KR102584057B1 - 박테리아 균주의 복합 혼합물을 사용하여 피부 마이크로바이옴의 조성을 변경하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 측면은, 피부에 국소 투여하기 위한, 2종 이상의 생 박테리아 균주를 포함하는 조성물로서, 2종 이상의 생 박테리아 균주가 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)(P. 아크네스(P. acnes)) 박테리아 균주인 조성물, 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 균주의 복합 혼합물을 사용하여 피부 마이크로바이옴의 조성을 변경하기 위한 방법 및 조성물

관련 출원

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2016년 10월 19일 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/410,329(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS"), 및 2017년 7월 25일 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/536,761(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS")의 이익을 주장하며, 상기 가출원 각각의 전체 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 피부 마이크로바이옴을 변형시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

인체는 고도로 복잡하고, 풍부한 미생물 군집의 숙주이다. 이들 미생물은 일반적으로 무해하고, 음식물 소화에 협조하면서 비타민을 생산하거나, 또는 면역계를 자극시킴으로써 건강한 상태에 기여한다. 인간 미생물총은 대개 피부 상에 및 피부 심층에, 타액 및 구강 점막에, 결막에, 및 위장관에 거주한다.

인간 미생물총은 인간 건강 및 질환에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 주로 소화관에서 입증되었다. 다수의 미생물이 피부에서 콜로니를 형성하고, 상기 미생물들은 대부분 유익하거나, 또는 무해하다. 그러나, 질환 상태의 피부에서 피부 마이크로바이옴은 건강한 피부와 비교하여 상이한 특이적인 조성을 가진다. 예컨대, 보통 여드름과 같은 질환은 마이크로바이옴의 강한 변경과 연관이 있다.

본 발명의 측면은, 2종 이상의 상이한 생 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)(P. 아크네스(P. acnes)) 박테리아 균주를 포함하는, 피부에 국소 투여하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 P. 아크네스 단일 좌위 서열 타이핑(SLST: single-locus sequence typing) 타입 C3 균주 및/또는 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 상기 조성물은 펩톤을 추가로 포함하는 것인 조성물에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 A5 균주를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 F4 균주를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 펩톤의 농도는 약 0.05%-1%이다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 농도는 약 0.25%이다. 일부 실시양태에서, 펩톤은, 카세인 유래의, 트립신에 의해 분해된 펩톤이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 증점제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 증점제로는 하이드록시에틸 셀룰로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이드록시에틸 셀룰로스로는 나트로솔(NATROSOL)® 하이드록시에틸셀룰로스(HEC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증점제의 농도는 약 1%-5%이다. 일부 실시양태에서, 겔화제의 농도는 약 2.5%이다.

일부 실시양태에서, 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주의 농도는 조성물의 적어도 5%이다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주는 조성물 중에 대략 동일한 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주는 나머지 다른 생 P. 아크네스 박테리아 균주보다 더 높은 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주, P. 아크네스 SLST 타입 A5 균주, P. 아크네스 SLST 타입 F4 균주, 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 경우에 따라, 여기서, 각 균주의 상대 농도는 각각 대략 55%, 30%, 10%, 및 5%이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 10⁴ 콜로니 형성 단위/밀리리터(CFU/ml: colony-forming unit per milliliter)의 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10⁴-10⁹ 콜로니 형성 단위/밀리리터(CFU/ml)의 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 겔, 크림, 연고, 또는 로션 형태이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 D1, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K9, 및 L1 SLST 타입 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 추가의 P. 아크네스 박테리아 균주를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 피험체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간 피험체이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 피부의 외관을 개선시키고/시키거나, 건강한 피부를 유지시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 여드름, 지성 피부, 진행성 반상 멜라닌저하증, 비듬, 아토피 습진, 아토피 피부염 및 주사로 구성된 군으로부터 선택되는 병태를 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 피험체에서 피부의 외관을 개선시키고/시키거나, 건강한 피부를 유지시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 피험체에서 여드름, 지성 피부, 진행성 반상 멜라닌저하증, 비듬, 아토피 습진, 아토피 피부염 및 주사로 구성된 군으로부터 선택되는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간 피험체이다.

본 발명의 측면은 조성물이 2종 이상의 상이한 생 프로피오니박테리움 아크네스(P. 아크네스) 박테리아 균주를 포함하고, 여기서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및/또는 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 여기서, 조성물은 펩톤을 추가로 포함하는 것인, 피험체에서 피부의 외관을 개선시키고/시키거나, 건강한 피부를 유지시키기 위한 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 측면은 조성물이 2종 이상의 상이한 생 프로피오니박테리움 아크네스(P. 아크네스) 박테리아 균주를 포함하고, 여기서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및/또는 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 여기서, 조성물은 펩톤을 추가로 포함하는 것인, 피험체에서 여드름, 지성 피부, 진행성 반상 멜라닌저하증, 비듬, 아토피 습진, 아토피 피부염 및 주사로 구성된 군으로부터 선택되는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 조성물의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 A5 균주를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 F4 균주를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 농도는 약 0.05%-1%이다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 농도는 약 0.25%이다. 일부 실시양태에서, 펩톤은, 카세인 유래의, 트립신에 의해 분해된 펩톤이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 증점제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 증점제로는 하이드록시에틸 셀룰로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이드록시에틸 셀룰로스로는 나트로솔® 하이드록시에틸셀룰로스(HEC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증점제의 농도는 약 1%-5%이다. 일부 실시양태에서, 겔화제의 농도는 약 2.5%이다.

일부 실시양태에서, 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주의 농도는 조성물의 적어도 5%이다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주는 조성물 중에 대략 동일한 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주는 나머지 다른 생 P. 아크네스 박테리아 균주보다 더 높은 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주, P. 아크네스 SLST 타입 A5 균주, P. 아크네스 SLST 타입 F4 균주, 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 여기서, 각 균주의 상대 농도는 각각 대략 55%, 30%, 10%, 및 5%이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 10⁴ 콜로니 형성 단위/밀리리터(CFU/ml)의 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 10⁴-10⁹ 콜로니 형성 단위/밀리리터(CFU/ml)의 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 겔, 크림, 연고, 또는 로션 형태이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 D1, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K9, 및 L1 SLST 타입 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 추가의 P. 아크네스 박테리아 균주를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 P. 아크네스의 리보타입 6(RT6: ribotype 6) 균주를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 P. 아크네스의 파일로타입(Phylotype) III 균주를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스의 리보타입 6(RT6) 균주를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스의 파일로타입 III 균주를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 용도의 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스의 리보타입 6(RT6) 균주를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 용도의 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스의 파일로타입 III 균주를 포함하지 않는다.

본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 그러므로, 어느 한 요소 또는 요소들의 조합을 포함하는 본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 각 측면에 포함될 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명은 그의 적용에서 하기 설명에서 기술되거나, 또는 도면에서 예시되는 구성의 세부 사항 및 성분의 배열에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나, 또는 수행될 수 있다.

첨부된 도면은 일정 비율로 확대 또는 축소하여 도시된 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 다양한 도면에서 도시된 각각의 동일한 또는 거의 동일한 성분은 유사 번호로 제시된다. 명확하게 하기 위해, 모든 성분이 모든 도면에서 표지될 수는 없다. 본 도면에서,
도 1은 RCM 배지 중에서의 상이한 P. 아크네스 균주의 시스-9, 시스-12 리놀레산의 소비를 도시한 것이다.
도 2는 글루코스 무함유 배지 중에서의 상이한 균주의 86 h 진탕 인큐베이션 이후의 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체의 농도를 도시한 것이다. 농도는 OD(600 nm)에 의해 성장에 대하여 정규화된 것이다.
도 3은 다양한 균주에서의 시간 경과에 따른 이성질체 농도를 도시한 것이다.
도 4는 접종 후 5일째 또는 6일째의 혼합물 중의 C3 균주의 상대적인 양을 도시한 것이다. 출발 혼합물 중에 높은 비율(%)로 존재할 때, C3은 우위종(dominant) 균주인 상태 그대로 유지된다. 놀랍게도, 더 낮은 출발 농도로 존재할 때, C3의 전체 비율(%)은 후기 정지기에 감소된다.
도 5는 37℃에서 RCM 배지 중에서의 균주 C3, F4, C1 및 K8의 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 6은 37℃에서 글루코스 무함유 PY 배지 중에서의 균주 C3, F4, C1, K8, 2 균주 혼합물(C3 및 K8) 및 4 균주 혼합물(A5, C3, F4, 및 K8)의 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 7은 RCM 아가 상에서의 5일간의 성장 전후로 리드 서열분석으로 측정된, 균주 혼합물 내의 상이한 P. 아크네스 균주의 상대 농도 변화를 도시한 것이다. 놀랍게도, 단리물로서 사용되었을 때, 매우 느리게 성장한 균주 K8은 균주 혼합물 내에서 5일간의 성장 이후에 배양물 내에서 우위종 균주가 되었다.
도 8a는 예비 임상 연구에서 사용된 투여 스케줄을 도시한 것이다. 14명의 피험체를 상이한 2개 아암으로 나누었고, 여기서, 각 아암은 상이한 박테리아 제제를 받았다. 도 8b는 더 큰 임상 연구에 대한 투여 스케줄을 도시한 것이다.
도 9는 14명의 피험체 예비 연구에서 모든 피험체의 피부 마이크로바이옴 중에서 가장 풍부한 9종의 박테리아의 상대 비율의 평균값을 도시한 것이다.
도 10은 수용자 또는 비수용자로서 분류된 피험체의 상대 비율을 도시한 것이다.
도 11a 및 11b는 완전한 박테리아 피부 마이크로바이옴 내의 P. 아크네스의 상대적인 양을 도시한 것이다. 도 11a는 예비 연구 전 기간 동안 수용자 및 비수용자 내의 P. 아크네스 집단의 역동적 발생을 보여주는 것이다. 수용자 군에서, P. 아크네스는 초기에 박테리아 피부 마이크로바이옴 중 단지 34%만을 차지하였다. BPO 처리 후, 상기 값은 박테리아 겔 적용 후 추가로 감소한 후, 그 값은 거의 2배로 증가하였다. 42일째, P. 아크네스 집단은 60%로 안정화되었다. 비수용자 군에서 역동적 성질은 유사하였다. 비수용자 기저 상태는 수용자 군에 비하여 더 높은 수준인 40%로 시작하였고, 42일째, 상기 집단의 증가는 유의적이지 않았다. 도 11b는 데이터 점의 포괄 범위를 도시한 박스 플롯으로서 P. 아크네스의 상대 비율을 보여주는 것이다. 수용자 군에서 1일째와 42일째의 차이는 통계적으로 고도로 관련이 있는 반면(p=0.001), 수용자 군에서 42일째의 값은 1일째와 유사하다.
도 12는 박스 플롯으로서 표시된 비염증 병변의 계수를 도시한 것이다. 3쌍의 박스 플롯이 제시되어 있다: 전체; A2 제제; 및 B4 제제. 통계적 유의수준에 대한 p 값은 플롯 아래에 제시되어 있다.
도 13은 수용자 및 비수용자에 대한 비염증 병변의 개수를 도시한 것이다. 2개 군 모두, 감소는 통계적으로 유의적이다.
도 14는 박스 플롯으로서 표시된 염증 병변의 계수를 도시한 것이다. 3쌍의 박스 플롯이 제시되어 있다: 전체; A2 제제; 및 B4 제제.
도 15는 수용자 및 비수용자에 대한 염증 병변의 개수를 도시한 것이다.
도 16은 예비 연구 전 기간 동안의 수용자 및 비수용자의 피부 pH 발생을 도시한 것이다.
도 17은 피험체의 답변의 평균값에 기초한 피험체 계수의 분포를 도시한 것이다.
도 18은 가장 흔하게 발견되는 15종의 P. 아크네스 균주의 상대적인 존재도를 보여주는 열지도를 도시한 것이다. 열지도는 새로운 박테리아의 매우 우수한 확립을 보인, 수용자로서 분류된 6명의 피험체의 평균을 나타낸다. 1일째와 42일째 사이의 마이크로바이옴의 조성물의 뚜렷한 변화가 육안으로 명백하게 관찰된다.
도 19는 사진에 기초한 비교 결과를 보여주는 그래프이다. 1일째부터 28일째까지의 결과를 1일째부터 42일째까지의 결과와 비교하였다. 피험체가 개선되었다면, +1로, 피험체가 어떤 변화도 보이지 않았다면, 0으로, 및 피험체가 악화되었다면, -1로 각 사진을 등급화하였다. 1일째부터 28일째까지의 평균은 -0.17이고, 1일째부터 42일째까지의 평균은 0.29이다. 차는 p<0.05로 통계적으로 유의적이다.
도 20은 42일의 임상 연구 동안의 염증 및 비염증 병변의 개선을 입증하는, 환자 평가 요약 결과를 보여주는 것이다.
도 21은 실험 1.2에 기술된 바와 같은, P. 아크네스 K8 및 C3 균주의 pH 조절된 배양물 및 pH가 조절되지 않은 배양물("산성화")의 OD₆₀₀을 도시한 것이다. 그래프는 이중 복제 배양물로부터의 데이터를 보여주는 것이다.
도 22는 실험 1.2에 기술된 바와 같은, P. 아크네스 K8 및 C3 균주의 pH 조절된 배양물 및 pH가 조절되지 않은 배양물("산성화")의 생존가능한 계수를 도시한 것이다. 그래프는 이중 복제 배양물로부터의 데이터를 보여주는 것이다.
도 23은 실험 1.3에 기술된 바와 같은, P. 아크네스 K8 및 C3 균주의 pH 조절된 배양물("산성화")의 OD₆₀₀을 도시한 것이다.
도 24는 실험 2.2에 기술된 바와 같은, P. 아크네스 K8(좌측) 및 C3(우측) 균주 배양물의 위상차 현미경법(500x)을 도시한 것이다.
도 25는 제제 A2 및 B4 투여 이후의 상이한 P. 아크네스 균주의 상대 농도의 변화를 도시한 것이다.

본원에서는 피부 마이크로바이옴의 조절을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서는 건강한 피부, 예컨대, 여드름이 없는 피부를 유지시키는 데, 또는 여드름을 예방하는 데 사용하기 위한, 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 기술한다. 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 피부를 마이크로바이옴 질환 상태에서 건강한 마이크로바이옴 상태로 복귀시키는 데 도움을 줄 수 있다.

어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, P. 아크네스는, 천연적으로 피지에 존재하는 신호 전구체 분자(리놀레산)를, 복귀 피지 분비에서 자극되는 활성 신호전달 분자(트랜스-10, 시스-12 리놀레산)로 전환시킬 수 있는데, 이는 피부의 P. 아크네스 콜로니 형성에 중요하다. 중요하게는, 상기 신호전달 분자 생산이 여드름 발병에 관하여 현재 이해되고 있는 내용들의 상이한 측면들 간의 연결점을 제공한다.

실시예 1에 제시된 바와 같이, 놀랍게도, 상이한 P. 아크네스 균주는 상이한 수준의 리놀레산 이소머라제 활성, 또는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 최종 임계 농도를 가지는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, P. 아크네스 SLST 타입 A1 균주가 가장 많은 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체를 생산한 반면, P. 아크네스 SLST 타입 균주 C3, C1, F4, A5, K1, K2, K8 및 L1은 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체를 거의 생산하지 못한 것으로 나타났다.

또한, 놀랍게도, 일부 균주는 균주 혼합물에서 성장하였을 때, 개별적으로 성장하였을 때와는 다른 성장 패턴을 보인 것으로 나타났다. 예를 들어, P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주는 개별적으로 느리게 성장한 것으로 관찰된 반면, 균주 혼합물 내에서 성장하였을 때에는 5일간의 인큐베이션 후 우위종 균주가 되어 있었다(도 7). 따라서, 본 발명의 측면은 심지어는, 천연적으로는 느리게 성장할 수 있는 개별 균주를 함유할 때에도, 자연상에서의 것을 능가할 가능성을 지닌 유익한 성장 특성을 보이는 균주 혼합물에 관한 것이다.

본원에서는 또한 놀랍게도 균주 혼합물이 개별 균주보다 더 높은 수준의 보존제에 대하여 내성을 띨 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 측면은 피부 상에서 확립될 수 있고, 단일 P. 아크네스 균주와 비교하여, 특정 화합물, 예컨대, 보존제를 함유하는 제품에의 노출로부터 개선된 생존을 보일 수 있는 P. 아크네스 균주의 혼합물에 관한 것이다. 이러한 특징은 개별 균주와 비교하여 박테리아 혼합물에 인간 피험체의 피부 상에의 확립 및 장기 지속을 위한 예상 밖의 이점을 제공한다.

또한 놀랍게도 본원에서는 2종 이상의 생 P. 아크네스 균주로 이루어진 2종의 상이한 제제를 사용하였을 때, 생 P. 아크네스 균주 투여가 여드름을 앓는 피험체에서 비염증 병변을 현저히 감소시킬 수 있다는 것이 입증된다. 실시예 5에 기술된 예비 임상 연구에서, 85%의 피험체가 본원에 기술된 제제 투여 후 여드름과 연관된 증상이 개선되었다고 보고하였다.

본 발명은 그의 적용에서 하기 설명에서 기술되거나, 또는 도면에서 예시되는 구성의 세부 사항 및 성분의 배열에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나, 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명을 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 "포함하는(including)," "포함하는(comprising)," 또는 "가지는," "함유하는," "포함하는(involving)" 및 그의 파생어 사용은 그 다음에 열거되는 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라, 추가 항목을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 측면은 마이크로바이옴에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바, "마이크로바이옴"이란, 체내 서식하는 모든 미생물을 지칭한다. 인간 마이크로바이옴은 인간 건강 및 질환에서 핵심적인 역할을 한다(문헌 [Consortium, 2012]; [NIH HMP Working Group et al., 2009]). 차세대 서열분석(NGS: Next Generation Sequencing) 기술의 개발에 기인하여 전례 없는 깊이와 분석으로 상기 미생물 군집을 연구할 수 있게 되었다(문헌 [Human Microbiota issue, Nature 2012] 참조). 10,000개 초과의 상이한 박테리아 균주가 인체에서 콜로니를 형성하고, 박테리아가 보통 인체내 인간 세포보다 10배 더 많다. 최근 연구에서는 체내 박테리아 군집의 조성이 인체의 건강과 밀접하게 연관되어 있다고 밝혀졌다(문헌 [Belkaid and Segre, 2014]; [Consortium, 2012]; [Zhao, 2010]). 그 결과, 마이크로바이옴의 정상 상태로부터의 변이가 각종 질환과 관련되어 진다.

소화관 마이크로바이옴, 및 소화관 마이크로바이옴의 표적화된 조작 방법이 심도있게 연구되고 있다(문헌 [Dore and Blottiere, 2015]). 상기 요법의 한 예는 "대변 이식"의 도움하에 항생제 내성 박테리아인 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)로 치료하는 것이다(문헌 [van Nood et al., 2013]; [Olle, 2013]).

최근에 연구원들은 피부 마이크로바이옴을 연구하기 시작하였다(문헌 [Belkaid and Segre, 2014]; [Oh et al., 2014]). 다수의 미생물이 피부에서 콜로니를 형성하고, 상기 미생물들은 대부분 유익하거나, 또는 무해하다(문헌 [Grice and Segre, 2011]). 그러나, 질환, 예컨대, 보통 여드름은 마이크로바이옴의 강한 변경과 연관이 있다(문헌 [Bek-Thomsen et al., 2008]; [Holmes, 2013]; [Kong et al., 2012]). 특히, 여드름은 인간 피부 마이크로바이옴의 정상 상태로부터의 변이와 연관이 있는 것으로 간주된다(문헌 [Fitz-Gibbon et al., 2013]). 이러한 정상 상태로부터의 변이는 피부 박테리아 P. 아크네스의 특정 서브세트에 의해 유발될 가능성이 있다(문헌 [Lomholt and Kilian, 2010]).

본원에서는 피부 마이크로바이옴의 정상 상태로부터의 변이로부터 기원하거나, 또는 그에 의해 영향을 받는 피부 장애에 대한 치료법을 개발하기 위해 조성물 및 방법은 피부 마이크로바이옴에 관한 지식을 적용한다.

여드름

본원에서 사용되는 바, "보통 여드름" 및 "여드름"은 상호교환적으로 사용되고, 전세계 수백만 명의 사람들에서 이환되고, 특히, 십대에서 만연한 피부 병태를 지칭한다. 여드름은 빈번하게는 피부 상의 염증성 및 비염증 병변 형성과 연관된다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 여드름은 적어도 부분적으로는 막히고/거나, 염증화되는 모낭과 연관이 있을 수 있다. 여드름은 인간 피부 마이크로바이옴의 정상 상태로부터의 변이와 연관이 있는 것으로 간주된다. 이러한 정상 상태로부터의 변이는 피부 박테리아 P. 아크네스의 특정 균주에 의해 유발될 수 있다(문헌 [Fitz-Gibbon et al., 2013]; [Holmes, 2013]; [Lomholt and Kilian, 2010]).

여드름 발생은 피지선으로부터의 피부 분비 시작과 연관이 있다(문헌 [Makrantonaki et al., 2011]; [Zouboulis, 2004]). 또한, P. 아크네스 집단의 밀도는 피지 생산량과 직접적인 연관이 있다(문헌 [Kearney et al., 1984]; [King et al., 1982]; [Mourelatos et al., 2007]). 그러나, 지금까지 P. 아크네스의 존재와 여드름 질환 사이의 명확한 분자적 연관성은 확립되지 못했다. 이는 적어도 부분적으로는 대부분의 성인 피부에서 P. 아크네스가 콜로니를 형성하지만, 여드름 증상이 다수의 상기 성인들에서는 발생하지 않는다는 사실 때문이다. 여드름이 발생하기 위해서는 피지의 부피 및 조성 변경을 동반하는, 염증성 반응이 유발되어야 한다(문헌 [Pappas et al., 2009]).

현재, 여드름을 위한 표준 치료법은 장기간의 항생제 치료법, 예컨대, 마크롤라이드(Macrolide) 및/또는 테트라사이클린(Tetracycline) 항생제를 이용한 치료법, 또는 이소트레티노인(Isotretinoin)의 전신 사용이다(문헌 [Berson et al., 2003]). 이들 치료법은 강력한 부작용 및 높은 재발률을 보인다. 예를 들어, 이소트레티노인은 피부 자극을 유발하고, 이는 또한 (선천성 결함을 유발하는) 최기형성 효과를 나타낸다(문헌 [McLane, 2001]). 추가로, 이소트레티노인의 경우, 재발률은 40% 초과로 이 또한 바람직하지 못하다(문헌 [Azoulay et al., 2007]). 이소트레티노인은 피지 생산 부피를 감소시켜 피부 상의 박테리아 밀도를 간접적으로 감소시키는 것으로 나타났다(문헌 [King et al., 1982]). 항생제가 일반적인 치료법이지만, 지난 수십년 동안 하나 이상의 항생제에 대해 내성을 띠는 다수의 박테리아 균주가 급증하였다(문헌 [Leyden, 2001]; [Ross et al., 2001]).

여드름 치료법의 또 다른 그룹은 처방전 없이 살 수 있는(OTC: over-the-counter) 제품 및 화장품을 포함한다. 일반적으로 사용되는 OTC 제품은 벤조일 퍼옥시드(예컨대, Galderma S.A.(스위스 로잔 소재)의 Benzaknen 및 Dr. August Wolff GmbH & Co. KG Arzneimittel(독일 빌레펠트 소재)의 Aknefug) 및 살리실산을 포함하는 광범위한 소독제이다. 추가로, 제한된 효능을 보이거나, 또는 효능이 입증되지 않는 천연 제품 라인이 다수 존재한다.

마이크로바이옴의 정상 상태로부터의 변이와 연관이 있는, 예컨대, 여드름과 같은 피부 장애에 대한 현행 요법은 효과가 없거나, 또는 중증의 부작용을 동반한다(문헌 [McLane, 2001]; [Tripathi et al., 2013]). 일반적으로, 여드름을 앓는 피험체의 피부는 예컨대, 항생제 또는 호르몬을 이용하는 전형적 치료 동안 개선된다. 그러나, 대부분의 사례에서는 치료 종료 후 피험체에서 재발이 일어난다. 이소트레티노인의 재발률은 약 41%이다(문헌 [Azoulay et al., 2007]). 그러므로, 피험체는 유익한 효과를 유지하기 위해서는 장기간 치료하여야 한다. 이러한 극심한 재발률은 요법 중단 후 마이크로바이옴이 피부에서 콜로니를 재형성한다는 것으로 설명될 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법은 주목할 만한 부작용 없이, 그리고, 재발을 예방하면서, 여드름을 치료할 수 있는 효과적인 치료법에 대한 충족되지 못한 요구를 다룬다. 본원에 기술된 신규한 접근법은 건강한 마이크로바이옴의 이식을 포함할 수 있다. 놀랍게도, 여드름을 유발하는 데 관여하는 것으로 간주되는 동일한 박테리아 종인 P. 아크네스 균주가 여드름을 치료 또는 예방하는 데, 또는 피부를 여드름이 없는 상태로 유지시키는 데 사용될 수 있다. 본원에서는 주목할 만한 부작용을 유발하지 않으면서, 개선된 피부 상태를 제공할 수 있는, 2종 이상의 생 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 기술한다. 본원에 기술된 조성물 내의 생 박테리아 균주는 P. 아크네스 박테리아 균주이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 화장품이다. 본원에서 사용되는 바, "화장품"이란, 외관을 개선시키는 것으로 의도되는 제품을 지칭한다. 본원에 기술된 하나 이상의 생 박테리아 균주를 포함하는 조성물 또한 "약용 화장품"로서 지칭될 수 있다(문헌 [Draelos, 2009]).

본 발명의 측면은 피험체의 피부에 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 단독으로, 다른 요법과 함께 조합하여, 또는 또 다른 요법 이후에 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 측면에서, 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 피부를 마이크로바이옴 질환 상태에서 건강한마이크로바이옴 상태로 복귀시키는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 피험체의 피부는 이미 예컨대, 항생제, 소독제, 또는 호르몬을 이용하는 표준 여드름 요법으로 치료를 받은 피부이다. 본원에 기술된 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은, 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물이 항생제 치료법 이후의 여드름의 재발율을 감소시킬 수 있는 바, 그를 통해 여드름의 표준 치료법에 대한 보충적 회복 방법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 항생제 또는 소독제 처리 후, 피험체의 피부에서 그의 천연 박테리아 대다수가 제거되었을 때 적용될 수 있다. 조성물 중의 생 박테리아가 다양하고, 건강하며, 균형잡힌 피부 마이크로바이옴을 회복하는 데 도움을 줄 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 피부로부터 병원성 박테리아 균주를 박멸시킨 후, 생 P. 아크네스 박테리아를 피부에 첨가하여 건강한 피부 마이크로바이옴을 생성하는 것을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 개체의 피지 생산 부피를 감소 또는 증가시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 또는 모낭 또는 피지선에서 트랜스-10, 시스-12 리놀레산을 생산하여 상기 활성 화합물을 피지선 환경으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 표준 국소 적용과 연관된 문제들을 회피한다.

본원에 기술된 바와 같은 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 또한 피부 상에서 피지 생산을 증가 또는 감소시키는 박테리아 균주를 피부에 제공하여 박테리아 밀도를 간접적으로 변화시킴으로써 피부 상의 박테리아 밀도를 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 또한 피지 생산을 변경시키는 생 박테리아 균주를 피부에 투여하여 피부 상에서의 P. 아크네스의 박테리아 밀도를 간접적으로 변경시킴으로써 다른 박테리아 종 대비, 또는 미생물총의 다른 성분, 예컨대, 진균 또는 진드기 대비 선택된 박테리아 종의 비를 변형시키는 데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 건강한 피부, 예컨대, 여드름이 없는 피부를 유지시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물의 투여가 여드름 형성을 예방하는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 여드름을 치료하는 데 사용될 수 있거나, 또는 표준 여드름 치료를 받았던 피험체에서 여드름의 재발을 예방하는 데 사용될 수 있다.

2종 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 천연적으로 피부에서 콜로니를 형성하는 하나 이상의 생 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 균주는 자연적으로 발생된 것이다. 그러나, 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 자연적으로 발생된 것이 아니다. 2개 이상의 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 자연상의 개별 균주와는 다른 상이한 특성을 가진다.

프로피오니박테리움 아크네스(P. 아크네스)

P. 아크네스는 여드름 뿐만 아니라, 다른 병태, 예컨대, 만성 안검염 및 내안구염과 연관이 있는, 혐기성 그람 양성 막대형 박테리아 종이다. P. 아크네스 균주는 대부분의 사람들의 피부 상에 존재한다. 일부 P. 아크네스 균주는 병원성이지만, 나머지 다른 P. 아크네스 균주는 병원성이 아닌 것으로 보고되었다(문헌 [Fitz-Gibbon et al., 2013]; [Lomholt et al., 2010]). 본원에서 사용되는 바, "병원성" P. 아크네스 균주란, 여드름과 연관이 있는 P. 아크네스 균주를 지칭한다. 본원에서는 병원성 P. 아크네스 균주 및 비병원성 P. 아크네스 균주를 확인하고, 선별할 수 있는 검정법을 개시한다.

P. 아크네스의 균주들은 그의 대사 및 표현형상의 습성에서 유의적으로 상이한 것으로 나타났다(문헌 [Lomholt and Kilian, 2010]). 상기 차이로는 뉴라미니다제, α-글루코시다제 또는 히알루로니다제 발현, 및 말 혈액의 용혈 반응, 발효, 에리트리톨 발효 또는 소르비톨 발효를 수행할 수 있는 능력을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, P. 아크네스는 시스 9, c-12 리놀레산을 트랜스-10, 시스-12 리놀레산으로 특이적으로 전환시키는 활성 리놀레산 이소머라제를 발현하는 것으로 나타났다(문헌 [Rosson et al., 2004]). 리놀레산은 피지 생산 조절에 중요한 분자이고, 리놀레산의 감소는 다수의 연구에서 여드름 발병과 연관되어져 왔다(문헌 [Downing et al., 1986]; [Letawe et al., 1998]).

추가로, P. 아크네스 사멸 세포 또는 상청액은 햄스터 피지선세포에서 지질 생산을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다(문헌 [Iinuma et al., 2009a]).

P. 아크네스 종은 추가로 아형: IA 및 IB를 포함하여, 클레이드 I - III으로 분류되었다(문헌 [Lomholt et al.]). IA는 IA₁ 및 IA₂로 추가로 세분되었다(문헌 [McDowell et al., 2012]). P. 아크네스 균주의 유전자 분석을 수행함으로써 어떤 균주가 병원성이고, 여드름과 연관이 있을 수 있는지, 및 어떤 균주가 비병원성이고, 여드름과 연관이 없을 수 있는지를 측정할 수 있다(문헌 [Fitz-Gibbon et al., 2013], [Lomholt et al., 2010], 및 [Kasimatis et al., 2013]). 일부 실시양태에서, 비병원성 P. 아크네스 균주는 하기의 P. 아크네스 부류: I-2, II 및 IB 중 하나로부터의 균주이다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 비병원성 P. 아크네스 균주는 문헌 [Scholz et al. (2014) PLOS ONE 9(8) e104199]에 기술된 바와 같이, D1, A5, C3, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K8, K9, L1, 및 F4 SLST 타입 균주로 구성된 비병원성 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다.

문헌 [Scholtz et al.]에 기술된 바와 같이, 및 당업계의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, P. 아크네스 균주는 표적 좌위의 PCR 증폭 및 DNA 서열분석을 포함하는, 단일 좌위 서열 타이핑(SLST)을 사용하여 확인될 수 있다. P. 아크네스 SLST 방식은 (문헌 [Scholz et al.]에서 "SLST 표적 서열"로 지칭되는) 표적 좌위 PPA2385를 사용하여 개발되었고, 문헌 [Scholz et al.]에서 기술되었다. 문헌 [Scholz et al.]에 기술된 SLST 방식과 연관된 P. 아크네스 데이터베이스는 온라인 medbac.dk/slst/pacnes에서 이용가능하다. 예시적인 SLST 타입 균주로는 A1-A24, B1, C1-C4, D1-D3, E1-E9, F1-F10, G1, H1-H5, K1-K14, 및 L1-L6을 포함한다. 사용자는 온라인 데이터베이스에 P. 아크네스 서열을 입력하여 SLST 타입 균주를 확인할 수 있다. 다른 P. 아크네스 균주 확인 및 네이밍 체계로는 MLST9 및 MLST8 방식, 리보타이핑, 및 recA 및 tly 서열 분석 기반의 타입 배정을 포함한다. 문헌 [Scholtz et al.]의 도 1에는 상기 상이한 네이밍 협약이 제시되어 있다. 당업계의 숙련가는 P. 아크네스 균주를 당업계에 공지된 상이한 네이밍 체계에 따라 확인 및 분류할 수 있는 방법을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바, 박테리아 균주를 "타이핑한다"는 것은 예컨대, SLST를 사용하여 박테리아 균주를 확인하는 것을 지칭한다. 하기 표 1에는 예컨대, P. 아크네스 SLST 타입 D1, A5, C3, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K8, K9, L1, 및 F4 균주와 같은, 본원에 기술된 균주를 확인하기 위해 SLST에서 사용된 대립유전자 서열이 열거되어 있다. 당업계의 숙련가는 문헌 [Scholtz et al.]에 개시된 것에 상응하는, 본원에서 사용되는 균주 명칭을 이해할 것이며, 예컨대, SLST를 사용함으로써 P. 아크네스 균주가 상기 특정 균주들 중 임의의 것에 상응하는지 여부를 확인하는 방법에 대해 이해할 것이다.

따라서, P. 아크네스 균주는 문헌 [Scholtz et al.]에 기술된 표적 좌위 PPA2385를 사용하였을 때의 SLST 타입 명칭에 기초하여 본원에 기술된다. 예를 들어, "P. 아크네스 균주 C3"은 문헌 [Scholtz et al.]에 기술된 표적 좌위 PPA2385를 사용하였을 때의 P. 아크네스 SLST 타입 C3을 지칭한다. "P. 아크네스 균주 K8"은 문헌 [Scholtz et al.]에 기술된 표적 좌위 PPA2385를 사용하였을 때의 P. 아크네스 SLST 타입 K8을 지칭한다. "P. 아크네스 균주 A5"는 문헌 [Scholtz et al.]에 기술된 표적 좌위 PPA2385를 사용하였을 때의 P. 아크네스 SLST 타입 A5를 지칭하고, "P. 아크네스 균주 F4"는 문헌 [Scholtz et al.]에 기술된 표적 좌위 PPA2385를 사용하였을 때의 P. 아크네스 SLST 타입 F4를 지칭한다.

본원에 기술된 박테리아 조성물은 2개 이상의 P. 아크네스 균주를 포함한다. 예를 들어, 박테리아 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 P. 아크네스 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2, 3, 4, 또는 5종의 상이한 P. 아크네스 균주를 포함한다. P. 아크네스 균주 중 하나 이상의 것은 비병원성 균주일 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 조성물 중의 모든 P. 아크네스 균주는 비병원성 균주이다. 일부 실시양태에서, 균주를 확인하기 위해, 및 조성물 중 균주 포함 여부에 관해 선택하기 위해 P. 아크네스 균주의 유전자형을 분석한다. 본원에 기술된 박테리아 조성물 중에 포함되는 P. 아크네스 균주는 지질 생산을 증가 또는 감소시키기 위해 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 P. 아크네스 균주 C3, P. 아크네스 균주 K8, 또는 P. 아크네스 균주 C3 및 P. 아크네스 균주 K8, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주 C3 및 P. 아크네스 균주 K8은 조성물 중에 대략 동일한 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, P. 아크네스 균주 C3은 조성물 내 P. 아크네스 균주 K8보다 더 높은 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, P. 아크네스 균주 C3은 조성물 내 P. 아크네스 균주 K8보다 더 낮은 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 P. 아크네스 균주 A5 및/또는 P. 아크네스 균주 F4를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 P. 아크네스 균주 C3 및/또는 P. 아크네스 균주 K8, 및/또는 P. 아크네스 균주 A5 및/또는 P. 아크네스 균주 F4를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 균주 C3 및 P. 아크네스 균주 K8 및 P. 아크네스 균주 A5 및 P. 아크네스 균주 F4를 포함한다.

일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주의 혼합물은 하나 이상의 클레이드 I 균주 및 하나 이상의 클레이드 II 균주를 포함한다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 클레이드 II 균주는 클레이드 I 균주보다 병원성은 더 작을 수 있지만; 이들 균주는 또한 더 느리게 성장할 수 있고; 스스로는 피부 상에서 콜로니를 형성할 가능성은 더 적을 수 있다. 따라서, 본 발명의 측면은 클레이드 I 및 클레이드 II 균주, 둘 모두를 포함하고, 피부에서의 클레이드 II 균주에 의한 콜로니 형성을 허용하는 균주 혼합물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본원에 기술된 하나 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 P. 아크네스 균주 H1(6609)를 포함한다(문헌 [Hunyadkurti et al.]). 상기 P. 아크네스 균주의 게놈은 서열분석되었고, 이는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 CP002815로 이용가능하다(문헌 [Hunyadkurti et al.]). 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 특정 CRISPR/CAS9 서열을 가지는 P. 아크네스 균주를 포함한다(문헌 [Bruggemann, 2012], [Fitz-Gibbon 2013]). 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 P. 아크네스 균주 K1, K4 및 H1(6609) 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 P. 아크네스 균주 K1, K4, D1, A5, C3 및 H1(6609) 각각을 포함한다.

본 발명의 측면은 P. 아크네스 균주의 혼합물에 관한 것이다. P. 아크네스 균주 선택은 적어도 부분적으로는 균주가 병원성인지 여부를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 측정은 공보 자료, 사전 보고서, 및/또는 P. 아크네스 균주가 병원성인지 아닌지 여부를 측정하는 실험 시험에 기반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 오직 비병원성 P. 아크네스 균주만이 선택된다.

P. 아크네스 균주 선택은 또한 적어도 부분적으로는 어떤 균주, 또는 균주의 조합이 화장품 또는 약학 조성물에서 사용하기에 적절할 수 있는 조건에서 안정적인지 여부를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가된 안정성을 보이는 P. 아크네스 균주가 선택된다. 안정성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예컨대, 콜로니 형성 단위(CFU)의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다.

본원에 기술된 박테리아 조성물에 포함된 P. 아크네스 균주는 자연적으로 발생된 것일 수 있거나, 또는 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 유전적으로 변형된 균주는 자연 돌연변이유발에 의해 및/또는 유전자 조작에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주의 유전자 변형은 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 생산에 영향을 미치고/거나, 그의 리놀레산 이소머라제 활성을 증가 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주는 상이한 수준의 리놀레산 이소머라제를 보이며, 이는 박테리아 균주를 분류하는 데 및/또는 특정 박테리아 균주를 선택하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 트랜스-10, 시스-12 리놀레산을 생산할 수 있는 그의 능력에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 그가 그의 자연 환경에서 생산하는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 양에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 그가 생산하는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 최대 농도에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 그가 생산하는 효소 리놀레산 이소머라제의 활성에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 리놀레산 활성이 없는 P. 아크네스 균주가 선택된다. 다른 실시양태에서, 리놀레산 활성 수준이 낮은 P. 아크네스 균주가 선택된다. 다른 실시양태에서, 리놀레산 활성 수준이 높은 P. 아크네스 균주가 선택된다.

일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주에 의한 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 생산은 2004년 6월 1일 특허권을 부여받은 미국 특허 번호 6,743,609(발명의 명칭: "Linoleate isomerase")에 기술되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 방법을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 생산량은 FAME(지방산 메틸 에스테르: Fatty acid ester) 및/또는 GC(기체 크로마토그래피: Gas Chromatography)를 사용하여 검출된다.

일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주는 500 pm 리놀레산으로부터 최대 250 ppm 트랜스-10, 시스-12 리놀레산으로 전환시킬 수 있고, 이어서, 상기 농도를 일정하게 유지시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 리놀레산을 트랜스-10, 시스-12 리놀레산으로 전환시킬 수 있는 능력이 더 높은 P. 아크네스 균주가 선택된다. 다른 실시양태에서, 리놀레산을 트랜스-10, 시스-12 리놀레산으로 전환시킬 수 있는 능력이 더 낮은 P. 아크네스 균주가 선택된다.

어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 일부 실시양태에서, 그 안의 P. 아크네스 균주의 리놀레산 이소머라제 수준이 0 내지 낮은 수준인 박테리아 조성물은 상기 조성물이 피지 분비를 감소시킬 수 있기 때문에, 여드름을 예방 또는 치료하는 데 유익할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 표준 여드름 치료(예컨대, 소독 또는 항생제) 종료 후, 여드름의 재발을 막는 데 도움이 될 수 있다.

일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 피부 모낭 중의 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 수준을 증가시키는 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 박테리아 조성물은 피부 모낭 중의 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 수준을 감소시키는 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주의 조합은 미용 또는 의료 목적으로 트랜스-10, 시스-12 리놀레산을 피지선에 직접 전달하는 데 사용된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 박테리아 조성물은 피지 생산 수준이 높은 피부, 예컨대, 지성 피부 상의 피지 생산을 감소시키는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 박테리아 조성물은 피지 생산 수준이 낮은 피부, 예컨대, 건성 피부 상의 피지 생산을 증가시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 리놀레산 이소머라제 활성이 높은 균주의 조합은 충분하게 피지를 생산하지 못하는 개체의 피부에 적용된다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 피지 생산 감소를 경험할 수 있는 노인이다.

일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주에 의해 생산되는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 양은 시험되는 균주에서의 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 생산을, 트랜스-10, 시스-12 리놀레산을 생산하지 않는 것으로 공지되어 있거나, 또는 무시해도 될 정도의 양으로 또는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 평균량보다 더 낮은 양으로 생산하는 P. 아크네스 균주의 것과 비교함으로써 평가된다. 다른 실시양태에서, P. 아크네스 균주에 의해 생산되는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 양은 시험되는 균주에서의 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 생산을, 평균량으로 또는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 평균량보다 더 높은 양으로 생산하는 것으로 공지된 P. 아크네스 균주의 것과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 생산되는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 상대적인 양이 측정 또는 평가된다. 다른 실시양태에서, 생산되는 트랜스-10, 시스-12 리놀레산의 절대량이 측정 또는 평가된다.

일부 실시양태에서, P. 아크네스 균주에 의해 분해되는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 양은 시험되는 균주에서의 시스-9, 시스-12 리놀레산의 분해율을, 시스-9, 시스-12 리놀레산을 분해하지 않는 것으로 공지되어 있거나, 또는 무시해도 될 정도의 양으로 또는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 평균량보다 더 낮은 양으로 분해하는 P. 아크네스 균주의 것과 비교함으로써 평가된다. 다른 실시양태에서, P. 아크네스 균주에 의해 분해되는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 양은 시험되는 균주에서의 시스-9, 시스-12 리놀레산의 분해율을, 평균 분해율을 가지거나, 또는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 평균보다 높은 분해율을 가지는 것으로 공지된 P. 아크네스 균주의 것과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 분해되는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 상대적인 양이 측정 또는 평가된다. 다른 실시양태에서, 분해되는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 절대량이 측정 또는 평가된다.

일부 실시양태에서, 조성물 내의 P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 시스-9, 시스-12 리놀레산의 저속의, 또는 무시해도 될 정도의 분해 또는 전환을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 모든 P. 아크네스 박테리아 균주는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 저속의, 또는 무시해도 될 정도의 분해 또는 전환을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 조성물 내의 P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 시스-9, 시스-12 리놀레산의 저속의, 또는 무시해도 될 정도의 분해 또는 전환에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 그가 그의 자연 환경에서 분해하는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 양에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 그가 분해하는 시스-9, 시스-12 리놀레산의 최대 농도에 기초하여 선택된다.

일부 실시양태에서, 조성물 내의 P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 더 소량의 시스-9, 시스-12 리놀레산을 분해하도록, 또는 시스-9, 시스-12 리놀레산을 더욱 느리게 분해하도록 유전적으로 변형된다.

어떤 조합을 통해 안정적인 조성물을 얻을 수 있는지 측정하기 위해 통상의 방법을 사용하여 개별 균주 및 균주 조합을 시험할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 실온에서 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주, 24주, 25주, 26주, 27주, 28주, 29주, 30주 또는 30주 초과의 기간 동안 안정적이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 실온에서 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 6개월 초과의 기간 동안 안정적이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 냉장되었을 때, 대략 4℃에서 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주, 24주, 25주, 26주, 27주, 28주, 29주, 30주 또는 30주 초과의 기간 동안 안정적이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 냉장되었을 때, 대략 4℃에서 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 6개월 초과의 기간 동안 안정적이다.

일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 공여자 피험체의 피부 마이크로바이옴으로부터 샘플을 채취함으로써 제제화된다. 예를 들어, 샘플은 여드름이 없는 피험체로부터 채취될 수 있다. 다른 실시양태에서, 샘플은 경미한, 중간 정도의 또는 중증의 여드름을 앓는 피험체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 여드름을 앓거나, 또는 여드름에 민감한 피험체로부터 채취되지만, 여드름을 유발하는 것과 연관된 박테리아 균주는 샘플로부터 제거된다. 샘플은 배양될 수 있고, 경우에 따라 다른 성분과 함께 조합되어 박테리아 조성물을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 박테리아 조성물은 하나 이상의 단리된 박테리아 균주로부터 형성될 수 있다.

공여자 피험체로부터 채취된 샘플은 상기 샘플이 비병원성 P. 아크네스 균주를 함유하는지 여부를 알아보기 위해 시험될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 피험체의 피부로부터의 하나 이상의 비병원성 P. 아크네스 균주가 선택되고, 수혜자 피험체에게 투여된다. 수혜자 피험체는 공여자 피험체와 동일한 피험체일 수 있거나, 또는 공여자 피험체와 상이한 피험체일 수 있다.

일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 하나 이상의 P. 아크네스 균주 이외에도 하나 이상의 다른 박테리아 균주, 예컨대, 다른 비병원성 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 다른 비병원성 박테리아 균주는 항생제 특성을 가진다. 일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 하나 이상의 S. 에피더미디스(S. epidermidis) 균주를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 P. 아크네스 균주는 서열 번호 1-76으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 P. 아크네스 균주는 서열 번호 1-76으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 27과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한 P. 아크네스 균주 및/또는 서열 번호 64와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한 P. 아크네스 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 27을 포함하는 P. 아크네스 균주 및/또는 서열 번호 64를 포함하는 P. 아크네스 균주를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 P. 아크네스의 리보타입 6(RT6) 균주를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 P. 아크네스의 파일로타입 III 균주를 포함하지 않는다.

리놀레산 및 그의 이성질체 트랜스-10, 시스 -12 리놀레산

리놀레산은 2개의 불포화 이중 결합을 가지는 C18 지방산이다. 보통, 주요 이성질체는 시스-9, 시스-12이다. 상기 이성질체는 또한 피지에서 유리 지방산으로서 분비된다. 시험관내에서, 리놀레산은 피지선세포에서의 지질 생산을 자극하고, 피지 생산을 조절하는 피드백 순환에 관여할 수 있다. 이는 또한 항박테리아 특성을 가지며, 상이한 P. 아크네스 균주는 리놀레산에 대하여 상이한 감수성을 나타낸다(문헌 [Hong Lioe Ko et al., 1978]; [Madli Puhvel and Reisner, 1970]). 그러나, 리놀레산은 또한 P. 아크네스의 먹이원을 나타내는 피지 생산의 자극제로서의 역할을 한다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 박테리아 집단 및 숙주의 피지 생산에 의해 측정되는 피지 내 리놀레산 농도로 표시되는, 평형이 존재할 수 있다. 상기 평형은 모낭에서 콜로니를 형성하는 P. 아크네스 집단에 의한 시스, 시스-12 리놀레산의 분해율/전환율에 의존한다.

리놀레산의 공액 이성질체, 즉, 시스-9, 시스-11 리놀레산 및 트랜스-10, 시스-12 리놀레산은 식품 보충제로서 관심을 끌고 있다(문헌 [Churruca et al., 2009]). 리놀레산 트랜스-10, 시스 12는 PPAR 수용체 패밀리(퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체: peroxisome proliferator-activated receptor)에 작용한다(문헌 [Moya-Camarena et al., 1999]). PPAR-α의 활성화는 표피 피부 모델에서 콜레스테롤을 포함하는 지질 합성을 활성화시킨다(문헌 [Rivier et al., 2000]). 또한, 트랜스-10, 시스-12 리놀레산은 ROS(활성 산소 종: reactive oxygen species)를 증가시키고, 항암 활성을 가지는 것으로도 보고되었다(문헌 [Pierre et al., 2013]).

스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis )(S. 에피더미디스 )

S. 에피더미디스는 인간 피부의 정상적인 구성 요소인 그람 양성 박테리아이다. S. 에피더미디스는 에피더민, Pep5, 에피시딘 280, 에피란신 K7, 및 에피더미신 NI01포함하는 5종의 란티바이오틱을 생산할 수 있다. 란티바이오틱이란, 비단백질 아미노산 란티오닌 및 3-메틸란티오닌을 함유하는, 항생제 유사 펩티드를 지칭한다(문헌 [Schnell et al., 1988]). 에피더민은 P. 아크네스에 대하여 고도의 활성을 보인다(문헌 [Allgaier et al., 1985]). (Gotz et al.)은 에피더민에 대하여 추가로 상세하게 기술하였다. (Wang et al.)은 S. 에피더미디스가 글리세롤의 발효를 매개하여 P. 아크네스의 성장을 억제시킬 수 있다고 보고하였다.

본원에 기술된 박테리아 조성물에 포함된 S. 에피더미디스 균주는 자연적으로 발생된 것일 수 있거나, 또는 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 유전적으로 변형된 균주는 자연 돌연변이유발에 의해 및/또는 유전자 조작에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, S. 에피더미디스 균주의 유전자 변형은 그의 항생제 특성을 증가시킨다. 일부 측면에서 박테리아 조성물은 하나 이상의 P. 아크네스 균주 및 하나 이상의 S. 에피더미디스 균주를 함유할 수 있다. 하나 이상의 P. 아크네스 균주는 하나 이상의 S. 에피더미디스 균주의 항생제 특성에 대해 내성을 띨 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 S. 에피더미디스 균주는 하나 이상의 다른 박테리아 균주, 예컨대, 하나 이상의 S. 에피더미디스 균주의 항생제 특성에 대한 그의 내성을 증가시키도록 유전적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 P. 아크네스 균주는 의 항생제 특성에 대한 그의 내성을 증가시키도록 자연 돌연변이유발에 의해 및/또는 유전자 조작에 의해 변형된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 항생제, 소독제(예컨대, BPO), 또는 살리실산 중 하나 이상의 것을 함유할 수 있다. 당업계의 숙련가는 어느 항생제 또는 소독제도 본 발명의 특정 실시양태와 양립가능하다는 것을 이해할 것이다.

피부 마이크로바이옴 이식

본 발명의 측면은 예컨대, 이식에 의한 피부 마이크로바이옴의 조절에 관한 것이다. 이식은 하나 이상의 피험체 간에 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식은 한 피험체에서 이루어지고, 동일 피험체가 공여자이자 수혜자이다. 다른 실시양태에서, 이식은 2명 이상의 피험체 간에 이루어진다. 일부 실시양태에서, 1명의 공여자 피험체 및 1명의 수혜자 피험체가 존재한다. 다른 실시양태에서, 다수의 공여자 피험체 및/또는 다수의 수혜자 피험체가 존재한다. 다수의 이식 방법이 사용될 수 있고, 이로써, 상이한 박테리아 조성물 제제가 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형되지 않은 마이크로바이옴을 이식하는데, 이는 공여자 마이크로바이옴을 단리시키고, 수혜자에게로의 전달을 위한 것으로 제조한다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 제제화된 마이크로바이옴을 이식하는데, 이는 공여자 마이크로바이옴을 단리시키고, 경우에 따라 유전자형을 분석하고, 제제화를 위해 특정 균주(예컨대, 특정 유전자형을 가지는 균주)를 선택한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 제제화되고, 유전자 편집된 마이크로바이옴을 이식하는데, 이는 공여자 마이크로바이옴을 단리시키고, 유전자형을 분석하고, 특정 균주를 선택하고, 균주로부터 유전자 돌연변이체를 단리시키고, 제제를 생성한다는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 공여자 피험체의 피부로부터 하나 이상의 생 박테리아 균주를 수득하는 단계로서, 여기서, 생 박테리아 균주가 P. 아크네스 균주인 것인 단계; 하나 이상의 생 박테리아 균주가 병원성인지 여부를 측정하는 단계; 및 하나 이상의 생 박테리아 균주가 병원성이 아니라면, 피험체의 피부로의 소독제 또는 항생제 투여 후, 하나 이상의 생 박테리아 균주를 필요로 하는 수혜자 피험체의 피부에 하나 이상의 생 박테리아 균주를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 생 P. 아크네스 균주가 병원성인지 여부를 측정하는 검정법이 수행된다. 예를 들어, 생 박테리아 균주가 시스-9, 시스-12 리놀레산을 어떻게 전환 또는 분해시키는지를 평가하는 검정법이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 P. 아크네스 박테리아 균주 중 하나 이상의 것은 그의, 시스-9, 시스-12 리놀레산의 저속의, 또는 무시해도 될 정도의 분해 또는 전환에 기초하여 선택된다.

다른 피부 병태

여드름 이외에도, 본원에 기술된 조성물은 다른 피부 병태, 예컨대, 비듬, 진행성 반상 멜라닌저하증, 아토피 피부염 또는 주사를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

비듬은 피부 마이크로바이옴 비율의 불균형과 연관이 있다. 비듬은 만성적으로, 또는 발적 및 자극을 동반할 수 있는 특정 유발 인자의 결과로서 나타날 수 있다. 주요 기여 인자는 프로피오니박테리움 아크네스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스이고, 이는 또한 말라세지아 레스트릭타(Malassezia restricta)를 포함할 수 있다. 비듬의 경우, 스타필로코쿠스 에피더미디스 및 말라세지아 레스트릭타와 비교하여 P. 아크네스에 의한 발병률이 더 낮다(문헌 [Clavaud et al., 2013]; [Wang et al., 2015]). 이는 P. 아크네스 박테리아를 이용하는 보충 요법이 비듬 치료에 유익할 수 있다는 것을 시사한다.

P. 아크네스는 대개는 청소년에서, 및 특히, 여성에서 주로 몸통 중심부 상에서 나타나는 일반 저색소증인 진행성 반상 멜라닌저하증에 관여하는 것으로 공지되어 있다(문헌 [Westerhof et al., 2004]). 이는 피부 상에 백점으로 나타나는 바와 같이, 대개는 피부색이 더 검은 환자에서 진단이 이루어진다. 최근, 보고에 따르면, 진행성 반상 멜라닌저하증은 클레이드 III의 P. 아크네스와 연관이 있는 것으로 나타났다(문헌 [Barnard et al., 2016]). 본원에 기술된 조성물은 클레이드 I 및 II 균주는 함유하지만, 클레이드 III 균주는 함유하지 않는다. 그러므로, 본원에 기술된 조성물은 진행성 반상 멜라닌저하증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

(또한 아토피 습진으로도 알려진) 아토피 피부염은 피부 마이크로바이옴의 강한 장내 세균 불균형을 보이는 발적과 연관이 있다. 염증은 피부 발적, 팽윤, 가려움, 및 갈라짐을 일으킨다. 무릎 뒤, 팔꿈치 앞, 손, 및 발이 가장 많이 이환되는 부위이다. 피부연화제 치료가 아토피 피부염을 치료하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 본원의 박테리아 조성물을 받은 환자는 일반적으로 개선된 피부 상태를 보인다. 그러므로, 본원에 기술된 조성물은 아토피 피부염을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

주사는 안면 발적, 안면 피부 상의 작은 표피 상의 혈관 확장, 농포, 구진, 및 팽윤을 특징으로 하는 피부 병태이다. 4가지 유형의 주사가 존재하는데, 그 중 3가지 유형은 피부를 이환시킨다. 본 장애는 보통 여드름 또는 지루성 피부염과 혼동되거나, 또는 그와 함께 공존할 수 있다. 주사는 비록 가끔은 상기 다른 부위에서도 출현할 수는 있지만, 주로 안면에서 진단이 이루어지기 때문에, 두피 또는 귀에 발진이 존재한다는 것은 상이하거나, 또는 공존한다는 진단을 제안하는 것이다. 주사를 치료하는 것은 중증도 및 아형에 따라 달라진다. 본원에 기술된 조성물을 사용하여 P. 아크네스로 이루어지는 보충 요법이 주사를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

치료

본원에서 사용되는 바, 예컨대, 여드름과 같은 장애와 관련하여 사용될 때, 치료하다, 치료된, 또는 치료하는이라는 용어는 여드름의 적어도 하나의 증상을 개선시키는 것, 예컨대, 여드름과 연관된 병변의 감소 또는 개선을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 여드름을 예방한다는 것은 예컨대, 병변과 같은 여드름의 증상이 형성되는 것을 막고/거나, 여드름의 적어도 하나의 증상이 악화되는 것을 막거나, 예컨대, 추가 병변을 막거나, 또는 기존 병변이 악화되는 것을 막는 것을 지칭한다.

본 발명의 측면은 피부의 외관을 개선시키고/시키거나, 건강한 피부를 유지시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 추가 측면은 여드름, 지성 피부, 진행성 반상 멜라닌저하증(문헌 [Barnard et al., 2016]), 비듬, 아토피 습진, 아토피 피부염, 및 주사로 구성된 군으로부터 선택되는 병태를 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다.

피험체

본원에 기술된 조성물은 인간 또는 인간이 아닌 피험체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피험체는 여드름을 앓거나, 또는 여드름이 발생될 위험이 있는 인간 또는 인간이 아닌 피험체이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 가축, 예컨대, 애완 동물, 예컨대, 고양이 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 농장 동물, 예컨대, 소, 염소, 말, 돼지 또는 양이다. 피부가 있다면 어느 동물이든 본 발명의 측면과 양립가능하다는 것을 이해하여야 한다.

일부 실시양태에서, 여드름을 앓는 피험체는 염증 병변 및/또는 비염증 병변을 앓는다. 일부 실시양태에서, 비염증 병변의 계수가 높은 피험체가 선택된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 비염증 병변의 개수에 기초하여 무작위화된다.

유효량

본원에 기술된 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 "유효량"이라는 용어는 원하는 생물학적 효과를 실현시키는 데 필요하거나, 또는 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 여드름 치료를 위한 조성물의 유효량은 여드름의 적어도 하나의 증상을 개선시키는 데, 예컨대, 병변을 감소 또는 개선시키는 데 충분한 양이다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료되는 병태, 투여되는 특정 조성물, 피험체의 크기, 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업계의 숙련가는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 본 발명의 특정 조성물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.

조성물

국소 투여용의, 화장품 또는 약학 조성물을 비롯한 조성물로는 경피용 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 에어로졸 스프레이를 포함하는 스프레이, 좌제, 액제, 세럼 또는 분제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 2 성분 분배 시스템이다. 추가로, 통상의 약학 담체, 수성, 분말 또는 오일성 베이스, 또는 증점제가 국소 투여용 약학 제제에서 사용될 수 있다. 상기 성분의 예로는 각종 하이드록실화된 화합물, 예컨대, 단량체 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 에틸 알콜, 글리세린 및 부틸렌 글리콜, 중합체 모이스춰라이저, 예컨대, 폴리글리세릴메타크릴레이트, 팔미테이트 및 스테아레이트의 유도체, 지방산의 트리글리세리드, 라놀린, 식물성 오일 또는 광유, 및 왁스를 포함한다.

본원에서는 놀랍게도 피부 상에 비병원성 P. 아크네스 균주를 확립시킬 수 있는 효과적인 방법은 다중 균주로 이루어진 혼합물 내에 있는 것으로 밝혀졌다. 균주 혼합물 내에, 느리게 성장하는 균주가 피부 상에 확립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피부 상에 확립된 생성된 집단이 낮은 리놀레산 이소머라제 활성을 가지도록 균주가 선택된다. 자연적 배경하에서는 새로운 균주가 가끔은 피부 마이크로바이옴에 첨가되기도 하지만(문헌 [Oh et al., 2016]), 이소머라제 활성이 높은 집단이 이소머라제 활성이 낮은 집단에 의해 대체될 가능성은 없다. (소독 및 접종의 조합을 포함하는) 본원에 기술된 접근법은 이소머라제 활성이 높은 집단을 이소머라제 활성이 낮은 집단으로 대체하는 비천연적 대체법을 제공한다.

본원에 개시된 바와 같이, 일부 느리게 성장하는 균주, 예컨대, 비병원성 P. 아크네스 K8 균주는 예상 밖으로 균주 혼합물 내에서 더욱 효율적으로 성장하고, 일부 실시양태에서, 균주 혼합물 내에서 우위종 균주가 되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상이한 P. 아크네스 균주의 혼합물은 느리게 성장하는 균주를 더 빠르게 성장하는 다른 균주와 혼합함으로써 피부에서 느리게 성장하는 균주가 더욱 효율적으로 콜로니를 형성하도록 하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 박테리아 계수를 안정화시키기 위한 배지를 포함한다. 배지는 순수, PBS, 펩톤, 및/또는 희석된 또는 희석되지 않은 버전의 적합한 성장 배지 또는 그의 임의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 조성물(예컨대, 겔)은 박테리아를 안정화시키는 데 도움을 주는 펩톤을 낮은 비율로 함유한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 조성물 중 펩톤의 비율은 약 0.05% 또는 약 0.1%이다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 비율은 0.005% - 1%, 또는 0.05% - 1% 범위일 수 있다. 예를 들어, 펩톤의 비율은 약 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 비율은 0.005% 미만이다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 비율은 1% 초과이다. 일부 실시양태에서, 펩톤의 비율은 약 0.25%이다.

다른 실시양태에서, 펩톤 대신 적합한 성장 배지가 사용된다.

일부 실시양태에서, 예컨대, 카세인 유래의, 트립신에 의해 분해된 펩톤과 같이, 펩톤의 공급원은 카세인 유래의 것이다. 그러나, 펩톤의 어떤 형태 또는 공급원이든 본 발명의 측면과 양립가능하다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩톤은 트립신에 의해 분해된 것 이외의 산에 의해 분해된 것이다. 일부 실시양태에서, 펩톤은 육류 유래의 것이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 pH를 안정화시키는 데 도움을 주는 완충제 성분을 함유한다. 일부 실시양태에서, pH는 4.5-8이다. 예를 들어, pH는 하기 값들 사이의 임의의 값을 포함하는, 대략 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0이다. 일부 실시양태에서, pH는 대략 7.0이다.

완충제의 비제한적인 예로는 ACES, 아세테이트, ADA, 수산화암모늄, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올), AMPSO, BES, BICINE, 비스-트리스, BIS-TRIS 프로판, 보레이트, CABS, 카코딜레이트, CAPS, CAPSO, 카보네이트(pK1), 카보네이트(pK2), CHES, 시트레이트(pK1), 시트레이트(pK2), 시트레이트(pK3), DIPSO, EPPS, HEPPS, 에탄올아민, 포르메이트, 글리신(pK1), 글리신(pK2), 글리실글리신(pK1), 글리실글리신(pK2), HEPBS, HEPES, HEPPSO, 히스티딘, 히드라진, 이미다졸, 말레이트(pK1), 말레이트(pK2), 말레에이트(pK1), 말레에이트(pK2), MES, 메틸아민, MOBS, MOPS, MOPSO, 포스페이트(pK1), 포스페이트(pK2), 포스페이트(pK3), 피페라진(pK1), 피페라진(pK2), 피페리딘, PIPES, POPSO, 프로피오네이트, 피리딘, 피로포스페이트, 숙시네이트(pK1), 숙시네이트(pK2), TABS, TAPS, TAPSO, 타우린(AES), TES, 트리신, 트리에탄올아민(TEA), 및 트리즈마(Trizma)(트리스)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제제는 증점제를 포함한다. 증점제의 비제한적인 예로는 하이드록시에틸셀룰로스(예컨대, NATROSOL®), 전분, 검, 예컨대, 아라비아 검, 카올린 또는 다른 클레이, 수화된 규산알루미늄, 흄드 실리카, 카복시비닐 중합체, 소듐 카복시메틸 셀룰로스 또는 다른 셀룰로스 유도체, 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 및 알긴산나트륨을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 증점제는 하이드록시에틸 셀룰로스이다. 일부 실시양태에서, 하이드록시에틸 셀룰로스는 나트로솔® 하이드록시에틸셀룰로스(HEC) (Ashland Inc.)이다. 일부 실시양태에서, 나트로솔®은 나트로솔® HX(Caesar & Loretz GmbH, 주문 번호 4482, CAS: 9004-62-0) 또는 나트로솔® G(Caesar & Loretz GmbH, 주문 번호 4484, CAS: 9004-62-0)이다. 어느 형태의 하이드록시에틸 셀룰로스든 본 발명의 측면과 양립가능하다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 점도 타입은 HHR-P, HH, H4, H, MH, M, K, G, E 또는 L이다.

일부 실시양태에서, 증점제, 예컨대, 하이드록시에틸 셀룰로스의 농도는 대략 1%-5%이다. 예를 들어, 농도는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0%일 수 있다. 다른 실시양태에서, 증점제, 예컨대, 하이드록시에틸 셀룰로스의 농도는 1% 미만, 또는 5% 초과이다. 일부 실시양태에서, 증점제, 예컨대, 하이드록시에틸 셀룰로스의 농도는 대략 1.5%이다. 일부 실시양태에서, 증점제, 예컨대, 하이드록시에틸 셀룰로스의 농도는 대략 2.5%이다.

일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 10⁴-10⁹/ml의 콜로니 형성 단위(CFU)로 하나 이상의 생 P. 아크네스 균주를 포함한다. 예를 들어, CFU는 적어도 10⁴, 적어도 10⁵, 적어도 10⁶, 적어도 10⁷, 적어도 10⁸, 적어도 10⁹ 또는 10⁹/ml 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 모든 P. 아크네스 균주가 조성물 중에 적어도 10⁴-10⁹/ml의 콜로니 형성 단위(CFU)로 존재한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 실온에서 적어도 3개월 동안에 걸쳐 안정적인 CFU를 나타낸다. 일부 실시양태에서, CFU 계수는 초기 저장 단계(예컨대, 2주) 동안 짧게 변동된 후, 이어서, 안정화된다.

일부 실시양태에서, 조성물은 약 2.5%의 증점제, 예컨대, 나트로솔® 하이드록시에틸셀룰로스(HEC); 약 0.25% 펩톤, 예컨대, 카세인 유래의, 트립신에 의해 분해된 펩톤; 및 약 10⁴-10⁹/ml의 CFU의 2종 이상의 생 P. 아크네스 균주(예컨대, 약 10⁷/ml의 각각의 생 P. 아크네스 균주)를 포함한다.

본 발명의 측면은 상이한 생 P. 아크네스 균주로 이루어진 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 혼합물은 2개 이상의 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 2종의 상이한 생 P. 아크네스 균주를 포함한다. 2종의 상이한 균주는 동일한 농도로, 또는 동일하지 않은 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 균주 C3 및 P. 아크네스 균주 K8로 이루어진 2 균주 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 두 균주 모두 동일한 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 상기 두 균주 모두 대략 5 x 10⁶/ml의 CFU로 존재한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 4종의 상이한 생 P. 아크네스 균주를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 P. 아크네스 균주 C3, P. 아크네스 균주 A5, P. 아크네스 균주 F4 및 P. 아크네스 균주 K8로 이루어진 4 균주 혼합물을 포함한다. 4종의 상이한 균주는 동일한 농도로, 또는 동일하지 않은 농도로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 균주 C3, A5, F4, 및 K8의 상대 농도는 각각 대략 55%, 30%, 10%, 및 5%이다. 일부 실시양태에서, 균주 C3, A5, F4, 및 K8에 대한 CFU 값은 각각 대략 5.5 x 10⁶/ml, 5.5 x 10⁶/ml, 1 x 10⁶/ml, 및 5 x 10⁵/ml이다.

일부 실시양태에서, 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주가 조성물의 적어도 대략 5%를 구성한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 살리실산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 0.05-10% 살리실산을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 대략 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10% 살리실산을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 0.05% 미만의 살리실산, 또는 10% 초과의 살리실산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장시간 안면에 유지되는 조성물에서 살리실산의 비율은 2% 이하이다. 일부 실시양태에서, 안면으로부터 세척되고, 장시간 안면에 유지되지 않는 조성물에서 살리실산의 비율은 3% 이하이다. 놀랍게도, P. 아크네스 균주는 살리실산에 의해 억제되지 않으며, 이를 통해 살리실산은 피부 병태(예컨대, 여드름 또는 비듬) 치료를 위한 본원에 기술된 조성물 중에 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 하나 이상의 항염증성 화합물과 조합된다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 항염증성 화합물은 단기적으로 염증 병변을 감소시킬 수 있는 반면, 박테리아 조성물은 근본적인 문제를 처리하고, 장기간의 효과를 발휘할 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 피부연화제, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것을 포함한다. 피부연화제의 비제한적인 예로는 스테아릴 알콜, 글리세릴 모노리시놀레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 프로판-1,2-디올, 부탄-1,3-디올, 밍크 오일, 세틸 알콜, 이소프로필 이소스테아레이트, 스테아르산, 이소부틸 팔미테이트, 이소세틸 스테아레이트, 올레일 알콜, 이소프로필 라우레이트, 헥실 라우레이트, 데실 올레이트, 옥타데칸-2-올, 이소세틸 알콜, 세틸 팔미테이트, 디메틸폴리실록산, 디-n-부틸 세바케이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 스테아레이트, 부틸 스테아레이트, 폴리에틸렌글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 라놀린, 참깨유, 코코넛유, 땅콩유, 피마자유, 아세틸화 라놀린 알콜, 페트롤륨, 광유, 부틸 미리스테이트, 이소스테아르산, 팔미트산, 이소프로필 리놀레이트, 라우릴 락테이트, 미리스틸 락테이트, 데실 올레이트, 미리스틸 미리스테이트를 포함한다.

일부 실시양태에서, 단백질 안정화제, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다. 비제한적인 예로는 글리세롤, 에틸렌디아민테트라아세트산, 시스테인, 및 프로테이나제 억제제, 예컨대, 류펩틴, 펩스타틴, 안티파인, 및 시스타틴을 포함한다.

일부 실시양태에서, 보습제, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다. 보습제의 비제한적인 예로는 글리세린, 소르비톨, 소듐 2-피롤리돈-5-카복실레이트, 가용성 콜라겐, 디부틸프탈레이트, 젤라틴을 포함한다.

일부 실시양태에서, 아스트린젠트제, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다. 아스트린젠트제의 비제한적인 예로는 아르니카꽃 또는 그의 추출물, 저급 알킬 알콜, 위치 하젤, 붕산, 락트산, 멘톨, 장뇌, 징크 페놀 술포네이트, 아세트산알루미늄, 황산알루미늄, 및 염화아연 또는 황산아연을 포함한다.

일부 실시양태에서, 안료, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다. 안료의 비제한적인 예로는 이산화티타늄, 운모, 산화철, 바륨 레이크, 칼슘 레이크, 알루미늄 레이크, 비스무스 옥시클로라이드, 지르코늄 레이크 및 산화칼슘을 포함한다.

일부 실시양태에서, 착색제, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다. 착색제의 비제한적인 예로는 시코닌, β-카로틴, 파프리카, 모나스쿠스(monascus), 잇꽃 적색, 잇꽃 황색, 적양배추 색소, 자색 고구마 색소, 리코펜, 카카오 색소, 포도 색소, 코치닐, 락 색소, 비트 레드, 헤마테인, 레드 넘버(Red. No.) 215, 레드 넘버 218, 레드 넘버 223, 레드 넘버 225, 오렌지 넘버(Orange No.) 201, 오렌지 넘버 206, 옐로우 넘버(Yellow No.) 201, 그린 넘버(Green No.) 202, 및 퍼플 넘버(Green No.) 201, 레드 넘버 2, 레드 넘버 3, 레드 넘버 102, 레드 넘버 104(1), 레드 넘버 105(1), 레드 넘버 106, 옐로우 넘버 4, 옐로우 넘버 5, 그린 넘버 3, 블루 넘버(Blue No.) 1, 블루 넘버 2, 레드 넘버 201, 레드 넘버 213, 레드 넘버 214, 레드 넘버 227, 레드 넘버 230(1), 레드 넘버 230(2), 레드 넘버 231, 레드 넘버 232, 오렌지 넘버 205, 오렌지 넘버 207, 옐로우 넘버 202(1), 옐로우 넘버 202(2), 옐로우 넘버 203, 그린 넘버 201, 그린 넘버 204, 그린 넘버 205, 블루 넘버 202, 블루 넘버 203, 블루 넘버 205, 및 브라운 넘버(Brown No.) 201을 포함한다.

일부 실시양태에서, UV-A 및 UV-B 조사 필터, 자외선 차단제, 자유 라디칼 차단제, 비타민 추출물, 또는 항산화제, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다.

일부 실시양태에서, 계면활성제 또는 용매, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다. 용매의 비제한적인 예로는 물, 에틸 알콜, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드, 이소프로판올, n-부틸 알콜, 피마자유, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 디메틸 술폭시드, 디메틸 포름아미드 및 테트라하이드로푸란을 포함한다. i) 음이온성 계면활성제, 예컨대, 지방산의 금속 또는 알카놀아민 염, 예를 들어, 소듐 라우레이트 및 트리에탄올아민 올레이트; 알킬 벤젠 술폰, 예를 들어, 트리에탄올아민 도데실 벤젠 술포네이트; 알킬 술페이트, 예를 들어, 소듐 라우릴 술페이트; 알킬 에테르 술페이트, 예를 들어, 소듐 라우릴 에테르 술페이트(2 내지 8 EO); 술포숙시네이트, 예를 들어, 소듐 디옥틸 술폰숙시네이트; 모노글리세리드 술페이트, 예를 들어, 소듐 글리세릴 모노스테아레이트 모노술페이트; 이소티오네이트, 예를 들어, 소듐 이소티오네이트; 메틸 타우리드, 예를 들어, 이게폰 T(Igepon T); 아실사르코시네이트, 예를 들어, 소듐 미리스틸 사르코시네이트; 아실 펩티드, 예를 들어, 메이폰(Maypon) 및 라메폰(lamepon); 아실 락틸레이트, 폴리알콕실화 에테르 글리콜레이트, 예를 들어, 트리데세트-7 카복실산; 포스페이트, 예를 들어, 소듐 디라우릴 포스페이트; 양이온성 계면활성제, 예컨대, 아민 염, 예를 들어, 사파민 하이드로클로라이드; 4급 암모늄 염, 예를 들어, 쿼터늄(Quaternium) 5, 쿼터늄 31 및 쿼터늄 18; 양쪽성 계면활성제, 예컨대, 이미다졸 화합물, 예를 들어, 미라놀(Miranol); N-알킬 아미노산, 예컨대, 소듐 코카미노프로피오네이트 및 아스파라긴 유도체; 베타인, 예를 들어, 코카미도프로필베타인; 비이온성 계면활성제, 예컨대, 지방산 알카놀아미드, 예를 들어, 올레익 디에탄올아미드; 에스테르 또는 폴리알콜, 예를 들어, 스판(Span); 폴리글리세롤 에스테르, 예를 들어, 지방산 및 하나 또는 수개의 OH 기로 에스테르화된 것; 폴리알콕실화된 유도체, 예를 들어, 폴리옥시:폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 에테르, 예를 들어, 폴리옥시에테 라우릴 에테르; 에스테르 에테르, 예를 들어, 트윈(Tween); 아민 옥시드, 예를 들어, 코코넛 및 도데실 디메틸 아민 옥시드. 일부 실시양태에서, 1개 초과의 계면활성제 또는 용매가 포함된다.

일부 실시양태에서, 보존제, 방부제, 안료 또는 착색제, 향미제, 차폐제, 및 담체, 예컨대, 물 및 저급 알킬, 알콜, 예컨대, 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 것이 조성물에 포함된다.

일부 실시양태에서, 조성물이 분말 형태인 경우, 분말은 미국 특허 번호 5,525,336에 개시되어 있고, 그로부터 참조로 포함된 백악, 활석, 백토, 콜로이드성 이산화규소, 소듐 폴리아크릴레이트, 테트라알킬 및/또는 트리알킬 아릴 암모늄 스멕타이트 및 화학적으로 개질된 마그네슘 알루미늄 실리케이트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 퍼퓸을 포함할 수 있다.

투여될 때, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 제제로서 치료적으로 유효한, 약학적으로 허용되는 양으로 적용된다. 본 발명의 조성물 중 임의의 것은 치료 유효 용량으로 피험체에게 투여될 수 있다. 피험체에게 투여될 때, 유효량은 치료되는 특정 병태 및 원하는 결과에 의존할 것이다. 치료 유효 용량은 예를 들어, 인자, 예컨대, 본원에 기술된 것과 같은 것을 사용하고, 단지 통상의 실험만을 이용함으로써 당업계의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 하기 작용제 중 하나 이상의 것이 본원에 기술된 조성물에 포함된다: 국소용 항생제(예컨대, 클린다마이신, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 메트로니다졸), 경구용 항생제(예컨대, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 클린다마이신), 국소용 레티노이드(예컨대, 아다팔렌, 타자로틴, 트레티노인), 경구용 레티노이드(예컨대, 이소트레티노인), 벤조일 퍼옥시드, 살리실산, 황, 아젤라산, 및 항미생물 펩티드 및 그의 유도체(예컨대, 리포헥사펩티드 HB1345, 올리고펩티드-10, 메가이닌(예컨대, 펙시가난), 프로테그린(예컨대, 이세가난), 인돌리시딘(예컨대, 오미가난, MBI 594AN), 히스타틴(예컨대, P113 P113D), 인간 살균성/투과성 증가 단백질(예컨대, XMP.629, 뉴프렉스), 카텔리시딘(예컨대, 카텔리시딘-BF).

일부 실시양태에서, 조성물은 국소 형태로, 예컨대, 크림 또는 연고로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물의 투여는 조합 치료의 일부를 포함하거나, 또는 앞서 수행된 피험체의 피부 치료 다음으로 진행된다.

적용되는 조성물의 적절한 양은 다수의 상이한 인자에 의존할 수 있고, 고려될 수 있는 수개의 비제한적인 인자로는 생물학적 활성 및 작용제의 생체이용률, 작용제의 성질, 투여 모드, 반감기, 및 치료하고자 하는 피험체의 특징을 포함한다.

일부 실시양태에서, 박테리아 조성물은 민감성 피부인 피험체에게는 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 여드름 치료 또는 예방을 위해 박테리아 조성물을 사용할 때, 치료되는 피험체는 불필요한 일광 노출을 피하고, 자외선 차단제를 사용한다. 일부 실시양태에서, 치료되는 피부가 발적, 팽윤, 화끈거림, 가려움, 또는 벗겨짐을 특징으로 하는 자극을 받았을 때, 제품은 덜 빈번하게, 또는 더 낮은 농도로 사용된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 건강한 피부 유지를 위해 피험체의 피부에 투여된다. 조성물은 1회 또는 다회 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 일정 간격으로 투여되는 반면, 다른 실시양태에서는, 불규칙한 간격으로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 하기 값들 사이의 모든 값을 포함하여, 약 매 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 24시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주마다, 또는 그보다 더욱 빈번하게 또는 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 당업계의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같은 표준 여드름 치료, 예컨대, 소독제 또는 항생제 또한 받거나, 또는 앞서 받은 적이 있는 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 표준 여드름 치료와 동시에 투여된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 표준 여드름 치료 이후에 투여된다. 조성물은 이전 치료 직후에 투여될 수 있거나, 또는 이전 치료와 조성물 투여 사이에 유예 기간이 존재할 수 있다. 조성물은 이전 치료 이후 1회 또는 다회 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 이전 치료 이후 일정 간격으로 투여되는 반면, 다른 실시양태에서는, 이전 치료 이후 불규칙한 간격으로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 이전 치료 이후, 하기 값들 사이의 모든 값을 포함하여, 약 매 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 24시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주마다, 또는 그보다 더욱 빈번하게 또는 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

본 발명의 측면은 예컨대, S. 에피더미디스에서 박테리아 균주를 돌연변이화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이화는 아미노산 치환을 선택함으로써, 또는 핵산 또는 폴리펩티드 중에서의 선택된 부위의 무작위 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 발현시키고, 돌연변이가 변이체 폴리펩티드에 원하는 특성을 제공하는지 여부를 측정하기 위해 하나 이상의 활성에 대하여 시험할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 침묵성이지만, 특정 숙주에서는 번역에 바람직한 코돈을 제공하는 추가의 돌연변이화가 변이체에 대해(또는 비변이체 폴리펩티드에 대해) 진행될 수 있다. 예컨대, E. 콜라이(E. coli)에서의 핵산의 번역에 바람직한 코돈은 당업계의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 폴리펩티드의 발현 증진을 위해 유전자 또는 cDNA 클론의 비코딩 서열에 대해 추가의 다른 돌연변이화가 이루어질 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 박테리아 또는 진핵성 발현 벡터에서 클로닝하고, 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입하고, 변이체 폴리펩티드를 발현시키고, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드의 기능적 능력에 대해 시험함으로써 변이체 폴리펩티드의 활성을 시험할 수 있다.

본 발명에 따른 박테리아 세포는 영양분이 풍부한 배지 또는 최소 배지를 비롯한, 다양한 배지 중에서 배양될 수 있다. 당업계의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 통상의 최적화를 통해 다양한 유형의 배지가 사용될 수 있을 것이다. 배지는 당 공급원을 포함하는, 각종의 추가 성분으로 보충될 수 있다. 보충 성분에 대한 일부 비제한적인 예로는 글루코스, 아미노산, 항생제 및 ATCC 미량 미네랄 보충제를 포함한다. 유사하게, 배지, 및 본 발명의 세포의 성장 조건의 다른 측면이 통상의 실험을 통해 최적화될 수 있다. 예를 들어, pH, 온도, 및 조성물 내의 성분의 농도는 최적화될 수 있는 인자의 비제한적인 예이다.

본 발명과 연관된 세포를 성장시키는 데 사용되는 액체 및/또는 고체 배양물은 당업계에서 공지되어 있고, 사용되는 배양 배쓸 중 임의의 것에 하우징될 수 있다.

일부 실시양태에서, 박테리아 균주는 배치식으로 성장된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 균주는 발효조에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 패키징된다. 특정 실시양태에서, 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 장용 시린지 또는 사쉐로 패키징된다.

키트

본 발명은 또한 키트 내의 상기 언급된 조성물 중 임의의 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 생 박테리아를 하우징하는 용기, 또는 냉동 건조된 생 박테리아를 하우징하는 용기를 포함한다. 키트는 배지, 예컨대, 펩톤을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 항생제(들), 소독제(들)(예컨대, BPO) 및/또는 살리실산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항생제(들), 소독제(들) 및/또는 살리실산은 생 박테리아를 포함하는 조성물 적용 전, 피부를 전처리하는 데 사용된다. 키트는 또한 조성물 투여 설명서를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 박테리아 균주를 조성물의 다른 성분과 혼합하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 박테리아 조성물을 피험체에게 적용시키기 위한 어플리케이터를 추가로 포함한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어느 방식으로든 추가 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전역에 걸쳐 인용된 (문헌 참고문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원, 및 공 계류 중인 특허 출원을 비롯한) 모든 참고문헌의 전체 내용이 명백하게 본원에서 참조로 포함된다.

실시예

실시예 1: 상이한 P. 아크네스 균주는 상이한 수준의 리놀레산 이소머라제 활성, 또는 트랜스-10, 시스 -12 리놀레산의 최종 임계 농도를 가진다.

다수의 상이한 P. 아크네스 균주의 리놀레산 이소머라제 활성 특징을 규명하는 실험을 수행하였다. 리놀레산을 함유하지 않는 성장 배지 중에서 P. 아크네스 균주를 성장시켰다(문헌 [(Rosson et al., 2004]). 시스-9, 시스-12 리놀레산을 성장 배지에 첨가한 후, 지방산 메틸 에스테르로의 전환을 포함하는 검정법 및 이어서, 기체 크로마토그래피를 이용하여 상이한 시점에 시스-9, 시스-12 및 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체의 양을 측정하였다. 불포화 지방산의 시스 및 트랜스 이성질체를 구별하는 확립된 방법은 문헌 [Kramer et al., 2004]에 기술되어 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.

놀랍게도, 이들 시험을 수행함에 있어 배지 및 인큐베이션 조건 선택이 중요한 변수라는 것을 발견하게 되었다. 배지에서의 리놀레산의 분해를 측정하기 위해, 일부 다른 유형의 배지에서는 리놀레산이 침전한 것이 관찰되었는 바, 이에 강화 클로스트리디움성 배지(RCM: reinforced clostridial media)를 사용하였다.

시스-9, 시스-12 리놀레산의 분해를 보여주는 결과는 도 1에 제시되어 있다. 시스-9, 시스-12 리놀레산이 매우 빠르게 감소되는 것으로 관찰되었고, 대부분의 분해는 실험 처음 48 h 내에 일어났다. 균주 A1은 배지로부터 리놀레산을 완전히 고갈시킨 반면, 균주 C3은 놀랍게도 리놀레산 분해 속도를 저속화시켜 평형 농도에 도달하는 것 또한 관찰되었다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 여드름 환자는 일반적으로 건강한 피험체와 비교하여 피지 중 더 낮은 농도의 리놀레산을 가진다. 따라서, 천천히 분해하는 균주의 집단이 피지 중 더 높은 농도의 리놀레산에 이르게 할 것이며, 이것이 이로울 수 있다.

예컨대, RCM과 같은 영양분이 풍부한 배지 중에서 단지 소량의 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체가 검출되었는데, 이는 가능하게는 예컨대, RCM과 같은 영양분이 풍부한 배지는 피지선에서 접하게 되는 환경을 나타내지 못하기 때문이다. 특히, 글루코스는 보통 피지선에서 한정되어 있고, 박테리아의 대사 프로그램에 영향을 줄 수 있다(문헌 [Im and Hoopes, 1974]). P. 아크네스용으로 기존에 보편적으로 사용되었던 모든 배지들(예컨대, RCM, BHI, GAM)은 적어도 3 g/L의 글루코스를 함유하지만, 피지선에서 글루코스는 단지 비교적 저농도(예컨대, ~0.6-1.4 g/kg 건조 중량(문헌 [Im and Hoopes, 1974]))로 존재한다.

그러므로, 모든 P. 아크네스 균주의 성장이 이루어지는 글루코스 무함유 배지는 본원에서 디자인되었고, 이는 11종의 P. 아크네스 균주를 시험하고, 특징 규명하는 데 사용되었다. 펩톤 및 효모 추출물로부터의 최소 배지(PY 배지)를 확립하였고, 이는 박테리아가 접하게 되는 자연 환경과 유사하기 때문에, 이를 통해서 박테리아는 성장할 수 있고, 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체의 생산을 측정할 수 있다.

최소 배지 중에서 샘플을 진탕하는 것을 포함하는, 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체의 생산을 평가하기 위한 조건을 개발하였다. 다중 균주를 이용하여 수행된 시간 경과에 따른 분석은 도 3에 제시되어 있다. 개별 균주의 성장이 서로 상이하였는 바, 판독값을 600 nm에서 측정된 광학 밀도(OD: Optical Density)에 의해 정규화 보정하였고, 이는 아가 플레이트 상의 CFU 계수에 의해 확인되었다. OD 정규화를 위해, 각 배양물의 OD를 각 균주의 바이오매스에 대한 척도로서 사용하였다. 이어서, 모든 OD 측정값을 측정값 중 최고치로 나눔으로써 상대 성장률을 얻었다. 이어서, 측정된 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 농도에 각 균주에 대한 상기의 상대 성장률을 곱하였다. 높은 광학 밀도로 성장하게 되는 균주는 느리게 성장하는 균주보다 세포 1개당 더 소량의 이소머라제를 계속해서 생산할 수 있을 것이라는 것을 기본 가정으로 한다. 트랜스 10, 시스 12 리놀레산 이성질체의 보정된 농도는 도 2에 제시되어 있다. 일반적으로 여드름과 연관이 있는(문헌 [McDowell et al., 2012, PLoS ONE 7, e41480]) 균주 A1은 가장 많은 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체를 생산하였다. 트랜스-10, 시스-12 리놀레산 이성질체를 거의 생산하지 않은 균주는 C3, C1, F4, A5, K1, K2, K8 및 L1이었다. K 균주 및 L1 균주는 거의 성장하지 않은 것으로 나타났다. 이들 균주는 또한 영양분이 풍부한 배지 중에서 매우 천천히 성장하고, 자연상에서는 좀처럼 발생하지 않는다. 예상 밖으로, 하기에서 논의되는 바와 같이, K8 균주는 다른 균주와의 특정 조합시, 개선된 성장을 보인다.

물질 및 방법

각 균주를 사전 배양물로서 성장시켰고, 사전 배양물을 OD에 의해 정규화시켰다. 각 실험 전에 1.7 mM 시스 9, 시스 12 리놀레산을 함유하는 신선한 배지를 제조하였다. 이어서, 배양물을 37℃에서 정치 또는 220 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 다양한 시점에 샘플을 채취하고, 액체 추출 및 기체 크로마토그래피(GC) 분석시까지 -80℃에서 급냉시켰다.

GC 분석을 위해, 배지 중 액체를 추출하고, 그의 메틸 에스테르로 전환시켰다. 이를 위해, 100 ㎕의 배지 샘플을 900 ㎕ H₂O로 희석시켰다. 20 ㎍의 헵타데칸산을 내부 표준으로서 첨가하고, 에틸아세테이트를 이용하여 전체 액체 분획을 추출하였다. 이어서, 유기상을 분리하고, 질소하에 건조시켰다. 이어서, 액체를 14% 보론트리플루오라이드-메탄올(Borontrifluoride-Methanol) 용액(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재), 카탈로그 번호 B1252)을 이용하여 전환시키고, 헥산으로 추출하고, 질소하에 건조시키고, 100 ㎕의 헥산 중에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 FID 검출기가 장착된 베어리언 CP 3800 기체 크로마토그래프(Varian CP 3800 Gas chromatograph) 상에서 분석하였다. 사용된 칼럼은 애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies: 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)로부터의 CP-WAX 58 (FFAP) 모세관 컬럼 25 m x 0.32 mm I.D였고, 온도 프로그램은 120℃(1 min) - 120℃에서 250℃(20℃/min) - 250℃(12 min)였다.

실시예 2: 박테리아 균주 혼합물의 최적화

실시예 1은 단리된 P. 아크네스 균주들이 그의 성장 습성에 있어 상당히 상이하였다는 것을 입증한다. 일반적으로, 클레이드 I로부터의 균주는 빠르게 성장하는 균주인 것으로 나타난 반면, 클레이드 II로부터의 균주는 느리게 성장하는 균주인 것으로 나타났다(예컨대, 도 5 참조). 일반적으로, 여드름과 연관이 없는 것으로 간주되는 균주는 클레이드 II로부터 기원할 가능성이 더 크다(문헌 [Lomholt and Kilian, 2010]; [Yu et al.]). 이러한 저속 성장은 상기 균주가 소독 후 피부에서 콜로니를 형성할 가능성이 더 작다는 것을 시사한다. 클레이드 II로부터의 균주는 또한 인간 피험체에서 덜 일반적으로 발견된다. 자연상에서는 클레이드 I로부터의 빠르게 성장하는 균주에 의해 피부에 콜로니가 형성되는 경향이 있다. 그에 반하여, 본원에서는 클레이드 II 균주에 의한 피부에의 콜로니 형성을 허용하는 균주 혼합물을 기술한다.

추가의 성장 곡선 실험 결과, 2종 또는 4종의 균주로 이루어진 혼합물이 혼합물 중 가장 빠른 순수 단리물만큼 빠르게 유사하게 성장한 것으로 나타났다. 놀립게도, 아가 상에서 5일 동안 성장시킨 6종의 균주로 구성된 혼합물의 조성을 분석하였을 때, 대다수의 박테리아는, 개별적으로 성장시켰을 때 느리게 성장한 것으로 관찰된 균주인, 균주 K8로부터 기원한 것으로 나타났다(도 7). 따라서, 비록 자연상에서는 느리게 성장하는 개별 균주를 함유할지라도, 자연상에서의 것을 능가할 가능성을 지닌 유익한 성장 특성을 보이는 균주 혼합물을 생성할 수 있다.

클레이드 IA1 내의 균주는 보통 여드름과 연관이 있다고 보고되었다(문헌 [Lomholt and Kilian, 2010, PLoS One 5]; [McDowell et al., 2012, PLoS ONE 7, e41480]). 클레이드 IA1로부터의 균주를 선택하여 클레이드 II로부터의 균주와 혼합하고, 이로써, 피부에 함께 콜로니를 형성하도록 하기 위해, 균주 선택을 위하여 시스 9, 시스 12 리놀레산에서 트랜스 10, 시스 12 이성질체로의 전환 기준을 사용하였다. 상기 균주 혼합물을 이용한 피부에서의 콜로니 형성은 자연적으로 발생할 가능성은 없는데, 그 이유는 부분적으로는 보존제를 포함하는 화장품 및 위생용품의 사용 증가가, 피부 상에서 우위종 점유자가 되는, 빠르게 성장하는 균주의 자연 도태를 유도하기 때문이다. 따라서, P. 아크네스 균주의 (예컨대, 가까운 신체 접촉에 의한) 자연적으로 발생된 전달에서 전달된 박테리아 대다수는 단 하나의 균주로부터의 것이 될 것이다.

성장 습성 및 트랜스 10, 시스 12 리놀레산 생산, 이 둘 모두에 기초하여, 박테리아 균주의 혼합물을 포함하는 조성물에서 콜로니 형성을 위해 사용하기 위한 균주로서 균주 C3을 선택하였다. 이어서, 조성물의 다양한 출발 농도가 피부에 미치는 효과를 시험하였다. 6종의 상이한 균주를 동량으로 혼합하고, 6종의 균주 중 하나를 과량으로 첨가하였다. 성장 5 및 6일 후, 이어서, 혼합물의 조성을 평가하였다. 성장 곡선과 함께 상기 데이터에 기초하여, 박테리아 균주의 혼합물을 포함하는 조성물 중 균주의 최종 농도를 선택하였다.

시스 9, 시스 12 리놀레산 전환율이 낮고, 중상의 OD로 성장하였고, 5일째부터 6일째까지 혼합물의 상대적인 양이 감소된 것으로 나타난, 클레이드 I로부터의 균주를 고농도로(예컨대, 60% 이하로) 첨가하였다.

주어진 균주가 집단 중에서 최대 50%를 차지하는 것인 혼합물을 제조하였다. 자연상에서는 대체로 한 P. 아크네스 균주가 가능하게는 한 숙주 상에서 관찰되는 P. 아크네스 집단의 90% 초과를 차지할 수 있다.

일부 균주의 경우, P. 아크네스의 성장 습성이 출발 CFU 계수에 크게 의존하는 것으로 관찰되었다. 그러므로, 일단 배양물이 정지기에 도달하고 나면, 혼합물 중의 한 균주의 상대 비율은 어떻게 전개되는지에 대해 조사하였다. 놀랍게도, 균주가 우위종 균주가 되게 하는 기본적인 역동적 성질은 적어도 부분적으로는 박테리아의 출발량에 의해 결정이 되고, 이는 균주마다 다른 것으로 나타났다.

사전 배양물을 RCM 배지 중에서 성장시키고, 원심분리 후, PBS 중에 재현탁시켰다. 배양물을 OD 0.5로 정규화시켰다. 이어서, 50 ㎕의 정규화된 현탁액을 1 ml의 배지에 접종하였다. 플레이트를 기밀 밀봉한 후, 이어서, 배양물을 테칸 스파크(Tecan Spark)에서 37℃하에 인큐베이션하였다. 배양물을 매 30 min마다 진탕시키고, 600 nm에서의 OD를 측정하였다. BD(BD/Difco 카탈로그 번호 218081)로부터 RCM 배지를 입수하였다. PY 배지는 2% 효모 추출물(Sigma 카탈로그 번호 Y1625-250G) 및 3% 펩톤(Sigma 70172-500G)로만 구성된, 주문 제조된 배지이다. 상기 배지는 글루코스를 함유하지 않는 바, 이에, 예컨대, RCM 또는 BHI와 같이, 글루코스 함량이 높은 영양분이 풍부한 배지보다, 피지선에서 P. 아크네스가 접하게 되는 낮은 글루코스 환경을 더욱 정확하게 반영한다.

도 4는 접종 후 5일째 또는 6일째의 혼합물 중의 C3 균주의 상대적인 양을 보여주는 것이다. C3이 출발 혼합물 중에 높은 비율(%)로 존재할 때, C3은 우위종 균주인 상태 그대로 유지된다. 놀랍게도, C3이 더 낮은 출발 농도로 존재하는 경우, 이는 후기 정지기에 전체 비율(%)을 감소시킨다.

도 5는 37℃에서 RCM 배지 중에서의 균주 C3, F4, C1 및 K8의 성장 곡선을 보여주는 것이다.

도 6은 37℃에서 글루코스 무함유 PY 배지 중에서의 균주 C3, F4, C1, K8, 2 균주 혼합물(균주 C3 및 K8) 및 4 균주 혼합물(A5, C3, F4, 및 K8)의 성장 곡선을 보여주는 것이다.

실시예 3: 균주 조합을 이용한 경쟁 실험

다양한 박테리아 혼합물의 시너지 효과를 측정하는 시험관내 실험을 수행하였다. 신선한 박테리아 배양물을 -80℃ 스톡으로부터 소생시키고, RCM 아가 플레이트 상에서 성장시켰다. 아가 플레이트로부터, BHI 액체 배지를 접종하고, 정지기까지 5일 동안 성장시켰다. 이어서, (4℃에서 10 min 동안 4,000 g로) 원심분리하여 배양물을 수거하고, 1.4 ml의 0.1% 펩톤(카세인 유래의, 트립신에 의해 분해된 펩톤) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 펩톤 종의 박테리아 현탁액을 OD 0.8로 정규화시켰다. 적용 전 보관을 시뮬레이션하기 위해 균주를 펩톤 용액 중에서 실온(RT: room temperature) 하에 밤새도록 저장하였다. 이어서, 다음날 아침, 모든 균주를 같은 몰 농도로 혼합하고, 펩톤 용액을 이용하여 상기 혼합물을 추가로 1.6배 희석하였다. 따라서, 각 균주는 스톡 용액과 비교하여 혼합물 중 1:10 희석률로 존재하였다. 이어서, 상이한 조합을 함유한 96 웰 마스터 플레이트를 생성하였다(하기 표 3).

이를 통해 하기 농도를 얻었다(하기 표 4):

10 ㎕의 각 혼합물을 96 웰 아가 플레이트 중앙부에 첨가하고, 4일 동안 인큐베이션하였다. 사용된 배지는 0.5 mg/ml 리놀레산으로 보충된 RCM-아가였다.

하기 프로토콜에 따라 플레이트를 수거하였다. 각 웰에 10 ㎕ 멸균 PBS를 첨가하였다. 짧게 인큐베이션한 후, 각 웰 중의 박테리아를 개별적으로 재현탁시키고, 새 플레이트로 옮겨 놓았다. 이어서, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 밀리Q 수(MilliQ water)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 펠릿을 90 ㎕의 새로 제조된 0.05 M NaoH(20 ml의 밀리Q 수 중 100 ㎕의 30% NaOH) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 플레이트를 PCR 장치에서 60℃하에 45 min 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 9.2 ㎕ 트리스(pH 7)를 첨가하여 반응물을 중화시키고, 5 ㎕의 상청액을 20 ㎕ PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 집단의 특징을 규명하기 위해 PCR 수행하여 SLST 대립유전자를 증폭시켰다. 사용된 프라이머 서열은 하기와 같았다:

카파 폴리머라제를 사용하여 샘플을 증폭시켰다(5 min 95℃; (98℃ 20s, 62℃ 25s, 72℃ 30s)로 35 사이클; 1 min 72℃). 2라운드의 PCR을 사용하여 서열분석 라이브러리를 수행하였다. 제1 라운드는 일루미나(Illumina) 서열분석과 양립가능한 서열을 포함한 SLST 프라이머를 사용하였다. 제2 라운드(10 사이클)를 사용하여 단일 일루미나 유동셀에서의 서열 분석을 위해 상이한 샘플을 바코딩하였다. (문헌 [Rohland and Reich, 2012])에 따라 제조된 자기 비드를 사용하여 PCR 반응물 및 3-S-바이오키트(3-S-Biokit) DNA 추출물을 정제하였다. 색인된 반응물을 풀링하고, 프로메가 위자드® SV 겔(promega WIZARD® SV Gel) 및 PCR 클린-업 시스템(PCR Clean-Up System)을 이용하여 아가로스 겔로부터 정제하였다. 이어서, 최종 라이브러리를 애질런트 테이프스테이션(Agilent TapeStation) 상에서 품질 관리하고, 로슈 라이트사이클러 480(Roche LightCycler 480) 상에서 KAPA 라이브러리 정량화 키트 KK4854를 사용하여 qPCR에 의해 정량화하였다. 2*300Bp 리드와 함께 MiSeq 리에이젠트 키트 v3(MiSeq Reagent Kit v3)(MS-102-3003)을 사용하여 일루미나 MiSeq 서열분석을 수행하였다.

내부에서 개발된 컴퓨터 파이프라인(S-유전자형 분석)을 이용하여 샘플을 분석하였다. 품질 필터링; bwa 소프트웨어를 사용하여 샘플을 내부 데이터베이스로 맵핑하고; R 통계 언어를 이용하여 데이터 프로세싱 및 시각화를 수행하였다. P. 아크네스 SLST 타입에 관한 가장 최근의 라이브러리를 medbac.dk/slst/pacnes로부터 다운로드받았다.

본 실험 결과, 개별 균주의 성장 습성은 혼합물로서 그의 성장 습성과는 상이한 것으로 나타났다. A5와 같이, 단리물일 때 빠르게 성장하는 균주가 배양물을 점거할 것으로 예상되었다. 놀랍게도, 단지 소량만이 최종 혼합물에 기여할 것으로 예상된, 느리게 성장하는 균주(K8)는 그가 다른 균주 존재하에서 성장한 경우에는 최종 바이오매스에 대한 주요 기여 인자였다. 도 7은 RCM 아가 상에서의 5일간의 성장 전후로 리드 서열분석으로 측정된, 상이한 P. 아크네스 균주 혼합물의 상대 적인 조성의 변경을 보여주는 것이다. 놀랍게도, 단리물로서 사용되었을 때, 매우 느리게 성장한 균주 K8은 실험 5일 후 배양물 대부분을 점거하였다. 실험 전, 모든 균주를 그의 OD에 따라 정규화하였고, 이는 출발 배양물 중 바이오매스의 16%를 차지하였다. 실험 후, K8는 69%로 최고의 우위종 균주였다. 또한 오직 E3만이 바이오매스 중의 그의 지분을 증가시킬 수 있었다. C3 지분은 8%로 감소된 반면, A5, C1 및 F4는 1% 미만으로 감소되었다.

실시예 4: 화장품 제품에서 확인되는 일반 보존제인 DMDM 히단토인 및 벤조산을 이용한, 단리된 균주 및 균주 혼합물에 대한 최소 살균 농도(MBC: Minimum Bactericidal Concentration) 및 최소 억제 농도( MIC : Minimum Inhibitory Concentratio) 측정

보존제를 함유하는 화장품 제품을 인간 피험체의 피부 상에 적용시키는 것을 시뮬레이션하고, 상기 보존제가 피험체의 피부 마이크로바이옴에 미치는 효과를 평가하는 실험을 수행하였다. 보존제가 단일 균주에 미치는 효과, 또는 다중의 균주 혼합물에 미치는 효과 사이에 차이가 있는지 여부를 조사하였다.

4종의 개별 P. 아크네스 균주를 접종물로서 별개의 배양물에서 성장시켰다. 이어서, 각 배양물을 그의 OD에 따라 정규화시키고, 화장품에 일반적으로 사용되는 2종의 보존제인 DMDM 히단토인 또는 벤조산으로 챌린지하였다. 각 균주를 단독으로, 및 다른 균주와 함께 조합하여 시험하였다. 개별 균주 및 균주 조합을 24 h 동안 보존제에 노출시킨 후, 이어서, 아가 상에 플레이팅하여 보존제의 최소 살균 농도(MBC) 및 최소 억제 농도(MIC)를 측정하였다.

균주 A5, C3, F4 및 K8을 강화 클로스트리디움성 배지(RCM)(Becton-Dickinson, 카탈로그 번호 218081, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) 중에서 -80℃ 스톡으로부터 성장시켰다. 각 균주에 대해, 50 ml의 RCM에 0.5 ml의 OD 1.0 스톡을 접종하였다. 박테리아를 37℃에서 인큐베이션하면서, 일정 간격으로 OD를 측정하였다. MIC 시험을 위해, 박테리아를 지수 증식기에서 수거하고, 하기 기술되는 바와 같이 정규화시켰다. MBC 시험을 위해, 박테리아를 정지기에 도달할 때까지 성장시키고, 37℃에서 추가로 24 h 동안 인큐베이션한 후, 실험을 위해 프로세싱하였다. 이어서, 희석제로서 RCM 배지를 사용하여 샘플을 OD 0.5로 정규화시켰다.

RCM 배지 중에서 DMDM 히단토인(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재), 카탈로그 번호 PHR1358-1ML) 및 벤조산(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재), 카탈로그 번호 242381-25G)의 작업 용액을 제조하였고, 여기서, DMDM 히단토인에 대한 시험 농도는 1%, 0.25%, 0.125%, 및 0.1%이고, 오직 RCM으로만 구성된 블랭크 대조군의 경우, 2.5%, 0.63%, 0.31 및 0.25%였다. 이들 농도는 화장품에서 일반적으로 사용되는 양에 상응하는 희석률을 나타낸다. DMDM 히단토인은 EU에 의해 화장품에서 최대 1% 농도로 제한되고, 벤조산은 FDA에 의해 린스-오프-제품(rinse-off-product)에서는 2.5%로, 및 "리브-온-제품(leave-on-product)"에서는 0.5%로 제한된다. 96 웰 플레이트에서 노출을 수행하고, 각 조건에 대해 삼중으로 시험하였다. 각 샘플에 대해, 보존제를 함유하는 200 ㎕의 배지에 20 ㎕의 정규화된 박테리아 용액을 접종하였다.

균주를 챌린지 배지에 개별적으로 또는 혼합물로 첨가하였다. 각 균주에 대해, 균주가 개별적으로 첨가될 때, 또는 균주가 혼합물의 성분으로서 첨가될 때, (OD 측정값에 의해 측정된) 동일한 전체 박테리아 계수를 사용하였다. 혼합물은 2 균주 또는 4 균주로 구성되었다. 2 균주 혼합물은 균주 C3 및 K8을 포함하였고, 여기서, 각 균주는 박테리아 질량의 대략 50%를 차지하였다. 4 균주 혼합물은 균주 A5(~35%), C3(~55%), F4(~10%) 및 K8(~5%)을 포함하였다. MBC 및 MIC 시험, 둘 모두 96 웰 플레이트에서 셋업하였다. 플레이트 효과를 막기 위해, 가장 바깥쪽 웰을 물로 충전시켰다. MIC 시험을 위해, 박테리아를 혐기성 조건하에 액체 배양물 중에서 5일 동안 보존제 존재하에서 성장시킨 후, 이를 분석하였다(하기 표 5).

MBC 시험을 위해, 박테리아를 혐기성 환경에서 37℃하에 24 h 동안 RCM 배지 중 보존제에 노출시켰다. 24 h 후, 10 ㎕의 각 시험 웰을, 각 웰이 200 ㎕의 RCM 아가(Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재), 카탈로그 번호 91365-500 g)로 충전되어 있는 아가 플레이트(96 웰 플레이트)로 옮겨 놓고, 산소 부재하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 4일 후, 각 플레이트를 육안으로 관찰가능한 콜로니 성장에 대해 분석하여 MBC를 측정하였다(하기 표 6).

결과

시험관내 시험은 2개의 시나리오를 시뮬레이션하였다. MIC 시험은 P. 아크네스가 전형적 화장품 제품을 오염시킨다는 시나리오를 나타내었다. MBC 시험은 피부 상에 거주하는 박테리아가 국소적으로 적용된 화장품으로부터의 보존제에 노출된다는 시나리오를 시뮬레이션하였다.

예상대로, MIC 시험에서, 두 보존제 모두 액체 성장 배지 중에 존재할 때, 성장을 효율적으로 억제시켰다. 심지어 화장품에서 일반적으로 사용되는 농도보다 유의적으로 더 낮은 농도일 때에도, 개별 P. 아크네스 균주 또는 혼합물의 성장은 검출되지 않았다.

MBC 시험에서, 본 결과는 놀랍게도 MIC 시험과는 상이하였다. 일반 보존제인벤조산은 0.31% vol/vol 초과인 농도에서 모든 균주의 성장에 영향을 미쳤다. 그러나, 상이한 균주들 사이에 차이가 나는 것으로 관찰되었다. 균주 A5 및 C3은 0.31% 벤조산에의 24 h 노출로부터 생존한 반면, 균주 F4 및 K8은 상기 노출 후에는 성장하지 못하였다. 균주 혼합물은 개별 균주가 내성을 띤, 벤조산 최대 농도 0.31%까지만 성장하였다. "리브-온" 제품은 최대 농도 0.5%의 벤조산을 함유한다. 데이터에 기초하면, 상기 농도는 P. 아크네스 균주 중 단지 일부에만 영향을 미칠 수 있고, 나머지 다른 균주는 상기 농도에서 생존할 것이다.

DMDM 히단토인을 사용하여 동일 시험을 수행하였을 때, 놀라운 결과를 얻었다. 임의의 개별 균주가 단독으로 내성을 띠는 농도(0.1%)보다 높은 농도(0.13%)에서 균주 혼합물의 예상 밖의 성장이 관찰되었다. 이는 피부 상에 확립된 단일 박테리아 균주와 비교하였을 때, 피부 상에 확립된 P. 아크네스 균주의 박테리아 군집이 보존제, 예컨대, DMDM 히단토인을 함유하는 제품에의 노출로부터 개선된 생존을 보일 것이라는 것을 시사한다. 이는 개별 균주와 비교하여 박테리아 혼합물에 인간 피험체의 피부 상에의 확립 및 장기 지속을 위한 예상 밖의 이점을 제공한다. 시험된 임의의 개별 균주보다 두 균주의 조합이 DMDM 히단토인과 같은 포름알데히드 방출제에 대해 우수한 내성을 제공한다.

실시예 5: 여드름 환자에서의 임상 연구( ACBAC )

여드름 환자에서 임상 예비 연구를 수행하였다. 예비 연구에서는 마이크로바이옴의 박테리아 생착 뿐만 아니라, 안전성 및 효능 동향을 평가하였다. 예컨대, 안전성, 안정성 및 반응자 비율과 같은 기준을 포함하는 예비 연구에 기초하여, 예비 연구에서 시험된 혼합물들 중 하나를 더 큰 임상 연구를 위해 선택하였다.

예비 연구 스케줄

18-23세 사이의 14명의 피험체에서 6주 동안 예비 연구를 수행하였다. 1차 종점은 안전성 및 효능 동향이었다. 2종의 상이한 박테리아 제제: A2(P. 아크네스의 균주 C3 및 K8을 포함하는 2 균주 혼합물) 및 B4(P. 아크네스의 균주 C3, K8, A5, 및 F4를 포함하는 4 균주 혼합물)를 시험하였다. 실시예 2에 기술된 데이터와 일관되게, A2 제제를 받은 피험체의 경우, K8은 피부 상에서 C3 대비 더 높거나, 또는 동일한 상대적인 존재도를 보였으며, 이는 균주 C3은 더 느리게 성장하는 K8 균주가 피부에서 콜로니를 형성하는 데 도움을 준다는 것을 제안하는 것이다(도 25).

두 제제 모두 어떤 부작용도 없이 탁월한 안전성 프로파일을 보였다. 비염증 병변의 유의적인 감소 및 염증 병변은 감소하는 경미한 동향이 관찰되었다. 추가로, 일반적으로 건강한 피부에서는 긍정적인 발생으로 간주되는 피부 pH 감소가 관찰되었다. 세부미터(sebumeter) 측정은 잡음이 있기 때문에, 피지 생산의 잠재적 변화는 여전히 연구 중에 있다. 더욱 복잡한 세부테이프(sebutape) 측정 분석이 여전히 진행 중이다. 일부 피험체에서, 적용된 균주의 증가가 뚜렷하고, 유의적으로 일어났다(예컨대, 1일째와 비교하여 21일째 및 42일째, 두 시점 모두에서 적어도 15%만큼 증가). SLST의 앰플리콘 서열분석(NGS)으로 균주의 상대적인 존재도를 측정하였다. 상기 피험체를 수용자로 정의하였다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 수용자 피험체는 예를 들어, 비염증 병변 및 pH에 대해 영향을 받은 것으로 나타났다. 그러므로, 예비 연구로부터의 결과는 긍정적이었고, 더 큰 임상 연구로 이어졌다.

예비 연구 디자인

피험체를 2개 아암으로 무작위로 나누고, 여기서, 각 아암의 피험체에게는 상이한 박테리아 제제를 투여하였다. 박테리아 제제를 이중 맹검화하였으며: 아암 1: n=8 피험체는 제제 A2를 받았다. 아암 2: n=6 피험체는 제제 B4를 받았다. 1일째, 7일째, 21일째, 및 42일째에 피험체를 평가하였다. 1일째 내지 7일째 사이인 첫주째에 모든 피험체는 벤조일 퍼옥시드(BPO) 처리(1일 1회 적용)를 받았다. 7일째 내지 42일째 사이인 다음 5주 동안 모든 피험체는 박테리아 제제(1일당 2x로 겔 적용)를 받았다. 도 8a는 예비 연구의 디자인을 도시한 것이다.

1일째, 7일째, 21일째, 및 42일째 4회 방문 동안 피험체를 조사하였다. 하기 표 7에는 매회 방문 동안 측정되고, 문서로 기록된 측정이 제시되어 있다.

안전성

매회 방문 동안 예를 들어, 발적, 자극, 또는 임의의 다른 피부 문제를 시각적으로 평가함으로써 투여된 제제의 안전성을 평가하였다. 연구 동안 어떤 안전성 문제도 관찰되지 않았다. 7명의 피험체는 BPO 사용 동안(1일째 - 7일째) 피부 건조 또는 발적을 보고하였다. 그러나, 생 박테리아 투여 동안 피험체의 피부는 어떤 발적, 자극 또는 다른 장애도 보이지 않았다. 생 박테리아 투여와 연관된 어떤 부작용도 관찰되지 않았다.

마이크로바이옴 샘플

박테리아 종 분석(16S)

매회 방문 동안 마이크로바이옴 샘플 중 박테리아 종(16S)의 조성을 분석하였다. 도 9는 본 연구에서 모든 피험체의 피부 마이크로바이옴 중에서 가장 풍부한 9종의 박테리아의 상대 비율을 도시한 것이다. BPO 적용 후, 전체 P. 아크네스 집단의 감소가 관찰되었다(7일째)(도 11a). 이어서, 박테리아 적용 2주 후, 전체 P. 아크네스 집단의 유의적인 증가가 관찰되었다(21일째)(도 11a). 박테리아 적용 5주 후, 전체 P. 아크네스 비율의 경미한 감소가 관찰되었다(42일째). 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 이러한 감소는 마이크로바이옴의 균형잡힌 상태 및/또는 박테리아 집단의 다양성의 증가를 나타낼 수 있다. 도 11b는 박스 플롯으로서 P. 아크네스의 상대 비율을 보여주는 것이다. 이러한 관찰 결과는 본원에 기술된 제제 투여 이후의 마이크로바이옴 조성 발생에서의 긍정적인 동향을 나타낸다.

P. 아크네스의 균주 수준 분석( SLST )

단일 좌위 서열 타이핑(SLST)을 사용하여, 매회 방문 동안(1일째, 7일째, 21일째 및 42일째) 채취된 마이크로바이옴 샘플의 P. 아크네스 균주 수준 조성을 측정하였다.

1일째(기저 상태) 대부분의 샘플에서 일반적으로 발견되는 균주는 우위종이었다. 박테리아 제제 투여 이후, 대부분의 피험체에서는 피부 마이크로바이옴의 조성이 적용된 균주 쪽으로 변화된 것으로 관찰되었다. 일부 피험체에서, 적용된 균주의 증가가 뚜렷하고, 유의적으로 일어났다(1일째와 비교하여 21일째 및 42일째, 두 시점 모두에서 정의된 균주가 적어도 15%만큼의 양으로 증가). 이들 피험체는 수용자로 분류되었다. 일부 피험체에서, 적용된 균주의 증가는 덜 눈에 띄었다. 이들 피험체는 비수용자로 분류되었다. 도 10은 수용자 및 비수용자로서 분류된 피험체의 상대 비율을 도시한 것이다.

전반적으로, 피험체 중 43%는 수용자로 분류되었고, 57%는 비수용자로 분류되었다. 제제별로 나누었을 때, A2 제제 군에서는 50% 수용자 및 50% 비수용자인 것으로 관찰되었고, B4 제제 군에서는 33% 수용자 및 67% 비수용자인 것으로 관찰되었다. 두 군 모두 크기가 작았기 때문에, 두 군 사이의 차이는 통계적으로 유의적이지 않다.

수용자가 될 수 있는 가능성에 유의적인 영향을 미칠 수 있는, 예컨대, 연령, 성별, 항박테리아 제품의 사용, 또는 샤워 패턴과 같은, 다른 교란 변수는 관찰되지 않았다.

박테리아 종(16S) 및 균주 수준( SLST ) 분석

박테리아 종(16S) 데이터와 P. 아크네스의 균주 수준 데이터(SLST)를 관련시켰을 때, 1일째(기저 상태) P. 아크네스의 상대적인 존재도는 비수용자(41%)와 비교하여 수용자(34%)에서 더 낮은 것으로 관찰되었다. 연구 동안, 수용자에서의 P. 아크네스의 평균 상대적인 존재도는 42일째(최종 방문) 쪽으로 거의 2배(60%) 증가하였다. 전형적 16S 앰플리콘 서열분석을 사용하여 상대적인 존재도를 측정하였다. 당업계에 널리 공지된 본 방법에서, PCR에 의해 샘플 중의 모든 박테리아 DNA로부터 16S 리보솜 서브유닛의 특정 부분을 증폭시킨다. 앰플리콘 서열분석에 의해 샘플 중에 존재하는 상이한 박테리아 종을 확인한다. 차세대 서열분석을 통해 샘플 중의 모든 서열/종의 완전한 상대적인 분포를 평가할 수 있다.

t 검정에 의해 분석된 바, 비수용자 군은 연구 동안 단지 경미하고, 통계적으로 유의적인 P. 아크네스 증가만을 보였다(도 11).

마이크로바이옴 결과 요약

환자 서브세트에서, 적용된 박테리아는 투여 이후 효과적으로 확립되었다. 상기 피험체 서브세트는 연구 시점시에는 P. 아크네스의 비율이 더 낮았고, 연구 종료시에는 P. 아크네스 비율이 유의적으로 증가된 것을 특징으로 하였다.

여드름 병변 계수

1일째(기저 상태) 및 42일째(최종 방문) 방문 동안, 피부과 의사는 피험체 안면 상의 병변의 개수를 계수하였다. 병변 계수를 염증 병변 및 비염증 병변으로 나누었다.

비염증 병변

비염증 병변은 또한 면포로도 공지되어 있다. 면포는 개방성(블랙헤드) 또는 폐쇄성(화이트헤드)일 수 있다.

두 제제 모두에서 비염증 병변이 상당부 감소된 것이 관찰되었다(37%만큼 감소, P = 0.006). A2 제제에서의 감소는 55%(P = 0.05)에 상응하였고, B4 제제에서의 감소는 35%(P = 0.06)에 상응하였다(도 12).

수용자 및 비수용자 (그의 피부 마이크로바이옴 조성 변경이 일어난 피험체/그러한 변경이 일어나지 않은 피험체) 사이의 비염증 병변 감소를 비교하였을 때, 수용자 군 내에서 대부분의 병변 감소가 관찰되었다(도 13).

군을 수용자 및 비수용자로 계층화한 후, 그 효과는 두 군 모두에서 통계적으로 유의적이었고, 여기서, p 값은 0.03 미만이었다. 비수용자는 기저 상태(1일째)에서 전반적으로 더 적은 비염증 병변을 보였지만; 확산은 더 작고, 병변 감소는 덜 뚜렷하였는 바, 이에 결과는 여전히 고도로 통계적으로 유의적이었다(도 13).

염증 병변

염증 병변은 보통 폐쇄성 면포(비염증 병변) 벽의 파열로 이어진다. 이는 또한 정상으로 보이는 피부에서도 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 여드름에서의 염증 병변으로는 작은 빨간 돌기(구진), 농포, 큰 빨간 돌기(결절) 및 가성낭종(유동성 결절)을 포함할 수 있다.

박테리아 제제 투여 후, 염증 병변의 개수가 감소된 것이 관찰되었다. (두 제제간의) 전체 피험체의 평균은 처리 전에는 염증 병변 19개였고, 그 이후에는 16개였고, 이는 처리 후 대략 15% 감소에 상응한다. A2 제제는 대략 20% 감소시킨 반면(20/16), B4 제제는 대략 9% 감소시켰다(17/15.5)(도 14). 이러한 차이는 통계적으로 유의적이지 않았고, 수용자 대 비수용자 사이에 유의적인 차이도 관찰되지 않았지만(도 15), 통계적으로 유의적이지 못한 것은 가능하게는 적어도 부분적으로는 연구 기간이 짧고, 샘플 크기가 작으며, 전체 병변 개수가 낮고, 이로 인해 표준 편차가 커지는 것에 기인할 수 있다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 비염증 병변이 염증 병변의 전구체이기 때문에, 생 박테리아 처리는 비염증 병변 대비 염증 병변에 대하여 더 느리게 영향을 미치는 것으로 나타날 수 있다. 관찰된 데이터에 기초하여, 더욱 장기간 수행되는 연구에서 통계적으로 유의적인, 염증 병변 감소에 미치는 효과가 기대된다.

피지 측정

2가지 유형의 검정법을 사용하여 피험체의 피지 생산을 평가하였다. 세부미터 측정은 매회 방문 동안(1일째, 7일째, 21일째 및 42일째) 수행한 반면, 샘플링은 시간이 소요되기 때문에, 세부테이프 측정은 오직 1일째(기저 상태) 및 42일째(최종 방문)에만 수행하였다. 세부미터를 이용한 초기 판독값은 일반적인 동향을 나타내지 않았다. 그러나, 세부미터를 통해서는 간단히 빠르게 측정할 수는 있지만, 이는 외부 인자, 예컨대, 세척, 발한 등에 의해 강하게 영향을 받기 때문에, 일부 다른 검정법보다 신뢰성이 낮다.

피부 pH 측정

매회 방문 동안(1일째, 7일째, 21일째 및 42일째) pH 미터를 이용하여 피험체 피부의 pH를 측정하였다. 1일째와 42일째 사이에 피험체의 피부 pH는 0.4 포인트만큼 감소된 것으로 관찰되었다. pH 감소는 건강한 피부로의 긍정적인 발생인 것으로 간주된다.

비염증 병변과 유사하게, 효과는 수용자로서 분류된 피험체에서 더욱 뚜렷하게 나타났고, 비수용자로서 분류된 피험체에서는 덜 뚜렷하게 나타났다(도 16). 투여된 특정 제제에 기초한 상관관계는 관찰되지 않았다. 관찰된 효과는 문헌 [Nodake et al. (2015)]에 의해 보고된 것과 규모가 동일하다.

자기 평가

피험체는 매회 방문 동안 설문에 답변하였다. 설문은 피험체의 피부의 자기 평가 및 제품 사용에 관한 것과 관련이 있었다. 하기 피부 외양을 리뷰하였다: 여드름 외관, 여드름 개수, 여드름과 연관된 발적 외관, 여드름 크기, 여드름 중증도, 피부 유분 상태, 피부 번들거림, 피부 건조함, 피부 벗겨짐, 피부 평활도, 및 전반적인 피부 외관.

상기 언급된 질의의 평균을 이용하였을 때, 1일째와 42일째 사이에 피험체 중 85%는 개선을 보고하였고, 피험체 중 15%는 어떤 변화도 보고하지 않았다. 전체의 평균 개선(1일째 대 4일째의 전체 피험체 사이의 모든 질의의 평균)은 (척도 1-10으로) 1.62 포인트만큼 이루어졌다. A2 제제 사용자 사이에서(2.05 포인트) 및 수용자 사이에서(1.75 포인트) 만족도가 더 높은 것으로 관찰되었다.

전체 피험체 사이에서, "피부 건조함"(2.21 포인트만큼)이 가장 크게 개선된 것으로 관찰되었고, 그 다음으로, "전반적인 피부 외관"(2.07 포인트) 및 "피부 평활도"(2.00 포인트)가 개선된 것으로 관찰되었다.

톱 박스 분석에 기초하여, 척도를 3개 박스로 나누었다: 하위 = 포인트 1-3, 중간 = 포인트 4 - 7 및 상위 = 포인트 8-10. 도 17은 매회 방문 동안(1일째, 7일째, 21일째 및 42일째)의 피험체의 모든 답변의 평균값에 기초한 피험체의 분포를 보여주는 것이다. 연구 전 기간 동안 더 높은 점수 쪽으로 이동한 뚜렷한 변화가 육안으로 관찰된다. 자기 평가에서 피험체로부터의 제품의 높은 수용률 및 일반적인 양의 피드백이 관찰되었다.

도 18은 가장 흔하게 발견되는 15종의 P. 아크네스 균주의 상대적인 존재도의 열지도를 보여주는 것이다. 도 19는 사진에 기초한 비교로부터의 데이터를 보여주는 것이다. 도 20은 환자 평가 요약으로부터의 데이터를 보여주는 것이다. 일부 피험체는 3회차 방문시 초기에 감소를 보여지만, 4회차 방문시까지 일반적인 개선을 보였다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 새롭게 확립된 균주에의 적응이 일시적인 발진의 원인이 될 수 있다. 연구 시작 및 종료시, 병변 계수 연구를 수행하였다. 대다수의 피험체는 여드름 병변 감소를 보였다.

예비 연구 요약

비염증 병변 개수의 통계적으로 유의적인 감소가 관찰되었다. 이는 놀랍게도 치료 기준 치료에서 일반적으로는 오직 비염증 병변의 감소만이 장기간에 걸쳐 관찰되었기 때문이다. BPO와 다른 최신 치료법을 비교하는 종합적 베타-분석에(문헌 [Seidler and Kimball, 2010]), 위약 아암은 6.7%만큼의 비염증 병변 감소를 보였다. 본원에 기술된 연구에서, 수용자 군은 거의 50%의 감소를 보였는데, 이는 위약을 능가하는 효과가 관찰될 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 비염증 병변을 표적화할 수 있는 능력에 있어 효과 크기는 잠재적으로는 현행 최신 치료법을 능가할 수 있다.

16S 마이크로바이옴 데이터, 및 P. 아크네스 집단의 균주 수준 분석과의 상관관계에 기초하여, (수용자로서 분류된) 적용된 박테리아 균주를 수용한 피험체는 모든 다른 박테리아와 비교하여 그의 P. 아크네스의 상대 비율의 증가를 보인 것으로 자명하게 나타났다. 비수용자는 연구 전 기간 동안 그의 P. 아크네스의 상대 비율을 그대로 유지하였지만, 기준선 방문시(1일째)의 P. 아크네스의 상대 비율이 더 높은 것을 특징으로 하였다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 비수용자에서는 이미 P. 아크네스에 의해 완전하게 콜로니가 형성될 수 있고, 이로써, 박테리아 균주 투여 이전에 수행된 소독 처리가, 모낭에 그대로 숨어있을 수 있는, 상주하는 P. 아크네스 집단을 제거하는 데 충분하지 않을 수 있다. 그에 반해, 수용자에서는 아직 완전하게 콜로니가 형성되지 않은 상태일 수 있고, 이를 통해 박테리아 균주 투여 이전의 소독 처리로 상주하는 P. 아크네스 집단을 감소시키거나, 제거할 수 있다. 변형된 소독 방법을 통해 수용자의 비율을 증가시킬 수 있다.

피부 pH에 대하여 관찰된 효과는 피부 박테리아를 사용하여 수행된 다른 무작위화 이중 맹검 임상 시험에 의해 보고된 것과 크기가 동일하였다(문헌 [Nodake et al., 2015]). pH가 하락하였을 뿐만 아니라, 연구 전 기간 동안 그의 변동은 감소하였으며, 이는 피험체의 피부 pH가 정상화되었음을 제안하는 것으로 이 또한 고무적인 일이다.

예비 연구에서 다수의 피험체는 더 매끄러운 피부를 보고하였는데, 이는 예비 연구에 참여한 피부과 의사에 의해 문서로 기록된 바와 같은 비염증 병변의 감소와 상관관계가 있다. 추가로, 다수의 피험체는 지성성이 더 작은 피부를 나타내었으며, 이는 피지 생산의 감소에 대한 지표가 될 수 있다.

본 데이터는 균주 수준에서의 피부 마이크로바이옴의 조절이 우수한 내성을 보였다는 것을 나타낸다. 대다수의 피험체는 그의 피부 병태의 전반적인 개선을 경험하였가. 구체적으로, 가려움 감소, 눈에 띄는 여드름 병변의 감소, 및 더욱 우수한 전반적인 피부 외관이 보고되었다. 어떤 피험체도 유의적인 악화 또는 장기간의 발진을 경험하지는 않았다. 본 임상 연구에서 중도 탈락한 피험체는 없었다.

물질 및 방법

P. 아크네스 제조에 사용된 물질로는 하기의 것을 포함하였다: 1 L 쇼트(schott) 병; 세포 배양 플라스크 마그네트; 혈청용 피펫; 필터가 장착된 피펫 팁, 1,000 ㎕; 팔콘(Falcon); 큰 배치 회전용 컵; 페트리 디쉬; 시린지 2.5 ml; 시린지용 스트로; 시린지용 캡; 및 에펜도르프(Eppendorf). 사용된 화학 물질로는 하기의 것을 포함한다: 나트로솔® 250 Hx 팜., 하이드록시에틸셀룰로숨(Pharm., Hydroxyethylcellulosum); 캣-헤페(Kat-Hefe) 배지; 덱스트로스(α-D-글루코스), 무수 96%, 알드리치(Aldrich), ref:158968; 염화나트륨(NaCl); 강화 클로스트리디움성 아가; 및 카세인 유래의 펩톤, 트립신 분해물.

박테리아 배지 제조: 각 리터에 대해 혼합물을 액체 프로그램으로 오토클레이빙하고; 아가를 분포시키기 전에, 200 ㎕의 푸라졸리돈(Furazilidone) 100 mg/ml를 각 1 L씩의 최종 부피에 첨가하고; 제조된 RCM 아가를 페트리 디쉬 및 바닥이 평평한 96 웰 플레이트(각 웰마다 200 ㎕씩)에 분포시키는 것을 포함하는, 공급업체의 설명서에 따라 RCM 아가를 제조하였다.

하기 용액을 제조하였다:

1) 20 g의 캣-헤페 단백질; 5 g의 NaCl; 및 900 ml의 물을 포함하는, 1 L 쇼트 병 중의 배지 기반 용액 믹스

2) 30 g의 덱스트로스(α-D-글루코스) 및 100 ml의 물을 포함하는, 100 ml 쇼트 병 중의 10 x 덱스트로스 용액 믹스.

두 용액 모두 오토클레이빙하였다. 무균 방식으로 냉각시킨 후, 100 ml의 10 x 덱스트로스 용액을 배지 기반 용액(1 L 병)에 첨가하여 최종 배지를 형성하였다. 최종 배지는 하기 농도를 함유하였다: 20 g/L의 캣-헤페 단백질; 5 g/L NaCl; 및 30 g/L의 덱스트로스.

2.5 g의, 카세인 유래의, 트립신 분해물인 펩톤 및 1 L 물을 포함하는 펩톤 용액 믹스를 1 L 쇼트 병에서 제조하였다. 상기 용액을 액체 프로그램으로 오토클레이빙하였다. 최종 용액은 0.25% 펩톤을 함유하였다.

박테리아 배양물

박테리아 사전 배양물 제조는 확인된 순수 균주로부터 출발하였다. 각 팔콘을 50 ml의 RCM 배지로 충전시켰다. 원하는 균주를 함유하는 시린지를 실온에서 해동시키고, 균주에 따라 상응하는 팔콘으로 0.5 ml 겔을 전달한다. 박테리아 배양물을 37℃에서 성장시킨다.

박테리아 배양물을 생성하는 단계는 하기에 개요되어 있다:

· 50 ml 사전 배양물을 750 ml 멸균 세포 배양 플라스크 중의 450 ml 캣-헤페 배지에 첨가하였다(주 배양물). 샘플을 37℃ 인큐베이터에 배치하고, 정기적으로 OD를 측정함으로써 성장을 모니터링하였다.

· 샘플을 10 min 동안 스핀 다운시키고, 상청액을 제거하였다.

· 샘플을 0.25%의 카세인 유래의, 트립신 분해물인 펩톤 50 ml에서 1회 세척하였다.

· 샘플을 10 min 동안 스핀 다운시키고, 상청액을 제거하였다.

· 각 펠릿을 0.25%의 카세인 유래의, 트립신 분해물인 펩톤 50 ml 중에 재현탁시켰다.

· 박테리아 현탁액을 정규화시켰다.

· 원하는 제제에 따라 박테리아 혼합물을 제조하였다.

· 멸균 Hec 분말을 첨가하여 겔을 제조하고, 이를 통해 휴지시킬 수 있었다.

· 시린지를 충전시켰다.

P. 아크네스 C3 균주 및 P. 아크네스 K8 균주는 각각 2017년 10월 19일자로 독일 브라운슈바이크 38124 인호펜슈트라쎄 7베에 소재하는 DSMZ(독일 생물 자원 센터(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH))에 기탁되었다.

실시예 6: 대규모 임상 연구를 위한 P. 아크네스 제조

식품 등급의 방법을 사용하여 대규모 임상 시험에서 사용되는 박테리아 균주 샘플 뿐만 아니라, 박테리아를 포함하지 않는 위약 샘플을 제조하였다. 제조된 샘플은, 밀봉된 적층된 알루미늄 호일 사쉐로 무균 방식으로 패킹되고, -80℃에서 보관된, 분취량당 적어도 1x10⁷ cfu 농도로 2종의 P. 아크네스 균주의 1:1 블렌드를 함유하는 1 ml 분취량의 겔 배지 9,000개, 및 동일한 사쉐로 패킹되고, -80℃에서 보관된, 박테리아를 포함하지 않는 1 ml 분취량의 겔 배지 5,500개(위약 샘플)를 포함하였다. P. 아크네스 박테리아 균주를 제조하는 데 사용된 방법 및 연관된 결과는 본원에 기술되어 있다. 연구는 2 단계로 나뉘어졌다. 파트 1에서는 박테리아의 성장, 수거, 및 보관을 위한 프로토콜을 개발하고, 평가하였다. 파트 2는 박테리아 블렌드 및 위약 샘플의 제조 및 패키징으로 구성되었다.

물질 및 방법

균주, 배지 및 배양 조건

멸균 1 ml 시린지 중 2.5% 하이드록시에틸셀룰로숨(HEC)에 희석된 배양물로서 P. 아크네스 균주 K8 및 C3을 수득하였다. 시린지를 -80℃에서 보관하였다.

스톡 배양물: 시린지 배양물로부터의 약 0.05 ml를 뇌 심장 침출 아가(BHIA: Brain Heart Infusion Agar; Tritium Microbiologie: 네덜란드 에인트호번 소재) 플레이트 상에 접종하고, 혐기성 자에서 37℃하에 밤새도록 인큐베이션함으로써 균주 K8 및 C3을 제조하였다. 인큐베이션 후, 플레이트로부터의 박테리아 물질을 희석시키고, 새 BHIA 플레이트 상에 확산시켜 단일 콜로니를 수득하였다. 37℃에서 밤새도록 혐기성 방식으로 인큐베이션한 후, 각 균주로부터의 단일 콜로니를 BHI 브로쓰(Tritium Microbiologie)에 접종하고, 37℃에서 밤새도록 혐기성 방식으로 인큐베이션하였다. 생성된 배양물을 멸균 60% 글리세롤 용액과 혼합하여 최종 글리세롤 농도가 15%가 되도록 만들고, 이들 다수의 서브샘플로 나누고, -80℃에서 보관하였다. 상기 스톡 배양물을 사용하여 발효 실험 1.1, 1.2, 1.3 및 2.1에서 사용되는 BHI 배지 중 사전 배양물을 접종하였다. 실험 2.2를 수행하기 전에 시린지 배양물로부터 출발하여 신선한 스톡 배양물을 제조하였다.

본 연구에서 사용된 배지는 하기와 같았다: 뇌 심장 침출 브로쓰(BHI) 및 뇌 심장 침출 아가(BHIA); 배지 A: 3% 덱스트로스, 0.5% 염화나트륨, 2% 효모 추출물(Ohly Kat: 독일 소재), pH 6.7; 배지 B: 배지 A + 1% 대두 펩톤(AM41, Organotechnie: 프랑스 라쿠르뇌브 소재), pH 6.7; 배지 C: 3% 덱스트로스, 0.5% 염화나트륨, 2% 효모 추출물(Springer 0251/0-MG-L, Biospringer: 프랑스 메종-알포르 소재), pH 6.7; 배지 D: 배지 C + 1% 대두 펩톤, pH 6.7; 및 배지 E: pH 6.3으로 조정된 배지 D.

하기 기술되는 바와 같이, 3개는 파트 1에서, 및 2개는 파트 2에서, 총 5개의 발효 실험을 수행하였다.

실험 1.1:

P. 아크네스 K8 및 C3을 100 ml 배지 A, B, C 또는 D를 함유하는 100 ml 플라스크에서 배양하였다. BHI 중 밤새도록 배양된 배양물로부터의 10 ml를 배지에 접종하였다. 37℃에서 24 h 동안 진탕 없이 인큐베이션되는 혐기성 자에서 플라스크를 보관하였다.

실험 1.2:

온도, 교반, 및 pH 조절 장치가 장착된 0.5 L 부피 발효조 베쓸(Multifors 2 시스템, Infors: 스위스 보트민겐 소재) 중 400 ml 배지 D에서 P. 아크네스 K8 및 C3을 배양하였다. BHI 중 밤새도록 배양된 배양물 1 ml를 접종하여 제조된 배지 D에서 밤새도록 배양된 배양물 40 ml(10% 접종물)를 배지에 접종하였다. 배양 조건은 하기와 같았다: 온도 37℃; 교반 속도 150 rpm; 2.5 N 수산화나트륨을 이용하여 pH 6.0으로 pH 조절 또는 pH 조절되지 않음; 95% N2/5% CO2(유속 125 ml/min)로 헤드 스페이스 플러싱.

실험 1.3:

셋업 및 배양 조건은 실험 1.2에 기술된 것과 동일하되, 단, 예외적으로, 배지 D에서 밤새도록 배양된 배양물 8 ml(2% 접종물)를 배지에 접종하였다.

실험 2.1:

온도, 교반, 및 pH 조절 장치가 장착된 3 L 부피 발효조 베쓸(Applikon Biotechnology: 네덜란드 델프트 소재) 중 2.0 L 배지 D에서 P. 아크네스 K8 및 C3을 배양하였다. 접종 방법 및 배양 조건은 실험 1.3에 기술된 것과 동일하였다.

실험 2.2:

셋업, 접종 방법 및 배양 조건은 실험 2.1에 기술된 것과 동일하되, 단, 예외적으로, 배지는 pH 6.0으로 조정되었고(배지 E; 문단 2.1.2 참조), 교반 속도는 250 rpm으로 증가되었다.

수거

P. 아크네스 균주를 포함하는 사쉐를 제조하기 위해 실험 2.2를 사용하였다. 두 균주 모두, 주변 온도에서 1 L 원심분리 병에서 16,000 x g로 10 min 동안 원심분리하여 2.0 L 부피의 배양물을 수거하였다. 펠릿을 200 ml의 0.25% 대두 펩톤 (AM41, Organotechnie: 프랑스 라쿠르뇌브 소재) 용액 중에 재현탁시키고, 한번 더 원심분리하였다. 박테리아를 주변 온도에서 200 ml의 0.25% 대두 펩톤 용액 중에 재현탁시키고, 30 min 이내에 프로세싱하였다. 상기 농축된 현탁액의 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)는 P. 아크네스 C3의 경우, 54.3, 및 P. 아크네스 K8의 경우, 48.4였다.

P. 아크네스를 포함하는 겔 배지 및 위약 겔 배지

19 ml 및 21 ml 부피의 P. 아크네스 C3 및 K8의 농축된 현탁액을 각각 0.25% 대두 펩톤 용액 중에서 희석시켜 최종 부피가 2.0 L가 되도록 만들었다. 상기 현탁액에 OD₆₀₀은 1.1이었고, OD₆₀₀ 기준으로 균주 간의 비율은 1:1이었다. 격렬하게 혼합시키면서, 멸균된 HEC를 하기 현탁액에 용해시켜 최종 농도가 1.5% (w/v)가 되도록 만들었다. 이를 9회 반복하였다. 배치를 혼합하여 총 부피 18 L의 P. 아크네스 K8 및 C3을 포함하는 겔 배지를 수득하였다. 호일 사쉐로의 패키징을 시작하기 전에, 겔 배지를 주변 온도에서 1 h 동안 유지시켰다. 위약 겔 배지는 최종 농도 10 ㎕/L로 이소발레산과 함께 0.25% 펩톤 용액 중의 1.5% HEC로 구성되었다. 총 부피 10 L로 제조되었다. HEC를 용해시키는 방법은 P. 아크네스를 포함하는 겔 배지에 대하여 기술된 것과 동일하였다.

사쉐 제조, 패키징 및 보관

사쉐 패키징 장치를 이용하여 독립 실행으로 P. 아크네스를 포함하는 겔 배지 또는 위약 겔 배지를 함유하는 사쉐를 제조하였다. 상기 장치는 펌프, 사쉐 제조 섹션 및 열 전사 인쇄 장치로 구성되었다. 겔 배지를 용기로부터 사쉐 제조 섹션으로 펌핑하였다. 사쉐 제조 섹션은, 그 주변에서 사쉐 폴딩이 이루어진, 멸균된 스테인리스 스틸 배관(하나는 겔 배지용 및 하나는 질소 가스용), 및 130℃ 온도에서 작동하는 수직 및 수평 밀봉 요소로 구성되었다. 사쉐 제조 섹션 앞에 위치하는 인쇄 장치를 사용하여 사쉐에 라벨링하였다. 삼면을 따라 폴딩하고, 가열 밀봉하여(실 너비 대략 12 mm) 65 x 65 mm의 적층된 알루미늄 호일로부터 사쉐를 제조하였다. 최종 사쉐 크기는 65 x 30 mm였고, 부피는 대략 2 ml였다. 장치는 1 min당 28개의 사쉐인 제조 속도, 및 사쉐 1개당 1.2(± 0.15) 그램인 겔 배지 정량으로 작동하였고; 사쉐 부피 중 나머지 부분은 N2 헤드스페이스이다. 충전 동안, 사쉐의 헤드 스페이스를 멸균 질소 가스로 플러싱하였다. 충전 작동 시점 시점에 및 중단 후, 10 내지 20개의 사쉐가 폐기되었다. 충전 작동 종료 시점에, 미생물학적 분석(P. 아크네스 생존가능한 계수 및 병원체 분석)을 위해 겔 배지 샘플을 채취하였다. P. 아크네스를 포함하는 겔 배지를 함유하는 사쉐를 플라스틱 백에 패킹하였다(백 1개당 사쉐 18개). 충전 작동이 진행되는 동안, 사쉐는 1,000개 내지 1,500개의 사쉐가 연속하여 -80℃ 냉동고로 옮겨졌다. 수송시까지 사쉐를 -80℃에서 보관하였다. P. 아크네스를 함유하는 사쉐, 및 위약 사쉐를 함유하는 사쉐는 독립 실행으로 제조되었다.

분석

성장 측정 및 미생물학적 분석

OD₆₀₀ 측정에 의해 배양물 중의 박테리아 질량을 측정하였다. 37℃에서 24 내지 30 h 동안 혐기성 방식으로 인큐베이션된, BHI 아가 상의 연속 희석액의 플레이팅에 의해 배양물 및 겔 배지 중 P. 아크네스의 생존가능한 계수를 측정하였다. P. 아크네스 및 위약을 포함하는 겔 배지 중 병원체의 부재를 확인하기 위해, 외부 시험실(Merieux NutriSciences: 네덜란드 에데 소재)에 의해 하기 표 9에 열거된 하기 병원체에 대해 겔 배지 샘플을 분석하였다:

FACS 유세포 분석법

FACS 유세포 분석법을 사용하여 배양물의 총 계수 및 생존능을 측정하였다. 세포를 2종의 핵산 착색 염료(녹색 형광성 SYTO™ 9 염료 및 적색 형광성 프로피디움 아이오다이드)의 혼합물로 염색한 후, 라이브/데드™ 백라이트™ 박테리아 생존능 및 계수 키트(LIVE/DEAD™ BACLIGHT™ Bacterial Viability and Counting Kit)(ThermoFisher scientific 카탈로그 번호 L34856)를 사용하여 생존능을 측정하였다.

결과

파트 1

파트 1의 주요 목표는 P. 아크네스 균주의 성장을 평가하고, 그에 대한 프로토콜을 개선시키고자 하는 것이었다. 프로토콜은 2 내지 3일 동안 플라스크에서 무산소 배양하는 것으로 구성되었으며, 이를 통해 OD₆₀₀ 0.6 내지 1.2인 최종 바이오매스 수율을 얻었다. 실험은 상기 수율을 증가시키고, 배양 시간을 단축시키고, 규모 확장가능한 배양 시스템을 사용하는 것을 목표로 하였다.

실험 1.1:

수율과 관련하여 배지 조성을 최적화시키기 위한 실험 1.1을 수행하였다. 효모 추출물의 두 공급원을 비교하고, 대두 펩톤을 배지에 첨가하는 것이 미치는 효과를 측정하였다. 박테리아를 플라스크에서 배양하였다. 하기 표 10에는 배양물의 생존가능한 계수 및 OD₆₀₀이 제시되어 있다. 데이터는 캣 효모 추출물을 이용하였을 때보다 스프링거(Springer) 효모 추출물을 이용하였을 때, 더 높은 OD₆₀₀ 값 및 생존가능한 계수를 달성한 것으로 나타났다. 추가로, 대두 펩톤이 OD₆₀₀에 대해, 및 보다 적게는, 생존가능한 계수에 대해 유익한 효과를 미치는 것으로 검출되었다. 균주 C3의 경우보다 균주 K8의 경우에 더 높은 OD₆₀₀ 및 생존가능한 계수를 얻었다. 상기 결과에 기초하여, 펩톤 및 스프링거 효모 추출물을 함유하는 배지를 이용하여 후속 실험을 수행하였다.

실험 1.2:

발효조에서의 배양 동안의 균주의 성장 특징을 시험하고, 일정한 pH 6.0에서의 배양 효과를 측정하는 실험 1.2를 수행하였다. OD₆₀₀ 및 생존가능한 계수 측정 결과는 각각 도 22 및 23에 제시되어 있다. pH가 조절된 배양물은 pH가 조절되지 않은 배양물보다 실질적으로 더 높은 OD₆₀₀ 및 생존가능한 계수를 보였다. pH가 조절되지 않은 배양물의 생존가능한 계수는 4 h 인큐베이션 이후보다 21 h 인큐베이션 이후에 대략 25배 더 낮았다. 이러한 관찰 결과는 본 실시양태에서, 아마도 pH가 조절되지 않은 배양물의 낮은 pH(pH 5.25)에 기인하여 박테리아가 사멸하였다는 것을 시사한다. 도 22에 도시된 결과 또한 최대 OD₆₀₀ 값은 21 h 배양 이내에 도달하였다는 것을 나타내었다. pH 조절된 발효조의 배양 동안의 염기 적정 기록(나타내지 않음)은 정지기는 이미 접종 후 약 14 h 경과시에 도달하였다는 것을 나타내었다. 실험 1.1의 결과와 달리, 균주 K8보다 균주 C3에 대해 더 높은 OD₆₀₀ 및 생존가능한 계수를 얻었다. 이러한 결과에 기초하여, pH 6.0으로 설정된 pH 조절을 이용하여 후속 발효를 수행하였다.

보관 이전 및 보관 3주 후의 생존가능한 계수를 측정함으로써 -80℃에서 박테리아를 보관하는 동안의 겔 배지 중의 P. 아크네스 C3 및 K8의 안정성을 시험하였다. 박테리아를 수거하고, 겔 배지 (2.5% HEC) 중에 현탁시켰다. pH 조절된 K8 배양물, 및 pH가 조절되지 않은 C3 및 K8 배양물에서는 보관 기간 동안 생존가능한 계수의 어떤 감소도 나타나지 않거나, 또는 소폭의 감소만이 나타났다. 그에 반해, pH 조절된 C3 배양물의 생존가능한 계수는 약 60%만큼 감소되었다(하기 표 11).

실험 1.3:

실험 1.2의 관찰 결과를 확인하고, 접종 수준을 10%에서 2%로 감소시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해 실험 1.3을 수행하였다. 배양 동안의 OD₆₀₀은 도 24에 제시되어 있다. 실험 1.2의 결과와 일치하여, 균주 K8보다 균주 C3 경우에 더 높은 OD₆₀₀이 관찰되었다. 본 결과는 또한 균주 C3이 균주 K8보다 조금 더 빠르게 성장한다는 것도 제안한다. 추가로, 본 결과를 통해, 접종 수준을 2%로 감소시킬 수 있다는 것도 확인할 수 있었다. OD₆₀₀ 측정 결과, 정지기는 균주 C3 및 K8의 경우, 각각 접종 후 약 14 h 및 18 h 경과시에 도달한 것으로 나타났다.

파트 2

위약 사쉐 제조

위약 겔 배지를 함유하는 대략 6,000개의 사쉐를 제조하였다. 사쉐 1개당 평균 정량은 1.25 g(범위 1.10 내지 1.40 g)이었다. 미생물학적 분석 결과, 물질은 살모넬라, 리스테리아 모노사이토게네스, 엔터로박테리아세아에, 술파이트 환원 클로스트리디아 및 코아귤라제 양성 스타필로코카이를 함유하지 않았다는 것이 입증되었다(하기 표 12).

P. 아크네스를 포함하는 사쉐 제조

균주 C3 및 K8을 배양하였다. 발효 기간은 14 h였다. 실험 1.2 및 1.3과 일치하여, 균주 K8보다 균주 C3 경우에 약간 더 높은 OD₆₀₀ 및 생존가능한 계수가 관찰되었다. OD₆₀₀ 값에 기초하여, 균주 C3 및 K8의 농축된 배양물을 47:53의 비율로 혼합하여 최종 비율 1:1의 블렌드를 수득하고, 여기에 1.5% HEC를 첨가하고, 이를 사쉐로 패킹하였다. 하기 표 13에는 결과가 요약되어 있다. 박테리아의 현미경 사진(도 24)은 P. 아크네스의 전형적인 형태를 보여주었다. 생존가능한 계수 측정 이외에도, FACS 유세포 분석법에 의해 박테리아 농도 또한 측정하였다(표 4). 이러한 방법을 통해 2종의 상이한 DNA 염료에 의해서 살아있는 세포, 손상된 세포 및 사멸 세포를 구별할 수 있다. 생존가능한 계수 및 FACS-살아있는 세포에 대한 결과는 두 균주 모두 유사하였다. 균주 C3 및 K8 배양물 중의 FACS-사멸 세포의 비율(%)(전체 대비 비율(%))은 18% 및 40%였다. 예상 밖으로, 농축된 세포 현탁액 중의 FACS-사멸 세포의 비율(%)은 C3 및 K8의 경우, 각각 8% 및 16%로 배양물 중에서보다 더 낮았다.

대략 총 10,000개의 사쉐를 제조하였고, 그 중 9,000개의 사쉐를 플라스틱 백에 패킹하였다(백 1개당 사쉐 18개). 사쉐 1개당 겔 배지의 정량을 사쉐 1개당 1.2 g으로 조정하였다. 상기 정량을 통해 정규 개봉 및 압착시 사쉐로부터 적어도 1 mL가 제거될 수 있었다. 사쉐 1개당 겔 배지의 정량을 매 500개 내지 1,000개의 사쉐마다 측정하였다(각 시점에 6회 반복). 사쉐 1개당 정량은 1.17 g 내지 1.38 g으로 달랐고, 평균은 1.28 g이었다. 사쉐 제조에 소요된 총 실행 시간은 7 h였다. 사쉐 중 겔 배지의 생존가능한 계수를 제조 실행 과정 동안 4회에 걸쳐 측정하였고, 이는 3.8 x 10⁷ 내지 4.3 x 10⁷ cfu/ml로 다르게 나타났고, 여기서, 평균은 4.0 x 10⁷ cfu/ml였다(하기 표 13). 본 결과에 기초하여, -80℃에서 보관하기 전, 사쉐 1개당 평균 생존가능한 계수는 5.1 x 10⁷ cfu였다. -80℃에서의 7일 보관 후, 사쉐 중 겔 배지의 생존가능한 계수는 2.9 x 10⁷ cfu/ml였으며(표 4), 이는 사쉐 1개당 3.7 x 10⁷ cfu에 상응하는 값이다. 미생물학적 분석 결과, P. 아크네스 박테리아의 블렌드를 포함하는 겔 배지는 살모넬라, 리스테리아 모노사이토게네스, 엔터로박테리아세아에, 술파이트 환원 클로스트리디아 및 코아귤라제 양성 스타필로코카이를 함유하지 않았다는 것이 입증되었다(하기 표 12). 하기 표 14에는 사쉐 제조를 위해 사용된, 적층된 알루미늄 호일의 명세 사항이 제시되어 있다.

요약

대체 효모 추출물 공급원을 사용하고, 펩톤을 포함시킴으로써 P. 아크네스 C3 및 K8 배양을 위한 배지 조성을 개질시켰다. P. 아크네스 균주는 pH 조절된 발효조에서 14 h 경과 후 대략 5 x 10⁸ cfu/ml에 상응하는, OD₆₀₀ 4.0 내지 5.0인 최종 바이오매스 수율로 성장하였다. 5.1 x 10⁷ cfu/사쉐의, P. 아크네스 균주 C3 및 K8의 1:1 블렌드를 함유하는 총 9,000개 초과의 사쉐를 제조하고, -80℃에서 보관하였다.

배양 방법을 변형시킨 결과(대체 효모 추출물 공급원, 배지 중 펩톤 포함, 및 pH 조절된 발효조에서의 배양), P. 아크네스 C3 및 K8의 수율은 5 내지 10배 더 높게 나타났다.

배양물 또는 현탁액의 경우, 5 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸ cfu/ml일 때, OD₆₀₀ 1.0으로, 생존가능한 계수와 OD₆₀₀ 사이의 비는 실험 전 기간 동안 매우 일관되게 나타났다. 다수의 다른 박테리아, 예를 들어, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 비교하였을 때, 상기 세포 농도는 낮다. 이는 P. 아크네스 세포가 상기 종들의 세포보다 더 크다는 것을 제안하는 것이다.

-80℃에서 1주 동안 보관된 사쉐 중 P. 아크네스의 농도는 냉동 이전의 농도보다 단지 약간 더 낮을 뿐이었으며(각각 4.0 x 10⁷ 및 2.9 x 10⁷ cfu/ml)(표 4),이는 박테리아가 냉동 이벤트에서도 잘 생존하였다는 것을 시사하는 것이다.

실시예 7: 대규모 임상 연구

예비 연구 분석에 기초하여, 하기 측면들을 대규모 임상 연구에 도입하였다: 시험을 위해 제제 A2를 선택하였고; 23명의 피험체를 활성 아암에, 및 23명을 위약 아암에 배정하였고; 마이크로바이옴 중 일부 종의 균주 수준 분석을 포함하고; 수용자의 비율을 증가시키기 위해 최적화된 소독 프로토콜을 포함한다. 병변 계수가 더 높은 대상, 여드름 등급이 더 높은 대상, 및 순수한 10대 여드름(호르몬 여드름, 성인 여드름 등 배제)을 앓는 피험체인지 여부에 기초하여 여드름 환자를 선택하였다.

피험체는 안면 보통 여드름 등급이 1.5 - 4(Leeds 척도)인 개체이다. 피험체는 연령인 16 - 23세인 남성 및 여성, 둘 모두를 포함한다.

1일째, 모든 피험체는 벤조일 퍼옥시드 제품(Akneroxid 겔 50 mg/g, Almirall)을 받아 7일 동안(1일째-7일째) 얼굴에 1일 1회 도포한다. 8일째, 피험체는 시험 제품(박테리아 제품 또는 위약)을 받는다. 피험체는 세수 후 (아침 저녁으로) 1일 2회에 걸쳐 시험 제품을 얼굴에 도포한다. 피험체는 11주 동안(8일째-84일째) 상기 제품을 계속해서 도포한다. 이 단계 후에는 도포하지 않는 2주 동안 추적 검사 단계가 진행된다. 1일째, 7일째, 28일째, 56일째, 84일째, 91일째 및 98일째 측정 및 샘플 채취를 진행한다(하기 표 8, 도 8b). 표 8에서, "X"는 각각의 표시된 연구일자에 수행된 분석 방법을 나타내는 것이다.

측정 방법

병변 계수는 숙련된 연구원에 의해 육안으로 수행된다. 안전성 평가는 연구원 또는 연구 간호사에 의해 발적, 자극 또는 임의의 다른 피부 문제에 대한 육안 평가로 평가된다. 매 방문시 영상을 촬영한다. 실시예 5에서 논의된 예비 단계 연구 동안에는 일반 카메라가 사용되었지만, 더 큰 임상 연구에서는 숙련된 연구원 또는 연구 간호사에 의해 가시 광선, 교차 편광 또는 청색 형광으로 영상 촬영이 수행되고, 이를 통해 피부 상태를 문서로 기록한다.

세부미터를 이용하는 지질 분석은 연구 간호사에 의해 수행된다. 세부테이프를 이용하는 지질 분석은 피부내 피지의 함량 및 정량에 관하여 더욱 상세한 사항을 제공한다. 측정을 위해, 70% 이소프로판올이 함유된 면봉 또는 유사 제품을 이용하여 시험 부위의 기름기를 제거함으로써 피험체의 피부를 준비한다. 이어서, 피험체의 피부(이마) 상에 세부테이프를 30분 동안 놓고 측정한다.

pH 분석은 피부 pH 미터를 이용하여 수행한다. 어떤 피부 준비도 없이 진행되는 비침습적인 즉석 방법이다.

멸균 면봉을 이용하는 마이크로바이옴 분석은 면봉을 피부 상에서 30초 동안 돌려 가면서 이동시켜 피부 표면 상에 거주하는 박테리아 군집을 수집하는 비침습적인 즉석 방법이다.

스트립 3-S-바이오키트(Skin surface Technology)를 이용하는 마이크로바이옴 분석을 통해 모낭 내 박테리아 군집에 도달할 수 있다. 이는 피부 친화성 시아노아크릴레이트 한 방울을 포함하는 플라스틱 스트립을 피부 상에서 부드럽게 프레싱하고, 1분 동안 그대로 건조시키는 비침습적인 방법이다. 이어서, 부드럽게 제거한다. 민감성 피부에서는 스트립 제거 후 몇분 동안 발적이 관찰될 수 있다. 그러나, 더욱 장기간의 또는 더욱 현저하게 나타나는 자극은 예상되지 않는다.

통계적 방법

연속 변수의 경우, 주어진다면, 개수, 평균, 중간값, 표준 오차, 최소값 및 최대값이 평가된다. 유의수준 임계값은 5%이다.

기술적 분석은 포함 데이터에 대해 수행된다. 포함 및 비포함 기준이 기술되고(개수 및 비율(%)), 편차가 열거된다. 중단 환자 또한 기술되고(개수 및 비율(%)), 중단 사유가 열거된다.

1차 분석은 무작위화되고, 기준선 이후 적어도 1회 방문이 이루어진 모든 환자를 포함하는 치료 의도 집단에서 수행된다. 감도 분석은 완전한 데이터를 포함하고, 주요 프로토콜을 위반하지 않은 모든 환자를 포함하는 프로토콜 순응 집단에서 수행된다. 안전성 분석은 미생물을 이용하는 적어도 하나의 처리를 받은 모든 환자를 포괄하는 안전성 집단(실험군 또는 대조군)에서 수행된다.

샘플 크기 계산: 샘플 크기 계산은 박테리아 집단에서 예상되는 변화에 관한 데이터는 이용불가능하기 때문에 전체 병변에서의 효능 종점에 기초한다. 마그데부르크 대학 피부과 클리닉(University Clinic of Dermatology in Magdeburg)에서 수행된 이전 여드름 연구에서(문헌 [Thielitz et al., 2015]), 3개의 상이한 겔을 비교하였다. 12주 동안의 처리 기간에 걸쳐, 3개 처리군에 대해 평균을 구하였을 때, 전체 병변의 계수는 40% ± 32%(평균 ± 표준 편차) 감소된 것으로 관찰되었다. 본원에 기술된 더 큰 임상 연구의 활성 처리군에서 유사한 효과가 예상된다. 대조군에서, (시험 수행 방법 및 위약 효과에 의한) 잔류 효과는 최대 약 15% 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 양측 t 검정에서 오차 수준 0.05 및 80%의 검정력으로 차이를 검출할 수 있도록 연구 아암당 적어도 27명의 환자로 이루어진 샘플 크기가 포함된다. 중도 탈락에 따른 희석 효과를 상쇄시키기 위해 추가로 10%의 피험체를 포함하여, 처리 아암당 30명의 환자가 포함된다. 60명의 환자 모두 한 코호트에 동원될 수 없다면, 중간 분석을 포함하는 적응 디자인이 실행된다. 제1 코호트가 실행되고, 상기 코호트 완료 후, 마이크로바이옴 조성 변경에 관한 분석이 수행된다. 마이크로바이옴 조성 변경에 관한 명확하고, 통계적으로 유의적인 신호가 이미 관찰되었다면, 이때는 임상 파라미터를 평가하게 될 것이다. 임상 파라미터 또한 통계적으로 유의적인 결과를 보인다면, 이때는 연구를 종료하고, 전체 분석을 실행하게 될 것이다. 결과가 통계적으로 유의적이지 않다면, 또는 결과의 통계적 유의수준이 명확하지 않다면, 제2 환자 코호트를 시험한다.

효능 분석: 효능은 2개의 상이한 수준에서 - 박테리아 조성 변경 및 임상 파라미터 변화(1차: 전체 병변 계수, 2차: 피지 생산)에서 고려된다.

기술적 분석: 처리된 피험체 및 처리되지 않은 피험체, 둘 모두에 대하여 각 평가 시점에(예비: 1일째, 7일째, 21일째 및 42일째; 더 큰 임상 연구: 1일째, 7일째, 28일째, 56일째, 84일째, 및 112일째), 및 차이가 날때(평가 0일째 - D0), 기술적 분석이 수행된다. 개수, 평균, 중간값, 표준 오차, 최소값 및 최대값이 주어진다.

1차 임상 종점 분석: 전체 병변 계수는 각 환자에 대한 기준선 측정값에 대한 상대적 비율(또는 분포가 비대칭이면, 그의 로그)로서 고려된다. 12주째까지 기준선 이후의 모든 방문을 포함하여, 반복 측정에 대한 선형 혼합 모델에서 두 연구 아암 모두에서 그들 사이의 기준선과 12주째의 차이를 비교하고, 이를 통해 일부 방문시에는 명확한 귀속 기술 없이도 값이 결측된 환자를 포함시킬 수 있다. 고정 인자는 처리 아암 및 성별 및 전체 병변의 절대 기준선 계수 및 공변량으로서 연령이다. 처리 효과에 대한 검정이 유의적이라면(p < 0.05), 이 또한 0.05 수준으로 기준선부터 16주째까지의 계수 차이에 대한 아날로그 검정이 수행된다. 이러한 계층적 방법을 통해 두 단계 모두에 대하여 오차 수준을 제어할 수 있다. 2차 분석으로서, 프로토콜 순응 집단에서 전체 방법을 수행한다.

2차 임상 종점 분석: 2차 임상 종점을 1차 임상 종점과 유사한 방식으로 처리한다.

박테리아 조성 분석: 박테리아 조성에 관한 1차 분석은 활성 처리의 화합물인 4종의 박테리아 균주의 상대적인 존재도를 포함한다. 분석은 1차 종점과 유사한 방식으로 수행되지만, 4종의 박테리아 균주를 병행 평가하는 것에 대해 본페로니 조정 유의 수준은 0.05/4 = 0.0125였다.

2차 다변량 분석을 위해, 마이크로바이옴을 기술하는 벡터를 비교하여 마이크로바이옴 차이를 계산한다. 벡터의 각 위치는 수치를 포함하며, 이는 특정 균주가 검출되는 횟수를 나타낸다. 상이한 마이크로바이옴 사이의 차이를 측정하는 데 상관 거리가 사용된다. 추가로, 상기 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 적용된 혼합물의 조성에 대한 P. 아크네스 마이크로바이옴의 거리를 계산한다. 단순 스피어만 상관이 사용될 수 있지만, 다른 통계 방법 또한 적용될 수 있다. 추가 분석으로는 상이한 박테리아의 분포 비교(예컨대, 섀넌 지수(Shannon index)로 표시), 및 두 연구 아암 모두의 그들 사이의 시간 경과에 따른 그의 안정성을 포함한다.

참고문헌

균등물

당업자는 단지 통상의 실험 사용만으로도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 균등물을 인지할 수 있거나, 또는 확인할 수 있다. 그러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

본원에 개시된, 특허 문헌을 비롯한, 모든 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 2016년 4월 20일 출원된 WO2016/172196(발명의 명칭: "Methods and Compositions for Changing the Composition of the Skin Microbiome Using Complex Mixtures of Bacterial Strains")의 전체 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Patzold, Bernhard Guell, Marc <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS <130> S1904.70001WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/536,761 <151> 2017-07-25 <150> US 62/410,329 <151> 2016-10-19 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 1 gttgcacacc agggggtcaa cttggcgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacagtt 60 ccatgtcggg aaacagcacc aggaagctcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttatg tacatttcta agctatagcg tctacccttg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcacatctc ctttctagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgttccacc 240 ctgtcatcac gaaggccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcaa caactcgatc cacccctgcc cattacatgg gtaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgtccat cacgcccgcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 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agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 59 <211> 483 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 59 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatatgt ctacccctgt cagacccagg acgatgggtg 180 tcatatcccc tttccagtca acctaagaag ggaggaaatg ccgcgatata tgttccgccc 240 tgtcatcatg aatgccacca caatctatcc cggaacagcc gtacttcacc caccatgccc 300 cgatgctgga ttcctattgt cgcccttatt agagcaagcg gtgccagcag cagaatattt 360 cacctcagca actcgatccg ctcctgccca ttacatgggt aacatatcca tggaggtacg 420 atgtatgcat cgaggatgca gtcgtctact atgcccgcct acatacccat tccatcagca 480 tag 483 <210> 60 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 60 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg taacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 61 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 61 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 tcgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 62 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 62 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttatttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 63 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 63 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa ggaaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggt taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 64 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 64 attgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attggttcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 65 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 65 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attggttcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctatgg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 66 <211> 483 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 66 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatca tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatatgt ctacccctgt cagacccagg acgatgggtg 180 tcatatcccc tttccagtca acctaagaag ggaggaaatg ccgcgatata tgttccgccc 240 tgtcatcatg aatgccacca caatctatcc cggaacagcc gtacttcacc caccatgccc 300 cgatgctgga ttcctattgt cgcccttatt agagcaagcg gtgccagcag cagaatattt 360 cacctcagca actcgatccg ctcctgccca ttacatgggt aacatatcca tggaggtacg 420 atgtatgcat cgaggatgca gtcgtctact atgcccgcct acatacccat tccatcagca 480 tag 483 <210> 67 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 67 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attggttcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatgtcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 68 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 68 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attggttcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatactg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 69 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 69 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attggttcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaacttg tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 70 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 70 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attggttcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactca tgacatatcg tctttcattg cgagaaacat 120 cttacttata cacatttcta agctatattg tctacccctg tcagacccag gacgatgggt 180 gtcatatccc ctttccagtc aacctaagaa gggaggaaat gccgcgatat atgttccgcc 240 ctgtcatcat gaatgccacc acaatctatc ccggaacagc cgtacttcac ccaccatgcc 300 ccgatgctgg attcctattg tcgcccttat tagagcaagc ggtgccagca gcagaatatt 360 tcacctcagc aactcgatcc gctcctgccc attacatggg taacatatcc atggaggtac 420 gatgtatgca tcgaggatgc agtcgtctac tatgcccgcc tacataccca ttccatcagc 480 atag 484 <210> 71 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 71 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtatcggg aaacagcacc agaaaactcg ggacatatcg tctttcattg cgagaaaaat 120 cttacttatg cgcatttcta agctatagcg tctacccttg tcagacccag gacgatgagt 180 gtcacatccc ctttccagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgctccgcc 240 ctgtcatcac gaaagccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcag caactcgatc cgcccctgcc cattacatgg gtaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgcccat cacgccagcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 <210> 72 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 72 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtatcggg aaacagcacc agaaaactcg ggacatatcg tctttcattg cgagaaaaat 120 cttacttatg cgcatttcta agctatagcg tctacccttg ccagacccag gacgatgagt 180 gtcacatccc ctttccagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgctccgcc 240 ctgtcatcac gaaagccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcag caactcgatc cgcccctgcc cattacatgg gtaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgcccat cacgccagcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 <210> 73 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 73 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtatcggg aaacagcacc agaaaactcg ggacatatcg tctttcattg cgagaaaaat 120 cttacttatg cgcatttcta agctatatcg tctacccttg ccagacccag gacgatgagt 180 gtcacatccc ctttccagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgctccgcc 240 ctgtcatcac gaaagccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcag caactcgatc cgcccctgcc cattacatgg gtaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgcccat cacgccagcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 <210> 74 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 74 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg ggacatatcg tctttcattg cgagaaaaat 120 cttacttatg cgcatttcta agctatagcg tctacccttg tcagacccag gacgatgagt 180 gtcacatccc ctttccagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgctccgcc 240 ctgtcatcac gaaagccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcag caactcgatc cgcccctgcc cattacatgg ttaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgcccat cacgccagcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 <210> 75 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 75 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtgtcggg aaacagcacc agaaaactcg ggacatatcg tctttcattg cgagaaaaat 120 cttacttatg cgcatttcta agctatagcg tctacccttg tcagacccag gacgatgagt 180 gtcacatccc ctttccagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgctccgcc 240 ctgtcatcac gaaagccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcag caactcgatc cgcccctgcc cattacatgg gtaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgcccat cacgccagcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 <210> 76 <211> 484 <212> DNA <213> Propionibacterium acnes <400> 76 gttgcacacc agggggtcaa cttggtgtcc tcagttcaaa attgattcaa actaacggtt 60 ccgtatcggg aaacagcacc agaaaactcg ggacatatcg tctttcattg cgagaaaaat 120 cttacttatg cgcatttcta agctatagcg tctacccttg tcagacccag gacgatgagt 180 gtcacatccc ctttccagtc aacctaagag aggaggaaat gccgcgatat atgctccgcc 240 ctgtcatcac gaaagccacc acaatctatc ccagaacagc cggcacttca ctcacgatgc 300 cccgatgctg gattcctatt gtcgccctta ttagggcaag cggtgccagt agcagaatat 360 gtcacctcag caactcgatc cgcccccgcc cattacatgg gtaacatatc catggaggtt 420 cgatgtatac tcgaggatac agtcgcccat cacgccagcc tacataccca ttacatcagc 480 atag 484 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 77 cagcggcgct gctaagaact t 21 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 78 ccggctggca aatgaggcat 20 <210> 79 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 79 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcagcggc gctgctaaga actt 54 <210> 80 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 80 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagccggct ggcaaatgag gcat 54 <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 81 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcagcggc gctgctaaga actt 54 <210> 82 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 82 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagccggct ggcaaatgag gcat 54

Claims (52)

1. 2종 이상의 상이한 생 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)(P. 아크네스(P. acnes)) 박테리아 균주를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 피부에 국소 투여하기 위한 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   - 담체;
   - 완충제;
   - 증점제; 또는
   - 펩톤
   을 추가로 포함하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 증점제는 하이드록시에틸 셀룰로스, 전분, 검, 카올린, 수화 규산알루미늄, 흄드 실리카, 카복시비닐 중합체, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 또는 알긴산나트륨을 포함하는 것인 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 펩톤은, 카세인 유래의, 트립신에 의해 분해된 펩톤인 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 하이드록시에틸 셀룰로스가 나트로솔(NATROSOL)® 하이드록시에틸셀룰로스(HEC)를 포함하는 것인 조성물.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증점제의 농도가 1%-5%이거나, 상기 펩톤의 농도가 0.05%-1%인 조성물.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 밀리리터당 적어도 10⁴ 콜로니 형성 단위(CFU/ml)의 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
8. 제7항에 있어서, 밀리리터당 10⁴-10⁹ 콜로니 형성 단위(CFU/ml)의 각각의 생 P. 아크네스 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 겔, 크림, 연고, 로션, 또는 분말의 형태이거나, 2 성분 분배 시스템의 일부인 조성물.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    - P. 아크네스 SLST 타입 A5 균주;
    - P. 아크네스 SLST 타입 F4 균주; 또는
    - D1, H1, H2, H3, K1, K2, K4, K6, K9, 및 L1 SLST 타입 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 추가의 P. 아크네스 박테리아 균주
    를 추가로 포함하는 조성물.
11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    - P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주가 조성물 내에 동일한 농도로 존재하는 것;
    - P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주가 다른 생 P. 아크네스 박테리아 균주보다 더 높은 농도로 존재하는 것;
    - P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주가 조성물 내의 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주보다 더 낮은 농도로 존재하는 것;
    - 조성물이 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주, P. 아크네스 SLST 타입 A5 균주, P. 아크네스 SLST 타입 F4 균주, 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 경우에 따라, 각 균주의 상대 농도가 각각 55%, 30%, 10%, 및 5%인 것;
    - 조성물이 P. 아크네스의 리보타입 6(RT6) 균주 또는 P. 아크네스의 파일로타입(Phylotype) III 균주를 포함하지 않는 것; 또는
    - 조성물이 실온에서 적어도 3개월 동안 안정한 것인 조성물.
12. 제1항에 있어서, 여드름, 지성 피부, 진행성 반상 멜라닌저하증, 비듬, 아토피 습진, 아토피 피부염 및 주사로 구성된 군으로부터 선택되는 피험체의 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 상기 피험체의 피부에 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 피험체는 인간 피험체인 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 피험체가 표준 여드름 치료를 또한 받고 있거나 이전에 받은 적이 있는 것인 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 표준 여드름 치료는 소독제 또는 항생제를 이용한 치료인 것인 조성물.
16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 화장료 조성물인 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 피험체의 피부에 투여되는 것인 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 피험체는 인간 피험체인 조성물.
19. 2종 이상의 상이한 냉동 건조된 생 P. 아크네스 박테리아를 수용하는 용기를 포함하는 키트로서, 상기 냉동 건조된 생 박테리아는 P. 아크네스 SLST 타입 C3 균주 및 P. 아크네스 SLST 타입 K8 균주를 포함하고, 상기 냉동 건조된 생 박테리아는 피부에 국소 투여하기 위한 것인 키트.
20. 제19항에 있어서, 소독제 또는 항생제를 추가로 포함하는 키트.
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