200829B1 (es)
JP (1) JP6863888B2 (es)
CN (1) CN106922129B (es)
AU (1) AU2015324924B2 (es)
BR (1) BR112017006602A2 (es)
CA (1) CA2962783A1 (es)
ES (1) ES2969960T3 (es)
RU (1) RU2715905C2 (es)
WO (1) WO2016054315A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3008678A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
GB201602356D0 (en) * 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US20190328901A1 (en) 2016-06-17 2019-10-31 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cells
SG10202102897PA (en) 2017-01-20 2021-04-29 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for the depletion of cd137+ cells
CN108358995B (zh) * 2017-01-25 2021-07-06 四川大学 CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用
WO2018147641A1 (ko) * 2017-02-07 2018-08-16 한미약품 주식회사 비펩티드성 중합체 링커 화합물, 그 링커 화합물을 포함하는 결합체, 및 이들의 제조방법
UA123889C2 (uk) 2017-02-08 2021-06-16 Ейдісі Терапьютікс Са Кон'югати піролобензодіазепін-антитіло
CN108864258A (zh) * 2017-05-12 2018-11-23 北京康明海慧生物科技有限公司 具有抑制肿瘤功能的peg化多肽及其制备方法与应用
CN114173877A (zh) 2019-05-06 2022-03-11 施科友智能化学疗法公司 用于治疗癌症的新的治疗载体和前药
CN116744943A (zh) * 2020-12-04 2023-09-12 达因疗法公司 抗体-寡核苷酸复合物及其用途
WO2024102603A1 (en) * 2022-11-07 2024-05-16 Merck Sharp & Dohme Llc Bisecting-glycan bridged conjugation for producing glycoprotein conjugates

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US5830912A (en) 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
AU2156802A (en) 2000-12-13 2002-06-24 Borean Pharma As Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of c-type lectin-like domains
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20030082630A1 (en) 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
AU2003253048A1 (en) 2002-07-09 2004-01-23 Morphochem Aktiengellschaft Fur Kombinatorische Chemie Tubulysin conjugates
CA2872136C (en) 2002-07-18 2017-06-20 Merus B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
JP4871126B2 (ja) 2003-07-04 2012-02-08 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
EP1675857B1 (en) 2003-10-22 2011-07-13 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
SG149004A1 (en) 2003-12-05 2009-01-29 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
ES2398975T3 (es) 2004-03-01 2013-03-25 Spirogen Sàrl Derivados de 11-hidroxi-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona como intermedios clave para la preparación de pirrolobenzodiazepinas sustituidas en C2
GB0410725D0 (en) 2004-05-13 2004-06-16 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine therapeutic agents
EP1879901B1 (en) 2005-04-21 2009-12-23 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
SG2014010029A (en) 2005-08-19 2014-08-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
CN101309933A (zh) * 2005-09-07 2008-11-19 米迪缪尼有限公司 毒素偶联的Eph受体抗体
ATE427949T1 (de) 2005-10-05 2009-04-15 Spirogen Ltd 4-a4-(5-oxo-2,3,5,11a-tetrahydro-5h-pyrrolo a2, 1-cua1,4ubenzodiazepin-8-yloxy)-butyrylaminou-1 - pyrrol-2-carbonsaurealkylesterderivate und verwandte verbindung zur behandlung einer proliferativen erkrankung
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
AU2008319298B2 (en) 2007-10-31 2014-07-31 Medimmune, Llc Protein scaffolds
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
BR112012026003B1 (pt) 2010-04-13 2022-03-15 Medimmune, Llc Estrutura multimérica recombinante específica trail r2, seu uso, bem como composição
CN103140227B (zh) 2010-08-06 2016-01-20 恩多塞特公司 制备微管蛋白细胞溶素的方法
WO2013006544A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Medimmune, Llc Methods for making multimeric polypeptides
EP2776061B1 (en) 2011-11-07 2019-08-14 MedImmune, LLC Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
EP2794905B1 (en) 2011-12-20 2020-04-01 MedImmune, LLC Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
US10010623B2 (en) * 2012-02-16 2018-07-03 Ucl Business Plc Lysosome-cleavable linker
JP6423340B2 (ja) * 2012-05-15 2018-11-14 シアトル ジェネティクス，インコーポレイティド 自己安定化リンカー結合体
CN103288957B (zh) * 2012-12-21 2015-01-28 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种抑制肿瘤生长的抗体药物衍生物及其制备方法和用途
CN103333246B (zh) * 2012-12-21 2015-09-16 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种抗egfr受体的肿瘤生长抑制剂及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN106922129A (zh) 2017-07-04
US20220160882A1 (en) 2022-05-26
EP3200829A1 (en) 2017-08-09
JP2017535526A (ja) 2017-11-30
CA2962783A1 (en) 2016-04-07
CN106922129B (zh) 2024-02-20
RU2017114343A3 (es) 2019-04-05
EP3200829B1 (en) 2023-12-06
RU2715905C2 (ru) 2020-03-04
BR112017006602A2 (pt) 2017-12-19
AU2015324924B2 (en) 2021-07-01
AU2015324924A1 (en) 2017-05-18
WO2016054315A1 (en) 2016-04-07
JP6863888B2 (ja) 2021-04-21
RU2017114343A (ru) 2018-11-07
US20170304460A1 (en) 2017-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2969960T3 (es) Método para conjugar un polipéptido
RU2580038C2 (ru) Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
WO2020052692A2 (en) Binding molecules against cd3 and uses thereof
EP3713962A1 (en) Trispecific binding molecules against tumor-associated antigens and uses thereof
US20230321267A1 (en) Method And Molecules
CN116249549A (zh) 用于治疗增殖性疾病和自身免疫病症的双特异性组合疗法
AU2017212484B2 (en) Methods for preparing antibodies with a defined glycosylation pattern