ES2963896T3

ES2963896T3 - Ensayos de unión ligando-receptor resueltos espacialmente

Info

Publication number: ES2963896T3
Application number: ES19166880T
Authority: ES
Inventors: Ruan Qiaoqiao; Silvia C Saldana; Joseph P Skinner; Sergey Y Tetin
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2011-06-06
Filing date: 2012-06-05
Publication date: 2024-04-03
Anticipated expiration: 2032-06-05
Also published as: EP2718717B1; JP2019148590A; CN106841127A; ES2733575T3; US20220228990A1; EP2718717A1; CN106841127B; CN103733066B; EP4249915A2; US10190986B2; US20190195798A1; EP4249915A3; JP2014523526A; US11719641B2; EP3527987B1; EP3151006A1; ES2624247T3; JP6173306B2; EP3527987A1; CN103733066A

Abstract

Un método para determinar la concentración de un antígeno en una muestra que comprende las etapas de: (a) combinar en una mezcla de reacción (i) una muestra que se sospecha que contiene un antígeno, (ii) un anticuerpo de captura unido a una micropartícula, que captura el anticuerpo se une específicamente al antígeno, y (iii) un anticuerpo de detección marcado fluorescentemente que se une específicamente al antígeno y permite la formación de un complejo que comprende la micropartícula unida al anticuerpo de captura, el antígeno y el anticuerpo de detección; (b) adquirir un imagen de luz blanca de la mezcla de reacción para determinar la ubicación de la micropartícula en la reacción del paso (a) y una imagen de fluorescencia de la mezcla de reacción para determinar la ubicación del anticuerpo de detección marcado fluorescentemente en la reacción del paso (a);(c) seleccionar al menos una región de interés de las imágenes adquiridas en el paso (b), en donde al menos una región de interés es una región desde la cual emanan señales luminosas del complejo formado en el paso (a);(d) seleccionar píxeles en al menos una región de interés para el análisis; (e) calcular y registrar el promedio y la varianza de los recuentos por píxel para los píxeles seleccionados en la etapa (d), en donde los recuentos por píxel es el número de fotones contado por píxel por unidad de tiempo; (f) omitir píxeles que tienen recuentos mayores o menores que una variación especificada; (g) calcular recuentos promedio por píxel de los píxeles restantes; y (h) determinar la concentración del antígeno a partir de los datos del paso (g). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayos de unión ligando-receptor resueltos espacialmente

La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de Estados Unidos n.° de serie 13/153.934 presentada el 6 de junio de 2011,

DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la determinación de la concentración de un ligando en una muestra, más particularmente, un ligando que se une específicamente a un receptor.

2. Discusión de la técnica

Durante las últimas décadas, se han realizado inmunoensayos utilizando fluorescencia, quimioluminiscencia, u otros medios para generar una señal en respuesta a un analito. Actualmente, muchos inmunoensayos se realizan midiendo la intensidad de una señal luminosa generada en el volumen total de una mezcla de reacción. La señal luminosa generada se puede medir por medios ópticos, en donde la señal luminosa generada es emitida por una gran cantidad de moléculas. En una realización habitual, estos inmunoensayos pueden realizarse combinando una muestra que se sospecha que contiene un antígeno con un reactivo que comprende un primer anticuerpo unido a un soporte sólido, por ejemplo, una esfera, una micropartícula, para formar una mezcla de reacción. El antígeno, si está presentes en la muestra, se une específicamente al primer anticuerpo. Un conjugado, que comprende un segundo anticuerpo que tiene un marcador adherido al mismo, se introduce en la mezcla de reacción y se une específicamente al antígeno, que está específicamente unido al primer anticuerpo, que, como se ha indicado anteriormente, está sujeto al soporte sólido. Un inmunoensayo de este tipo se denomina inmunoensayo de tipo sándwich o ensayo inmunométrico. Este tipo de inmunoensayo se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Luego se mide la señal atribuible al marcador después de eliminar el conjugado no unido de la mezcla de reacción, normalmente realizando una etapa de lavado. La señal que deriva del volumen total de la mezcla de reacción se mide y luego se compara con una curva de calibración para establecer la concentración de antígeno presente en la muestra.

Otro tipo de inmunoensayo se denomina inmunoensayo competitivo. En una realización habitual, un antígeno no marcado y un antígeno marcado compiten por el mismo sitio del anticuerpo. Como alternativa, un anticuerpo y un anticuerpo marcado compiten por el mismo sitio del antígeno. En un ejemplo de lo primero, se utilizan un antígeno marcado y un antígeno no marcado. Un soporte sólido se reviste de un anticuerpo que puede unirse específicamente al antígeno marcado o al antígeno no marcado. El soporte sólido, el antígeno marcado y la muestra de un paciente que se sospecha que contienen el antígeno se combinan. Por supuesto, cualquier antígeno en la muestra del paciente no está marcado. El antígeno marcado y el antígeno no marcado compiten por los sitios de anticuerpos en el soporte sólido. Sólo cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo en el soporte sólido se puede producir una señal, porque sólo el antígeno marcado puede generar una señal. La cantidad de antígeno en la muestra del paciente es inversamente proporcional a la cantidad de señal producida. Este tipo de inmunoensayo se muestra esquemáticamente en la Figura 2.

Al realizar inmunoensayos utilizando diferentes métodos ópticos, se deben considerar una serie de parámetros. Estos parámetros incluyen el tiempo necesario para realizar el inmunoensayo, la cantidad de muestra necesaria para realizar el inmunoensayo, la cantidad de reactivos adicionales necesarios para realizar el inmunoensayo, el número de etapas necesarias para completar el inmunoensayo, la sensibilidad del inmunoensayo y el intervalo dinámico del inmunoensayo. El intervalo dinámico a menudo puede cubrir tres o más órdenes de magnitud. Durante muchas décadas, se ha demostrado que los inmunoensayos que utilizan micropartículas magnéticas proporcionan valores adecuados para la mayoría de los parámetros mencionados anteriormente. Las micropartículas magnéticas permiten la separación del analito unido al conjugado del conjugado no unido y otros reactivos de una manera sencilla. Otra propiedad atractiva de las micropartículas magnéticas es que pueden controlarse fácilmente en una solución para permitir la unión del analito o conjugado en la fase sólida en un tiempo relativamente corto. Al hacer uso de la atracción magnética, las micropartículas magnéticas se pueden mover y lavar para proporcionar información sólo sobre el analito unido a las micropartículas magnéticas.

Un inconveniente importante del uso de cualquier micropartícula como soporte sólido es la falta de uniformidad de una micropartícula a otra con respecto a la cantidad de anticuerpo que recubre la micropartícula. Otro inconveniente es la interacción no deseada del conjugado con las micropartículas. Esta interacción no deseada puede afectar a los resultados del inmunoensayo y, como consecuencia, puede requerir un estudio extenso de una serie de micropartículas diferentes, fabricadas por diferentes fabricantes, para su uso en un analizador de inmunoensayo. Otro inconveniente se presenta cuando los inmunoensayos se realizan en un recipiente de reacción. El conjugado puede unirse a las superficies del recipiente de reacción, lo cual es indeseable. Estos inconvenientes no sólo limitan la sensibilidad de un inmunoensayo, sino que pueden producir resultados falsos al medir el analito.

Problemas adicionales que pueden surgir en los inmunoensayos implican (a) unión no específica del conjugado al soporte sólido y (b) agregación de reactivos. Estos problemas son una preocupación importante para los desarrolladores de un ensayo. Normalmente, los métodos para reducir la unión no específica implican no sólo la adaptación de los reactivos, sino también mezclarlos en proporciones adecuadas para proporcionar los resultados deseados. Estos métodos, que implican una cantidad significativa de prueba y error, a menudo dan como resultado hacer que el desarrollo de un ensayo sea un proceso largo, además de hacer del desarrollo de un ensayo un proceso empírico, con el resultado de que los reactivos a menudo varían de un lote a otro. Asimismo, una señal resultante de la unión no específica del conjugado puede ser mayor que la señal resultante de la unión específica del conjugado a un analito, limitando así la sensibilidad del inmunoensayo. Sólo mediante el uso de una calibración con muestras libres de cualquier analito se pueden estimar los efectos de la unión no específica durante un ensayo real.

Otro posible inconveniente de un inmunoensayo típico es que una vez realizado el ensayo, el único registro del ensayo es el valor de la señal. No hay oportunidad de volver a comprobar la muestra en busca de defectos ni de obtener más información si se encuentran disponibles nuevos métodos de análisis. No sólo no habrá registro de las propiedades de la fase sólida, sino que tampoco habrá forma de revisar los datos registrados utilizando un algoritmo recientemente desarrollado. No es posible utilizar datos históricos para extraer nueva información.

Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar instrumentos y métodos analíticos para abordar la unión no específica y el rendimiento no deseado de la fase sólida en un ensayo determinado y al mismo tiempo adquirir datos del ensayo para mejorar la sensibilidad del ensayo. Existe la necesidad de reducir el uso de reactivos y proporcionar mediciones en un tiempo adecuado para su uso tanto en un entorno de laboratorio como en un lugar de atención. En principio, un método de este tipo también proporcionaría un control de calidad en tiempo real mientras se realiza el ensayo. Adicionalmente, se desea aliviar la necesidad de generar nuevas curvas de calibración y reducir la variación de reactivos de un lote a otro. También sería deseable mantener un registro del ensayo de tal manera que pueda revisarse en una fecha posterior mediante el uso de diferentes métodos a medida que estos estén disponibles.

Se pueden combinar nuevos métodos de detección con dispositivos de los campos emergentes de la nanotecnología y los microfluidos para proporcionar ensayos más pequeños, más eficaces y más sensibles para detectar y medir analitos en muestras biológicas.

Sumario de la invención

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona un método para determinar la concentración de un antígeno en una muestra que comprende las etapas de:

(a) combinar en una mezcla de reacción (i) una muestra que se sospecha que contiene un antígeno, (ii) un anticuerpo de captura unido a una micropartícula, que el anticuerpo de captura se une específicamente al antígeno y (iii) un anticuerpo de detección marcado fluorescentemente que se une específicamente al antígeno y que permite la formación de un complejo que comprende la micropartícula unida al anticuerpo de captura, el antígeno y el anticuerpo de detección;

(b) adquirir una imagen de luz blanca de la mezcla de reacción para determinar la ubicación de la micropartícula en la reacción del paso (a) y una imagen de fluorescencia de la mezcla de reacción para determinar la ubicación del anticuerpo de detección marcado fluorescentemente en la reacción de la etapa (a);

(c) seleccionar al menos una región de interés de las imágenes adquiridas en la etapa (b), en donde la al menos una región de interés es una región desde la cual emanan señales luminosas del complejo formado en la etapa (a);

(d) seleccionar píxeles en al menos una región de interés para análisis;

(e) calcular y registrar el promedio y la varianza de los recuentos por píxel para los píxeles seleccionados en la etapa (d), en donde los recuentos por píxel son el número de fotones contados por píxel por unidad de tiempo; (f) omitir píxeles que tengan recuentos mayores o menores que una variación especificada;

(g) calcular recuentos promedio por píxel de los píxeles restantes; y

(h) determinar la concentración del antígeno a partir de los datos en la etapa (g).

Más particularmente, el ensayo de unión antígeno-anticuerpo implica combinar reactivos apropiados en los que los anticuerpos se unen a un soporte sólido que es una micropartícula, una muestra que se sospecha que contiene un antígeno y un conjugado que comprende un marcador forman un complejo en el que el marcador está presente en una concentración que es directamente proporcional a la cantidad de ligando presente en la muestra. El marcador del conjugado está unido a un segundo anticuerpo, que es diferente del anticuerpo adherido al soporte sólido. -Para mejorar la sensibilidad del inmunoensayo, se puede emplear una etapa de reacción opcional y una etapa de lavado opcional para reducir la unión no específica y eliminar cualquier exceso de conjugado. Otra alternativa es un inmunoensayo homogéneo de una sola etapa, que no requiere una etapa de separación.

Las micropartículas que llevan anticuerpos en su superficie, una muestra que se sospecha que contiene un antígeno y un conjugado que comprende un marcador unido a un segundo anticuerpo, en el que el segundo anticuerpo difiere de aquellos anticuerpos unidos a las micropartículas, se introducen en un recipiente de reacción y se dejan reaccionar, mediante lo cual se forma un complejo que comprende un marcador que emite una señal luminosa. El recipiente de reacción es capaz de permitir registrar en una imagen los complejos que comprenden los marcadores que emiten señales luminosas. La imagen resultante se puede almacenar para su uso posterior. La señal luminosa de la imagen se califica antes de usarse como medida de la concentración de un antígeno. La imagen incluye una cantidad de píxeles y la imagen se califica y cuantifica píxel por píxel.

La calificación implica restringir el análisis a aquellas partes de la imagen donde se encuentran los complejos y medir el valor de la intensidad de la luz que emana de los complejos en la imagen. Un algoritmo que es adecuado para calificar una señal luminosa de un complejo en una imagen comprende las etapas de:

obtener una imagen de luz blanca de la mezcla de reacción para determinar la ubicación de los complejos unidos a un soporte sólido y adquirir una primera imagen de fluorescencia para determinar la ubicación de un primer conjugado en el complejo;

seleccionar píxeles en la imagen para su análisis;

calcular y registrar el promedio y la varianza de los recuentos por píxel para los píxeles seleccionados en la etapa (b); omitir del análisis píxeles que tengan recuentos mayores o menores que un nivel de varianza específico; y calcular el promedio de recuentos por píxel de los píxeles restantes.

A partir de los datos obtenidos en la etapa (e), se puede determinar la concentración de un antígeno en una muestra. En otra etapa opcional, se puede adquirir una segunda imagen de fluorescencia para determinar la ubicación de un segundo conjugado en el complejo. La segunda imagen de fluorescencia se puede utilizar para aumentar la sensibilidad con respecto a la determinación de la concentración de un antígeno en una muestra.

En los inmunoensayos de tipo sándwich anteriores, el anticuerpo unido al soporte sólido a menudo se denomina anticuerpo de captura. El segundo anticuerpo, que está adherido al marcador se denomina anticuerpo de detección. El recipiente de reacción puede ser un micropocillo o una placa de micropocillos. En un inmunoensayo de tipo sándwich típico, después de dejar que la mezcla de reacción se incube durante un período de tiempo prescrito, la mezcla de reacción normalmente se lava para eliminar cualquier exceso de anticuerpo de detección y otras sustancias no unidas. Luego se obtienen imágenes del complejo que permanece en el recipiente de reacción mediante, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital. A continuación se determina el valor promedio de la intensidad luminosa por píxel. El valor así determinado puede usarse luego para determinar la concentración de antígeno en la muestra.

Con respecto a ciertos tipos de inmunoensayos competitivos, el receptor unido al soporte sólido también puede considerarse un anticuerpo de captura. Sin embargo, cuando un antígeno está adherido a un marcador y se sospecha que la muestra contiene el antígeno, este tipo particular de inmunoensayo competitivo no tiene un anticuerpo de detección. El recipiente de reacción puede ser un micropocillo o una placa de micropocillos. En este tipo particular de inmunoensayo competitivo, después de dejar que la mezcla de reacción se incube durante un período de tiempo prescrito, la mezcla de reacción normalmente se lava para eliminar el exceso de antígeno marcado y cualquier otra sustancia que quede en la mezcla de reacción. Luego se obtienen imágenes del material que queda en el recipiente de reacción mediante, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital. A continuación se determina el valor promedio de la intensidad luminosa por píxel. El valor determinado se utiliza luego para determinar la concentración de antígeno en una muestra. Como se ha indicado anteriormente, existen otros tipos de inmunoensayos que se pueden realizar para proporcionar los resultados necesarios para llevar a cabo los aspectos de obtención de imágenes de la presente invención.

Un método alternativo para proporcionar información adicional relacionada con los ensayos de unión antígenoanticuerpo antes mencionados implica contar el número de micropartículas o puntos fluorescentes que cumplen o superan al menos un criterio seleccionado para el cálculo de la intensidad. Este método alternativo puede proporcionar un control interno para indicar el desempeño adecuado del ensayo. En principio, se puede realizar una comparación de los resultados de un ensayo a otro para garantizar que cada ensayo sea fiable, es decir, suficientemente sensible y suficientemente preciso. El valor promedio de la intensidad de fluorescencia por micropartícula se puede utilizar para determinar la concentración de un antígeno, en contraste con el valor de intensidad por píxel. Los dos valores deben coincidir con los valores del calibrador, produciendo así dos medidas estadísticas que pueden usarse para determinar la concentración de un antígeno.

El método descrito en el presente documento también permite mantener un registro del ensayo de una manera similar a aquellos en los que se mantienen registros de patología tisular y de rayos X. Debido a que las imágenes se adquieren y almacenan fuera de línea, es decir, mediante el almacenamiento de datos informáticos que no están disponibles para su uso inmediato a pedido del sistema sin intervención humana, se pueden emplear diferentes procedimientos de análisis en una fecha posterior. Un beneficio de esta característica es la posibilidad de comparar directamente los resultados del ensayo de muestras tomadas del mismo paciente en diferentes momentos. De esta manera, la información sobre una muestra real y sus ensayos no se pierde y puede compartirse o revisarse más adelante.

El método descrito en el presente documento aborda los problemas inherentes a la medición de la señal total generando imágenes de fluorescencia de complejos que comprenden micropartículas después de realizar un ensayo de unión ligando-receptor. En el método descrito en el presente documento, la medición de la intensidad de la luz emitida por el volumen total de una muestra se reemplaza por el análisis de imágenes del complejo que comprende un analito de la muestra para mejorar la sensibilidad del ensayo. Al incorporar información espacial que no está contenida en los ensayos de unión ligando-receptor convencionales, la agregación de reactivos y la unión no específica se pueden eliminar de la señal generada y el analito en la muestra se puede calificar y cuantificar simultánea o posteriormente. Por ejemplo, con respecto a la calificación, los artefactos no deseados asociados con una fase sólida, tal como, por ejemplo, micropartículas, pueden examinarse y eliminarse antes de utilizar la información de intensidad. Como alternativa, si se desea medir el grado de agregación de proteínas, se puede medir la información espacial antes mencionada relacionada con la agregación, en lugar de eliminarse de la señal generada. Por ejemplo, la agregación de amiloides es un indicador de la enfermedad de Alzheimer. Adicionalmente, con respecto a la cuantificación, el método descrito en el presente documento permite la omisión de información de intensidad de reactivos y conjugados que se han unido de manera no específica a la pared de un recipiente de reacción y de reactivos y conjugados que se difunden en la mezcla de reacción. La información espacial se puede utilizar para definir con precisión la región en una imagen a partir de la cual se debe medir la intensidad para realizar un ensayo de unión ligando-receptor preciso y exacto.

Los ensayos convencionales requieren una gran cantidad de muestra y una gran cantidad de reactivo para proporcionar una señal suficiente. El método descrito en el presente documento requiere sólo una pequeña cantidad de un material de soporte sólido, tal como, por ejemplo, sólo unos cientos de micropartículas recubiertas, por ejemplo, hasta aproximadamente doscientas (200) micropartículas, o menos. El método descrito en este documento permite volver a comprobar las muestras en busca de defectos u obtener más información si hay nuevos métodos de análisis disponibles.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra un inmunoensayo de tipo sándwich.

La figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra un inmunoensayo competitivo.

La figura 3 es una imagen de fluorescencia de un anticuerpo de captura marcado con un fluoróforo rojo.

La figura 4 es una imagen de fluorescencia de un anticuerpo de detección unido a una micropartícula.

La figura 5 es una imagen que muestra regiones de interés a partir de las cuales se puede calcular la intensidad promedio por píxel.

La figura 6 es una imagen de luz blanca de micropartículas que tienen complejos de anticuerpo:analito:conjugado (es decir, anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE) unidos a las mismas.

La figura 7 es una imagen de fluorescencia de micropartículas que tienen complejos de anticuerpo:analito:conjugado (es decir, anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE) unidos a las mismas.

La figura 8 es una imagen de la región de interés basada en las imágenes de la figura 6 y la figura 7. La figura 8 se generó mediante un programa de software.

La figura 9 es una superposición de la imagen de fluorescencia de la figura 7 en la imagen de la región de interés de la figura 8.

La figura 10 es una curva de calibración que muestra el aumento en la sensibilidad de un inmunoensayo resultante del uso de un algoritmo de imágenes descrito en el presente documento. Para esta curva de calibración, los calibradores del analito (es decir, troponina) oscilan entre 10 pg/ml y 50.000 pg/ml.

La figura 11 es una curva de calibración que muestra el aumento en la sensibilidad de un inmunoensayo resultante del uso de un algoritmo de imágenes descrito en el presente documento. Para esta curva de calibración, los calibradores del analito (es decir, troponina) oscilan entre 0 pg/ml y 200 pg/ml. En la figura 11, también se muestra el valor promedio de la intensidad de fluorescencia por píxel del área total de la imagen para cada calibrador.

La figura 12 es una curva de calibración que muestra la intensidad de fluorescencia promedio por píxel para calibradores de un analito (es decir, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos, alternativamente denominado en el presente documento "NGAL"). Para esta curva de calibración, los calibradores del analito NGAL oscilan entre 0 pM y 94 pM.

La figura 13 es una curva de calibración que muestra la intensidad de fluorescencia promedio por píxel para calibradores de un analito (es decir, lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos, alternativamente denominado en el presente documento "NGAL"). Para esta curva de calibración, los calibradores del analito NGAL oscilan entre 0 pM y 6 pM.

La figura 14 es una imagen de luz blanca de micropartículas que tienen complejos de anticuerpo:analito:conjugado (es decir, anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE) unidos a las mismas.

La figura 15 es una imagen de una región de interés basada en las imágenes de la figura 14. La figura 14 se generó mediante un programa de software.

La figura 16 es una imagen de fluorescencia de micropartículas que tienen complejos de anticuerpo:analito:conjugado (es decir, anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE) unidos a las mismas.

La figura 17 es una curva de calibración generada a partir del valor de intensidad promedio por píxel para cada concentración de la troponina calibradora.

La figura 18 (no según la presente invención) es una ilustración que muestra el protocolo de un ensayo para detectar ADN.

Descripción detallada

Las siguientes divulgaciones que se refieren a términos utilizados en la técnica se refieren a la invención sólo en la medida en que sean consistentes con el alcance de la invención como se define en el SUMARIO DE LA INVENCIÓN anterior y en las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en el presente documento, el término "analito" significa un compuesto o composición a medir, que puede ser un ligando, que es monoepitópico o poliepitópico, antigénico o hapténico, uno o varios compuestos, que comparten al menos un sitio epitópico común o un receptor.

Un inmunoensayo es una prueba bioquímica que mide la presencia o concentración de una sustancia en soluciones que frecuentemente contienen una mezcla compleja de sustancias. Los analitos en líquidos biológicos tales como el suero o la orina se analizan frecuentemente mediante métodos de inmunoensayo. Estos ensayos se basan en la capacidad única de un anticuerpo para unirse con alta especificidad a una o un grupo muy limitado de moléculas. Una molécula que se une a un anticuerpo se llama antígeno. Se pueden realizar inmunoensayos para cualquiera de los miembros de un par antígeno/anticuerpo. Además de la especificidad de unión, la otra característica clave de todos los inmunoensayos es un medio para producir una señal mensurable en respuesta a una unión específica. Históricamente, esto se lograba midiendo un cambio en alguna característica física, como la dispersión de la luz o cambios en el índice de refracción. Sin embargo, la mayoría de los inmunoensayos actuales dependen del uso de un reactivo analítico asociado a un marcador detectable. Se han demostrado diversos marcadores, incluidos enzimas; tintes fluorescentes, fosforescentes y quimioluminiscentes; látex y partículas magnéticas; cristalitos de tinte, partículas coloidales de oro, plata y selenio; quelatos metálicos; coenzimas; grupos electroactivos; oligonucleótidos, radicales estables y otros. Dichos marcadores sirven para la detección y cuantificación de eventos de unión después de separar los reactivos marcados libres y unidos o diseñando el sistema de tal manera que un evento de unión efectúe un cambio en la señal producida por el marcador. Los inmunoensayos que requieren una etapa de separación, a menudo llamados inmunoensayos de separación o inmunoensayos heterogéneos, son populares porque son fáciles de diseñar, pero con frecuencia requieren múltiples etapas, incluido el lavado cuidadoso de una superficie a la que se ha adherido el reactivo marcado. Los inmunoensayos en los que la señal se ve afectada por la unión a menudo se pueden realizar sin una etapa de separación. Con frecuencia, estos ensayos se pueden llevar a cabo simplemente mezclando los reactivos y la muestra y realizando una medición física. Estos ensayos se denominan inmunoensayos homogéneos o, con menor frecuencia, inmunoensayos de no separación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "inmunoensayo de tipo sándwich" significa un inmunoensayo que emplea al menos dos receptores que se unen específicamente al mismo ligando. En este tipo de inmunoensayo, el ligando es el analito. Uno de los receptores es capaz de unirse específicamente al ligando, por lo que el receptor permite que el ligando se una directa o indirectamente a un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una micropartícula. El otro receptor es capaz de unirse específicamente al ligando, mediante lo cual el receptor permite que el ligando se una directa o indirectamente a un marcador para proporcionar una señal para detectar el ligando. Por ejemplo, uno de los receptores puede ser un anticuerpo de captura para unirse específicamente a un antígeno en una muestra, mediante el cual el antígeno se une directa o indirectamente a un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una micropartícula, y el otro receptor puede ser un anticuerpo de detección para unirse específicamente al antígeno en la muestra, mediante el cual el antígeno se une directa o indirectamente a un marcador para detectar el antígeno. Si hay una cantidad relativamente alta de ligando presente en la muestra, se producirá una señal más alta. Si hay una cantidad relativamente baja de ligando presente en la muestra, se producirá una señal más baja. La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo representativo de un inmunoensayo de tipo sándwich.

Como se usa en el presente documento, la expresión "inmunoensayo competitivo" significa un inmunoensayo que emplea un receptor que se une a un ligando. En este tipo de inmunoensayo, el ligando es el analito. El receptor es capaz de unirse específicamente al ligando, mediante el cual el ligando se une directa o indirectamente a un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una micropartícula. Un ligando marcado compite por el mismo receptor que el analito.

En el método de la invención, el receptor es un anticuerpo de captura para unirse específicamente a un antígeno en una muestra, mediante el cual el antígeno se une directa o indirectamente a un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una micropartícula. El antígeno de la muestra no está marcado. Un antígeno marcado compite por el mismo anticuerpo de captura que el antígeno no marcado. El antígeno marcado que se une al soporte sólido proporciona una etiqueta para detectar el antígeno. Como alternativa, en el caso en que el receptor sea un antígeno para unirse específicamente a un anticuerpo en una muestra, mediante el cual el anticuerpo se une directa o indirectamente a un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una micropartícula, un anticuerpo no marcado y un anticuerpo marcado pueden competir por el mismo antígeno. El anticuerpo marcado que se une al soporte sólido proporciona un marcador para detectar el anticuerpo. Si hay una cantidad relativamente alta de ligando presente en la muestra, se producirá una señal más baja. Si hay una cantidad relativamente baja de ligando presente en la muestra, se producirá una señal más alta. La figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo representativo de un inmunoensayo competitivo.

Como se usa en el presente documento, el término "complejo" significa al menos dos moléculas que están unidas específicamente entre sí. Los ejemplos de complejos incluyen, pero sin limitación, un ligando unido a un receptor, un ligando unido a una pluralidad de receptores, por ejemplo, un ligando unido a dos receptores, un receptor unido a una pluralidad de ligandos, por ejemplo, un receptor unido a dos ligandos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fase sólida" significa el estado de un receptor en donde el receptor está unido a una superficie de un soporte sólido de manera que el receptor no puede liberarse del soporte sólido en un medio líquido. Una fase sólida se puede separar fácilmente de un líquido en el que está dispersa la fase sólida. Un ejemplo de soporte sólido al que se puede unir un receptor es una micropartícula, tal como, por ejemplo, una micropartícula magnética. La micropartícula se puede separar fácilmente de un líquido en el que está dispersa. La micropartícula se dispersa fácilmente en un medio acuoso.

Como se usa en el presente documento, la expresión "soporte sólido" significa una sustancia que es instrumental en la creación de una fase sólida. Los ejemplos representativos de soportes sólidos, incluyen, pero sin limitación, micropartículas, micropocillos de placas de micropocillos, nanopartículas, geles, coloides, células biológicas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo de captura" significa un anticuerpo que se une a un analito, es decir, un antígeno, a un soporte sólido, con el resultado de que el anticuerpo une el analito al soporte sólido, mediante lo cual el analito se une al soporte sólido directa o indirectamente a través de un resto interpuesto o una molécula interpuesta.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo de detección" significa un anticuerpo que está unido a un resto o a una molécula que proporciona o puede prepararse para proporcionar una señal detectable en una reacción química o biológica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "par de unión específica" significa dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas tiene un área en la superficie o en una cavidad que se une específicamente a una organización espacial particular de la otra molécula. Los miembros del par de unión específica se denominan ligando y receptor.

Como se usa en el presente documento, la expresión "unión no específica" significa la unión entre dos o más entidades, tal como, por ejemplo, dos moléculas, de una manera distinta a la que da como resultado un par de unión específica.

Como se usa en el presente documento, el término "ligando" significa cualquier sustancia para la cual existe naturalmente un receptor o puede prepararse. Tales sustancias incluyen, pero sin limitación, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos y elementos químicos, por ejemplo, cobre, litio.

Como se usa en el presente documento, el término "receptor" significa cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, es decir, sitio epitópico. Los receptores ilustrativos incluyen receptores naturales, por ejemplo, globulina fijadora de tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas y similares.

La unión de un ligando a un receptor implica una interacción no covalente entre dos especies moleculares. Normalmente, pero no necesariamente, un ligando más pequeño es una molécula soluble que se une a un receptor más grande. Los ejemplos de unión de un ligando a un receptor incluyen, pero sin limitación, los siguientes:

(a) un receptor de ADN monocatenario largo que tiene una secuencia complementaria para un ligando de ADN monocatenario corto;

(b) cualquier receptor de anticuerpo que se une a su ligando de antígeno complementario o receptor de antígeno que se une a su ligando de anticuerpo complementario;

(c) el receptor de proteína del factor intrínseco que se une al ligando de la vitamina B<12>;

(d) el receptor de hemoglobina para el ligando de la molécula de oxígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "conjugado" significa una entidad que comprende un miembro de un par de unión y un miembro de un sistema productor de señales, por ejemplo, un marcador. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" significa un miembro de un sistema productor de señales que está unido directa o indirectamente a un miembro de un par de unión o a una micropartícula. Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema productor de señales" se refiere a un sistema que tiene uno o más componentes, estando al menos un componente conjugado con un miembro del par de unión específica. El sistema productor de señales produce una señal medible que es detectable por medios externos, normalmente la medición de la radiación electromagnética, y dependiendo del sistema empleado, el nivel de señal variará en la medida en que el sistema productor de señal se encuentre en el entorno del soporte sólido, por ejemplo, una micropartícula. En su mayor parte, el sistema productor de señales implicará cromóforos, donde los cromóforos incluyen tintes que absorben la luz en la región ultravioleta o visible, fósforos, sustancias fluorescentes, fluoróforos, luminóforos y agentes quimioluminiscentes. Además, se pueden emplear enzimas para producir una señal o para amplificar una señal o ambas de las anteriores.

Como se usa en el presente documento, los términos "calificar", "calificado" y similares se refieren a un procedimiento para eliminar aquellas señales de una imagen que no son atribuibles al complejo que comprende el analito de interés. Las señales que se eliminan incluyen, pero sin limitación, señales que surgen de la unión no específica, la agregación no deseada o las señales que emanan de lugares que no están unidos al soporte sólido. En la mayor parte de casos, pero con algunas excepciones, aquellas señales que califican para análisis y medición son el resultado de la unión específica de un conjugado que comprende un marcador.

Tal como se utiliza en el presente documento y en el campo de la imagen digital en general, el término "píxel" o "pel" (elemento de imagen), significa un único punto en una imagen digital o el elemento de pantalla direccionable más pequeño en un dispositivo de visualización. Es la unidad de imagen más pequeña que se puede representar o controlar. Cada píxel tiene su propia dirección. La dirección de un píxel corresponde a sus coordenadas espaciales. Los píxeles suelen estar dispuestos en una cuadrícula bidimensional y, a menudo, se representan mediante puntos o cuadrados. Cada píxel es una muestra de una imagen original; más muestras suelen proporcionar representaciones más precisas del original. La intensidad de cada píxel es variable. El número total de píxeles de una imagen puede variar. Un ejemplo representativo del número de píxeles de una imagen digital es 1024 x 1024.

Como se usa en el presente documento, el término "intensidad" significa la cantidad o grado de intensidad de la electricidad, luz, calor o sonido por unidad de área o volumen. Más particularmente, con respecto al método realmente descrito en el presente documento, el término "intensidad" se refiere al número de fotones contados por unidad de área por unidad de tiempo. Por ejemplo, se pueden registrar 1000 fotones por unidad de área como 500 cuentas en un solo píxel, mientras que 80 fotones por unidad de área se registran como 40 cuentas en un solo píxel. La conversión particular depende del sistema de cámara utilizado. La intensidad es proporcional al número de fotones contados.

Como se usa en el presente documento, la expresión "región de interés" se refiere a aquellos píxeles de una imagen que se seleccionan para un análisis posterior. En una imagen, los píxeles pueden ser contiguos o no contiguos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "información espacial" significa identificación de un lugar del que emana una señal.

Como se usa en el presente documento, el término "IgG" significa Inmunoglobulina G.

Según la invención se proporciona un método para determinar la concentración de un antígeno en una muestra que comprende las etapas de:

(d) seleccionar píxeles en al menos una región de interés para análisis;

(g) calcular recuentos promedio por píxel de los píxeles restantes; y

En una realización preferida del método según la invención, las imágenes adquiridas en la etapa (b) son imágenes digitales.

En otra realización preferida del método según la invención se requieren hasta aproximadamente doscientas (200) micropartículas.

En otra realización preferida del método según la invención, las imágenes adquiridas en la etapa (b) se registran mediante un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital.

en el método según la invención se puede almacenar un registro del ensayo en un almacenamiento de datos informático.

en el método según la invención, las imágenes adquiridas en la etapa (b) pueden adquirirse y almacenarse fuera de línea.

En el método según la invención se puede utilizar información espacial para calificar y cuantificar los resultados de la determinación.

en el método según la invención, los píxeles omitidos de la etapa (f) pueden tener recuentos mayores o menores que dos veces la varianza.

En el método de la presente divulgación, un ligando se une específicamente a un receptor para formar un complejo ligando-receptor. Se obtiene una imagen del complejo ligando-receptor. La imagen se almacena preferentemente para poder utilizarla más adelante, si se desea. Se selecciona una región de interés de la imagen de tal manera que sólo se estudien más a fondo los complejos ligando-receptor. Esta característica de selección garantiza que las señales de fondo y las señales de unión no específicas se eliminen sustancialmente del análisis posterior. Se calcula el número promedio de recuentos de luz por píxel en la región de interés.

Los ligandos que son susceptibles del método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, los mencionados en la patente de Estados Unidos número 4.275.149, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. Los receptores que son susceptibles del método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, los mencionados en la patente de Estados Unidos número 4.275.149, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. Los complejos ligando-receptor que son susceptibles del método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, los mencionados en la patente de Estados Unidos número 4.275.149, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia.

Los receptores suelen estar unidos a un soporte sólido. Un soporte sólido adecuado para su uso en el presente documento es una micropartícula. Las micropartículas que son adecuadas para su uso con el método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, micropartículas magnéticas. Los tamaños de las micropartículas normalmente oscilan entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 100 pm. Las micropartículas disponibles comercialmente están disponibles en una amplia variedad de materiales, incluidos los hechos de cerámica, vidrio, polímeros y metales. Las micropartículas magnéticas adecuadas para su uso en el método descrito en el presente documento están disponibles comercialmente en Polymer Laboratories, una filial de Agilent Technologies. Aunque la definición generalmente aceptada de 0,1 pm a 100 pm complementa la definición de tamaño de las nanopartículas, hay otras formas de definir el tamaño. La aceptación general considera nanopartículas las micropartículas menores de 100 nm. Cualquier micropartícula mayor que 0,5 pm y menor que 0,5 mm se considera una micropartícula. En general, el tamaño de las micropartículas adecuado para su uso con el método descrito en el presente documento debe ser suficientemente grande para que el sistema de imágenes seleccionado pueda resolver dos micropartículas. Las propiedades de las micropartículas adecuadas para su uso con el método descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, color, es una cuestión de elección. Un experto en la técnica puede seleccionar las propiedades de las micropartículas para cumplir los requisitos impuestos por las variaciones apropiadas del método.

Los recipientes de reacción que son adecuados para su uso con el método descrito en el presente documento incluyen placas de micropocillos. Se prefiere que el recipiente de reacción sea de tal carácter que pueda realizarse una imagen del complejo ligando-receptor. Se prefiere que el recipiente de reacción sea transparente a la radiación electromagnética, típicamente en el rango ultravioleta y visible del espectro. Los materiales que son adecuados para fabricar un recipiente de reacción incluyen vidrio y materiales poliméricos. Se prefiere que el material del recipiente de reacción no sea autofluorescente. Sin embargo, la forma o contorno particular del recipiente de reacción no es crítica.

Las condiciones de reacción para los ensayos contemplados para su uso con el método descrito en el presente documento no son críticas. Se pueden usar sustancialmente las mismas condiciones que se usan con inmunoensayos convencionales u otras reacciones de unión específica convencionales. Tales condiciones incluyen, pero sin limitaciones, la duración de la incubación, el intervalo de temperatura de incubación, el número de etapas de lavado, tampones y otras sustancias no reactivas en los ensayos, y similares. En principio, cualquier inmunoensayo diseñado para su uso como ensayo quimioluminiscente se puede llevar a cabo mediante el método descrito en el presente documento mediante el uso de un marcador fluorescente.

Los sistemas de imágenes adecuados para su uso en el método descrito en el presente documento pueden ser cualquier sistema capaz de adquirir imágenes de manera que se puedan resolver micropartículas individuales. Los dispositivos de imágenes adecuados para su uso con el método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, microscopios ópticos, microscopios de barrido, escáneres de imágenes de fluorescencia y similares. Los tipos de archivos de imagen que son adecuados para su uso con el método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, JPEG/JFIF, GIF, BMP, TIFF y FITS. Los formatos de archivos de imagen se describen en Formatos de archivos de imagen - Wikipedia, la enciclopedia libre, a los que se puede acceder mediante el Protocolo de transferencia de hipertexto en el sitio web en.wikipedia.org/wiki/image_file_formats, incorporados en el presente documento por referencia, y FITS se describe en FITS - Wikipedia, la enciclopedia libre, a la que se puede acceder mediante el Protocolo de transferencia de hipertexto en el sitio web en.wikipedia.org/wiki/FITS, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia.

La duración de la exposición durante la adquisición de la imagen no es crítica. Los tiempos de exposición adecuados para su uso con el método descrito en el presente documento pueden ser cualquier tiempo de exposición que proporcione una resolución suficiente para discernir detalles relevantes de la imagen.

La selección de la región de interés es importante. Mediante el uso de un programa informático adecuado, las ubicaciones de las micropartículas individuales se determinan mediante contraste o algunos criterios alternativos. Los píxeles asociados con las micropartículas u otro soporte sólido pueden considerarse una región de interés. Para obtener un valor significativo de concentración de un analito en una muestra, se prefiere que al menos aproximadamente 100 micropartículas, más preferiblemente al menos aproximadamente 200 micropartículas, se ubiquen en una imagen. Los programas informáticos disponibles comercialmente adecuados para su uso en el método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, aquellos programas que tengan las marcas comerciales "SLIDEBOOK" y "METAMORPH" o software de dominio público, tal como, por ejemplo, ImagenJ.

Para llevar a cabo una forma simplificada del método, se puede utilizar un microscopio de epifluorescencia disponible comercialmente para obtener imágenes de los complejos a través de una superficie transparente sobre la que están apoyados. Un ejemplo representativo de dicho microscopio es un microscopio de fluorescencia invertido motorizado (OLYMPUS "I<x>81") acoplado con una cámara CCD de alta resolución (Hamamatsu Modelo C4742-80-12AG), que están disponibles comercialmente en numerosas fuentes.

En esta forma básica del método, se puede utilizar un enfoque de un solo color para proporcionar una mayor sensibilidad que un inmunoensayo convencional que emplea una señal luminosa del volumen total de una mezcla de reacción. Esta mayor sensibilidad puede evidenciarse mediante un gráfico de una función lineal que tiene una pendiente mayor a concentraciones más bajas en relación con el de un gráfico lineal empleado como curva de calibración en un inmunoensayo convencional.

Las micropartículas que contienen anticuerpos de captura, anticuerpos de detección adheridos a fluoróforos y una muestra que se sospecha que contiene un analito se combinan en condiciones apropiadas para llevar a cabo un inmunoensayo. Una vez realizado el inmunoensayo, se omite cualquier señal de fluorescencia que no emane de un complejo que comprende una micropartícula unida a un anticuerpo de captura, un analito y un conjugado que comprende un anticuerpo de detección unido a un fluoróforo. Después, los complejos restantes se califican aún más en función de la fluorescencia emitida por el fluoróforo del conjugado. Esta última etapa omite cualquier sección en la superficie de la micropartícula que no cumpla con los criterios de selección. Basado en un parámetro estadístico, tal como, por ejemplo, la desviación estándar, un ejemplo típico de criterio de selección es que las micropartículas que se van a utilizar para la medición tengan un recubrimiento sustancialmente homogéneo, lo que esencialmente elimina la agregación excesiva de conjugados, que puede resultar de un alto grado de unión no específica. En general, los criterios de selección varían, dependiendo del ensayo particular. Un experto en la técnica del ensayo particular debería ser capaz de formular criterios de selección significativos para ese ensayo particular. Por último, se mide el valor promedio de intensidad por píxel de las partículas calificadas para comparar la intensidad con una curva de calibración que establece la concentración del analito en función de la intensidad. El valor promedio de intensidad por píxel de las partículas cualificadas se puede determinar mediante una cámara CCD, que es capaz de medir la intensidad de la luz. La medida de intensidad se convierte en un parámetro, que se designa en las unidades de recuento. Cada píxel tiene un número correspondiente a la intensidad de la luz medida en ese píxel. -

De acuerdo con la invención, se obtiene una imagen de luz blanca de la mezcla de reacción. La imagen de luz blanca se emplea para localizar la posición de cada micropartícula. Una imagen de luz blanca se forma utilizando todo el espectro electromagnético tanto para la iluminación como para la detección. Esta etapa se lleva a cabo porque es deseable localizar la posición de cada micropartícula. Luego se adquiere una imagen de fluorescencia para determinar la ubicación y la intensidad de los anticuerpos de detección adheridos a las micropartículas. La imagen de fluorescencia utiliza un color, por ejemplo, rojo, verde. Se calculan los recuentos por píxel y se registran el promedio y la desviación estándar de los recuentos por píxel. Los píxeles que tienen recuentos mayores o menores que, por ejemplo, dos veces la desviación estándar mencionada anteriormente se omiten del análisis. Se calcula el número promedio de recuentos por píxel para los píxeles restantes. La cantidad de señal medida en el marcador del anticuerpo de detección determina la concentración del analito.

Para poder realizar una medición más sofisticada que proporcione un mayor grado de sensibilidad, se puede utilizar un microscopio de epifluorescencia disponible comercialmente para obtener imágenes de los complejos a través de una superficie transparente sobre la que están apoyados. Un ejemplo representativo de dicho microscopio es un microscopio de fluorescencia invertido motorizado (OLYMPUS "IX81") acoplado con una cámara CCD de alta resolución (Hamamatsu Modelo C4742-80-12AG), que están disponibles comercialmente en numerosas fuentes.

En esta medición más sofisticada, se utiliza un enfoque de dos colores para proporcionar una mayor sensibilidad que un inmunoensayo convencional que emplea una señal luminosa del volumen total de la mezcla de reacción y una medición realizada mediante el enfoque de un solo color descrito anteriormente. Esta mayor sensibilidad se evidencia mediante un gráfico de una función lineal que tiene una pendiente mayor a concentraciones más bajas en relación con el de un gráfico lineal empleado como curva de calibración en un inmunoensayo convencional o un ensayo que utiliza el enfoque de un solo color.

Las micropartículas que contienen anticuerpos de captura, anticuerpos de detección adheridos a fluoróforos y una muestra que se sospecha que contiene un analito se combinan en condiciones apropiadas para llevar a cabo un inmunoensayo. Una vez realizado el inmunoensayo,se omite cualquier señal de fluorescencia que no emana de un complejo que comprende una micropartícula unida a un anticuerpo de captura, un analito y un conjugado que comprende un anticuerpo de detección unido a un primer fluoróforo. A continuación, se obtiene una imagen del anticuerpo de captura (caracterizado por un segundo fluoróforo, diferente del primer fluoróforo). Esta imagen omite los píxeles correspondientes a las micropartículas que no están recubiertas con anticuerpo de captura de manera homogénea. Si una micropartícula no está recubierta uniformemente, se omiten los píxeles de esa parte que no está recubierta uniformemente. Después, el complejo se califica aún más en función de la fluorescencia emitida por el conjugado. Esta última etapa omite cualquier sección del complejo que no cumpla con los criterios de selección. Un ejemplo típico de criterio de selección es el recubrimiento homogéneo, lo que esencialmente elimina la agregación excesiva de conjugados, que puede resultar de un alto grado de unión no específica. Como se ha indicado anteriormente, los criterios de selección varían, dependiendo del ensayo particular. Por último, se mide el valor promedio de intensidad por píxel de las partículas calificadas para comparar la intensidad con una curva de calibración que establece la concentración del analito.

De acuerdo con la invención, se obtiene una imagen de luz blanca de la mezcla de reacción. La imagen de luz blanca se emplea para localizar la posición de cada soporte sólido, por ejemplo, una micropartícula. Una imagen de luz blanca se forma utilizando todo el espectro electromagnético tanto para la iluminación como para la detección. Esta etapa se lleva a cabo porque es deseable localizar la posición de cada micropartícula. Luego se adquiere una primera imagen de fluorescencia para determinar las ubicaciones de los anticuerpos de captura adheridos a las micropartículas. La primera imagen de fluorescencia utiliza un color, por ejemplo, rojo, verde. Se adquiere una segunda imagen de fluorescencia para determinar las ubicaciones de los anticuerpos que están presentes como componente de un conjugado. La segunda imagen de fluorescencia utiliza un color, por ejemplo, rojo, verde, pero el color de la segunda imagen de fluorescencia difiere del color de la primera imagen de fluorescencia. Los píxeles derivados tanto de un anticuerpo de captura en una micropartícula como de un anticuerpo en un conjugado se seleccionan para su posterior análisis. Se calculan los recuentos por píxel y se registran el promedio y la desviación estándar de los recuentos por píxel. Los píxeles que tienen recuentos mayores o menores que, por ejemplo, dos veces la desviación estándar mencionada anteriormente se omiten del análisis. Se calcula el número promedio de recuentos por píxel para los píxeles restantes. La cantidad de señal medida en la etiqueta del anticuerpo de detección determina la concentración del antígeno.

Las figuras 3, 4 y 5 ilustran lasa etapas necesarias para calificar los resultados de un ensayo de unión ligando-receptor. Un canal de fluorescencia se define con un conjunto de filtros que comprende un filtro de excitación y un filtro de emisión, lo que permite que una luz que tiene una longitud de onda específica llegue a la muestra y que una señal que tenga una longitud de onda específica llegue a la cámara CCD. Por ejemplo, el fluoróforo R-ficoeritrina (alternativamente denominado en el presente documento "PE") sólo puede detectarse en el canal de PE y no puede detectarse en ningún otro canal de fluorescencia. De forma análoga, el fluoróforo indodicarbocianina (alternativamente denominado en el presente documento "Cy5") sólo puede detectarse en el canal Cy5 y no puede detectarse en ningún otro canal de fluorescencia. En la figura 3, un canal del detector mide la imagen de fluorescencia de un anticuerpo de captura, que se marcó con fluoróforos rojos (canal Cy5). Sólo aparecen las micropartículas que han sido recubiertas con un anticuerpo de captura que tiene el marcador fluorescente rojo. Hay dos ubicaciones (círculos blancos) que pueden omitirse porque no están adheridas a la micropartícula. En la figura 4, otro canal del detector mide la imagen de fluorescencia de un anticuerpo de detección adherido a la micropartícula. Aparece un punto muy brillante que no coincide con el perfil de intensidad de las otras micropartículas y se designa con un círculo blanco. Esta ubicación también puede omitirse del análisis. La figura 5 indica la región de interés a partir de la cual se pueden calcular valores de intensidad por píxel. Las áreas que no cumplieron con determinados criterios de selección pueden omitirse de este tipo de análisis.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente realizaciones de la presente invención. En los ejemplos siguientes, todas las concentraciones son en peso (p/p) a menos que se indique lo contrario. En los ejemplos siguientes, los conjugados se prepararon por medios convencionales conocidos por los expertos en la técnica, a menos que se indique de otro modo. En el Ejemplo 1, a menos que se indique de otro modo, las micropartículas que llevan un recubrimiento de anticuerpo monoclonal antitroponina 19C7 pero que aún no han reaccionado en un inmunoensayo se denominan "micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal antitroponina 19C7"; las micropartículas que han reaccionado en un inmunoensayo y que están presentes en un complejo sándwich se denominan "micropartículas unidas al anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:complejo conjugado M06-PE". En el Ejemplo 2, a menos que se indique de otro modo, las micropartículas que llevan un recubrimiento de anticuerpo monoclonal anti-IgG humana pero que aún no han reaccionado en un inmunoensayo se denominan "micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana"; las micropartículas que han reaccionado en un inmunoensayo y que están presentes en un complejo de sándwich se denominan "micropartículas unidas al complejo conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE".

Los Ejemplos que no están dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan únicamente por referencia.

EJEMPLO 1

Este ejemplo ilustra un inmunoensayo para troponina, mediante el uso de un único tinte fluorescente como marcador para el anticuerpo de detección.

Se prepararon micropartículas recubiertas con el anticuerpo monoclonal antitroponina 19C7. Se preparó un conjunto de calibradores para troponina (Tnl (28-110aa)-TnC) a la siguiente concentración en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía seroalbúmina bovina (BSA) (0,5 %), agente tensioactivo ("STANDAPOL", 0,2 %) y agente antimicrobiano ("PROCLIN" 300, 0,1 %). La siguiente tabla enumera las concentraciones de Tn (28-110aa)-TnC en cada calibrador.

TABLA 1

Se preparó un conjugado que comprende anticuerpo monoclonal antitroponina M06 y ficoeritrina (PE) mediante un kit de conjugación R-PE (PJ31 K, Prozyme Inc.) según el protocolo sugerido en el mismo. El conjugado se denomina en el presente documento "conjugado M06-PE".

R-ficoeritrina o PE, es útil en el laboratorio como indicador basado en fluorescencia para marcar anticuerpos u otras moléculas en diversas aplicaciones. La R-ficoeritrina absorbe fuertemente a aproximadamente 566 nm con picos secundarios a 496 y 545 nm y emite fuertemente a 575 nm. La R-ficoeritrina se encuentra entre los tintes fluorescentes más brillantes jamás identificados. Véase, por ejemplo, Ficoeritrina - Wikipedia, la enciclopedia libre, a la que se puede acceder mediante el Protocolo de transferencia de hipertexto en el sitio web en.wikipedia.org/wiki/Phycoerythrin y R-PHYCOERYTHRIN (PB31), ProZyme Inc., Hayward, CA, que se incorporan como referencia en el presente documento.

Cada calibrador (100 j l) se mezcló con micropartículas recubiertas con el anticuerpo monoclonal antitroponina 19C7 (2,5 j l, 0,1 %) y el conjugado M06-PE (2 jl, 68 nM) en una placa con fondo de vidrio de 96 micropocillos durante 15 minutos. a temperatura ambiente. Se utilizó la placa con fondo de vidrio para reducir el nivel de autofluorescencia. Luego se colocó la placa con fondo de vidrio de 96 micropocillos sobre un imán ("DYNAL" "MPC"-96B) para atraer las micropartículas unidas al anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:complejos conjugados M06-PE al fondo de los micropocillos durante la etapa de lavado. En la etapa de lavado, se añadió solución salina tamponada con fosfato (100 j l) a cada micropocillo y luego se eliminó rápidamente. Esta etapa se repitió dos veces. Se añadió solución salina tamponada con fosfato (50 j l ) a cada micropocillo después del paso de lavado final y la placa se colocó en un microscopio de fluorescencia invertido motorizado (OLYMPUS "IX81") acoplado con una cámara CCD de alta resolución (Hamamatsu Modelo C4742-80). -12AG). Después de que las micropartículas unidas al anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:complejos conjugados M06-PE se asentaran en el fondo de los micropocillos, se tomaron imágenes de las micropartículas unidas a complejos anticuerpo monoclonal-antígeno-anticuerpo monoclonal con un objetivo UPlanSApo 20X (OLYMPUS) en el canal de luz blanca y el canal para el fluoróforo PE. El área de visualización de cada imagen era de aproximadamente 400 micrómetros x 300 micrómetros y normalmente tenía aproximadamente 100 micropartículas unidas a complejos de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE. Se tomaron imágenes de una pluralidad de ubicaciones dentro de un micropocillo determinado para mejorar el análisis estadístico.

La figura 6 muestra imágenes de luz blanca de las micropartículas unidas a los complejos de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE. La figura 7 muestra imágenes de fluorescencia de las micropartículas unidas a los complejos de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE. La imagen de luz blanca se utilizó para localizar la posición de cada micropartícula individual unida a un complejo de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE, según el contraste de las micropartículas individuales unidas a los complejos anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE con el fondo. La figura 8 muestra las localizaciones de micropartículas individuales unidas a los complejos de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE, que se definieron como la región de interés. La región de interés comprende las manchas de luz en la figura 8. Luego se calculó el valor promedio de la intensidad de fluorescencia por píxel en la región de interés utilizando la imagen digital en el canal PE. En la figura 9, había manchas sustancialmente más pequeñas que las micropartículas que no se superponían a la región de interés. Estas manchas de alta intensidad de fluorescencia emanaban de los conjugados M06-PE que no estaban específicamente unidos a la superficie de la placa de micropocillos. Estas mancas se excluyeron del análisis. El enfoque de análisis e imágenes descrito en este documento redujo en gran medida las señales de fondo que no emanaban de las micropartículas unidas a los complejos de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE. Los valores de intensidad de todos los calibradores se utilizaron para generar una curva de calibración. Debido al intervalo dinámico limitado del detector, se utilizó un tiempo de exposición más corto para calibradores en donde las concentraciones de analito son mayores. La figura 10 muestra una curva de calibración de calibradores que oscilan entre 10 pg/ml y 50.000 pg/ml. La figura 11 muestra una curva de calibración ampliada de calibradores que oscilan entre 0 pg/ml y 200 pg/ml. En el gráfico ampliado, también se representó para comparación el valor promedio de la intensidad de fluorescencia por píxel del área total de la imagen para cada calibrador. Es evidente que el uso de información espacial de la imagen aumentó mucho la pendiente de la curva, mejorando así la sensibilidad del inmunoensayo.

EJEMPLO 2

Este ejemplo ilustra un inmunoensayo para lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (alternativamente denominada en el presente documento "NGAL"), mediante el uso de dos tintes fluorescentes, uno como marcador para el anticuerpo de captura y el otro como marcador para el anticuerpo de detección.

Se prepararon micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana. Se preparó un conjunto de calibradores para lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos que oscilaba entre 94 pM y 0,7 pM utilizando tampón HBS-EP.

Se prepararon un conjugado que comprendía el anticuerpo monoclonal anti-NGAL 2322 y un tinte fluorescente (Cy5) y un conjugado que comprendía el anticuerpo monoclonal anti-NGAL 903 y R-ficoeritrina (PE). El anticuerpo monoclonal 2322 marcado con el fluoróforo Cy5 se denomina en el presente documento "conjugado 2322-Cy5". El anticuerpo monoclonal 903 marcado con el fluoróforo PE se denomina en el presente documento "conjugado 903-PE".

El anticuerpo monoclonal 2322 y el anticuerpo monoclonal 903 son anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a NGAL. El anticuerpo monoclonal 2322 es un anticuerpo quimérico humano y el anticuerpo monoclonal 903 es un anticuerpo de ratón. Las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana pueden unirse directamente al anticuerpo monoclonal 2322.

Cy5 es un tinte fluorescente reactivo soluble en agua de la familia de los tintes de cianina. Cy5 es fluorescente en la región roja del espectro electromagnético (aproximadamente 650 nm o 670 nm) pero se absorbe en la región naranja del espectro electromagnético (aproximadamente 649 nm). Cy5 también se utiliza para marcar proteínas y ácidos nucleicos para diversos estudios, incluida la proteómica y la localización de ARN. Véase, por ejemplo, "Información técnica sobre sondas conjugadas con anticuerpos purificados por afinidad y con otras proteínas: Tintes de cianina (Cy2, Cy3 y Cy5)", al que se puede acceder mediante el Protocolo de transferencia de hipertexto en la World Wide Web en el sitio web jacsonimmuno.com/technical/f-cy3-5.asp, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia.

Las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana se bloquearon con el anticuerpo monoclonal 903. Debido a que el anticuerpo monoclonal 903 es un anticuerpo monoclonal de ratón, no debe reaccionar de forma cruzada con micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana. Sin embargo, se encontró cierta reactividad cruzada cuando las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana se incubaron con el anticuerpo monoclonal 903 marcado con un fluoróforo de PE. Si las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana se tratan primero con el anticuerpo monoclonal 903 y luego se hacen reaccionar con el anticuerpo monoclonal 903 marcado con un fluoróforo de PE, la reactividad cruzada de las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana con el anticuerpo monoclonal 903 marcado con un fluoróforo de PE se reduce considerablemente. El valor promedio de intensidad de fluorescencia por píxel calculado a partir de la región de interés en las imágenes fue 336 para las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana cuando se trataron con el conjugado 903-PE y 136 para las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana tratadas primero. con el anticuerpo monoclonal 903 y luego reaccionó con el conjugado 903-PE. Las ejecuciones adicionales mostraron que el tratamiento de las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana con el anticuerpo monoclonal 903 no disminuye la señal generada a partir del analito NGAL. Cuando la concentración de NGAL es relativamente alta, el efecto de la señal en el fondo de la imagen no es significativo.

La TABLA 2 muestra la intensidad de fluorescencia de una muestra que contiene NGAL 0 pM usando (a) micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana que se trataron con el anticuerpo monoclonal 903 y (b) micropartículas no tratadas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana. La intensidad de las micropartículas tratadas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana es aproximadamente el 40 % de la de las micropartículas no tratadas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana.

TABLA 2

*los recuentos de oscuridad de la cámara se restan de la intensidad

La TABLA 3 muestra la intensidad de fluorescencia medida para una muestra que contiene NGAL 300 pM usando las micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana que se trataron con el anticuerpo monoclonal 903 y la intensidad de fluorescencia medida para una muestra que contiene NGAL 300 pM usando micropartículas no tratadas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana. El inmunoensayo realizado con el fin de determinar la eficacia del uso del anticuerpo monoclonal 903 como agente bloqueante se realizó de la misma manera que los inmunoensayos que se realizaron para verificar la concentración de NGAL. Las imágenes se midieron con un tiempo de exposición más corto que el utilizado para las imágenes caracterizadas en la TABLA 1.

TABLA

Se incubaron micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana (1 ml, 0,01 %) con anticuerpo monoclonal 903 (70 nM) durante 15 minutos. Las micropartículas así tratadas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana se separaron de la mezcla de reacción por medio de un imán y luego se lavaron con tampón HBS-EP. Las micropartículas así tratadas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana se reconstituyeron luego a una concentración del 0,01 % con tampón HBS-EP. En la primera fila de micropocillos de una placa de micropocillos que tiene 96 micropocillos, se prepararon varias concentraciones de NGAL (94 pM, 47 pM, 23 pM, 12 pM, 6 pM, 3 pM, 1,5 pM, 0,7 pM, 0 pM). Cada micropocillo contenía 100 pl de líquido. Se añadieron el anticuerpo monoclonal 2322 marcado con fluoróforo Cy5 (25 pl, 2 nM) y el anticuerpo monoclonal 903 marcado con fluoróforo PE (8 pl, 20 nM) a la primera fila de micropocillos de la placa. Las mezclas de reacción se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron micropartículas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IgG humana (25 pl, 0,01 %) a cada micropocillo de la primera fila. Las mezclas de reacción se incubaron durante 20 minutos más. Las micropartículas unidas a los complejos conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE fueron atraídas por un imán y luego se lavaron tres veces con tampón HBS-EP. Las muestras se transfirieron a una placa de micropocillos en la que los micropocillos tenían fondo de vidrio. La placa de micropocillos se colocó en el microscopio de fluorescencia (OLYMPUS "IX81") y se tomaron imágenes de la misma manera que se describe en el EJEMPLO 1 en el canal de luz blanca, en el canal de PE y en el canal de Cy5.

La imagen de luz blanca se utilizó para localizar las posiciones de las micropartículas individuales unidas a los complejos de conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE basándose en el contraste entre las micropartículas individuales unidas a los complejos de conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE y el fondo. Las ubicaciones de las micropartículas individuales unidas a los complejos conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE se definieron como regiones de interés. Las regiones de interés se analizaron más detalladamente estableciendo un umbral en el canal Cy5, mediante lo cual solo se utilizan aquellas áreas de las micropartículas unidas a los complejos de conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE que tienen el anticuerpo monoclonal 2322 marcado con fluoróforo Cy5 unido específicamente a las micropartículas unidas a los complejos de conjugado 2322-Cy5:NGAL:conjugado 903-PE para un análisis más detallado. El valor promedio de la intensidad de fluorescencia por píxel de la región de interés en el canal PE se calculó mediante un programa informático disponible comercialmente ("SLIDEBOOK").

La siguiente tabla enumera el valor promedio de intensidad por píxel del canal PE para cada concentración de analito en la duración de exposición correspondiente. Se utilizaron tres duraciones diferentes de exposición para aumentar el intervalo dinámico del ensayo.

TABLA 4

La figura 12 muestra curvas de calibración para NGAL generadas a partir de los datos de la TABLA 4. La figura 13 muestra la curva de calibración a concentraciones extremadamente bajas de calibrador. Se utilizaron tres algoritmos diferentes para demostrar los beneficios de la presente invención. El algoritmo 2 y el algoritmo 3 mejoraron enormemente la sensibilidad del ensayo.

Los datos del algoritmo 1 aparecen como círculos sólidos (•) en el gráfico. Se calculó el valor promedio de intensidad de toda la imagen en el canal de PE. No se utilizó información espacial. Este algoritmo equivale a una medición de intensidad total.

Los datos del algoritmo 2 aparecen como cuadrados sólidos (■) en el gráfico. Todas las micropartículas se seleccionaron como regiones de interés utilizando la imagen de luz blanca según el nivel de contraste. Las dimensiones de las regiones de interés se redujeron estableciendo un umbral en el canal PE. El límite se seleccionó arbitrariamente y fue igual al valor promedio de la intensidad de fluorescencia de la imagen del canal PE más o menos tres desviaciones estándar. Sin embargo, se podrían haber utilizado otros valores de corte.

Los datos del algoritmo 3 aparecen como cuadrados abiertos (□) en el gráfico. Se seleccionó un área de las micropartículas unidas a complejos de anticuerpo monoclonal:antígeno:anticuerpo monoclonal que tenían una intensidad superior a un umbral en el canal Cy5, y luego se calculó el valor promedio de la intensidad de fluorescencia del canal PE. Se redujeron las señales generadas por la unión no específica. El límite se seleccionó arbitrariamente y fue igual al valor promedio de la intensidad de fluorescencia de la imagen del canal PE más o menos tres desviaciones estándar. Sin embargo, se podrían haber utilizado otros valores de corte.

EJEMPLO 3

Este ejemplo ilustra un inmunoensayo homogéneo para troponina, mediante el uso de un único tinte fluorescente como marcador para el anticuerpo de detección. En algunos inmunoensayos, donde la concentración del analito está en el intervalo de ng/ml, es posible realizar un inmunoensayo homogéneo utilizando el método descrito en el presente documento. Estos inmunoensayos se llevan a cabo simplemente mezclando los reactivos y la muestra y realizando una medición física. Los inmunoensayos homogéneos son deseables porque son fáciles de realizar.

Todos los reactivos y parámetros de imagen utilizados en este ejemplo fueron los mismos que los utilizados en el EJEMPLO 1. Cada calibrador (100 j l) se mezcló con micropartículas recubiertas con el anticuerpo monoclonal antitroponina 19C7 (2 j l, 0,1 %) y el conjugado M06-PE (5 jl, 20 nM) en una placa con fondo de vidrio de 96 micropocillos durante 15 minutos. a temperatura ambiente. Se utilizó la placa con fondo de vidrio para reducir el nivel de autofluorescencia. Luego se añadió PBS (200 j l) a cada micropocillo para disminuir la concentración del conjugado y reducir la intensidad de la fluorescencia del fondo. La placa se colocó en un microscopio de fluorescencia invertido motorizado (OLYMPUS "IX81") acoplado con una cámara CCD de alta resolución (Hamamatsu Modelo C4742-80-12AG). Después de que las micropartículas unidas al anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:complejos conjugados M06-PE se asentaran en el fondo de los micropocillos, se tomaron imágenes de aquellas micropartículas unidas a los complejos de anticuerpo monoclonal 19C7: troponina:conjugado M06-PE con un objetivo UPlanSApo 20X (OLYMPUS) en el canal de luz blanca y el canal de PE. La imagen de luz blanca, mostrada en la figura 14, se utilizó para localizar la posición de cada micropartícula individual unida a un complejo de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE, según el contraste de las micropartículas individuales unidas a los complejos anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE con el fondo. La figura 15 muestra las localizaciones de micropartículas individuales unidas a los complejos de anticuerpo monoclonal 19C7:troponina:conjugado M06-PE, ubicaciones que se definieron como la región de interés. Luego se calculó el valor promedio de la intensidad de fluorescencia por píxel en la región de interés utilizando la imagen digital en el canal PE, como se muestra en la Figura 16. El uso de la información espacial de la imagen hizo posible eliminar un paso de lavado y simplificar el ensayo a un ensayo homogéneo de una sola etapa. La figura 17 muestra la curva de calibración calculada en este ejemplo. Aunque en este ejemplo se utilizó un microscopio de epifluorescencia estándar, se prefiere un microscopio confocal o TIRF (fluorescencia de reflexión interna total), porque este tipo de microscopio tiene una mejor resolución en el plano z, que puede eliminar señales desde arriba del plano focal donde se colocan las micropartículas, reduciendo así la señal de fondo. Una etapa de dilución (añadir tampón directamente a la mezcla de reacción) justo antes de la medición puede reducir aún más el fondo de fluorescencia del exceso de conjugados de anticuerpos y, por lo tanto, mejorar la sensibilidad de los ensayos.

Otro enfoque para eliminar la etapa de lavado en el inmunoensayo implica el análisis mediante espectroscopia de correlación de imágenes (ICS). El análisis de espectroscopia de correlación de imágenes espacio-temporal (STICS) es una extensión de ICS donde se adquieren una serie de imágenes de la muestra. Estas imágenes incluyen información tanto espacial como temporal; los conjugados unidos a las micropartículas mediante la formación de un complejo sándwich están inmóviles mientras que el exceso de conjugados no unidos se difunde libremente en la solución. El análisis STICS puede separar la población conjugada inmóvil de la población conjugada en difusión. Hay otras extensiones de ICS, tales como espectroscopia de correlación de imágenes espaciales de espaciok(kICS) y también versiones de correlación cruzada de ICS (CCICS). Adicionalmente, realizando análisis de espectroscopia de correlación de imágenes (ICS) en las imágenes, se puede adquirir información adicional sobre la muestra. Por ejemplo, para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, es posible utilizar ICS para cuantificar el tamaño de las placas amiloides en una imagen, así como para eliminar moléculas en proceso de difusión.

EJEMPLO 4 (no forma parte de la invención tal como se reivindica)

Este ejemplo ilustra cómo se puede utilizar el método descrito en el presente documento para detectar ADN. En este caso, el analito es una secuencia diana de ADN y el receptor es la cadena de ADN complementaria a la secuencia diana. Para la detección, se utiliza una cadena de ADN marcada que tiene una secuencia idéntica a la secuencia diana. El principio de un ensayo competitivo para una diana de ADN se muestra en la figura 18.

En este ejemplo, el ADN monocatenario (ADNmc) inmovilizado en micropartículas se mezcla con una muestra que se sospecha que contiene ADNmc objetivo y se incuba. La mezcla también contiene ADNmc idéntico al ADNmc objetivo pero que tiene un marcador fluorescente para determinar la concentración de ADN. El ADNmc que está adherido a un marcador fluorescente será bloqueado por la presencia del ADNmc objetivo. Por consiguiente, si no se detecta fluorescencia, se puede concluir que la muestra contiene una cantidad suficiente de ADNmc para bloquear completamente el ADNmc que tiene el marcador fluorescente. Esta condición indicaría un resultado positivo. Por otra parte, si no hay moléculas de ADNmc objetivo en la muestra, el ADNmc inmovilizado en las micropartículas se marcará completamente con ADNmc que tiene un marcador fluorescente. La mezcla de reacción mostrada en la figura 18 ilustra el caso en el que la muestra contiene ADNmc objetivo, pero no lo suficiente como para bloquear completamente la unión del ADNmc que tiene el marcador fluorescente. Por consiguiente, estarán presentes tanto el ADNmc objetivo como el ADNmc que tenga un marcador fluorescente y la intensidad de la fluorescencia se corresponderá inversamente con la cantidad de ADNmc objetivo en la muestra.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la concentración de un antígeno en una muestra que comprende las etapas de:

(d) seleccionar píxeles en al menos una región de interés para análisis;

(g) calcular recuentos promedio por píxel de los píxeles restantes; y

2. El método de la reivindicación 1, en donde las imágenes adquiridas en la etapa (b) son imágenes digitales.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde se requieren hasta aproximadamente doscientas (200) micropartículas.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde las imágenes adquiridas en la etapa (b) se registran mediante un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde un registro del ensayo se almacena en un almacenamiento de datos informático.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las imágenes adquiridas en la etapa (b) se adquieren y almacenan fuera de línea.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde se utiliza información espacial para calificar y cuantificar los resultados de la determinación.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde los píxeles omitidos de la etapa (f) tienen recuentos mayores o menores que dos veces la varianza.