ES2966181T3

ES2966181T3 - Método para preparar GOS que tienen alergenicidad reducida

Info

Publication number: ES2966181T3
Application number: ES18732370T
Authority: ES
Inventors: Dirk Groeneveld; Bas Kuipers; Bernardina Delsing; Linqiu Cao
Original assignee: FrieslandCampina Nederland BV
Current assignee: FrieslandCampina Nederland BV
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2024-04-18
Anticipated expiration: 2038-06-26
Also published as: EP3645011C0; WO2019002304A1; US11535641B2; CN110799195B; EP3645011B1; CN110799195A; PL3645011T3; EP3645011A1; SG11201913210PA; US20200115407A1; AU2018293698A1; AU2018293698B2

Abstract

La invención se refiere al campo de los ingredientes nutricionales, en particular a métodos para producir galactooligosacáridos (GOS) hipoalergénicos y su uso en alimentos y bebidas. Se proporciona el uso de una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada de Cryptococcus terrestris (recientemente rebautizada como Papiliotrema terrestris) en la producción de una preparación de GOS hipoalergénica que tiene una capacidad reducida para inducir una respuesta alérgica en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar GOS que tienen alergenicidad reducida

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al campo de los ingredientes nutricionales. Más en particular, se refiere a métodos para producir galacto-oligosacáridos hipoalergénicos y al uso de los mismos en artículos de comida y de bebida. La invención se refiere particularmente al uso de una beta-galactosidasa derivada deOryptococcus terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris)en la producción de una preparación de GOS hipoalergénica.

Antecedentes de la invención

El término “GOS” significa galacto-oligosacáridos (GOS), que comprenden generalmente una cadena de unidades de galactosa y una unidad de glucosa terminal, que surgen a través de reacciones de transgalactosilación consecutivas (reacciones de transgalactosilación), catalizadas por una beta-galactosidasa. Algunos de los componentes de GOS existen de manera natural en la leche materna human y el calostro bovino. Las preparaciones de GOS típicas comprenden principalmente de di- a hexasacáridos.

Se han notificado diversas funciones fisiológicas de los GOS, incluyendo la capacidad de estimular el crecimiento de bacterias bifidogénicas en el intestino [1-3], de respaldar el tránsito intestinal normal [4], de contribuir a las defensas naturales [5, 6] y de potenciar la absorción de minerales [7]. Los GOS han recibido atención particular por sus efectos prebióticos que promueven el crecimiento deBifidobacterium, Lactobacillusy otras bacterias entéricas. Por tanto, los GOS se usan comúnmente en preparado para lactantes, bebidas fermentadas medianteLactobacillusy yogures. Algunos de estos alimentos que contienen GOS están certificados como alimentos para usos específicos de salud(Food for Specified Health Uses)por la Agencia de asuntos del consumidor en Japón, y los GOS están certificados como sustancias reconocidas generalmente como seguras (GRAS) por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos (notificaciones GRAS: GRN 233, 236, 285, 286, 334, 484, 489, 495, 518 y 569).

En general, los GOS se producen mediante una reacción de transglicosilación (en particular una reacción de transgalactosilación) con una enzima beta-galactosidasa (clase de enzima EC.3.2.1.23). Las enzimas betagalactosidasa se producen en muchos microorganismos tales comoBacillus circulans, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis, Sporobolomyces singularisyLactobacillus fermentum.Las betagalactosidasas difieren en sus estructuras tridimensionales, dando como resultado la estereo- y regioselectividad de los enlaces glicosídicos que se forman. Por ejemplo, normalmente una beta-galactosidasa fúngica derivada deAspergillusproduce predominantemente enlaces (31-6 (dando así como resultado una preparación de GOS que comprende predominantemente enlaces (31 -6, que puede denominarse “6’-GOS”), mientras que una betagalactosidasa bacteriana derivada deBacillusproduce predominantemente enlaces (31-4 (dando como resultado una preparación de GOS que comprende predominantemente enlaces (31-4, que también puede denominarse “4’-GOS”). Además, la beta-galactosidasa producida porB. circulanspresenta una actividad de transgalactosilación particularmente fuera y, por tanto, los GOS preparados medianteB. circulansse venden en todo el mundo.

Desde su introducción en el mercado (1999), aproximadamente más de 100 millones de lactantes han consumido preparado para lactantes que contiene GOS preparados medianteB. circulans.Se ha demostrado que es un ingrediente seguro, con un estado GRAS reconocido por la FDA.

Sin embargo, en los últimos años se han notificado un pequeño número de casos muy raros de alergia relacionada con GOS en el Sudeste Asiático. La investigación ha mostrado que ciertas estructuras de oligosacárido presentes en los GOS pueden ejercer una respuesta alérgica en sujetos muy sensibles [8].

Jyoet al.(Occup. Environ. Allergy 3, 12-20 (1992)) determinaron síntomas de alergia tras el consumo de una bebida con lactobacilos que contenía 6’-GOS producida mediante beta-galactosidasa fúngica. También se han observado síntomas de alergia con 4’-GOS producida mediante beta-galactosidasa bacteriana. En 2014, Kanekoet al.(Biosc. Biotechnol. Biochem. 78, 100-108) observaron que los GOS producidos tratando lactosa con una beta-galactosidasa derivada deB. circulanspueden inducir reacciones alérgicas y revelaron que las alergias estaban provocadas por dos tetrasacáridos [Gal p1 -4 (Gal p1 -4 Gal p1 -6 GIc, Gal (31-4 Gal (31-4 Gal (31-3 GIc]. Estos casos de alergia por GOS se produjeron en sujetos que ya tenían un historial de atopia.

Los presentes inventores tuvieron como objetivo la fabricación de una preparación de GOS que tuviese alergenicidad reducida. En particular, pretendieron identificar una beta-galactosidasa para su uso en la fabricación de una preparación de GOS que tuviese una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante beta-galactosidasa deBacillus circulanso mediante beta-galactosidasa deAspergillus oryzae.

Sumario de la invención

Se observó sorprendentemente que una preparación de GOS producida mediante una p-galactosidasa derivada de un microorganismo del géneroOryptococcustiene una alergenicidad inesperadamente baja. Más específicamente, se encontró en una prueba de exposición oral que GOS obtenidos usando una enzima beta-galactosidasaOryptococcus terrestrisno inducía síntomas alérgicos en sujetos humanos que sufren hipersensibilidad a GOS preparados mediante enzima deB. circulansconvencional.

Por la presente, la invención proporciona el método según la reivindicación 1 que implica el uso de una betagalactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deO. terrestrisen la producción de una preparación de galacto-oligosacáridos (GOS) hipoalergénica. Dicha preparación de GOS hipoalergénica tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando beta-galactosidasa derivada deBacillus circulansoAspergillus oryzae.Más en particular, dicha preparación de GOS hipoalergénica tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto que tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando beta-galactosidasa derivada deBacillus circulansoAspergillus oryzae.

Se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris),para su uso en prevenir al menos parcialmente una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto.

También se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris),para su uso en prevenir al menos parcialmente una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae.

Se da a conocer adicionalmente, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestrispara su uso en una composición nutricional para un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBacillus circulansoAspergillus oryzae.

También se da a conocer, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, un método para prevenir al menos parcialmente la hipersensibilidad a una preparación de GOS en un sujeto, que comprende administrar una composición nutricional (hipoalergénica) que comprende una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris)al sujeto.

La composición nutricional comprende (i) una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestrisy (ii) al menos un ingrediente adicional seleccionado del grupo que consiste en una fuente de proteínas hipoalergénicas o no alergénicas, preferiblemente un hidrolizado de proteína, preferiblemente un hidrolizado de proteína no alergénico, aminoácidos libres, probióticos, LC-PUFA y carbohidratos, tales como lactosa, sacarosa, almidón o maltodextrina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al método según la reivindicación 1 e implica el uso de una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deO. terrestrisen la producción de una preparación de galacto-oligosacáridos (GOS) hipoalergénica. La preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae.

Debe indicarse que el organismo“Oryptococcus terrestris"se renombró recientemente como“Papiliotrema terrestris".Por tanto, los nombres“Oryptococcus terrestris" (O. terrestris)y“Papiliotrema terrestris" (P. terrestris)se refieren al mismo organismo. En la presente descripción y en las reivindicaciones, el nombreOryptococcus terrestrisse usa a lo largo de las mismas. Sin embargo, el organismoOryptococcus terrestristambién puede denominarse mediante el nombrePapiliotrema terrestris. Oryptococcus terrestrises el basónimo dePapiliotrema terrestris(Liuet al.,Towards an integrated phylogenetic classification of the Tremellomycetes, Studies in Mycology 81,85-147 (2016)).

Tal como se usa en el presente documento, el término “preparación de GOS hipoalergénica” (abreviado como HA-GOS) se refiere a una composición de GOS que, cuando se administra a un sujeto que sufre al menos un tipo de alergia relacionada con GOS, es decir una alergia provocada por GOS producidos mediante beta-galactosidasa deBacillus circulansy/o por GOS producidos mediante beta-galactosidasa deAspergillus oryzae,provoca una respuesta alérgica reducida en comparación con una preparación de GOS producida mediante beta-galactosidasa deBacillus circulansoAspergillus oryzae.

En un aspecto, el término “preparación de GOS hipoalergénica” se refiere a una preparación de GOS que provoca al menos una alergenicidad reducida en un sujeto que sufre alergia relacionada con GOS derivados deBacillus circulans.En este aspecto, una preparación de GOS hipoalergénica provoca una respuesta alérgica reducida en comparación con una preparación de GOS producida medianteBacillus circulans.Más en particular, una preparación de GOS hipoalergénica tiene una puntuación disminuida en una prueba de punción cutánea en el sujeto y/o en una prueba de activación de basófilos realizada en una muestra de sangre aislada del sujeto en comparación con una preparación de GOS obtenida medianteBacillus circulans.

En otro aspecto, el término “preparación de GOS hipoalergénica” se refiere a al menos una alergenicidad reducida en un sujeto que sufre alergia relacionada con GOS derivados deAspergillus oryzae.En este aspecto, una preparación de GOS hipoalergénica provoca una respuesta alérgica reducida en comparación con una preparación de GOS producida medianteAspergillus oryzae.Más en particular, una preparación de GOS hipoalergénica tiene una puntuación disminuida en una prueba de punción cutánea en el sujeto y/o en una prueba de activación de basófilos realizada en una muestra de sangre aislada del sujeto en comparación con una preparación de GOS obtenida medianteAspergillus oryzae.

La invención implica el uso de una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deC. terrestrisen la producción de una preparación de galacto-oligosacáridos (GOS) hipoalergénica, teniendo dicha preparación de GOS una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae.

En una realización, la preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto del que se conoce que sufre hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBacillus circulansoAspergillus oryzae,en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae.

Por ejemplo, dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto que tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBacillus circulansoAspergillus oryzae,en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae.

En estas realizaciones, el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano. El sujeto puede tener cualquier edad. En una realización preferida, el sujeto es un adolescente o un adulto. Un adolescente se define en el presente documento como una persona que tiene una edad de desde 13 hasta 20 años. Un adulto se define en el presente documento como una persona que tiene una edad de 20 años o más. En otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 3 años (36 meses) a 13 años. En aún otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 0 a 3 años, preferiblemente que tiene una edad de 18 meses o más, más preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más. La alergia relacionada con GOS rara no se ha notificado en sujetos que tienen una edad de 18 meses o menos. Por tanto, en una realización preferida, el sujeto es un adulto, un adolescente o un niño, que tiene una edad de 18 meses o más, preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más, más preferiblemente que tiene una edad de 36 meses o más.

En vista de la incidencia localizada de las alergias relacionadas con 4’-GOS y/o 6’-GOS en el Sudeste Asiático (por ejemplo, Singapur, Japón), el sujeto es preferiblemente originario del Sudeste Asiático.

La(s) enzima(s) p-galactosidasa para su uso en la presente invención para la fabricación de GOS hipoalergénicos se conoce(n) en sí por la solicitud de patente WO 2017/115826 de Amano. El documento WO 2017/115826 reivindica una fecha de prioridad del 29 de diciembre de 2015, basándose en la solicitud de patente japonesa n ° 2015-257705.

El documento WO 2017/115826 da a conocer el examen de diversas clases de microorganismos para enzimas pgalactosidasa que tienen propiedades deseables para aplicaciones industriales desde puntos de vista de la resistencia al calor, la estabilidad de pH y otras. Esto dio como resultado el hallazgo de un microorganismo (cepa de tipo silvestre) del géneroCryptococcus,en particularCryptococcus terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris)que produce p-galactosidasa que tiene una temperatura óptima alta y una resistencia al calor superior y, además, una actividad de transgalactosilación excelente. La beta-galactosidasa derivada deCryptococcus terrestrisdescrita en el documento PCT/JP2016/089001 se describe en más detalle más adelante. El documento WO 2017/115826 describe también un método para producir oligosacáridos, que comprende una etapa de someter la enzima p-galactosidasa a una reacción con un disacárido, oligosacárido o polisacárido que tiene al menos uno de los enlaces p-1,3, p-1,4 y p-1,6. También se da a conocer un método para producir oligosacáridos, que comprende una etapa de someter la enzima p-galactosidasa a una reacción con lactosa.

El documento WO 2017/115826 describe además una mezcla de oligosacáridos obtenida mediante las enzimas y los métodos dados a conocer en el mismo, en particular una mezcla de oligosacáridos en la que el 65% o más de los trisacáridos contenidos en la mezcla de oligosacáridos se componen de un oligosacárido lineal. Se refiere además al uso de la enzima p-galactosidasa para la producción de oligosacáridos, producción de leche con bajo contenido en lactosa y producciones de medicamentos o suplementos para pacientes con intolerancia a la lactosa. El documento WO 2017/115826 enseña específicamente que los GOS producidos pueden usarse como factor de crecimiento deBifidobaoteriumintestinal.

Sin embargo, de manera importante, el documento WO 2017/115826 no aborda la alergenicidad de la mezcla de GOS obtenida usando cualquiera de sus enzimas. Por tanto, el presente hallazgo de que los GOS obtenidos mediante enzimas deOryptoooooussegún el documento WO 2017/115826 tienen una alergenicidad sorprendentemente baja en comparación con los GOS preparados medianteB. oiroulanso medianteA. oryzaeno se enseñaba ni sugería en la técnica.

Se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptooooous terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris),para su uso en la prevención, al menos parcialmente, de una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto.

También se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptooooous terrestris,para su uso en la prevención, al menos parcialmente, de una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una betagalactosidasa derivada deBaoillus oiroulanso deAspergillus oryzae.En una realización, se conoce que el sujeto sufre, o tiene una probabilidad aumentada de sufrir, hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBaoillus oiroulans.En otra realización, se conoce que el sujeto sufre, o tiene una probabilidad aumentada de sufrir, hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deAspergillus oryzae.

También se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deO. terrestris,para su uso en una composición nutricional para un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando beta-galactosidasa deBaoillus oiroulansoAspergillus oryzae.En una realización, se conoce que el sujeto sufre, o tiene una probabilidad aumentada de sufrir, hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBaoillus oiroulans.En otra realización, se conoce que el sujeto sufre, o tiene una probabilidad aumentada de sufrir, hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una betagalactosidasa derivada deAspergillus oryzae.

También en estas realizaciones, el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano. El sujeto puede tener cualquier edad. En una realización preferida, el sujeto es un adolescente o un adulto. En otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 3 años (36 meses) a 13 años. En aún otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 0 a 3 años, preferiblemente que tiene una edad de 18 meses o más. En otra realización preferida, el sujeto es un adulto, un adolescente o un niño que tiene una edad de 18 meses o más, preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más, más preferiblemente que tiene una edad de 36 meses o más. También en estas realizaciones, el sujeto es preferiblemente originario del Sudeste Asiático.

Se da a conocer adicionalmente, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, un método para prevenir al menos parcialmente la hipersensibilidad a una preparación de GOS en un sujeto, que comprende administrar una composición nutricional (preferiblemente hipoalergénica) que comprende una preparación de HA-GOS que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deO. terrestrisal sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, una composición nutricional se refiere a cualquier composición o formulación para pasa al canal alimentario con fines nutricionales, en cualquier estado sólido, líquido, gaseoso. Por tanto, una composición nutricional puede ser un artículo de comida o un artículo de bebida.

Además, en esta realización el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano, y puede tener cualquier edad. En una realización preferida, el sujeto es un adolescente o un adulto. En otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 3 años (36 meses) a 13 años, preferiblemente que tiene una edad de 18 meses o más. En otra realización preferida, el sujeto es un adulto, un adolescente, o un niño que tiene una edad de 18 meses o más, preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más, más preferiblemente que tiene una edad de 36 meses o más. También en estas realizaciones, el sujeto es preferiblemente originario del Sudeste Asiático.

La composición nutricional proporcionada mediante el método según la reivindicación 1 puede comprender (i) una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deC. terrestrisy (ii) al menos un ingrediente adicional seleccionado del grupo que consiste en una fuente de proteínas hipoalergénicas o no alergénicas, preferiblemente un hidrolizado de proteína de la leche no alergénico, aminoácidos libres, probióticos, una fuente de lípidos y carbohidratos, tales como lactosa, sacarosa, almidón o maltodextrina.

Fuentes de proteínas hipoalergénicas o no alergénicas se conocen en la técnica, particularmente para su empleo en preparado para lactantes. Los términos hidrolizados no alergénicos e hidrolizados sustancialmente libres de proteínas alergénicas tal como se usan en el presente documento son intercambiables. Se refieren a hidrolizados de proteína que pueden administrarse a lactantes que tienen intolerancia a proteínas de la dieta, más particularmente proteínas de leche de vaca, sin inducir reacciones alérgicas. En una realización, el al menos un ingrediente hipoalergénico o no alergénico adicional se selecciona de hidrolizados de proteína no alergénicos e hidrolizados sustancialmente libres de proteínas alergénicas, fuentes de proteínas hipoalergénicas y proteínas de lactosuero hidrolizadas. Por ejemplo, el documento US 5.039.532 da a conocer un material de proteína de lactosuero hidrolizada del que no se han eliminado alérgenos que consisten en alfa-lactoalbúmina, beta-lactoglobulina, albúmina sérica e inmunoglobulinas, y en el que el material de proteína hidrolizada que incluye alérgenos hidrolizados está en forma de residuos de hidrólisis que tienen un peso molecular no por encima de 10.000 Da de modo que el material hidrolizado está sustancialmente libre de proteínas alergénicas y alérgenos de origen proteico. En una realización, se incluye un hidrolizado de caseína poco alergénico con péptidos de como máximo 3000 Da.

Como fuente de carbohidratos puede servir cualquier tipo de carbohidrato, o una mezcla de diferentes carbohidratos, que se use normalmente en formulaciones de alimento para niños. Fuentes de carbohidratos adecuadas son disacáridos tales como lactosa y sacarosa, monosacáridos, tales como glucosa, y maltodextrinas, almidón y fuentes de carbohidratos que tienen un efecto prebiótico. En una realización se usan oligosacáridos de leche humana.

La fuente de lípidos en una composición puede ser cualquier tipo de lípido o combinación de lípidos que sea adecuada para su uso en productos nutricionales (para niños). Ejemplos de fuentes de lípidos adecuadas son tri-, di- y monoglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, ácidos grasos, y ésteres o sales de los mismos. Los lípidos pueden tener un origen animal, vegetal, microbiano o sintético. De particular interés son los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) tales como ácido gamma-linolénico (GLA), ácido dihomo-gamma-linolénico (DHGLA), ácido araquidónico (AA), ácido estearidónico (SA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido docosapentaenoico (DPA) y ácido linoleico conjugado (CLA). El CLA es importante en la protección frente a eccema y enfermedades respiratorias en niños. Esto implica particularmente los isómeros cis-9, trans-11 y cis-12 de CLA. Los ejemplos de fuentes de lípidos vegetales adecuadas incluyen aceite de girasol, aceite de girasol con alto contenido oleico, aceite de coco, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de soja, etc. Los ejemplos de fuentes de lípidos adecuadas de origen animal incluyen grasa láctea, por ejemplo, grasa láctea anhidra (AMF), nata, etc. En una realización preferida se usa una combinación de grasa láctea y lípidos de origen vegetal.

En una realización, la composición comprende un probiótico. En el contexto de la presente invención, el término “probiótico” se refiere a una cepa de bacterias probióticas. Bacterias probióticas se conocen en la técnica. De manera adecuada, las bacterias probióticas no están modificadas genéticamente. Las bacterias probióticas adecuadas incluyen bacterias del géneroBifidobaoteria(por ejemplo,B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum), Laotobacillus(por ejemplo,L. acidophilus, L. paracasei, L. johnsonii, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. casei, L. lactis)yStreptococcus(por ejemplo, S.thermophilus). B. breveyB. longumson probióticos especialmente adecuados. Cepas deB. breveadecuadas pueden aislarse, por ejemplo, de las heces de lactantes alimentados con leche humana sanos.

La combinación de un prebiótico y un probiótico se denomina también “simbiótico”. El probiótico puede estar presente en la composición en cualquier concentración adecuada, de manera adecuada en una cantidad terapéuticamente efectiva o “cantidad efectiva para tratar” en el contexto de la invención. De manera adecuada, el probiótico está incluido en la presente composición en una cantidad de 10exp2-10exp13 ufc por g de peso seco de la composición, de manera adecuada 10exp5-10exp12 ufc/g, de la manera más adecuada 10exp7-10exp10 ufc/g.

Además, la composición puede contener uno o más microingredientes convencionales, tales como vitaminas, antioxidantes, minerales, aminoácidos libres, nucleótidos, taurina, carnitina y poliaminas. Ejemplos de antioxidantes adecuados son BHT, palmitato de ascorbilo, vitamina E, alfa- y beta-caroteno, luteína, zeaxantina, licopeno y fosfolípidos.

La presente invención se refiere a un método para proporcionar una composición nutricional hipoalergénica, que comprende (i) poner en contacto una alimentación de lactosa con una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deC. terrestrispara proporcionar una preparación de galacto-oligosacáridos (GOS) hipoalergénica, y (ii) formular dicha preparación de GOS hipoalergénica junto con al menos un ingrediente hipoalergénico o no alergénico adicional para dar una composición nutricional hipoalergénica.

La composición puede usarse como una composición nutricional, terapia nutricional, soporte nutricional, como alimento médico, como alimento para fines médicos especiales o como suplemento nutricional. La presente composición es de manera adecuada una composición enteral. La composición se administra a, o está prevista para administrarse a, un sujeto que lo necesite. El sujeto es un mamífero, en particular un ser humano, y el sujeto puede tener cualquier edad. En una realización preferida, el sujeto es un adulto. El sujeto puede ser, por ejemplo, una persona anciana o una mujer postmenopáusica. El sujeto puede ser también una mujer embarazada. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente composición es una composición MUM para mujeres embarazadas. En otra realización preferida, el sujeto es un adolescente.

En otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 3 años (36 meses) a 13 años. En esta realización se prefiere que el niño tenga una edad de 3 años a 6 años. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente composición es una leche de crecimiento para niños que tienen una edad de 36 meses o más.

En aún otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 0 a 3 años, preferiblemente que tiene una edad de 18 meses o más, más preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más. En esta realización, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en niños y lactantes, incluyendo bebés, de hasta 3 años de edad. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente composición es un preparado para lactantes, un preparado de continuación o una leche de crecimiento.

En una realización particular, la composición es para la administración a sujetos, en particular lactantes, que corren el riesgo de desarrollar alergia, especialmente alergia a la proteína de leche de vaca (CMA). Los lactantes de los que se conoce que corren el riesgo de desarrollar alergia incluyen lactantes nacidos de al menos un progenitor que sufre, o ha sufrido, un trastorno atópico (por ejemplo, eccema) y/o una alergia, lo más en particular CMA.

La enzima para su uso según la invención es una p-galactosidasa derivada de la levaduraOryptococcus terrestris.Como se ha descrito anteriormente, el organismoOryptococcus terrestrisse renombró recientemente comoPapiliotrema terrestris,y los nombres“Oryptococcus terrestris" (O. terrestris)y“Papiliotrema terrestris" (P. terrestris)hacen referencia por tanto al mismo organismo. En la presente descripción y en las reivindicaciones, el nombreOryptococcus terrestrisse usa a lo largo de las mismas, pero el organismoOryptococcus terrestrispuede denominarse también mediante el nombrePapiliotrema terrestris.En el presente documento, con “p-galactosidasa derivada deO. terrestris"quiere decirse una enzima p-galactosidasa producida mediante un microorganismo (de o bien una cepa de tipo silvestre o bien una cepa mutante) que se clasifica enOryptococcus terrestris,o una enzima p-galactosidasa obtenida mediante procedimientos de ingeniería genética usando el gen de p-galactosidasa de un microorganismo (de o bien una cepa de tipo silvestre o bien una cepa mutante) que se clasifica enOryptococcus terrestris.Por tanto, el término “p-galactosidasa derivada deOryptococcus terrestris"abarca también una enzima recombinante que se produce mediante un microorganismo huésped en el que se ha introducido el gen de p-galactosidasa (o un gen modificado del mismo) obtenido deOryptococcus terrestris.

En general, una p-galactosidasa muestra una actividad de hidrólisis de lactosa (una actividad para hidrolizar lactosa mediante la acción sobre el enlace p-1,4) y una actividad de transgalactosilación (una actividad para transferir galactosa). Por tanto, la expresión “actividad p-galactosidasa” tal como se usa en el presente documento pretende incluir tales dos actividades.

Como se demuestra en la sección de ejemplos, los inventores del documento WO 2017/115826 tuvieron éxito a la hora de aislar y purificar enzimas p-galactosidasa que tenían las propiedades descritas anteriormente, de la cepa deOryptococcus terrestrisMM13-F2171 y sus cepas mutantes M2 y M6. Las cepas mutantes (M2 y M6) se obtuvieron de la cepa deOryptococcus terrestrisMM13-F2171 por medio de mutagénesis con tratamiento UV. Las cepas deOryptococcus terrestrisMM13-F2171 y M2 se han depositado en un depósito, tal como se describe a continuación, y están fácilmente disponibles.

Depositario: Depositario de microorganismos de patentes, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (sala 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, JAPÓN). Referencia de identificación:Oryptococcus terrestrisMM13-F2171. Fecha de depósito: 10 de diciembre de 2015. Número de registro: NITE BP-02177;

Depositario: Depositario de microorganismos de patentes, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (sala 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, JAPÓN). Referencia de identificación:Oryptococcus terrestrisAPC-6431. Fecha de depósito: 10 de diciembre de 2015. Número de registro: NITE BP-02178.

Por consiguiente, en una realización, la enzima usada en la presente invención se deriva de la cepa deOryptooooous terrestrisMM13-F2171 (número de registro: NITE BP-02177) o APC6431 (número de registro: N<i>T<e>BP-02178).

En el presente documento se da a conocer, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, el uso de una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptooooous terrestrisen la producción de una preparación de galacto-oligosacáridos (GOS) hipoalergénica, en el que dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBaoillus oiroulanso deAspergillus oryzae,y en el que la beta-galactosidasa se deriva de la cepa deOryptooooous terrestrisMM13-F2171 (número de registro: NITE BP02177) o APC-6431 (número de registro: NITE BP-02178). De manera adecuada, se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBaoillus oiroulansoAspergillus oryzae.En una realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBaoillus oiroulansy dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBaoillus oiroulans. En otra realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoAspergillus oryzaey dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deAspergillus oryzae.

Se da a conocer adicionalmente, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptooooous terrestris,para su uso en la prevención, al menos parcialmente, de una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en la que la beta-galactosidasa se deriva de la cepa deOryptooooous terrestrisMM113-F2171 (número de registro: N<i>T<e>BP-02177) o APC6431 (número de registro: NITE BP-02178). En una realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una betagalactosidasa derivada deBaoillus oiroulans. En otra realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deAspergillus oryzae.

También se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptooooous terrestrispara su uso en una composición nutricional para un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBaoillus oiroulansoAspergillus oryzae,en la que la betagalactosidasa se deriva de la cepa deOryptooooous terrestrisMM13-F2171 (número de registro: NITE BP-02177) o APC-6431 (número de registro: NITE BP02178). En una realización, se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBaoillus oiroulans. En otra realización, se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoAspergillua oryzae.

También se da a conocer, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, un método para prevenir al menos parcialmente la hipersensibilidad a una preparación de GOS en un sujeto, que comprende administrar una composición nutricional (hipoalergénica) que comprende una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptooooous terrestrisal sujeto, en el que la beta-galactosidasa se deriva de la cepa deOryptooooous terrestrisMM13-F2171 (número de registro: NITE BP02177) o APC-6431 (número de registro: NiTe BP-02178).

También en estas realizaciones, el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano. El sujeto puede tener cualquier edad. En una realización preferida, el sujeto es un adolescente o un adulto. En otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 3 a 13 años. En aún otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 0 a 3 años, preferiblemente que tiene una edad de 18 meses o más. En otra realización preferida, el sujeto es un adulto, un adolescente o un niño que tiene una edad de 18 meses o más, preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más. También en estas realizaciones, el sujeto es preferiblemente originario del Sudeste Asiático.

Además, el documento WO 2017/115826 describe tres clases de p-galactosidasa producidas mediante cepas mutantes derivadas del microorganismoOryptooooous(enzimas de cepa mutante 1,2, y 3) y determinó sus secuencias de aminoácidos. Se encontró que estas tres enzimas p-galactosidasa tienen una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre (la enzima de cepa de tipo silvestre se muestra en la Fig. 1A; SEQ ID NO: 1), que se deduce de su secuencia génica. Específicamente, estas enzimas mutantes son una que tiene una secuencia de aminoácidos en la que los 130 residuos de aminoácido N-terminales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre están delecionados, lo que se denomina “enzima de cepa muíante 1” para el propósito de la descripción (véase la Fig. 1B; SEQ ID NO: 2); una que tiene una secuencia de aminoácidos en la que los 136 residuos de aminoácido N-terminales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre están delecionados (véase la Fig. 1C; SEQ ID NO:3), lo que se denomina “enzima de cepa mutante 2” para el propósito de la descripción; y una que tiene una secuencia de aminoácidos en la que los 141 residuos de aminoácido N-terminales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre están delecionados (véase la Fig. 1D; SEQ ID NO:4), lo que se denomina “enzima de cepa muíante 3”.

Por consiguiente, una enzima p-galactosidasa derivada deC. terrestrispara su uso en una realización preferida de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos equivalente a dicha secuencia de aminoácidos.

Además, puede usarse una combinación de dos o más enzimas p-galactosidasa derivadas deC. terrestris, comprendiendo cada enzima una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 o una secuencia de aminoácidos equivalente a una cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos. En una realización, se usa al menos una enzima mutante (SEQ ID NO: 2, 3 o 4, o un equivalente de las mismas). Preferiblemente se usan dos o más enzimas mutantes, opcionalmente en combinación con la enzima de tipo silvestre. Por ejemplo, se usa una combinación de dos o más enzimas, comprendiendo cada enzima una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos equivalente a dichas secuencias de aminoácidos. En un aspecto específico, la combinación de enzimas comprende las tres enzimas mutantes distintas y la enzima de tipo silvestre.

El término “secuencia de aminoácidos equivalente” significa en este caso una secuencia de aminoácidos que es parcialmente diferente de la secuencia de aminoácidos de referencia (es decir secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 4), pero la diferencia no influye sustancialmente en la función de la proteína (actividad beta-galactosidasa). Por tanto, una enzima que tiene una cadena polipeptídica de la secuencia de aminoácidos equivalente muestra una actividad beta-galactosidasa.

El grado de la actividad no está limitado particularmente siempre que pueda exhibirse la función de una betagalactosidasa, pero es preferiblemente equivalente a o superior a la de la enzima que tiene una cadena polipeptídica de la secuencia de referencia. Preferiblemente, la longitud de la secuencia de aminoácidos equivalente no es mayor que la de la secuencia de SEQ ID NO: 1.

El término “diferencia parcial en la secuencia de aminoácidos” significa normalmente una mutación (cambio) en la secuencia de aminoácidos provocada por la deleción o sustitución de uno a varios (hasta, por ejemplo, 3, 5, 7 o 10) aminoácidos que componen la secuencia de aminoácidos, o la adición, la inserción o una combinación de las mismas de uno a varios (hasta, por ejemplo, 3, 5, 7 o 10) aminoácidos. La diferencia en la secuencia de aminoácidos es aceptable siempre que se mantenga la actividad beta-galactosidasa (la actividad puede variarse en cierta medida). Siempre que se satisfagan las condiciones, la posición de la diferencia en la secuencia de aminoácidos no está limitada particularmente, y la diferencia puede surgir en una pluralidad de posiciones. El término “pluralidad” significa, por ejemplo, un número correspondiente a menos de aproximadamente el 20%, preferiblemente menos de aproximadamente el 15%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% de los aminoácidos totales, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 1%. Más específicamente, la proteína equivalente tiene aproximadamente el 95% o más, incluso de manera más preferible aproximadamente el 97% o más, y de la manera más preferible aproximadamente el 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de referencia.

La diferencia de la secuencia de aminoácidos puede surgir en una pluralidad de posiciones. Preferiblemente, la proteína de equivalencia se obtiene provocando una sustitución de aminoácido conservativa en un residuo de aminoácido que no es esencial para la actividad beta-galactosidasa. El término “sustitución de aminoácido conservativa” significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades similares.

Los residuos de aminoácido se clasifican en varias familias según sus cadenas laterales, tales como cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales con ramificación p (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). La sustitución de aminoácido conservativa es preferiblemente la sustitución entre residuos de aminoácido en una familia.

La identidad (%) entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácido nucleico (a continuación en el presente documento, el término “dos secuencias” se usa para representar cualesquiera de dos secuencias) puede determinarse mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, dos secuencias se alinean para la comparación óptima de las dos secuencias (por ejemplo, puede introducirse un hueco en la primera secuencia para optimizar la alineación con respecto a la segunda secuencia). Cuando una molécula (residuo de aminoácido o nucleótido) en una posición específica en la primera secuencia y una molécula en la posición correspondiente en la segunda secuencia son iguales entre sí, las moléculas en las posiciones se definen como idénticas. La identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias (es decir, identidad (%) = número de posiciones idénticas / número total de posiciones %100). Preferiblemente, el número y el tamaño de los huecos, que se requieren para optimizar la alineación de las dos secuencias, se toman en consideración.

La comparación y la determinación de la identidad entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo específico del algoritmo matemático que puede usarse para comparar las secuencias incluye un algoritmo descrito en Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 y modificado por Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Sin embargo, el algoritmo no está limitado necesariamente a este. Un algoritmo de este tipo está incorporado en el programa NBLAST y el programa XBLAST (versión 2.0) descritos en Altschuletal.(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Con el fin de obtener una secuencia de ácido nucleico equivalente, por ejemplo, puede llevarse a cabo una búsqueda de nucleótidos BLAST con puntuación = 100 y longitud de palabra = 12 mediante el programa NBLAST. Con el fin de obtener una secuencia de aminoácidos equivalente, por ejemplo, puede llevarse una búsqueda de polipéptidos BLAST con puntuación = 50 y longitud de palabra = 3 mediante el programa XBLAST. Con el fin de obtener alineaciones con huecos para su comparación, puede utilizarse Gapped BLAST descrito en Altschulet al.,(1997) Aminoacids Research 25(17): 3389-3402. Al usar BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas correspondientes (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). En detalle, véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo del algoritmo matemático que puede usarse para comparar secuencias incluye un algoritmo descrito en Meyers y Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17. Tales programas están incorporados en el programa ALIGN que puede usarse para, por ejemplo, el servidor de red GENESTREAM (IGH Montpellier, Francia) o el servidor ISREC. Cuando se usa el programa ALIGN para la comparación de las secuencias de aminoácidos, por ejemplo, puede usarse la tabla de residuos de peso PAM120, en la que una penalización de longitud de hueco es 12 y una penalización de hueco es 4.

La identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando la matriz Blossom 62 o la matriz PAM250 con el peso de hueco de 12, 10, 8, 6 o 4, y el peso de longitud de hueco de 2, 3 o 4. La identidad entre dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), con el peso de hueco de 50 y el peso de longitud de hueco de 3. La enzima puede ser una porción de una proteína más grande (por ejemplo, una proteína de fusión). Los ejemplos de la secuencia añadida a una proteína fusionada incluyen las secuencias/etiquetas útiles para la purificación de múltiples residuos histidina, y secuencias de adición lo que garantiza la estabilidad en la producción recombinante.

Se da a conocer, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, el uso de una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) en la producción de una preparación de galacto-oligosacáridos (GOS) hipoalergénica, en el que dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una betagalactosidasa derivada deBaclllus clrculanso deAsperglllus oryzae,y en el que la beta-galactosidasa comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, aún incluso más preferiblemente al menos un 97% y lo más preferiblemente al menos un 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.

También se da a conocer, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, el uso de una betagalactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deCryptococcus terrestrísen la producción de una preparación de galactooligosacáridos (GOS) hipoalergénica, en el que dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBaclllus clrculanso deAsperglllus oryzae,y en el que la beta-galactosidasa comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, aún incluso más preferiblemente al menos un 97% y lo más preferiblemente al menos un 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4. De manera adecuada, se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBaclllus clrculansoAsperglllus oryzae.En una realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBaclllus clrculansy dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una betagalactosidasa derivada deBaclllus clrculans.En otra realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoAsperglllus oryzaey dicha preparación de GOS tiene una capacidad reducida de inducir una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en comparación con una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deAsperglllus oryzae.

Se da a conocer adicionalmente, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23), para su uso en la prevención, al menos parcialmente, de una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto, en la que la beta-galactosidasa comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, aún incluso más preferiblemente al menos un 97% y lo más preferiblemente al menos un 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4. En una realización adicional, se conoce que dicho sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae.Se da a conocer adicionalmente, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deCryptococcus terrestris,para su uso en la prevención, al menos parcialmente, de una respuesta alérgica (mediada por IgE) en un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulanso deAspergillus oryzae,en la que la beta-galactosidasa comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, aún incluso más preferiblemente al menos un 97% y lo más preferiblemente al menos un 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO 1,2, 3 o 4. En una realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deBacillus circulans.En otra realización se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa derivada deAspergillus oryzae.

También se da a conocer, pero no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deCryptococcus terrestrispara su uso en una composición nutricional para un sujeto del que se conoce que sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBacillus circulansoAspergillus oryzae, en la que la betagalactosidasa comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, aún incluso más preferiblemente al menos un 97% y lo más preferiblemente al menos un 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4. En una realización, se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoBacillus circulans.En otra realización, se conoce que el sujeto sufre o tiene una probabilidad aumentada de sufrir hipersensibilidad a una preparación de GOS obtenida mediante la transgalactosilación de lactosa usandoAspergillua oryzae.

También se da a conocer, pero no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, un método para prevenir al menos parcialmente la hipersensibilidad a una preparación de GOS en un sujeto, que comprende administrar una composición nutricional (hipoalergénica) que comprende una preparación de GOS hipoalergénica que puede obtenerse mediante la transgalactosilación de lactosa usando una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deCryptococcus terrestrisal sujeto, en el que la beta-galactosidasa comprende una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, aún incluso más preferiblemente al menos un 99% y lo más preferiblemente al menos un 98% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.

También en estas realizaciones, el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano. El sujeto puede tener cualquier edad. En una realización preferida, el sujeto es un adolescente o un adulto. En otra realización preferida, el sujeto es un niño que tiene una edad de 3 a 13 años. En aún otra realización preferida el sujeto es un niño que tiene una edad de 0 a 3 años, preferiblemente que tiene una edad de 18 meses o más. En otra realización preferida, el sujeto es un adulto, un adolescente o un niño que tiene una edad de 18 meses o más, preferiblemente que tiene una edad de 24 meses o más. También en estas realizaciones, el sujeto es preferiblemente originario del Sudeste Asiático.

Una enzima para su uso en la presente invención que tiene la secuencia de aminoácidos descrita anteriormente puede prepararse también mediante una técnica de ingeniería genética. Por ejemplo, una célula huésped apropiada (por ejemplo,Escherichia coli)se transforma mediante un ADN que codifica la presente enzima, y se recoge la proteína expresada en el transformante, y de ese modo se prepara la presente enzima. La proteína recogida se trata según sea apropiado según el uso previsto. La enzima así obtenida como proteína recombinante puede someterse a diversas modificaciones. Por ejemplo, la enzima compuesta de una proteína recombinante ligada a cualquier péptido o proteína puede obtenerse produciendo una proteína recombinante usando un vector en el que se ha insertado un ADN que codifica la enzima junto con otro ADN apropiado. Además, puede llevarse a cabo una modificación para provocar la adición de una cadena de azúcar y/o un líquido, o un procesamiento N- o C-terminal. Estas modificaciones permiten, por ejemplo, la extracción de una proteína recombinante, la simplificación de la purificación o la adición de funciones biológicas.

Los inventores del documento WO 2017/115826 también caracterizaron las propiedades enzimáticas de las enzimas p-galactosidasa novedosas que se habían obtenido. Por tanto, la enzima para su uso en la presente invención puede caracterizarse mediante las propiedades enzimáticas descritas a continuación en (1) a (3), tal como se describe en el documento WO 2017/115826.

(1) Acción enzimática

La enzima tiene una actividad de hidrólisis de lactosa y una actividad de transgalactosilación, siendo la actividad de la enzima para transferir un residuo galactosilo por medio de enlace p-1,4 superior a aquella por medio de enlace p-1,6, p-1,3 o p-1,2. Es decir, la enzima tiene una actividad excelente para transferir un residuo galactosilo por medio de enlace p-1,4. Por tanto, el uso de la enzima permite una producción eficiente de un producto (hipoalergénico) que tiene el residuo de azúcar transferido unido por medio de enlace p-1,4. Por ejemplo, la reacción de la enzima con lactosa, que es un sustrato para la enzima, genera una mezcla de oligosacáridos trisacáridos que es rica en oligosacáridos lineales. En los casos en los que se obtienen oligosacáridos trisacáridos cuando se usa lactosa como sustrato para la reacción con la presente enzima en las condiciones de reacción descritas en la sección de ejemplos del documento WO 2017/115826 (en la subsección titulada “Examen sobre la capacidad de producción de oligosacáridos 1”), el 65% o más, preferiblemente el 70% o más, más preferiblemente el 72% o más, todavía más preferiblemente el 73% o más, más preferiblemente el 75% o más, de los oligosacáridos trisacáridos resultantes se componen de oligosacáridos con enlaces meramente p-1,4-glicosídicos (O-p-D-galactopiranosil(1 ^4)-O-p-D-galactopiranosil-(1 ^4)-D-glucosa).

En estos casos, el oligosacárido lineal producido mediante la enzima es un galacto-oligosacárido. En general, el galacto-oligosacárido se representa mediante Gal-(Gal)n-Glc, siendo n de 1 a 5 más o menos, siendo Gal un residuo galactosa y siendo GIc un residuo glucosa. El tipo de enlace entre residuos de azúcar incluye p-1,4, p-1,6, p-1,3 y p-1,2, y además de estos, a-1,3, a-1,6 y otros.

Por tanto, un “galacto-oligosacárido (GOS)” tal como se usa en el presente documento significa un galactooligosacárido de dos o más residuos de azúcar, es decir, que tiene un grado de polimerización de 2 o más, excluyendo la lactosa.

(2) Temperatura óptima

La enzima tiene una temperatura óptima de 70°C. Una temperatura óptima tan alta de la enzima es ventajosa para su uso como enzima para la producción de oligosacáridos. Cuando se usa la enzima para la producción de oligosacáridos, la temperatura de proceso (reacción) puede establecerse para que sea más alta. En el presente documento, la temperatura óptima puede determinarse mediante un método en el que se hacen mediciones usando tampón acetato (pH 6,0) y con lactosa como sustrato.

(3) Peso molecular

La enzima de cepa de tipo silvestre y las enzimas de cepa mutante 1 a 3 dadas a conocer en el documento WO 2017/115826 comprenden, cada una, una(s) cadena(s) de azúcar; cuando los pesos moleculares de estas enzimas se determinaron mediante SDS-PAGE tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas a N y O, se encontró que tenían un peso molecular de 104 kDa (para la enzima de cepa de tipo silvestre), 64 kDa (para la enzima de cepa mutante 1), 61 kDa (para enzima de cepa mutante 2) y 61 kDa (para la enzima de cepa mutante 3). Basándose en estos hallazgos, según una realización, la enzima sin cadenas de azúcar para su uso en la presente invención tiene un peso molecular de 104 kDa (mediante SDS-PAGE). Según otra realización, la enzima sin cadenas de azúcar que se usa en la presente invención tiene un peso molecular de 64 kDa (mediante SDS-PAGE). Según otra realización adicional, la enzima sin cadenas de azúcar tiene un peso molecular de 61 kDa (mediante SDS-PAGE). Se encontró que las enzimas mencionadas anteriormente, cuando no se someten a tratamientos para eliminar cadenas de azúcar, tenían un peso molecular de 120 kDa (para la enzima de cepa de tipo silvestre), 71 kDa (para la enzima de cepa mutante 1), 66 kDa (para la enzima de cepa mutante 2) y 66 kDa (para la enzima de cepa mutante 3).

La enzima para su uso según la presente invención puede caracterizarse adicionalmente mediante las propiedades enzimáticas descritas a continuación en (4) a (6).

(4) pH óptimo

La enzima tiene un pH óptimo de 4 a 5. El pH óptimo se determina, por ejemplo, basándose en los resultados de mediciones hechas usando tampón glicina 0,1 M en el intervalo de pH de pH 2 a 3, tampón citrato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 3 a 6, tampón acetato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 5 a 6, tampón fosfato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 7 a 8, y tampón carbonato de sodio 0,1 M en el intervalo de pH de pH 9 a 10.

(5) Estabilidad de pH

En una realización, la presente enzima presenta una actividad enzimática estable en el intervalo de pH de pH 2 a 8, y en otra realización en el intervalo de pH de pH 2 a 9. Con otras palabras, si el pH de una disolución de enzima que debe someterse a tratamientos está dentro de este intervalo de pH, entonces la enzima tras tratamientos de pH a 40°C durante 30 minutos muestra una actividad del 80% o más de la actividad máxima. La estabilidad de pH se determina, por ejemplo, basándose en los resultados de mediciones hechas usando tampón glicina 0,1 M en el intervalo de pH de pH 2 a 3, tampón citrato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 3 a 6, tampón acetato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 5 a 6, tampón fosfato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 7 a 8, y tampón carbonato de sodio 0,1 M en el intervalo de pH de pH 9 a 10.

(6) Termoestabilidad

En una realización, la enzima para su uso tal como se da a conocer en el presente documento conserva una actividad del 80% o más de la actividad máxima, incluso cuando la enzima se trata durante 30 minutos en tampón acetato (pH 6,0) en condiciones de temperatura de 30°C a 60°C. En otra realización, la enzima conserva una actividad del 80% o más de la actividad, incluso cuando la enzima se trata durante 30 minutos en tampón acetato (pH 6,0) en condiciones de temperatura de 30°C a 65°C.

El documento WO 2017/115826 también da a conocer genes que codifican una enzima para su uso en la presente invención. En una realización, el gen incluye un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 4. Ejemplos específicos de la realización son el ADNc que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 (que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1), el ADNc que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 (que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 2), el ADNc que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 (que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3) y el ADNc que consiste en la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 (que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4). Un ejemplo adicional es el ADN genómico que consiste en SEQ ID NO: 16. Este ADN genómico corresponde al ADNc de SEQ ID NO: 5.

El gen se usa normalmente en la preparación de las enzimas beta-galactosidasa derivadas deC. terrestrisdadas a conocer en el documento WO 2017/115826 y usadas en la presente invención. Según un procedimiento de ingeniería genética que usa el gen que codifica la enzima, la enzima puede obtenerse en un estado más homogéneo. Además, el método puede ser un método preferible también en el caso de preparar una gran cantidad de la enzima. También se considera la degeneración de un codón.

Como se da a conocer en el documento WO 2017/115826, el gen para su uso en la preparación de las enzimas betagalactosidasa derivadas deC. terrestrispuede prepararse en un estado aislado usando una técnica de ingeniería genética estándar, una técnica de biología molecular, una técnica bioquímica, una síntesis química, un método de PCR (por ejemplo, una PCR de extensión solapada) o una combinación de los mismos, con referencia a la información de secuencia dada a conocer en la lista de secuencias adjunta.

En general, y como se describe también en el documento WO 2017/115826, cuando se modifica una parte del ADN que codifica una cierta proteína, una proteína codificada por el ADN modificado puede tener en ocasiones la misma función que la de una proteína codificada por el ADN antes de la modificación. Es decir, la modificación de la secuencia de ADN no tiene un efecto sustancial sobre la función de la proteína codificada, de modo que la función de la proteína codificada puede mantenerse antes y después de la modificación. Por tanto, el ADN que codifica una proteína puede tener una secuencia de ácido nucleico equivalente a la secuencia de bases de referencia (es decir, una cualquiera de SEQ ID NO: 5 a 8, 16) y tener la actividad p-galactosidasa (denominado a continuación en el presente documento también “ADN equivalente”).

La “secuencia de ácido nucleico equivalente” en el presente documento indica una secuencia de ácido nucleico que es parcialmente diferente de la secuencia de ácido nucleico de referencia, pero en la que la función (en el presente documento, actividad p-galactosidasa) de la proteína codificada por la secuencia no está afectada sustancialmente por la diferencia.

Un ejemplo específico del ADN equivalente incluye ADN que se hibrida con la secuencia de bases complementaria de la secuencia de ácido nucleico de referencia en condiciones estrictas. En el presente documento, se denomina “condiciones estrictas” a las condiciones en las que se forma un denominado híbrido específico, pero no se forma un híbrido no específico. Los expertos en la técnica conocen tales condiciones estrictas. Tales condiciones estrictas pueden establecerse con referencia a, por ejemplo, Molecular Cloning (tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Current protocols in molecular biology (editado por Frederick M. Ausubelet al.,1987). Un ejemplo de las condiciones estrictas puede incluir una condición en la que se usa una disolución de hibridación (formamida al 50%, 10 x SSC (NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0), 5 x disolución de Denhardt, SDS al 1%, sulfato de dextrano al 10%, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 10 gg/ml y tampón fosfato 50 mM (pH 7,5)) y se incuba a de aproximadamente 42°C a aproximadamente 50°C, después se lava con 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a de aproximadamente 65°C a aproximadamente 70°C. Condiciones estrictas preferibles adicionales pueden incluir, por ejemplo, una condición en la que se usa una disolución de hibridación (formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0), 1 x disolución de Denhardt, SDS al 1 %, sulfato de dextrano al 10%, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 10 gg/ml y tampón fosfato 50 mM (pH 7,5)).

Como se da a conocer en el documento WO 2017/115826, otro ejemplo específico del ADN equivalente puede incluir ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de ácido nucleico que incluye sustitución, deleción, inserción, adición o inversión en uno o una pluralidad de ácidos nucleicos (preferiblemente de uno a varios ácidos nucleicos) en la secuencia de referencia y que tiene una actividad p-galactosidasa. La sustitución, deleción o similar, del ácido nucleico puede producirse en una pluralidad de sitios. La “pluralidad” en el presente documento indica, por ejemplo, de 2 a 40 bases, preferiblemente de 2 a 20 ácidos nucleicos y más preferiblemente de 2 a 10 ácidos nucleicos, aunque depende de las posiciones o los tipos del residuo de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína codificada por el ADN. El ADN equivalente muestra un 60% o más de identidad, por ejemplo, preferiblemente un 70% o más de identidad, más preferiblemente un 80% o más de identidad, más y más preferiblemente un 85% o más de identidad, mucho más preferiblemente un 90% o más de identidad, incluso más preferiblemente un 95% o más de identidad, y lo más preferiblemente un 99% o más de identidad con la secuencia de ácido nucleico de referencia. El ADN equivalente mencionado anteriormente pueden obtenerse modificando el ADN de referencia para incluir una sustitución, deleción, inserción, adición y/o inversión de ácido nucleico usando tratamiento con una enzima de restricción; tratamiento con exonucleasa, ADN ligasa, etc.; introducción de mutación mediante mutagénesis dirigida al sitio (Molecular Cloning, tercera edición, capítulo 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y mutagénesis aleatoria (Molecular Cloning, tercera edición, capítulo 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York), y similares. Además, el ADN equivalente puede obtenerse también mediante otros métodos tales como irradiación con rayo ultravioleta. Un ejemplo adicional del ADN equivalente puede incluir ADN que tiene diferencia en el ácido nucleico tal como se mencionó anteriormente debido a polimorfismo representado por SNP (polimorfismo de un solo nucleótido).

Por tanto, el ácido nucleico también puede ser un ácido nucleico que tiene una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases del gen que codifica las enzimas usadas en la presente invención. Por ejemplo, el ácido nucleico puede tener una secuencia de bases con una identidad de al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o el 99,9% con la secuencia de bases del gen que codifica las enzimas usadas en la presente invención, o la secuencia de bases complementaria a la misma. El ADN también puede ser un ADN recombinante que contiene el gen que codifica las enzimas usadas en la presente invención.

El ADN recombinante se proporciona de manera adecuada en, por ejemplo, forma de un vector. El término “vector” en la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transferir un ácido nucleico insertado en el vector a una diana tal como una célula. Un vector adecuado se selecciona según su uso previsto (clonación, expresión de una proteína) y en consideración de una clase de una célula huésped.

Los ejemplos incluyen un fago M13 o una forma alterada del mismo, un fago l o una forma alterada del mismo, y pBR322 o una forma alterada del mismo (por ejemplo, pB325, pAT153, pUC8), etc. como vector que tieneEscherichia coIícomo huésped, pYepSec1, pMFa y pYES2 como vector que tiene una levadura como huésped, pAc, pVL, etc. como vector que tiene una célula de insecto como huésped, y pCDM8, pMT2PC, etc. como vector que tiene una célula de mamífero como huésped. El vector es preferiblemente un vector de expresión. El “vector de expresión” se refiere a un vector capaz de introducir un ácido nucleico insertado en el vector de expresión en una célula diana (célula huésped) y expresarlo en la célula. El vector de expresión contiene generalmente una secuencia promotora necesaria para la expresión de un ácido nucleico insertado, una secuencia potenciadora para promover la expresión, y similares. También puede usarse un vector de expresión que contiene un marcador selectivo. Cuando se usa un vector de expresión de este tipo, la presencia o ausencia (y se grado) de introducción del vector de expresión puede confirmarse usando un marcador selectivo.

La inserción de ADN en el vector, la inserción de un gen marcador selectivo (si es necesario), la inserción de un promotor (si es necesario) y similar puede realizarse usando una técnica de ADN recombinante estándar (por ejemplo, un método conocido de uso de una enzima de restricción y una ADN ligasa, que puede consultarse en Molecular Cloning, tercera edición, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).

Como se describe en el documento WO 2017/115826, una enzima para su uso en la presente invención se produce ventajosamente mediante un transformante en el que se introduce el ADN recombinante que codifica la betagalactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deC. terrestris,de modo que el gen existe como molécula exógena. Preferiblemente, el transformante se prepara mediante transfección o transformación usando el vector mencionado anteriormente. La transfección y la transformación pueden llevarse a cabo usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un método de precipitación conjunta con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, microinyección, un método de Hanahan (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983)), un método de acetato de litio (Schiestl, R.H.et al.,Curr. Genet. 16, 339-346 (1989)), método de protoplasto-polietilenglicol (Yelton, M.M.et al.,Proc Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474 (1984)) y similar.

La célula huésped no está limitada particularmente siempre que la presente enzima puede expresarse, y puede seleccionarse de, por ejemplo, bacterias del géneroBacillus(por ejemplo,Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans,etc.), bacterias del ácido láctico (por ejemplo,Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium,etc.), otras bacterias (por ejemplo,Escherichia, Streptomyces,etc.), levadura (por ejemplo,Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torula, Torulopsis, Pichia, Schizosaccharomyces,etc.), y hongos filamentosos (eumicetos) (por ejemplo, hongos del géneroAspergillustal comoAspergillus oryzaeyAspergillus niger,hongos del géneroPenicillium,hongos del géneroTrichoderma,hongos del géneroFusarium,etc.).

El documento WO 2017/115826 describe también un método para producir una enzima p-galactosidasa que se usa ventajosamente en la presente invención. Se da a conocer un método que comprende las etapas de cultivar células deCryptooooous terrestris(etapa (1)); y una etapa de recoger la enzima p-galactosidasa del medio cultivado y/o de células (etapa (2)). Preferiblemente, comoCryptooooous terrestris, se usa la cepa deCryptooooous terrestrisMM13-F2171 o una cepa mutante de la misma, por ejemplo,Cryptooooous terrestrisAPC-6431 (cepa M2) y cepas mutantes adicionales de la misma.

Las condiciones y los métodos para cultivar células deCryptooooous terrestrisno están limitados particularmente, siempre que se produzca la enzima. Por tanto, los métodos y las condiciones de cultivo que son adecuados para cultivar un microorganismo que deba usarse pueden establecerse según sean apropiados, con la condición de que se produzca la enzima. El cultivo celular puede comprender mezclas de dos o más cepas deCryptooooous terrestris,por ejemplo, la cepa de tipo silvestre MM13-F2171 y una o más cepas mutantes de la misma, por ejemplo,Cryptooooous terrestrisAPC-6431 (cepa M2) y/o la cepa deCryptooooous terrestrisM6. En estos casos, dos o más enzimas pueden aislarse y purificarse simultáneamente.

Aunque el cultivo puede ser o bien un cultivo líquido o bien un cultivo sólido, preferiblemente se emplea un cultivo líquido. Como medio puede usarse cualquier medio siempre que microorganismos que deben usarse pueden crecer. Por ejemplo, puede usarse medio suplementado con una fuente de carbono tal como glucosa, sacarosa, gentiobiosa, almidón soluble, glicerina, dextrina, melaza y ácido orgánico; y además una fuente de nitrógeno tal como sulfato de amonio, carbonato de amonio, fosfato de amonio, acetato de amonio o peptona, extracto de levadura, licor de maceración de maíz, hidrolizado de caseína, salvado y extracto de carne; y además, una sal inorgánica tal como sal de potasio, sal de magnesio, sal de sodio, sal de fosfato, sal de manganeso, sal de hierro y sal de cinc, y similares.

Con el fin de promover el crecimiento de los transformantes que deben usarse, pueden añadirse al medio vitamina, aminoácido y similares. El medio puede cultivarse en condiciones aerobias de modo que el pH del medio se ajuste a, por ejemplo, aproximadamente de 3 a 8 (de manera preferible aproximadamente de 4 a 7), y la temperatura de cultivo generalmente sea aproximadamente de 20°C a 40°C (de manera preferible aproximadamente de 25°C a 35°C) durante de 1 a 10 días (preferiblemente de 3 a 6 días). Un ejemplo del método de cultivo puede incluir un método de cultivo con agitación y un método de cultivo sumergido aerobio usando un fermentador agitado.

Tras cultivar en las condiciones anteriores, la(s) proteína(s) diana se recoge(n) de la disolución de cultivo o de los cuerpos celulares (etapa (2)). Cuando se recoge de la disolución de cultivo, la enzima puede obtenerse mediante separación y purificación eliminando materias insolubles mediante, por ejemplo, filtración del sobrenadante de cultivo, centrifugación y similar, seguido de llevar a cabo, por ejemplo, una concentración mediante membrana de ultrafiltración, desalando mediante precipitación con sulfato de amonio, diálisis, diversos tipos de cromatografía de una resina de intercambio iónico o una combinación apropiada de los mismos. Por otro lado, cuando se recoge(n) de cuerpos celulares, la(s) proteína(s) diana puede(n) obtenerse pulverizando los cuerpos celulares mediante tratamiento de presurización, tratamiento ultrasónico o similar, seguido de separación y purificación de los mismos similar a las anteriores.

Tras recoger los cuerpos celulares de una disolución de cultivo mediante filtración, centrifugación, etc., pueden llevarse a cabo una serie de procesos (pulverización, separación y purificación de los cuerpos celulares) mencionados anteriormente. La(s) p-galactosidasa(s) para su uso en la presente invención pueden producirse también usando el transformante mencionado anteriormente. El transformante se cultiva entonces en condiciones de modo que se produzca una proteína codificada por un gen introducido en el mismo (etapa (i)).

Las condiciones de cultivo del transformante se conocen en cuanto a diversos sistemas vector-huésped, y un experto en la técnica puede establecer fácilmente una condición de cultivo apropiada. Tras la etapa de cultivo, se recoge la proteína producida (p-galactosidasa) (etapa (ii)). La recogida y la posterior purificación pueden realizarse de la misma manera que en la realización anterior. El grado de purificación de p-galactosidasa(s) no está limitado particularmente. Además, la forma final de la(s) p-galactosidasa(s) puede ser un estado líquido o un estado sólido (incluyen una forma en polvo).

La(s) enzima(s) purificada(s) puede(n) proporcionarse en forma de polvo, por ejemplo, mediante liofilización, secado a vacío o secado por pulverización. Por ejemplo, la(s) enzima(s) purificada(s) puede(n) disolverse previamente en una disolución de tampón ácido fosfórico, una disolución de tampón trietanolamina, una disolución de tampón ácido trisclorhídrico, o una disolución de tampón GOOD. Preferiblemente, pueden usarse una disolución de tampón ácido fosfórico y una disolución de tampón trietanolamina. Obsérvese que, para la disolución de tampón GOOD en el presente documento, se muestra a modo de ejemplo PIPES, MES o MOPS.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1: Secuencias de aminoácidos de enzimas beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) a modo de ejemplo derivadas deCryptooooous terrestris.A) SEQ ID NO: 1: enzima de tipo silvestre; B) SEQ ID NO: 2: enzima de cepa mutante 1; C) SEQ ID NO: 3: enzima de cepa mutante 2; D) SEQ ID NO: 4: enzima de cepa mutante 3.

Figura 2: Activación de basófilos en el sujeto de prueba n.° 1 medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figura 2a, MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figura 2b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico). Para detalles véase el ejemplo 2.

Figura 3: Activación de basófilos en el sujeto de prueba n ° 2 medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figura 3a, MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figura 3b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico). Para detalles véase el ejemplo 2.

Figura 4: Activación de basófilos en el sujeto de prueba n ° 3 medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figura 4a, MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figura 4b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico). Para detalles véase el ejemplo 2.

Figura 5: Activación de basófilos en el sujeto de prueba n ° 4 medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figura 5a, MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figura 5b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico). Para detalles véase el ejemplo 2.

Figura 6: Activación de basófilos en el sujeto de prueba n ° 5 medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figura 6a, MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figura 6b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico). Para detalles véase el ejemplo 2.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

0-Galactosidasa derivada de C. terrestris

Las enzimas beta-galactosidasa derivadas deC. terrestristal como se usan en la presente invención se obtuvieron de Amano Enzyme Inc. (Nagoya, Japón). Estas enzimas beta-galactosidasa y métodos para su preparación se dan a conocer en el documento WO2017/115826 de Amano. El método para la preparación de enzimas beta-galactosidasa derivadas deC. terrestris,así como las propiedades de enzima, tal como se dan a conocer en el documento WO2017/115826, se describen a continuación en los párrafos 1 a 8.

1. Obtención de una beta-galactosidasa de tipo silvestre de C. terrestris

Con el fin de obtener una enzima p-galactosidasa adecuada para la producción de galacto-oligosacáridos, se examinaron diversas clases de microorganismos. Como resultado, resultó que un microorganismo deCryptococcus terrestriscontenido en una muestra de suelo que se había recogido cerca del aeropuerto Heho en Myanmar en octubre 2013 era una cepa productora prometedora para p-galactosidasa. Se hizo un intento de purificar p-galactosidasa a partir de esta cepa microbiana (cepa deCryptococcus terrestrisMM13-F2171). La cepa deCryptococcus terrestrisMM13-F2171 se depositó el 10 de diciembre de 2015 en el Depositario de microorganismos de patentes, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación, con el nombre deCryptococcus terrestrisMM13-F2171, al que se le asignó el número de registro NITE BP-02177.

La cepa deCryptococcus terrestrisMM13-F2171 se cultivó en un medio líquido (lactosa al 2,0%, extracto de levadura al 2,0%, KH2PO4 al 0,1%, MgSO4-7H2O al 0,05%, pH 5,0) a 30°C durante 4 días con agitación (a 200 revoluciones por minuto). Tras completarse el cultivo, se recogieron aproximadamente 3 l de sobrenadante mediante centrifugación y se sometieron entonces a concentración y tratamiento de desalación con una membrana de ultrafiltración (AIP-1013D con un tamaño interno de membrana de 0,8 mm; Asahi Kasei Chemicals Corp.). En el tratamiento de desalación se usó tampón acetato 20 mM (pH 6,0).

La disolución concentrada se cargó en una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF (GE Healthcare Biosciences), que se había equilibrado con tampón acetato 20 mM (pH 6,0). Las fracciones absorbidas se eluyeron con un gradiente usando tampón acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 1 M, y se midieron para la actividad de enzima. Las fracciones con actividad de enzima se agruparon y entonces se sometieron a diálisis frente a tampón acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía sulfato de amonio 1,8 M. La fracción activa para enzima obtenida tras la diálisis se cargó en una columna hidrófoba HiTrap Phenyl HP (GE Healthcare Biosciences), que se había equilibrado con tampón acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía sulfato de amonio 1,8 M. Las fracciones absorbidas se eluyeron con un gradiente usando tampón acetato 20 mM (pH 6,0) y se midieron para la actividad de enzima. Las fracciones con actividad de enzima se agruparon y entonces se sometieron a diálisis frente a tampón acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 0,2 M.

La fracción activa para enzima obtenida tras la diálisis se cargó en una columna de filtración de gel HiLoad Superdex 200 prep grade (GE Healthcare Biosciences), que se había equilibrado con tampón acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 0,2 M, y entonces se recogieron las fracciones con actividad de enzima. La enzima tenía un peso molecular de aproximadamente 266 kDa cuando se determinó mediante un método de filtración de gel usando esta columna HiLoad Superdex 200 prep grade. Cuando este resultado se consideró en combinación con los resultados del análisis de SDS-PAGE (véase más adelante), se supone que la enzima está en forma de un dímero.

Posteriormente, se determinó el peso molecular de la enzima de cepa de tipo silvestre purificada mediante SDS-PAGE. En primer lugar, las muestras de la enzima de cepa de tipo silvestre purificada se sometieron a desnaturalización (en un tampón de desnaturalización en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos), seguido de tratamientos para la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas a O (usando tanto O-glicosidasa como neuraminidasa; O-Glycosidase & Neuraminidase Bundle, New England Biolabs) y/o cadenas de azúcar ligadas a N (usando PNGase F; New England Biolabs). Las condiciones para estos tratamientos de enzima siguieron los protocolos proporcionados con las respectivas enzimas. Tras los tratamientos, se determinaron los pesos moleculares de los productos resultantes mediante SDS-PAGE.

Se encontró que la enzima de cepa de tipo silvestre tiene un peso molecular de 120 kDa tras ningún tratamiento, de 106 kDa tras la eliminación de cadenas de azúcar ligadas a O, de 104 kDa tras la eliminación de cadenas de azúcar ligadas a N y de 104 kDa tras la eliminación de cadenas de azúcar tanto ligadas a O como ligadas a N.

2. Secuencias de aminoácidos internas de la enzima purificada

El análisis de la secuencia de aminoácidos interna de la enzima purificada reveló que la enzima comprende las siguientes secuencias de aminoácidos internas:

GVQYVDYNSPT (SEQ ID NO: 9)

FLFGWATAAQQ (SEQ ID NO: 10)

QAYQIGIFAEPIYNT (SEQ ID NO: 11)

PSIWDWAS (SEQ ID NO: 12), y

EEPPFAYVPE (SEQ ID NO: 13).

3. Determinación de la secuencia génica de la enzima de cepa de tipo silvestre

Se hizo un intento de determinar la secuencia génica que codifica la p-galactosidasa producida mediante la cepa deOryptococcus terrestrisMM13-F2171. La cepa deüryptococcus terrestrisMM13-F2171 se cultivó en un medio líquido (lactosa al 2,0%, extracto de levadura al 2,0%, KH2PO4 al 0,1%, MgSO4-7H2O al 0,05%, pH 5,0) a 30°C durante 24 horas con agitación (a 200 revoluciones por minuto). Tras completarse el cultivo, se recogieron células. Se preparó ARN total según el protocolo del minikit RNeasy (QIAGEN) para la extracción de ARN de células de levadura (rotura mecánica de células). La síntesis de ADNc a partir del ARN total resultante se realizó usando el kit SMARTer RACE 5’/3’ (TaKaRa), y entonces se llevaron a cabo reacciones 5’ y 3’ RACE PCR. El cebador de 5’RACE GSP usado tenía la secuencia GATTACGCCAAGCTTgcaaagatcccgatctggtacgcctg (SEQ ID NO: 14), y el cebador 3’RACE GSP usado tenía la secuencia GATTACGCCAAGCTTttcctgtttggctgggcgaccgcc (SEQ ID NO: 15). La secuencias de bases de los productos de RACE PCR resultantes se analizaron para determinar la secuencia de ADNc de longitud completa (SEQ ID NO: 5). La secuencia de aminoácidos putativa codificada por la secuencia de ADNc de longitud completa es de SEQ ID NO: 1.

Mediante investigación adicional, se determinó satisfactoriamente la secuencia de ADN genómica que codifica la pgalactosidasa producida mediante la cepa deOryptococcus terrestrisMM13-F2171 (SEQ ID NO 16).

4. Propiedades de la enzima de tipo silvestre purificada

(1) pH óptimo y estabilidad de pH

El pH óptimo y la estabilidad de pH de la enzima de tipo silvestre purificada se examinaron usando una actividad de hidrólisis de lactosa como indicador. Se realizaron exámenes para e pH óptimo usando tampón glicina 0,1 M en el intervalo de pH de pH 2 a 3, tampón citrato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 3 a 6, tampón acetato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 5 a 6, tampón fosfato 0,1 M en el intervalo de pH de pH 7 a 8, y tampón carbonato de sodio 0,1 M en el intervalo de pH de pH 9 a 10. Los resultados de las mediciones de actividad de enzima a diferentes pH mostraron que la enzima purificada tiene un pH óptimo de 4 a 5.

La estabilidad de pH de la enzima purificada se examinó calentándola a 40°C durante 30 minutos en tampones de diferentes pH (usando los tampones descritos anteriormente) y midiendo entonces la actividad de enzima residual. Los resultados de las mediciones de actividad de enzima residual a diferentes pH mostraron que la enzima purificada presentaba una actividad de enzima estable en el intervalo de pH de pH 2 a 8.

(2) Temperatura óptima y termoestabilidad

Para examinar la temperatura óptima de la enzima purificada se usó tampón acetato (pH 6,0) y se midió la actividad de hidrólisis de lactosa a diferentes temperaturas. Los resultados de las mediciones de actividad de enzima a diferentes temperaturas mostraron que se encontró que la enzima purificada tenía una temperatura óptima de 70°C. Para examinar la termoestabilidad de la enzima purificada, se midió la actividad de hidrólisis de lactosa tras haberse calentado la enzima en tampón acetato (pH 6,0) durante 30 minutos a diferentes temperaturas. Los resultados de las mediciones de actividad de enzima a diferentes temperaturas mostraron que la enzima purificada era estable entre 30°C y 60°C y que se conservaba la actividad de enzima a niveles del 80% o más de la actividad.

5. Examen de la capacidad de producción de oligosacáridos de la enzima de tipo silvestre

(1) Métodos

La enzima purificada se examinó para la capacidad de producir oligosacáridos. Una unidad (1 U) de la enzima de cepa de tipo silvestre purificada por 1 g de lactosa se añadió a alícuotas de una disolución de lactosa al 53% que se había precalentado hasta temperaturas de reacción especificadas, que se sometieron entonces a reacción a esas temperaturas durante 24 horas. Las disoluciones de reacción tras haberse completado la reacción se analizaron mediante HPLC (en las condiciones descritas más adelante) para determinar la composición de azúcares contenidos en las mismas. Los resultados de la determinación de la composición de azúcares permiten una evaluación de la actividad de transglicosilación.

Se hicieron exámenes para los grados de polimerización de galacto-oligosacáridos (GOS) y de ramificación de trisacáridos cuando la producción de galacto-oligosacáridos mediante la enzima purificada (enzima de cepa de tipo silvestre) alcanzó un rendimiento de aproximadamente el 50%. Las reacciones se llevaron a cabo según los procedimientos descritos anteriormente, y a 65°C durante 24 horas como condiciones en las que la producción de GOS mediante la enzima purificada (derivada deOryptococcus terrestris)alcanzó un rendimiento de aproximadamente el 50%.

El grado de polimerización se determinó usando una columna MCITM GEL CK04S (Mitsubishi Chemical Corporation); H2O como eluyente; tasa de flujo de 0,4 ml/min; detector de RI; temperatura de columna de 80°C.

El grado de ramificación se determinó usando una columna Shodex (marca comercial registrada) Asahipak NH2P-40 3E (Showa K.K.); MeCN:H2O = 75:25 (vol:vol) como eluyente; tasa de flujo de 0,35 ml/min; detector de RI; temperatura de columna de 25°C.

(2) Resultados

Los resultados de las mediciones se usaron para calcular el contenido (%) de galacto-oligosacáridos (GOS) en la cantidad total de azúcares (azúcar total), contenida en las respectivas disoluciones de reacción y las proporciones (%) de los respectivos GOS con los grados de polimerización indicados, a las temperaturas de reacción indicadas. Los resultados se muestran en la tabla 1. Se encontró que la enzima purificada (enzima de cepa de tipo silvestre) tenía una capacidad de producción de GOS excelente. Además, se encontró que la enzima de cepa de tipo silvestre presentaba altos niveles de actividad de transglicosilación en condiciones de alta temperatura.

Ta l 1: Pr i n n fí- l i i ilv r m r r v ri l .

* Lactosa no incluida

Los resultados de las mediciones se usaron para calcular las proporciones (%) de los respectivos GOS con los grados de polimerización indicados. Los resultados típicos para los grados de polimerización de GOS cuando se usó la enzima purificada (enzima de cepa de tipo silvestre) se muestran en la tabla 2. Se encontró que la enzima de cepa de tipo silvestre (enzima derivada deOryptococcus terrestris)tiene una capacidad de producción de GOS excelente y que produce de manera eficiente oligosacáridos, particularmente trisacáridos y sacáridos superiores.

Tabla 2: Com aración de la roducción de GOS con diversas enzimas.

* Lactosa no incluida

Los resultados de las mediciones se usaron para calcular las proporciones (%) de oligosacárido lineal y ramificado en los trisacáridos resultantes y para comparar las relaciones de trisacáridos con cadena ramificada (es decir los grados de ramificación de los trisacáridos) entre las enzimas derivadas deOryptooooous terrestrisy otras cepas productoras de p-galactosidasa conocidas. Los resultados para los grados de ramificación de los GOS cuando se usó la enzima purificada (enzima de cepa de tipo silvestre) se muestran en la tabla 3. Se encontró que la enzima de cepa de tipo silvestre (enzima derivada deOryptooooous terrestris)produce predominantemente oligosacáridos lineales. Por tanto, se reveló que la enzima de cepa de tipo silvestre tiene actividad de transglicosilación en la que la cadena de azúcar se transfiere específicamente por medio del enlace glicosídico p-1,4 y en particular es menos capa de transglicosilar para formar el enlace glicosídico p-1,6.

Ta l : m r i n l r r mifi i n DP r i n iv r nzim

6. Obtención de enzimas fi-galaotosidasa producidas mediante cepas mutantes y determinación de secuencias de aminoácidos y los pesos moleculares de las mismas

Se obtuvieron dos cepas mutantes (M2 y M6) de la cepa deOryptooooous terrestrisMM13-F2171 por medio de mutagénesis con tratamiento UV. Las enzimas p-galactosidasa producidas mediante estas cepas mutantes se purificaron en procedimientos similares a los descritos anteriormente para la enzima de tipo silvestre. Se encontró que las cepas M2 y M6 tenían, cada una, una alta capacidad para producir enzimas de cepa mutante 1 a 3; se observó que la cepa M2 tiene una capacidad particularmente alta para producir enzima de cepa mutante 1, y la cepa M6 para producir enzimas de cepa mutante 2 y 3. La cepa deOryptooooous terrestrisM2 se depositó el 10 de diciembre de 2015 en el Depositario de microorganismos de patentes, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación, bajo el nombre deOryptooooous terrestrisAPC-6431, al que se le asignó el número de registro NITE BP-02178.

Se determinaron las secuencias de aminoácidos de las enzimas purificadas obtenidas, es decir, una enzima derivada de la cepa mutante M2 (enzima de cepa mutante 1) y dos enzimas derivadas de la cepa mutante M6 (enzimas de cepa mutante 2 y 3). En primer lugar, se determinaron las secuencias de aminoácidos N-terminales de enzimas de cepa mutante 1 a 3 usando un secuenciador de proteínas (PPSQ-31A, SHIMADZU CORPORATION). Entonces, se buscó la secuencia de ADNc de la enzima de cepa de tipo silvestre (SEQ ID NO: 5) para la secuencia de bases correspondiente a la secuencia de aminoácidos N-terminal de cada una de las enzimas de cepa mutante, para determinar de ese modo la secuencia de ADNc que codifica cada una de las enzimas de cepa mutante. La secuencia de aminoácidos de enzima de cepa mutante 1 (SEQ ID NO: 2) corresponde a una que tiene una deleción de los 130 residuos de aminoácido N-terminales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), que se deduce de la secuencia de ADNc que codifica la enzima de cepa de tipo silvestre (SEQ ID NO: 5). De manera similar, la secuencia de aminoácidos de enzima de cepa mutante 2 (SEQ ID NO: 3) corresponde a una que tiene una deleción de los 136 residuos de aminoácido N-terminales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), mientras que la secuencia de aminoácidos de enzima de cepa mutante 3 (SEQ ID NO 4) corresponde a una que tiene una deleción de los 141 residuos de aminoácido N-terminales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la enzima de cepa de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).

Posteriormente, se determinaron los pesos moleculares de estas enzimas de cepa mutante mediante SDS-PAGE. Los procedimientos y las condiciones para eliminar cadenas de azúcar eran según los descritos anteriormente para la enzima de tipo silvestre. Los pesos moleculares de las respectivas enzimas de cepa mutante se determinaron cuando las enzimas no se sometieron a ningún tratamiento, y a tratamientos para la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aN,las cadenas de azúcar ligadas aOy las cadenas de azúcar tanto ligadas aNcomo ligadas aO.Basándose en los resultados del análisis de SDS-PAGE, se observó que la cepa M2 produce enzimas de cepa mutante 2 y 3, además de enzima de cepa mutante 1.

Se encontró que la enzima de cepa mutante 1 tiene un peso molecular de 71 kDa tras ningún tratamiento, de 65 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aO, de 64 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aNy de 64 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar tanto ligadas aOcomo ligadas aN.

Se encontró que la enzima de cepa mutante 2 tiene un peso molecular de 66 kDa tras ningún tratamiento, de 63 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aO, de 61 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aNy de 61 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar tanto ligadas aOcomo ligadas aN.

Se encontró que la enzima de cepa mutante 3 tiene un peso molecular de 66 kDa tras ningún tratamiento, de 62 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aO, de 61 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar ligadas aNy de 61 kDa tras la eliminación de las cadenas de azúcar tanto ligadas aOcomo ligadas aN.

7. Examen de la capacidad de producción de oligosacáridos de enzimas de cepa muíante 1, 2 y 3

(1) Métodos

A alícuotas de una disolución de lactosa se les añadió la enzima purificada derivada de la cepa M2 (enzima de cepa mutante 1) o M6 (enzima de cepa mutante 3), y se sometieron las mezclas a reacción. Se realizaron exámenes para los grados de polimerización y ramificación de los azúcares contenidos en las disoluciones de reacción tras haberse completado la reacción. Las condiciones de reacción y las mediciones de los grados de polimerización y ramificación eran según los descritos anteriormente en 5.

(2) Resultados

Los resultados de las mediciones se usaron para calcular el contenido (%) de GOS en la cantidad total de los azúcares (azúcar total) contenidos en las respectivas disoluciones de reacción y las proporciones (%) de los respectivos GOS con los grados de polimerización indicados, a las temperaturas de reacción indicadas (tabla 4). Se encontró que la enzima purificada (enzima de cepa mutante) tiene una capacidad de producción de GOS excelente. Además, se encontró que la enzima de cepa mutante presenta niveles altos de actividad de transferencia de azúcar en condiciones de alta temperatura. También puede encontrarse que no había diferencias en la capacidad de producción de GOS entre la enzima de cepa de tipo silvestre y la enzima de cepa mutante.

Tabl

* Lactosa no incluida

Los resultados de las mediciones se usaron para calcular las proporciones (%) de los respectivos GOS con los grados de polimerización indicados. Los resultados típicos para los grados de polimerización de los GOS cuando se usaron las enzimas mutadas purificadas derivadas de las cepas M2 (enzima de cepa mutante 1) y M6 (enzima de cepa mutante 3) se muestran en la tabla 5. Se encontró que las enzimas de cepa mutante tienen una capacidad de producción de GOS excelente y producen de manera eficiente oligosacáridos, particularmente trisacáridos y sacáridos superiores. También puede encontrarse que no había diferencias en la capacidad de producción de GOS entre la enzima de cepa de tipo silvestre y las enzimas de cepa mutante.

Tabla 5: Com aración de la roducción de GOS con diversas enzimas .

* Lactosa no incluida

Los resultados de las mediciones se usaron para calcular las proporciones (%) de oligosacárido lineal y ramificado en los trisacáridos resultantes y para comparar las relaciones de trisacáridos con cadena ramificada (es decir los grados de ramificación de los trisacáridos) entre la enzima de cepa de tipo silvestres y dos enzimas de cepa mutante Tabla 6.

Ta l : m r i n l r r mifi i n DP r i n iv r nzim .

Se encontró que las enzimas de cepa muíante (enzimas derivadas deCryptococcus terrestris, mutadas) producen predominantemente oligosacáridos lineales. Por tanto, se reveló que las enzimas de cepa muíante tienen actividad de transglicosilación en la que la cadena de azúcar se transfiere específicamente por medio de enlace glicosídico p-1,4 y en particular son menos capaces de transglicosilar para formar enlace glicosídico p-1,6. También se observó que la enzima de cepa de tipo silvestre y las enzimas de cepa mutante tienen una capacidad comparable de producir GOS y no tienen ninguna diferencia sustancial en términos de propiedades tal como p-galactosidasa. La enzima de cepa mutante 2 es una enzima p-galactosidasa de la que la secuencia de aminoácidos es más corta en seis residuos de aminoácido en el extremo N-terminal que la de enzima de cepa mutante 1 y más larga en cinco residuos de aminoácido en el extremo N-terminal que la de la enzima de cepa mutante 3. Dado que resulta evidente a partir de los resultados anteriores que una secuencia de aminoácidos en una región N-terminal no afecta a las propiedades enzimáticas, puede deducirse que la enzima de cepa mutante 2 también tiene propiedades enzimáticas equivalentes a las de las enzimas de cepa mutante 1 y 3.

8, Propiedades de enzimas de cepa mutante 1 y 3

Se usaron las enzimas mutadas, purificadas, (véase la sección anterior descrita en 6.) para examinar las propiedades de las enzimas de cepa mutante 1 y 3. Los métodos experimentales fueron similares a los descritos para la enzima de cepa de tipo silvestre (véase la sección anterior descrita en 4.).

(1) pH óptimo y estabilidad de pH

Se encontró que las enzimas de cepa mutante 1 y 3 tenían cada una un pH óptimo de 4 a 5. Se encontró que las enzimas de cepa mutante 1 y 3 presentaban cada una actividad estable en el intervalo de pH de pH 2 a 9.

(2) Temperatura óptima y termoestabilidad

Se encontró que las enzimas de cepa mutante 1 y 3 tienen, cada una, una temperatura óptima de 70°C. Se encontró que las enzimas de cepa mutante 1 y 3 son cada una estables entre 30°C y 65°C y conservan la actividad de enzima a niveles del 80% o más de la actividad.

EJEMPLO 1: Preparación de GOS hipoalergénicos (HA-GOS).

Síntesis de la preparación de GOS

Se produjeron cuatro lotes de una preparación de GOS (denominada PT 731-741-631-431) mediante la transgalactosilación de lactosa mediante cuatro lotes de enzima p-galactosidasa deCryptococcus terrestris(obtenida de Amano Enzyme Inc., números de lote GFEO0450731SDR, GFEO0450741SDR, GFEN1052631SDR y GFEO0750431SDR). Para cada lote, se usó una suspensión de lactosa (~50% (p/p) Lactopure, n.° de lote 502392; MFG: 13-07-2014) como sustrato. Esta suspensión de lactosa se calentó hasta 95°C para disolver la lactosa. Posteriormente se enfrió la disolución de lactosa hasta la temperatura de reacción de 65°C. Se añadió un tampón citrato muy suave (2-3 mM) con el fin de ajustar y estabilizar el pH. Por gramo de lactosa se usaron 0,94 LU de enzima. Durante la reacción se ajustó el pH mediante ácido cítrico e hidróxido de sodio cuando fue necesario. 42 horas tras la adición de enzima se detuvo la reacción calentando 30 min a 90°C.

Procesamiento aguas abaio

Tras terminar la reacción enzimática mediante calentamiento, se hizo pasar la disolución en una columna de intercambio iónico (intercambio catiónico seguido de intercambio aiónico)), seguido de la reducción del pH a 3,2 usando ácido cítrico. Tras la pasteurización a 75°C se concentraron los GOS hasta aproximadamente el 75% de materia seca.

Los análisis de los lotes así obtenidos de preparación de GOS se indican en la tabla 7. En esta tabla se muestra que las especificaciones de los cuatro lotes producido aplicando cuatro lotes de enzima p-galactosidasa deP. terrestrisson altamente consistentes (baja variación entre lotes). Las diferencias con REF-GOS, que se prepara mediante la transgalactosilación de lactosa bajo la acción deB. circulans, son muy pequeñas.

Ta l 7: An li i r xim l iv r l HA-

* GOS convencionales preparados mediante la transgalactosilación de lactosa bajo la acción deB. circulans.

El análisis del grado de polimerización (DP) de GOS se realizó según métodos establecidos. Las tabla 8 muestra que los resultados del análisis del grado de polimerización de GOS hipoalergénicos (HA-GOS) de la presente invención son altamente similares a los encontrados en la preparación de GOS de referencia obtenida usando la enzima deB. circulans(REF-GOS).

Ta l : R l n lí i r l n li i DP

EJEMPLO 2: Prueba de exposición oral

Este ejemplo describe una prueba de exposición oral controlada por placebo doble ciega para demostrar la alergenicidad reducida de HA-GOS en en múltiples sujetos humanos con alergia a los galacto-oligosacáridos conocida. Además, se realizaron una prueba de punción cutánea y una prueba de activación de basófilos con HA-GOS.

Materiales

Se incluyeron HA-GOS (lote PT731; véase el ejemplo 1) y una preparación de GOS comercial obtenida usando enzima deB. circulans(REF-GOS) en las pruebas. Los materiales se almacenaron a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.

Sujetos

Los sujetos eligibles se seleccionaron de la cohorte estudiada previamente para la prevalencia de alergia a GOS en una población atópica de Singapur, tal como se describe en el artículo científico de Sohetal.,201510. Se dirigió a siete sujetos eligibles para la participación en el estudio. Dos sujetos se negaron a participar. Por tanto, se trajeron de vuelta a la clínica a cinco sujetos adultos con alergia relacionada con GOS confirmada para una prueba de punción cutánea, extracción de muestras de sangre y dos veces para una prueba de exposición oral controlada por placebo doble ciega con HA-GOS (el tiempo mínimo entre las exposiciones fue de 2 semanas). El estudio fue aprobado por la comisión de revisión ética institucional del hospital (protocolo IRB “Pruebas de hipoalergenicidad de un galacto-oligosacárido modificado en pacientes con alergia a galacto-oligosacáridos conocida”. Se obtuvo consentimiento por escrito de todos los sujetos antes del inicio del estudio.

Prueba de punción cutánea, prueba de activación de basófilos y prueba de exposición oral

Las pruebas de punción cutánea de HA-GOS se llevaron a cabo por el coordinador de investigación clínica en el centro del brazo o el antebrazo. Se usaron histamina y REF-GOS como controles positivos. Se registró el tamaño de roncha para cada muestra y se usó como grado de reactividad a la prueba cutánea.

Se realizó una prueba de activación de basófilos en muestras de sangre de los pacientes. Se incubaron previamente alícuotas de sangre periférica heparinizas (100 gl) a 37°C durante 5 minutos y entonces se incubaron con 100 gl de PBS (control negativo), anticuerpo anti-IgE (control positivo, G7-18; BD Biosciences, San José, Calif.) o muestras de GOS diluidas durante 15 minutos (37°C). Tras la incubación se lavaron las células en PBS-EDTA (20 mmol/l) y entonces se incubaron con Acm anti-IgE humana etiquetado con ficoeritrina (lge21; eBioscience, San José, Calif.), anti-CD203c humano etiquetado con biotina (NP4D6; BioLegend, San José, Calif.) y anti-CD63 humano etiquetado con isotiocianato de fluoresceína (MEM-259, BioLegend) durante 20 minutos a 48°C. La expresión de CD203c y CD63 son ambas marcadores para la activación de basófilos. Tras lavar las células con BSA al 1%/PBS, se añadió estreptavidina conjugada con aloficocianina (BD Biosciences) y se incubó durante 15 minutos a 48°C. Después, se sometieron las muestras a lisis de eritrocitos con 2 ml de disolución de lisis FACS (BD Biosciences). Entonces se lavaron las células, se resuspendieron en BSA al 1% /PBS y se analizaron por medio de FACSCalibur (BD Biosciences). Se detectaron los basófilos basándose en las características de dispersión lateral y la expresión de IgE (IgEhigh)7.

Se realizó una prueba de exposición a alimento oral mediante la administración de dosificaciones crecientes de HA-GOS a intervalos de 30 minutos hasta conseguir una dosis acumulada total de 4 gramos (véase la tabla 9 a continuación). Se eligió la dosis total de 4 gramos, ya que esta era la dosis máxima que desencadenaba una reacción clínica en 5 pacientes que tenían anafilaxia a REF-GOS, tal como se notifica por Chianget al.7.Se usó una disolución de 0,8 g de GOS/100 ml de agua en el estudio y se preparó recientemente el día de la exposición.

Tabl : R im n i l r x i i n lim n r l

Como placebo se usó una mezcla de glucosa, lactosa y ácido cítri

el sabor de HA-GOS. La preparación de la disolución de prueba para las exposiciones orales se realizó por parte de persona de laboratorio no implicado en las verdaderas pruebas de exposición oral. Además, la preparación de la disolución se comprobó por parte de una segunda persona para evitar cualquier confusión. El médico que realizaba la exposición oral era ciego para el material de prueba(HA-GOS o disolución placebo).

Resultados

Resultados de la prueba de punción cutánea y la prueba de exposición oral

Siete sujetos con alergia relacionada con REF-GOS probada previa fueron eligibles para una exposición oral con HA-GOS. Estos sujetos habían tenido reacciones típicas de una reacción alérgica aguda en el plazo de 30 minutos de la dosis umbral durante la exposición con REF-GOS. Todos tuvieron pruebas de punción cutánea positivas para REF-GOS.

Finalmente, se expusieron cuatro sujetos con HA-GOS y placebo en el estudio actual (sujeto n.° 1, n.° 2, n.° 4 y n.° 5). Antes de la exposición a HA-GOS, todos eran negativos a la prueba de punción cutánea de HA-GOS.

Los resultados detallados de la exposición oral (OC) y la prueba de punción cutánea (SPT) con HA-GOS se presentan en la tabla a continuación. La respuesta a una exposición con REF-GOS (realizada aproximadamente dos años y medio antes de la exposición actual con HA-GOS) se describe también en la tabla 10, como referencia.

Tabl 1 : R l l x i i n r l l r n i n n PT n HA-

AR = rinitis alérgica, AS = asma, AD = dermatitis atópica, OC = exposición oral, SPT = prueba de punción cutánea, C = HA-GOS, P = placebo

*El sujeto n ° 1 no pasó la prueba de exposición a placebo; experimentó picor en la espalda, el pecho y la lengua y se sintió mareada.

El sujeto nT 1 experimentó síntomas de una respuesta alérgica (picor en la espalda, el pecho y la lengua; sensación de mareo) durante la exposición con placebo, mientras que pasó la prueba de exposición oral con HA-GOS sin ninguna queja. Se confirmó por parte de profesionales médicos que el sujeto había recibido placebo antes de experimentar estos síntomas de alergia. Este es un fenómeno que se produce en ocasiones durante exposiciones controladas por placebo y está provocado probablemente por la ansiedad del sujeto.

Los datos en la tabla 10 muestran que los cuatro sujetos que se sometieron a una exposición con HA-GOS controlada por placebo doble ciega no mostraron síntomas alérgicos tras el consumo de HA-GOS.

Resultados de la prueba de activación de basófilos

Las Figuras 2-6 muestran los resultados de la prueba de activación de basófilos realizada en los cinco sujetos antes de someterse a la prueba de exposición oral.

La Figura 2 muestra los resultados de la activación de basófilos en el sujeto de prueba n.o 1 medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figura 2a, MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figura 2b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico).

De manera similar, las Figuras 3, 4, 5 y 6 muestran la activación de basófilos en los sujetos de prueba n° 2, n ° 3, n° 4 y n ° 5, respectivamente, medida mediante la expresión del marcador de activación de basófilos CD203c (Figuras 3a, 4a, 5a y 6a; MFl = fluorescencia media) y el porcentaje de células que expresan el marcador de activación de basófilos CD63 (Figuras 3b, 4b, 5b y 6b). Los cuadrados representan HA-GOS (línea continua en el gráfico). Los diamantes representan REF-GOS (línea discontinua en el gráfico).

Los resultados muestran que tres sujetos (n° 1, n ° 3 y n ° 4) tenían una respuesta de activación de basófilos negativa a REF-GOS. Esto se observó también previamente durante otras pruebas de activación de basófilos con REF-GOS. Sin embargo, se confirma que estos sujetos son alérgicos a REF-GOS, dado que tienen una prueba de punción cutánea positiva y un resultado de prueba de exposición oral en respuesta a REF-GOS. La respuesta de basófilos con respecto a HA-GOS también era negativa en estos sujetos.

Los sujetos n.° 2 y n.° 5 mostraron una clara respuesta de activación de basófilos con respecto a REF-GOS, mientras que HA-GOS no dio como resultado una activación de basófilos.

Conclusiones

El consumo de HA-GOS no mostró ninguna respuesta alérgica durante una prueba de exposición oral controlada por placebo en n=4 sujetos alérgicos a REF-GOS. Las pruebas de punción cutánea con HA-GOS fueron negativas en todos los sujetos sometidos a prueba. También en la prueba de activación de basófilos en sujetos alérgicos a REF-GOS, se encontrón una alergenicidad claramente reducida con HA-GOS en comparación con REF-GOS. Tomado conjuntamente, puede concluirse que HA-GOS es claramente hipoalergénico en comparación con REF-GOS.

REFERENCIAS

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2. Sierra, C.et al.Prebiotic effect during the first year of life in healthy infants fed formula containing GOS as the only prebiotic: a multicentre, randomised, double-blind and placebo-controlled trial. Eur. J. Nutr. 54, 89-99 (2014). 3. Fanaro, S.et al.Galacto-oligosaccharides are bifidogenic and safe at weaning: a double-blind randomized multicenter study. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 48, 82-8 (2009).

4. Sierra, C.et al.Prebiotic effect during the first year of life in healthy infants fed formula containing GOS as the only prebiotic: a multicentre, randomised, double-blind and placebo-controlled trial. Eur. J. Nutr. (2014).

5. Arslanoglu, S., Moro, G. E. y Boehm, G. Early supplementation of prebiotic oligosaccharides protects formulafed infants against infections during the first 6 months of life. J. Nutr. 137, 2420-2424 (2007).

6. Chatchatee, P.et al.Identification of IgE and IgG binding epitopes on beta- y kappa-casein in cow’s milk allergic patients. Clin. Exp. Allergy 31, 1256-62 (2001).

7. Whisner, C. M.et al.Galacto-oligosaccharides increase calcium absorption and gut bifidobacteria in young girls: a double-blind cross-over trial. Br. J. Nutr. 110, 1292-303 (2013).

8. Chiang, W. C.et al.Anaphylaxis to cow’s milk formula containing short-chain galacto-oligosaccharide. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 1361-1367 (2012).

9. Lieberman, J. A. y Sicherer, S. H. Diagnosis of food allergy: epicutaneous skin tests,in vitrotests, and oral food challenge. Curr. Allergy Asthma Rep. 11,58-64 (2011).

10. Soh, J. Y.et al.Anaphylaxis to galacto-oligosaccharides - an evaluation in an atopic population in Singapore. Allergy 70, 1020-3 (2015).

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un método para proporcionar una composición nutricional hipoalergénica, que comprende (i) poner en contacto una alimentación de lactosa con una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestrisque tiene una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, para proporcionar una preparación de galactooligosacáridos (GOS) hipoalergénica, y (ii) formular dicha preparación de GOS hipoalergénica junto con al menos un ingrediente hipoalergénico o no alergénico adicional para dar una composición nutricional hipoalergénica.
2. - El método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un ingrediente hipoalergénico o no alergénico adicional se selecciona de hidrolizados de proteína no alergénicos, hidrolizados sustancialmente libres de proteínas alergénicas y fuentes de proteínas hipoalergénicas.
3. - El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la composición nutricional es una composición MUM para mujeres embarazadas, una leche de crecimiento, un preparado de continuación o un preparado para lactantes.
4. - El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deOryptococcus terrestris(renombrado recientemente comoPapiliotrema terrestris)es una beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada de la cepa deOryptococcus terrestrisMM13-F2171 (número de registro: NITE BP-02177) o APC-6431 (número de registro: NITE BP-02178).
5. - El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) derivada deO. terrestriscomprende una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 97%, preferiblemente al menos un 98% y lo más preferiblemente al menos un 99%, idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 4.