ES2967029T3

ES2967029T3 - Métodos y composiciones para cambiar la composición del microbioma de la piel usando mezclas complejas de cepas bacterianas

Info

Publication number: ES2967029T3
Application number: ES21178348T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Pätzold; Marc Güell
Original assignee: S Biomedic NV
Current assignee: S Biomedic NV
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2024-04-25
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: PL3912630T3; JP2019535681A; EP3912630A1; CA3040814A1; KR20190084988A; EP3528825B1; EP3912630C0; PL3528825T3; US20190314428A1; DK3528825T3; US20210187043A9; WO2018073651A1; JP7235654B2; EP3528825A1; MX2019004611A; KR102584057B1; CN110352065A; ES2894498T3; EP3912630B1; US11541081B2

Abstract

Aspectos de la invención se refieren a composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas vivas para administración tópica en la piel, en donde las dos o más cepas bacterianas vivas son cepas bacterianas de Propionibacterium acnes (P. acnes), y métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para cambiar la composición del microbioma de la piel usando mezclas complejas de cepas bacterianas

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos y composiciones para modificar el microbioma de la piel.

Antecedentes de la invención

El cuerpo humano es huésped de una comunidad microbiana altamente compleja y rica. Estos microorganismos generalmente son inofensivos y contribuyen a un estado saludable al producir vitaminas, cooperar con la digestión de los alimentos o al estimular el sistema inmunitario. La microbiota humana reside principalmente en la superficie y en las capas profundas de la piel, en la saliva y la mucosa oral, en la conjuntiva y en los tractos gastrointestinales. Se ha demostrado, principalmente en el intestino, que la microbiota humana tiene funciones fundamentales en la salud y la enfermedad de los seres humanos. La piel está colonizada por una gran cantidad de microorganismos, la mayoría de ellos son beneficiosos o inofensivos. Sin embargo, el microbioma de la piel tiene composiciones específicas en estados patológicos de la piel que son diferentes en comparación con la piel sana. Enfermedades como el acné vulgar están asociadas con fuertes alteraciones del microbioma.

Sumario de la invención

Los aspectos de la invención se refieren a una composición para la administración tópica a la piel que comprende dos o más cepas bacterianas diferentes dePropionibacterium acnes (P. acnes)vivas, en donde la composición comprende una cepa C3 de tipo de tipificación de secuencia de un solo locus (SLST) deP. acnesy/o una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnes.

En algunas realizaciones, la composición comprende además una cepa A5 de tipo de SLST deP. acnes.En algunas realizaciones, la composición comprende además una cepa F4 de tipo de SLST deP. acnes.

En algunas realizaciones, la composición comprende además peptona. En algunas realizaciones, la concentración de peptona es de desde aproximadamente el 0,05 %-1 %. En algunas realizaciones la concentración de peptona es de aproximadamente el 0,25 %. En algunas realizaciones, la peptona es una peptona digerida con tripsina de la caseína. En algunas realizaciones, la composición además comprende un espesante. En algunas realizaciones, el espesante comprende hidroxietilcelulosa. En algunas realizaciones, la hidroxietilcelulosa comprende hidroxietilcelulosa (HEC) NATROSOL®. En algunas realizaciones, la concentración del espesante es de aproximadamente el 1 %-5 %. En algunas realizaciones, la concentración de agente gelificante es de aproximadamente el 2,5 %.

En algunas realizaciones, la concentración de cada cepa bacteriana deP. acnesviva es de al menos el 5 % de la composición. En algunas realizaciones, una cepa C3 de tipo de SLST deP. acnesy una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnesestán en concentraciones aproximadamente iguales dentro de la composición. En algunas realizaciones, una cepa C3 de tipo de SLST deP. acnesestá presente en una concentración más alta que las otras cepas bacterianas deP. acnesvivas.

En algunas realizaciones, la composición comprende una cepa C3 de tipo de SLST deP. acnes,una cepa A5 de tipo SLST deP. acnes,una cepa F4 de tipo de SLST deP. acnesy una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnes,opcionalmente en donde la concentración relativa de cada cepa es de aproximadamente el 55 %, 30 %, 10 % y 5 %, respectivamente.

En algunas realizaciones, la composición incluye al menos 104 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa bacteriana deP. acnesviva. En algunas realizaciones, la composición incluye aproximadamente 104 109 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa bacteriana deP. acnesviva.

En algunas realizaciones, la composición está en la forma de un gel, una crema, un ungüento o una loción.

En algunas realizaciones, la composición además comprende una cepa bacteriana adicional deP. acnesseleccionada del grupo que consiste en: cepas D1, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6,<k>9 y L1 de tipo de SLST.

En algunas realizaciones, la composición es para su uso como medicamento. En algunas realizaciones, la composición es para su uso en un método para mantener una piel sana en un sujeto. En algunas realizaciones, la composición es para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección en un sujeto seleccionada del grupo que consiste en: acné, piel grasa, hipomelanosis macular progresiva, caspa, eccema atópico, dermatitis atópica y rosácea. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano.

Aspectos de la invención se refieren al uso no terapéutico de una composición en un método para mejorar el aspecto de la piel en un sujeto, en donde la composición comprende dos o más cepas bacterianas dePropionibacterium acnes (P. acnes)vivas diferentes, en donde la composición comprende una cepa C3 de tipo de SLST deP. acnesy/o una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnes.

En algunas realizaciones, la composición comprende además una cepa A5 de tipo SLST deP. acnes.En algunas realizaciones, la composición comprende además una cepa F4 de tipo de SLST deP. acnes.En algunas realizaciones, la concentración de peptona es de desde aproximadamente el 0,05 %-1 %. En algunas realizaciones, concentración de peptona es de aproximadamente el 0,25 %. En algunas realizaciones, la composición comprende además peptona. En algunas realizaciones, la peptona es una peptona digerida con tripsina de la caseína. En algunas realizaciones, la composición además comprende un espesante. En algunas realizaciones, el espesante comprende hidroxietilcelulosa. En algunas realizaciones, la hidroxietilcelulosa comprende hidroxietilcelulosa (HEC) nAt ROSOL®. En algunas realizaciones, la concentración del espesante es de desde aproximadamente el 1 %-5 %. En algunas realizaciones, la concentración de agente gelificante es de aproximadamente el 2,5 %.

En algunas realizaciones, la concentración de cada cepa bacteriana deP. acnesviva es de al menos el 5 % de la composición. En algunas realizaciones, una cepa C3 de tipo de SLST deP. acnesy una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnesestán en concentraciones aproximadamente iguales dentro de la composición. En algunas realizaciones, una cepa C3 de tipo de SLST deP. acnesestá presente en una concentración más alta que las otras cepas bacterianas deP. acnesvivas. En algunas realizaciones, la composición comprende una cepa c 3 de tipo de SLSt deP. acnes,una cepa A5 de tipo SLST deP. acnes,una cepa F4 de tipo de SLST deP. acnesy una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnes,en donde la concentración relativa de cada cepa es de aproximadamente el 55 %, 30 %, 10 % y 5 %, respectivamente. En algunas realizaciones, la composición incluye al menos 104 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa bacteriana deP. acnesviva. En algunas realizaciones, la composición incluye aproximadamente 104-109 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa bacteriana deP. acnesviva. En algunas realizaciones, la composición está en forma de un gel, una crema, un ungüento o una loción.

En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento no incluye una cepa de ribotipo 6 (RT6) deP. acnes.En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento no incluye una cepa de filotipo III deP. acnes.En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la composición no incluye una cepa de ribotipo 6 (RT6) deP. acnes. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la composición no incluye una cepa de filotipo III deP. acnes.En algunas realizaciones de usos descritos en el presente documento, la composición no incluye una cepa de ribotipo 6 (RT6) deP. acnes.En algunas realizaciones de los usos descritos en el presente documento, la composición no incluye una cepa de filotipo III deP. acnes.

Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar varias realizaciones de la invención.

Esta invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de tener otras realizaciones y de ponerse en práctica o llevarse a cabo de diversas maneras tal como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos no se consideran dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en diversas figuras está representado por un número similar. Para fines de claridad, no todos los componentes están marcados en cada dibujo. En los dibujos:

La figura 1 representa el consumo de ácido cis-9, cis-12 linoleico de diferentes cepas deP. acnesen medios RCM. La figura 2 representa la concentración del isómero del ácido cis-12 trans-10 linoleico, después de 86 h de incubación con agitación de diferentes cepas en medio sin glucosa. Las concentraciones se normalizan para el crecimiento por DO (600 nm).

La figura 3 representa un curso temporal de la concentración de isómeros en una variedad de cepas.

La figura 4 representa la cantidad relativa de la cepa C3 en una mezcla el día 5 o el día 6 después de la inoculación. Cuando está presente en un alto porcentaje en la mezcla de partida, C3 se mantiene como la cepa dominante. Sorprendentemente, cuando está presente en una concentración inicial más baja, el porcentaje global de C3 se reduce en la fase estacionaria tardía.

La figura 5 representa una curva de crecimiento de las cepas C3, F4, C1 y K8 en medios RCM a 37 °C.

La figura 6 representa una curva de crecimiento de las cepas C3, F4, C1, K8, una mezcla de 2 cepas (C3 y K8) y una mezcla de 4 cepas (A5, C3, F4 y K8) en medios PY libres de glucosa a 37 °C.

La figura 7 representa el cambio de las concentraciones relativas de diferentes cepas deP. acnesdentro de una mezcla de cepas determinada por lecturas de secuenciación antes y después de 5 días de crecimiento en agar de RCM. Sorprendentemente, la cepa K8, que tenía un crecimiento muy lento cuando se usaba como aislado, se convirtió en la cepa dominante dentro del cultivo después de 5 días de crecimiento en una mezcla de cepas.

La figura 8A representa el programa de administración utilizado en un estudio clínico piloto. 14 sujetos se dividieron en dos grupos, donde cada grupo recibió una formulación bacteriana diferente. La figura 8B representa un programa de administración para un estudio clínico más grande.

La figura 9 representa las razones relativas promedio de las nueve bacterias más abundantes en el microbioma de la piel de todos los sujetos en el estudio piloto de 14 sujetos.

La figura 10 representa las razones relativas de los sujetos clasificados como aceptores o no aceptores.

Las figuras 11A y 11B representan la cantidad relativa deP. acnesdentro del microbioma bacteriano de la piel completo. La figura 11A muestra el desarrollo dinámico de la población deP. acnesen aceptores y no aceptores a lo largo del estudio piloto. En el grupo de aceptores,P. acnesrepresentó inicialmente solo el 34 % del microbioma bacteriano de la piel. Después del tratamiento con BPO, este valor se redujo adicionalmente antes de aumentar hasta casi el doble después de que se aplicara el gel bacteriano. La población deP. acnesse estabilizó al 60 % el día 42. La dinámica en el grupo no aceptor fue similar. El estado fundamental de los no aceptores comenzó en un nivel más alto del 40 % y, a diferencia del grupo aceptor, el aumento de la población no fue significativo el día 42. La figura 11B muestra las razones relativas deP. acnescomo diagramas de caja que ilustran la dispersión de los puntos de datos. La diferencia entre el día 1 y el día 42 en el grupo aceptor es altamente relevante estadísticamente (p = 0,001), mientras que el grupo aceptor es similar el día 42 al día 1.

La figura 12 representa recuentos de lesiones no inflamadas representadas como diagramas de caja. Se muestran tres pares de diagramas de caja: general; formulación A2; y formulación B4. El valor de p para la significación estadística se proporciona debajo de los gráficos.

La figura 13 representa el número de lesiones no inflamadas para aceptores y no aceptores. Para ambos grupos, la reducción es estadísticamente significativa.

La figura 14 representa el recuento de lesiones inflamadas representadas como diagramas de caja. Se muestran tres pares de diagramas de caja: general; formulación A2; y formulación B4.

La figura 15 representa el número de lesiones inflamadas para aceptores y no aceptores.

La figura 16 representa el desarrollo del pH de la piel a lo largo del estudio piloto para aceptores y no aceptores. La figura 17 representa la distribución de los recuentos de sujetos en función del valor promedio de sus respuestas. La figura 18 representa un mapa de calor que muestra la abundancia relativa de las 15 cepas deP. acnesmás comúnmente encontradas. El mapa de calor representa el promedio de 6 sujetos clasificados como aceptores que mostraron muy buen establecimiento de las nuevas bacterias. Un cambio claro en la composición del microbioma es visible entre el día 1 y el día 42.

La figura 19 representa una gráfica que muestra los resultados de una comparación basada en imágenes. Los resultados del día 1 al día 28 se compararon con los resultados del día 1 al día 42. Cada imagen se calificó con 1 si el sujeto mejoró, 0 si el sujeto parecía no cambiar y -1 si el sujeto empeoraba. Los promedios son del día 1 al 28: -0,17 y día 1 a 42: 0,29. La diferencia es estadísticamente significativa, p<0,05.

La figura 20 muestra los resultados de un resumen de evaluación de pacientes, que demuestra la mejora de las lesiones inflamadas y no inflamadas durante el estudio clínico de 42 días.

La figura 21 representa la DO<600>de cultivos con pH controlado y cultivos sin control de pH (“acidificante”) de cepas K8 y C3 deP. acnes,como se describe en el experimento 1.2. Las gráficas muestran datos de cultivos duplicados. La figura 22 representa el recuento viable de cultivos con pH controlado y cultivos sin control de pH (“acidificante”) de cepas K8 y C3 deP. acnes,como se describe en el experimento 1.2. Las gráficas muestran datos de cultivos duplicados.

La figura 23 representa la DO<600>de cultivos con pH controlado (“acidificantes”) de cepas K8 y C3 deP. acnes,como se describe en el experimento 1.3.

La figura 24 representa la microscopía de contraste de fases (500x) de los cultivos de cepas K8 (izquierda) y C3 (derecha) deP. acnes,como se describe en el experimento 2.2.

La figura 25 representa el cambio de concentraciones relativas de diferentes cepas deP. acnesdespués de la administración de las formulaciones A2 y B4.

Descripción detallada

En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para la modulación del microbioma de la piel. Se describen en el presente documento composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas para su uso en el mantenimiento de una piel sana, tal como piel que está libre de acné o para tratar o prevenir el acné. Las composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas vivas deP. acnespueden ayudar a la piel a revertir los estados patológicos microbianos a estados microbianos saludables.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría,P. acnespuede convertir una molécula precursora de señal (ácido linoleico), que está presente de forma natural en el sebo, en una molécula de señalización activa (ácido trans-10, cis-12 linoleico), que estimula, en cambio, la secreción de sebo, que es importante para la colonización de la piel porP. acnes.Significativamente, la producción de esta molécula de señalización proporciona una conexión entre diferentes aspectos de la comprensión actual de la aparición del acné.

Como se muestra en el ejemplo 1, se encontró sorprendentemente que diferentes cepas deP. acnestienen diferentes niveles de actividad ácido linoleico isomerasa o umbrales finales de concentración de ácido trans-10, cis-12 linoleico. Por ejemplo, se encontró que una cepa A1 de tipo de SLST deP. acnesproduce la mayor parte del isómero del ácido cis-12 trans-10 linoleico, mientras que las cepas C3, C1, F4, A5, K1, K2, K8 y L1 de tipo de SLST deP. acnesmostraron muy poca producción del isómero de ácido trans-10, cis-12 linoleico.

También se encontró sorprendentemente que algunas cepas presentaban diferentes patrones de crecimiento cuando se cultivaban en una mezcla de cepas que cuando se cultivaban individualmente. Por ejemplo, se descubrió que una cepa K8 de tipo de SLST deP. acnescrece lentamente de forma individual, pero cuando se cultiva dentro de una mezcla de cepas, se convierte en la cepa dominante dentro de la composición después de 5 días de incubación (figura 7). Por consiguiente, los aspectos de la invención se refieren a mezclas de cepas que presentan propiedades de crecimiento ventajosas incluso cuando contienen cepas individuales que pueden crecer lentamente en la naturaleza y que probablemente serían superadas en la naturaleza.

También se encontró sorprendentemente en el presente documento que las mezclas de cepas podían tolerar niveles más altos de conservantes que las cepas individuales. En consecuencia, los aspectos de la invención se refieren a mezclas de cepas deP. acnesque pueden establecerse en la piel y que tendrán una supervivencia mejorada frente a la exposición a ciertos compuestos, como productos que contienen conservantes, en comparación con cepas individuales deP. acnes.Esta característica proporciona una ventaja inesperada para las mezclas bacterianas en comparación con las cepas individuales para el establecimiento y la persistencia a largo plazo en la piel de un sujeto humano.

También se demuestra sorprendentemente en el presente documento, usando dos formulaciones diferentes de dos o más cepas deP. acnesvivas, que la administración de cepas deP. acnesvivas puede conducir a una reducción sustancial de las lesiones no inflamadas en sujetos que tienen acné. En un estudio clínico piloto descrito en el ejemplo 5, el 85 % de los sujetos notificaron una mejoría en los síntomas asociados con el acné después de la administración de las formulaciones descritas en el presente documento.

Esta invención no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de tener otras realizaciones y de ponerse en práctica o llevarse a cabo de varias maneras como se define en las reivindicaciones.

Además, la fraseología y terminología usada en el presente documento son para el propósito de descripción y no deben considerarse como limitantes. El uso de “que incluye”, “que comprende”, o “que tiene”, “que contiene”, “que implica”, y variaciones de los mismos en la presente, pretende abarcar los elementos mencionados a continuación así como elementos adicionales.

Aspectos de la invención se refieren al microbioma. Como se usa en el presente documento, “microbioma” se refiere a todos los microorganismos que habitan el cuerpo. El microbioma humano tiene un papel fundamental en la salud y la enfermedad humanas (Consortium, 2012; NIH HMP Working Groupet al.,2009). El desarrollo de tecnologías de secuenciación de última generación (NGS) ha permitido el estudio de estas comunidades microbianas con una profundidad y resolución sin precedentes (véase Human Microbiota issue, Nature 2012). Más de 10.000 cepas bacterianas diferentes colonizan el cuerpo humano, y hay diez veces más bacterias que células humanas en un cuerpo humano promedio. Investigaciones recientes han indicado que la composición de las comunidades bacterianas en el cuerpo está estrechamente relacionada con la salud del cuerpo humano (Belkaid y Segre, 2014; Consortium, 2012; Zhao, 2010). Como resultado, las distorsiones del microbioma están vinculadas a una variedad de enfermedades. El microbioma intestinal y los métodos para la manipulación dirigida del microbioma intestinal se han investigado en profundidad (Doré y Blottiére, 2015). Un ejemplo de tal terapia es el tratamiento de las bacterias resistentes a antibióticosClostridium diffiálecon la ayuda del “trasplante fecal” (van Noodet al.,2013; Olle, 2013).

Investigadores recientemente comenzaron a investigar el microbioma de la piel (Belkaid y Segre, 2014; Ohet al.,2014). La piel está colonizada por una gran cantidad de microorganismos, la mayoría de los cuales son beneficiosos o inofensivos (Grice y Segre, 2011). Sin embargo, enfermedades como el acné vulgar se asocian con fuertes alteraciones del microbioma (Bek-Thomsenet al.,2008; Holmes, 2013; Konget al.,2012). El acné, en particular, se considera vinculado a una distorsión del microbioma de la piel humana (Fitz-Gibbonet al.,2013). Esta distorsión está probablemente provocada por un subconjunto específico de la bacteria de la pielP. acnes(Lomholt y Kilian, 2010). En el presente documento, las composiciones y los métodos aplican el conocimiento del microbioma de la piel para desarrollar tratamientos contra trastornos de la piel que se originan o están influidos por las distorsiones del microbioma de la piel.

Acné

Como se usa en el presente documento, “acné vulgar” y “acné” se usan de manera intercambiable y se refieren a una afección de la piel que afecta a millones de personas en todo el mundo y es especialmente frecuente en adolescentes. El acné está asociado frecuentemente con la formación de lesiones inflamatorias y no inflamatorias en la piel. Sin querer limitarse a ninguna teoría, el acné puede estar asociado, al menos en parte, con los folículos pilosos que se obstruyen y/o inflaman. Se considera que el acné está relacionado con la distorsión del microbioma de la piel humana. Esta distorsión puede ser provocada por cepas específicas de la bacteria de la pielP. acnes(Fitz-Gibbonet al.,2013; Holmes, 2013; Lomholt y Kilian, 2010).

El desarrollo del acné está vinculado con el inicio de la secreción de sebo de las glándulas sebáceas (Makrantonakiet al.,2011; Zouboulis, 2004). Además, la densidad de población deP. acnesestá directamente vinculada con la cantidad de sebo producido (Kearneyet al.,1984; Kinget al.,1982; Mourelatoset al.,2007). Sin embargo, hasta ahora, no pudo establecerse un vínculo molecular claro entre la presencia deP. acnesy la enfermedad del acné. Esto se debe, al menos en parte, al hecho de que la piel de la mayoría de los humanos adultos está colonizada porP. acnes,mientras que los síntomas del acné no se producen en muchos de esos adultos. Para que se produzca el acné, debe desencadenarse una reacción inflamatoria que va acompañada por un cambio en el volumen y la composición del sebo (Pappaset al.,2009).

Actualmente, el tratamiento convencional para el acné es un tratamiento antibiótico a largo plazo, como el tratamiento con antibióticos macrólidos y/o de tetraciclina, o el uso sistémico de isotretinoína (Bersonet al.,2003). Estos tratamientos presentan fuertes efectos secundarios y altas tasas de recaída. Por ejemplo, la isotretinoína provoca irritación de la piel y también tiene efectos teratogénicos (que provocan defectos de nacimiento) (McLane, 2001). Además, la tasa de recaída con isotretinoína también es desfavorable, por encima del 40 % (Azoulayet al.,2007). Se ha demostrado que la isotretinoína reduce el volumen de producción de sebo, reduciendo de ese modo indirectamente la densidad bacteriana en la piel (Kinget al.,1982). Si bien los antibióticos son un tratamiento común, en las últimas décadas, el número de cepas bacterianas que son resistentes a uno o más antibióticos ha aumentado drásticamente (Leyden, 2001; Rosset al.,2001).

Otro grupo de tratamientos para el acné incluye productos de venta sin receta (OTC) y cosméticos. Los productos de venta sin receta comúnmente usados son agentes de desinfección de banda ancha que incluyen peróxido de benzoílo (por ejemplo, Benzaknen, Galderma SA, Lausanne, Suiza y Aknefug, Dr. August Wolff GmbH & Co. KG Arzneimittel, Bielefeld, Alemania) y ácido salicílico. Además, hay una serie de líneas de productos naturales que tienen una eficacia limitada o no probada.

Las terapias actuales para los trastornos de la piel como el acné, que están vinculados con una distorsión del microbioma, o bien son ineficaces o bien están acompañadas de efectos secundarios graves (McLane, 2001; Tripathiet al.,2013). Habitualmente, la piel de un sujeto con acné mejora durante los tratamientos clásicos, como con antibióticos u hormonas. Sin embargo, el sujeto en la mayoría de los casos recae después del final del tratamiento. La isotretinoina tiene aproximadamente un índice de recaída del 41 % (Azoulayet al.,2007). Por lo tanto, los sujetos deben someterse a tratamientos a largo plazo para mantener los efectos beneficiosos. Esta tasa de recaída extrema puede explicarse por la recolonización de la piel con el microbioma después de detener la terapia.

Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento abordan una necesidad no satisfecha de un tratamiento eficaz del acné sin efectos secundarios notables y con la prevención de recaídas. El nuevo enfoque descrito en el presente documento puede implicar el trasplante de un microbioma sano. Sorprendentemente, pueden usarse cepas deP. acnes,la misma especie bacteriana que se cree que está implicada en la causa del acné, para tratar o prevenir el acné o para mantener la piel en una condición en la que está libre de acné. En el presente documento se describen composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas vivas que pueden proporcionar un estado mejorado de la piel sin provocar efectos secundarios notables. Las cepas bacterianas vivas dentro de las composiciones descritas en el presente documento son cepas bacterianas deP. acnes.

En algunas realizaciones, la composición es un cosmético. Como se usa en el presente documento, un “cosmético” se refiere a un producto que está destinado a mejorar el aspecto. La composición cosmética que comprende una o más cepas bacterianas vivas como se describe en el presente documento también puede denominarse “cosmecéuticos” (Draelos, 2009).

Aspectos de la invención se refieren a composiciones para su uso o al uso de composiciones en métodos en donde las composiciones comprenden dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas en la piel de un sujeto, o bien solas, en combinación con otras terapias, o bien después de otra terapia. En algunos aspectos, una composición que comprende dos o más cepas bacterianas vivas deP. acnespuede ayudar a la piel a revertir un estado patológico del microbioma a un estado de microbioma sano. En algunas realizaciones, la piel del sujeto ya se ha tratado con una terapia convencional para el acné, como antibióticos, desinfectantes u hormonas. Pueden usarse composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas descritas en el presente documento como métodos de recuperación complementarios a los tratamientos convencionales para el acné, por lo que la composición que comprende dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas puede reducir la tasa de recaída del acné después del tratamiento con antibióticos. Por ejemplo, puede aplicarse una composición que comprende dos o más cepas bacterianas vivas deP. acnesdespués de un tratamiento con antibióticos o desinfectante cuando se eliminan la mayoría de las bacterias naturales de la piel de un sujeto. Las bacterias vivas en la composición pueden desplazar cepas bacterianas patógenas y ayudar a recuperar un microbioma de la piel diverso, sano y equilibrado. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento implican erradicar cepas bacterianas patógenas de la piel y luego añadir bacteriasP. acnesvivas a la piel para crear un microbioma de piel saludable.

Pueden usarse composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas como se describen en el presente documento para disminuir o aumentar el volumen de la producción de sebo de un individuo. También pueden usarse composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas como se describen en el presente documento para producir ácido cis-12 trans-10 linoleico en los folículos o glándulas sebáceas y, de este modo, administrar este compuesto activo al medio ambiente de las glándulas sebáceas. Estos métodos evitan los problemas asociados con la aplicación tópica convencional del ácido cis-12 trans-10 linoleico.

Pueden usarse composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas deP. acnesvivas como se describen en el presente documento también para aumentar o disminuir la densidad bacteriana en la piel al proporcionar una cepa bacteriana a la piel que aumentará o disminuirá la producción de sebo en la piel, cambiando de ese modo indirectamente la densidad bacteriana.

También pueden usarse composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas vivas deP. acnescomo se describen en el presente documento para modificar la razón de especies bacterianas seleccionadas en comparación con otras especies bacterianas o en comparación con otros componentes de la microbiota, como hongos o ácaros, administrando una cepa bacteriana viva a la piel que altera la producción de sebo, alterando de ese modo indirectamente la densidad bacteriana deP. acnesen la piel.

Pueden usarse composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas vivas deP. acnescomo se describen en el presente documento para mantener la piel sana, como piel libre de acné. En algunas realizaciones, la administración de tales composiciones puede ayudar a prevenir la formación de acné. En algunas realizaciones, tales composiciones pueden usarse para tratar el acné o pueden usarse para prevenir la recurrencia del acné en un sujeto que ha recibido un tratamiento convencional para el acné.

Las composiciones que comprenden dos o más cepas bacterianas vivas deP. acnesincluyen una o más cepas de bacterias vivas que colonizan de manera natural la piel. En algunas realizaciones, la una o más cepas son de origen natural. Sin embargo, la composición que comprende las dos o más cepas bacterianas no es de origen manera natural. La composición que comprende las dos o más cepas bacterianas tiene propiedades diferentes que las cepas individuales en la naturaleza.

Propionibacterium acnes (P. acnes)

P. acneses una especie de bacilo Gram-positiva anaerobia asociada con el acné, así como otras afecciones, la blefaritis crónica y endoftalmitis. Están presentes cepas deP. acnesen la piel de la mayoría de la gente. Se ha notificado que algunas cepas deP. acnesson patógenas, mientras que otras cepas deP. acnesno lo son (Fitz-Gibbonet al.,2013; Lomholtet al.,2010). Como se usa en el presente documento, cepas “patógenas” deP. acnesse refiere a cepas deP. acnesque están asociadas con el acné. En el presente documento se divulgan ensayos mediante los cuales pueden identificarse y seleccionarse cepas patógenas y no patógenas deP. acnes.

Se ha demostrado que las cepas deP. acnesdifieren significativamente en su metabolismo y comportamiento fenotípico (Lomholt y Kilian, 2010). Estas diferencias incluyen, pero no se limitan a, la expresión de neuraminidasa,<a>-glucosidasa o hialuronidasa y la capacidad de realizar hemólisis de la sangre de caballo, fermentación de ribosa, fermentación de eritritol o fermentación del sorbitol. Además, se ha demostrado queP. acnesexpresa una isomerasa activa del ácido linoleico, que convierte específicamente el ácido cis 9, c-12 linoleico en ácido trans-10, cis-12 linoleico (Rossonet al.,2004). El ácido linoleico es una molécula clave en la regulación de la producción de sebo y la reducción del ácido linoleico se ha vinculado en múltiples estudios con la aparición del acné (Downinget al.,1986; Letaweet al.,1998).

Además, se ha demostrado que las células muertas o los sobrenadantes deP. acnespueden aumentar la producción de lípidos en sebocitos de hámster (Iinumaet al.,2009a).

Las especies deP. acnesse han clasificado en clados I - III, incluyendo además subtipos: IA e IB. (Lomholtet al.).IA se ha subdividido además en IA<1>e IA<2>(McDowellet al.,2012). Se ha realizado análisis genético de las cepas deP. acnespara determinar qué cepas pueden ser patógenas y estar asociadas con el acné, y qué cepas pueden ser no patógenas y no asociadas con el acné (Fitz-Gibbonet al.,2013, Lomholtet al.,2010, y Kasimatiset al.,2013). En algunas realizaciones, una cepa deP. acnesno patógena es una cepa de una de las siguientes clases deP. acnes: I-2, II e IB. En algunas realizaciones no limitantes, una cepa no patógena deP. acnesse selecciona del grupo de cepas no patógenas que consiste en: cepas D1, A5, C3, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K8, K9, L1 y F4 de tipo de S<l>ST, como se describe en Scholzet al.(2014)PLOS ONE9(8) e104199.

Como se describe en Scholtzet al.,y como entendería un experto habitual en la técnica, las cepas deP. acnespueden identificarse usando tipificación de secuencia de un solo locus (SLST), que implica amplificación por PCR y secuenciación de ADN de un locus diana. Un esquema de SLST paraP. acnesse desarrolló y describió en Scholzet al.usando el locus diana PPA2385 (denominado en Scholzet al.“secuencia diana de SLST”). Está disponible en línea una base de datos deP. acnesasociada con el esquema de SLST descrito en Scholtzet al.en medbac.dk/slst/pacnes. Las cepas de tipo SLST a modo de ejemplo incluyen A1-A24, B1, C1-C4, D1-D3, E1-E9, F1-F10, G1, H1-H5, K1-K14 y L1-L6. Los usuarios pueden introducir una secuencia deP. acnesen la base de datos en línea para identificar las cepas de tipo SLST. Otros sistemas de identificación y nomenclatura de cepas deP. acnesincluyen los esquemas de MLST9 y MLST8, ribotipado y asignaciones de tipos basándose en el análisis de secuencia derecAytly.La figura 1 de Scholtzet al.demuestra estas diferentes convenciones de nomenclatura. Un experto habitual en la técnica entendería cómo podría identificarse y clasificarse una cepa deP. acnesde acuerdo con los diferentes sistemas de nomenclatura conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, “tipificación” de una cepa bacteriana se refiere a la identificación de la cepa bacteriana, tal como usando SLST. La tabla 1 enumera secuencias alélicas usadas en SLST para identificar las cepas descritas en el presente documento, como las cepas D1, A5, C3, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K8, K9, L1 y F4 de tipo de SLST deP. acnes.Un experto habitual en la técnica entendería las designaciones de cepas usadas en el presente documento, correspondientes a las divulgadas en Scholtzet al.,y entendería cómo identificar si una cepa deP. acnescorresponde a alguna de estas cepas específicas usando, por ejemplo, SLST.

Por consiguiente, las cepas deP. acnesse describen en el presente documento basándose en la designación de tipo de SLST usando el locus diana PPA2385 descrito en Scholtzet al.Por ejemplo, “cepa C3 deP. acnés"se refiere aP. acnesde tipo de SLST C3, usando el locus diana PPA2385 descrito en Scholtzet al.“Cepa K8 deP. acnes"se refiereP. acnesde tipo de SLST K8, usando el locus diana PPA2385 descrito en Scholtzet al.“Cepa A5 deP. acnes"se refiere aP. acnesde tipo de SLST A5, usando el locus diana PPA2385 descrito en Scholtzet al.y “cepa F4 deP. acnes"se refiere aP. acnesde tipo de SLST F4, usando el locus diana PPA2385 descrito en Scholtzet al.

Las composiciones bacterianas descritas en el presente documento comprenden dos o más cepas deP. acnes.Por ejemplo, una composición bacteriana puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 cepas deP. acnes.En algunas realizaciones, la composición comprende 2, 3, 4 o 5 cepas diferentes deP. acnes.Una o más de las cepas deP. acnespueden ser cepas no patógenas. En algunas realizaciones, todas las cepas deP. acnesen una composición bacteriana son cepas no patógenas. En algunas realizaciones, las cepas deP. acnesse genotipan con el fin de identificar la cepa y hacer una selección en cuanto a si incluir o no la cepa en una composición. Las cepas deP. acnesincluidas en las composiciones bacterianas descritas en el presente documento pueden seleccionarse para aumentar o disminuir la producción de lípidos.

En algunas realizaciones, una composición que comprende dos o más cepas bacterianas deP. acnesdiferentes comprende la cepa C3 deP. acnes,cepa K8 deP. acneso tanto la cepa C3 deP. acnescomo la cepa K8 deP. acnes.En algunas realizaciones la cepa C3 deP. acnesy la cepa K8 deP. acnesestán a concentraciones aproximadamente iguales dentro de la composición. En otras realizaciones, la cepa C3 deP. acnesestá en una concentración más alta que la cepa K8 deP. acnesdentro de la composición. En otras realizaciones, la cepa C3 deP. acnesestá en una concentración más baja que la cepa K8 deP. acnesdentro de la composición.

En algunas realizaciones, una composición que comprende dos o más cepas bacterianas deP. acnesdiferentes comprende la cepa A5 deP. acnesy/o la cepa F4 deP. acnes.Por ejemplo, una composición puede incluir cepa C3 deP. acnesy/o cepa K8 deP. acnesy/o cepa A5 deP. acnesy/o cepa F4 deP. acnes.En algunas realizaciones, una composición incluye la cepa C3 deP. acnesy/o cepa K8 deP. acnesy cepa A5 deP. acnesy cepa F4 deP. acnes.En algunas realizaciones, las mezclas de cepas deP. acnesincluyen una o más cepas del ciado I y una o más cepas del clado II. Sin desear estar limitados por ninguna teoría, las cepas del clado II pueden ser menos patógenas; sin embargo, estas cepas también pueden tener un crecimiento más lento que las cepas del clado I, y es menos probable que puedan colonizar la piel por sí mismas. En consecuencia, los aspectos de la invención se refieren a mezclas de cepas que incluyen tanto cepas del clado I como del clado II y que permiten la colonización de la piel por cepas del clado II.

En algunos aspectos, las composiciones que comprenden una o más cepas bacterianas deP. acnesvivas descritas en el presente documento incluyen la cepa H1 deP. acnes(6609). (Hunyadkürtiet al.)El genoma de esta cepa deP. acnesse ha secuenciado y está disponible en el número de registro de GenBank CP002815 (Hunyadkürtiet al.).En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden una o más cepas bacterianas deP. acnesvivas descritas en el presente documento incluyen cepas deP. acnesque tienen ciertas secuencias de CRISPR/CAS9 (Brüggemann, 2012, Fitz-Gibbon 2013). En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden una o más cepas bacterianas deP. acnesvivas descritas en el presente documento incluyen una o más de las cepas K1, K4 y H1 deP. acnes(6609). En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden una o más cepas bacterianas deP. acnesvivas descritas en el presente documento comprenden cada una de las cepas K1, K4, D1, A5, C3 y H1 deP. acnes(6609). Aspectos de la invención se refieren a mezclas de cepas deP. acnes.La selección de cepas deP. acnespuede implicar, al menos en parte, una determinación de si la cepa es patógena. Esta determinación puede basarse en información pública, informes anteriores y/o pruebas experimentales para determinar si una cepa deP. acneses patógena o no. En algunas realizaciones, solo se seleccionan cepas deP. acnesno patógenas.

La selección de cepas deP. acnestambién puede implicar, al menos en parte, una determinación de qué cepas, o combinaciones de cepas, son estables en condiciones que serían apropiadas para su uso en una composición cosmética o farmacéutica. En algunas realizaciones, se seleccionan cepas deP. acnesque presentan estabilidad aumentada. La estabilidad puede evaluarse usando métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo midiendo un cambio en las unidades formadoras de colonias (UFC).

Las cepas deP. acnesincluidas en las composiciones bacterianas descritas en el presente documento pueden ser de origen natural o pueden estar modificadas genéticamente. Las cepas que están modificadas genéticamente pueden modificarse por mutagénesis natural y/o por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la modificación genética de la cepa deP. acnesinfluye en la producción de ácido trans-10, cis-12 linoleico y/o aumenta o disminuye su actividad ácido linoleico isomerasa. En algunas realizaciones, las cepas deP. acnesmuestran niveles diferentes de ácido linoleico isomerasa, lo que puede usarse para clasificar cepas bacterianas y/o para seleccionar cepas bacterianas específicas.

En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesse seleccionan en función de su capacidad para producir ácido trans-10, cis-12 linoleico. En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesse seleccionan en función de la cantidad de ácido trans-10, cis-12 linoleico que produce en su entorno natural. En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesse seleccionan en función de la concentración máxima de ácido trans-10, cis-12 linoleico que produce. En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesse seleccionan en función de la actividad de la enzima ácido linoleico isomerasa que produce. En algunas realizaciones, se selecciona una cepa deP. acnessin actividad de ácido linoleico. En otras realizaciones, se selecciona una cepa deP. acnescon bajos niveles de actividad de ácido linoleico. En otras realizaciones, se selecciona una cepa deP. acnescon altos niveles de actividad de ácido linoleico.

En algunas realizaciones, la producción de ácido trans-10, cis-12 linoleico por las cepas deP. acnesse detecta usando los métodos descritos en la patente estadounidense n.° 6.743.609, titulada “Linoleato isomerasa”, otorgada el 1 de junio de 2004. En algunas realizaciones, la cantidad de ácido trans-10, cis-12 linoleico producido se detecta usando FAME (ésteres metílicos de ácidos grasos) y/o GC (cromatografía de gases).

En algunas realizaciones, una cepa deP. acnespuede convertir desde 500 pm de ácido linoleico hasta 250 ppm de ácido trans-10, cis-12 linoleico y luego puede mantener esta concentración constante. En algunas realizaciones, se selecciona una cepa deP. acnesque tiene mayor capacidad para la conversión de ácido linoleico en ácido trans-10, cis-12 linoleico. En otras realizaciones, se selecciona una cepa deP. acnesque tiene menor capacidad para la conversión de ácido linoleico en ácido trans-10, cis-12 linoleico.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría, en algunas realizaciones, una composición bacteriana en la que las cepas deP. acnestienen niveles de cero a bajos de ácido linoleico isomerasa puede ser beneficiosa para prevenir o tratar el acné porque tales composiciones pueden reducir la secreción de sebo. En algunas realizaciones, tal composición puede ser útil para evitar la recaída del acné después de finalizar el tratamiento convencional del acné (como desinfección o antibióticos).

En algunas realizaciones, pueden usarse composiciones bacterianas para aumentar los niveles de ácido trans-10, cis12 linoleico en los folículos de la piel. En otras realizaciones, pueden usarse composiciones bacterianas para disminuir los niveles de ácido trans-10, cis-12 linoleico en los folículos de la piel. En algunas realizaciones, se usa una combinación de cepas deP. acnespara administrar ácido trans-10, cis-12 linoleico directamente a las glándulas sebáceas, ya sea con fines cosméticos o médicos.

En algunas realizaciones, se usa una composición bacteriana descrita en el presente documento para reducir la producción de sebo en la piel que tiene altos niveles de producción de sebo, tal como piel grasa. En otras realizaciones, se usa una composición bacteriana descrita en el presente documento para aumentar la producción de sebo en la piel que tiene bajos niveles de producción de sebo, tal como piel seca. En algunas realizaciones, se aplica una combinación de cepas con alta actividad ácido linoleico isomerasa a la piel de individuos que carecen de suficiente producción de sebo. En algunas realizaciones, tales individuos son personas mayores que pueden experimentar una disminución en la producción de sebo.

En algunas realizaciones, la cantidad de ácido cis-12, trans-10 linoleico producido por una cepa deP. acnesse evalúa comparando la producción de ácido cis-12, trans-10 linoleico en la cepa que está sometiéndose a prueba con una cepa deP. acnesque se sabe que no produce ácido cis-12, trans-10 linoleico o que produce cantidades insignificantes o más bajas que el promedio del ácido cis-12, trans-10 linoleico. En otras realizaciones, la cantidad de ácido cis-12, trans-10 linoleico producido por una cepa deP. acnesse evalúa comparando la producción de ácido cis-12, trans-10 linoleico en la cepa que está sometiéndose a prueba con una cepa deP. acnesque se sabe que produce cantidades promedio o más altas que el promedio de ácido trans-10, cis-12 linoleico. En algunas realizaciones, se mide o evalúa la cantidad relativa de ácido trans-10, cis-12 linoleico producido. En otras realizaciones, se mide o evalúa la cantidad relativa de ácido trans-10, cis-12 linoleico producido.

En algunas realizaciones, la cantidad de ácido cis-12, trans-9 linoleico degradado por una cepa deP. acnesse evalúa comparando la tasa de degradación de ácido cis-9, cis-12 linoleico en la cepa que está sometiéndose a prueba con una cepa deP. acnesque se sabe que no produce ácido cis-9, cis-12 linoleico o que degrada cantidades insignificantes o más bajas que el promedio del ácido cis-12, cis-9 linoleico. En otras realizaciones, la cantidad de ácido cis-9, cis-12 linoleico degradado por una cepa deP. acnesse evalúa comparando la tasa de degradación del ácido cis-9, cis-12 linoleico en la cepa que está sometiéndose a prueba con una cepa deP. acnesse sabe que tiene una tasa de degradación promedio o superior al promedio del ácido cis-9, cis-12 linoleico. En algunas realizaciones, se mide o evalúa la cantidad relativa de ácido cis-9, cis-12 linoleico degradado. En otras realizaciones, se mide o evalúa la cantidad relativa de ácido cis-9, cis-12 linoleico degradado.

En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición presentan una degradación o conversión lenta o insignificante de ácido cis-9, cis-12 linoleico. En algunas realizaciones, todas las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición presentan una degradación o conversión lenta o insignificante de ácido cis-9, cis-12 linoleico.

En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición se selecciona en función de su degradación o conversión lenta o insignificante de ácido cis-9, cis-12 linoleico. En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición se seleccionan en función de la cantidad de ácido cis-9, cis-12 linoleico que degrada en su entorno natural. En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición se seleccionan en función de la concentración máxima de ácido cis-9, cis-12 linoleico que degrada.

En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición se modifican genéticamente para degradar menos ácido cis-9, cis-12 linoleico o para degradar el ácido cis-9, cis-12 linoleico más lentamente.

Pueden someterse a prueba cepas individuales y combinaciones de cepas usando métodos de rutina para determinar qué combinaciones conducen a composiciones estables. En algunas realizaciones, tales composiciones son estables a temperatura ambiente durante al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 sem anas o más de 30 semanas. En algunas realizaciones, las composiciones son estables a temperatura ambiente durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 m eses o más de 6 meses.

En algunas realizaciones, las composiciones son estables cuando se refrigeren a aproximadamente 4 °C durante al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 Semanas, 30 semanas o más de 30 semanas. En algunas realizaciones, las composiciones son estables cuando se refrigeran a aproximadamente 4 °C durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 m eses o más de 6 meses.

En algunas realizaciones, una composición bacteriana se formula tomando una muestra del microbioma de la piel de un sujeto donante. Por ejemplo, la muestra puede tomarse de un sujeto que no tiene acné. En otras realizaciones, se toma una muestra de un sujeto que tiene acné leve, moderado o grave. En algunas realizaciones, la muestra se toma de un sujeto que tiene acné o es susceptible al acné, pero las cepas bacterianas asociadas con la causa del acné se eliminan de la muestra. Una muestra puede cultivarse y, opcionalmente, puede combinarse con otros componentes para formar una composición bacteriana. En otras realizaciones, puede formarse una composición bacteriana a partir de una o más cepas bacterianas aisladas.

Puede someterse a prueba una muestra tomada de un sujeto donante para ver si contiene cepas deP. acnesno patógenas. En algunas realizaciones, se seleccionan una o más cepas deP. acnesno patógenas de la piel de un sujeto donante y se administran a un sujeto receptor. El sujeto receptor puede ser el mismo sujeto que el sujeto donante o puede ser un sujeto diferente del sujeto donante.

En algunas realizaciones, una composición bacteriana puede incluir una o más cepas de otras bacterias, tales como otras bacterias no patógenas, además de una o más cepas deP. acnes.En algunas realizaciones, la una o más cepas de otras bacterias no patógenas tienen propiedades antibióticas. En algunas realizaciones, una composición bacteriana puede incluir una o más cepas de S.epidermidis.

En algunas realizaciones, una cepa deP. acnesdescrita en el presente documento comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-76. En algunas realizaciones, una cepa deP. acnesdescrita en el presente documento comprende una secuencia que es al menos el 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % , 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID No : 1-76.

En algunas realizaciones, una composición comprende una cepa deP. acnesque es al menos el 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO: 27 y/o una cepa deP. acnesque es al menos el 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO: 64. En algunas realizaciones, una composición comprende una cepa deP. acnesque comprende la SEQ ID NO: 27 y/o una cepa deP. acnesque comprende la SEQ ID NO: 64.

En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento no incluye una cepa de ribotipo 6 (RT6) deP. acnes.En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento no incluye una cepa de filotipo III deP. acnes.

Tabla 1: Secuencias usadas para identificar cepas deP. acnesmediante SLST

Tabla 2: Secuencias de cebador usadas para tipificar colonias bacterianas

Ácido linoleico y su isómero ácido trans-10, cis-12 linoleico

El ácido linoleico es un ácido graso C18 con dos dobles enlaces insaturados. Habitualmente, el isómero principal es cis-9, cis-12. Este isómero también se secreta como ácido graso libre en el sebo. El ácido linoleicoin vitroestimula la producción de lípidos en los sebocitos y puede participar en un bucle de retroalimentación que regula la producción de sebo. También tiene propiedades antibacterianas, presentando diferentes cepas deP. acnesdiferente susceptibilidad al ácido linoleico (Hong Lioe Koet al.,1978; Madli Puhvel y Reisner, 1970). Sin embargo, el ácido linoleico también sirve como estimulante para la producción de sebo, que representa la fuente de alimento deP. acnes.Sin desear estar limitado por ninguna teoría, puede existir un equilibrio, representado por la concentración de ácido linoleico en el sebo determinado por la población bacteriana y la producción de sebo del huésped. Este equilibrio depende de la tasa de degradación/conversión del ácido linoleico cis, cis-12 por la población deP. acnesque coloniza el folículo.

Los isómeros conjugados del ácido linoleico, concretamente, el ácido cis-9, cis-11 linoleico y el ácido trans-10, cis-12 linoleico, han llamado la atención como complementos alimenticios (Churrucaet al.,2009). El ácido trans-10, cis 12 linoleico actúa sobre la familia del receptor PPAR (receptor activado por el proliferador de peroxisomas) (Moya-Camarenaet al.,1999). La activación de PPAR-<a>activa la síntesis de lípidos en modelos epidérmicos de piel, incluido el colesterol (Rivieret al.,2000). También se ha notificado que el ácido cis-12, trans-10 linoleico aumenta las ROS (especies reactivas de oxígeno) y tiene actividad anticancerígena (Pierreet al.,2013).

Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis)

S. epidermidises una bacteria Gram-positiva que es un componente normal de la piel humana. S.epidermidispuede producir 5 lantibióticos, que incluyen: epidermina, Pep5, epicidina 280, epilancina K7 y epidermicina NI01. Un lantibiótico se refiere a un péptido similar a un antibiótico que contiene los aminoácidos no proteicos lantionina y 3-metil-lantionina (Schnellet al.,1988). La epidermina es altamente activa contraP. acnes(Allgaieret al.,1985). Gotzet al.describen la epidermina con más detalle. Wanget al.notifican que S.epidermidispuede mediar en la fermentación del glicerol para inhibir el crecimiento deP. acnes.

Las cepas deS. epidermidisincluidas en las composiciones bacterianas descritas en el presente documento pueden ser de origen natural o pueden estar modificadas genéticamente. Las cepas que están modificadas genéticamente pueden modificarse por mutagénesis natural y/o por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la modificación genética de la cepa de S.epidermidisaumenta sus propiedades antibióticas. En algunos aspectos, una composición bacteriana puede contener una o más cepas deP. acnesy una o más cepas de S.epidermidis.La una de más cepas deP. acnespuede ser resistente a las propiedades antibióticas de una o más cepas de S.epidermidis.En algunas realizaciones, la una o más cepas deP. acnesse modifican genéticamente para aumentar su resistencia a las propiedades antibióticas de una o más cepas bacterianas, tales como una o más cepas deS. epidermidis. En algunas realizaciones, la una o más cepas deP. acnesse modifican por mutagénesis natural y/o por ingeniería genética para aumentar su resistencia a las propiedades antibióticas de una o más de otras cepas bacterianas.

En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden una o más cepas bacterianas deP. acnesvivas descritas en el presente documento pueden contener uno o más de un antibiótico, un desinfectante (por ejemplo, BPO) o ácido salicílico. Un experto habitual en la técnica apreciará que cualquier antibiótico o desinfectante puede ser compatible con ciertas realizaciones de la invención.

Trasplante de microbioma de la piel

La modulación de un microbioma de la piel puede realizarse, por ejemplo, mediante trasplante. El trasplante puede producirse entre uno o más sujetos. En algunas realizaciones, el trasplante se produce en un sujeto y el mismo sujeto es el donante y el receptor. En otras realizaciones, el trasplante se produce entre dos o más sujetos. En alguna realización, hay un sujeto donante y un sujeto receptor. En otras realizaciones, hay múltiples sujetos donantes y/o múltiples sujetos receptores. Pueden usarse múltiples métodos de trasplante, dando como resultado diferentes formulaciones de una composición bacteriana. En algunas realizaciones, se trasplanta un microbioma no modificado, lo que significa que se aísla un microbioma donante y se prepara para su administración a un receptor. En otras realizaciones, se trasplanta un microbioma formulado, lo que significa que se aísla un microbioma donante, opcionalmente se genotipifica y se seleccionan cepas específicas para una formulación (por ejemplo, cepas con genotipos específicos). En algunas realizaciones, se trasplanta un microbioma formulado y editado genéticamente, lo que significa que se aísla un microbioma donante, se genotipa, se seleccionan cepas específicas, se aíslan mutantes genéticos de las cepas y se genera una formulación.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden: obtener una o más cepas bacterianas vivas de la piel de un sujeto donante, en donde las cepas bacterianas vivas son cepas deP. acnes;determinar si una o más cepas bacterianas vivas son patógenas; y administrar una o más cepas bacterianas vivas a la piel de un sujeto receptor que lo necesita después de la administración de un desinfectante o antibiótico a la piel del sujeto si la una o más cepas bacterianas vivas no son patógenas. En algunas realizaciones, se realiza un ensayo para determinar si una o más cepas deP. acnesvivas son patógenas. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo para evaluar cómo las cepas bacterianas vivas convierten o degradan el ácido cis-9, cis-12 linoleico. En algunas realizaciones, una o más de las cepas bacterianas deP. acnesdentro de la composición se seleccionan en función de su degradación o conversión lenta o insignificante de ácido cis-9, cis-12 linoleico.

Otras afecciones de la piel

Además del acné, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir otras afecciones de la piel como la caspa, la hipomelanosis macular progresiva, la dermatitis atópica o la rosácea.

La caspa está asociada con un desequilibrio en la proporción del microbioma de la piel. La caspa puede experimentarse de manera crónica o como resultado de ciertos desencadenantes, que pueden ir acompañados de enrojecimiento e irritación. Los principales contribuyentes sonPropionibacterium acnesyStaphylococcus epidermidis,y también pueden incluirMalassezia restricta.Con la caspa, hay una tasa de incidencia más baja paraP. acnesen comparación conStaphylococcus epidermidisyMalassezia restricta(Clavaudet al.,2013; Wanget al.,2015). Esto indica que la terapia de suplementación con la bacteriaP. acnespuede ser beneficiosa para un tratamiento para la caspa.

Se sabe queP. acnesestá implicada en la hipomelanosis macular progresiva, que es una hipopigmentación común principalmente en las partes centrales del tronco, predominantemente en adultos jóvenes, y especialmente en mujeres (Westerhofet al.,2004). Como se manifiesta a través de manchas blancas en la piel, se diagnostica principalmente en pacientes con un color de piel más oscuro. Recientemente, un informe mostró que la hipomelanosis macular progresiva está asociada con el clado III deP. acnes(Barnardet al.,2016). Las composiciones descritas en el presente documento contienen cepas del clado I y II y no cepas del clado III. Por lo tanto, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir la hipomelanosis macular progresiva.

La dermatitis atópica (también conocida como eccema atópico) está asociada con brotes que muestran una fuerte disbiosis del microbioma de la piel. La inflamación da como resultado enrojecimiento, hinchazón, picazón y agrietamiento de la piel. Las zonas más afectadas son la parte posterior de las rodillas, la parte frontal de los codos, las manos y los pies. Los emolientes han demostrado ser eficaces en el tratamiento de la dermatitis atópica. Los pacientes que reciben composiciones bacterianas en el presente documento presentan una afección de la piel generalmente mejorada. Por lo tanto, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar o prevenir la dermatitis atópica.

La rosácea es una afección de la piel que se caracteriza por enrojecimiento facial, vasos sanguíneos dilatados pequeños y superficiales en la piel facial, pústulas, pápulas e hinchazón. Existen cuatro tipos de rosácea, tres de los cuales afectan a la piel. El trastorno puede confundirse o coexistir con el acné vulgar o la dermatitis seborreica. La presencia de erupción en el cuero cabelludo o en las orejas sugiere un diagnóstico diferente o coexistente porque la rosácea es principalmente un diagnóstico facial, aunque ocasionalmente puede aparecer en estas otras zonas. El tratamiento de la rosácea varía según la gravedad y los subtipos. Puede usarse terapia de suplementación conP. acnesusando las composiciones descritas en el presente documento para tratar o prevenir la rosácea.

Tratamiento

Como se usa en el presente documento, el término tratar, tratado o que trata cuando se usa con respecto a un trastorno como el acné se refiere a mejorar al menos un síntoma del acné, como una reducción o mejora de las lesiones asociadas con el acné. Como se usa en el presente documento, prevenir el acné se refiere a prevenir la formación de síntomas del acné, como lesiones, y/o prevenir que al menos un síntoma del acné empeore, como prevenir lesiones adicionales o prevenir que las lesiones existentes empeoren.

Los aspectos de la invención se refieren a mejorar el aspecto de la piel y/o mantener una piel sana. Otros aspectos de la invención se refieren al tratamiento o la prevención de una afección seleccionada del grupo que consiste en: acné, piel grasa, hipomelanosis macular progresiva (Barnardet al.,2016), caspa, eccema atópico, dermatitis atópica y rosácea.

Sujetos

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a sujetos humanos o no humanos. En algunas realizaciones, un sujeto es un ser humano o no humano que tiene acné o está en riesgo de desarrollar acné. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal doméstico tal como una mascota doméstica, tal como un gato o un perro. En ciertas realizaciones, el sujeto es un animal de granja tal como una vaca, cerdo, caballo, oveja o cabra. Debe apreciarse que cualquier animal que tenga piel puede ser compatible con los aspectos de la invención.

En algunas realizaciones, un sujeto que tiene acné tiene lesiones inflamadas y/o lesiones no inflamadas. En algunas realizaciones, se seleccionan sujetos con altos recuentos de lesiones no inflamadas. En algunas realizaciones, los sujetos se asignan al azar en función del número de lesiones no inflamadas.

Cantidades eficaces

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse en cantidades eficaces. El término “cantidad eficaz” de una composición de la invención se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una composición para tratar el acné es la cantidad suficiente para mejorar al menos un síntoma del acné, como una reducción o mejora de las lesiones. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la afección que está tratándose, la composición particular que se administra, el tamaño del sujeto o la gravedad de la afección. Un experto habitual en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una composición particular de la invención sin necesidad de experimentación indebida.

Composiciones

Las composiciones, incluidas composiciones cosméticas o farmacéuticas, para administración tópica, incluyen parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizaciones, que incluyen pulverizaciones de aerosol, supositorios, líquidos, sueros o polvos. En algunas realizaciones, la preparación es un sistema de dispensación de dos componentes. Además, pueden usarse portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas o espesantes en preparaciones farmacéuticas para administración tópica. Los ejemplos de tales componentes incluyen diversos compuestos hidroxilados, como glicoles monoméricos, por ejemplo, propilenglicol, alcohol etílico, glicerina y butilenglicol, humectantes poliméricos como poli(metacrilato de glicerilo), derivados de palmitatos y estearatos, triglicéridos de ácidos grasos, lanolina, aceites vegetales o minerales y ceras. Se encontró sorprendentemente en el presente documento que una forma eficaz de establecer cepas deP. acnesno patógenas en la piel es dentro de una mezcla de múltiples cepas. Dentro de una mezcla de cepas, pueden establecerse cepas de crecimiento lento en la piel. En algunas realizaciones, las cepas se seleccionan de modo que la población resultante establecida en la piel tenga una baja actividad ácido linoleico isomerasa. Aunque, en el contexto natural, ocasionalmente se añaden nuevas cepas al microbioma de la piel (Ohet al.,2016), es poco probable que una población con una alta actividad isomerasa se reemplace por una con una baja actividad isomerasa. El enfoque descrito en el presente documento (que implica la combinación de desinfección e inoculación) proporciona un reemplazo no natural de una población con alta actividad isomerasa por una población de baja actividad isomerasa. Como se divulga en el presente documento, se encontró inesperadamente que algunas cepas de crecimiento lento, tales como la cepa K8 deP. acnesno patógena, crecen más eficientemente dentro de una mezcla de cepas y, en algunas realizaciones, se convierten en la cepa dominante dentro de una mezcla de cepas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, puede usarse una mezcla de diferentes cepas deP. acnespara colonizar más eficazmente la piel con cepas de crecimiento lento mezclándolas con otras cepas de crecimiento más rápido.

En algunas realizaciones, las composiciones incluyen medios para estabilizar el recuento bacteriano. Los medios pueden incluir agua pura, PBS, peptona y/o una versión diluida o no diluida de un medio de crecimiento adecuado o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición bacteriana (por ejemplo, un gel) contiene un bajo porcentaje de peptona que ayuda a estabilizar las bacterias. En algunas realizaciones, el porcentaje de peptona en la composición bacteriana es de aproximadamente el 0,05 % o aproximadamente el 0,1 %. El porcentaje de peptona puede oscilar en algunas realizaciones entre el 0,005 % - 1 %, o entre el 0,05 % - 1 %. Por ejemplo, el porcentaje de peptona puede ser de aproximadamente el 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de peptona es menor del 0,005 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de peptona es mayor del 1 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de peptona es de aproximadamente el 0,25 %.

En otras realizaciones, se usa un medio de crecimiento adecuado en lugar de peptona.

En algunas realizaciones, la fuente de peptona es de la caseína, tal como peptona digerida con tripsina de la caseína. Sin embargo, debe apreciarse que cualquier forma o fuente de peptona puede ser compatible con aspectos de la invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la peptona se digiere con ácido, en lugar de digerirse con tripsina. En algunas realizaciones, la peptona es de carne.

En algunas realizaciones, la composición contiene un componente de tampón para ayudar a estabilizar el pH. En algunas realizaciones, el pH es de entre 4,5-8. Por ejemplo, el pH puede ser de aproximadamente 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8,0, incluido cualquier valor entre ellos. En algunas realizaciones, el pH es de aproximadamente 7,0.

Los ejemplos no limitantes de tampones pueden incluir ACES, acetato, ADA, hidróxido de amonio, AMP (2-amino-2-metil-1-propanol), AMPD (2-amino-2-metil-1,3-propanodiol), AMPSO, BES, BICINE, bis-tris, BIS-TRiS propano, borato, CABS, cacodilato, CAPS, CAPSO, carbonato (pK1), carbonato (pK2), CHES, citrato (pK1), citrato (pK2), citrato (pK3), DIPSO, EPPS, HEPPS, etanolamina, formiato, glicina (pK1), glicina (pK2), glicilglicina (pK1), glicilglicina (pK2), HEPBS, HEPES, HEPPSO, histidina, hidrazina, imidazol, malato (pK1), malato (pK2), maleato (pK1), maleato (pK2), MES, metilamina, MOBS, MOPS, MOPSO, fosfato (pK1), fosfato (pK2), fosfato (pK3), piperazina (pK1), piperazina (pK2), piperidina, PIPES, POPSO, propionato, piridina, pirofosfato, succinato (pK1), succinato (pK2), T<a>B<s>, TAPS, TAPSO, taurina (AES), TES, tricina, trietanolamina (TEA) y Trizma (tris).

En algunas realizaciones, la formulación incluye un espesante. Los ejemplos no limitantes de espesantes pueden incluir hidroxietilcelulosas (por ejemplo, NATROSOL®), almidón, gomas como goma arábiga, caolín u otras arcillas, silicato de aluminio hidratado, sílice pirogénica, polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica u otros derivados de celulosa, monoestearato de etilenglicol y alginatos de sodio.

En algunas realizaciones, el espesante es hidroxietilcelulosa. En algunas realizaciones, la hidroxietilcelulosa comprende hidroxietilcelulosa (HEC) NATROSOL® (Ashland Inc.). En algunas realizaciones, el NATROSOL® es NATROSOL® HX (Caesar & Loretz GmbH, n.° de orden 4482, CAS: 9004-62-0) o NATROSOL® G (Caesar & Loretz GmbH, n.° de orden 4484, CAS: 9004-62-0). Debe apreciarse que cualquier forma de hidroxietilcelulosa puede ser compatible con aspectos de la invención. En algunas realizaciones, el tipo de viscosidad es HHR-P, HH, H4, H, MH, M, K, G, E o L.

En algunas realizaciones, la concentración del espesante, tal como hidroxietilcelulosa, está entre aproximadamente el 1 %-5 %. Por ejemplo, la concentración puede ser de aproximadamente el 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o 5,0 %. En otras realizaciones, la concentración del espesante, tal como hidroxietilcelulosa, es menor del 1 % o mayor del 5 %. En algunas realizaciones, la concentración del espesante, tal como hidroxietilcelulosa, es de aproximadamente el 1,5 %. En algunas realizaciones, la concentración del espesante, tal como hidroxietilcelulosa, es de aproximadamente el 2,5 %.

En algunas realizaciones, una composición comprende una o más cepas deP. acnesvivas en unidades formadoras de colonias (UFC) de al menos 104-109/ml. Por ejemplo, la UFC puede ser al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o más de 109/ml. En algunas realizaciones, todas las cepas deP. acnesestán presentes en una composición en unidades formadoras de colonias (UFC) de al menos 104-109/ml. En algunas realizaciones, la composición bacteriana presenta una UFC estable durante al menos tres m eses a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el recuento de UFC fluctúa brevemente en la fase de almacenamiento inicial (por ejemplo, 2 semanas) y luego se estabiliza.

En algunas realizaciones, una composición comprende aproximadamente el 2,5 % de un espesante, tal como hidroxietilcelulosa (HEC) NATROSOL®; aproximadamente el 0,25 % de peptona, tal como peptona digerida con tripsina de la caseína; y una UFC de aproximadamente 104-109/ml de dos o más cepas deP. acnesvivas (por ejemplo, aproximadamente 107/ml de cada una de las cepas deP. acnesvivas).

Los aspectos de la invención se refieren a composiciones que comprenden mezclas de diferentes cepas deP. acnesvivas. Las mezclas pueden incluir dos o más cepas. En algunas realizaciones, la composición incluye al menos dos cepas deP. acnesvivas diferentes. Las dos cepas diferentes pueden estar presentes a concentraciones iguales o a concentraciones desiguales. En algunas realizaciones, la composición comprende una mezcla de 2 cepas de cepa C3 deP. acnesy cepa K8 deP. acnes.En ciertas realizaciones, ambas cepas están presentes a concentraciones iguales. En ciertas realizaciones, ambas cepas están presentes en una CPU de aproximadamente 5 x 106/ml.

En algunas realizaciones, la composición comprende al menos 4 cepas diferentes deP. acnesvivas. En ciertas realizaciones, la composición comprende una mezcla de 4 cepas de cepa C3 deP. acnes,cepa A5 deP. acnes,cepa F4 deP. acnesy cepa K8 deP. acnes.Las cuatro cepas diferentes pueden estar presentes a concentraciones iguales o a concentraciones desiguales. En ciertas realizaciones, las concentraciones relativas de las cepas C3, A5, F4 y K8 son aproximadamente el 55 %, el 30 %, el 10 % y el 5 %, respectivamente. En algunas realizaciones, los valores de CPU para las cepas C3, A5, F4 y K8 son aproximadamente 5,5 x 106/ml, 5,5 x 106/ml, 1 x 106/ml y 5 x 105/ml, respectivamente.

En algunas realizaciones, cada cepa bacteriana deP. acnesviva constituye al menos aproximadamente el 5 % de la composición.

En algunas realizaciones, las composiciones incluyen además ácido salicílico. En algunas realizaciones, las composiciones incluyen el 0,05-10 % de ácido salicílico. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir aproximadamente el 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 % de ácido salicílico. En otras realizaciones las composiciones incluyen menos de un 0,05 % de ácido salicílico o más de un 10 % de ácido salicílico. En algunas realizaciones, en una composición que se mantiene en la cara durante un tiempo prolongado, el porcentaje de ácido salicílico es menor o igual al 2 %. En algunas realizaciones, en una composición que se lava de la cara y no se mantiene en la cara durante un tiempo prolongado, el porcentaje de ácido salicílico es menor o igual al 3 %. Sorprendentemente, las cepas deP. acnesno se ven inhibidas por el ácido salicílico, lo que permite la inclusión del ácido salicílico en las composiciones descritas en el presente documento para el tratamiento de afecciones de la piel (por ejemplo, acné o caspa).

En algunas realizaciones, la composición bacteriana se combina con uno o más compuestos antiinflamatorios. Sin desear estar limitado por ninguna teoría, el compuesto antiinflamatorio puede reducir las lesiones inflamadas a corto plazo, mientras que la composición bacteriana puede abordar el problema subyacente y producir un efecto a largo plazo.

En algunas realizaciones, las composiciones comprenden emolientes como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitativos de emolientes incluyen alcohol estearílico, monoricinoleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, propano-1,2-diol, butano-1,3-diol, aceite de visón, alcohol cetílico, isoestearato de isopropilo, ácido esteárico, palmitato de isobutilo, estereato de isocetilo, alcohol oleílico, laurato de isopropilo, laurato de hexilo, oleato de decilo, octadecan-2-ol, alcohol isocetílico, palmitato de cetilo, dimetilpolisiloxano, sebacato de di-n-butilo, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, estearato de isopropilo, estearato de butilo, polietilenglicol, trietilenglicol, lanolina, aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de arrachis, aceite de ricino, alcoholes de lanolina acetilados, petróleo, aceite mineral, miristato de butilo, ácido isoesteárico, ácido palmítico, linoleato de isopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo, oleato de decilo, miristato de miristilo.

En algunas realizaciones, se incluye en la composición un agente estabilizador de proteínas como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitantes incluyen glicerol, ácido etilendiaminotetraacético, cisteína e inhibidores de proteinasa, tales como leupeptina, pepstatina, antipaína y cistatina.

En algunas realizaciones, se incluye en la composición un humectante como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitantes de humectantes incluyen glicerina, sorbitol, 2-pirrolidona-5-carboxilato de sodio, colágeno soluble, ftalato de dibutilo, gelatina.

En algunas realizaciones, se incluye en la composición un agente astringente como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitantes de agentes astringentes incluyen flores de árnica o extractos de las mismas, alcoholes de alquilo inferior, hamamelis, ácido bórico, ácido láctico, metol, alcanfor, fenolsulfato de zinc, acetato de aluminio, sulfato de aluminio y cloruro o sulfato de zinc.

En algunas realizaciones, se incluye en la composición un pigmento como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitantes de pigmentos incluyen dióxido de titanio, micas, óxidos de hierro, laca de bario, laca de calcio, laca de aluminio, oxicloruro de bismuto, laca de circonio y óxidos de calcio.

En algunas realizaciones, se incluye en la composición un agente colorante como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitantes de agente colorante incluyen shikonina, p-caroteno, paprika, monascus, rojo de cártamo, amarillo de cártamo, color rojo de repollo, color púrpura de boniato, licopeno, color de cacao, color de uva, cochinilla, color de resina, rojo de remolacha, hemateína, rojo n.° 215, rojo n.° 218, rojo n.° 223, rojo n.° 225, naranja n.° 201, naranja n.° 206, amarillo n.° 201, verde n.° 202, y morado n.° 201, rojo n.° 2, rojo n.° 3, rojo n.° 102, rojo n.° 104 (1), rojo n.° 105 (1), rojo n.° 106, amarillo n.° 4, amarillo n.° 5, verde n.° 3, azul n.° 1, azul n.° 2, rojo n.° 201, rojo n.° 213, rojo n.° 214, rojo n.° 227, rojo n.°230 (1), rojo n.° 230 (2), rojo n.° 231, rojo n.° 232, naranja n.° 205, naranja n.° 207, amarillo n.° 202 (1), amarillo n.° 202 (2), amarillo n.° 203, verde n.° 201, verde n.° 204, verde n.° 205, azul n.° 202, azul n.° 203, azul n.° 205 y marrón n.° 201.

En algunas realizaciones, se incluyen en las composiciones filtros de radiación UV-A y UV-B, filtros solares, bloqueadores de radicales libres, extractos de vitaminas o antioxidantes como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336.

En algunas realizaciones, se incluye en la composición un tensoactivo o un solvente como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336. Los ejemplos no limitantes de disolventes incluyen agua, alcohol etílico, tolueno, cloruro de metileno, isopropanol, alcohol n-butílico, aceite de ricino, monoetil éter de etilenglicol, monobutil éter de dietilenglicol, monoetil éter de dietilenglicol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida y tetrahidrofurano. i) Tensoactivos aniónicos, tales como sales metálicas o de alcanolamina de ácidos grasos, por ejemplo, laurato de sodio y oleato de trietanolamina; alquilbencenosulfonas, por ejemplo dodecilbencenosulfonato de trietanolamina; sulfatos de alquilo, por ejemplo laurilsulfato de sodio; alquil éter sulfatos, por ejemplo lauril éter sulfato de sodio (2 a 8 OE); sulfosuccinatos, por ejemplo dioctilsulfosuccinato de sodio; sulfatos de monoglicéridos, por ejemplo monosulfato de monoestearato de glicerilo sódico; isotionatos, por ejemplo isotionato de sodio; tauridas de metilo, por ejemplo Igepon T; acilsarcosinatos, por ejemplo miristilsarcosinato de sodio; péptidos de acilo, por ejemplo Maypons y lamepons; lactilatos de acilo, glicolatos de éter polialcoxilados, por ejemplo ácido trideceth-7-carboxílico; fosfatos, por ejemplo dilaurilfosfato de sodio; tensoactivos catiónicos, tales como sales de amina, por ejemplo clorhidrato de sapamina; sales de amonio cuaternario, por ejemplo, Quaternium 5, Quaternium 31 y Quaternium 18; tensoactivos anfóteros, tales como compuestos de imidazol, por ejemplo, miranol; aminoácidos de N-alquilo, tales como cocaminopropionato de sodio y derivados de asparagina; betaínas, por ejemplo cocamidopropilebetaína; tensoactivos no iónicos, tales como alcanolamidas de ácidos grasos, por ejemplo etanolamida oleica; ésteres o polialcoholes, por ejemplo Span; ésteres de poliglicerol, por ejemplo, que están esterificados con ácidos grasos y uno o varios grupos OH; derivados polialcoxilados, por ejemplo, polioxi:estearato de polioxietileno; éteres, por ejemplo, polioxietil lauril éter; éteres de éster, por ejemplo Tween; óxidos de amina, por ejemplo óxidos de coco y dodecildimetilamina. En algunas realizaciones, se incluye más de un tensoactivo o disolvente.

En algunas realizaciones, se incluyen en las composiciones conservantes, antisépticos, pigmentos o colorantes, fragancias, agentes de enmascaramiento y portadores, tales como agua y alquilo inferior, alcoholes, como los divulgados en la patente estadounidense n.° 5.525.336.

En algunas realizaciones en donde una composición está en un polvo, los polvos pueden incluir tiza, tierra de Fuller, dióxido de silicio coloidal, poliacrilato de sodio, esmectitas de tetraalquil y/o trialquilarilamonio y silicato de aluminio y magnesio químicamente modificado como se divulga en la patente estadounidense n.° 5.525.336. En algunas realizaciones, una composición puede incluir un perfume.

Cuando se administran, las composiciones de la invención se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz, farmacéuticamente aceptable, como una formulación farmacéuticamente aceptable. Cualquiera de las composiciones de la presente invención puede administrarse al sujeto en una dosis terapéuticamente eficaz. Cuando se administra a un sujeto, las cantidades efectivas dependerán de la afección particular que esté tratándose y del resultado deseado. Los expertos en la técnica pueden determinar una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, empleando factores como los descritos en el presente documento y no usando más que experimentación rutinaria.

En algunas realizaciones, uno o más de los siguientes agentes se incluyen en las composiciones descritas en el presente documento: antibióticos tópicos (por ejemplo, clindamicina, eritromicina, tetraciclina, metronidazol), antibióticos orales (por ejemplo, tetraciclina, eritromicina, minociclina, doxiciclina, clindamicina), retinoides tópicos (por ejemplo, adapaleno, tazaroteno, tretinoína), retinoides orales (por ejemplo, isotretinoína), peróxido de benzoílo, ácido salicílico, azufre, ácido azelaico y péptidos antimicrobianos y derivados de los mismos (por ejemplo, lipohexapéptido HB1345, oligopéptido-10, magaininas (por ejemplo, pexiganan), protegrinas (por ejemplo, iseganan), indolicidinas (por ejemplo, omiganan, MBI 594AN), histatinas (por ejemplo, P113 P113D), proteínas bactericidas humanas/que aumentan la permeabilidad (por ejemplo, XMP.629, neuprex), catelicidinas (por ejemplo, catelicidina-BF).

En algunas realizaciones, las composiciones se administran en forma tópica, tal como en una crema o ungüento. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones descritas en el presente documento comprende parte de un tratamiento de combinación o se deriva de un tratamiento anterior de la piel de un sujeto.

La cantidad apropiada de una composición que va a aplicarse puede depender de muchos factores diferentes y puede determinarla un experto habitual en la técnica a través de experimentación rutinaria. Varios factores no limitantes que podrían considerarse incluyen la actividad biológica y la biodisponibilidad del agente, la naturaleza del agente, el modo de administración, la semivida y las características del sujeto que va a tratarse.

En algunas realizaciones, la composición bacteriana no se aplica a sujetos con piel sensible. En algunas realizaciones, cuando se usa una composición bacteriana para el tratamiento o la prevención del acné, el sujeto que está tratándose evita la exposición innecesaria al sol y usa un protector solar. En algunas realizaciones, si la piel tratada está irritada, caracterizada por enrojecimiento, hinchazón, ardor, picazón o descamación, el producto se usa con menos frecuencia o en una concentración más baja.

En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento se administra a la piel de un sujeto para mantener una piel sana. Una composición puede administrarse una vez o múltiples veces. En algunas realizaciones, se administra una composición a intervalos regulares mientras que, en otras realizaciones, se administra en intervalos irregulares. Por ejemplo, una composición puede administrarse aproximadamente cada 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o más o menos frecuentemente, incluidos todos los valores intermedios.

En algunas realizaciones, se administra una composición a un sujeto que también recibe o ha recibido previamente un tratamiento convencional para el acné, como un desinfectante o un antibiótico, como reconocería un experto habitual en la técnica. En algunas realizaciones, la composición se administra en paralelo con el tratamiento convencional para el acné. En otras realizaciones, la composición se administra después del tratamiento convencional del acné. La composición puede administrarse o bien inmediatamente después del tratamiento previo o bien puede haber un retraso entre el tratamiento previo y la administración de la composición. La composición puede administrarse una vez o múltiples veces después del tratamiento previo. En algunas realizaciones, se administra una composición a intervalos regulares después del tratamiento previo, mientras que en otras realizaciones se administra en intervalos irregulares después del tratamiento previo. Por ejemplo, una composición puede administrarse cada 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas. horas, 24 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o más o menos frecuentemente, incluidos todos los valores intermedios después de un tratamiento previo.

Las cepas bacterianas, tales como en las cepas de S.epidermis,pueden estar mutadas. Pueden hacerse mutaciones en algunas realizaciones seleccionando una sustitución de aminoácido, o mediante mutagénesis aleatoria de un sitio seleccionado en un ácido nucleico o polipéptido. Los polipéptidos variantes pueden expresarse y someterse a prueba para una o más actividades para determinar si una mutación proporciona un polipéptido variante con las propiedades deseadas. Pueden hacerse mutaciones adicionales en variantes (o en polipéptidos no variantes) que son silenciosas en cuanto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que proporcionan codones preferidos para la traducción en un huésped particular. Los codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico en, por ejemplo,E. coli,los conocen por los expertos habituales en la técnica. Todavía pueden hacerse otras mutaciones en las secuencias no codificantes de un gen o clon de ADNc para mejorar la expresión del polipéptido. La actividad de los polipéptidos variantes puede someterse a prueba mediante la clonación del gen que codifica el polipéptido variante en un vector de expresión bacteriano o eucariota, introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, expresando el polipéptido variante y sometiendo a prueba la capacidad funcional de los polipéptidos como se divulga en el presente documento.

Las células bacterianas de acuerdo con la invención pueden cultivarse en una variedad de medios, incluidos medios ricos o mínimos. Como entenderá un experto habitual en la técnica, la optimización de rutina permitiría el uso de una variedad de tipos de medios. Los medios pueden suplementarse con varios componentes adicionales, incluidas fuentes de azúcar. Algunos ejemplos no limitativos de componentes suplementarios incluyen glucosa, aminoácidos, antibióticos y suplemento de minerales traza de la ATCC. De manera similar, otros aspectos del medio y las condiciones de crecimiento de las células de la invención pueden optimizarse mediante experimentación rutinaria. Por ejemplo, el pH, la temperatura y la concentración de componentes dentro de las composiciones son ejemplos no limitativos de factores que pueden optimizarse.

Los cultivos líquidos y/o sólidos utilizados para cultivar células asociadas con la invención pueden alojarse en cualquiera de los recipientes de cultivo conocidos y usados en la técnica.

En algunas realizaciones, las cepas bacterianas se cultivan en lotes. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas se cultivan en fermentadores. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden las cepas bacterianas se envasan. En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden las cepas bacterianas se envasan en jeringas o bolsitas enterales.

Kits

La presente invención también proporciona cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente en kits. En algunas realizaciones, un kit comprende un recipiente que contiene bacterias vivas o un recipiente que contiene bacterias vivas liofilizadas. Los kits pueden incluir un segundo recipiente que incluye medios como peptona. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir antibiótico(s), desinfectante(s) (por ejemplo, BPO) y/o ácido salicílico. En algunas realizaciones, el(los) antibiótico(s), desinfectante(s) y/o ácido salicílico se usan para tratar previamente la piel antes de la aplicación de la composición que comprende bacterias vivas. Los kits también pueden incluir instrucciones para administrar la composición. En ciertas realizaciones, se proporcionan instrucciones para mezclar las cepas bacterianas con otros componentes de la composición. En algunas realizaciones, un kit incluye adem ás un aplicador para aplicar la composición bacteriana a un sujeto.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que de ningún modo deben interpretarse como limitaciones adicionales.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diferentes cepas de P. acnes tienen diferentes niveles de actividad ácido linoleico isomerasa o umbrales finales de concentración de ácido trans-10, cis-12 linoleico

Se realizaron experimentos para caracterizar la actividad ácido linoleico isomerasa de múltiples cepas diferentes deP. acnes.Las cepas deP. acnesse cultivaron en un medio de crecimiento que carecía de ácido linoleico (Rossonet al.,2004). Se añadió ácido cis-9, cis-12 linoleico al medio de crecimiento y luego se determinó la cantidad de isómero de ácido cis-9, cis-12 y trans-10, cis-12 linoleico en diferentes puntos de tiempo, usando un ensayo que implica la conversión a ésteres metílicos de ácidos grasos y posterior cromatografía de gases. Se describen métodos establecidos para distinguir los isómeros cis y trans de los ácidos grasos insaturados en Krameret al.,2004.

Sorprendentemente, se encontró que la elección de los medios y las condiciones de incubación son variables importantes para realizar estos experimentos. Para medir la degradación del ácido linoleico en el medio, se usó medio clostridial reforzado (RCM) porque se observó que en algunos otros tipos de medio, el ácido linoleico precipitaba.

Los resultados que muestran la degradación del ácido cis-9, cis-12 linoleico se muestran en la figura 1. Se observó una disminución muy rápida del ácido cis-9, cis-12 linoleico, produciéndose la mayor parte de la degradación en las primeras 48 h del experimento. También se observó que, mientras que la cepa A1 agota completamente el ácido linoleico del medio, la cepa C3 se ralentiza sorprendentemente en la degradación del ácido linoleico alcanzando una concentración de equilibrio. Sin desear estar limitados por ninguna teoría, los pacientes con acné habitualmente tienen una menor concentración de ácido linoleico en el sebo en comparación con los sujetos sanos. Por consiguiente, una población de cepas de degradación lenta dará como resultado una mayor concentración de ácido linoleico en el sebo, lo que puede ser ventajoso.

Solo se detectaron pequeñas cantidades de isómero del ácido cis-12, trans-10 linoleico en medios ricos, como RCM, probablemente porque los medios ricos como RCM no representan el ambiente que se encuentra en las glándulas sebáceas. En particular, la glucosa está normalmente limitada en las glándulas sebáceas y podría influir en el programa metabólico de las bacterias (Im y Hoopes, 1974). Todos los medios usados con anterioridad comúnmente paraP. acnes(por ejemplo, RCM, BHI, GAM) contienen al menos 3 g/l de glucosa, mientras que, en las glándulas sebáceas, la glucosa solo aparece en concentraciones comparablemente bajas (por ejemplo. ~0,6-1,4 g/kg de peso seco (Im y Hoopes, 1974)).

Por tanto, en el presente documento se diseñó un medio libre de glucosa en el que se cultivan todas las cepas deP. acnesy se usó para someter a prueba y caracterizar 11 cepas deP. acnes. Se estableció un medio mínimo a partir de peptona y extracto de levadura (medio PY) que permite el crecimiento de bacterias y la medición de la producción del isómero de ácido cis-12, trans-10 linoleico, ya que se asemeja al entorno natural encontrado por las bacterias.

Se desarrollaron condiciones para evaluar la producción del isómero de ácido trans-10, cis-12 linoleico que implica agitar muestras en un medio mínimo. Se muestra un análisis del curso temporal realizado con múltiples cepas en la figura 3. A medida que el crecimiento de las cepas individuales varió, la lectura se normalizó y se corrigió por la densidad óptica (DO) medida a 600 nm, lo que se confirmó mediante recuentos de UFC en placas de agar. Para normalizar la DO, la DO de cada cultivo se usó como una medida para la biomasa de cada cepa. Todas las mediciones de DO se dividieron entre el valor medido más alto, proporcionando un factor que representa el crecimiento relativo. La concentración de ácido cis-12, trans-10 linoleico medida se multiplicó entonces por este factor para cada cepa. El supuesto subyacente es que una cepa que habrá crecido hasta una alta densidad óptica podría haber producido aún menos isomerasa por célula que una cepa de crecimiento lento. Las concentraciones corregidas del isómero de ácido trans 10, cis 12 linoleico se muestran en la figura 2. La cepa A1, que generalmente está asociada con el acné (McDowellet al.,2012, PLoS ONE 7, e41480), produjo la mayor parte del isómero del ácido trans-10, cis-12 linoleico. Las cepas con muy poca producción de isómero del ácido trans-10, cis-12 linoleico fueron C3, C1, F4, A5, K1, K2, K8 y L1. Las cepas K y la cepa L1 mostraron muy poco crecimiento. Estas cepas también crecen muy lentamente en medios ricos y rara vez aparecen en la naturaleza. Inesperadamente, como se comenta a continuación, en ciertas combinaciones con otras cepas, la cepa K8 muestra un crecimiento mejorado.

Materiales y métodos

Cada cepa se cultivó como un precultivo y los precultivos se normalizaron por DO. Antes de cada experimento, se preparó un medio fresco que contenía ácido cis 9, cis 12 linoleico 1,7 mM. Los cultivos se incubaron luego a 37 °C, o bien inmóvil o bien con agitación a 220 rpm. Las muestras se tomaron en varios puntos de tiempo y se congelaron inmediatamente a -80 °C hasta la extracción de lípidos y el análisis de cromatografía de gases (GC).

Para el análisis de GC, los lípidos en los medios se extrajeron y se convirtieron en sus ésteres metílicos. Para esto, se diluyeron 100 |il de una muestra del medio se diluyó con 900 |il de H<2>O. Se añadieron 20 |ig de ácido heptadecanoico como patrón interno y la fracción lipídica completa se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó luego y se secó bajo nitrógeno. Entonces, los lípidos se convirtieron con una disolución de trifluoruro de borometanol al 14 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, número de catálogo B1252), se extrajeron con hexano, se secaron bajo nitrógeno y se resuspendieron en 100 |il de hexano. Las muestras se analizaron entonces en un cromatógrafo de gases Varían CP 3800 con detector FID. La columna usada fue una columna capilar CP-WAX 58 (FFAP) de 25 m x 0,32 mm de D.I. de Agilent Technologies, Santa Clara, CA. y el programa de temperatura fue de 120 °C (1 min) -120 °C a 250 °C (20 °C/min) - 250 °C (12 min).

Ejemplo 2: Optimización de mezclas de cepas bacterianas

El ejemplo 1 demuestra que cepas aisladas deP. acnesdifirieron significativamente en su comportamiento de crecimiento. En general, se descubrió que las cepas del clado I son de crecimiento rápido, mientras que las cepas del clado II son de crecimiento lento (véase, por ejemplo, la figura 5). En general, las cepas que se consideran no asociadas con el acné es más probable que se originen del clado II (Lomholt y Kilian, 2010; Yuetal.).Este crecimiento lento indica que estas cepas es menos probable que colonicen la piel después de una desinfección. Las cepas del clado II también se encuentran con menos frecuencia en sujetos humanos. En la naturaleza, la piel tiende a ser colonizada por cepas de rápido crecimiento del clado I. Por el contrario, se describen en el presente documento mezclas de cepas que permiten la colonización de la piel por cepas del clado II.

Experimentos adicionales con curvas de crecimiento mostraron que las mezclas de 2 o 4 cepas crecen de manera similar tan rápido como los aislados puros más rápidos en las mezclas. Sorprendentemente, cuando se analizaron composiciones de mezclas que consisten en 6 cepas cultivadas durante 5 días en agar, se encontró que la mayoría de las bacterias se originaban de la cepa K8 (figura 7), que era una cepa que se observó que crecía lentamente cuando se cultivaba individualmente. Por consiguiente, pueden crearse mezclas de cepas que tienen propiedades de crecimiento ventajosas, aunque contengan cepas individuales que crecen lentamente en la naturaleza y que probablemente serían superadas en la naturaleza.

Se ha notificado que las cepas dentro del clado IA1 están asociadas con el acné vulgar (Lomholt y Kilian, 2010, PLoS One 5; McDowellet al.,2012, PLoS ONE 7, e41480). Para seleccionar cepas del clado IA1 para mezclar con cepas del clado II para colonizar conjuntamente la piel, se usaron los criterios de conversión de ácido cis 9, cis 12 linoleico en el isómero trans 10, cis 12 para la selección de cepas. Es improbable que la colonización de la piel con una mezcla de cepas de este tipo se produzca de manera natural, en parte debido a que el aumento del uso de cosméticos con conservantes y productos higiénicos conduce a la selección natural de cepas de crecimiento rápido, que se convierten en los ocupantes dominantes de la piel. En consecuencia, en una transferencia natural de las cepas deP. acnes(por ejemplo, por contacto directo con el cuerpo), la gran mayoría de las bacterias transferidas serían de una sola cepa. Basándose en el comportamiento de crecimiento y la producción de ácido trans 10, cis 12 linoleico, la cepa C3 se seleccionó como una cepa para colonización para su uso en las composiciones que comprenden mezclas de cepas bacterianas. Luego se sometió a prueba el efecto de variar las concentraciones de partida de la composición sobre la piel. Se mezclaron 6 cepas diferentes en cantidades iguales y se añadió una de las 6 cepas en exceso. Después de 5 y 6 días de crecimiento, se evaluó entonces la composición de la mezcla. Basándose en estos datos junto con las curvas de crecimiento, se seleccionó la concentración final de cepas en las composiciones que comprenden mezclas de cepas bacterianas.

Se añadió una alta concentración (por ejemplo, menor o igual al 60 %) de una cepa del clado I, que presentaba una tasa de conversión baja de ácido cis 9, cis 12 linoleico, se cultivó hasta una DO media alta y mostró una disminución en la cantidad relativa de la mezcla desde el día 5 hasta el día 6.

Se preparó una mezcla en la que una cepa dada representa al máximo el 50 % de la población. En la naturaleza, la mayoría de las veces una cepa deP. acnesprobablemente representa más del 90 % de la población observada deP. acnesen un huésped.

Se observó que el comportamiento de crecimiento deP. acnespara algunas cepas depende en gran medida del recuento de UFC de partida. Por lo tanto, se investigó cómo se desarrolla la proporción relativa de una cepa en una mezcla una vez que el cultivo ha alcanzado una fase estacionaria. Sorprendentemente, se encontró que la dinámica subyacente por la cual una cepa se convierte en una cepa dominante está determinada, al menos en parte, por la cantidad inicial de bacterias y varía de una cepa a otra.

Los precultivos se hicieron crecer en medios RCM y, después de la centrifugación, se resuspendieron en PBS. Los cultivos se normalizaron a DO 0,5. Luego se inoculó 1 ml de medio con 50 |il de la suspensión normalizada. Las placas se sellaron herméticamente y los cultivos se incubaron entonces a 37 °C en un instrumento Tecan Spark. Los cultivos se agitaron cada 30 minutos y se midió la DO a 600 nm. Los medios RCM se obtuvieron de BD (n.° de catálogo de BD/Difco 218081). El medio PY es un medio personalizado, que solo consiste en extracto de levadura al 2 % (número de catálogo de Sigma Y1625-250G) y peptona al 3 % (Sigma 70172-500G). Este medio no contiene glucosa y, de ese modo, refleja con mayor precisión el entorno de bajo contenido en glucosa encontrado porP. acnesen las glándulas sebáceas que los medios ricos con un alto contenido de glucosa como RCM o BHI.

La figura 4 muestra la cantidad relativa de la cepa C3 en una mezcla el día 5 o el día 6 después de la inoculación. Cuando hay un alto porcentaje de C3 en la mezcla de partida, C3 se mantiene como la cepa dominante. Sorprendentemente, una concentración inicial más baja de C3 reduce el porcentaje global en la fase estacionaria tardía.

La figura 5 muestra una curva de crecimiento de las cepas C3, F4, C1 y K8 en medios RCM a 37 °C.

La figura 6 muestra una curva de crecimiento de las cepas C3, F4, C1, K8, una mezcla de 2 cepas (cepas C3 y K8) y una mezcla de 4 cepas (A5, C3, F4 y K8) en medios de PY libres de glucosa a 37 °C.

Ejemplo 3: Experimentos de competición con combinaciones de cepas

Se realizó un experimentoin vitropara determinar el efecto sinérgico de varias mezclas bacterianas. Los cultivos de bacterias frescas se reactivaron a partir de disoluciones madre a -80 °C y se cultivaron en placas de agar de RCM. A partir de las placas de agar, se inoculó un medio líquido de BHI y se cultivó durante 5 días hasta la fase estacionaria. Luego, los cultivos se recogieron por centrifugación (4000 g durante 10 min a 4 °C) y se resuspendieron en 1,4 ml de peptona al 0,1 % (peptona digerida con tripsina de la caseína). Las suspensiones bacterianas en peptona se normalizaron entonces a una DO de 0,8. Las cepas se almacenaron durante la noche a temperatura ambiente (TA) en la disolución de peptona para simular el almacenamiento antes de la aplicación. A la mañana siguiente, todas las cepas se mezclaron en concentraciones equimolares y esta mezcla se diluyó adicionalmente 1,6 veces con la disolución de peptona. Por consiguiente, cada cepa estaba en una dilución 1:10 en la mezcla en comparación con la disolución madre. Luego se generó una placa maestra de 96 pocillos que contenía diferentes combinaciones (tabla 3). Tabla 3: Cepas

Esto dio lugar a las siguientes concentraciones (tabla 4):

Tabla 4: Concentraciones

Los 10 |il de cada mezcla se añadieron en el medio de una placa de agar de 96 pocillos y se incubaron durante 4 días. El medio usado fue RCM-agar complementado con 0,5 mg/ml de ácido linoleico.

La placa se cultivó de acuerdo con el siguiente protocolo: A cada pocillo, se le añadieron 10 |il de PBS estéril. Después de un corto tiempo de incubación, las bacterias en cada pocillo se resuspendieron individualmente y se transfirieron a una placa nueva. Las células se sedimentaron entonces por centrifugación y se lavaron dos veces con agua MilliQ. Luego, los sedimentos se resuspendieron en 90 |il de NaOH 0,05 M recién preparado (100 |il de NaOH al 30 % en 20 ml de agua MilliQ). Las placas se incubaron luego en una máquina de PCR a 60 °C durante 45 min. Luego, la reacción se neutralizó añadiendo 9,2 |il de Tris pH 7 y se usaron 5 |il del sobrenadante como molde en una reacción de PCR de 20 |il. Se realizó una PCR para amplificar el alelo SLST con el fin de caracterizar la población. Las secuencias de cebador usadas fueron:

SLST FW: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCAGCGGCGCTGC TAAG AACTT (SEQ ID NO: 81) y

SLST-RV: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCGGCTGGCAAATGAGGCAT (SEQ ID NO: 82) (Scholzet al.,2014).

Las muestras se amplificaron utilizando una polimerasa Kappa (5 min 95 °C; 35 ciclos de: (98 °C 20 s, 62 °C 25 s, 72 °C 30 s); 1 min 72 °C). La genoteca de secuenciación se construyó utilizando dos rondas de PCR. La primera ronda usó cebadores de SLST que incluían secuencias compatibles con la secuenciación de Illumina. La segunda ronda (10 ciclos) se usó para codificar con códigos de barras las diferentes muestras para secuenciar en una única celda de flujo de Illumina. Las reacciones de PCR y las extracciones de ADN de 3-S-Biokit se purificaron utilizando perlas magnéticas que se prepararon de acuerdo con (Rohland y Reich, 2012). Las reacciones indexadas se agruparon y se purificaron a partir de un gel de agarosa usando el gel promega WIZARD® SV y el sistema de limpieza por PCR. Se controló la calidad de las genotecas finales en un instrumento Agilent TapeStation y se cuantificaron mediante qPCR utilizando el kit de cuantificación de genotecas KAPA KK4854 en un instrumento Roche LightCycler 480. La secuenciación de Illumina MiSeq se realizó utilizando un kit de reactivo MiSeq v3 con lecturas de 2*300 pb (MS-102-3003). ;;Las muestras se analizaron usando un proceso informático desarrollado internamente (S-genotipificación). Filtrado de calidad; las muestras se mapearon en una base de datos interna usando el software bwa; el procesamiento y la visualización de datos se realizó con el lenguaje estadístico R. La última genoteca de los tipos SLST deP. acnesse descargó de medbac.dk/slst/pacnes. ;;Este experimento mostró que el comportamiento de crecimiento de las cepas individuales difiere de su comportamiento de crecimiento como mezclas. Se esperaba que las cepas que crecieran rápidamente de forma aislada como A5 se hicieran cargo del cultivo. Sorprendentemente, una cepa de crecimiento lento (K8) que se hubiera esperado que contribuyera solo con una cantidad menor a la mezcla final fue el principal contribuyente a la biomasa final si se cultivaba en presencia de otras cepas. La figura 7 muestra el cambio en la composición relativa de una mezcla de diferentes cepas deP. acnesdeterminada por lecturas de secuenciación antes y después de 5 días de crecimiento en agar de RCM. Sorprendentemente, la cepa K8, que creció muy lentamente cuando se usó como aislado se hizo cargo de la mayor parte del cultivo en los 5 días del experimento. Antes del experimento, todas las cepas se normalizaron de acuerdo con su DO para representar el 16 % de la biomasa en el cultivo de partida. Después del experimento, K8 fue la cepa más dominante con el 69 %. Solo E3 también fue capaz de aumentar su participación en la biomasa. La porción de C3 se redujo al 8 %, mientras que A5, C1 y F4 se redujeron a menos del 1 %. ;;Ejemplo 4: Determinación de la concentración bactericida mínima (MBC) y de la concentración inhibidora mínima (MIC) para cepas aisladas y mezclas de cepas con DMDM hidantoína y ácido benzoico, conservantes comunes que se encuentran en productos cosméticos;;Se realizaron experimentos para simular la aplicación de un producto cosmético que contiene conservantes en la piel de un sujeto humano y para evaluar el efecto de esos conservantes en el microbioma de la piel del sujeto. Se investigó si existe alguna diferencia entre el efecto del conservante en una sola cepa o en una mezcla de múltiples cepas. ;Cuatro cepas individuales deP. acnesse cultivaron en cultivos separados como inóculo. Posteriormente, cada cultivo se normalizó de acuerdo con su DO y se expuso a DMDM hidantoína o ácido benzoico, que son dos conservantes comúnmente usados en cosmética. Cada cepa se sometió a prueba sola y en combinación con otras cepas. Las cepas individuales y las combinaciones de cepas se expusieron durante 24 h al conservante y posteriormente se colocaron en placas de agar para determinar la concentración bactericida mínima (MBC) y la concentración inhibidora mínima (MIC) del conservante. ;;Las cepas A5, C3, F4 y K8 se cultivaron a partir de disoluciones madre a -80 °C en medio clostridial reforzado (RCM) (Becton-Dickinson, número de catálogo 218081, Franklin Lakes, NJ). Para cada cepa, se inocularon 50 ml de RCM con 0,5 ml de una disolución madre de DO 1,0. La DO se midió a intervalos regulares mientras que las bacterias se incubaron a 37 °C. Para la prueba de MIC, las bacterias se recogieron en fase exponencial y se normalizaron como se describe a continuación. Para la prueba de MBC, las bacterias se cultivaron hasta alcanzar la fase estacionaria y se incubaron a 37 °C durante otras 24 h antes de procesarse para el experimento. Las muestras se normalizaron entonces a una DO de 0,5, usando medios RCM como diluyente. ;;Se prepararon disoluciones de trabajo de DMDM hidantoína (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, número de catálogo PHR1358-1ML) y ácido benzoico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, número de catálogo 242381-25G) en medios RCM, con concentraciones de prueba del 1 %, 0,25 %, 0,125 % y 0,1 % para DMDM hidantoína, y del 2,5 %, 0,63 %, 0,31 y 0,25 %, como control en blanco que consiste solo en RCM. Estas concentraciones representan diluciones correspondientes a cantidades comúnmente utilizadas en cosmética. La DMDM hidantoína está limitada por la UE a concentraciones de hasta un 1 % en cosméticos y el ácido benzoico está limitado por la FDA en “productos que se eliminan por aclarado” a un 2,5 % y en “productos que no requieren aclarado” a un 0,5 %. La exposición se realizó en placas de 96 pocillos y cada condición se sometió a prueba por triplicado. Para cada muestra, se inocularon 200 |il de medio que contiene el conservante con 20 |il de disolución bacteriana normalizada. ;;Las cepas se añadieron o bien individualmente al medio de prueba o bien como una mezcla. Para cada cepa, se usó el mismo recuento bacteriano global (determinado por la medición de DO) cuando la cepa se añadió individualmente o cuando la cepa se añadió como un componente de una mezcla. Las mezclas consistieron en 2 cepas o 4 cepas. La mezcla de dos cepas incluyó las cepas C3 y K8, representando cada cepa aproximadamente el 50 % de la masa bacteriana. La mezcla de cuatro cepas incluyó las cepas A5 (~35 %), C3 (~55 %), F4 (~10 %) y K8 (~5 %). Tanto la prueba de MBC como la de MIC se configuraron en una placa de 96 pocillos. Para evitar un efecto de placa, los pocillo más externos se llenaron con agua. Para la prueba de MIC, las bacterias se cultivaron en presencia del conservante durante 5 días en cultivo líquido en condiciones anaerobias antes de analizarse (tabla 5). ;;Para la prueba de MBC, las bacterias se expusieron al conservante en el medio RCM durante 24 h en un ambiente anaerobio a 37 °C. Después de 24 h, se transfirieron 10 |il de cada pocillo de prueba a una placa de agar (placa de 96 pocillos) que tenía cada pocillo lleno con 200 |il de agar de RCM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, número de catálogo 91365-500 g) y se incubó durante cuatro días a 37 °C en ausencia de oxígeno. Después de 4 días, cada placa se analizó para observar el crecimiento visible de las colonias para determinar la MBC (tabla 6). ;;Tabla 5: Concentraciones MIC de diferentes conservantes en medio RCM líquido. ;;; ;;; Tabla 6: MBC después de 24 horas de exposición a DMDM hidantoína y ácido benzoico ;;; ; ;; Resultados;La pruebain vitrosimuló dos escenarios. La prueba de MIC representó un escenario en el queP. acnescontamina un producto cosmético clásico. La prueba de MBC simuló un escenario en el que las bacterias que viven en la piel están expuestas a un conservante de cosméticos de aplicación tópica. ;Como se esperaba, en la prueba de MIC, ambos conservantes inhibieron de manera eficiente el crecimiento cuando estaban presentes en los medios líquidos de crecimiento. Incluso a concentraciones significativamente más bajas que las usadas comúnmente en cosméticos, no se detectó crecimiento de las cepas o mezclas individuales deP. acnes.En la prueba de MBC, los resultados fueron sorprendentemente diferentes de la prueba de MIC. El ácido benzoico, un conservante común, afectó al crecimiento de todas las cepas en concentraciones superiores al 0,31 % vol/vol. Sin embargo, se observaron diferencias entre las diferentes cepas. Las cepas A5 y C3 sobrevivieron a la exposición de 24 h a ácido benzoico al 0,31 %, mientras que las cepas F4 y K8 no pudieron crecer después de esta exposición. Las mezclas de cepas crecieron solo hasta la concentración máxima de ácido benzoico al 0,31 % que fue tolerada por las cepas individuales. Los productos “que no requieren aclarado” contienen una concentración máxima del 0,5 % de ácido benzoico. Según los datos, tal concentración podría afectar solo a algunas de las cepas deP. acnes,mientras que otras sobrevivirán a tal concentración. ;Se obtuvieron resultados sorprendentes cuando se realizó la misma prueba con DMDM hidantoína. Se observó un crecimiento inesperado de la mezcla de cepas en concentraciones más altas (0,13 %) que las toleradas por cualquier cepa individual sola (0,1 %). Esto indica que una comunidad bacteriana de cepas deP. acnesestablecidas en la piel tendrá una mejor supervivencia frente a la exposición a productos que contienen conservantes como DMDM hidantoína en comparación con cepas bacterianas individuales establecidas en la piel. Esto proporciona una ventaja inesperada para las mezclas bacterianas en comparación con las cepas individuales para el establecimiento y la persistencia a largo plazo en la piel de un sujeto humano. Las combinaciones de dos cepas proporcionaron una mejor resistencia contra un agente liberador de formaldehído como DMDM hidantoína que cualquier otra cepa individual sometida a prueba. ;Ejemplo 5: Estudio clínico en pacientes con acné (ACBAC);Se realizó un estudio clínico piloto en pacientes con acné. El estudio piloto evaluó el injerto bacteriano del microbioma, así como las tendencias de seguridad y eficacia. Basándose en el estudio piloto, que incluye criterios como la seguridad, la estabilidad y la tasa de respuesta, una de las mezclas sometidas a prueba en el estudio piloto se eligió para un estudio clínico más amplio. ;Programa de estudio piloto;El estudio piloto se realizó durante 6 semanas con 14 sujetos entre 18 y 23 años. Los criterios de valoración primarios fueron las tendencias de seguridad y eficacia. Se sometieron a prueba dos formulaciones bacterianas diferentes: A2 (una mezcla de 2 cepas que comprende las cepas C3 y K8 deP. acnes) y B4 (una mezcla de 4 cepas que comprende las cepas C3, K8, a 5 y f 4 deP. acnes).De acuerdo con los datos descritos en el ejemplo 2, los sujetos que recibieron la formulación A2 mostraron una abundancia relativa mayor o igual de K8 en la piel con respecto a C3, lo que sugiere que la cepa C3 ayuda a la cepa K8 de crecimiento más lento a colonizar la piel (figura 25). ;Ambas formulaciones mostraron un excelente perfil de seguridad sin efectos adversos. Se observó una reducción significativa en las lesiones no inflamadas y una ligera tendencia en la reducción de las lesiones inflamadas. Además, se observó una disminución en el pH de la piel, que generalmente se considera como un desarrollo positivo en la piel sana. Debido a la medición ruidosa del sebómetro, todavía están investigándose los posibles cambios en la producción de sebo. El análisis de la medición de Sebutape más sofisticada aún está en curso. En algunos de los sujetos, el aumento de las cepas aplicadas fue claro y significativo (por ejemplo, un aumento de al menos un 15 % tanto el día 21 como el día 42 en comparación con el día 1). La abundancia relativa de las cepas se midió con la secuenciación de amplicones de la SLST (NGS). Estos sujetos se definieron como aceptores. Como se comenta a continuación, los sujetos aceptores mostraron efectos, por ejemplo, en las lesiones no inflamadas y el pH. Por lo tanto, los resultados del estudio piloto fueron positivos y condujeron a un estudio clínico más amplio. ;Diseño del estudio piloto;Los sujetos se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos con diferentes formulaciones bacterianas administradas a los sujetos en cada grupo. Las formulaciones bacterianas tenían doble enmascaramiento: Grupo 1: n=8 sujetos recibieron la formulación A2. Grupo 2: n=6 sujetos recibieron la formulación B4. Los sujetos se evaluaron el día 1, día 7, día 21 y el día 42. En la primera semana, entre el día 1 y el día 7, todos los sujetos recibieron tratamiento con peróxido de benzoílo (BPO) (aplicado una vez al día). En las siguientes 5 semanas, entre el día 7 y el día 42, todos los sujetos recibieron una formulación bacteriana (gel aplicado 2 veces al día). La figura 8A representa el diseño del estudio piloto. ;Los sujetos se examinaron durante 4 visitas: el día 1, el día 7, el día 21 y el día 42. La tabla 7 muestra las mediciones tomadas y documentadas durante cada visita. ;Seguridad;La seguridad de las formulaciones administradas se evaluó, por ejemplo, mediante una evaluación visual del enrojecimiento, la irritación o cualquier otro problema de la piel durante cada visita. No se observaron problemas de seguridad durante el estudio. Siete sujetos notificaron piel seca o roja durante el uso de BPO (día 1 - día 7). Sin embargo, la piel de los sujetos no se enrojeció, ni se irritó, ni se alteró durante la administración de bacterias vivas. No se observaron efectos adversos asociados con la administración de bacterias vivas. ;Tabla 7: Estudio piloto ;;; ;; Muestras de microbioma;Resolución de especies bacterianas (16S);La composición de las especies bacterianas (16S) en las muestras de microbioma se analizó en cada visita. La figura 9 muestra las razones relativas de las nueve bacterias más abundantes en el microbioma de la piel de todos los sujetos en el estudio. Se observó una disminución en la población total deP. acnesdespués de la aplicación de BPO (día 7) (figura 11A). Después de dos semanas de aplicación bacteriana (día 21), se observó un aumento significativo en la población total deP. acnes(figura 11A). Se observó una ligera disminución en la proporción total deP. acnesdespués de cinco sem anas de aplicación bacteriana (día 42). Sin desear estar limitado por ninguna teoría, esta disminución puede representar un estado equilibrado del microbioma y/o un aumento en la diversidad de la población bacteriana. La figura 11B muestra las razones relativas deP. acnescomo diagramas de caja. Estas observaciones muestran una tendencia positiva en el desarrollo de la composición del microbioma después de la administración de las formulaciones descritas en el presente documento. ;Resolución del nivel de cepas de P. acnes (SLST);Usando tipificación de secuencia de un solo locus (SLST), se determinó la composición del nivel de cepas deP. acnesde muestras de microbioma tomadas en cada visita (día 1, 7, 21 y 42). ;Las cepas encontradas comúnmente fueron dominantes en la mayoría de las muestras el día 1 (estado fundamental). Tras la administración de las formulaciones bacterianas, en la mayoría de los sujetos, se observó un cambio en la composición del microbioma de la piel hacia las cepas aplicadas. En algunos sujetos, el aumento de las cepas aplicadas fue claro y significativo (aumento de la cantidad de cepa definida en al menos un 15 % tanto en el día 21 como en el día 42 en comparación con el día 1). Estos sujetos se clasificaron como aceptores. En algunos sujetos, el aumento de las cepas aplicadas fue menos notable. Estos sujetos fueron clasificados como no aceptores. La figura 10 representa las razones relativas de los sujetos clasificados como aceptores y no aceptores. ;Globalmente, el 43 % de los sujetos se clasificaron como aceptores y el 57 % se clasificaron como no aceptores. La división por formulación, se observó el 50 % de aceptores y el 50 % de no aceptores en el grupo de formulación A2, mientras que se observó el 33 % de aceptores y el 67 % de no aceptores en el grupo de formulación B4. Debido al pequeño tamaño de ambos grupos, la diferencia entre los dos grupos no es estadísticamente significativa. ;No se observaron otros factores de confusión, como la edad, el sexo, el uso de productos antibacterianos o el patrón de ducha, que probablemente influyan significativamente en la probabilidad de ser un aceptor. ;Análisis de especies bacterianas (16S) y nivel de cepas (SLST);Al relacionar los datos de especies bacterianas (16S) con los datos de nivel de cepas (SLST) deP. acnes, seobservó que en el día 1 (estado fundamental) la abundancia relativa deP. acnesfue menor en los aceptores (34 %) en comparación con los no aceptores (41 %). Durante el estudio, la abundancia relativa promedio deP. acnesen los aceptores aumentó casi dos veces (60 %) hacia el día 42 (visita final). Las abundancias relativas se determinaron usando la secuenciación del amplicón 16S clásica. En este método, que se conoce bien en la técnica, se amplifica una parte específica de la subunidad ribosomal 16S de todo el ADN bacteriano en la muestra mediante PCR. Las diferentes especies bacterianas presentes en la muestra se identifican mediante la secuenciación del amplicón. La secuenciación de última generación permite evaluar la distribución relativa completa de todas las secuencias/especies en la muestra. ;El grupo de no aceptores presentó solo un aumento menor y no estadísticamente significativo deP. acnesdurante el estudio según se analizó mediante una prueba t (figura 11). ;Resumen de los resultados del microbioma;En un subconjunto de pacientes, las bacterias aplicadas se establecieron eficazmente después de la administración. Este subconjunto de sujetos se caracterizó por una menor proporción deP. acnesal inicio del estudio y una proporción significativamente mayor deP. acnesal final del estudio. ;Recuento de lesiones de acné;Durante la visita del día 1 (estado fundamental) y el día 42 (visita final), un dermatólogo contó el número de lesiones en la cara de los sujetos. Los recuentos de lesiones se dividieron en lesiones inflamadas y no inflamadas. ;Lesiones no inflamadas;Las lesiones no inflamadas también se conocen como comedones. Los comedones pueden estar abiertos (puntos negros) o cerrados (puntos blancos). ;Se observó una reducción sustancial de la lesión no inflamada (en un 37 %, P = 0,006) en ambas formulaciones. La reducción en la formulación A2 correspondió al 55 %, P = 0,05, y en la formulación B4 correspondió al 35 %, P = 0,06. (Figura 12). ;Comparando la reducción de lesiones no inflamadas entre aceptores y no aceptores (sujetos que cambiaron / no cambiaron su composición del microbioma de la piel), la mayor parte de la reducción de lesiones se observó dentro del grupo aceptor (figura 13). ;Después de estratificar los grupos en aceptores y no aceptores, el efecto fue estadísticamente significativo en ambos grupos, con valores p por debajo de 0,03. Los no aceptores tuvieron en general menos lesiones no inflamadas en el estado fundamental (día 1); sin embargo, debido a la menor extensión y la reducción menos pronunciada de las lesiones, el resultado fue aún muy significativo estadísticamente (figura 13) ;Lesiones inflamadas;Una lesión inflamada generalmente sigue a la ruptura de la pared de un comedón cerrado (lesión no inflamada). También puede surgir de la piel de aspecto normal. Las lesiones inflamatorias en el acné pueden incluir en algunas realizaciones pequeñas protuberancias rojas (pápulas), pústulas, grandes protuberancias rojas (nódulos) y pseudoquistes (nódulos fluctuantes). ;Se observó una reducción en el número de lesiones inflamadas después de la administración de formulaciones bacterianas. El promedio de todos los sujetos (en ambas formulaciones) fue de 19 lesiones inflamadas antes del tratamiento y 16 después, lo que corresponde a una reducción de aproximadamente el 15 % después del tratamiento. La formulación A2 produjo una reducción aproximada del 20 % (20/16), mientras que la formulación B4 produjo una reducción aproximada del 9 % (17/15,5) (figura 14). Aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa, y no se observó una diferencia significativa entre los aceptores y los no aceptores (figura 15), la falta de significación estadística probablemente se debió, al menos en parte, a la corta duración del estudio, al pequeño tamaño de la muestra y al bajo número de lesiones totales, lo que llevó a una desviación estándar alta. Sin querer limitarse a ninguna teoría, el tratamiento con bacterias vivas puede presentar un efecto más lento sobre las lesiones inflamadas en relación con las lesiones no inflamadas, ya que las lesiones no inflamadas son precursoras de las lesiones inflamadas. Según los datos observados, se espera un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción de las lesiones inflamadas en un estudio de mayor duración. ;Medición de sebo;Se usaron dos tipos de ensayos para evaluar la producción de sebo de los sujetos. La medición del sebómetro se realizó durante cada visita (día 1, 7, 21 y 42), mientras que la medición del Sebutape solo se realizó el día 1 (estado fundamental) y el día 42 (visita final) ya que el muestreo requiere mucho tiempo. Las lecturas iniciales con un sebómetro no revelaron una tendencia general. Sin embargo, el sebómetro simplemente proporciona una medición rápida pero es menos fiable que otros ensayos porque está fuertemente influido por factores externos como el lavado, la sudoración, etc. ;Medición del pH de la piel;El pH de la piel de los sujetos se midió durante cada visita (día 1, 7, 21 y 42) usando un medidor de pH. Se observó una disminución en el pH de la piel de los sujetos en 0,4 puntos entre el día 1 y el día 42. La disminución del pH se considera un desarrollo positivo hacia una piel sana. ;Al igual que en las lesiones no inflamadas, el efecto fue más pronunciado en los sujetos clasificados como aceptores y menos pronunciado en los sujetos clasificados como no aceptados (figura 16). No se observó una correlación basada en la formulación específica administrada. El efecto observado es de la misma magnitud que lo notificado por Nodakeet al.(2015). ;Autoevaluación;Los sujetos respondieron un cuestionario durante cada visita. El cuestionario relacionado con la autoevaluación de su piel y sobre el uso del producto. Se revisaron los siguientes aspectos de la piel: aspecto de los granos, número de granos, aspecto de enrojecimiento asociado con los granos, tamaño de los granos, gravedad de los granos, grasa de la piel, brillo de la piel, sequedad de la piel, descamación de la piel, suavidad de la piel y aspecto global de la piel. Usando el promedio de las preguntas mencionadas anteriormente, el 85 % de los sujetos notificaron una mejora y el 15 % de los sujetos no notificaron cambios entre el día 1 y el día 42. La mejora promedio global (el promedio de todas las preguntas entre todos los sujetos el día 1 frente al día 4) fue de 1,62 puntos (en la escala 1-10). Se observó una mayor satisfacción entre los usuarios de la formulación A2 (2,05 puntos) y entre los aceptores (1,75 puntos). ;Entre todos los sujetos, la mayor mejora se observó en “Sequedad de la piel” (en 2,21 puntos) seguida de “Aspecto general de la piel” (2,07 puntos) y “Suavidad de la piel” (2,00 puntos). ;Basándose en el análisis de cajas superior, la escala se dividió en tres cajas: Inferior = puntos 1-3, Media = puntos 4 - 7 y Superior = puntos 8-10. La figura 17 muestra una distribución de los sujetos según su valor promedio de todas las respuestas para cada visita (día 1, 7, 21 y 42). Un claro cambio hacia puntuaciones más altas es visible a lo largo del estudio. Se observó una alta tasa de aceptación del producto y una retroalimentación positiva general de los sujetos en la autoevaluación. ;La figura 18 muestra un mapa de calor de la abundancia relativa de las 15 cepas deP. acnesmás comúnmente encontradas. La figura 19 muestra datos de una comparación basada en imágenes. La figura 20 muestra datos de un resumen de evaluación del paciente. Algunos sujetos mostraron una disminución inicial en la visita 3, pero mostraron una mejora general en la visita 4. Sin desear estar limitado por ninguna teoría, la adaptación a las cepas recientemente establecidas podría contribuir a un brote temporal. Al inicio y al final del estudio se realizó un recuento de lesiones. La mayoría de los sujetos mostraron una disminución en las lesiones de acné. ;Resumen del estudio piloto;Se observó una disminución estadísticamente significativa en el número de lesiones no inflamadas. Esto fue sorprendente porque, en los tratamientos de referencia, generalmente se observa una reducción de las lesiones no inflamadas solo a largo plazo. En un metanaálisis completo que compara BPO y otros tratamientos de vanguardia (Seidler y Kimball, 2010), el grupo de placebo mostró una disminución del 6,7 % en las lesiones no inflamadas. En el estudio descrito en el presente documento, el grupo aceptor tuvo una reducción de casi el 50 %, lo que indica que pudo observarse un efecto más allá del placebo. La magnitud del efecto podría potencialmente superar a los tratamientos de vanguardia actuales en la capacidad de seleccionar como diana lesiones no inflamadas. ;Basándose en el análisis de los datos del microbioma de 16S y la correlación con la resolución del nivel de cepas de la población deP. acnes,fue evidente que los sujetos que aceptaron las cepas bacterianas aplicadas (clasificados como aceptoras) mostraron un aumento en la proporción relativa deP. acnesen comparación con todas las otras bacterias. Los no aceptores mantuvieron su razón relativa deP. acnesen todo el estudio, pero se caracterizaron por un mayor porcentaje relativo deP. acnesen la visita inicial (día 1). Sin desear estar limitados por ninguna teoría, los no aceptores pueden haber sido ya completamente colonizados porP. acnes,de tal manera que el tratamiento de desinfección que se administró antes de que se administraran las cepas bacterianas puede no haber sido suficiente para eliminar la población deP. acnesresidente, que puede haber permanecido oculta en los folículos. Por el contrario, es posible que los aceptores aún no hayan sido totalmente colonizados, lo que permite que el tratamiento de desinfección reduzca o elimine la población deP. acnesresidente antes de la administración de las cepas bacterianas. Procedimientos de desinfección modificados pueden permitir un aumento en la tasa de aceptores. ;El efecto observado para el pH de la piel fue de la misma magnitud que lo notificado por otros ensayos clínicos aleatorios de doble enmascaramiento que usan bacterias de la piel (Nodakeet al.,2015). También es alentador que no solo disminuyó el pH, sino que también disminuyó su variación a lo largo del estudio, lo que sugiere una normalización del pH de la piel de los sujetos. ;Muchos sujetos en el estudio piloto notificaron una piel más suave, que está en correlación con la disminución de las lesiones no inflamadas, según lo documentado por los dermatólogos que participaron en el estudio piloto. Además, muchos sujetos notaron una piel menos grasa, lo que podría ser un indicador de una reducción de la producción de sebo. ;Los datos muestran que la modulación del microbioma de la piel al nivel de cepas se toleró bien. La mayoría de los sujetos experimentaron una mejora general del estado de su piel. Específicamente, se notificó una disminución en la picazón, lesiones de acné menos perceptibles y un mejor aspecto global de la piel. Ninguno de los sujetos experimentó un deterioro significativo o un brote prolongado. No hubo abandonos en este estudio clínico. ;Materiales y métodos;Los materiales usados para la producción deP. acnesincluyeron: Botellas Schott de 1 l; matraces de cultivo celular Magnet; pipetas serológicas; puntas de pipeta con filtro, 1000 |il; frascos Falcon; recipientes para centrifugación de lotes grandes; placas de Petri; jeringas de 2,5 ml; adaptador para jeringas; tapones para jeringas; y tubos Eppendorf. Los productos químicos usados incluyen: NATROSOL® 250 Hx Pharm., hidroxietilcelulosa; medio Kat-Hefe; dextrosa (a-D-glucosa), anhidro 96 %, Aldrich, ref.: 158968; cloruro de sodio (NaCl); agar clostridial reforzado y peptona de la caseína, digestión tríptica. ;Preparación de medios bacterianos: Se preparó agar de RCM siguiendo las instrucciones del proveedor, incluyendo para cada litro: esterilizar en autoclave la mezcla en un programa de líquidos; añadir 200 |il de flurazilidona 100 mg/ml a cada 1 l de volumen final antes de distribuir el agar; y distribuir el agar de RCM preparado a placas de Petri y placas de 96 pocillos de fondo plano (200 |il cada pocillo). ;Se prepararon las siguientes disoluciones: ;1) Mezcla de disolución basada en medios en una botella Schott de 1 l que incluye: 20 g de proteína Kat-Hefe; 5 g de NaCl; y 900 ml de agua. ;2) 10 x mezcla de disolución de dextrosa en una botella Schott de 100 ml, que incluye: 30 g de dextrosa (a-D-glucosa) y 100 ml de agua. ;Ambas disoluciones se esterilizaron en autoclave. Después de enfriar asépticamente, se añadieron 100 ml de 10 x disolución de dextrosa a la disolución basada en medios (botella de 1 l) formando el medio final. El medio final contenía las siguientes concentraciones: 20 g/l de proteína Kat-Hefe; 5 g/l de NaCl; y 30 g/l de dextrosa. ;Se preparó una mezcla de disolución de peptona en una botella Schott de 1 l, que incluye: 2,5 g de peptona de la caseína, digestión tríptica y 1 l de agua. Esta disolución se esterilizó en autoclave en un programa de líquidos. La disolución final contenía el 0,25 % de peptona. ;Cultivo de bacterias;La preparación del precultivo bacteriano se inició a partir de una cepa pura confirmada. Cada frasco Falcon se llenó con 50 ml de medio RCM. Se descongela una jeringa que contiene la cepa deseada a temperatura ambiente y se transfieren 0,5 ml de gel al frasco Falcon correspondiente, según la cepa. Los cultivos bacterianos se cultivaron a 37 °C. ;Las etapas para crear el cultivo bacteriano se describen a continuación: ;• Se añadieron 50 ml de precultivo a 450 ml de medio Kat-Hefe en un matraz de cultivo celular estéril de 750 ml (cultivo principal). Las muestras se colocaron en la incubadora a 37 °C y se monitorizó el crecimiento mediante mediciones regulares de DO ;• Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos y se eliminó el sobrenadante. ;• Las muestras se lavaron una vez en 50 ml de peptona al 0,25 % de la caseína, digestión tríptica ;• Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos y se eliminó el sobrenadante. ;• Cada sedimento se resuspendió en 50 ml de peptona al 0,25 % de la caseína, digestión tríptica. ;• Se normalizaron las suspensiones de bacterias. ;• Se prepararon mezclas bacterianas de acuerdo con la formulación deseada. ;• Se añadió polvo de Hec estéril para preparar el gel y se dejó reposar. ;• Se llenaron jeringas ;Una cepa C3 deP. acnesy una cepa K8 deP. acnesse depositaron cada una el 19 de octubre de 2017, en DSMZ (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania. ;Ejemplo 6: Producción de P. acnes para estudio clínico a gran escala;Se produjeron muestras de cepas bacterianas que van a usarse en un ensayo clínico a gran escala, así como muestras de placebo sin bacterias, utilizando procedimientos de calidad alimentaria. Las muestras producidas incluyeron 9000 alícuotas de 1 ml de un medio de gel que contenía una combinación 1:1 de dos cepas deP. acnesen una concentración de al menos 1x107 ufc por alícuota, envasadas asépticamente en sobres de papel aluminio laminado sellado y almacenadas a -80 °C, y 5500 partes alícuotas de 1 ml del medio de gel sin bacterias, envasadas en los mismos sobres y almacenadas a -80 °C (muestras de placebo). Los métodos usados para la producción de las cepas bacterianas deP. acnesy los resultados asociados se describen en el presente documento. El trabajo se dividió en dos fases. En la parte 1, se desarrollaron y evaluaron los protocolos para el crecimiento, la recogida y el almacenamiento de las bacterias. La parte 2 consistió en la producción y el envasado de la mezcla de bacterias y las muestras de placebo. ;Materiales y métodos;Cepas, medios y condiciones de cultivo;Las cepas K8 y C3 deP. acnesse obtuvieron como cultivos diluidos en hidroxietilcelulosa (HEC) al 2,5 % en jeringas estériles de 1 ml. Las jeringas se almacenaron a -80 °C. ;Cultivos madre: Se prepararon las cepas K8 y C3 inoculando aproximadamente 0,05 ml de los cultivos de jeringa en placas de agar-infusión de cerebro y corazón (BHIA; Tritium Microbiologie, Eindhoven, Países Bajos) e incubación durante la noche a 37 °C en un recipiente anaerobio. El material bacteriano de las placas después de la incubación se diluyó y se extendió sobre placas de BHIA nuevas para obtener colonias individuales. Después de una incubación anaerobia durante la noche a 37 °C, se inoculó una sola colonia de cada cepa en caldo BHI (Tritium Microbiologie) y se incubó de manera anaerobia durante la noche a 37 °C. Los cultivos resultantes se mezclaron con una disolución estéril de glicerol al 60 % hasta una concentración final de glicerol del 15 %, se dividieron en múltiples submuestras y se almacenaron a -80 °C. Estos cultivos madre se usaron para inocular los precultivos en medio BHI usado en los experimentos de fermentación 1.1, 1.2, 1.3 y 2.1. Se produjeron cultivos madre nuevos a partir de los cultivos de jeringa antes de la ejecución del experimento 2.2. ;Los medios usados en los estudios fueron: Caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) y agar de infusión de cerebro y corazón (BHIA); medio A: dextrosa al 3 %, cloruro de sodio al 0,5 %, extracto de levadura al 2 % (Ohly Kat, Alemania), pH 6,7; medio B: medio A más peptona de soja al 1 % (AM41, Organotechnie, La Courneuve, Francia), pH 6,7; medio C: dextrosa al 3 %, cloruro de sodio al 0,5 %, extracto de levadura al 2 % (Springer 0251/0-MG-L, Biospringer, Maisons-Alfort, Francia), pH 6,7; medio D: medio C más peptona de soja al 1 %, pH 6,7; y medio E: medio D, ajustado a pH 6,3. ;Se realizaron un total de cinco experimentos de fermentación, tres en la parte 1 y dos en la parte 2, como se describe a continuación. ;Experimento 1.1: ;Se cultivaron K8 y C3 deP. acnesen matraces de 100 ml que contenían 100 ml de medio A, B, C o D. Los medios se inocularon con 10 ml de cultivos durante la noche en BHI. Los matraces se almacenaron en recipientes anaerobios incubados sin agitación durante 24 horas a 37 °C. ;Experimento 1.2: ;Se cultivaron K8 y C3 deP. acnesse cultivaron en 400 ml de medio D en recipientes de fermentador de 0,5 l de volumen, equipados con unidades para controlar la temperatura, la agitación y el pH (sistema Multifors 2, Infors, Bottmingen, Suiza). El medio se inoculó con 40 ml de cultivos durante la noche en medio D (10 % de inoculación), que se prepararon mediante la inoculación de 1 ml de cultivos durante la noche en BHI. Las condiciones de cultivo fueron: temperatura de 37 °C; velocidad de agitación de 150 rpm; pH controlado a pH 6,0 con hidróxido de sodio 2,5 N o sin control de pH; espacio vacío enjuagado con el 95 % de N2/el 5 % de CO2 (flujo de 125 ml/min). ;Experimento 1.3: ;Mismas condiciones de configuración y cultivo como se describen para el experimento 1.2, excepto que el medio se inoculó con 8 ml de cultivos durante la noche en medio D (2 % de inoculación). ;Experimento 2.1: ;Se cultivaron K8 y C3 deP. acnesen 2,0 l de medio D, en recipientes de fermentador de 3 l de volumen, equipados con unidades para controlar la temperatura, la agitación y el pH (Applikon Biotechnology, Delft, Países Bajos). El procedimiento de inoculación y las condiciones de cultivo fueron las mismas que las descritas para el experimento 1.3. Experimento 2.2: ;La configuración, el procedimiento de inoculación y las condiciones de cultivo fueron las mismas que las descritas para el experimento 2.1, excepto que el medio se ajustó a pH 6,0 (medio E; véase el párrafo 2.1.2) y la velocidad de agitación se aumentó a 250 rpm. ;Recogida;Se usó el experimento 2.2 para la producción de sobres con cepas deP. acnes.Para ambas cepas, se recogió un volumen de 2,0 l de cultivo mediante centrifugación durante 10 minutos a 16.000 x g en botellas de centrifugación de 1 l a temperatura ambiente. Los sedimentos se resuspendieron en 200 ml de disolución de peptona de soja al 0,25 % (AM41, Organotechnie, La Courneuve, Francia) y se centrifugaron una vez más. Las bacterias se resuspendieron en 200 ml de disolución de peptona de soja al 0,25 % a temperatura ambiente y se procesaron en 30 minutos. La densidad óptica a 600 nm (DO<600>) de estas suspensiones concentradas fue de 54,3 para C3 deP. acnesy de 48,4 para K8 deP. acnes. ;Medio de gel con P. acnes y medio de gel de placebo;Se diluyeron volúmenes de 19 ml y 21 ml de suspensión concentrada de C3 y K8 deP. acnes,respectivamente, en una disolución de peptona de soja al 0,25 % hasta un volumen final de 2,0 l. La DO<600>de esta suspensión fue de 1,1 y la razón entre las cepas 1:1 en base a DO<600>. Se disolvió HEC esterilizada en esta suspensión hasta una concentración final del 1,5 % (p/v) con mezclado vigoroso. Esto se repitió nueve veces en total. Los lotes se mezclaron para dar un volumen total de 18 l de medio de gel con K8 y C3 deP. acnes. El medio de gel se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 h antes de comenzar el envasado en sobres de papel de aluminio. El medio de gel de placebo consistió en HEC al 1,5 % en una disolución de peptona al 0,25 % con ácido iso-valérico hasta una concentración final de 10 |il/l. Se produjo un volumen total de 10 l. El procedimiento para disolver HEC fue el mismo que el descrito para el medio de gel conP. acnes. ;Formación de bolsitas, envasado y almacenamiento;Se produjeron bolsitas que contienen medio de gel conP. acneso medio de gel de placebo en ejecuciones independientes usando una máquina de envasado de bolsitas. La máquina consistía en una bomba, una sección de formación de bolsitas y una unidad de impresión de transferencia térmica. El medio de gel se bombeó desde un recipiente a la sección de formación de bolsitas. La sección de formación de bolsitas consistía en tubos de acero inoxidable esterilizados (uno para medio de gel y otro para gas nitrógeno), alrededor de los cuales se doblaron las bolsitas, y elementos de sellado verticales y horizontales que funcionan a una temperatura de 130 °C. La unidad de impresión, ubicada antes de la sección de formación de bolsitas, se usó para etiquetar las bolsitas. Las bolsitas se produjeron a partir de láminas de 65 x 65 mm de papel de aluminio laminado, que se doblaron y se sellaron térmicamente a lo largo de tres lados (ancho del sello de aproximadamente 12 mm). Las bolsitas finales tuvieron un tamaño de 65 x 30 mm y tuvieron un volumen de aproximadamente 2 ml. La máquina funcionó a una velocidad de producción de 28 bolsitas por minuto y una cantidad de medio de gel de 1,2 (± 0,15) gramos por bolsita; el resto del volumen de la bolsita es espacio vacío de N2. Durante el llenado, el espacio vacío de las bolsitas se enjuagó con gas nitrógeno estéril. Al inicio de la operación de llenado y después de las interrupciones, se descartaron de 10 a 20 bolsitas. Al final de la operación de llenado, se tomaron muestras de medio de gel para análisis microbiológicos (recuento viable deP. acnesy análisis de patógenos). Las bolsitas que contienen medio de gel conP. acnesse empaquetaron en bolsas de plástico (18 bolsitas por bolsa). En el transcurso de las operaciones de llenado, las bolsitas se transfirieron a un congelador a -80 °C en series de 1000 a 1500 bolsitas. Se almacenaron las bolsitas a -80 °C hasta el envío. Las bolsitas conP. acnesy las bolsitas con bolsitas de placebo se produjeron en ejecuciones independientes. ;Análisis;Medición del crecimiento y análisis microbiológicos;La masa bacteriana en los cultivos se determinó mediante la medición de DO<600>. El recuento viable deP. acnesen cultivos y medio de gel se determinó sembrando en placas diluciones en serie sobre agar BHI, incubado de manera anaerobia durante de 24 a 30 horas a 37 °C. Para confirmar la ausencia de patógenos en medio de gel conP. acnesy placebo, las muestras de medio de gel las analizó un laboratorio externo (Mérieux NutriSciences, Ede, Países Bajos) para los siguientes patógenos enumerados en la tabla 9: ;Tabla 9. ;Patógeno Método Nivel objetivoSalmonellaEquivalente a norma ISO 6579 Ausente en 25 g ;Listeria monocytogenesEquivalente a norma ISO 11290-1 Ausente en 25 gEnterobacteriaceaeNorma ISO 21528-2 < 10 ufc/g ;Clostridios reductores de sulfito Norma ISO 15213 < 10 ufc/g ;Estafilococos positivos para coagulasa Norma ISO 6888-2 < 10 ufc/g ;Citometría de flujo FACS;Los recuentos totales y la viabilidad de los cultivos se determinaron mediante citometría de flujo FACS. La viabilidad se determinó después de teñir las células con una mezcla de dos tinciones de ácido nucleico (tinte SYTO™ 9 verde fluorescente y yoduro de propidio rojo fluorescente), usando el kit de recuento y viabilidad bacteriana LIVE/DEAD™ BACLIGHT™ (n.° de cat. de ThermoFisher Scientific L34856). ;Resultados;Parte 1;El principal objetivo de la parte 1 fue evaluar y mejorar el protocolo para el crecimiento de las cepas deP. acnes.El protocolo consistió en el cultivo anóxico en matraces durante de 2 a 3 días, dando rendimientos finales de biomasa de DO<600>0,6 a 1,2. Los experimentos tenían como objetivo aumentar el rendimiento, reducir el tiempo de cultivo y usar un sistema de cultivo escalable. ;Experimento 1.1: ;El experimento 1.1 se realizó para optimizar la composición del medio con respecto al rendimiento. Se compararon dos fuentes de extracto de levadura y se determinó el efecto de la adición de peptona de soja al medio. Las bacterias se cultivaron en matraces. La tabla 10 muestra el recuento viable y la DO<600>de los cultivos. Los datos mostraron que se lograron mayores valores de DO<600>y recuentos viables con extracto de levadura Springer que con extracto de levadura Kat. Además, se detectó un efecto beneficioso de la peptona de soja sobre la DO<600>y, en menor medida, el recuento viable. Se obtuvieron mayores DO<600>y recuentos viables con la cepa K8 que con la cepa C3. Basándose en estos resultados, los experimentos posteriores se realizaron con un medio que contiene peptona y extracto de levadura Springer. ;Tabla 10. Efecto de la fuente de extracto de levadura y presencia de peptona de soja en el medio sobre los recuentos viables y DO<600>de cultivos de C3 y K8 deP. acnesdespués de 24 horas y 48 horas de incubación a 37 °C. ;Cepa Extracto dePeptona 24 h 48 h ;levadura ;DO600ufc/ml ufc/ml DO1* DO600ufc/ml ufc/ml DO11

C3 Kat No 0,32 1,8E+06 5,6E+06 0,63 2,7E+07 4,3E+07

C3 Kat Sí 0,40 1,6E+06 4,0E+06 0,79 3,9E+07 4,9E+07

C3 Springer No 0,44 1,4E+06 3,2E+06 0,98 6,9E+07 7,0E+07

C3 Springer Sí 0,72 3,7E+06 5,2E+06 1,15 6,9E+07 6,0E+07

K8 Kat No 0,16 1,9E+07 1,2E+08 0,40 3,9E+07 9,8E+07

K8 Kat Sí 0,19 1,0E+07 5,2E+07 0,80 4,5E+07 5,6E+07

K8 Springer No 0,45 2,8E+07 6,2E+07 1,58 >1,0E+08

K8 Springer Sí 0,38 3,8E+07 9,9E+07 1,97 >1,0E+08 -

1 Recuento viable normalizado para cultivos con una DO<600>de 1,0

Experimento 1.2:

El experimento 1.2 se realizó para someter a prueba las características de crecimiento de las cepas durante el cultivo en fermentadores y para determinar el efecto del cultivo a un pH constante de 6,0. Los resultados de DO<600>y las mediciones del recuento viable se muestran en las figuras 22 y 23, respectivamente. Los cultivos con pH controlado tuvieron un DO<600>y recuento viable sustancialmente mayores que los cultivos sin control de pH. Los recuentos viables de cultivos sin control de pH fueron aproximadamente 25 veces más bajos después de 21 h de incubación que después de 4 h de incubación. Este hallazgo indica que, en esta realización, las bacterias murieron, probablemente debido al bajo pH de los cultivos sin control de pH (pH 5,25). Los resultados representados en la figura 22 también mostraron que el valor máximo de DO<600>se alcanzó en 21 h de cultivo. El registro de la titulación de la base durante el cultivo de los fermentadores con pH controlado (no mostrado) indicó que la fase estacionaria se alcanzó ya aproximadamente 14 h después de la inoculación. En contraste con los resultados del experimento 1.1, se obtuvieron mayores DO<600>y recuentos viables para la cepa C3 que para la cepa K8. Basándose en estos resultados, las fermentaciones posteriores se realizaron con un control de pH establecido a pH 6,0.

La estabilidad de C3 y K8 deP. acnesen medio de gel durante el almacenamiento de bacterias a -80 °C se sometió a prueba midiendo el recuento viable antes del almacenamiento y después de 3 sem anas de almacenamiento. Las bacterias se recogieron y se suspendieron en medio de gel (HEC al 2,5 %). El cultivo de pH controlado de K8 y los cultivos de C3 y K8 sin control de pH no mostraron ninguna o poca reducción del recuento viable durante el periodo de almacenamiento. En contraste, el recuento viable del cultivo de pH controlado de C3 disminuyó en aproximadamente un 60 % (tabla 11).

Tabla 11. Efecto de 3 semanas de almacenamiento a -80 °C sobre el recuento viable (ufc/ml) de la cepa C3 y K8 deP. acnescultivadas con o sin control de pH y suspendidas en un medio de gel de HEC al 2,5 %

Cultivo Antes del almacenamiento Después de 3 semanas de almacenamiento

C3 sin control de pH 5,2E+05 6,2E+05

K8 sin control de pH 5,0E+05 6,4E+05

C3 con control de pH 4,7E+07 1,8E+06

K8 con control de pH 4,7E+07 1,9E+07

Experimento 1.3:

El experimento 1.3 se realizó para confirmar las observaciones del experimento 1.2 y para someter a prueba si el nivel de inoculación podría reducirse del 10 % al 2 %. La DO<600>durante el cultivo se muestra en la figura 24. De acuerdo con los resultados del experimento 1.2, se observó una mayor DO<600>para la cepa C3 que para la cepa K8. Los resultados también sugieren que la cepa C3 crece ligeramente más rápido que la cepa<k>8. Además, los resultados confirmaron que era posible reducir el nivel de inoculación al 2 %. Las mediciones de DO<600>indicaron que la fase estacionaria se alcanzó aproximadamente 14 h y 18 h después de la inoculación para la cepa C3 y K8, respectivamente.

Parte 2

Producción de bolsitas de placebo

Se produjeron aproximadamente 6000 bolsitas que contienen medio de gel de placebo. La cantidad promedio por bolsita fue de 1,25 g (intervalo de 1,10 a 1,40 g). El análisis microbiológico demostró que el material estaba libre deSalmonella, Listeria monocytogenes, Enterobacteriaceae,clostridios reductores de sulfito y estafilococos positivos para coagulasa (tabla 12).

Tabla 12. Resultados del análisis de patógenos en muestras de medio de gel conP. acnesy medio de gel de placebo

Patógeno Gel conP. acnesGel de placeboSalmonellaAusente en 25 g Ausente en 25 g

Listeria monocytogenesAusente en 25 g Ausente en 25 gEnterobacteriaceae< 10 ufc/g < 10 ufc/g

Clostridios reductores de sulfatos < 10 ufc/g < 10 ufc/g

Estafilocosos positivos para coagulasa < 10 ufc/g < 10 ufc/g

Producción de bolsitas con P. acnes

Se cultivaron las cepas C3 y K8. El periodo de fermentación fue de 14 h. De acuerdo con el experimento 1.2 y 1.3, se observó una DO<600>y un recuento viable ligeramente mayores para la cepa C3 que para la cepa K8. Basándose en los valores de DO<600>, los cultivos concentrados de la cepa C3 y K8 se mezclaron en una razón de 47:53, para dar una razón final de 1:1 en la mezcla a la que se añadió h Ec al 1,5 % y se empaquetó en bolsitas. La tabla 13 resume los resultados. Imágenes microscópicas de las bacterias (figura 24) mostraron la morfología típica deP. acnes.Además de la medición del recuento viable, la concentración de bacterias también se determinó mediante citometría de flujo FACS (tabla 4). Este método puede discriminar entre células vivas, dañadas y muertas por medio de dos colorantes de ADN diferentes. Los resultados para el recuento viable y las células vivas por FACS fueron similares para ambas cepas. El porcentaje de células muertas por FACS (porcentaje del total) en los cultivos de la cepa C3 y K8 fue del 18% y el 40 %. Inesperadamente, el porcentaje de células muertas por FACS en las suspensiones de células concentradas fue menor que en los cultivos: el 8 % y el 16 % para C3 y K8, respectivamente.

Tabla 13. DO<600>, recuento viable y recuento por citometría de flujo de FACS de cultivos de la cepa C3 y la cepa K8 deP. acnesantes de la recogida, después de la concentración de las bacterias en disolución de peptona al 0,25 %, después de la dilución y mezcla de las cepas, y en medio de gel de bolsitas (experimento 2.2)

Muestra DO600Recuento viable FACS (eventos/ml)

(ufc/ml) Vivas Dañadas Muertas TotalCultivo C3 4,9 5,4E+08 4,6E+08 3,3E+07 1,1E+08 6,1E+08 Cultivo K8 3,8 4,5E+08 2,5E+08 3,3E+07 2,0E+08 4,9E+08 Concentrado C3 54,3 5,3E+09 6,3E+09 1,0E+08 5,5E+08 7,0E+09 Concentrado K8 48,4 5,6E+09 4,6E+09 3,5E+08 9,5E+08 5,9E+09 Mezcla C3-K81 1,1 - - - - -Bolsitas n.° 10002 - 3,8E+07 - - - -Bolsitas n.° 35002 - 3,8E+07 - - - -Bolsitas n.° 60002 - 4,3E+07 - - - -Bolsitas n.° 85002 - 4,3E+07 - - - -Bolsitas, después de 1 - 2,9E+07 - - - -semana a -80 °C3

1 Antes de la adición de HEC

2 Medio de gel de 3 bolsitas, muestreado después de la producción de 1000, 3500, 6000 y 8500 bolsitas 3 Medio de gel de 4 bolsitas

Se produjo un total de aproximadamente 10.000 bolsitas, de las cuales 9000 se empaquetaron en bolsas de plástico (18 bolsitas por bolsa). La cantidad de medio de gel por bolsita se ajustó a 1,2 g por bolsita. Esta cantidad permitió la retirada de al menos 1 ml de las bolsitas al abrir y apretar regularmente. La cantidad de medio de gel por bolsitas se midió cada de 500 a 1000 bolsitas (seis repeticiones en cada punto de tiempo). La cantidad por bolsita varió de 1,17 g a 1,38 g, con un promedio de 1,28 g. El tiempo total de ejecución de la producción de bolsitas fue de 7 h. El recuento viable de medio de gel en bolsitas se determinó cuatro veces en el transcurso de la ejecución de producción y varió entre 3,8x107 y 4,3x107 ufc/ml, con un promedio de 4,0 x 107 ufc/ml (tabla 13). Basándose en estos resultados, el recuento promedio viable por bolsita antes del almacenamiento a -80 °C fue de 5,1x107 ufc. El recuento viable del medio de gel en bolsitas después de 7 días de almacenamiento a -80 °C fue de 2,9 x 107 ufc/ml (tabla 4), que corresponde a 3,7 x 107 ufc por bolsita. El análisis microbiológico demostró que el medio de gel con la mezcla de bacterias deP. acnesestaba libre deSalmonella, Listeria monocytogenes, Enterobacteriaceae,clostridios reductores de sulfito y estafilococos positivos para coagulasa (tabla 12). La tabla 14 muestra las especificaciones del papel de aluminio laminado usado para la producción de bolsitas.

Tabla 14. Especificaciones del papel de aluminio laminado usado para la producción de bolsitas

Número de artículo Rev. - Válido a partir de: 08-04-2014 Descripción del artículo DAKLAFILM ALU 12/7/15/100 Especificación n.° 01

Características

Propiedad Valor Unidad Tolerancia Método

Grosor total 141,5 ^m /- 8 % DIN 53370

Peso del material 153,74 g/m2 /- 8 % DIN EN ISO 2286-2 Resistencia del se o an es es > 70,0 N/15 mm Mín. DIN 55529

Resistencia de laminación PET/ > 3,0 N/15 mm Mín. DIN 53357 ASTM D-904-98 Resistencia de laminación ALU/ > 3,5 N/15 mm Mín. DIN 53357 ASTM D-904-98 Resistencia de laminación NY/L > 3,5 N/15 mm Mín. DIN 53357 ASTM D-904-98 Transmisión de oxígeno<0 , 0>cm3/m2 x d x bar Máx. DIN 53390 ASTM D-3985-81 Transmisión de vapor de agua<0 , 0>g/m2 x d Máx. ISO 15106 ASTM F-1249 Disolvente residual 8,0 mg/m2 Máx. DIN 13628-2

Campo de aplicación________________________________________________________________________________Para alimento; no alimento

Certificados de productos alimenticios________________________________________________________________Debe mencionarse la confirmación en un Certificado de Prueba de acuerdo con la norma EN 10204.

Todos los materiales deben mencionarse en las regulaciones EG 2002/72/EG y enmiendas, así como en BfR y FDA.

Resumen

La composición del medio para el cultivo de C3 y K8 deP. acnesse modificó usando una fuente alternativa de extracto de levadura e inclusión de peptona. Las cepas deP. acnesse cultivaron en fermentadores de pH controlado en 14 h hasta rendimientos de biomasa finales de DO<600>de 4,0 a 5,0, correspondientes a aproximadamente 5 x 108 ufc/ml. Se produjo un total de más de 9000 bolsitas que contienen 5,1 x 107 ufc/bolsita de una mezcla 1:1 de cepas C3 y K8 deP. acnesy se almacenaron a -80 °C.

Las modificaciones del procedimiento de cultivo (fuente alternativa de extracto de levadura, inclusión de peptona en el medio y cultivo en fermentadores de pH controlado) dieron como resultado un rendimiento de 5 a 10 veces mayor de C3 y K8 deP. acnes.

La razón entre el recuento viable y la DO<600>fue bastante constante en todos los experimentos: de 5 x 107 a 1 x 108 ufc/ml para cultivos o suspensiones con DO<600>1,0. Esta concentración celular es baja en comparación con cultivos de muchas otras bacterias, por ejemplo especies deLactobacillus,especies deLactococcusyEscherichia coli.Esto sugiere que las células deP. acnesson más grandes que las células de estas especies.

La concentración deP. acnesen bolsitas almacenadas durante 1 semana a -80 °C fue solo ligeramente más baja que la concentración antes de la congelación (4,0 x 107 y 2,9 x 107 ufc/ml respectivamente) (tabla 4), lo que indica que las bacterias sobrevivieron bien al evento de congelación.

Ejemplo 7: Estudio clínico a gran escala

Basándose en el análisis del estudio piloto, se incorporaron los siguientes aspectos a un estudio clínico a gran escala: se seleccionó la formulación A2 para la prueba; se asignaron 23 sujetos al grupo activo y 23 al grupo de placebo; se incluye el análisis del nivel de cepas de algunas especies en el microbioma; y se incluye un protocolo de desinfección optimizado para aumentar la tasa de aceptores. Los pacientes con acné se seleccionaron, al menos en parte, en función de los que tuvieron mayores recuentos de lesiones y mayor grado de acné, y si eran sujetos con acné puro adolescente (excluyendo el acné hormonal, el acné adulto, etc.).

Los sujetos son individuos con acné vulgar facial de grado 1 , 5-4 (escala de Leeds). Los sujetos incluyen hombres y mujeres, de 16 a 23 años de edad.

El día 1, todos los sujetos recibieron un producto de peróxido de benzoílo (gel Akneroxid 50 mg/g, Almirall) para aplicar una vez al día en la cara durante 7 días (día 1 - 7). El día<8>, los sujetos reciben el producto de prueba (o bien producto bacteriano o bien placebo). Los sujetos aplican el producto de prueba en la cara dos veces al día (mañana y tarde) después de lavarse la cara. Los sujetos siguen aplicando el producto durante 11 semanas (día<8>- día 84). Después de esta fase, hay una fase de seguimiento de 2 semanas sin ninguna aplicación. Las mediciones y las muestras se toman el día 1, el día 7, el día 28, el día 56, el día 84, el día 91 y el día<9 8>(tabla<8>, figura<8>B). En la tabla<8>, “X” indica qué método de análisis se realiza en cada día indicado del estudio.

Tabla 8. Estudio clínico grande

Método de medición

El recuento de lesiones lo realiza visualmente un investigador capacitado. La evaluación de seguridad la evalúa el investigador o una enfermera del estudio mediante una evaluación visual del enrojecimiento, la irritación o cualquier otro problema de la piel. Se toma una imagen en cada visita. Durante el estudio de fase piloto comentado en el ejemplo 5, se usó una cámara normal, mientras que en el estudio clínico más grande, la obtención de imágenes se realiza mediante luz visible, polarizada cruzada o azul fluorescente tomada por un investigador capacitado o una enfermera del estudio para documentar el estado de la piel.

El análisis de los lípidos con un sebómetro lo realiza una enfermera del estudio. El análisis de lípidos con Sebutape proporciona más detalles sobre el contenido y la cantidad de sebo en la piel. Para la medición, la piel del sujeto se prepara desengrasando el área de prueba con un hisopo impregnado de isopropanol al 70 % o un producto similar. Luego, se coloca el Sebutape durante 30 minutos sobre la piel (frente) del sujeto para tomar la medición.

El análisis de pH se realiza usando un medidor de pH de la piel. Es un método instantáneo no invasivo sin ninguna preparación de la piel.

El análisis de microbioma utilizando un hisopo estéril es un método instantáneo no invasivo en el que un hisopo se mueve sobre la piel, girando durante 30 segundos para recoger la comunidad bacteriana que vive en la superficie de la piel.

El análisis de microbioma utilizando una tira 3-S-Biokit (tecnología de superficie de la piel) permite llegar a las comunidades bacterianas en los folículos. Es un método no invasivo en el que una tira de plástico con una gota de cianoacrilato que no daña la piel se presiona suavemente sobre la piel y se deja secar durante 1 minuto. Luego se retira suavemente. En la piel reactiva, puede observarse enrojecimiento durante unos minutos después de retirar la tira. Sin embargo, no se espera una irritación más prolongada o más pronunciada.

Métodos estadísticos

Para las variables continuas, se evalúan el número, la media, la mediana, el error estándar, el mínimo y el máximo. El umbral de significación es del 5 %.

Se realiza un análisis descriptivo de los datos de inclusión. Se describen los criterios de inclusión y de no inclusión (número y porcentaje) y se enumera la desviación. También se describen los pacientes retirados (número y porcentaje) y se enumeran los motivos de la detención.

El análisis primario se lleva a cabo en la población con intención de tratar que contiene a todos los pacientes que se asignan al azar y tienen al menos una visita posterior al momento basal. Los análisis de sensibilidad se llevan a cabo en la población por protocolo que comprende todos los pacientes con datos completos y sin violaciones importantes del protocolo. Los análisis de seguridad se realizan en la población de seguridad que cubre a todos los pacientes que recibieron al menos un tratamiento con microbios (experimental o de control).

Cálculo del tamaño de la muestra: El cálculo del tamaño de la muestra se basa en el punto final de eficacia en las lesiones totales, ya que no están disponibles datos sobre el cambio esperado en la población bacteriana. En un estudio previo sobre el acné en la Clínica Universitaria de Dermatología en Magdeburgo (Thielitzet al.,2015), se compararon tres geles diferentes. Durante un periodo de tratamiento de 12 semanas, con un promedio de los tres tratamientos, se observó una reducción del recuento de lesiones totales de 40 % ± 32 % (media ± desviación estándar). Se espera un efecto similar en el grupo de tratamiento activo del estudio clínico más grande descrito en el presente documento. En el grupo control, pudo observarse un efecto residual (por medidas de ensayo asistidas y efecto placebo) de hasta aproximadamente un 15 % de reducción. En consecuencia, se incluye un tamaño de muestra de al menos 27 pacientes por grupo de estudio para detectar una diferencia en una prueba t bilateral con nivel de error de 0,05 y el 80 % de potencia. Incluyendo un 10 % adicional de sujetos para compensar los efectos de dilución de los abandonos, se incluyen 30 pacientes por grupo de tratamiento. Si no puede reclutarse a todos los 60 pacientes en una cohorte, se ejecuta un diseño adaptativo con un análisis provisional. Se ejecutará una primera cohorte y, una vez finalizada esta cohorte, se realizará un análisis del cambio de la composición del microbioma. Si ya se observa una señal clara y estadísticamente significativa de un cambio de la composición del microbioma, se evaluarán entonces los parámetros clínicos. Si los parámetros clínicos también muestran un resultado estadísticamente significativo, entonces el estudio se cerrará y se ejecutará un análisis completo. Si los resultados no son estadísticamente significativos, o si la significación estadística de los resultados no está clara, se somete a prueba entonces una segunda cohorte de pacientes.

Análisis de eficacia: La eficacia se considera en dos niveles diferentes, el cambio en la composición de las bacterias y en los parámetros clínicos (primario: recuento total de lesiones, secundario: producción de sebo).

Análisis descriptivos: Tanto para los sujetos tratados como para los no tratados, se realiza un análisis descriptivo en cada momento de la evaluación (piloto: día 1, día 7, día 21 y día 42; estudio clínico más grande: día 1, día 7, día 28, día 56, día 84 y día 112) y sobre las diferencias (día de evaluación - D0). Se proporcionan el número, la media, la mediana, el error estándar, el mínimo y el máximo.

Análisis del criterio de valoración clínico primario: Los recuentos totales de lesiones se consideran como porcentajes de la medición basal para cada paciente (o logaritmo de la misma si la distribución está sesgada). La diferencia desde el momento basal hasta la semana 12 se compara entre los dos grupos del estudio en un modelo lineal mixto para medidas repetidas, incluidas todas las visitas después del momento basal hasta la semana 12, haciendo posible la inclusión de pacientes con valores faltantes en algunas visitas sin técnicas de imputación explícitas. Los factores fijos son el grupo de tratamiento y el género y el recuento basal absoluto de las lesiones totales y la edad como covariables. Si la prueba para el efecto del tratamiento es significativa (p <0,05), entonces se realiza la prueba analógica para la diferencia en los recuentos desde el momento basal hasta la semana 16 también en el nivel 0,05. Este procedimiento jerárquico garantiza el control del nivel de error en ambas etapas. Como análisis secundario, todo el procedimiento se lleva a cabo en la población por protocolo.

Análisis de criterios de valoración clínicos secundarios: Los criterios de valoración clínicos secundarios se tratan de forma análoga al criterio de valoración clínico primario.

Análisis de la composición bacteriana: El análisis primario de la composición bacteriana comprende las abundancias relativas de las cuatro cepas bacterianas que son compuestos del tratamiento activo. El análisis se realiza de forma análoga al criterio de valoración primario, pero a un nivel de significancia ajustado por Bonferroni de 0,05/4 = 0,0125 para la evaluación paralela de cuatro cepas bacterianas.

Para análisis multivariados secundarios, las diferencias del microbioma se calculan comparando los vectores que describen el microbioma. Cada posición del vector contiene un número, que indica el número de veces que se ha detectado una cierta cepa. La distancia de correlación se usa para medir las diferencias entre diferentes microbiomas. Además, la distancia del microbioma deP. acneshacia la composición de la mezcla aplicada se calcula usando el mismo método anterior. Puede usarse una correlación simple de Spearman, pero también pueden aplicarse otros métodos estadísticos. Los análisis adicionales incluyen la comparación de la distribución de las diferentes bacterias (por ejemplo, expresada como índice de Shannon) y su estabilidad en el tiempo entre ambos grupos del estudio.Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Una composición para administración tópica a la piel que comprende dos o más cepas bacterianas dePropionibacterium acnes (P. acnes)vivas diferentes, en donde la composición comprende un cepa C3 de tipo SLST de P.acnesy una cepa K8 de tipo SLST deP. acnes.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además:

- un portador;

- un tampón;

- un espesante; preferiblemente en donde el espesante comprende hidroxietilcelulosa, almidón, goma, caolín, silicato de aluminio hidratado, sílice pirogénica, polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, monoestearato de etilenglicol o alginato de sodio; y/o

- peptona, preferiblemente en donde la peptona es peptona digerida con tripsina de la caseína.
3. La composición de la reivindicación 2, en donde la concentración del espesante es de aproximadamente el 1 %-5 %, tal como aproximadamente el 2,5 % y/o la concentración de peptona es de aproximadamente el 0,05 %-1 %, tal como aproximadamente el 0,25 %.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición incluye al menos 104 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa bacteriana deP. acnesviva, tal como aproximadamente 104-109 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa bacteriana deP. acnesviva.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la composición está en forma de un gel, crema, ungüento, loción o polvo y/o en donde la composición es parte de un sistema de dispensación de dos componentes.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además:

- una cepa A5 de tipo SLST deP. acnes;

- una cepa F4 de tipo SLST deP. acnes;y/o

- una cepa bacteriana deP. acnesadicional seleccionada del grupo que consiste en: cepas D1, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K9 y L1 de tipo SLST.
7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:

- la cepa C3 de tipo SLST deP. acnesy la cepa K8 de tipo SLST deP. acnesson las únicas cepas deP. acnesdentro de la composición;

- una cepa C3 de tipo SLST deP. acnesy una cepa K8 de tipo SLST deP. acnesestán a concentraciones aproximadamente iguales dentro de la composición;

- una cepa C3 de tipo SLST deP. acnesestá presente a una concentración más alta que las otras cepas bacterianas deP. acnesvivas;

- una cepa C3 de tipo SLST deP. acnesestá presente a una concentración más baja que una cepa K8 de tipo SLST deP. acnesdentro de la composición;

- la composición comprende un cepa C3 de tipo SLST deP. acnes,una cepa A5 de tipo SLST deP. acnes,una cepa F4 de tipo SLST deP. acnes,y un cepa K8 de tipo SLST deP. acnes,opcionalmente en donde la concentración relativa de cada cepa es de aproximadamente el 55 %, 30 %, 10 % y 5 %, respectivamente - la composición no incluye una cepa de ribotipo 6 (RT6) deP. acnesy/o una cepa de filotipo Ill deP. acnes;y/o

- la composición es estable a temperatura ambiente durante al menos tres meses.
8. Uso no terapéutico de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como cosmético en un método para mejorar el aspecto de la piel en un sujeto, preferiblemente en donde el sujeto es un sujeto humano.
9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso como medicamento.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para mantener la piel sana en un sujeto, preferiblemente en donde el sujeto es un sujeto humano.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para tratar o prevenir una afección en un sujeto seleccionada del grupo que consiste en: acné, piel grasa, hipomelanosis macular progresiva, caspa, eccema atópico, dermatitis atópica y rosácea, preferiblemente en donde el sujeto es un sujeto humano.
12. El uso de la reivindicación 8 o la composición para el uso de las reivindicaciones 10 u 11, en donde el método comprende la administración de la composición a un sujeto, preferiblemente en donde el sujeto también recibe o ha recibido previamente un tratamiento convencional para el acné, tal como tratamiento con un desinfectante o un antibiótico.
13. Un kit que comprende un recipiente que aloja dos o más bacteriasP. acnesvivas liofilizadas diferentes, en donde las bacterias vivas liofilizadas comprenden un cepa C3 de tipo SLST deP. acnesy una cepa K8 de tipo SLST deP. acnes.
14. El kit de la reivindicación 13, en donde el kit comprende además un desinfectante o antibiótico.