ES2967739T3

ES2967739T3 - Formato de anticuerpo heterodimérico multiespecífico dirigido al menos a CD3 y a HSA

Info

Publication number: ES2967739T3
Application number: ES18731373T
Authority: ES
Inventors: David Urech; Tea Gunde; Sebastian Meyer; Christian Hess; Alexandre Simonin
Original assignee: Numab Therapeutics AG
Current assignee: Numab Therapeutics AG
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: JP7549961B2; US12098203B2; AU2018280683B2; AU2018280683A1; MA49255A; JP2020522267A; EP3635014C0; US20200181263A1; KR102771043B1; KR20200013230A; EP3635014A1; CN110719918B; CA3065868A1; SG11201911527QA; CN110719918A; CA3065868C; EP3635014B1; WO2018224443A1

Abstract

Esta invención se refiere a un nuevo formato multiespecífico heterodimérico de múltiples dominios variables de anticuerpos que comprende un núcleo de dos pares de dominios variables divididos en el que tanto los dominios ligeros variables como los dos dominios pesados variables afines se colocan en tándem en dos cadenas de proteínas separadas, respectivamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formato de anticuerpo heterodimérico multiespecífico dirigido al menos a CD3 y a HSA

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un nuevo formato multiespecífico heterodimérico de múltiples dominios variables de anticuerpos que comprende un núcleo de dos pares de dominios variables divididos en donde tanto los dominios ligeros variables como los dos dominios pesados variables cognados se colocan en tándem sobre dos cadenas de proteínas separadas, respectivamente, en particular a una proteína heterodimérica dirigida contra seralbúmina humana y CD3 humano y que comprende adicionalmente al menos un tercer dominio funcional, en donde dicha proteína heterodimérica no comprende un dominio constante de inmunoglobulina.

Antecedentes de la invención

En los últimos cuarenta años, desde el desarrollo de los primeros anticuerpos monoclonales [R17], los anticuerpos se han convertido en una clase de biomoléculas cada vez más importante para fines de investigación, diagnóstico y terapéuticos.

Los anticuerpos, como agentes terapéuticos, están evolucionando hacia funcionalidades diseñadas más racionalmente, mejorando y ampliando así sus propiedades inherentes. Los ejemplos incluyen la optimización de las funciones efectoras mediante glicoingeniería [R18], localización específica como la transferencia sobre la barrera hematoencefálica [R19] o la semivida ajustada, p. ej., mediante aumento de la unión a FcRn [R20].

Un enfoque complementario de la funcionalización de anticuerpos es la combinación de diferentes especificidades de diana en una molécula para generar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, lo que permite mecanismos de acción alternativos, como el redireccinamiento de células T, como lo ilustra el anticuerpo biespecífico Blinatumomab o el anticuerpo triespecífico Catumaxomab.

A pesar de la gran cantidad de formatos de anticuerpos multiespecíficos diferentes que se han desarrollado hasta ahora [R21], el repertorio actual de formatos de anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos aún deja a la industria con considerables desafíos técnicos y poca flexibilidad con solo unos pocos formatos que permiten la unión tri-y multiespecífica e incluso menos formatos que apoyen la formación de proteínas heterodiméricas.

En el pasado se han presentado diferentes formatos multiespecíficos. Conceptualmente, estos formatos se pueden agrupar en tres categorías: a) formatos multiespecíficos de una sola cadena, en los que los diferentes dominios de unión a la diana están todos ubicados en una sola cadena de proteína, expresada a partir de un solo gen, b) formatos homo-bi-, y homo-multiméricos, en los que los diferentes dominios de unión a la diana se ubican en cadenas proteicas idénticas que se ensamblan mediante el uso de un dominio de multimerización que da como resultado complejos bi-/multi-valentes y, opcionalmente, también multiespecíficos, y c) formatos heterodiméricos en los que los dominios de unión a la diana están ubicados en diferentes cadenas de proteínas, y el ensamblaje de las dos cadenas de proteínas está dirigido por un dominio de heterodimerización.

Los formatos multiespecíficos heterodiméricos en principio ofrecen la ventaja de que los dominios de unión con diferentes especificidades y afinidades pueden probarse fácilmente en varias combinaciones mediante la simple permutación de las dos cadenas de proteínas heterodimerizantes, lo que permite el escrutinio de combinaciones óptimas de especificidades y afinidades directamente en el formato final sin necesidad de tediosas clonaciones.

Tal escrutinio en el formato del producto final se requiere en los casos en que las propiedades de unión y/o las potencias de los diversos dominios deben combinarse cuidadosamente entre sí para lograr la potencia óptima de la proteína biespecífica y al mismo tiempo minimizar el riesgo de efectos inespecíficos. En la situación clínica, esto se traduciría en una eficacia óptima con un riesgo mínimo de efectos adversos. Las situaciones en las que se requieren tales combinaciones óptimas pueden ser, por ejemplo, el bloqueo concomitante de dos citocinas que provocan enfermedades que se producen en el curso de la enfermedad en diferentes concentraciones. En esta situación, la proteína biespecífica terapéutica debería permitir bloquear eficazmente ambas citocinas a una misma dosis terapéutica.

Otro ejemplo, en el que deben coordinarse las características de los dominios de unión a la diana de una molécula multiespecífica, es la terapia del cáncer con un anticuerpo citotóxico dirigido a dos dianas de la superficie celular en diferentes células tumorales. Si bien las dos dianas de la superficie celular del anticuerpo en esta situación pueden expresarse conjuntamente exclusivamente en células cancerosas, pueden expresarse individualmente en una variedad de tejidos sanos. Para lograr la mejor eficacia con el menor riesgo de efectos secundarios adversos en la terapia tumoral, el anticuerpo citotóxico debe unirse preferentemente a una célula, cuando ambas dianas se expresan conjuntamente, pero no debe unirse a tejidos que expresen solo una de las dos dianas. Para lograr esto, las afinidades de los dos dominios de unión a la diana deben ajustarse de manera que, por un lado, las afinidades de los dominios individuales con su diana sean demasiado débiles para provocar la lisis celular y, por otro lado, la avidez cooperativa resultante de la unión concomitante de la molécula biespecífica a ambas dianas en una célula cancerosa sea suficiente para inducir la lisis celular. Debido a las restricciones geométricas resultantes de la unión simultánea a diferentes macromoléculas inmovilizadas en la superficie celular, la combinación de dominios para lograr la unión cooperativa máxima no solo es una función de las afinidades, sino también de los epítopos y solo puede identificarse probando diferentes combinaciones de dominios en el formato real del producto.

El anticuerpo de tipo IgG nativo puede considerarse un formato homodimérico.

Con el fin de aumentar el número de especificidades del formato de anticuerpo homodimérico que emplea la arquitectura IgG clásica como armazón, se pueden añadir radicales de unión adicionales, tales como Fv de cadena sencilla [R15], Fv [R16], dominios únicos [p. ej., Nanoanticuerpos: Huang et al., Expert Rev Mol Diagn. 10 (2010):777-85] o armazones alternativos [p. ej. Finómero: Schlatter et al., MAbs. 4 (2012) 497-508], ya sea al extremo amino terminal o carboxilo terminal de la cadena pesada y ligera. Una ventaja de este enfoque es que se pueden generar construcciones bi- a triespecíficas con una IgG convencional como dominio central, lo que permite explotar la mayoría de las tecnologías de fabricación y modificación que se han establecido para las IgG convencionales. Sin embargo, debido a la naturaleza homodimérica de las regiones Fc convencionales, este enfoque siempre dará como resultado al menos dos dominios de unión idénticos por molécula y, en consecuencia, en unión bivalente a una diana determinada. Esto puede no ser siempre deseable, particularmente no (a) si solo la unión cooperativa a dos dianas dará como resultado el efecto deseado, o (b) si el peso molecular no se incrementará más. Además, este enfoque a menudo adolecía de malas estabilidades de dominio de los radicales de unión adjuntos, lo que los hacía inadecuados para el desarrollo farmacéutico.

El concepto de fusionar más dominios de unión para aumentar las especificidades también se puede aplicar a fragmentos Fab [R14] u otros fragmentos de unión a antígeno de IgG [R23]. Debido a la naturaleza heterodimérica del Fab, que consiste en una cadena pesada y una ligera, el fragmento Fab puede usarse como un dominio de heterodimerización. El fragmento Fab, por ejemplo, se ha utilizado para diseñar el llamado Trianticuerpo. En este formato, los fragmentos scFv se fusionan con el extremo carboxilo de la cadena ligera y pesada de un Fab, lo que da como resultado una molécula triespecífica verdaderamente heterodimérica. La asociación cadena ligera-cadena pesada del Fab está impulsada principalmente por la interacción entre CL-CH1, que además están conectados a través de un enlace disulfuro covalente [R2]. Los desafíos con este formato son (a) la limitación de la estabilidad al componente menos estable, que muy probablemente será el scFv adjunto, y (b) la limitación a un máximo de tres especificidades por la diana.

Como enfoque para resolver las limitaciones de los formatos biespecíficos homodiméricos, se han introducido las IgG heterodiméricas [R31]. La simple expresión con junta de dos mAb diferentes de una célula conduce con muy poca probabilidad al ensamblaje de IgG biespecíficas heterodiméricas en las que dos cadenas pesadas diferentes se emparejarán entre sí, y las dos cadenas ligeras diferentes se emparejarán con su correspondiente cadena pesada [R24]. Sin embargo, también conducirá a A) el emparejamiento erróneo de cadenas pesadas y ligeras con diferentes especificidades y B) mezclas de diferentes combinaciones de cadenas pesadas que dan como resultado variantes monoespecíficas y biespecíficas. Para hacer frente a estas dificultades se han emprendido varios enfoques, que crean una asimetría artificial en las moléculas. El concepto de "botones en ojales" [R3, R4] utiliza la modificación genérica de la interfase de cadena pesada/cadena pesada o cadena pesada/cadena ligera para impulsar la asociación de las cadenas expresadas conjuntamente hacia la configuración deseada. En otro enfoque, la metodología CrossMab [R5] permite el emparejamiento selectivo de un par de cadena ligera/cadena pesada modificado genéticamente. Un inconveniente de estas metodologías es que cualquier fracción residual de moléculas emparejadas erróneamente es muy difícil de separar del producto. Por lo tanto, otras técnicas se centran en el problema de la separación mediante la modificación genética de propiedades de unión diferenciales para los aglutinantes monoespecíficos y biespecíficos [R22] y, por otro lado, toleran la pérdida de rendimiento causada por la distribución estocástica de variantes.

Una limitación adicional de los formatos heterodiméricos basados en IgG es que todos deben comprender un dominio efector Fc. Un formato en el que la heterodimerización estaría impulsada por dominios de unión a la diana dirigidos a cualquier diana de elección permitiría aumentar el número de especificidades/funcionalidades con el mismo peso molecular o con uno inferior. Las moléculas con pesos moleculares más bajos penetran más eficientemente en los tejidos diana (p. ej., cánceres sólidos) y, por lo tanto, prometen una mayor eficacia con la misma dosis o con una dosis más baja. Sin embargo, los formatos más pequeños adolecen de la desventaja de tener una semivida en suero más corta.

Un enfoque alternativo utiliza proteínas de fusión que no son de anticuerpos para conferir la multiespecificidad deseada, por ejemplo, a radicales scFv. Los ejemplos de tales proteínas de fusión son Dock-and-Lock [R25], barnasebarstar [R26], jun-fos [R27], TNF [R28] o HSA [R29]. Estos conceptos tienen en común que se añade al menos un par de dominios que interactúa de forma heterodimérica para unir los dominios de unión biespecíficos o multiespecíficos. Estos dominios de heterodimerización no están directamente implicados en la unión a la diana, sin embargo, aumentan el peso molecular de la proteína, similar a la región constante uno (C1) en el formato de Trianticuerpo. Además, podrían tener el riesgo de una mayor inmunogenicidad al incorporar epítopos y secuencias no humanos.

En contraste con la interacción entre CL y CH1 discutida anteriormente, la asociación de los dominios VL-VH formadores de paratopos generalmente se considera débil. Sin embargo, existen varios conceptos de fragmentos de anticuerpos heterodiméricos que se componen exclusivamente de dominios variables de anticuerpos. Enfoques como dianticuerpos [R6], DART [R10] y tandab [R7, R8], pero sin limitarse a, ofrecen enfoques elegantes y minimalistas para crear ensamblajes homo- y heterodiméricos biespecíficos y bi- a tetravalentes. Las limitaciones más importantes de estas estrategias de formato son (a) la adición de otras especificidades al fusionar, p. ej., un scFv al extremo amino terminal o carboxilo terminal de cualquier cadena de diacuerpos o DART podría dar como resultado el emparejamiento intracatenario de los dominios variable ligero y pesado variable, lo que hace que la heterodimerización de las dos cadenas de proteínas sea muy desafiante, y (b) debido a la débil unión de la interfase de dominio entre la cadena ligera variable y la cadena pesada variable a menudo observada en el pasado, estos formatos adolecían de una baja estabilidad monomérica y una escasa producibilidad, por lo que se consideró necesario la modificación genética adicional, tal como la introducción de enlaces disulfuro entre dominios [R12 ] para estabilizar la interfase VL/VH.

Con el objetivo de construir anticuerpos Fv en tándem monocatenarios multiespecíficos, Kipriyanov et al. [R30] sugirieron un diseño que comprendía dos cadenas de proteínas, cada una de las cuales consistía en dos dominios Fv divididos dispuestos en el orden VL-(conector1)-VH-(conector2)-VL-(conector3)-VH. Para la construcción de proteínas tetraespecíficas heterodiméricas, el heterodímero consistiría en dos cadenas de proteínas con la siguiente arquitectura. Cadena 1: VLA-(conector1)-VHA-(conector12)-VLB-(conector3)-VHC, y cadena B: VLD-(conector1)-VHD-(conector2)-VLC-(conector3)-VHB, en donde el ensamblaje de FvB y FvC impulsaría la heterodimerización de las dos cadenas (véase la Figura 10A del documento WO 2016/202457). Con el fin de evitar el ensamblaje intracatenario que da como resultado un formato similar a Fv de cadena sencilla en tándem (scFv2), y para promover la heterodimerización de dos cadenas de proteínas monoméricas, se han sugerido conectores acortados en las posiciones del conector3 de un máximo de 10 aminoácidos (documento EP1293514 A1). Sin embargo, la organización propuesta de los dos dominios variables divididos con un conector2 de al menos 15 aminoácidos da como resultado la posibilidad de que los segundos dominios variables se plieguen hacia los dominios N-terminales, lo que lleva a un formato similar a dianticuerpo de cadena sencilla (scDb) que consiste en pares VH/VL no coincidentes, que en consecuencia probablemente no podrían unirse a su diana. Además, también existe la posibilidad de que se forme un heterodímero en el que todas las cadenas pesadas y ligeras variables de la cadena proteica 1 se emparejarían con las cadenas ligeras y pesadas variables de la cadena proteica 2, respectivamente, evitando así la formación de scFv terminales (scFvA y scFvD) y dando como resultado el emparejamiento de dominios variables no cognados. Los subproductos de tipo scFv (scFv2) o scDb en tándem podrían ser la razón de la fracción muy alta de proteína observada en el peso molecular aparente de las cadenas de proteína no multimerizadas [R30].

En teoría, la formación de estructuras similares a scDb en el enfoque descrito anteriormente podría reducirse aún más acortando también el segundo conector (conector2) entre los dos dominios variables divididos. Sin embargo, esto limitaría la flexibilidad de la construcción, lo que en muchos casos tendría un impacto negativo en la gama de epítopos accesibles que permiten la unión concomitante de dos dianas. Estas restricciones geométricas son particularmente limitantes cuando dos proteínas de membrana deben unirse al mismo tiempo.

Además, y lo que es más importante, sin embargo, ambos monómeros podrían formar fragmentos homodiméricos (véase la Figura 10B del documento WO 2016/202457), por lo que, estadísticamente, hasta dos tercios de los productos diméricos podrían consistir en los dos homodímeros, mientras que solo un tercio consistiría en el heterodímero deseado.

En resumen, existe una necesidad muy pronunciada en la industria de formatos multiespecíficos heterodiméricos que permitan una permutación simple y la posterior caracterización de diferentes dominios de unión en el formato final. Los principales desafíos con tales formatos han sido (a) la eficiencia relativamente baja de la heterodimerización específica que da como resultado rendimientos de producción subóptimos, y (b) la necesidad de usar proteínas que no se unen a la diana como dominios de heterodimerización o dominios efectores Fc de heterodímeros modificados genéticamente que vengan con poca flexibilidad para ajustar la semivida en suero y que limiten la flexibilidad al añadir nuevas funcionalidades sin aumentar el peso molecular.

Por lo tanto, se sugirió que el formato multiespecífico heterodimérico óptimo consistiría exclusivamente en dominios de unión a la diana y permitiría el ajuste de la geometría de la molécula, por ejemplo, cambiando libremente las longitudes del conector entre los diferentes dominios de unión para adaptarse a las restricciones geométricas definidas por los compañeros de interacción (dianas). Como solución a ese problema, el documento WO 2015/058861 y Egan et al., Mabs 9 (2017) 68-84 informaron sobre el desarrollo de un nuevo formato multiespecífico heterodimérico de múltiples dominios variables de anticuerpo, que comprende un núcleo de dos pares de dominios variables divididos, en donde tanto los dominios ligeros variables como los dos dominios pesados variables cognados están situados en tándem sobre cadenas de proteínas separadas, respectivamente, dirigiendo de ese modo la heterodimerización de las dos cadenas de proteína. Este formato se ha denominado "terapia basada en anticuerpos multiespecíficos mediante heterodimerización cognada (MATCH)". Se fusionan hasta dos dominios de unión adicionales, particularmente dominios de unión basados en anticuerpos, tales como fragmentos scFv, al extremo amino terminal y/o carboxilo terminal de cualquier cadena de proteína, dando como resultado una proteína heterodimérica hasta hexaespecífica.

Sin embargo, aunque se podría demostrar satisfactoriamente que el principio subyacente permitía la formación de tales proteínas multiespecíficas heterodiméricas basadas en un núcleo que comprende un par de dominios variables con especificidad de unión para CD3 humano y un par de dominios variables con especificidad de unión para una diana terapéutica, se podría esperar que fueran necesarios, caso por caso, construcciones tales como las construcciones MATCH probadas en el documento WO 2015/058861 y por Egan et al., el reajuste de las propiedades de las proteínas multiespecíficas heterodiméricas, por ejemplo, identificando los marcos de los dominios VL y VH adecuados, los conectores adecuados, y opcionalmente las posiciones adecuadas para los restos de cisteína para la formación de enlaces disulfuro intercatenarios. Se piensa que tal reajuste es necesario ya que no parece que sea posible pronosticar completamente la propensión a la heterodimerización de tales proteínas multiespecíficas heterodiméricas que incluyen un nuevo par de dominios variables. Además, se sabe que el mecanismo de acción de tal clase de moléculas multiespecíficas, que comprenden un dominio de unión a CD3 y al menos un dominio de unión a un antígeno expresado sobre las células diana se basa en la lisis de las células diana tras la formación de una sinapsis inmunológica. El entrecruzamiento y el agrupamiento del receptor de CD3 sobre la célula T por interacción con un antígeno asociado al tumor (TAA) sobre la membrana de la célula diana conducirán a la activación de las células T y a la subsiguiente liberación de citocinas y agentes citotóxicos en la sinapsis. Sin desear vincularse a ninguna teoría, se espera que la formación de tal sinapsis inmunológica esté dirigida, o al menos fundamentalmente influenciada por la geometría de la proteína multiespecífica y los epítopos de los respectivos dominios de unión, de manera que, una vez más, no parece que sea predecible que una nueva combinación de pares de dominios variables que forman dicho núcleo funcione como se había planeado. Por lo tanto, todavía existe una necesidad no satisfecha de identificar un método más robusto para generar de manera fiable tales proteínas multiespecíficas heterodiméricas.

Además, los autores de la presente invención comprendieron que, para aumentar la especificidad de la lisis de las células diana, una molécula de acoplamiento con células T puede comprender, además del dominio de unión a CD3, al menos dos dominios de unión concomitante a antígenos expresados sobre la superficie de la célula diana. Para la identificación eficaz de dos dominios de unión, que se unen juntos, con una selectividad óptima, a las células diana, mediante la permutación de combinaciones de plásmidos de expresión, que codifican cada uno una de las dos cadenas de proteína del complejo MATCH, los dos dominios deben estar localizados cada uno sobre una cadena de proteína diferente del complejo MATCH heterodimérico. Por lo tanto, existía la necesidad de identificar el domino central, que condujera la heterodimerización de las dos cadenas, que comprendieran los dominios que no están implicados en la unión a la célula diana.

La solución a este problema, es decir la identificación de un núcleo definido de dos pares de dominios variables fijos que se pueden extender fusionando uno o más radicales de direccionamiento adicionales a los extremos N y/o C de una o ambas proteínas monocatenarias, no ha sido demostrada ni sugerida hasta ahora en la técnica anterior.

Compendio de la invención

Esta presente solicitud se refiere a un nuevo formato multiespecífico heterodimérico de múltiples dominios variables de anticuerpo que comprende un núcleo de dos pares de dominios variables divididos, en donde tanto los dominios ligeros variables como los dos dominios pesados variables cognados se colocan en tándem sobre dos cadenas de proteínas separadas, respectivamente, por medio de lo cual se impulsa la heterodimerización de las dos cadenas de proteína, en donde el núcleo está formado por un primer par de dominios variables con especificidad para CD3 humano y un segundo par de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana. Se fusionan hasta dos dominios de unión adicionales, en particular dominios de unión basados en anticuerpos, tales como fragmentos scFv, al extremo amino terminal y/o carboxilo terminal de cualquiera de las cadenas proteicas, lo que da como resultado una proteína heterodimérica hasta hexaespecífica. Además de formar construcciones que son estables y bien expresadas y que se puede esperar que muestren una semivida en plasma prolongada, se pudo demostrar sorprendentemente que tales construcciones mostraban un perfil farmacodinámico diferente al mostrar una cinética de activación de células T más lenta y una reducción de la liberación de citocinas, sin comprometer su máxima capacidad de lisis de células diana, cuando se comparan con un formato de dianticuerpos de cadena sencilla (scDb) que comprende el dominio de unión a CD3 idéntico y el mismo dominio de unión al antígeno diana expresado sobre las células diana. Tal reducción de la liberación de citocinas a una extensión de comparable mantiene la promesa de reducción de efectos adversos debidos a la liberación de citocinas y por lo tanto de un perfil riesgo a beneficio favorable.

Así, la presente solicitud se refiere a una proteína heterodimérica que comprende una primera y una segunda proteínas monocatenarias,

en donde dicha primera proteína monocatenaria comprende una primera secuencia de aminoácidos que consiste en (del extremo N-terminal al C-terminal):

(ia) un primer dominio VL;

(iia) un primer conector polipeptídico, y

(iiia) un segundo dominio VL, y

en donde dicha segunda proteína monocatenaria comprende una segunda secuencia de aminoácidos que consiste en (del extremo N-terminal al C-terminal):

(ib) un primer dominio VH;

(iib) un segundo conector polipeptídico, y

(iiib) un segundo dominio VH, y

en donde dicho primer dominio VL forma un primer par cognado de dominios variables con especificidad para un primer antígeno diana formando dicho primer o dicho segundo dominios VH y dicho segundo dominio VL un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para un segundo antígeno diana con el otro de dichos dominios VH, en donde uno de dichos antígenos diana es seralbúmina humana y el otro de dichos antígenos diana es CD3 humano, y en donde al menos una de dicha primera o dicha segunda proteínas monocatenarias comprende adicionalmente

(iv) al menos un dominio adicional como tercer dominio funcional que se fusiona a través de un tercer conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencias de aminoácidos.

En un primer aspecto, la presente solicitud se refiere a una proteína heterodimérica que comprende una primera y una segunda proteínas monocatenarias,

(ia) un primer dominio VL;

(iia) un primer conector polipeptídico, y

(iiia) un segundo dominio VL, y

(ib) un primer dominio VH;

(iib) un segundo conector polipeptídico, y

(iiib) un segundo dominio VH, y

en donde dicho primer dominio VL forma un primer par cognado de dominios variables con especificidad para un primer antígeno diana formando dicho primer o dicho segundo dominio VH y dicho segundo dominio VL un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para un segundo antígeno diana con el otro de dichos dominios VH, en donde uno de dichos antígenos diana es seralbúmina humana y el otro de dichos antígenos diana es CD3 humano, y en donde al menos una de dicha primera o dicha segunda proteínas monocatenarias comprende adicionalmente

(iv) al menos un dominio adicional como tercer dominio funcional que se fusiona a través de un tercer conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencias de aminoácidos, en donde dicho dominio funcional es un dominio proteico que tiene una función predefinida, particularmente una actividad enzimática o una unión específica a un ligando cognado,

en donde cada conector polipeptídico consiste en una cadena de restos de aminoácido conectados por enlaces peptídicos, y en donde dicha primera y dicha segunda proteínas monocatenarias no comprenden un dominio constante de inmunoglobulina.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una o dos secuencias de ácido nucleico que codifican dichas primera y segunda proteínas monocatenarias.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a uno o dos vectores que comprenden dichas una o dos secuencias de ácido nucleico.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una célula anfitriona o células anfitrionas que comprenden dichos uno o dos vectores.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la proteína heterodimérica de la presente invención, que comprende (i) proporcionar un ácido nucleico o ácidos nucleicos según la presente invención, o un vector o vectores según la presente invención, que expresan dicho ácido nucleico o dichos ácidos nucleicos o dichos vector o vectores y recoger dichas primera y segunda proteínas monocatenarias, o dicha proteína heterodimérica, del sistema de expresión, o (ii) proporcionar una célula anfitriona o células anfitrionas de la presente invención, cultivar dichas célula anfitriona o células anfitrionas y recoger dicha proteína heterodimérica del cultivo celular.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína heterodimérica de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente solicitud se refiere además a la proteína heterodimérica de la presente invención para uso en el tratamiento de una enfermedad, particularmente una enfermedad humana, más particularmente una enfermedad humana seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria, en donde al menos uno de dichos tercer, cuarto, quinto o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la enfermedad correspondiente.

Además, la presente solicitud se refiere a un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad, particularmente una enfermedad humana, más particularmente una enfermedad humana seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la proteína heterodimérica de la presente invención, en donde al menos uno de dichos tercer, cuarto, quinto o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la enfermedad correspondiente.

Las realizaciones particulares de la presente invención se exponen en las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Figuras

LaFigura 1muestra el análisis de SDS-PAGE de las variantes de construcciones MATCH descritas en la Tabla 2 en condiciones reductoras y no reductoras.

LaFigura 2muestra la respuesta a la dosis de la activación de células T en presencia de células diana a diferentes concentraciones de MATCH y moléculas scDb de referencia. Se añadieron concentraciones fisiológicas de seralbúmina humana a los cultivos celulares después de 5 h y 30 h de incubación.

LaFigura 3muestra la respuesta a la dosis de la activación de células T en presencia de células de control a diferentes concentraciones de MATCH y moléculas scDb de referencia.

LaFigura 4muestra un gráfico de la activación máxima de las células T inducida por MATCH y la molécula de referencia de scDb normalizada a la amplitud de la señal de scDb a las 5 h.

LaFigura 5muestra un gráfico de la potencia de las moléculas de prueba a lo largo del tiempo del estudio.

LaFigura 6muestra la determinación de la concentración de IL-2 del ensayo de activación NFAT en diferentes puntos de tiempo mediante ELISA.

LaFigura 7muestra los gráficos de dosis-respuesta de la lisis celular para MATCH y los dos scDb de referencia. El panel izquierdo muestra la lisis específica de las células diana que expresan IL23R, mientras que el panel derecho muestra la lisis no específica de células negativas para IL23R.

LaFigura 8muestra el gráfico de dosis-respuesta de la fracción de células T activadas. El panel izquierdo muestra la fracción de células T activadas en presencia de células diana que expresan IL23R, mientras que el panel derecho muestra las células T activadas en presencia de células negativas para IL23R.

LaFigura 9muestra la dosis-respuesta de la concentración de IL-2 en los respectivos pocillos del ensayo de citotoxicidad inducida por la activación de células T. El panel izquierdo muestra la concentración de IL-2 inducida por la presencia de células diana que expresan IL23R, mientras que el panel derecho muestra la concentración de IL-2 de IL-2 inducida en presencia de células negativas para IL23R.

LaFigura 10muestra un esbozo esquemático del direccionamiento dual utilizando una MATCH con un ensamblaje de núcleo heterodimérico anti-CD3/anti-HSA.

LaFigura 11muestra gráficos de dosis-respuesta de la lisis celular para dos ensamblajes MATCH tetraespecíficos (PRO821 y PRO824). El panel superior izquierdo muestra la lisis específica de células diana que expresan IL23R, mientras que el panel superior derecho muestra la lisis específica de células positivas para Her2. En el panel inferior se representa la lisis específica de células negativas para el antígeno.

LaFigura 12muestra una representación esquemática del Ensamblaje 1.

LaFigura 13muestra una representación esquemática del Ensamblaje 3.

LaFigura 14muestra una representación esquemática del Ensamblaje 5.

LaFigura 15muestra una representación esquemática del Ensamblaje 7.

Descripción detallada de la invención

Aquí, los autores de la presente invención presentan un formato novedoso que exhibe un ensamblaje heterodimérico cuantitativo de dos cadenas de proteínas que contienen múltiples dominios variables de anticuerpo. Este formato consiste en un núcleo de dos pares de dominios variables divididos (dos fragmentos Fv) en donde tanto los dominios ligeros variables como los dominios pesados variables se colocan cada uno en una cadena proteica separada, lo que impulsa la heterodimerización de las dos cadenas proteicas, en donde un par de dominios VL y VH es específico para seralbúmina bovina y el otro es específico para CD3 humano. Se fusionan hasta dos dominios de unión adicionales, por ejemplo, en el formato scFv con alta estabilidad intra- e interdominio al extremo amino terminal y/o carboxilo terminal de cualquiera de las cadenas peptídicas, lo que da como resultado una proteína heterodimérica hasta hexaespecífica.

Así, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una proteína heterodimérica que comprende una primera y una segunda proteínas monocatenarias,

(ia) un primer dominio VL;

(iia) un primer conector polipeptídico, y

(iiia) un segundo dominio VL, y

(ib) un primer dominio VH;

(iib) un segundo conector polipeptídico, y

(iiib) un segundo dominio VH, y

en donde dicho primer dominio VL forma un primer par cognado de dominios variables con especificidad para un primer antígeno diana formando dicho primer o dicho segundo dominio VH y dicho segundo dominio VL un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para un segundo antígeno diana con el otro de dichos dominios VH, en donde uno de dichos antígenos diana es seralbúmina humana y el otro de dichos antígenos diana es CD3 humano, en donde al menos una de dicha primera o dicha segunda proteínas monocatenarias comprende adicionalmente

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusión de un número entero, composición o etapas o grupo de números enteros o etapas establecidos, mientras que cualquier número entero, composición o etapa adicional o grupo de números enteros, composiciones o etapas adicionales también pueden estar presente opcionalmente, incluidas las realizaciones, en las que no están presentes ningún número entero, composición o etapa o grupo de números enteros, composiciones o etapas adicionales. Con respecto a estas últimas realizaciones, el término "que comprende" incluye así el término más estricto "que consiste en".

Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta memoria descriptiva. Cada uno de los documentos citados en el presente documento (incluidas todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, envíos de secuencias de Números de Acceso de GenBank, etc.), ya sea más arriba o más abajo, se incorpora a la presente como referencia en su totalidad en la medida de lo posible bajo la respectiva ley de patentes. Nada de lo aquí contenido debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser anterior a tal divulgación en virtud de una invención anterior.

En el contexto de la presente invención, los términos "dominio VL" y "dominio VH" se refieren al dominio de cadena ligera variable y al dominio de cadena pesada variable, respectivamente, de anticuerpos. En el contexto de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno, es decir, que incluyen porciones de anticuerpo que comprenden al menos un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo.

En el contexto de la presente invención, se considera que un anticuerpo, o cualquier molécula de unión en general, se "une específicamente" a un antígeno (en el caso de un anticuerpo), o a un compañero de unión cognado (en el caso de una molécula de unión en general), si tiene una constante de disociación Kd para dicho antígeno/ compañero de unión cognado como diana de 100 pM o menos, preferiblemente 50 pM o menos, preferiblemente 30 pM o menos, preferiblemente 20 pM o menos, preferiblemente l0 pM o menos, preferiblemente 5 pM o menos, más preferiblemente 1 pM o menos, más preferiblemente 900 nM o menos, más preferiblemente 800 nM o menos, más preferiblemente 700 nM o menos, más preferiblemente 600 nM o menos, más preferiblemente 500 nM o menos, más preferiblemente 400 nM o menos, más preferiblemente 300 nM o menos, más preferiblemente 200 nM o menos, incluso más preferiblemente 100 nM o menos, incluso más preferiblemente 90 nM o menos, incluso más preferiblemente 80 nM o menos, incluso más preferiblemente 70 nM o menos, incluso más preferiblemente 60 nM o menos, incluso más preferiblemente 50 nM o menos, incluso más preferiblemente 40 nM o menos, incluso más preferiblemente 30 nM o menos, incluso más preferiblemente 20 nM o menos, e incluso más preferiblemente 10 nM o menos.

En el contexto de la presente invención, el término "dominios funcionales" se refiere a un dominio proteico que tiene una función predefinida, tal como actividad enzimática o unión específica a un ligando cognado, en donde dicho dominio proteico es un dominio estructurado que tiene al menos un elemento de estructura secundaria. Los métodos para determinar la presencia de estructura secundaria en polipéptidos o proteínas, tales como cristalografía de rayos X, dicroísmo circular (CD), dicroísmo circular vibratorio (VCD), r Mn o FT-IR, o para predecir la presencia de estructura secundaria en polipéptidos, tales como PEP-FOLD (Shen y col., J. Chem. Theor. Comput. 10 (2014) 4745-4758) son bien conocidos por el experto en la técnica. En realizaciones particulares, dicho dominio proteico es un dominio estructurado que tiene una estructura terciaria. En realizaciones particulares, dicho dominio proteico comprende al menos aproximadamente 20 restos de aminoácido (véase Heitz et al., Biochemistry 38 (1999) 10615-25), particularmente al menos aproximadamente 50 restos de aminoácido, más particularmente al menos aproximadamente 100 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, un dominio funcional es un dominio proteico que se une específicamente a un ligando cognado. En realizaciones particulares, el dominio funcional es un anticuerpo o una porción inmunológicamente activa de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno.

En el contexto de la presente invención, el término "conector polipeptídico" se refiere a un conector que consiste en una cadena de restos de aminoácido conectados por enlaces peptídicos que conecta dos dominios, estando cada uno anclado a un extremo del conector. En realizaciones particulares, el conector polipeptídico tiene una cadena continua de entre 2 y 30 restos de aminoácido (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 restos de aminoácido). En realizaciones particulares, el conector polipeptídico es un polipéptido no estructurado. Como se mencionó anteriormente, los métodos para determinar la presencia de estructura secundaria en polipéptidos, tales como cristalografía de rayos X, dicroísmo circular (CD), dicroísmo circular vibracional (VCD), RMN o FT-IR, o para predecir la presencia de estructura secundaria en polipéptidos, tales como PEP-FOLD (Shen y col., J. Chem. Theor. Comput. 10 (2014) 4745-4758) son bien conocidos por el experto en la técnica. En realizaciones particulares, un conector consiste en restos de aminoácido seleccionados entre restos de glicina y serina.

Esta invención se caracteriza por lo siguiente:

• El uso de dominios variables de anticuerpos para crear un formato heterodimérico, donde al menos dos dominios VL están ubicados en una cadena de proteína mientras que los dominios VH correspondientes están ubicados en una segunda cadena de proteína.

• El dominio central heterodimérico permite añadir dominios funcionales adicionales, tales como dominios de unión, para crear entidades tri-, tetra-, penta- o hexaespecíficas.

• Múltiples ejemplos para el emparejamiento altamente eficaz del ensamblaje del núcleo heterodimérico.

• Solución simple para el escrutinio combinatorio de múltiples grupos de dominios de unión que comparten un dominio central heterodimérico común.

En una realización particular, la invención se refiere a una proteína heterodimérica, en donde dicha primera o dicha segunda proteínas monocatenarias comprenden adicionalmente

(v) un cuarto dominio funcional que se fusiona a través de un cuarto conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencias de aminoácidos.

(vi) un quinto dominio funcional que se fusiona a través de un quinto conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencias de aminoácidos.

(vii) un sexto dominio funcional que se fusiona a través de un sexto conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencias de aminoácidos.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica comprende dicho tercer y dicho cuarto dominios funcionales. En tales realizaciones, dicha proteína heterodimérica es tetravalente, en realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica es tetraespecífica.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica comprende dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto y dicho sexto dominios funcionales. En tales realizaciones, dicha proteína heterodimérica es hexavalente, en realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica es hexaespecífica.

La presente solicitud describe una proteína heterodimérica que no comprende un par cognado de un primer y un segundo dominios constantes de inmunoglobulina, en donde dicho primer dominio constante de inmunoglobulina está comprendido en dicha primera proteína monocatenaria y en donde dicho segundo dominio constante de inmunoglobulina está comprendido en dicha segunda proteína monocatenaria. La presente solicitud describe además que al menos una de dicha primera y dicha segunda proteínas monocatenarias no comprende un dominio constante de inmunoglobulina.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica no comprende un par cognado de un primer dominio de interacción proteico comprendido en dicha primera proteína monocatenaria ni un segundo dominio de interacción proteico comprendido en dicha segunda proteína monocatenaria distintos de los pares cognados de (i) dicho primer dominio VL y dicho primer dominio VH y (ii) dicho segundo dominio VL y dicho segundo dominio VH.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica, en donde al menos uno de dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto, dicho sexto dominios funcionales está unido a un antígeno diana expresado sobre la superficie de una célula diana, desencadena niveles reducidos de citocinas en el momento de la activación de células T similar evaluados midiendo la actividad Luciferasa en células T Jurkat que expresan el gen informador de Luciferasa bajo el control de NFAT in vitro en presencia de concentraciones fisiológicas de HSA cuando se comparan con un dianticuerpo monocatenario (scDb) que comprende el mismo dominio de unión a antígeno diana y el mismo dominio de unión a CD3. En realizaciones particulares, dichas citocinas son citocinas derivadas de células T asociadas con un síndrome de liberación de citocinas, tales como IL-2, IL-10, IL-6, TNF-alfa y/o interferón gamma, preferiblemente IL-2. En realizaciones particulares, dichos niveles de citocinas son al menos dos veces, preferiblemente tres veces, más preferiblemente cuatro veces y lo más preferiblemente cinco veces más bajos, cuando se comparan con los de scDb. En realizaciones particulares, la determinación de la actividad Luciferasa y de los niveles de citocinas se realiza como se describe en los ejemplos.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica, en donde al menos uno de dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto, dicho sexto dominios funcionales está unido a un antígeno diana expresado sobre la superficie de una célula diana, demuestra una cinética más lenta para alcanzar una activación de células T similar evaluada midiendo la actividad Luciferasa en células T Jurkat que expresan el gen informador de Luciferasa bajo el control de NFAT in vitro en presencia de concentraciones fisiológicas de HSA cuando se compara con un dianticuerpo monocatenario (scDb) que comprende el mismo dominio de unión a antígeno diana y el mismo dominio de unión a CD3. En realizaciones particulares, dicha cinética es al menos dos veces, preferiblemente tres veces, y lo más preferiblemente cuatro veces más lenta, cuando se compara con la de scDb. En realizaciones particulares, la determinación de la actividad Luciferasa y de los niveles de citocinas se realiza como se describe en los ejemplos.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica, en donde al menos uno de dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto, dicho sexto dominios funcionales está unido a un antígeno diana expresado sobre la superficie de una célula diana, conduce a niveles reducidos de citocinas en el momento de la activación de células T similar evaluados por la expresión de CD69 in vitro en presencia de concentraciones fisiológicas de HSA cuando se comparan con un dianticuerpo monocatenario (scDb) que comprende el mismo dominio de unión a antígeno diana y el mismo dominio de unión a CD3. En realizaciones particulares, dichas citocinas son citocinas derivadas de células T asociadas con un síndrome de liberación de citocinas, tales como IL-2, IL-10, IL-6, TNF-alfa y/o interferón gamma, preferiblemente IL-2. En realizaciones particulares, dichos niveles de citocinas son al menos dos veces, preferiblemente tres veces, más preferiblemente cuatro veces y lo más preferiblemente cinco veces más bajos, cuando se comparan con los de scDb. En realizaciones particulares, la determinación de la expresión de CD69 y de los niveles de citocinas se realiza como se describe en los ejemplos.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica, en donde al menos uno de dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto, dicho sexto dominios funcionales está unido a un antígeno diana expresado sobre la superficie de una célula diana, conduce a niveles reducidos de citocinas en el momento de una extensión similar de lisis de células diana in vitro en presencia de concentraciones fisiológicas de HSA cuando se comparan con un dianticuerpo monocatenario (scDb) que comprende el mismo dominio de unión a antígeno diana y el mismo dominio de unión a CD3. En realizaciones particulares, dichas citocinas son citocinas derivadas de células T asociadas con un síndrome de liberación de citocinas, tales como IL-2, IL-10, IL-6, TNF-alfa y/o interferón gamma, preferiblemente IL-2. En realizaciones particulares, dichos niveles de citocinas son al menos dos veces, preferiblemente tres veces, más preferiblemente cuatro veces y lo más preferiblemente cinco veces más bajos, cuando se comparan con los de scDb. En realizaciones particulares, la determinación de los niveles de citocinas se realiza como se describe en los ejemplos.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica, en donde al menos uno de dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto, dicho sexto dominios funcionales está unido a un antígeno diana expresado sobre la superficie de una célula diana, demuestra una cinética más lenta para alcanzar una extensión similar de lisis de células diana in vitro en presencia de concentraciones fisiológicas de HSA cuando se compara con un dianticuerpo monocatenario (scDb) que comprende el mismo dominio de unión a antígeno diana y el mismo dominio de unión a CD3. En realizaciones particulares, dicha cinética es al menos dos veces, preferiblemente tres veces, y lo más preferiblemente cuatro veces más lenta, cuando se compara con la de scDb. En realizaciones particulares, la determinación de la cinética de la lisis de células diana se realiza como se describe en los ejemplos.

En realizaciones particulares, dicha proteína heterodimérica, en donde al menos uno de dicho tercer, dicho cuarto, dicho quinto, dicho sexto dominios funcionales está unido a un antígeno diana expresado sobre la superficie de una célula diana, tiene la capacidad de alcanzar una lisis de células diana máxima similar, cuando se compara con un dianticuerpo monocatenario (scDb) que comprende el mismo dominio de unión a antígeno diana y el mismo dominio de unión a CD3. En realizaciones particulares, la determinación de la lisis de células diana se realiza como se describe en los ejemplos.

En realizaciones particulares, dicho primer conector polipeptídico consiste en 5 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 6 a 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5.

En otras realizaciones particulares, dicho primer conector polipeptídico consiste en 11 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 11 a 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4; y seleccionándose n entre 3, 4 y 5.

En realizaciones particulares, dicho segundo conector polipeptídico consiste en 5 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 6 a 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5.

En otras realizaciones particulares, dicho segundo conector polipeptídico consiste en 11 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 11 a 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4; y seleccionándose n entre 3, 4 y 5.

En realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto conectores polipeptídicos consisten independientemente en 8 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 10 a 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dichos conectores polipeptídicos tienen independientemente la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 2 y 3.

En realizaciones particulares, dicho primer dominio VL (ia) y dicho primer dominio VH (ib) forman un primer par cognado de dominios variables con especificidad para un primer antígeno diana, y dicho segundo dominio VL (iia) y dicho segundo dominio VH (iib) forman un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para un segundo antígeno diana. En tal realización, dicha primera y dicha segunda proteínas monocatenarias forman dicha proteína heterodimérica en una disposición paralela de dichas proteínas monocatenarias (véase la Figura 15).

En tales realizaciones particulares, dicho primer conector polipeptídico consiste en 10 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 12 a 17 restos de aminoácido, particularmente 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 3.

En tales realizaciones particulares, dicho segundo conector polipeptídico consiste en 10 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 12 a 17 restos de aminoácido, particularmente 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 3.

En tales realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto conectores polipeptídicos consisten independientemente en 10 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 12 a 17 restos de aminoácido, particularmente 15 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 3.

En otras realizaciones particulares, dicho primer dominio VL (ia) y dicho segundo dominio VH (iib) forman un primer par cognado de dominios variables con especificidad para un primer antígeno diana, y dicho segundo dominio VL (iia) y dicho primer dominio VH (ib) forman un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para un segundo antígeno diana. En tal realización, dicha primera y dicha segunda proteínas monocatenarias forman dicha proteína heterodimérica en una disposición antiparalela de dichas proteínas monocatenarias (véanse las Figuras 12 a 14).

En tales realizaciones particulares, dicho primer conector polipeptídico consiste en 5 a 12 restos de aminoácido, particularmente de 5 a 10 restos de aminoácido, particularmente 6 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 2; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 2.

En tales realizaciones particulares, dicho segundo conector polipeptídico consiste en 5 a 12 restos de aminoácido, particularmente de 6 a 10 restos de aminoácido, particularmente 8 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 3; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 2.

En tales realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto conectores polipeptídicos consisten independientemente en 10 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 8 a 12 restos de aminoácido, particularmente 10 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GmS)n; seleccionándose m independientemente entre 2, 3 y 4, particularmente 4; y seleccionándose n entre 1, 2, 3, 4 y 5, particularmente 2.

En otra realización particular de la disposición antiparalela, dicho primer y dicho segundo conectores polipeptídicos consisten cada uno en 10 a 20 restos de aminoácido, que comprenden entre 40 y 60% de restos cargados, particularmente de 12 a 16 restos de aminoácido que comprenden 50% de restos cargados, en cada caso, en donde los dos conectores son capaces de interactuar formando pares intercatenarios de restos cargados positivamente y negativamente. En realizaciones particulares, los restos cargados en uno de dichos primer y segundo conectores son restos cargados positivamente de manera exclusiva, y los restos cargados en el otro de dichos primer y segundo conectores son restos cargados negativamente de manera exclusiva, particularmente en donde dichos primer y segundo conectores se seleccionan entre SEQ ID NO: 16 y 17.

En realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios funcionales se seleccionan independientemente de la lista de: dominios de unión, toxinas, enzimas, hormonas, y proteínas de señalización.

En realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios funcionales se seleccionan independientemente entre los dominios de unión.

En tales realizaciones particulares, los dominios de unión se seleccionan independientemente de la lista de: dominios de unión basados en anticuerpos que incluyen, pero sin limitarse a, scFv, Fab y dominios variables de anticuerpo único, anticuerpos de dominio único basados en la estructura VNAR de tiburón y dominios de unión basados en armazones alternativos que incluyen, pero sin limitarse a, dominios basados en anquirina, Finómeros, avimeros, anticalinas, fibronectinas y sitios de unión que se construyen en regiones constantes de anticuerpos (p. ej., tecnología f-star; véase, por ejemplo, Wozniak-Knopp et al., Protein Eng. Des. Sel. 23 (2010) 289-297).

En tales realizaciones particulares, dichos dominios de unión son dominios de unión basados en anticuerpos seleccionados entre: fragmentos Fv de cadena sencilla y dominios variables de anticuerpo único.

En ciertas realizaciones de este tipo, el orden del dominio variable en tal fragmento Fv de cadena sencilla se selecciona entre (del extremo N-terminal al C-terminal) VL-(conector)-VH y VH-(conector)-VL. En ciertas realizaciones, el orden de los dominios variables es el mismo para todos los fragmentos Fv de cadena sencilla comprendidos en la proteína heterodimérica. En ciertas realizaciones, tres dominios VL están conectados entre sí por dicho primer conector polipeptídico y uno de dichos tercer, cuarto y quinto conectores polipeptídicos, respectivamente, por ejemplo, donde un fragmento Fv de cadena sencilla en el orden VL-(conector)-VH es C-terminal desde dicha primera secuencia de aminoácidos. En ciertas realizaciones, tres dominios VH están conectados entre sí por dicho segundo conector polipeptídico y uno de dichos tercer, cuarto y quinto conectores polipeptídicos, respectivamente, por ejemplo, donde un fragmento Fv de cadena sencilla en el orden VL-(conector)-VH es N-terminal desde dicha segunda secuencia de aminoácidos (véanse las Figuras 12, 13 y 15). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, al menos una de dichas primera y segunda proteínas monocatenarias comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en tres dominios VL o tres dominios VH, respectivamente, conectados por dos conectores polipeptídicos.

En ciertas otras realizaciones, el dominio variable de cualquier dominio de unión basado en anticuerpos que esté directamente conectado a través del conector correspondiente al extremo N-termina y/o C-termina de dicha primera o segunda secuencias de aminoácidos es (a) un dominio VH en caso de que esté fusionado con dicha primera secuencia de aminoácidos, y (b) un dominio VL en caso de que esté fusionado con dicha segunda secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, un dominio VH se fusiona al extremo N- y/o C-terminal de una región central VL-conector-VL, y un dominio VL se fusiona al extremo N- y/o C-terminal de una región central VH-conector-VH (véase, por ejemplo, la Figura 14).

En realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios de unión son fragmentos Fv de cadena sencilla.

En tales realizaciones particulares, el conector polipeptídico que conecta los dominios variables de dichos fragmentos Fv de cadena sencilla consiste en entre 15 y 25 restos de aminoácido, particularmente 20 restos de aminoácido. En realizaciones particulares, dicho conector polipeptídico tiene la secuencia (GGGGS)n, con seleccionándose n entre 3, 4 y 5, particularmente 4.

En realizaciones particulares, el al menos uno de dichos dominios variables de anticuerpo comprende regiones CDR derivadas de un anticuerpo parental de conejo, como se evidencia por los patrones específicos inherentes a las CDR de conejo.

En realizaciones particulares, el al menos uno de dichos dominios variables de anticuerpos comprende regiones marco humanas.

En realizaciones particulares, dicha primera proteína monocatenaria y dicha segunda proteína monocatenaria están entrecruzadas con al menos un enlace disulfuro.

En realizaciones particulares, dicho enlace disulfuro se forma entre un primer resto de cisteína que flanquea dicho primer o dicho segundo dominio VL y un segundo resto de cisteína que flanquea dicho primer o dicho segundo dominios VH.

En realizaciones particulares, dicho enlace disulfuro se forma entre un primer resto de cisteína comprendido en una región marco de dicho primer o dicho segundo dominios VL y un segundo resto de cisteína comprendido en una región marco de dicho primer o dicho segundo dominios VH.

En realizaciones particulares, dicho primer resto de cisteína está ubicado en la posición 141 de dicho primer o dicho segundo dominios VL y dicho segundo resto de cisteína está ubicado en la posición 51 de dicho primer o dicho segundo dominios VH.

En el contexto de la presente invención, el sistema de numeración utilizado para los dominios variables de anticuerpo se basa en el sistema de numeración ("Numeracion AHo") según Honegger y Plückthun (A. Honegger & A. Plückthun "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modeling and analysys tool". J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670).

En realizaciones particulares, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende las tres CDR de VL presentes en una de las secuencias de la proteína VL seleccionadas entre SEQ ID NO: 10, 12, y 14 en un marco de VL de anticuerpo humano, en donde el marco de VL comprende los marcos de Vk FR1, FR2, FR3, particularmente los marcos de Vk1, y un marco FR4, que se selecciona entre un FR4 de Vk, particularmente f R4 de Vk1, y un marco 4 de VA, y las tres CDR de VH presentes en una de las secuencias de proteína VH seleccionadas entre SEQ ID NO: 11, 13, y 15 en un marco de VH de un anticuerpo humano, particularmente un marco de VH3.

En el contexto de la presente invención, la asignación a los marcos de V<k>, VA y/o VH se realiza mediante alineamiento con las secuencias de anticuerpos humanos mostradas en el documento WO 97/08320. Se utiliza la definición de los marcos y las CDR según Honegger y Plückthunloc. cit.

En tales realizaciones particulares, al menos uno de dichos dominios VL comprende (i) regiones marco de Vk humana FR1 a FR3, particularmente regiones marco de Vk1 humana FR1 a FR3; (ii) dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3; y (iii) una región marco IV, que se selecciona entre

a. una secuencia de línea germinal de VA humana para la región marco IV, particularmente una secuencia de línea germinal de VA seleccionada de la lista de: SEQ ID No : 24 a 30 (SEQ ID NO. 16 a 22 según el documento WO 2014/206561;

b. una secuencia basada en VA, que es (bi) una secuencia de VA consenso de secuencias de línea germinal de VA humana para la región marco IV, particularmente SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO. 17 según el documento WO 2014/206561; o (bii) una secuencia de VA consenso de secuencias de VA humanas reordenadas para la región marco IV, particularmente una secuencia consenso VA seleccionada de la lista de: SEQ ID NO: 24 y 25 (SEQ ID NO. 16 y 17 según el documento WO 2014/206561); y

c. una secuencia basada en VA, que tiene una o dos mutaciones, particularmente una mutación, en comparación con la secuencia de la línea germinal VA humana más cercana para la región marco IV.

En una realización particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende (i) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14, y/o (ii) un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.

En una realización particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende (i) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 10, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 11; o (ii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 12, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 13; o (iii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 14, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID N<o>: 15.

En una realización más particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende

(i) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 10, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 10, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 11, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 11; o

(ii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 12, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 12, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 13, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 13,

preferiblemente en donde dicho dominio VL comprende K50Q y A51P (numeración AHo) y dicho dominio VH comprende W54Y, V103T e Y105F (numeración AHo).

En una realización más particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 14, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 14, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 15, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 15, preferiblemente en donde dicho dominio VL comprende I2V, Q3V, K50Q y A51P (numeración AHo) y dicho dominio VH comprende I55V, V103T e Y105F (numeración AHo).

En realizaciones particulares, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende un dominio VL que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteínas seleccionada entre SEQ ID NO: 10, 12, y 14, y un dominio VH que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteínas seleccionada entre SEQ ID NO: 11, 13, y 15 (posiciones según Honegger y Plückthunloc. cit.),particularmente en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende un dominio VL seleccionado entre SEQ ID NO: 10, 12, y 14, y un dominio VH seleccionado entre SEQ ID NO: 11, 13, y 15.

En realizaciones particulares, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende las tres CDR de VL presentes en una de las secuencias de proteína de VL seleccionada entre SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 en un marco de VL de anticuerpo humano, en donde el marco de VL comprende los marcos de Vk FR1, FR2 y FR3, particularmente los marcos de Vk1, y un marco FR4, que se selecciona de un FR4 de Vk, particularmente FR4 de Vk1, y un marco 4 de VA, y las tres CDR de VH presentes en una de las secuencias de proteína de VH seleccionada entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9 en un marco de VH de anticuerpo humano, particularmente un marco de VH3.

En tales realizaciones particulares, al menos uno de dichos dominios VL comprende (i) regiones marco FR1 a FR3 de Vk humana, particularmente regiones marco FR1 a FR3 de Vk1 humana; (ii) dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3; y (iii) una región marco IV, que se selecciona entre

En una realización particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende (i) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según una secuencia seleccionada entre SEQ ID<n>O: 2, 4, 6 y 8, y/o (ii) un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

En una realización particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende (i) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 2, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 3; o (ii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 4, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 5; o (iii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 6, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 7; o (iv) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 8, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 9.

En una realización más particular, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende

(i) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 2, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 2, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 3, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 3; preferiblemente en donde dicho dominio VL comprende I44F, K50Q, A51S y L54R (numeración AHo) y dicho dominio VH comprende E53A, V103T e Y105F (numeración AHo), o

(ii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 4, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 4, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 5, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 5; preferiblemente en donde dicho dominio VL comprende I44F, K50Q, A51S y L54R (numeración AHo) y dicho dominio VH comprende E53A, V103T e Y105F (numeración AHo), o

(iii) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 6, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 6, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 7, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 7; o

(iv) un dominio VL que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VL según SEQ ID NO: 8, en donde dicho dominio VL comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VL según SEQ ID NO: 8, y un dominio VH que exhibe al menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento, preferiblemente al menos 90 por ciento, de identidad de secuencia con la secuencia de VH según SEQ ID NO: 9, en donde dicho dominio VH comprende los dominios CDR CDR1, CDR2 y CDR3 tomados de la secuencia de VH según SEQ ID NO: 9.

En realizaciones particulares, dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende un dominio VL que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteínas seleccionada entre SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, y un dominio VH que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteínas seleccionada entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9 (posiciones según Honegger y Plückthunloc. cit.),particularmente en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende un dominio VL seleccionado entre SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8, y un dominio VH seleccionado entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

En tales realizaciones particulares, dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios de unión son fragmentos Fv de cadena sencilla con especificidad para una diana seleccionada de la lista de: una diana cancerosa, y una diana presente en células efectoras inmunitarias.

En el contexto de la presente solicitud, el término "diana" se refiere a un compañero de unión cognado de un dominio de unión, tal como un antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a tal dominio de unión.

En realizaciones particulares, dicha diana es una diana cancerosa, en particular un antígeno o un epítopo que están presentes sobre la superficie de uno o más tipos de células tumorales o células asociadas a tumores a una mayor concentración y/o en una configuración estérica diferente en comparación con la superficie de las células no tumorales. En particular, dicha diana cancerosa está presente en la superficie de uno o más tipos de células tumorales o de estroma tumoral, pero no sobre la superficie de células no tumorales.

En otras realizaciones particulares, dicha diana es un antígeno o epítopo que se expresan preferentemente sobre células implicadas en enfermedades autoinmunitarias. En otras realizaciones, dicho antígeno o epítopo se expresan preferentemente sobre células implicadas en una enfermedad inflamatoria.

En ciertas realizaciones, dicha primera y dicha segunda proteínas de cadena sencilla se seleccionan de la siguiente lista, en donde VLA, VLB, VHA y VHB corresponden a dichos primer y segundo dominios VL y VH, respectivamente, y VLC, VLD, VLE, VLF, VHC, VHD, VHE y VHF forman parte de fragmentos de cadena sencilla con un conector correspondiente a dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios funcionales, respectivamente, conectados a través del tercer, cuarto, quinto y/o sexto conectores CONECTOR3, CONECTOR4, CONECTOR5 y CONECTOR6) al dominio central (en negrita); todas las construcciones se escriben en la dirección N-terminal a C-terminal:

A (paralela;6Fv):

cadena 1: VLC-(conector)-VHC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLB-(CONECTOR4)-VLD-(conector)-VHD cadena 2: VLE-(conector)-VHE-(CONECTOR5)-VHA-(CONECTOR2)-VHB-(CONECTOR6)-VLF-(conector)-VHFB (antiparalela 6Fv):

cadena 1: VLC-(conector)-VHC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLB-(CONECTOR4)-VLD-(conector)-VHD cadena 2: VLE-(conector)-VHE-(CONECTOR5)-VHB-(CONECTOR2)-VHA-(CONECTOR6)-VLF-(conector)-VHFC1 (antiparalela 4 Fv) (véase la Figura 12):

cadena 1: VLC-(conector)-VHC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLB

cadena 2: VLD-(conector)-VHD-(CONECTOR4)-VHB-(CONECTOR2)-VHA

C2 (antiparalela 4 Fv) (véase la Figura 14):

cadena 1: VLC-(conector)-VHC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLB

cadena 2:VHB-(CONECTOR2)-VHA-(CONECTOR4)-VLD-(conector)-VHD

C3 (antiparalela 4 Fv):

cadena 1:VLA-(CONECTOR1)-VLB-(CONECTOR3)-VLC-(conector)-VHC

cadena 2: VLD-(conector)-VHD-(CONECTOR4)-VHB-(CONECTOR2)-VHA

C4 (antiparalela 4 Fv):

cadena 1:VLA-(CONECTOR1)-VLB-(CONECTOR3)-VLC-(conector)-VHC

cadena 2:VHB-(CONECTOR2)-VHA-(CONECTOR4)-VLD-(conector)-VHD

D1 (paralela 4 Fv) (véase la Figura 15):

cadena 1: VLC-(conector)-VHC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLB

cadena 2: VLD-(conector)-VHD-(CONECTOR4)-VHA-(CONECTOR2)-VHB

D2 (paralela 4 Fv):

cadena 1: VLC-(conector)-VHC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLB

cadena 2:VHA-(CONECTOR2)-VHB-(CONECTOR4)-VLD-(conector)-VHD

D3 (paralela 4 Fv):

cadena 1:VLA-(CONECTOR1)-VLB-(CONECTOR3)-VLC-(conector)-VHC

cadena 2: VLD-(conector)-VHD-(CONECTOR4)-VHA-(CONECTOR2)-VHB

D4 (paralela 4 Fv):

cadena 1:VLA-(CONECTOR1)-VLB-(CONECTOR3)-VLC-(conector)-VHC

cadena 2:VHA-(CONECTOR2)-VHB-(CONECTOR4)-VLD-(conector)-VHD

En ciertas realizaciones, el orden de los dominios VH y VL en uno o más de los fragmentos scFv comprendidos en las construcciones de acuerdo con los formatos heterodiméricos A, B, C1 a C4, o D1 a D4 están en orden inverso (p. ej.,VHC-(conector)-VLC-(CONECTOR3)-VLA-(CONECTOR1)-VLD-(CONECTOR4)-VHD-(CONECTOR)-VLDen la cadena 1 de la construcción A.

En estos formatos, la localización de dos dominios pesados variables divididos VHA y VHB en una cadena de proteína y los dos dominios ligeros variables correspondientes VLA y VLB en la otra cadena de proteína (VH-VH/VL-VL) evita la formación de emparejamientos de dominios intracatenarios que dan como resultado estructuras inactivas de tipo dianticuerpo monocatenario (scDb), como sería el caso si la orientación VH-VL/VH-VL del dianticuerpo convencional - similar al diseño sugerido por Kipriyanov et al. - se hubiera utilizado para impulsar la heterodimerización. Por el contrario, la orientación VH-VH/VL-VL fuerza la formación de proteínas exclusivamente heterodiméricas biespecíficas a hexaespecíficas.

Existe la posibilidad teórica de que el emparejamiento de dominios VH/VL del dominio central VHA-VHB/VLA-VLB de unión a la diana A y B produzca un dominio central inactivo debido al emparejamiento inapropiado de VHA con VLB y VHB con VLA que da como resultado los pares VHA-VLB y VHB-VLA. De manera inesperada y sorprendente, tales variantes inactivas no se han observado hasta ahora. Sin desear vincularse a la teoría, la dimerización podría conducirse hacia el apareamiento cognado debido al empaquetamiento más eficiente de las CDR de pares cognados en oposición a las posibles interferencias de empaquetamiento que se producen en apareamientos no coincidentes.

Con el fin de impulsar aún más la heterodimerización hacia el emparejamiento activo en el dominio central VH-VH/VL-VL, podrían aplicarse las tecnologías de botón en ojal o similares en uno o, si se aplican recíprocamente, en ambos pares VL/VH del dominio central VH-VH/VL-VL. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el emparejamiento activo en el dominio central VH-VH/VL-VL de dicha proteína heterodimérica está respaldado adicionalmente por una tecnología seleccionada entre: botón en ojal (Zhu et al., "Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation", Protein Sci abril de 1997; 6(4): 781-788), y puentes de cisteína intercatenarios.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la proteína heterodimérica de la presente invención, que comprende (i) proporcionar un ácido nucleico o ácidos nucleicos según la presente invención, o un vector o vectores según la presente invención, que expresan dicho ácido nucleico o dichos ácidos nucleicos o dicho vector o dichos vectores y recoger dicha proteína heterodimérica del sistema de expresión, o (ii) proporcionar una célula anfitriona o células anfitrionas de la presente invención, cultivar dicha célula anfitriona o células anfitrionas y recolectar dicha proteína heterodimérica del cultivo celular.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína heterodimérica de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables potencian o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles.

La presenta solicitud se refiere además a la proteína heterodimérica de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, particularmente una enfermedad humana, más particularmente una enfermedad humana seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria. En realizaciones particulares, al menos uno de dichos tercer, cuarto, quinto, o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la correspondiente enfermedad.

Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar", "tratado", y similares, como se emplean en el presente documento, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser terapéutico en términos de una curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad o el retraso del progreso de la enfermedad. "Tratamiento", como se emplea en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, p.ej., en un ser humano, e incluye: (a) la inhibición de la enfermedad, p. ej., deteniendo su desarrollo; y (c) el alivio de la enfermedad, p. ej., causando la reversión de la enfermedad.

Adicionalmente, la presente solicitud se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad, particularmente una enfermedad humana, más particularmente una enfermedad humana seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria, que comprende la etapa de administrar la proteína heterodimérica de la presente invención, en donde al menos uno de dichos tercer, cuarto, quinto, o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la correspondiente enfermedad. En particular, la presente invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de la proteína heterodimérica de la presente invención, en donde al menos uno de dichos tercer, cuarto, quinto, o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la correspondiente enfermedad.

El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan indistintamente en el presente documento.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz", o "cantidad efectiva" se refieren a la cantidad de un agente que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar tal tratamiento de la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del agente, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto que se vaya a tratar.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a uso de la proteína heterodimérica de la presente invención en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad, particularmente una enfermedad humana, más particularmente una enfermedad humana seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria, en donde al menos uno de dichos pares cognados de dominios VL y VH, o de dichos tercer, cuarto, quinto o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la enfermedad correspondiente.

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a uso de la proteína heterodimérica de la presente invención en el tratamiento de una enfermedad, particularmente una enfermedad humana, más particularmente una enfermedad humana seleccionada entre cáncer, una enfermedad inflamatoria y una autoinmunitaria, en donde al menos uno de dichos pares cognados de dominios VL y VH, o de dichos tercer, cuarto, quinto o sexto dominios funcionales es capaz de interactuar específicamente con una diana de relevancia terapéutica en la enfermedad correspondiente.

Bibliografía

R1. Skerra, A., y Plückthun, A. (1988). Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240, 1038-1041.

R2. Rothlisberger et al., (2005). Domain interactions in the Fab fragment: A comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. J Mol Biol 347, 773 789.

R3. Ridgway et al., 1996. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 9, 617-621.

R4. Zhu (1997) Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation. Protein Sci. 6, 781-788

R5. Schaefer, W., et al., 2011b. Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11187-11192.

R6. Holliger et al., "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

90, 6444-6448.

R7. Arndt et al., 1999. Abispecific diabody that mediates natural killer cell cytotoxicity against xenotransplantated human Hodgkin's tumors. Blood 94, 2562-2568.

R8. Kipriyanov et al., 1999. Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics. J. Mol. Biol. 293, 41-56.

R9. Alt et al., 1999. Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gamma1 Fc or CH3 region. FEBS Lett. 454, 90-94.

R10. Johnson et al., 2010. Effector cell recruitment with novel Fv-based dual-affinity retargeting protein leads to potent tumor cytolysis and in vivo B-cell depletion. J. Mol. Biol.399, 436-449.

R11. De Jonge et al., (1995) Production and characterization of bispecific single-chain antibody fragments. Mol. Immunol. 32, 1405-1412.

R12. Reiter et al., (1994) Engineering interchain disulfide bonds into conserved framework regions of Fv fragments: improved biochemical characteristics of recombinant immunotoxins containing disulfide-stabilized Fv. Protein Eng. 7, 697-704.

R13. Pack, P., y Plückthun, A. (1992). Miniantibodies: Use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry 31, 1579-1584.

R14. Schoonjans et al., Fab chains as an efficient heterodimerization scaffold for the production of recombinant bispecific and trispecific antibody derivatives. J Immunol. 2000 15 dic;165(12):7050-7.

R15. Orcutt et al., 2009. A modular IgG-scFv bispecific antibody topology. Pro-tein Eng. Des. Sel. 23, 221 228.

R16. Wu, C. et al., 2007. Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nat.Biotechnol. 25, 1290-1297.

R17. "mAbs"; Kohler & Milstein, Nature. 256 (1975) 495-7

R18. Umaña et al., 1999. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibodydependent cellular cytotoxic activity. Nat. Biotechnol. 17, 176 -180

R19. Yu, Y. J. et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44 (2011).

R20. Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum halflives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6.

R21. Spiess et al., 2015. Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 27 enero de 2015.

R22. Davis et al., 2013. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format. Patente de Estados Unidos Núm. 8.586.713. Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

R23. Shahied LS, et al., Bispecific minibodies targeting HER2/neu and CD16 exhibit improved tumor lysis when placed in a divalent tumor antigen binding format. J Biol Chem. 24 dic de 2004;279(52):53907-14. Epub 7 oct 2004.

R24. Milstein. C y Cuello.A.C. (1983) Nature, 305, 537-54

R25. Chang et al., The dock and lock method: a novel platform technology for building multivalent, multifunctional structures of defined composition with retained bioactivity. Clin Cancer Res. 15 sep de 2007;13(18 Pt 2):5586s-5591s.

R26. Deyev et al., (2003). Design of multivalent complexes using the barnase- barstar module. Nature biotechnology, 21(12), 1486-1492.

R27. Pack, P., y Plückthun, A. (1992). Miniantibodies: Use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry 31, 1579-1584.

R28. Halin et al. (2003). Synergistic therapeutic effects of a tumor targeting antibody fragment, fused to interleukin 12 and to tumor necrosis factor a. Cancer research, 63(12), 3202-3210.

R29. D. Müller et al., Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibody molecules by fusión to human serum albumin J. Biol. Chem., 282 (2007), pág. 12650-12660

R30. EP1293514

R31. Milstein C, y Cuello AC (1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature 305:537-540.

R32. Skander RN, Tewari KS: Epithelial cell-adhesion molecule directed trifuctional antibody immunotherapy for symptom management of advanced ovarian cancer. Clin Pharmacol 2013, 5:55-61.

R33. Stiegelmaier J, Benjamin J, Nagorsen D: Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer. Expert Opin Biol Ther 2015, 15:1093-1099.

R34. Bluemel C, Haussmann SW, Fluhr P, Sriskandarajah M, Stallcup WB, Baeuerle PA, Kufer P: Epitope distance to the target cell membrane and antigen size determine the potency of T cell mediated lysis by Bite antibodies specific for a large melanoma surface antigen. Cancer Immunol Immunother 2010, 59:1197-1209.

R35. Kohnke T, Krupka C, Tischer J, Kno'sel T, Subklewe M: Increase of PD-L1 expressing B-precursor ALL cells in a patient resistant to the CD19/CD3-bispecific T cell engager antibody blinatumomab. J Hematol oncol 2015, 8:111.

R36. Junttila TT, Li J, Johnston J, H Ristopoulos M, Clark R, Ellerman D, Wang BE, Li Y, Mathieu M, Li G: Antitumor efficacy of a bispecific antibody that targets HER2 and activates T cells. Cancer Res 2014, 74:5561-5571.

R37. Laszlo GS, Gudgeon CJ, Harrington KH, Walter RB: T-cell ligands modulate the cytolytic activity of the CD33/CD3 BiTE antibody construct, AMG 330. Blood Cancer J 2015, 5:e340.

R38. Arndt C, Feldmann A, von Bonin M, Cartellieri M, Ewen E, Koristka S, Michalk U, Stamova S, Berndt N, Gocht A et al.: Costimulation impoves the killing capability of T cells redirected to tumor cells expresing low levels of CD33: Description of a novel modular targeting system. Leukemia 2014, 28:59-69.

R39. Compte M, Álvarez-Cienfuegos A, Nuñez-Prado N, et al. Fuctional comparison of single-chain and twochain anti-CD3-based bispecific antibodies in gene immunotherapy applications. Oncoimmunology.

2014;3:e28810. doi:10.4161/onci.28810.

R40. Yariv Mazor, Kris F. Sachsenmeier, Chunning Yang, Anna Hansen, Jessica Filderman, Kathy Mulgrew, Herren Wu y William F. Dall'Acqua; Enhanced tumor targeting selectivity by modulating bispecific antibody binding affinity and format valence. Scientific Reports 7, Artículo núm.: 40098 (2017) doi:10.1038/srep40098.

R41. Reiter Y, Brinkmann U, Lee B, Pastan I., Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nat Biotechnol. octubre de 1996;14(10): 1239-45.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de formatos multiespecíficos

Métodos y Resultados

Diseño, expresión y purificación de construcciones

Se diseñaron moléculas MATCH heterodiméricas para que contuvieran la especificidad para CD3e y HSA en los dominios variables divididos del ensamblaje central heterodimérico. Se ancló un scFv que se unía a IL23R al extremo N-terminal de cada uno de los dominios de heterodimerización. Pasa asociar covalentemente las dos cadenas peptídicas de MATCH y para confirmar el ensamblaje correcto de los correspondientes dominios en el núcleo de heterodimerización se introdujo un disulfuro intercatenario (descrito en [11]) en la interfase VL/VH de cualquiera de los dominios anti-CD3 o anti-HSA.

Se generó una serie de realizaciones diferentes variando parámetros como, la disposición de MATCH (paralela o anti paralela), los dominios de unión a CD3 utilizados (clones 28-21-D09 o 09-24-H09), el dominio de unión a HSA utilizado (clones 19-01-H04 o 23-13-A01) y los diferentes conectores centrales (SEQ 16-20). Las dos disposiciones posibles (paralela o anti-paralela) del formato MATCH se han descrito con detalle (documento WO2016202457) la disposición anti-paralela (ap): Cadena A (VL1-VH1-VH2-VH3) y Cadena B (VL4-VH4-VL3-VL2); y la disposición paralela (p): Cadena A (VL1-VH1-VH2-VH3) y Cadena B (VL4-VH4-VL2-VL3). Aparte de la variación de la disposición, también se han sometido a prueba diferentes elecciones para dos dominios centrales, los módulos de scFv y los conectores centrales mostrados en las Tablas 1 y 2:

��

Para generar las construcciones esbozadas anteriormente, se tradujeron de nuevo las secuencias de aminoácidos para los dominios Fv y los conectores a las correspondientes secuencias nucleicas, que se sintetizaron de novo. Las secuencias codificantes se ensamblaron y se clonaron mediante técnicas convencionales de biología molecular (p. ej., Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual) en un vector de expresión adecuado (p. ej. pcDNA3.1, Invitrogen) para la selección de la proteína recombinante.

Se produjo la proteína MATCH en células CHO-S (Thermo Fisher) mediante transfección transitoria utilizando el kit de expresión CHOgro (Mirus Bio LLC) de acuerdo con el protocolo del proveedor. La fracción de proteínas se purificó del sobrenadante de CHO-S que se había cosechado por centrifugación en cuanto la viabilidad celular descendió por debajo de 80% (después de 6 días de incubación con oscilación orbital a 37°C y CO2 al 8%. La purificación se realizó mediante purificación por afinidad L capturando los dominios variables con resina Capto-L (GE Healthcare) en una columna fijada a un sistema Ákta Pure FPLC (GE Healthcare) y eluyendo con Ácido cítrico 0,1 M, pH 2,0, seguido del ajuste rápido del pH de la muestra con la adición de Tris-HCl 2M 1/3 (v/v), pH 7,5. A continuación, se cambió el tampón de las soluciones de proteínas con IxPBS de pH 7,4 (complementado con Arginina 300 mM) utilizando una membrana de diálisis (Corte de PM a 3,5 kDa, Spectrum Laboratories Inc.) y finalmente se concentraron utilizando una columna Vivaspin Protein Concentrator Spin (Corte de PM a 5 kDa, GE Healthcare).

Las proteínas de referencia en el formato de dianticuerpo de cadena sencilla (scDb) se diseñaron como se ha descrito previamente [10]. En resumen, los dominios variables enumerados en la Tabla 1 se dispusieron de una manera VLA-S1-VHB-L1-VLB-S2-VHA, donde S1 y S2 son conectores GS4 cortos y L1 es un conector (GS4)4 largo. Las moléculas generadas como referencia incluían los fragmentos Fv idénticos a los de la construcción MATCH.

Todas las proteínas sometidas a prueba se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución y exclusión por tamaños (SE-HPLC) y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para determinar la pureza y espectroscopia UV/Vis para determinar el contenido de proteína. En el caso de la construcción MATCH, la conexión mediante disulfuro cuantitativa de los dos heterodímeros se confirmó mediante SDS-PAGE no reductora.

Resultados

El análisis de SDS-PAGE de las variantes de construcción MATCH muestra en la Figura 1 que en condiciones no reductoras se observa un desplazamiento casi cuantitativo de la banda de proteína hacia el heterodímero conectado covalentemente. Sin embargo, en condiciones reductoras, se observa una doble banda en el tamaño de las cadenas individuales.

^ Debido a la posición del puente disulfuro intercatenario designado en la interfase de un par VL/VH es altamente improbable un emparejamiento erróneo de las cadenas, especialmente en combinación con la afinidad observada de los dominios centrales en el experimento de SPR.

Medición de la afinidad mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR)

Se midieron las afinidades de unión de los dominios de unión a la diana individuales en el formato Fv de cadena sencilla (scFv), así como de las construcciones MATCH heterodiméricas purificadas a las proteínas diana recombinantes receptor de IL-23 humano ECD (IL23R), CD3 gamma-épsilon monocatenario (CD3) humano y seralbúmina humana HSA mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) utilizando un dispositivo Biacore T200 (General Electric) o MASS-1 (Sierra Sensors). En resumen, las proteínas recombinantes se inmovilizaron directamente mediante química de acoplamiento con aminas en un CM5 (Biacore, General Electric) o chip sensor de alta capacidad Sierra Sensors). Se inyectaron diferentes concentraciones de los dominios de unión a la diana como analito y se midió la respuesta de unión (en unidades de respuesta, UR). Después de cada inyección, se realizó un procedimiento de regeneración. Los datos de unión obtenidos se restaron dos veces (inyección de analito cero, canal de flujo de referencia) y se analizaron utilizando el respectivo paquete de soporte lógico.

Resultados

Las afinidades de las construcciones MATCH heterodiméricas para cada una de las dianas fueron generalmente muy similares a las afinidades de los dominios de unión individuales medidas en el formato scFv o scDb. Notablemente, la afinidad aparente de la construcción MATCH por IL23R parecía aumentar en comparación con la molécula de referencia scDb, lo que se puede explicar por el efecto de avidez resultante de la incorporación de dos dominios de unión a IL23R en cada molécula MATCH.

Estos datos demuestran una actividad de unión mantenida para cada dominio variable en las construcciones MATCH y confirman el correcto ensamblaje de los pares de dominios variables cognados independientemente de la elección de los conectores centrales, la ubicación del disulfuro intercatenario, los dominios anti-CD3, anti-HSA utilizados o los módulos de scFv anclados.

Se observaron ciertas diferencias en las afinidades hacia las dianas del dominio central para las diferentes construcciones. Para las construcciones que contenían un enlace disulfuro en la interfase VL/VH del dominio CD3, la combinación del conector central cargado (que comprende SEQ16 y SEQ17 utilizada en PRO746 mostró la mejor afinidad.

Activación de células T mediante el ensayo de gen informador NFAT

Ensayo NFAT

Se generó una línea celular CHO-K1 que expresaba establemente el heterodímero IL23R IL12Rbeta 1 humano bajo el control del promotor de CMV mediante transducción lentiviral de la línea celular CHO-K1 parental. Estas células se utilizaron como células diana en el ensayo de gen informador NFAt, mientras se utilizó la línea celular CHO-K1 parental como control. Se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano de color blanco 25.000 células diana viables diluidas en 50 pl de medio de ensayo (RPMI 1640, FCS al 10%) que contenía 25 g/L de seralbúmina humana. A continuación, se añadieron 25 pl de proteínas de prueba concentradas 4 veces en medio de ensayo que contenía HSA (25 g/L) a pocillos apropiados. Finalmente se añadieron 25 pl de medio de ensayo con HSA que contenía 50.000 células Jurkat a cada pocillo y las placas se incubaron a RT durante 10 min. con agitación suave. Se preparó una placa para cada punto de tiempo tal como 5h, 22h, o 30h correspondiente a los tiempos de incubación a 37°C, CO2 al 5%. Con el fin de detectar la actividad luciferasa, se utilizó un kit de ensayo de luciferasa de una etapa (AMSBIO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, al final de los tiempos de incubación, se mezcló el sustrato reactivo con luciferasa con el tampón reactivo con luciferasa y se añadieron 50 pl a cada pocillo y las placas se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a RT. Las placas se leyeron con el TopCount (Perkin Elmer). Se sembraron 25.000 células diana viables diluidas en 50 pl de medio de ensayo (RPMI 1640, FCS al 10%) en placas de 96 pocillos de fondo redondo de color blanco. A continuación, se añadieron a los pocillos apropiados 25 pl de proteínas de prueba concentradas 4 veces diluidas en medio de ensayo. Finalmente, se añadieron a cada pocillo 25 pl de medio de ensayo que contenía 50.000 células Jurkat y las placas se incubaron a RT durante 10 min con agitación suave. Se preparó una placa para cada punto de tiempo tal como 5h, 22h, o 30h correspondiente a los tiempos de incubación a 37°C, CO2 al 5% que contenían concentraciones fisiológicas de seralbúmina humana o no. Con el fin de detectar la actividad luciferasa, se utilizó un kit de ensayo de luciferasa de una etapa (AMSBIO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, al final de los tiempos de incubación, se mezcló el sustrato reactivo con luciferasa con el tampón reactivo con luciferasa y se añadieron 50 pl a cada pocillo y las placas se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad a RT. Las placas se leyeron con el TopCount (Perkin Elmer).

Cuantificación de IL-2 mediante ELISA

Se recogieron sobrenadantes de 100 pl en diferentes momentos puntuales durante el ensayo de gen informador NFAT de los pocillos que contenían 250 nM de las moléculas de prueba. La cuantificación de IL-2 se realizó utilizando el kit IL-2 ELISA MAX Standard (Biolegend) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se aplicaron como recubrimiento 100 pl de anticuerpo de captura diluido en tampón de dilución (PBS, BSA al 1%, Tween 20 al 0,2%) sobre placas de 96 pocillos Maxisorb (Nunc) durante la noche a 4°C. Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,005%). Los pocillos se bloquearon con 300 pl de tampón de dilución durante 1 h a TR, después se lavaron 3 veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron sobrenadantes de 100 pl de las muestras sometidas a prueba, así como 100 pl de cada una de las concentraciones de la curva patrón a los pocillos apropiados, y las placas se incubaron durante 2 h a RT con movimiento oscilante. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado antes de la incubación con el anticuerpo de detección durante 1 h a RT con movimiento oscilante. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con tampón de lavado y se añadieron 100 pl de Avidina-HRP a cada pocillo y se incubaron a RT durante 30 minutos con movimiento oscilante. Se realizaron 3 lavados finales antes de la adición de 100 pl de solución sustrato de TMB. Las placas se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad y la reacción se detuvo añadiendo 100 pl de solución de Parada a cada pocillo. La absorbancia se leyó a 450 nm y 570 nm. La absorbancia a 570 nm se restó de la absorbancia a 450 nm.

Resultados

Tabla 4: Datos tabulados del ensayo de activación de células T en el punto

temporal de 5h para las diferentes construcciones con respecto a scDb CD3 / HSA de referencia (PR0389) en placa

El análisis funcional de las variantes de construcciones MATCH en el ensayo de gen informador NFAT después de 5 h de incubación mostró la potencia para activar las células T. Para la comparación entre las diferentes placas, los datos se normalizaron a una referencia en placa.

Para la caracterización adicional en profundidad, se utilizó la construcción MATCH de afinidad más alta (para CD3) PRO746, que también mostró la mejor potencia para activar las células T. Además, se utilizaron las construcciones PRO821 y PRO824 a) para evaluar la actividad funcional del dominio central HSA/CD3 en el contexto de un dominio de direccionamiento diferente (en este caso anti-Her2), y b) para evaluar el posicionamiento alternativo del enlace disulfuro en el dominio de unión a HSA en lugar del dominio anti-CD3.

La potencia de las moléculas para activar las células T en presencia de células diana portadoras de antígenos y concentraciones fisiológicas de seralbúmina humana (HSA) se determinó a lo largo de múltiples puntos de tiempo y concentraciones de moléculas (véase la Figura 2). El MATCH heterodimérico (PRO746) se comparó con un scDb biespecífico con especificidades para CD3 e IL23R (PRO624) y scDb biespecífico que combinaba las especificidades presentes en el núcleo de heterodimerización de MATCH (CD3<e>y HSA) como control negativo (PRO811). Los datos muestran que, si bien el control negativo casi no muestra activación de las células T, el scDb PRO624 muestra una potente activación de las células T en presencia de células diana que expresan IL23R, tanto en el punto de tiempo temprano como tardío. La amplitud de la señal alcanza la saturación en ambos puntos de tiempo y la CE50 mejora aproximadamente siete veces desde la incubación de 5 horas a la de 30 horas (desde 141,8 pM a 19,8 pM). Curiosamente aproximadamente cinco veces desde la incubación de 5 horas a la de 30 horas. Resulta interesante que la molécula MATCH, PRO746, muestre una dependencia del tiempo pronunciada en la activación de las células T. Si bien la respuesta a las 5 h muestra solamente una baja amplitud de señal, la respuesta con MATCH-4 alcanza una amplitud de señal muy similar a la de scDb después de 30 horas. La CE50 permanece prácticamente cinco veces más alta que para scDb en todos los puntos de tiempo (266,3 pM después de 5 h y 102,2 pM después de 30 h) (véanse los puntos (véase la Figura 4). Por lo tanto, los dos formatos difieren principalmente en la cinética de activación de células T (véase también la Figura 3) en lugar de en su máximo potencial de activación.

El gráfico de la activación de células T para las diferentes moléculas en presencia de células desprovistas de la proteína diana (Figura 3) casi no muestra activación de las células T ni siquiera a concentraciones bastante por encima de la CE50 para la activación de células T en presencia de células diana. Esto, junto con la carencia de activación de células T con PRO811, confirma el requerimiento de la unión a la célula diana para la activación de células T para las moléculas que contienen el dominio central HSA/CD3. La carencia de activación inespecífica de células T es un requisito previo para evitar efectos secundarios no deseados por las terapias que reclutan células T.

El gráfico de los valores meseta de las señales dosis-respuesta en diferentes momentos puntuales (Figura 4) muestra que el scDb de referencia (PRO624) induce una amplitud de señal casi máxima ya a las 5 h de incubación. Por otro lado, la amplitud de señal inducida por la molécula MATCH comienza por debajo de 20% del valor de scDb, sin embargo, aumenta paulatinamente con el tiempo hasta alcanzar finalmente el mismo nivel de activación de células T después de 30 h de incubación.

El gráfico de los valores de CE50 de las curvas dosis-respuesta para scDb y la molécula MATCH (Figura 5) muestra una mejora de la CE50 en el transcurso del tiempo, curiosamente, sin embargo, la mejora de la CE50 sigue un patrón muy similar para ambas moléculas, y las curvas discurren paralelas entre sí. Por lo tanto, las cinéticas para la potencia (CE50) son similares para ambos, scDb pequeño y MATCH más grande que contiene un dominio de unión a HSA. No obstante, las cinéticas para la activación de células T máxima difieren en gran medida, ya que MATCH muestra una activación más lenta.

La liberación del marcador IL-2 de células T se cuantificó para las muestras del ensayo de gen informador NFAT de las moléculas PRO624 (scDb) y PRO746 (MATCH) (véase la Figura 6). Para la molécula de referencia scDb se observa un fuerte incremento de la concentración de IL-2 durante la incubación de 30 h. Curiosamente, la cantidad de IL-2 presente en los pocillos con las moléculas MATCH fue considerablemente inferior para todos los puntos de tiempo incluso después de 30 h, cuando la señal de activación de células T correspondiente era casi idéntica.

En resumen, los descubrimientos de los autores de la presente invención indican que el formato MATCH que comprende el dominio central HSA/CD3 tiene la misma capacidad para activar las células T, aunque con una cinética de activación más lenta. Esto resulta interesante a la luz del hecho de que, los efectos secundarios asociados con la liberación de citocinas con otros agentes biespecíficos que se vinculan a células T (p. ej., blinatumomab/blincyto) son los más fuertes durante los primeros tiempos de dosificación. De hecho, solo se toleran dosis bajas de blinatumomab/blincyto al principio de la terapia, aunque después se toleren dosis considerablemente más altas. Una probable explicación de esto es el potente estallido de citocinas que se produce inmediatamente después de la dosificación que puede conducir al denominado síndrome de liberación de citocinas (SLC). Por lo tanto, es probable que el MATCH presentado aquí, debido a su lenta cinética de activación de células T y a la consiguiente reducción de la liberación de citocinas conduzca a una reducción de la toxicidad, mientras tiene la capacidad de alcanzar el mismo nivel de activación de células T con el tiempo. Además, la reducción de la liberación de citocinas incluso a niveles similares de activación de células T es un rasgo aún más sorprendente de PRO746, que sugiere la reducción de la aparición delsíndrome de liberación de citocinasfrecuentemente observado asociado con terapias de reclutamiento de células T.

Ensayo de citotoxicidad (agotamiento de células diana impulsado por células T)

Fraccionamiento de células sanguíneas

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre recién extraída de voluntarios sanos utilizando el medio de separación de linfocitos (Stemcell Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la sangre se diluyó 1:1 con tampón de aislamiento en tubos de centrífuga de 50 ml (PBS) FCS al 2%, EDTA 2 mM) y se aplicó a tubos Leucosep que contenían la cantidad recomendada de medio Lymphoprep. Los tubos LeucoSep se centrifugaron 30 minutos a 800 g sin frenado a RT. A continuación, la capa celular que contenía las PBMC se recogió y se lavó dos veces con tampón de aislamiento y los glóbulos rojos se lisaron utilizando tampón de lisis para glóbulos rojos durante 5 minutos a RT. A continuación, las células se lavaron una vez con tampón de aislamiento y una vez con medio de ensayo (RPMI-1640, FCS al 10%). Después de eliminar las plaquetas, las PBMC aisladas se resuspendieron en medio de ensayo que contenía 25 g/ml de HSA a una densidad de 3x106 células viables por ml.

Ensayo de citotoxidad in vitro basado en citometría de flujo y activación de células T CD8+

Se generó una línea celular CHO-K1 que expresaba el heterodímero y IL23R IL12Rbeta 1 humano bajo el control de un promotor de CMV mediante transducción lentiviral de la línea celular CHO-K1 parental. Estas células se utilizaron como células diana en el ensayo de citotoxicidad, mientras se utilizó la línea celular CHO-K1 parental como control. Además, también se generó una línea celular CHO-K1 que expresaba establemente HER2 humano mediante transducción lentiviral de células CHO-K1 parentales con ADNc de HER-1 de longitud completa. Los niveles de expresión de HER2 e IL23R se determinaron mediante citometría de flujo. Los niveles de HER2 en la superficie celular son mucho más altos en comparación con los niveles de IL23R. Se añadieron 5.000 células diana viables marcadas previamente con PKH67 y se diluidas en 75 pl de medio de ensayo (RPMI-1640, FCS al 10%) que contenía 25 g/L de seralbúmina humana (HSA) a placas de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 25 pl de las proteínas sometidas a prueba concentradas 6 veces diluidas en medio de ensayo con HSA a los pocilios apropiados. Después, con el fin de tener una razón E:T de 30:1, se añadieron 150.000 células efectoras viables (PBMC) diluidas en 50 j l de medio de<ensayo que contenía HSA a cada pocillo y las placas se mezclaron en un mezclador de nutación a>R<t antes de su>incubación a 37°C, CO2 al 5%. Después de 16 horas, las células se tripsinizaron, se resuspendieron en tampón de tinción (PBS, BCS al 2%, EDTA 2 mM) y se transfirieron a placas sin unión.

Las células se tiñeron con diferentes marcadores como CD69, CD8, CD4, CD11c y Anexina V. Para el análisis, el foco está en las células apoptóticas y muertas y las células T CD8+ activadas. De ese modo, las células diana se identifican por la fluorescencia verde (PKH67) y su viabilidad se analiza por medio de Anexina V-APC. Las células efectoras (células CD8+) se identificaron detectando CD8 sobre su superficie (PerCP-Cy5.5 anti-CD8). La activación de las células T CD8+ se detecta finalmente mediante cuantificación de la expresión de CD69 (PE anti-CD69). Se utiliza CD4 para discriminar mejor las células T CD8+ y CD4+. Se utiliza CD11c para marcar los monocitos y las células dendríticas y excluirlos. Para cada marcador excepto Anexina-V, los anticuerpos contra se incuban 30 minutos a RT con agitación suave. Las células se lavan con tampón de tinción, una vez con tampón de unión a Anexina y se lleva a cabo la tinción de la Anexina-V durante 30 minutos a RT con agitación. Las células se lavan una vez más con tampón de unión a Anexina-V y el análisis de citometría de flujo se realiza en un Citómetro de Flujo Novocyte.

El porcentaje de lisis de células diana específicas se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

100

El porcentaje de células T CD8+ activadas corresponde a la proporción de células T CD69+ CD8+.

Cuantificación de IL-2 mediante citometría de flujo

La cuantificación de IL-2 en el sobrenadante se realizó utilizando el kit II de citocinas Th1/Th2 humanas de matriz de cuentas citométricas (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 50 j l de las cuentas de captura mezcladas a cada sobrenadante analizado, así como a las diluciones patrón de IL-2. Después de 3 horas de incubación a RT en la oscuridad, las cuentas se lavaron 3 veces con tampón de lavado y se analizaron mediante citometría de flujo en un aparato Novocyte.

Resultados

Los datos del análisis celular muestran la potencia específica y la especificidad de ambas moléculas PRO746 (MATCH-4 anti-TAA2xCD3xHSA) y PRO624 (scDb; anti-TAAxCD3) para inducir el agotamiento de las células que portan la diana, mientras el control negativo PRO811 (scDb; anti-CD3xHSA) no logra inducir la lisis de las células diana (véase la Figura 7). En conformidad con el ensayo NFAT mostrado anteriormente, la CE50 de la respuesta con la molécula MATCH se desplaza ligeramente hacia una concentración más alta en comparación con la de scDb, mientras una fracción similar de células diana se lisa después de 16 horas de incubación.

La cuantificación de la activación de células T en la dosis-respuesta de las tres moléculas es compatible con las observaciones de lisis celular (véase la Figura 8). Con esta lectura, se observa una señal de activación de células T inespecífica con el scDb para CD2/IL23R (PRO624) en ausencia de células que expresan la diana. Por otro lado, MATCH no muestra ningún signo de activación de células T inespecífica hasta las concentraciones más altas sometidas a prueba.

Se midieron las concentraciones de IL-2 en los pocillos (Figura 9). La concentración máxima de IL2 es sorprendentemente diferente para ambas moléculas, produciendo MATCH una meseta de IL-2 considerablemente más baja. En las cuantificaciones de los pocillos con la línea celular negativa para la diana, solamente el scDb CD2/IL23R produce un aumento de la concentración de IL-2 a las concentraciones más altas de scDb sometidas a prueba. En línea con los datos mostrados en el ensayo de gen informador NFAT anterior, los datos de la Figura 8 confirman la reducción de la liberación de citocinas con MATCH (PRO746) que comprende un dominio central de CD3-HSA en presencia de HSA, cuando se comparan con el scDb (PRO624). De manera importante, ambas moléculas tienen capacidades similares para desencadenar la lisis de células diana, mientras su capacidad para una lisis máxima de las células diana es similar.

Se generaron ensamblajes tetraespecíficos para mostrar el potencial de los ensamblajes de MATCH con un núcleo de heterodimerización de CD3/HSA que se iban a utilizar para combinar dos especificidades de antígeno de antígenos asociados a tumores de diferentes perfiles de expresión (véase la Figura 10).

Los datos muestran que ambas especificidades del scFv "periférico" anclado al dominio central de CD3/HSA se pueden explotar para conducir eficazmente el agotamiento mediado por células T de dos poblaciones de células diana diferentes por medio de una sola molécula (véase la Figura 11). También muestra el efecto de la diferente expresión de la diana en las curvas de respuesta a la dosis observadas, es decir, que la expresión más baja de la diana desplaza la respuesta a concentraciones más altas, lo que se puede invertir proporcionando la unión multivalente de las dianas de expresión baja, como se muestra en la Figura 6. Para las dianas de expresión alta, por otro lado, ya la unión al antígeno monovalente da como resultado un agotamiento de las células diana altamente potente. Tal direccionamiento dual se puede explotar adicionalmente para incrementar la especificidad del mecanismo de acción mediante el direccionamiento preferente de la molécula a células que expresan conjuntamente dos dianas de la superficie celular, en lugar de células que expresan exclusivamente una de las dos dianas. Para lograr esto, se puede someter a prueba una gama de aglutinantes con afinidades variables para cualquiera de las dos dianas en todas las posibles combinaciones utilizando el formato MATCH que comprende el dominio central de CD3/HSA presentado en el presente documento, para seleccionar la combinación con especificidad óptima en la lisis celular (véase Egan et al. mAbs.

2016).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína heterodimérica que comprende una primera y una segunda proteínas monocatenarias,

(ia) un primer dominio VL;

(iia) un primer conector polipeptídico, y

(iiia) un segundo dominio VL, y

(ib) un primer dominio VH;

(iib) un segundo conector polipeptídico, y

(iiib) un segundo dominio VH, y

en donde dicho primer dominio VL forma un primer par cognado de dominios variables con especificidad para un primer antígeno diana formando dicho primer o dicho segundo dominios VH y dicho segundo dominio VL un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para un segundo antígeno diana con el otro de dichos dominios VH, en donde uno de dichos antígenos diana es seralbúmina humana y el otro de dichos antígenos diana es CD3 humano,

en donde al menos una de dicha primera o dicha segunda proteínas monocatenarias comprende adicionalmente (iv) al menos un dominio adicional como tercer dominio funcional que se fusiona a través de un tercer conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencias de aminoácidos, en donde dicho dominio funcional es un dominio proteico que tiene una función predefinida, particularmente una actividad enzimática o una unión específica a un ligando cognado,

en donde cada conector polipeptídico consiste en una cadena de restos de aminoácido conectados por enlaces peptídicos, y

en donde dicha primera y dicha segunda proteínas monocatenarias no comprenden un dominio constante de inmunoglobulina.

2. La proteína heterodimérica de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente

(v) un cuarto dominio funcional que se fusiona a través de un cuarto conector polipeptídico a dicha primera o dicha segunda secuencia de aminoácidos;

(vi) un cuarto y un quinto dominios funcionales que están fusionados a través de un cuarto y un quinto conectores polipeptídicos, respectivamente, a dicha primera y/o dicha segunda secuencias de aminoácidos; o (vi) un cuarto, un quinto y un sexto dominios funcionales que están fusionados a través de un cuarto, un quinto y un sexto conectores polipeptídicos, respectivamente, a dicha primera y dicha segundas secuencias de aminoácidos.

3. La proteína heterodimérica de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho primer conector polipeptídico consiste en 5 a 20 restos de aminoácido, particularmente de 6 a 15 restos de aminoácido.

4. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha primera proteína monocatenaria y dicha segunda proteína monocatenaria se heterodimerizan en una orientación paralela; o en una orientación antiparalela, particularmente en donde dicho primer y dicho segundo conectores polipeptídicos consisten en 10 a 20 restos de aminoácido, que comprenden entre 40 y 60% de restos cargados, particularmente de 12 a 16 restos de aminoácido que comprenden 50% de restos cargados, en cada caso, en donde los dos conectores son capaces de interactuar formando pares intercatenarios de restos cargados positivamente y negativamente; particularmente en donde los restos cargados en uno de dichos primer y segundo conectores son restos cargados positivamente de manera exclusiva, y los restos cargados en el otro de dichos primer y segundo conectores son restos cargados negativamente de manera exclusiva, particularmente en donde dichos primer y segundo conectores se seleccionan entre SEQ ID NO: 16 y 17.

5. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde (a) dicho primer dominio VL (ia) y dicho primer dominio VH (ib) forman un primer par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana, y dicho segundo dominio VL (iia) y dicho segundo dominio VH (iib) forman un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano; o (b) dicho primer dominio VL (ia) y dicho segundo dominio VH (iib) forman un primer par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano, y dicho segundo dominio VL (iia) y dicho primer dominio VH (ib) forman un segundo par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana.

6. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios funcionales se seleccionan independientemente de la lista de: dominios de unión, toxinas, enzimas, hormonas, y proteínas de señalización; particularmente en donde dichos tercer, cuarto, quinto y/o sexto dominios funcionales se seleccionan independientemente entre dominios de unión; particularmente en donde dichos dominios de unión se seleccionan independientemente de la lista de: dominios de unión basados en anticuerpos, particularmente fragmentos scFv, fragmentos Fab y dominios variables de anticuerpos individuales, y dominios de unión basados en armazones alternativos, particularmente dominios basados en anquirina, finómeros, avimeros, anticalinas y sitios de unión que se construyen en regiones constantes de anticuerpos.

7. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde al menos uno de dichos dominios variables de anticuerpo comprende regiones CDR derivadas de un anticuerpo parental de conejo, particularmente en donde uno de dichos dominios variables de anticuerpo comprende regiones marco humanas.

8. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha primera proteína monocatenaria y dicha segunda proteína monocatenaria se entrecruzan mediante al menos un enlace disulfuro; particularmente en donde dicho enlace disulfuro se forma entre un primer resto de cisteína que flanquea dicho primer o dicho segundo dominios VL y un segundo resto de cisteína que flanquea dicho primer o dicho segundo dominios VH; o en donde dicho enlace disulfuro se forma entre un primer resto de cisteína comprendido en una región marco de dicho primer o dicho segundo dominios VL y un segundo resto de cisteína comprendido en una región marco de dicho primer o dicho segundo dominios VH, particularmente en donde dicho primer resto de cisteína está ubicado en la posición 141 de dicho primer o dicho segundo dominios VL y dicho segundo resto de cisteína está ubicado en la posición 51 de dicho primer o dicho segundo dominios VH.

9. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende las tres CDR de VL presentes en una de las secuencias de la proteína VL seleccionadas entre SEQ ID NO: 10, 12, y 14 en un marco de V<l>de anticuerpo humano, en donde el marco de VL comprende los marcos de Vk FR1, FR2, FR3, particularmente los marcos de Vk1, y un marco FR4, que se selecciona entre un FR4 de Vk, particularmente FR4 de Vk1, y un marco 4 de VA, y las tres CDR de VH presentes en una de las secuencias de proteína VH seleccionadas entre<s>E<q>ID NO: 11, 13, y 15 en un marco de VH de un anticuerpo humano, particularmente un marco de VH3, particularmente en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende un dominio VL que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteína seleccionada entre SEQ ID NO: 10, 12, y 14, y un dominio VH que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteína seleccionada entre SEQ ID NO: 11, 13, y 15, particularmente en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para seralbúmina humana comprende un dominio VL seleccionado entre SEQ ID NO: 10, 12, y 14, y un dominio VH seleccionado entre SEQ ID NO: 11, 13, y 15.

10. La proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende las tres CDR de VL presentes en una de las secuencias de la proteína V<l>seleccionadas entre SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 en un marco de VL de anticuerpo humano, en donde el marco de VL comprende los marcos de Vk FR1, FR2, FR3, particularmente los marcos de Vk1, y un marco FR4, que se selecciona entre un FR4 de Vk, particularmente FR4 de Vk1, y un marco 4 de VA, y las tres CDR de VH presentes en una de las secuencias de proteína VH seleccionadas entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9 en un marco de VH de un anticuerpo humano, particularmente un marco de VH3, particularmente en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende un dominio VL que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteína seleccionada entre SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, y un dominio VH que comprende al menos las posiciones 5 a 140, particularmente al menos las posiciones 3 a 145, de una secuencia de proteína seleccionada entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9, particularmente en donde dicho par cognado de dominios variables con especificidad para CD3 humano comprende un dominio VL seleccionado entre SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, y un dominio v H seleccionado entre SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

11. Una secuencia de ácido nucleico o dos secuencias de ácido nucleico que codifican la primera y la segunda proteínas monocatenarias de la proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector o dos vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico o las dos secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Una célula anfitriona o células anfitrionas que comprenden el vector o los dos vectores de la reivindicación 12.

14. Un método para producir la proteína heterodimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende (i) proporcionar la secuencia de ácido nucleico o las dos secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 11, o el vector o los dos vectores de la reivindicación 12, que expresan dicha secuencia de ácido nucleico o dichas secuencias de ácido nucleico, o dicho vector o dichos vectores, y recoger dicha proteína heterodimérica del sistema de expresión, o (ii) proporcionar una célula anfitriona o células anfitrionas según la reivindicación 13, cultivar dicha célula anfitriona o dichas células anfitrionas; y recoger dicha proteína heterodimérica del cultivo celular.

15. Una composición farmacéutica que comprende la proteína heterodimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.