ES2967020T3

ES2967020T3 - Un conducto nervioso celular biocompatible y biodegradable listo para usar para lesiones de nervios y un procedimiento de preparación del mismo

Info

Publication number: ES2967020T3
Application number: ES20210715T
Authority: ES
Inventors: Rajan Datt; Siddharth Pandey; Poonam Meena; Mukesh Kumar; Nitin Khatri; Nagar Rakesh Kumar
Original assignee: Datt Life Sciences Private Ltd
Current assignee: Datt Life Sciences Private Ltd
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2024-04-25
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: EP3939628B1; AU2022201887B2; US11957815B2; AU2022201887A1; IL283584A; AU2021203224B1; US20220016320A1; EP3939628A1

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de cultivo celular biocompatible tridimensional novedoso y único que puede usarse para cultivar una variedad de células diferentes (células madre mesenquimales humanas, células de Schwann humanas, células nerviosas, células de Schwann y células nerviosas diferenciadas de células madre mesenquimales). in vitro) in vitro durante períodos de tiempo continuos. En la presente invención, se inoculan células madre mesenquimales (MSC derivadas de la médula ósea o del cordón umbilical), células de Schwann y células neuronales (células madre mesenquimales de forma diferenciada) y se cultivan en un andamio o matriz o conducto del Complejo Polielectrolítico (PEC) preestablecido formado por gelatina, quitosano, colágeno y ácido hialurónico. Las construcciones de tejido desarrolladas contienen células, factores de crecimiento, citocinas y otros factores reguladores secretados por las células y pueden prepararse en 12 días. Las construcciones de tejido desarrolladas mediante bioingeniería ayudan en la reparación y regeneración de las neuronas y restauran su función de manera sinérgica. Construcción de tejido desarrollada útil en el tratamiento rentable de lesiones de nervios periféricos, lesiones de la médula espinal o cualquier otro tipo de lesión nerviosa. El conducto nervioso desarrollado a base de células será útil en la restauración de la función motora y sensorial del nervio dañado en humanos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un conducto nervioso celular biocompatible y biodegradable listo para usar para lesiones de nervios y un procedimiento de preparación del mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería de tejidos nerviosos. Más concretamente, la invención se refiere a un novedoso procedimientoin vitropara inducir a las células a producir una construcción de ingeniería tisular para la regeneración y reparación de nervios de forma sinérgica. Más concretamente, la invención se refiere a un conducto nervioso/matriz basado en células vivas, que tiene propiedades similares a los tejidos y es capaz de utilizarse para la regeneración y reparación de nervios. Más concretamente, la invención se refiere a un conducto nervioso/matriz basado en células para el tratamiento de lesiones de nervios periféricos (LNP), lesiones de la médula espinal y cualquier otro tipo de lesiones de nervios.

Antecedentes de la invención

El campo de la ingeniería tisular combina procedimientos de bioingeniería con los principios de las ciencias de la vida para comprender las relaciones estructurales y funcionales en los tejidos normales y patológicos de los mamíferos. El objetivo de la ingeniería tisular es el desarrollo y la aplicación final de sustitutos biológicos para restablecer, mantener o mejorar las funciones de los tejidos. Así, mediante la ingeniería tisular, es posible diseñar y fabricar una construcción tisular de bioingenieríain vitro.Las construcciones de tejidos de bioingeniería incluyen células que se asocian a tejidos humanos y a matrices/andamiajes naturales. El nuevo tejido de bioingeniería debe ser funcional cuando se injerta en un receptor e incorporarse permanentemente en el organismo del receptor o biorremodelarse progresivamente con células del paciente receptor. La fabricación de un equivalente tisular sin un elemento de soporte o andamiaje plantea retos científicos a la hora de crear el nuevo tejido de bioingeniería.

El sistema nervioso periférico (SNP) se extiende fuera del sistema nervioso central (SNC) y desempeña, entre otras, las funciones de trasladar información sensorial al SNC y recibir órdenes motoras del SNC, coordinar los movimientos corporales y controlar los músculos involuntarios. A diferencia del sistema nervioso central, el SNP no está protegido por el hueso y, por tanto, es vulnerable a las lesiones.

El daño a los nervios del SNP puede causar un deterioro motor o sensorial significativo. En concreto, los pacientes con lesiones de nervios periféricos agudas suelen presentar defectos de conducción nerviosa que pueden manifestarse como alteraciones motoras o disfunciones sensoriales. En función de la gravedad de la lesión y del nervio afectado, un nervio seccionado puede causar parálisis, pérdida parcial de movilidad del miembro afectado y/o pérdida de sensibilidad. Si no se produce una recuperación suficiente o no se proporciona un tratamiento oportuno, se producirá una atrofia de nervios y músculo. Del mismo modo, el aplastamiento de nervios periféricos puede reducir el rendimiento motor o sensorial.

Las lesiones de los nervios periféricos pueden deberse a traumatismos, cirugía, cáncer y anomalías congénitas. Las lesiones de los nervios periféricos también pueden estar causadas por radioterapia, quimioterapia, complicaciones metabólicas/endocrinas, enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, deficiencias vitamínicas, enfermedades infecciosas, causas tóxicas, exposición accidental a metales orgánicos y pesados, fármacos, amputaciones y enfermedades o afecciones relacionadas con la pérdida de la función nerviosa motora o sensorial. Las lesiones de nervios pueden incluir sección de nervios, aplastamiento, compresión, estiramiento, laceración (objetos punzantes o fragmentos óseos), isquemia y explosión. Además, las lesiones de nervios pueden deberse a daños o alteraciones de los axones neuronales.

Las lesiones de nervios periféricos son una fuente importante de morbilidad y un campo con una necesidad médica significativa. De hecho, sólo el 50 % de los pacientes logran un restablecimiento de la función de bueno a normal tras la reparación quirúrgica, independientemente de la estrategia. Además, el fracaso de la regeneración de nervios puede hacer necesaria la amputación de una extremidad que, de otro modo, se habría salvado. Esto se debe a la insuficiencia de las estrategias actuales de reparación de LNP, en las que incluso el "tratamiento de referencia", el autoinjerto de nervio, es en gran medida ineficaz para los traumatismos nerviosos graves, definidos como la pérdida de un segmento grande de nervio (es decir, >5 cm) o la lesión que se produce más cerca de la médula espinal (por ejemplo, hombro, muslo), lo que da lugar a distancias extremadamente largas para la regeneración de los axones hasta los astas distales (por ejemplo, mano, pie). A pesar de los importantes esfuerzos realizados, la reparación de LNP no ha progresado más allá de los tubos guía nerviosos ("nerve guidance tubes", NGT) para el 10 de diciembre de 2015

La intervención quirúrgica es necesaria para reparar los nervios periféricos seccionados. Una técnica quirúrgica para intentar el crecimiento de un nervio periférico consiste en proporcionar un andamiaje, normalmente en forma de conducto, en el lugar del daño nervioso, para facilitar y fomentar la extensión de los axones en regeneración. Específicamente, el andamiaje se selecciona para proporcionar un entorno que fomente el crecimiento del nervio, de modo que pueda recuperarse la función nerviosa. Hasta la fecha, los índices de éxito del crecimiento de nervios periféricos han sido bajos y actualmente no es posible alcanzar el grado de crecimiento de nervios periféricos que sería necesario para reparar muchas de las lesiones que sufren los nervios periféricos.

A la hora de fabricar la próxima generación de conductos nerviosos, hay que tener en cuenta varios aspectos. Entre ellos se incluyen la biocompatibilidad de los materiales y las propiedades mecánicas y de degradación personalizadas. Los conductos de colágeno monocanal que poseen una resistencia mecánica y son fáciles de procesar se han utilizado anteriormente en aplicaciones de regeneración de nervios.

La FDA ha aprobado varios conductos nerviosos para defectos nerviosos relativamente cortos, como el tubo de colágeno de tipo I de Integra Neurosciences, NeuraGen TM, el Neuroflex de Collagen Matrix Inc. y el Gem Neurptube TM de Synovis Surgical Innovations. Se trata de tubos monocanal que sólo se utilizan para pequeños defectos de varios milímetros y no abordan lesiones de nervios periféricos de mayor envergadura. Además, los axones que se regeneran a través de estos tubos de lumen único adoptan una dirección dispersa, lo que da lugar a una reinervación diana inadecuada y a la cocontracción de músculos opuestos o sincinesis.

A pesar de la evolución del microscopio quirúrgico y de un prodigioso esfuerzo por perfeccionar las técnicas de aproximación precisa a los nervios, los resultados clínicos de la reparación quirúrgica de nervios siguen siendo decepcionantes. El tejido cicatricial resultante de las manipulaciones quirúrgicas necesarias para la sutura directa del nervio proximal al distal interfiere con frecuencia en el crecimiento de los axones del muñón proximal hacia el interior del muñón del nervio distal. Si se impide que un número considerable de axones atraviese la zona anastomótica, suele producirse la formación de un neuroma (tumor doloroso de células nerviosas). En consecuencia, se reducen las perspectivas de lograr una reinervación significativa. El resultado final es la falta de recuperación completa de la función motora y/o sensorial.

Además, el potencial regenerativo del nervio proximal dañado con frecuencia es impredecible y no se conoce bien. Las lesiones graves en los nervios han requerido injertos microquirúrgicos para cubrir el defecto. Esta técnica consiste en injertar quirúrgicamente un trozo de nervio de otra parte del cuerpo, pero esta estrategia también tiene ciertas limitaciones. La zona de la que se ha extraído el nervio queda sin sensibilidad. Además, la cantidad de tejido nervioso que puede extraerse de forma sensata para dichos injertos también es limitada. Sin embargo, las técnicas de sutura y/o los injertos no siempre han sido suficientes para reparar un defecto grave. Además, la sutura bajo tensión, la reducción de la brecha por estiramiento, movilización, flexión de una articulación o redireccionamiento pueden comprometer la vascularidad intraneuronal sensible, y los autoinjertos inducen una segunda zona quirúrgica con los riesgos y complicaciones necesarios.

Además, en muchos casos, no hubo crecimiento nervioso o sólo hubo crecimiento de tejido conectivo. Así pues, los resultados funcionales de la reparación quirúrgica de las lesiones de nervios periféricos han sido decepcionantes a pesar de la mejora de las técnicas quirúrgicas. Se han ideado estrategias para potenciar supuestamente la regeneración de los nervios periféricos (los que están situados fuera de la médula espinal y el cerebro). Así pues, la protección del lugar de una neurorrafia frente a la infiltración de tejido fibroso y la prevención de la formación neuromatosa mediante el uso de envolturas, manguitos o tubos de diversos materiales se vienen practicando desde 1980. En ese momento, se intentó interponer un drenaje de hueso descalcificado entre los extremos seccionados de un nervio ciático. Sin embargo, generalmente se producía una unión fibrosa sin retorno de la función. Además de hueso y vasos descalcificados, se han utilizado con mayor o menor éxito fascialata, grasa, músculo, pergamino, membrana de Cargile, gelatina, agar, caucho, película de fibrina y diversos metales. Muchos materiales fracasaron porque provocaban una reacción a cuerpo extraño, producían tejido cicatricial constrictivo, eran técnicamente difíciles de aplicar o requerían una operación secundaria para su extracción. Se han seguido introduciendo diversas mejoras tanto en la tubulación terminal como en la envoltura del nervio para facilitar su reparación.

Tanto los materiales biodegradables como los no reabsorbibles se han utilizado para actuar como canal para estimular el crecimiento y la regeneración en nervios seccionados que han sido suturados juntos o en conexión con injertos nerviosos.

Aunque se han obtenido mejores resultados en la regeneración de nervios mediante el uso de tubos rellenos con promotores de la regeneración de nervios, aún queda mucho por mejorar. En concreto, la fabricación de tubos rellenos de dichos agentes promotores es un proceso relativamente caro y laborioso. Además, sigue siendo deseable proporcionar un medio por el cual se regenere un número aún mayor de axones mielinizados, se logre una velocidad más rápida de crecimiento nervioso y se cubran brechas en nervios más largas. Sigue existiendo la necesidad de satisfacer dicha necesidad y de reducir o eliminar los problemas que han surgido con los intentos de reparación de nervios de la técnica anterior, tal como la revascularización, la fibrosis excesiva, la reorientación de las fibras nerviosas y el escaso retorno final de la función de los órganos finales.

Colmar pequeñas lagunas o acercarse al rendimiento de los autoinjertos. Por ello, este campo necesita desesperadamente una tecnología transformadora para reparar las lesiones de los nervios periféricos. El principal fallo de todas las estrategias actuales para reparar desde el punto de vista funcional los grandes traumatismos nerviosos es la incapacidad de conseguir que un número suficiente de axones crezca una distancia sustancial para reinervar las dianas distales (por ejemplo, la mano) y restablecer la función. Para superar este defecto, las estrategias de reparación deben abordar dos grandes retos: (1) fomentar la regeneración rápida de los axones proximales y (2) mantener la capacidad prorregenerativa del segmento distal del nervio para regenerar axones.

La degeneración de los segmentos axónicos distales a un punto de lesión de nervio es una consecuencia inevitable de la sección o lesión del nervio; sin embargo, las células de Schwann de soporte en el segmento del nervio distal sobreviven y cambian a un fenotipo prorregenerativo para apoyar el crecimiento del axón. Este fenotipo prorregenerativo incluye un cambio en la alineación celular para formar columnas paralelas, proporcionando tractos que sirven de guía para los axones en regeneración. Por desgracia, el entorno natural prorregenerativo se degrada tras varios meses sin la presencia de axones, privando así a los axones en regeneración de su "hoja de ruta" hacia una diana final. Esto ocurre cuando el tiempo que tardan los axones regenerados en infiltrarse en el segmento distal es mayor que el tiempo que las células de Schwann pueden mantener su fenotipo prorregenerativo. A menudo, tras una<l>N<p>prolongada o proximal, el entorno prorregenerativo falla y se produce una recuperación funcional incompleta. Por ejemplo, un paciente con una LNP en la parte superior del brazo puede recuperar la función del codo, pero no la de la mano, debido a la distancia entre la lesión del nervio y las dianas finales en la mano, que a menudo no son alcanzadas por los axones proximales antes de que el entorno distal deje de ser prorregenerativo. En otro ejemplo, una LNP no es tratable debido al gran tamaño del daño o lesión del nervio, independientemente de la ubicación del daño o lesión.

Se han explorado diversas técnicas para prolongar la capacidad prorregenerativa del segmento distal del nervio tras una lesión del nervio. Entre ellas se incluyen el suministro de factores neurotróficos (por ejemplo, GDNF, BDNF y TGF-beta) al segmento distal del nervio; la administración de estimulación eléctrica a la vaina del nervio para intentar estimular la aceleración de la regeneración de los axones; y la transferencia de un nervio sensorial ajeno o de un nervio sano adyacente a la vaina del nervio denervado. Sin embargo, estas técnicas suelen verse limitadas por la falta de eficacia, sobre todo a largo plazo.

Además, algunas de estas técnicas tienen la clara desventaja de seccionar un nervio sano cercano con el fin de transferirlo al muñón del nervio denervado adyacente.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de medios más eficaces para mantener la capacidad prorregenerativa de los segmentos nerviosos distales denervados, de modo que pueda aumentarse la eficacia de los medios de reparación de LNP actuales o futuros. Existe una necesidad concreta en la técnica para mantener la capacidad prorregenerativa y la alineación de las células de Schwann en el segmento distal del nervio denervado a largo plazo.

En la actualidad, las células de soporte utilizadas en los nervios de ingeniería tisular incluyen células de Schwann y diversas células madre, que son células alogénicas y pueden causar inmunogenicidad, lo que no es adecuado para aplicaciones clínicas. Por otra parte, el destinoin vivoy los efectos biológicos de las células de soporte una vez implantadas en el organismo no están del todo claros, y es posible que se inactiven en el entorno del cuerpo, con lo que no se consiguen los efectos biológicos esperados. Todas estas cuestiones limitan el desarrollo de injertos de nervios de ingeniería tisular.

El daño en los nervios de pacientes a menudo no se regenera de forma natural y puede conducir a una pérdida permanente de sensibilidad y función. Por esta razón, las intervenciones quirúrgicas y terapéuticas para estimular la reparación pueden ser deseables.

Se remite al documento GB2386841 titulado Conducto bioabsorbible multicanal de regeneración de nervios y procedimiento de preparación del mismo, del solicitante IND TECH RES INST Esta invención describe un conducto de regeneración de nervios bioabsorbible multicanal que tiene un tubo redondo hueco de polímero bioabsorbible poroso y un relleno multicanal fabricado con una película de polímero bioabsorbible poroso situada dentro del tubo.

Se remite a la patente de EE. UU. n.° 5019087 titulada Conducto de regeneración de nervios, del solicitante American Biomaterials Corp. La invención describe un procedimiento de hilado de una mezcla de colágeno y laminina sobre un mandril para fabricar un conducto nervioso de un solo canal.

Se remite a la patente de EE. UU. n.° 3786817, titulada Procedimiento y aparato para ayudar a que se unan nervios seccionado, del solicitante Palma J. la invención describe el uso de un tubo no reabsorbible para ayudar a alinear y unir nervios seccionados. En este caso, los extremos de un nervio seccionado se introducen en los extremos de un tubo hasta que los extremos del nervio se acerquen o se toquen en el centro del tubo. Un líquido, tal como nitrógeno, pasa a través del tubo para ayudar a la regeneración.

Se remite a la patente de EE. UU. n.° 4534349, titulada Dispositivo de reparación de nervios sin suturas absorbible, del solicitante 3m Co. La invención es un dispositivo tubular hueco absorbible. Este dispositivo supuestamente permite la reparación sin suturas de nervios lacerados, seccionados o injertados, en el que el dispositivo está compuesto por un polímero absorbible por el organismo.

Se remite al documento CN1589913, titulado Un nervio periférico de ingeniería tisular utilizado para reparar defectos de nervios periféricos y procedimiento para la preparación del mismo, del solicitante School of Stomatology, Fourth Military Medical University of Chinese People's Liberation Army. La invención describe un nervio de ingeniería tisular utilizado para reparar defectos de nervios periféricos. El nervio de ingeniería tisular consiste en un conducto nervioso fabricado con materiales biodegradables con células gliales o células madre añadidas con capacidad para diferenciarse en células gliales, que se utilizan como células de siembra, y modificados con microesferas para la liberación controlada de factores neurotróficos y con moléculas de ECM.

Se remite al documento WO2004/087231, titulado Crecimiento de tejido autoalineable, del solicitante Ucl Biomedica Plc. La invención describe una guía de crecimiento de tejido autoalineable. La guía comprende un núcleo de una matriz de biopolímero que se fija a una vaina exterior en dos puntos. El núcleo se siembra con células, que generan una fuerza contráctil mecánica que conduce a la autoalineación de las células dentro del núcleo. Se obtiene así un sustrato de guía celular para regenerar tejidosin vivo.La tensión en el núcleo también puede hacer que las fibras de la matriz se alineen. La combinación de la alineación celular y la alineación del sustrato actúa para guiar el nuevo crecimiento celular en un sujeto. Tal como se describe en el documento WO2004/087231, la matriz biopolimérica es preferentemente una matriz de colágeno. Las células utilizadas para sembrar la matriz se alinean y contraen, pero no proliferan para formar un tejido organizado. La lista de células cuya utilidad se menciona en la publicación incluye las células de Schwann. Una realización de la guía también puede incluir células del tejido de interés sembradas dentro de la matriz y que crecerán y serán guiadas por las células contráctiles.

También se remite al documento 9123/DELNP/2014, titulado Andamiaje, del solicitante THE UNIVERSITY OF SHEFFIELD. La invención proporciona un procedimiento para producir un andamiaje electrohilado, que comprende el electrohilado de un polímero o copolímero sobre una plantilla que comprende un colector conductor que tiene un patrón tridimensional sobre el mismo, en el que dicho polímero o copolímero electrohilado se deposita preferentemente sobre dicho patrón tridimensional.

También se remite al documento 368/DELNP/2012, titulado Andamiaje biodegradable para la regeneración de tejido blando y uso del mismo, del solicitante COLOPLAST A/S. La presente invención se refiere a nuevos andamiajes biodegradables reforzados para la regeneración de tejidos blandos, así como a procedimientos de soporte y de aumento y regeneración de tejidos vivos, en los que se utiliza un andamiaje biodegradable reforzado para el tratamiento de indicaciones, en las que se requiere una mayor resistencia y estabilidad además de la necesidad de regeneración de tejidos vivos dentro de un paciente. La presente invención se refiere además al uso de andamiajes junto con células o explantes de tejidos para la regeneración de tejidos blandos, tal como en el tratamiento de un prolapso médico, tal como el prolapso rectal o de órganos pélvicos, o una hernia.

También se remite al documento 201821042296, titulado Proceso para la preparación de injertos tubulares o andamiajes tubulares para la ingeniería tisular, del solicitante Dr. D. Y. Patil Vidyapeeth. La presente invención se refiere a un proceso para preparar injertos tubulares o andamiajes tubulares para la ingeniería tisular, que es susceptible de automatización, mediante el cual se puede ampliar la fabricación de andamiajes tubulares o injertos derivados de ellos. Más concretamente, la presente invención se refiere además a un proceso para la preparación de injertos tubulares o andamiajes tubulares, que tienen un diámetro uniforme, no presentan costuras en la construcción ni desgarros y otros defectos que surgen debido al proceso de fabricación. La presente invención también se refiere a un proceso para preparar injertos tubulares o andamiajes tubulares para la ingeniería tisular, utilizando un enfoque de molde de sacrificio y mandril de sacrificio, en el que se utiliza un molde de sacrificio para preparar un mandril de sacrificio. La presente invención se refiere además a un proceso para preparar injertos tubulares o andamiajes tubulares para la ingeniería tisular, en el que se evita el uso de productos químicos no respetuosos con las células, tales como disolventes orgánicos.

También se remite a la patente de EE. UU. n.° 10507 187, titulada Injertos de tejido regenerativo y procedimientos para la fabricación de los mismos, del solicitante Jackson; Wesley M. (Albany, CA), Nesti; Leon J. (Silver Spring, MD), Tuan; Rocky S. (Bethesda, MD). La presente invención divulga un injerto que contiene un andamiaje que incluye una matriz en la que se ubican células progenitoras mesenquimales ("mesenchymal progenitor cells", MPC) que tiene la capacidad de mejorar sustancialmente la cicatrización de heridas, incluidas las heridas como consecuencia de lesiones en tejido nervioso, óseo y vascular. Las MPC pueden obtenerse a partir de tejido muscular desbridado tras un traumatismo ortopédico. Las células progenitoras derivadas de músculo traumatizado son una fuente celular autóloga fácilmente disponible que puede utilizarse para llevar a cabo o mejorar la cicatrización de heridas en una diversidad de entornos y vehículos terapéuticos.

Una publicación titulada "Chitosan/gelatin porous scaffolds containing hyaluronic acid and heparan sulfate for neural tissue engineering", de Guan Shuiet al.(Guan S., Zhang X.L., Lin X.M., Liu T.Q., Ma X.H., Cui Z.F., Chitosan/gelatin porous scaffolds containing hyaluronic acid and heparan sulfate for neural tissue engineering, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2013, 24(8):999-1014) divulga un andamiaje polielectrolítico fabricado con quitosano, gelatina, ácido hialurónico pero obligatoriamente contiene sulfato de heparano.

Sumario de la invención

Sin embargo, ninguna de las invenciones de la técnica anterior comprende una técnica novedosa y exclusiva de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células madre mesenquimales diferenciadas en células de Schwann y células nerviosas en una capa proliferativa y subconfluente sobre un conducto/matriz biocompatible preparado a partir de una pluralidad de polímeros compuestos mediante el uso de glutaraldehído como reticulante para su implantación directa o administración. En la presente divulgación, las células se transfieren mientras se encuentran en estado proliferativo y el producto final obtenido se transporta en medio semisólido, en el que el medio semisólido es medio de agar del 1%p/v al 3%p/v y medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales. El medio de agar contiene HEPES 2-3 gm/l y bicarbonato de sodio 2-3,5 gm/l, adecuado para injertos y proporciona un conducto nervioso/matriz artificial biodegradable y biocompatible mejor, eficiente, fácil de usar, rentable y listo para usar para la reparación y regeneración de nervios con función sensorial y motora de forma sinérgica. En la presente divulgación, los injertos pueden prepararse en 12 días.

La presente divulgación proporciona una técnica novedosa y exclusiva de preparación de un conducto nervioso/matriz y de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células de Schwann y células neuronales y su proliferación sobre un conducto/matriz biocompatible adecuado para la implantación/el injerto de nervios. La divulgación proporciona una construcción tisular biodegradable y biocompatible lista para usar con un producto basado en células madre humanas autólogas/alogénicas. La presente divulgación también proporciona un procedimiento reconstructivo para cumplir los requisitos específicos necesarios para lograr una curación satisfactoria de la lesión del nervio y restablecer la integridad funcional en el menor tiempo y con las menores complicaciones y morbilidad. El conducto nervioso/matriz tal como se proporciona en la presente divulgación tiene propiedades similares a los tejidos y es capaz de utilizarse para la regeneración y reparación de nervios de forma sinérgica.

El objetivo principal de la presente invención es proporcionar un conducto nervioso/matriz artificial de bioingeniería para lesiones de nervios periféricos.

Otro objetivo de la presente invención es cultivar células directamente sobre el conducto/matriz polimérica (andamiaje) para su implantación directa o administración.

Otro objetivo de la presente invención es preparar injertos en 12 días.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un conducto nervioso/matriz biodegradable y biocompatible listo para usar con un producto basado en células madre humanas autólogas/alogénicas.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de preparación de dicho dispositivo.

Otro objetivo de la presente invención es desarrollar un conducto nervioso/matriz artificial de bioingeniería para la reparación y regeneración de lesiones de nervios periféricos, lesiones de la médula espinal y cualquier otro tipo de lesión de nervios de forma sinérgica.

Otro objetivo de la presente invención es desarrollar un conducto nervioso/matriz artificial de bioingeniería para el restablecimiento de la función motora y sensorial del nervio dañado o lesionado.

La presente divulgación proporciona una técnica novedosa y exclusiva de preparación de un conducto nervioso/matriz y de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células de Schwann y células neuronales y su proliferación sobre un conducto/matriz biocompatible preparado a partir de una pluralidad de polímeros compuestos mediante el uso de glutaraldehído como reticulante para su implantación directa o administración. En la presente divulgación, las células se transfieren mientras se encuentran en estado proliferativo y el producto final obtenido se transporta en medio semisólido, en el que el medio semisólido es medio de agar del 1 % p/v al 3 % p/v y medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales. El medio de agar contiene HEPES 2-3 gm/l y bicarbonato de sodio 2-3,5 gm/l apto para injertos. La presente divulgación proporciona una construcción tisular biodegradable y biocompatible lista para usar con un producto basado en células madre humanas autólogas/alogénicas. La presente divulgación también proporciona un procedimiento reconstructivo para cumplir los requisitos específicos necesarios para lograr una curación satisfactoria de la lesión del nervio y restablecer la integridad funcional en el menor tiempo y con las menores complicaciones y morbilidad. El conducto nervioso/matriz tal como se proporciona en la presente divulgación tiene propiedades similares a los tejidos y es capaz de utilizarse para la regeneración y reparación de nervios de forma sinérgica. En la presente divulgación, los injertos pueden prepararse en 12 días.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es un conducto nervioso artificial biodegradable, biocompatible y de alta porosidad para su implantación directa o administración en procesos de reparación y regeneración de nervios, comprendiendo dicho conducto nervioso un andamiaje de complejo polielectrolítico (CPE) que comprende una pluralidad de polímeros, caracterizado porque dicho conducto nervioso comprende células humanas autólogas y/o alogénicas directamente soportadas sobre el andamiaje, en el que los polímeros del andamiaje están reticulados por un reticulante de glutaraldehído, en el que los polímeros consisten en gelatina al 1 %-10 % p/v, quitosano al 0,5 %-2,5 % p/v, ácido hialurónico al 0,1 %-2 % p/v, colágeno al 0,1 %-10 % p/v y solución de glutaraldehído al 5 %-50 % v/v, en el que el poder gelificante de la gelatina es de 50-300 y el quitosano DAC (dialdehído de celulasa) oscila entre el 75 % p/v y el 95 % p/v, siendo el andamiaje no adherente, con porosidad diferencial y apto para el cultivo de células directamente sobre su superficie, y en el que las células humanas autólogas y/o alogénicas se seleccionan entre células madre mesenquimales, células de Schwann diferenciadas y células neuronales en estado proliferativo.

Preferentemente, el conducto nervioso artificial según la invención se caracteriza porque el andamiaje está formado por láminas esponjosas o estructuras muy complejas con poros y canales intrincados, de manera que las propiedades espaciales y de composición del andamiaje, la porosidad del andamiaje y la interconectividad de los poros permiten la penetración de las células en la estructura, así como el transporte de nutrientes y productos de desecho, y la porosidad diferencial ayuda a la adhesión de las células y a la transducción de señales.

Preferentemente, el conducto nervioso artificial según la invención se caracteriza porque el andamiaje tiene forma de lámina o forma cilíndrica hueca.

Preferentemente, el conducto nervioso artificial según la invención se caracteriza porque los polímeros adicionales incluidos se seleccionan entre poli(alcohol vinílico) (PVA), policaprolactona (PCL), polipirrol, poliuretano (PU), poli(alilamina), poli(etilenglicol) 200 (PEG 200), goma arábiga, goma guar, colágeno parcialmente desnaturalizado o combinaciones de los mismos.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento de preparación del conducto nervioso artificial biodegradable, biocompatible y de alta porosidad según la invención para su implantación directa o administración en procesos de reparación y regeneración de nervios, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) poner en contacto una pluralidad de polímeros con glutaraldehído como reticulante para formar un andamiaje de complejo polielectrolítico (CPE), en el que los polímeros consisten en gelatina al 1 %-10 % p/v, quitosano al 0,5 %-2,5 % p/v, ácido hialurónico al 0,1 %-2 % p/v, colágeno al 0,1 %-10 % p/v y solución de glutaraldehído al 5 %-50 % v/v;

(b) proporcionar células humanas autólogas y/o alogénicas en forma de una capa subconfluente sobre la superficie del material del andamiaje, siendo las células seleccionadas entre células madre mesenquimales, células de Schwann diferenciadas y células neuronales en estado proliferativo;

(c) cultivo de las células que recubren el conducto nervioso artificial obtenido en la etapa (b) en un medio semisólido.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque el medio semisólido contiene medio de agar con un contenido de agar que oscila entre el 1 % p/v y el 3 % p/v, así como un medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales, el medio agar que contiene 2-3 gm/l de HEPES y 2-3,5 gm/l de bicarbonato de sodio.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque el andamiaje obtenido en la etapa (a) se liofiliza antes de la etapa (b).

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque la etapa (a) implica un tratamiento fisicoquímico secuencial con patrón cronológico de los polímeros para obtener un andamiaje 3D de complejo polielectrolítico (CPE)

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque el andamiaje liofilizado se estabiliza y neutraliza con vapores de amoníaco (al 5 %-25 %) durante 12 a 24 horas en una cámara cerrada antes de ser utilizado en la etapa (b).

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque en la etapa (b) las células se siembran sobre la superficie del material de andamiaje biocompatible a una densidad celular de 0,5 * 105 a 0,8 * 105 células/cm2.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque en la etapa (c) las células forman una monocapa que es confluente en un 80 % a un 100 %.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque en la etapa (c) el medio de cultivo semisólido comprende suero.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque la etapa (c) se realiza durante 12 días. Preferentemente, el procedimiento según la invención se caracteriza porque comprende una etapa adicional (d) de mantener el conducto nervioso artificial final en un medio semisólido y/o líquido, en el que el medio semisólido/líquido comprende nutrientes y es capaz de mantener la viabilidad de las células en monocapa cultivadas sobre la superficie del andamiaje entre el 70 % y el 95 % a la temperatura de 4 °C a 37 °C durante 15 días.

Breve descripción de los dibujos

La invención se explicará a continuación con mayor detalle en una realización preferida, remitiéndose a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra el diseño y la fabricación de una forma de conducto nervioso/matriz de guía nerviosa basado en biopolímeros.

La figura 2 muestra el comportamiento de degradación del conducto nervioso/matriz en tripsina y colagenasa. La figura 3 muestra la proporción de hinchamiento del conducto nervioso/matriz en 1X PBS.

La figura 4 muestra los espectros FTIR del conducto nervioso/matriz reticulado con glutaraldehído

La figura 5 muestra la morfología superficial del conducto nervioso/matriz mediante análisis SEM, (A) vista transversal (100 X) y (B) vista superficial (200 X)

La figura 6 muestra el ensayo MTT que demuestra la biocompatibilidad del conducto nervioso/matriz con las células L929 (CP - control plano; CE - control estático; CD - control dinámico).

La figura 7 muestra imágenes de fluorescencia que muestran la viabilidad de las MSC sobre el conducto nervioso/matriz el séptimo día de cultivo

La figura 8 muestra la biocompatibilidad del conducto nervioso/matriz para MSC. (A) MSC preteñidas con PKH26 que crecen uniformemente por todo el andamiaje; (B) MSC teñidas con calceína-AM sobre un andamiaje de conducto nervioso/matriz; (C) con núcleos teñidos con DAPI; (D) fusión de PKH y DAPI; (E) fusión de PKH, DAPI y calceína-AM (ampliación 10 X).

La figura 9 muestra micrografías electrónicas de barrido de las MSC sembradas sobre la superficie del conducto nervioso/matriz.

La figura 10 muestra imágenes de fluorescencia que muestran la tinción con calceína-AM en diferentes secciones transversales del conducto nervioso/matriz.

La figura 11 muestra la tinción con calceína-AM sobre el conducto nervioso/matriz revivido (conservado a -80 °C después de la liofilización) crioconservado en criomedio A, criomedio B, criomedio C y criomedio D en el día 4

La figura 12 muestra imágenes de campo claro que muestran los cambios morfológicos de las MSC durante su diferenciación en células de Schwann en diferentes intervalos de tiempo

La figura 13 muestra la inmunotinción para los marcadores de células de Schwann CD56 (rojo), p75NGFR (verde), CD 104 (rojo), S100 (verde) tras 14 días de diferenciación. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala, 100 pm.

La figura 14 muestra la degradaciónin vivode la forma de conducto nervioso y matriz implantados por vía subcutánea en la zona dorsal de ratas a las 4, 8, 12, 16, 20 y 27 semanas después de la implantación.

La figura 15 muestra la disección (A, B) y la reconstrucción quirúrgica (C) de una lesión experimental del nervio ciático

La figura 16 muestra el examen histológico de los nervios ciáticos regenerados tras 8 semanas de implantación. (A) Tinción H&E que muestra la morfología de los nervios en cada grupo; (B) Mielinización de los nervios regenerados revelada por la tinción con azul de toluidina (aumento de 10X)

Descripción detallada de la invención

En consecuencia, la presente divulgación proporciona una técnica novedosa y exclusiva de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células madre mesenquimales diferenciadas, células de Schwann y células nerviosas en una capa proliferativa y subconfluente sobre un conducto/matriz biocompatible liofilizado preparado a partir de una pluralidad de polímeros compuestos utilizando glutaraldehído como reticulante sin ningún producto químico nocivo integrado para la implantación directa o la administración de dichas células madre mesenquimales humanas, en la que, en dicha divulgación, dichas células se transfieren mientras están en estado proliferativo y el producto final obtenido se transporta en un medio semisólido. Dicho medio semisólido es medio de agar del 1 % p/v al 3 % p/v y medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales que incluye HEPES 2-3 gm/l y bicarbonato de sodio 2 3,5 gm/l adecuado para injertos y proporciona un conducto nervioso/matriz artificial biodegradable y biocompatible mejor, eficiente, fácil de usar, rentable y listo para usar para la reparación y regeneración de nervios con función sensorial y motora de forma sinérgica en la que los injertos pueden prepararse en 12 días.

La presente divulgación proporciona una técnica novedosa y exclusiva de preparación de un conducto nervioso/matriz y de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células de Schwann y células neuronales y su proliferación sobre un conducto/matriz biocompatible adecuado para la implantación/injerto de nervio.

La presente divulgación proporciona una construcción tisular biodegradable y biocompatible listo para usar con un producto basado en células madre humanas autólogas/alogénicas.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento reconstructivo para cumplir los requisitos específicos necesarios para lograr una curación satisfactoria de la lesión del nervio y restablecer la integridad funcional en el menor tiempo y con las menores complicaciones y morbilidad. El conducto nervioso/matriz tal como se proporciona en la presente divulgación tiene propiedades similares a los tejidos y puede utilizarse para la regeneración y reparación de nervios.

La presente divulgación está dirigida a construcciones tisulares de bioingeniería de células cultivadas y componentes de matriz extracelular producidos endógenamente sin el requisito de componentes de matriz exógenos o elementos de soporte de red o andamiaje. De este modo, la divulgación puede realizarse ventajosamente en su totalidad a partir de células humanas y componentes de la matriz humana producidos por dichas células, por ejemplo, cuando la construcción de tejido de bioingeniería está diseñada para su uso en seres humanos.

La presente divulgación también se dirige a procedimientos para producir construcciones de tejido mediante la estimulación de células en cultivo, tales como células madre mesenquimales y células madre mesenquimales diferenciadas en células de Schwann y células nerviosas para producir componentes de la matriz extracelular sin la adición de componentes de matriz exógenos, un soporte de red o elementos de andamiaje para ayudar en la reparación y regeneración de nervios.

En la presente divulgación, además, esta construcción tisular puede formarse mediante siembras de células madre mesenquimales y células madre mesenquimales diferenciadas en células de Schwann y células nerviosas para producir una construcción tisular cultivada que imita la composición celular y las estructuras tisulares para la transducción de señales, la reparación y la regeneración de nervios como tejidos nativos. Las construcciones tisulares de la divulgación son útiles para fines clínicos, tales como el injerto de nervios a un paciente con un defecto tisular u orgánico, tal como una lesión de nervios periféricos o cualquier otro tipo de lesión de nervios, o para ensayos tisularesin vitroo injertos en animales, tales como para ensayos de seguridad o validación de productos farmacéuticos, cosméticos y químicos.

La presente divulgación utiliza células madre mesenquimales (MSC) proliferativas/preconfluentes, células de Schwann, células nerviosas, células madre mesenquimales diferenciadas en células de Schwann y células madre mesenquimales diferenciadas en células neuronales, mediante las cuales las células se transfieren del cultivo al conducto nervioso/matriz vivo listo para usar.

En una realización, las células se cultivan directamente sobre el conducto/matriz polimérico (andamiaje) para su implantación directa o administración. Por lo tanto, las células con andamiaje pueden transferirse como tales al paciente, evitando así los posibles daños que se producen en la separación enzimática convencional del recipiente de cultivo.

En una realización, las células se transfieren mientras están en un estado proliferativo. En algunas realizaciones, el uso de células preconfluentes ayuda a la adherencia de dichas células al lugar de aplicación, ya que expresan un perfil de integrinas diferente del de las células terminales totalmente diferenciadas.

En una realización, el componente interactivo de la divulgación se proporciona mediante el uso de células madre mesenquimales en proliferación activa, células de Schwann, células nerviosas (unipolares o bipolares o multipolares). Durante la reparación y regeneración del nervio dañado, se liberan en el lugar de aplicación una serie de citocinas, factores de crecimiento, etc., que ayudarán a la transducción de señales y a la regeneración del nervio.

En una realización, las células en el lugar de aplicación expresan moléculas que tienen tanto un efecto autocrino como paracrino.

En una realización, los usos de un sustituto de injerto de conducto nervioso artificial son útiles tanto para la reparación como para la regeneración de nervios dañados de forma sinérgica. La reparación indica el proceso que experimenta un tejido para regenerarse/reformarse completamente. Las células madre mesenquimales alogénicas, las células de Schwann y las células nerviosas utilizadas en este conducto nervioso/matriz ayudarán a reparar y regenerar el nervio dañado.

En otra realización, el proceso implica la optimización de los andamiajes sobre los que se siembran las células para formar un tejido uniforme con andamiajes que proporcionan señales físicas y químicas para guiar el proceso. Los andamiajes pueden seleccionarse de un grupo que comprende biopolímeros naturales, tales como el quitosano, la gelatina, el colágeno y el ácido hialurónico.

En otra realización, los andamiajes adoptan formas que van desde láminas esponjosas a geles o estructuras muy complejas con poros y canales intrincados fabricados con nuevas tecnologías de procesamiento de materiales. Las propiedades espaciales y de composición del andamiaje, su porosidad y la interconectividad de los poros son necesarias para permitir la penetración de las células en la estructura, así como el transporte de nutrientes y productos de desecho. La porosidad diferencial ayudará a la adhesión de las células y a la transducción de señales.

En una realización, se lleva a cabo el tratamiento fisicoquímico secuencial con patrón cronológico de los cuatro o más polímeros para obtener un andamiaje 3D liofilizado de complejo polielectrolítico (CPE) y también, al mismo tiempo, utilizar una proporción de aspecto específicamente diseñada de un sistema para la agitación/homogenización. El tratamiento fisicoquímico secuencial con patrón cronológico de los polímeros puede ser en forma de una disolución de gelatina a una temperatura de 35 a 75 °C, preferentemente a 60 °C, utilizando un 5 % p/v de gelatina, comprendiendo el proceso:

a) Agitar la solución de gelatina a 2000-3200 rpm a una temperatura de 15-30 °C durante 15 a 25 min.

b) Añadir una solución de quitosano al 1%p/v (en una solución de ácido acético glacial al 0,5-2,5%p/v) gota a gota a la solución de gelatina a una temperatura de 15-30 °C y agitar la solución con un homogeneizador durante 20 a 30 minutos.

c) Añadir una solución hialurónica (en agua Milli Q) preferentemente al 0,1-1 % p/v gota a gota a la mezcla y agitar durante 10 minutos.

d) Añadir una solución de colágeno de tipo 1 o de tipo 4 (en solución de ácido acético glacial) preferentemente al 0,1-1 % p/v gota a gota a la mezcla y agitar durante 10 minutos.

e) Añadir una solución de glutaraldehído preferentemente al 25-50 % v/v gota a gota a una concentración final del 0,1-0,5 % v/v.

En una realización, una vez completado el procedimiento anterior de tratamiento fisicoquímico de los polímeros, se lleva a cabo el proceso de liofilización de la solución compuesta. El compuesto se congeló a -80 °C durante 12 h y luego se liofilizó durante 72 h a 0 °C y 500 de motor de vacío.

En una realización, después de la liofilización, el conducto/matriz fue neutralizado con vapores de amoníaco (vapores de solución de amoníaco al 25 % p/v) durante 12 horas en una cámara cerrada dentro de la campana de humos.

En una realización, se siembran más células madre mesenquimales, células de Schwann y células nerviosas sobre un andamiaje biocompatible con una densidad celular de 0,5 * 105 a 0,8 * 105 células/cm2. Las células están en una monocapa y son confluentes entre el 80 % y el 100 % en la fase final de formulación del producto. Las células utilizadas para la siembra son del pase 2 al pase 5. Las células madre mesenquimales, las células de Schwann y las células nerviosas utilizadas para la siembra son células madre mesenquimales humanas, células de Schwann diferenciadas de células madre mesenquimales humanas y células nerviosas diferenciadas de células madre mesenquimales humanas y sólo una población pura. Las células madre mesenquimales, las células de Schwann y las células nerviosas segregan varios factores de crecimiento y citocinas (matriz extracelular) útiles para la reparación y regeneración de nervios.

En una realización, el producto final obtenido se transportará en un medio semisólido. El medio semisólido es medio de agar del 1 % p/v al 3 % p/v y medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales. El medio de agar contiene HEPES 2-3 gm/l y bicarbonato de sodio 2-3,5 gm/l. El medio semisólido contiene medio de agar y medio de cultivo celular en una proporción de 5:5, 6:4, 7:3 y 8:2 o cualquiera de ellos, respectivamente. El medio semisólido mantiene la viabilidad celular de la matriz entre el 60 % y el 90 % a la temperatura de 4 °C a 37 °C durante 28 días.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y, por lo tanto, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención:

Ejemplo 1: Diseño y fabricación de un conducto/matriz de guía nervioso a base de biopolímeros Preparación de un conducto nervioso/matriz:

En una realización, tomar 50 ml de solución de gelatina al 5 % p/v y homogeneizarla durante 15 min a 2000 rpm. Añadir 25 ml de solución de quitosano al 1 % p/v gota a gota a la solución de gelatina. Seguir removiendo esta mezcla durante 30 min hasta formar una mezcla homogénea. Añadir gota a gota 500 pl de solución de HA (ácido hialurónico) al 0,1 % p/v con agitación durante 10 min. A esta mezcla, añadir 1 ml de solución de colágeno al 0,1 % p/v. Tras 10 min de agitación continua, añadir 200 pl de solución de glutaraldehído al 50 % v/v para la reticulación. Una vez homogeneizada la mezcla, verter la muestra en bandejas/conductos y congelar a -80 °C durante 12 h, seguido de liofilización (ciclo de 72 h, secado a 0 °C, vacío de 66,7 Pa (500 mtorr)) para formar andamiajes porosos.

Inoculación y cultivo de células madre mesenquimales, células de Schwann y células nerviosas:

En una realización, se sembraron 0,5 * 105 células en el andamiaje preaclimatado (andamiaje empapado en medio de cultivo celular) y se cultivaron las células en los días 12-15. Después o entre el día 12 y 15, los andamiajes estaban completamente llenos de células madre mesenquimales, células de Schwann y células nerviosas y ricos en factores de crecimiento y nutrientes como se muestra en la figura 1.

Ejemplo 2: Comportamiento de degradaciónin vitrodel conducto nervioso/matriz

En una realización, la degradaciónin vitrodel conducto nervioso/matriz se estudió incubándolos en una solución enzimática y controlando su pérdida de peso en diferentes puntos temporales.

En una realización, las muestras de andamiaje fueron incubadas en 1X PBS que contenía tripsina (0,25 mg/ml) y colagenasa (0,1 mg/ml) a 37 °C en una estufa de incubación con agitador a 60 rpm durante diversos periodos de hasta 21 días.

En una realización, en intervalos de tiempo predeterminados, los andamiajes se retiraron del medio de incubación, se lavaron con agua desionizada y posteriormente se secaron en la estufa para la medición del peso final. A continuación, se determinó la pérdida de peso como diferencia entre la masa seca de la muestra antes y después de la incubación, normalizada con respecto a la masa seca de la muestra antes de la incubación.

En una realización, los andamiajes incubados en tripsina tuvieron la mayor reducción de peso después de dos semanas de incubación en comparación con la incubación en colagenasa. Además, también se realizó la degradaciónin vitrode los andamiajes en PBS, solución salina y medios a 37 °C para comprobar la estabilidad mecánica a largo plazo y la degradación del material de los andamiajes.

En una realización, los andamiajes no se degradaron en PBS, solución salina y medios hasta pasados cuatro meses, lo que indica un comportamiento de degradación controlada del conducto nervioso/matriz, tal como se muestra en la figura 2.

Ejemplo 3: Prueba de hinchamiento de un conducto nervioso/matriz fabricado

En una realización, para determinar el porcentaje de absorción de agua, se realizaron estudios de hinchamiento por inmersión de los andamiajes en 1X PBS. Se determinó el peso seco del andamiaje antes de la inmersión (Ps). Los andamiajes se introdujeron en una solución tampón de PBS y, tras un tiempo predeterminado, se extrajeron, se eliminó el agua adsorbida de la superficie con papel de filtro y se registró su peso húmedo(Ph)como se describe en la figura 3. La proporción de hinchamiento se determinó mediante la ecuación:

(Ph - Ps)

Proporción de hinchamiento

Ps

Ejemplo 4: Análisis por infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR)

En una realización, la estructura química del conducto nervioso/matriz fabricado se analizó mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). El espectro de infrarrojo del andamiaje se midió en una gama de longitudes de onda de 4000 a 400 cm-1, como se muestra en la figura 4.

Ejemplo 5: Caracterización morfológica de un conducto nervioso/matriz mediante SEM

En una realización, se realizó una microscopía electrónica de barrido ("scanning electron microscopy", SEM) para estudiar la superficie y la morfología de la sección transversal del conducto nervioso/matriz. La imagen SEM (figura 5) demostró que el conducto nervioso/matriz poseía una estructura porosa bien definida y bien integrada que es fundamental para la fijación, proliferación y supervivencia de las células. Las imágenes a mayor aumento indican la presencia de poros abiertos e interconectados de diferentes tamaños en la superficie de los andamiajes. Así, el conducto nervioso/matriz posee una morfología porosa suficiente y beneficiosa para la vascularización y el intercambio de nutrientes entre el lumen y el entorno exterior.

Ejemplo 6: Evaluación de la citotoxicidad de un conducto nervioso/matriz mediante el ensayo MTT

En una realización, se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidadin vitropara comprobar la biocompatibilidad del conducto nervioso/matriz. Este ensayo se basa en la medición de la viabilidad de las células a través de la actividad metabólica. El MTT amarillo soluble en agua (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) se reduce metabólicamente en las células viables a un formazán insoluble azul-violeta. El número de células viables se correlaciona con la intensidad del color determinada mediante mediciones fotométricas tras disolver el formazán en DMSO. La citotoxicidad de los andamiajes se evaluó de acuerdo con las directrices ISO 10993-5-2009, utilizando un período de extracción de 24 horas en condiciones dinámicas.

Para calcular la reducción de la viabilidad en comparación con el blanco, se utilizó la siguiente ecuación:

Absorbancia de la concentración del extraco(570nm)

% de viabilidad

Absorbancia del blanco(570nm)

Claramente, los datos de MTT (figura 6) revelaron que el andamiaje de conducto nervioso/matriz no indujo ninguna respuesta citotóxica en ninguna de las concentraciones de extracto ensayadas. En general, el conducto nervioso/matriz mostró una biocompatibilidad y viabilidad celular significativas para las células L929.

Ejemplo 7: Evaluación de la adhesión y proliferación celular de MSC sobre un conducto nervioso/matriz

En una realización, se llevó a cabo una tinción con calceína-AM para comprobar el soporte del conducto nervioso/matriz para la adhesión celular y la proliferación de MSC. El andamiaje estéril se equilibró en medio de cultivo durante la noche antes de la siembra. Las MSC se sembraron con una densidad de 5 * l04 células por andamiaje y se incubaron a 37 °C en un incubador de CO2. Tras 5 días de cultivo, se retiró el medio del andamiaje y se lavó con medio sin suero para eliminar por completo la actividad esterasa sérica. Se preparó una solución de tinción de calceína-AM 2 |<j>M añadiendo 1 j l de calceína-AM 2 mM a 1 ml de medio sin suero. Se añadió un volumen suficiente de solución de tinción de calceína-AM para cubrir la superficie del andamiaje. Las células se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las células marcadas se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia para comprobar la adhesión y proliferación celular, como se muestra en la figura 7.

Ejemplo 8: Tinción con PKH26 de MSC sobre un conducto nervioso/matriz

En una realización, se realizó una tinción con PKH26 para hacer el seguimiento de las MSC marcadas sobre el conducto nervioso/matriz después de 48 horas de cultivo. Las MSC teñidas previamente con PKH26 crecieron uniformemente por todo el andamiaje y mostraron una señal fluorescente adecuada tras 48 horas en cultivo. La tinción con calceína confirmó además la biocompatibilidad del andamiaje de conducto nervioso/matriz para las MSC, como se muestra en la figura 8.

Ejemplo 9: Observación morfológica de la adhesión celular mediante SEM

En una realización, las MSC se cultivaron en una concentración de 0,5 * 105 células sobre un andamiaje de conducto nervioso/matriz. Tras 5 días de cultivo celular, se observó mediante SEM la morfología de las células sembradas sobre los andamiajes compuestos. Tal como se muestra en la figura 9, las MSC estaban bien adheridas y extendidas, mostrando más excrecencias celulares. Además, la invasión celular indica la naturaleza porosa del conducto, que proporciona espacio suficiente y un entorno 3D para el crecimiento y la migración celular.

Ejemplo 10: Preparación de secciones del andamiaje de un conducto nervioso/matriz para comprobar la proliferación y migración de las MSC

En una realización, el conducto nervioso/matriz se dividió en diferentes secciones para comprobar la adherencia y viabilidad de las células MSC en el lumen y sobre la superficie exterior de la pared del conducto utilizando una tinción con calceína-AM. Se capturaron imágenes del conducto (figura 10) en secciones verticales y horizontales para garantizar la migración de las células.

Ejemplo 11: Crioconservación y liofilización de un conducto nervioso/matriz sembrado con células

En una realización, para comprobar la eficacia de la supervivencia celular después de la liofilización (figura 11), se utilizó trehalosa a una concentración única de 0,5 M junto con tres concentraciones diferentes de albúmina de suero bovina ("Bovine Serum Albumin", BSA), es decir, al 12,5 % p/v, al 10 % p/v, al 9,5 % p/v. Los andamiajes sembrados con MSC se crioconservaron utilizando medios de congelación compuestos por MEM alfa con FBS al 10 % p/v junto con A) MEM alfa FBS al 20 % p/v trehalosa deshidratada 0,5 M BSA al 12,5 % p/v; B) MEM alfa FBS al 20 % p/v trehalosa deshidratada 0,5 M BSA al 10 % p/v; C) MEM alfa FBS al 20 % p/v trehalosa deshidratada 0,5 M BSA al 9,5 % p/v; D) MEM alfa FBS al 20 % p/v trehalosa deshidratada 0,5 M solo. Las placas Petri que contenían los andamiajes se introdujeron en una solución de congelación que contenía alcohol isopropílico y que proporciona una velocidad de enfriamiento de 1 °C/min cuando se almacena a -80 °C. La liofilización se realizó transfiriendo las muestras congeladas de -80 °C a los estantes de temperatura controlada de un liofilizador. Ciclo de liofilización: Ciclo de liofilización: Secado 0 °C, Vacío 66,7 Pa (500 mtorr), ciclo de 48 h. Los andamiajes crioconservados en condiciones de liofilización en los criomedios A, B, C, D revivieron con éxito, como muestra la tinción con calceína realizada al cuarto día de la revivificación.

Ejemplo 12: Diferenciaciónin vitrode las MSC en células similares a células de Schwann

En una realización, para la diferenciación se aplicaron varios reactivos y factores tróficos para inducir a las MSC a la diferenciación en células con un fenotipo similar al de las células de Schwann (figura 12) mediante un tratamiento secuencial: primero con p-mercaptoetanol (BME), seguido de tratamiento con ácido todo-trans-retinoico (ATRA) y, a continuación, cultivando las células en presencia de forskolina (FSK), bFGF, PDGF y HRG. La microscopía de contraste de fases reveló que las MSC diferenciadas eran morfológicamente diferentes de las MSC indiferenciadas originales. Las células cultivadas en el medio de diferenciación cambiaron de una morfología similar a la de los fibroblastos a una forma de huso alargado (Figura 12), similar a la de las células de Schwann.

En una realización, para confirmar el éxito de la diferenciación de SC, se realizó una inmunocitoquímica de S-100, p75, CD104 y CD56, todos conocidos como marcadores de las células de Schwann. Tras la inducción, la mayoría de las SC diferenciadas fueron positivas para S100, CD56, CD 104 y p75 (figura 13), en contraste con las MSC indiferenciadas.

Ejemplo 13: Estudio de la degradaciónin vivode un conducto nervioso/matriz

En una realización, para el estudio de degradaciónin vivo, el conducto nervioso/matriz, tanto en forma de conducto como de lámina, se implantó de forma subcutánea en el lomo de ratas SD (figura 14). En puntos temporales predefinidos (4, 8, 12, 16, 20 y 27 semanas) tras la implantación, se fotografiaron los andamiajes de ensayo y se recogieron junto con el tejido circundante para su evaluación histológica. El conducto nervioso/matriz no se degradó durante todo el periodo de implantación y permaneció estable hasta 27 semanas después de la implantación.

Ejemplo 14: Implantaciónin vivo paracomprobar la eficacia de un conducto nervioso/matriz presembrado con células de Schwann diferenciadas

En una realización, el estudioinvivo se llevó a cabo para evaluar la eficacia del conducto nervioso/matriz presembrado con células madre mesenquimales (MSC) y células de Schwann diferenciadas de MSC para reparar un defecto de un nervio periférico en el modelo de sección del nervio ciático de rata. El modelo de sección del nervio ciático de la rata se ha utilizado habitualmente para evaluar la capacidad de los NGC obtenidos por ingeniería tisular para estimular la regeneración de nervios periféricosin vivo.Antes de la implantaciónin vivo,se investigó la biocompatibilidadin vitrodel conducto nervioso/matriz con MSC. El estudio piloto inicial de los inventores para optimizar los experimentosin vivose realizó con 15 ratas Sprague Dawley. Se seccionó el nervio ciático derecho de cada animal y se retiró un segmento de 10 mm del nervio, creando así una brecha que se rellenó con (1) un conducto nervioso/matriz sembrado con SC diferenciadas (conducto nervioso/matriz DSC) o (2) MSC y SC diferenciadas (conducto nervioso/matriz B2 DSC). El nervio ciático izquierdo permaneció intacto y se utilizó posteriormente como control. La eficacia del conducto nervioso/matriz se investigó basándose en los resultados del análisis de la trayectoria de la marcha, la electrofisiología y la evaluación histológica (figura 15).

Ejemplo 15: Análisis histológico de un conducto nervioso/matriz implantado

En una realización, para la evaluación histológica de la regeneración de nervios, se seccionó el tejido nervioso cosechado y se tiñó con hematoxilina-eosina y azul de toluidina. Las observaciones morfológicas realizadas a las 8 semanas del postoperatorio detectaron que las fibras mielinizadas regeneradas eran más pequeñas y mostraban una vaina de mielina más fina en comparación con los nervios normales. El grupo de conducto nervioso/matriz DSC mostró distribución de fibras nerviosas con mielina y tejido conectivo fibroso (figura 16). Este grupo mostraba un perineuro y epineuro de forma irregular, ocupados en su mayor parte por tejido conjuntivo fibroso, con el centro mostrando axones distorsionados con plasma ondulado y vaina de mielina. Además, se observaron numerosos vasos sanguíneos alrededor de los nervios regenerados. La regeneración del nervio fibroso mielinizado se considera un factor importante por lo que se refiere a la regeneración nerviosa de nervios dañados. El número de fibras nerviosas regeneradas distales a los NGC sembrados con SC diferenciadas fue menor en comparación con el punto medio del conducto. El grupo de conducto nervioso/matriz B2 DSC mostró nervios en crecimiento con menos fibras mielinizadas y vainas de mielina más finas en comparación con el grupo de conducto nervioso/matriz DSC. En este grupo, sin embargo, eran visibles muchas menos fibras nerviosas, pero una gran cantidad de tejido conjuntivo entre los muñones nerviosos. Además, se descubrió la infiltración de células inflamatorias en las porciones proximal e intermedia del injerto, rodeadas de fibras de tejido conectivo fibroso y cuerpos de células nerviosas.

En una realización, el conducto nervioso/matriz preparado es un sustituto potencial en la regeneración y reparación de nervios y ayuda a un restablecimiento más rápido de la función motora y sensorial en lesiones de nervios (lesión de nervios periféricos, lesión de la médula espinal y cualquier otro tipo de lesión de nervios). Se realizaron diversos experimentos para comprobar dicha eficacia del conducto nervioso/matriz de bioingeniería. Los resultados de viabilidad celular, microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de barrido confirman el crecimiento celular y la distribución uniforme de las células en la matriz. Los estudiosin vivoconfirmaron el potencial de regeneración y reparación de nervios del conducto.

En una realización, los resultados obtenidos acerca del potencial y las propiedades del producto de esta invención se consideraron considerablemente eficaces. Esto indica claramente el avance técnico en comparación con la técnica anterior.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una técnica novedosa y exclusiva de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células madre mesenquimales diferenciadas en células de Schwann y células nerviosas en una capa proliferativa y subconfluente sobre un conducto/matriz biocompatible liofilizado preparado a partir de una pluralidad de polímeros compuestos utilizando glutaraldehído como reticulante sin ningún producto químico nocivo integrado para la implantación directa o la administración de dichas células madre mesenquimales humanas, en la que, en dicha divulgación, dichas células se transfieren mientras están en estado proliferativo y el producto final obtenido se transporta en un medio semisólido. Dicho medio semisólido es medio de agar del 1 % p/v al 3 % p/v y medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales que incluye HEPES 2-3 gm/l y bicarbonato de sodio 2 3,5 gm/l adecuado para injertos y proporciona un conducto nervioso/matriz artificial biodegradable y biocompatible mejor, eficiente, fácil de usar, rentable y listo para usar para la reparación y regeneración de nervios con función sensorial y motora de forma sinérgica en la que los injertos pueden prepararse en 12 días.

Así pues, la presente divulgación proporciona un andamiaje tridimensional mejorado biodegradable, biocompatible y de alta porosidad basado en un conducto nervioso/matriz artificial de un complejo polielectrolítico (CPE) con células madre humanas autólogas/alogénicas para la reparación y regeneración de nervios, y un procedimiento de preparación del mismo, comprendiendo dicho andamiaje una pluralidad de polímeros compuestos y utilizando el glutaraldehído como reticulante, en el que dicho andamiaje no es adherente, tiene porosidad diferencial, es capaz de cultivar células directamente sobre el conducto/matriz polimérico (andamiaje) para su implantación directa o administración.

En una realización, dichos injertos se preparan en 12 días.

En otra realización, dichos andamiajes adoptan formas que varían desde láminas esponjosas a geles y estructuras muy complejas con poros y canales intrincados fabricados con nuevas tecnologías de procesamiento de materiales, de forma que las propiedades espaciales y de composición del andamiaje, la porosidad del andamiaje y la interconectividad de los poros permiten la penetración de células en la estructura, así como el transporte de nutrientes y productos de desecho, con porosidad diferencial que ayuda a la adhesión celular y la transducción de señales.

En otra realización, dicho procedimiento comprende una técnica exclusiva de cultivo de células madre mesenquimales humanas, células madre mesenquimales diferenciadas en células de Schwann y células nerviosas en una capa proliferativa y subconfluente sobre un conducto/matriz biocompatible liofilizado, sin ningún producto químico nocivo integrado para la implantación directa o la administración de dichas células madre mesenquimales humanas, en la que las células se transfieren mientras están en estado proliferativo y el producto final obtenido se transporta en un medio semisólido.

En otra realización, dicho conducto nervioso/matriz proporciona reparación y regeneración de forma sinérgica.

Dichos polímeros están en el intervalo de gelatina al 1 %-10 % p/v, quitosano al 0,5 %-2,5 % p/v, ácido hialurónico al 0,1 %-2 % p/v, colágeno al 0,1 %-10 % p/v y solución de glutaraldehído al 5 %-50 % v/v con gelatina de 50-300 de poder gelificante, DAC (dialdehído de celulosa) quitosano entre el 75 %-95 % p/v.

En otra realización, dicho medio semisólido es un medio de agar en el intervalo del 1 % p/v al 3 % p/v y un medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales que incluyen HEPES 2-3 gm/l y bicarbonato de sodio 2-3,5 gm/l adecuado para injertos que produce un conducto nervioso/matriz artificial biodegradable y biocompatible mejor, eficiente, fácil de usar, rentable y listo para usar para la reparación y regeneración de nervios con función sensorial y motora, de forma sinérgica.

En otra realización, dicho procedimiento de preparación del andamiaje comprende un tratamiento fisicoquímico; y liofilización del andamiaje liofilizado.

En otra realización, dicho procedimiento comprende un tratamiento fisicoquímico secuencial con patrón cronológico de los cuatro o más polímeros para obtener un andamiaje 3D de complejo polielectrolítico (CPE) y también, al mismo tiempo, utilizar una proporción de aspecto específicamente diseñada de un sistema de agitación/homogenización.

En otra realización, dicho procedimiento comprende estabilizar el andamiaje mediante reticulación con una solución de glutaraldehído y liofilización.

En otra realización, dicho andamiaje 3D liofilizado obtenido se estabiliza y neutraliza con vapores de amoníaco (al 5 % p/v-25 % p/v) durante 12 a 24 horas en una cámara cerrada para que el andamiaje sea estable y funcional para la siembra de células.

En otra realización, dicho andamiaje obtenido se liofiliza para que el andamiaje sea estable para la siembra de células madre mesenquimales autólogas o alogénicas (MSC derivadas de médula ósea o cordón umbilical), células de Schwann y células neuronales (diferenciadas a partir de células madre mesenquimales).

En otra realización, dichas células madre mesenquimales, células de Schwann y células neuronales se siembran en un andamiaje biocompatible con una densidad celular de 0,5 * 105 a 0,8 * 105 células/cm2.

En otra realización, dichas células están en una monocapa y son confluentes de un 80 % a un 100 % en la etapa final de formulación del producto.

En otra realización, dichas células sembradas sobre el andamiaje se cultivan en medio con suero y sin suero.

En otra realización, dichas células madre mesenquimales son autólogas, alogénicas o ambas.

En otra realización, dichas células madre mesenquimales, células de Schwann y células neuronales secretan varios factores de crecimiento y citocinas (matriz extracelular) útiles en la regeneración y reparación de nervios.

En otra realización, el producto final es transportado en medio semisólido y/o medio líquido o en estado congelado, de tal manera que el medio semisólido/medio líquido proporciona nutrientes y soporte a la matriz y mantiene la viabilidad celular de la matriz del 70 % al 95 % a la temperatura de 4 °C a 37 °C durante 15 días.

En otra realización, dicho conducto/andamiaje tiene forma de lámina y/o forma de conducto cilíndrico hueco.

Ventajas de la invención

La invención ofrece las siguientes ventajas:

• El andamiaje de la presente invención ayuda en la regeneración y reparación de nervios.

• La presente invención comprende una curación mejorada.

• Puede fabricarse en cualquier tamaño y forma según las necesidades.

• Es fácil de manejar.

• Es respetuoso con el medio ambiente, ya que se degrada fácilmente.

• Garantiza una curación rápida en las lesiones de los nervios periféricos.

• Garantiza una recuperación y reparación más rápidas de la función motora y sensorial.

• Los injertos pueden realizarse en 12 días.

• Es económico y ofrece un tratamiento alternativo a los procedimientos habituales de tratamiento de lesiones de nervios.

• El riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas se reduce drásticamente gracias a los rigurosos controles del proceso.

• Ayuda a restablecer la función motora y sensorial del tejido dañado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conducto nervioso artificial biodegradable, biocompatible y de alta porosidad para su implantación directa o administración en procesos de reparación y regeneración de nervios, comprendiendo dicho conducto nervioso un andamiaje de complejo polielectrolítico (CPE) que comprende una pluralidad de polímeros,caracterizado porquedicho conducto nervioso comprende células humanas autólogas y/o alogénicas directamente soportadas sobre el andamiaje, en el que los polímeros del andamiaje están reticulados por un reticulante de glutaraldehído, en el que los polímeros consisten en gelatina al 1 %-10 % p/v, quitosano al 0,5 %-2,5 % p/v, ácido hialurónico al 0,1 %-2 % p/v, colágeno al 0,1 %-10 % p/v y solución de glutaraldehído al 5 %-50 % v/v, en el que el poder gelificante de la gelatina es de 50-300 y el quitosano DAC (dialdehído de celulosa) oscila entre el 75 % p/v y el 95 % p/v, siendo el andamiaje no adherente, con porosidad diferencial y apto para el cultivo de células directamente sobre su superficie, y en el que las células humanas autólogas y/o alogénicas se seleccionan entre células madre mesenquimales, células de Schwann diferenciadas y células neuronales en estado proliferativo.

2. El conducto nervioso artificial según la reivindicación 1, en el que el andamiaje está formado por láminas esponjosas o por estructuras muy complejas con poros y canales intrincados, de manera que las propiedades espaciales y de composición del andamiaje, la porosidad del andamiaje y la interconectividad de los poros permiten la penetración de las células en la estructura, así como el transporte de nutrientes y productos de desecho, y la porosidad diferencial ayuda a la adhesión de las células y a la transducción de señales.

3. El conducto nervioso artificial según la reivindicación 2, en el que el andamiaje tiene forma de lámina o forma cilíndrica hueca.

4. El conducto nervioso artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los polímeros adicionales incluidos se seleccionan entre poli(alcohol vinílico) (PVA), policaprolactona (PCL), polipirrol, poliuretano (PU), poli(alilamina), poli(etilenglicol) 200 (PEG 200), goma arábiga, goma guar, colágeno parcialmente desnaturalizado o combinaciones de los mismos.

5. Un procedimiento de preparación del conducto nervioso artificial biodegradable, biocompatible y de alta porosidad definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su implantación directa o administración en procesos de reparación y regeneración de nervios, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el medio semisólido contiene medio de agar con un contenido de agar que oscila entre el 1 % p/v y el 3 % p/v, así como un medio de cultivo celular con factores de crecimiento esenciales, conteniendo el medio de agar 2-3 gm/l de HEPES y 2-3,5 gm/l de bicarbonato de sodio.

7. El procedimiento según la reivindicación 5 o 6, en el que el andamiaje obtenido en la etapa (a) se liofiliza antes de la etapa (b).

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la etapa (a) implica un tratamiento fisicoquímico secuencial con patrón cronológico de los polímeros para obtener un andamiaje 3D de complejo polielectrolítico (CPE)

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que el andamiaje liofilizado se estabiliza y neutraliza mediante vapores de amoníaco (al 5 %-25 %) durante 12 a 24 h en una cámara cerrada antes de ser utilizado en la etapa (b).

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que en la etapa (b) las células se siembran sobre la superficie del material biocompatible del andamiaje con una densidad celular de 0,5 * 105 a 0,8 * 105 células/cm2.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que en la etapa (c) las células forman una monocapa confluente entre el 80 % y el 100 %.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que en la etapa (c) el medio de cultivo semisólido comprende suero.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que la etapa (c) se realiza durante 12 días.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, 6 a 14, que comprende una etapa adicional (d) de mantener el conducto nervioso artificial final en un medio semisólido y/o líquido, en el que el medio semisólido/líquido comprende nutrientes y es capaz de mantener la viabilidad de las células en monocapa cultivadas sobre la superficie del andamiaje entre el 70 % y el 95 % a la temperatura de 4 °C a 37 °C durante 15 días.