JP2004361158A

JP2004361158A - 生化学検出装置及び検出方法

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Publication number: JP2004361158A
Application number: JP2003157711A
Authority: JP
Inventors: Seitaro Fujishima; 島清太郎藤; Yoshinori Moriya; 屋美紀守; Koji Horio; 尾浩司堀
Original assignee: Moritex Corp
Current assignee: Moritex Corp
Priority date: 2003-06-03
Filing date: 2003-06-03
Publication date: 2004-12-24
Also published as: WO2004109283A1

Abstract

【課題】極めて安価にしかも簡単な演算処理で、多数の検出対象を正確にしかも短時間で検出できるようにする。
【解決手段】可視光で識別することができる識別特性を備えた多数の微小粒子（Ａ_１〜Ａ_１００）の夫々に、予め選定された検出対象（Ｃ_１〜Ｃ_１００）に対して特異的に結合する特異的結合物質（Ｂ_１〜Ｂ_１００）を識別特性ごとに担持させておき、微小粒子（Ａ_１〜Ａ_１００）にサンプル中に存在する検出対象を付着させた後、その検出対象に蛍光標識（Ｒ）を付着させ、全微小粒子の蛍光観察画像（Ｇ_１）及び可視光観察画像（Ｇ_２）を取り込み、検出対象が結合した微小粒子の二次元位置情報を蛍光観察画像（Ｇ_１）に基づいて取得し、その識別特性を前記二次元位置情報と可視光観察画像（Ｇ_２）に基づいて抽出し、微小粒子に結合された検出対象の種類を予め設定された識別特性−検出対象対照データに基づいて特定するようにした。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル内にどのような生化学物質・微生物・細胞などが存在するかを分析するための生化学検出装置及び検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、社会の高齢化と共に重症肺炎で入院・死亡する患者が増加している。また、集中治療室などで治療を受けて一命を取りとめた重症患者が、症状が落ち着いてきたときに院内肺炎にかかり、再び重篤な状態に陥ることが珍しくない。
このため、肺炎に関する早期診断システムの確立が求められており、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液や喀痰中における病原菌の特定を早期に行うことができれば、早期診断・早期治療を行うことができる。
【０００３】従来、人の血液、喀痰等のサンプルに存在する病原菌を特定する場合、一般的には、希釈されたサンプルを寒天培地に滴下して、孵卵器内で一日以上かけて培養させ、培養された菌を顕微鏡観察することにより特定しているが、このような手法では培養に時間がかかり過ぎ、早期診断は不可能である。
【０００４】このため、マイクロビーズ等の微小粒子を用い、抗原抗体反応を利用して、サンプル中にどのような病原菌や微生物（検出対象）が存在するかを早期に診断するシステムが提案されている（特許文献１及び２）
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−５２０３２３号公報
【特許文献２】特開２００２−５０１１８４号公報
【０００６】これらによれば、例えば赤色蛍光顔料とオレンジ蛍光顔料を夫々８段階に色付けして、８×８＝合計６４色のカラーマトリックスに色分けされた直径５μｍ程度のマイクロビーズを製造し、夫々のビーズに、特定の病原菌に対する抗体を付けておく。
ここで、マイクロビーズは６４色に色分けされているから、最大６４種類の病原菌に対する抗体をつけることができ、このときのビーズの色−病原菌データを予め設定しておく。
【０００７】そして、このマイクロビーズを人の血液、痰等のサンプルと接触させることにより抗原抗体反応を起こさせれば、個々のビーズ上抗体に対して病原菌が選択的に付着する。
次いで、蛍光標識を付した二次抗体とビーズを接触させれば、ビーズ上抗体と結合している病原菌に蛍光標識が付着する。
【０００８】このように反応させたマイクロビーズをフローサイトメータにより一つずつ流しながら、赤色レーザによりビーズの色を判別すると共に、緑色レーザで蛍光標識の結合量を計測する。
これにより、蛍光標識有りと判断されたビーズの色に基づき、色−病原菌データを参照すれば、どの種類の病原菌が付着しているかが簡単にわかり、その蛍光強度により付着量も知ることができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この検出方法に用いる検出装置は、１式１０００万円程度と極めて高価なだけでなく、一種類のタンパク質やＤＮＡなどの生化学物質を検出する試薬キットが約１０万円もするため、多種類の物質を低コストで同定することが必要な各種検査での実用化は困難である。さらに、現状では、一部のサイトカイン等のタンパク質を検出するための試薬キットしか市販されていないため、病原菌の同定・定量を行えるようにすることが要望されている。
【００１０】また、測定原理上は８×８＝６４色に限らず、市販品では１０段階に色分けした１０×１０＝１００色のカラーマトリックスも形成可能であるため、何種類でもタンパク質を識別可能である。
しかし、現実には同系色の濃淡を正確に８段階に色分けすることが品質管理上困難であるばかりでなく、極めて高精度の測定機器を用いても誤差を含む８段階の濃淡を正確に識別することは困難であり、通常は各色３〜４段階の濃淡を付して３×３＝９色、または、４×４＝１６色のカラーマトリックスを形成し、９−１６種類のタンパク質を識別するに止まる。
【００１１】また、検出にあっては、サンプルと接触させた多数のマイクロビーズをフローサイトメータにより一つずつ流して、マイクロビーズの色及び蛍光標識の有無を判断しているが、この場合に、光源としてマイクロビーズの色を識別するためのレーザと、蛍光標識の無を識別するためのレーザを必要とする。
さらに、赤系の蛍光色を呈するマイクロビーズの色を検出するためにアバランシュ型ホトダイオードや、蛍光標識となる緑系の蛍光を検出するために光電子増倍管を用いているため、装置が大掛かりで処理も複雑化し面倒になるという問題があった。
【００１２】そこで本発明は、極めて安価にしかも簡単な演算処理で、多数の検出対象を正確にしかも短時間で検出できるようにすることを技術的課題としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この課題を解決するために、本発明は、予め選定された検出対象の夫々に対して特異的に結合する特異的結合物質を検出対象別に担持させた多数の微小粒子をサンプルと接触させ、そのサンプルに存在する検出対象を微小粒子に付着させた後、その検出対象にルミネッセンス標識を付着させて観察することにより検出対象の種類を特定する生化学検出装置であって、前記微小粒子が、可視光で識別することができ、且つ、前記検出対象の種類ごとに異なる識別特性を備えており、前記ルミネッセンス標識の付着後に、微小粒子のルミネッセンス観察画像及び可視光観察画像を取り込む撮像装置と、その画像に基づいて微小粒子に結合した検出対象の種類を特定する画像処理装置とを備え、前記画像処理装置は、検出対象が結合した微小粒子の二次元位置情報をルミネッセンス観察画像に基づいて取得する位置情報検出手段と、その識別特性を前記二次元位置情報と可視光観察画像に基づいて抽出する識別特性抽出手段と、微小粒子に結合された検出対象の種類を予め設定された識別特性−検出対象対照データに基づいて特定する検出対象特定手段を備えたことを特徴とする。
【００１４】本発明によれば、例えば、検出対象が例えば病原菌である場合、色（識別特性）の異なるマイクロビーズ（微小粒子）を検出しようとする病原菌の数に応じた色数分用意する。そして、各色のマイクロビーズに、その色と病原菌を対応させて、夫々の病原菌に対して抗原抗体反応により特異的に結合する抗体（特異的結合物質）を担持させておく。
このマイクロビーズを気管支肺胞洗浄液等のサンプルと接触させると、そのサンプルに存在する病原菌が抗原抗体反応により、ビーズ上抗体と結合し、さらに、ルミネッセンス標識となる蛍光標識が付された二次抗体をビーズに接触させることにより、ビーズ上抗体と結合したその病原菌に蛍光標識が付される。
【００１５】ここで、全てのマイクロビーズを観察面上に分散させ、蛍光観察画像と可視光観察画像を撮像する。
蛍光観察画像からは、蛍光点の位置から病原菌が付着したマイクロビーズの二次元位置情報が得られ、蛍光量から付着量を計測することができるが、病原菌の菌種を特定することはできない。
一方、可視光観察画像からは、全てのマイクロビーズの二次元位置情報と、色情報（識別特性情報）が得られる。
【００１６】ここで、マイクロビーズの色と病原菌の菌種は１：１に対応しているので、蛍光観察画像で得られた二次元位置情報に基づき、同じ位置にある可視光観察画像のビーズの色を参照すれば、個々のビーズに付着している病原菌の菌種が特定される。
【００１７】したがって、１００種類の病原菌を検出する場合でも、１００色に色分けされたマイクロビーズを用いて、２種類の画像を取り込むだけで、病原菌の菌種が特定され、菌量が計測される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて具体的に説明する。
図１は本発明に係る生化学検出装置を示す説明図、図２は画像処理装置のプログラムを示すフローチャート、図３は各プログラムの具体的処理を示すフローチャート、図４〜図８は本発明に係る生化学検出方法の一例を示す説明図である。
【００１９】図１に示す生化学検出装置１は、例えば、予め１００種類の病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００を検出対象として選定しておき、気管支肺胞洗浄液などのサンプルに、検出対象となっている病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００のうちどれが存在するかを特定するために用いられるものである。
【００２０】本例では、１００種類の病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００を種類別に付着させる１００種類のマイクロクビーズ（微小粒子）Ａ_１〜Ａ_１００が用いられると共に、各マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００に付着した病原菌の菌種を特定して菌量を計測するために、全てのマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を二次元的に分散させた状態で蛍光観察（ルミネッセンス観察）及び可視光観察を行う倒立顕微鏡２と、その観察画像を撮像する撮像装置３と、その観察画像を画像処理する画像処理装置４を備えている。
【００２１】マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００は、例えばポリスチレン製で直径１〜５０μｍ程度に形成され、検出しようとする病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００の種類に対応する数分の異なる識別特性を備えている（図４参照）。
この識別特性として、本例では色を用いており、１００種類の病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００を検出する場合は、夫々の病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００に対応して１００色に色分けされた１００種類のマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００が用いられる。
また、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００の表面には、夫々の病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００に対して抗原抗体反応により特異的に結合する抗体（特異的結合物質）Ｂ_１〜Ｂ_１００が種類別に担持されている。
【００２２】倒立顕微鏡２は、サンプルと接触させたマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００に蛍光標識を付着させた後、これらの蛍光観察及び可視光観察を行うもので、蛍光観察用光源（ルミネッセンス観察用光源）５と可視光観察用光源６を備えると共に、その観察画像を取り込む撮像装置３が設けられている。
蛍光観察用光源５としては、Ａｒレーザ、赤色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ等が用いられ、可視光観察用光源６としてはハロゲンランプ、白色ＬＥＤ、キセノンランプ、水銀ランプなどが用いられ、撮像装置３としてはＣＣＤカメラが用いられている。
この顕微鏡２で観察する場合、例えば、底部がフラットに形成された９６穴のマイクロプレート７を用いて、各ウェル８…に１００種類のマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を同数程度ずつ均一に分散させた検出液を入れ、任意のサンプルを滴下することにより、サンプルとマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を接触させる（図５参照）。
例えば、サンプルに病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３が存在する場合、各病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３は抗原抗体反応により夫々に対応する抗体Ｂ_１〜Ｂ_３が付されたマイクロビーズＡ_１〜Ａ_３に結合する（図６（ａ）参照）。
次いで、蛍光標識Ｒが付された二次抗体Ｄ_１〜Ｄ_１００をウェル８内に滴下させると、病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３と結合しているマイクロビーズＡ_１〜Ａ_３にのみ蛍光標識Ｒが付されることになる（図６（ｂ）参照）。
なお、二次抗体Ｄ_１〜Ｄ_１００としては、各病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００に対して抗原抗体反応により特異的に結合する抗体を用い、蛍光標識Ｒはどの二次抗体Ｄ_１〜Ｄ_１００に対しても同じものを付しておく。
本例ではＡｒレーザを照射することにより緑色蛍光を呈する緑色蛍光物質を付してある。
【００２３】なお、顕微鏡２で観察するときに、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００が３次元的に浮遊していると、対物レンズの焦点深度の関係から全てのビーズＡ_１〜Ａ_１００を同時に観察することができないので、これらを同一観察面上に二次元的に分散させる必要があり、本例では、静電気力及び磁力を利用してみた。
静電気力による場合は、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を予め帯電させると共に、ウェル８の底面に透明電極（図示せず）を貼り付けておき、この透明電極によりウェル８の底面をマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００と反対極の極性に帯電させれば、その静電気力によりマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００がウェル８の底面に引き付けられて二次元的に並ぶ。
また磁力による場合は、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を磁化して磁性粒子とし、各ウェル８の底面も磁化させれば、その磁力によりマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００は各ウェル８の底面に並ぶ。
その他、誘電泳動法により粒子を底面にならべたり、レーザー干渉計を用いた光ピンセットにより粒子を底面に並べたり、さらには、ポリリジンなどの接着剤を用いて予め微小粒子を底面に接着させたりしてもよい。
このようにして、二次元的に分散されたマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を蛍光観察及び可視光観察し、その画像を撮像装置３で取り込む。
【００２４】撮像装置３は、倒立顕微鏡２で観察される蛍光観察画像（ルミネッセンス観察画像）と可視光観察画像を取り込むもので、前記各光源５及び６の照明光をシャッターＳ_１及びＳ_２、フィルター、ミラー等で切り換えることにより、暗視野で蛍光観察画像Ｇ_１を撮像した直後に、明視野で可視光観察画像Ｇ_２（図７参照）を撮像することにより二種類の画像を略同時に取り込むことができ、夫々の画像Ｇ_１及びＧ_２が画像処理装置４に対して出力される。
【００２５】画像処理装置４では、入力された蛍光観察画像Ｇ_１と可視光観察画像Ｇ_２に基づいて病原菌の菌種の特定と菌量の計測を行う。
画像処理装置４は、蛍光観察画像Ｇ_１から得られる蛍光点の二次元位置情報及び夫々に対応する蛍光量を記憶させる座標−光量テーブル９と、可視光観察画像Ｇ_２から得られる、全てのマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００の二次元位置情報及びこれに対応する色情報λ_１〜λ_１００を記憶させる座標−色テーブル１０と、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００の色と病原菌の関係を予め記憶させた色−病原菌テーブル１１と、蛍光量に基づいて算出された菌量を菌種ごとに記憶する菌種−菌量テーブル１２を備えている。
なお、色情報λ_１〜λ_１００は、可視光観察画像Ｇ_２で取り込まれた画像データから抽出された波長やＲＧＢ値が用いられる。
【００２６】図２及び図３は画像処理装置４の処理手順を示す。
図２は処理手順の全体の流れを示すもので、蛍光観察画像Ｇ_１が入力されるとプログラムＰＧＭ１の蛍光画像処理を行い、処理可視光観察画像Ｇ_２が入力されるとプログラムＰＧＭ２の可視光画像処理を行い、夫々の処理が終了するとプログラムＰＧＭ３の分析処理を行う。
【００２７】図３（ａ）はプログラムＰＧＭ１の蛍光画像処理の具体的手順を示し、蛍光観察画像Ｇ_１が入力されると実行開始されて、ステップＳＴＰ１１でインデックスｎをリセットし、ステップＳＴＰ１２で画像をスキャンして蛍光点の有無を判別し、蛍光点が検出されたときはステップＳＴＰ１３に移行してインデックスｎ＝ｎ＋１に置き換え、ステップＳＴＰ１４で蛍光点の二次元位置情報となる座標を検出し、ステップＳＴＰ１５でその蛍光点の光量を検出し、ステップＳＴＰ１６で座標データと光量データを座標−光量テーブル９に記録し、ステップＳＴＰ１２に戻る。
また、ステップＳＴＰ１２で蛍光点が検出されなかったときは、ステップＳＴＰ１７に移行して、入力された蛍光観察画像Ｇ_１のスキャンが終了したか否かが判断され、ＮＯの場合はステップＳＴＰ１２に戻ってスキャンを続行し、ＹＥＳの場合はステップＳＴＰ１８でｎの最大値ｎ_ｍａｘを記憶して、プログラムＰＧＭ１の蛍光画像処理を終了する。
なお、ここでステップＳＴＰ１４の処理が、病原菌が結合したマイクロビーズの二次元位置情報を取得する位置情報検出手段である。
【００２８】図３（ｂ）はプログラムＰＧＭ２の可視光画像処理の具体的手順を示し、可視光観察画像Ｇ_２が入力されると実行開始されて、ステップＳＴＰ２１でインデックスｍをリセットし、ステップＳＴＰ２２で画像をスキャンしてビーズの有無を判断し、ビーズが検出されたときはステップＳＴＰ２３に移行してインデックスｍ＝ｍ＋１に置き換え、ステップＳＴＰ２４でビーズの二次元位置情報となるその座標を検出し、ステップＳＴＰ２５でその色を検出し、ステップＳＴＰ２６で座標データと色データを座標−色テーブル１０に記録し、ステップＳＴＰ２２に戻る。
また、ステップＳＴＰ２２でビーズが検出されなかったときは、ステップＳＴＰ２７に移行して、入力された可視光観察画像Ｇ_２のスキャンが終了したか否かが判断され、ＮＯの場合はステップＳＴＰ２２に戻ってスキャンを続行し、ＹＥＳの場合はプログラムＰＧＭ２の可視光画像処理を終了する。
【００２９】図３（ｃ）は示すプログラムＰＧＭ３の分析処理の具体的手順を示し、プログラムＰＧＭ１の蛍光画像処理と、プログラムＰＧＭ２の可視光画像処理が終了すると実行開始されて、ステップＳＴＰ３１でインデックスｎ＝１とし、ステップＳＴＰ３２で座標−光量テーブル９からインデックスｎの座標データを読み出し、ステップＳＴＰ３３で座標−色テーブル１０を参照して、その座標データに対応した色データを読み出し、ステップＳＴＰ３４で色−病原菌テーブル１１を参照してその色データに対応する病原菌の菌種を特定し、ステップＳＴＰ３５で座標−光量テーブル９を参照してその光量を読み出し、その光量から菌量を算出する。
これにより、ｎ＝１の蛍光点について、病原菌の菌種が特定され、菌量が算出されたので、ステップＳＴＰ３６で菌種−菌量テーブル１２に記録する。
次いで、ステップＳＴＰ３７でｋがプログラムＰＧＭ１のステップＳＴＰ１８で記録されたｎ_ｍａｘと等しいか否か判断され、ＮＯの場合はステップＳＴＰ３８でｎ＝ｎ＋１と置き換えてステップＳＴＰ３２に戻り、ＹＥＳの場合は、ステップＳＴＰ３９で菌種−菌量テーブル１２のデータを図８に示すようにグラフ化して出力し、処理を終了する。
なお、ここでステップＳＴＰ３３の処理が、マイクロビーズの識別特性である色を抽出する識別特性抽出手段の具体例であり、ステップＳＴＰ３４の処理がマイクロビーズに結合された病原菌の菌種を特定する検出対象特定手段の具体例であり、ステップＳＴＰ３５〜３６の処理が病原菌の菌量を計測する検出対象計量手段の具体例である。
【００３０】これにより、各ウェル８に注入した夫々のサンプルについて、蛍光観察画像Ｇ_１と可視光観察画像Ｇ_２に基づいて、サンプル中にどのような病原菌がどの程度存在するか、その菌種と菌量を瞬時に分析することができる。
この結果より、サンプルを提供した患者が何らかの病原菌に感染しているか否かを極めて簡単に、且つ、即座に知ることができる。
【００３１】以上が本発明に係る生化学検出装置の一構成例であって、次に、本発明に係る生化学検出方法を説明する。
まず、図４に示すように、１００色のマイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００を用意し、その夫々に、検出しようとする１００種類の病原菌Ｃ_１〜Ｃ_１００と抗原抗体反応を起こす１００種類の抗体Ｂ_１〜Ｂ_１００を個別に担持させる。
そして、各ビーズＡ_１〜Ａ_１００を略同数ずつ均一に分散させた検出液を生成し、図５に示すように、これをマイクロプレート７の各ウェル８…に入れ、サンプルとなる気管支肺胞洗浄液などを２００〜３００μリットルずつ注入して、サンプルとビーズＡ_１〜Ａ_１００を接触させる。
このとき、例えば、サンプルに病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３のみが存在すれば、図６（ａ）に示すように、その病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３は抗原抗体反応を起こして抗体Ｂ_１〜Ｂ_３に結合するので、その抗体Ｂ_１〜Ｂ_３を担持しているビーズＡ_１〜Ａ_３に付着し、他のビーズＡ_４〜Ａ_１００には病原菌が付着しない。
【００３２】次いで、各ウェル８…に蛍光標識Ｒ付きの二次抗体Ｄ_１〜Ｄ_１００を滴下すると、図６（ｂ）に示すように、ビーズＡ_１〜Ａ_３に付着している病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３に対して、抗原抗体反応を起こす二次抗体Ｄ_１〜Ｄ_３のみが結合するので、蛍光標識ＲはビーズＡ_１〜Ａ_３にのみ付され、他のビーズＡ_４〜Ａ_１００には蛍光標識Ｒが付されることはない。
【００３３】このようにして、病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３の付着したビーズＡ_１〜Ａ_３にのみ蛍光標識Ｒを付した後、全てのビーズＡ_１〜Ａ_１００を静電気力又は磁力によりウェル８の底面に並べて、顕微鏡２により蛍光観察及び可視光観察を行い、撮像装置３により蛍光観察画像Ｇ_１及び可視光観察画像Ｇ_２を取り込み、夫々の画像データに基づいて画像処理装置４で病原菌の菌種の特定を行う。
【００３４】各ウェル８を倒立顕微鏡２で蛍光観察すると、図７（ａ）に示すようにビーズＡ_１〜Ａ_３に付着された蛍光標識Ｒから発する蛍光点が観察され、可視光観察をすると、図７（ｂ）に示すように全ビーズＡ_１〜Ａ_１００が映し出される。
【００３５】そして、撮像装置３により撮像された蛍光観察画像Ｇ_１と可視光観察画像Ｇ_２が画像処理装置４で分析される。
まず、蛍光観察画像Ｇ_１を分析することにより、病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３が結合したマイクロビーズＡ_１〜Ａ_３の二次元位置情報（座標）と蛍光量が取得され、座標−蛍光量テーブル９に記録される。
次いで、可視光観察画像Ｇ_２を分析することにより、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_１００の二次元位置情報（座標）と色λ_１〜λ_１００が可視光観察画像に基づいて抽出され、座標−色テーブル１０に記録される。
最後に、これらの結果に基づいて、マイクロビーズＡ_１〜Ａ_３に結合された病原菌Ｃ_１〜Ｃ_３の菌種が特定され、蛍光量に基づいて菌量が算出されて、そのデータが菌種ごとに積算されて菌種−菌量テーブル１２に記録されるので、菌種−菌量テーブル１２に記録されたデータを基づいて図８に示すようにグラフ化して出力すれば、菌種と菌量の分析結果を容易に把握できる。
【００３６】なお、サンプルとしては、気管支肺胞洗浄液に限らず、喀痰、血液、尿などの体液、その他任意のものを用いることができる。
また、本発明に係る生化学検出装置及び検出方法の検出対象としては、上述した病原菌に限らず、抗原、タンパク、ＤＮＡ、アミノ酸、酵素など任意の生化学物質や、微生物、細胞などを検出対象とすることができる。
さらに、検出対象を微小粒子（マイクロビーズ）に結合させる特異的結合物質としては、抗原抗体反応を生じる抗体に限らず、検出対象を個別に結合することができれば任意の物質を利用できる。
【００３７】微小粒子の識別特性は、色に限らず、形状、大きさ、あるいはこれらの組み合わせなど、可視的に識別可能なものであればよい。また、静止画像により直接観察できる識別特性に限らず、例えば、水中における微小流体のゼータ電位を測定する際の移動量の違いを識別特性として用いることもできる。
即ち、表面改質により各微小粒子を異なる電荷量に帯電させた状態で、平行電界を形成すれば、微小粒子の単位時間あたりの移動量はその電荷量に応じて異なる。このとき、サンプルの粘性及び誘電率を水と略等しく設定しておけば、移動量は水中における移動量に等しい。したがって、可視光画像として所定時間間隔で撮像した２枚の静止画像又は動画像に基づき、これを画像処理することにより各微小粒子の移動量を検出すれば、その移動量に基づき微小粒子の種類を特定できる。このような電荷量の違いと、前述の色・形状・大きさの違いを組み合わせても良い。
【００３８】ルミネッセンス標識としては蛍光標識に限らず、化学発光標識やその他任意のルミネッセンス標識を用いることができる。化学発光の場合は、特に励起光を必要とせず、暗視野にするだけで観察できるので、装置をより簡素化することができる。
【００３９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、１００種類の病原菌を検出する場合でも、例えば１００色に色分けされたマイクロビーズを用いて、２種類の画像を取り込むだけで、極めて簡単に病原菌の菌種の特定と菌量の計測を行うことができるので、多数の検出対象を正確にしかも短時間で分析することができるという大変優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る生化学検出装置を示す説明図。
【図２】画像処理装置の処理手順を示すフローチャート。
【図３】その具体的処理内容を示すフローチャート。
【図４】本発明に使用するマイクロビースの概念図。
【図５】反応実験を示す説明図。
【図６】反応モデルを示す説明図。
【図７】観察画像を示す説明図。
【図８】検出結果を示すグラフ。
【符号の説明】
１………………生化学検出装置
Ａ_１〜Ａ_１００……マイクロクビーズ（微小粒子）
Ｂ_１〜Ｂ_１００……抗体（特異的結合物質）
Ｃ_１〜Ｃ_１００……病原菌（検出対象）
Ｄ_１〜Ｄ_１００……二次抗体
Ｒ………………蛍光標識
２………………倒立顕微鏡
３………………撮像装置
４………………画像処理装置
５………………蛍光観察用光源（ルミネッセンス観察用光源）
６………………可視光観察用光源
７………………マイクロプレート
８………………ウェル

Claims

予め選定された検出対象の夫々に対して特異的に結合する特異的結合物質を検出対象別に担持させた多数の微小粒子をサンプルと接触させ、そのサンプルに存在する検出対象を微小粒子に付着させた後、その検出対象にルミネッセンス標識を付着させて観察することにより検出対象の種類を特定する生化学検出装置であって、
前記微小粒子が、可視光で識別することができ、且つ、前記検出対象の種類ごとに異なる識別特性を備えており、
前記ルミネッセンス標識の付着後に、微小粒子のルミネッセンス観察画像及び可視光観察画像を取り込む撮像装置と、その画像に基づいて微小粒子に結合した検出対象の種類を特定する画像処理装置とを備え、
前記画像処理装置は、検出対象が結合した微小粒子の二次元位置情報をルミネッセンス観察画像に基づいて取得する位置情報検出手段と、その識別特性を前記二次元位置情報と可視光観察画像に基づいて抽出する識別特性抽出手段と、微小粒子に結合された検出対象の種類を予め設定された識別特性−検出対象対照データに基づいて特定する検出対象特定手段を備えたことを特徴とする生化学検出装置。
前記微小粒子の識別特性が、色、大きさ又は形状である請求項１記載の生化学検出装置。
前記検出対象特定手段で特定された検出対象の夫々について、ルミネッセンス観察画像の微小粒子から発せられる光量に基づき、検出対象の付着量を計測する検出対象計量手段を備えた請求項１記載の生化学検出装置。
予め選定された検出対象の夫々に対して特異的に結合する特異的結合物質を検出対象ごとに担持させた多数の微小粒子をサンプルと接触させ、そのサンプルに存在する検出対象を種類ごとに微小粒子に付着させた後、その検出対象にルミネッセンス標識を付着させて観察することにより検出対象の種類を特定する生化学検出方法であって、
前記微小粒子が、可視光で識別することができ、且つ、前記検出対象の種類ごとに異なる識別特性を備えており、
前記ルミネッセンス標識の付着後に、全微小粒子のルミネッセンス観察画像及び可視光観察画像を取り込み、検出対象が結合した微小粒子の二次元位置情報をルミネッセンス観察画像に基づいて取得し、その識別特性を前記二次元位置情報と可視光観察画像に基づいて抽出し、その微小粒子に結合された検出対象の種類を予め設定された識別特性−検出対象対照データに基づいて特定することを特徴とする生化学検出方法。
前記サンプルが気管支肺胞洗浄液である請求項４記載の生化学検出方法。