ES2960311T3 - Nueva proteína de fusión bifuncional recombinante, procedimiento de preparación y uso de la misma - Google Patents

Nueva proteína de fusión bifuncional recombinante, procedimiento de preparación y uso de la misma Download PDF

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Abstract

Se proporcionan una proteína de fusión bifuncional recombinante, un método de preparación para la misma y su uso. En particular, la proteína de fusión bifuncional proporcionada se forma mediante la unión en serie de un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano y una primera región funcional en el extremo del SIRPα humano fuera de la membrana. Las pruebas in vitro indican que la proteína de fusión bifuncional recombinante puede unirse al CD20 humano y al CD47 humano simultáneamente, teniendo efectos terapéuticos en las células tumorales CD20 positivas mediante actividades citotóxicas dependientes de anticuerpos, mediadas por células y citotóxicas dependientes del complemento, y pueden bloquear la unión de CD47 y SIRPα y así activar los macrófagos para atacar las células tumorales, teniendo importantes actividades antitumorales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nueva proteína de fusión bifuncional recombinante, procedimiento de preparación y uso de la misma
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación está relacionada con el campo biomédico, y específicamente con una nueva proteína de fusión bifuncional recombinante y el procedimiento de preparación de la misma y su uso.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
CD20 es una proteína transmembrana que se expresa en la superficie celular de los linfocitos B. Su función biológica no está clara hasta ahora, y puede funcionar como un canal de calcio para permitir la respuesta inmune de los linfocitos B. CD20 se expresa en las membranas celulares de todos los linfocitos B, excepto las células pro-B y las células plasmáticas. También se encuentra en los linfomas de células B, la leucemia linfocítica crónica de células B, la leucemia de células pilosas y las células madre del cáncer de melanoma. Los anticuerpos anti-CD20 aprobados y disponibles en el mercado incluyen Rituximab, Obinutuzumab y Ofatumumab. Estos anticuerpos inducen ADCC y CDC. Sin embargo, se ha observado en la clínica que CD20 pueden desprenderse de las células en determinados pacientes que reciben el tratamiento durante un periodo de tiempo y los pacientes dejan de ser sensibles a estos anticuerpos. Ciertos otros pacientes pueden expresar receptores Fc-gamma-158F con baja afinidad (PoyKIIIA-158P) y presentar cierta tolerancia a Rituxan®. Por lo tanto, la forma de abordar el problema de la tolerancia se ha convertido en un tópico candente en el ámbito del desarrollo de fármacos anticuerpos.
CD47, también una proteína transmembrana, es miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y se expresa en casi todas las células, incluidos los glóbulos rojos. CD47 se une a ligandos como la integrina, la trombospondina-1 y la proteína reguladora de señales (SIRP). CD47 tiene diversas funciones biológicas y participa en la migración celular, la activación de células T, la activación de células dendríticas y el desarrollo de axones neuronales. Además, CD47 interactúa con SIRPa para inhibir la fagocitosis de los macrófagos y, de este modo, transmite señales de "no me comas" para evitar la fagocitosis de células normales, como las células sanguíneas, por parte de los macrófagos.
Los estudios han demostrado que muchas células tumorales sobreexpresan CD47, que se unen a SIRPa en las superficies de los macrófagos para inhibir la fagocitosis de las células tumorales por los macrófagos. Ese es uno de los mecanismos que adoptan los tumores para evitar la vigilancia inmunitaria. Los tumores con niveles elevados de CD47 incluyen la leucemia mieloide aguda (LMA), la leucemia mieloide crónica (LMC), la leucemia linfoblástica aguda (LLA), el linfoma no hodgkiniano (LNH), el mieloma múltiple (MM), el cáncer de vejiga, el cáncer de ovario, el cáncer de próstata, el cáncer de pulmón, el cáncer de colon, el cáncer de mama y el cáncer de páncreas.
Los estudios demostraron que la administración de un anticuerpo específico de CD47 que bloquea la interacción CD47-SIRPa inhibía significativamente el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación desvela una nueva proteína de fusión bifuncional recombinante y el procedimiento de preparación de la misma y su uso.
En un primer aspecto, la presente divulgación desvela una proteína de fusión bifuncional recombinante que comprende:
- un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, y
- un péptido que se une específicamente a CD47,
en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 5, y una cadena liviana que comprende una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 7
el péptido que se une específicamente a CD47 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 9, y
el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al extremo N o C de la cadena pesada del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo CD47.
En otra realización preferente, el anticuerpo es Rituximab.
En otra realización preferente, el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20.
En otra realización preferente, el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al terminal C de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20.
En otra realización preferente, la cadena pesada y la cadena liviana en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20 comprenden las secuencias de aminoácidos de i) SEQ ID NÚM.: 3 y 4, respectivamente, o ii) SEQ ID NÚM.: 13 y 10, respectivamente.
En un segundo aspecto, la presente divulgación desvela un polinucleótido que codifica la proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con el primer aspecto de la presente divulgación.
En un tercer aspecto, la presente divulgación desvela un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto de la presente divulgación.
En otra realización preferente, el vector incluye un plásmido bacteriano, un fago, un plásmido de levadura, un virus de una planta, un virus de mamífero como un adenovirus y un retrovirus, y otros vectores.
En un cuarto aspecto, la presente divulgación desvela una célula huésped modificada genéticamente que tiene su genoma integrado con el polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto de la presente divulgación.
En un quinto aspecto, la presente divulgación desvela una composición farmacéutica que contiene:
(i) la proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con el primer aspecto de la presente divulgación; y
(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
En un sexto aspecto, la presente divulgación desvela la proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con el primer aspecto de la presente divulgación para su uso en el tratamiento de un tumor CD20+.
En otra realización preferente, el tumor CD20+ se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de hígado, leucemia, tumor renal, cáncer de pulmón, cáncer de intestino delgado, cáncer óseo, cáncer prostático, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de intestino grueso, cáncer prostático, cáncer cervical, cáncer suprarrenal y cáncer de vejiga.
En un séptimo aspecto, la presente divulgación desvela un procedimiento para preparar la proteína de fusión bifuncional recombinante, que comprende las etapas de:
(a) cultivar la célula huésped modificada genéticamente de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9 en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas; y
(b) aislar del cultivo celular la proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 muestra la estructura y los mecanismos de acción de CD20mAb-SD1.
La Fig. 2 muestra la estructura y los mecanismos de acción de SD1-CD20mAb.
Las Figs. 3A y 3B muestran las secuencias de nucleótidos de CD20mAb-SD1, con la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada en la Fig. 3A, y la secuencia de nucleótidos de la cadena liviana en la Fig. 3B.
Las Figs. 3C y 3D muestran las secuencias de nucleótidos de SD1-CD20mAb, con la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada en la Fig. 3C, y la secuencia de nucleótidos de la cadena liviana en la Fig. 3D.
Las Figs. 4A y 4B muestran las secuencias de aminoácidos de CD20mAb-SD1, con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada en la Fig. 4A y la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana en la Fig. 4B.
Las Figs. 4C y 4D muestran las secuencias de aminoácidos de SD1-CD20mAb, con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada en la Fig. 4C, y la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana en la Fig. 4D.
Las Figs. 5A y 5B muestran los resultados del análisis SEC-HPLC, con el resultado del análisis SEC-HPLC de CD20mAb-SD1 en la Fig. 5A, y el resultado del análisis SEC-HPLC de SD1-CD20mAb en la Fig. 5B.
La Fig.6 muestra las actividades de unión de las proteínas recombinantes a dianas, en las que las actividades de unión de las proteínas recombinantes a CD20 de las Figs. 6A y 6B, y las actividades de unión de las proteínas recombinantes a CD47 en las Figs. 6C y 6D.
La Fig. 7 muestra las actividades de unión de las proteínas recombinantes a CD47 en ensayos competitivos.
La Fig. 8 muestra los resultados de los análisis ADCC y CDC, con las actividades ADCC de las proteínas recombinantes en las Figs. 8A y 8B, y las actividades c Dc de las proteínas recombinantes en las Figs. 8C y 8D.
La Fig. 9 muestra la capacidad de las proteínas recombinantes para inducir la fagocitosis de los macrófagos.
La Fig. 10 muestra las actividades antitumoralesin vivode las proteínas recombinantes, con la actividad antitumoralin vivode CD20mAb-SD1 en la Fig. 10A, y las actividades antitumoralesin vivode CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb en la Fig. 10B.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Con amplios estudios en profundidad, los inventores de la presente divulgación inesperadamente han hallado una proteína de fusión bifuncional recombinante, a saber CD20mAb-SD1, que se compone de un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano y un primer dominio extracelular de SIRPa humano (SIRPa-dominio 1, SD1). CD20mAb-SD1 es un homodímero con un peso molecular de 180 kDa. Tras el cribado de líneas celulares, se obtuvo una línea celular que expresaba de forma estable la proteína a partir de células de ovario de hámster chino (CHO). Con el cultivo de fermentación de estas células, se prepararon 500 miligramos de dichas proteínas. Los ensayosin vitrodemostraron que estas proteínas pueden unirse a CD20 y CD47 humanos simultáneamente, eliminando así las células tumorales CD20+ mediante la inducción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y promoviendo que los macrófagos ataquen a las células tumorales mediante el bloqueo de la interacción CD47-SIRPa. Asimismo, un ensayoin vivocon un modelo de linfoma humano demostró la significativa actividad antitumoral del CD20Ab-SD1. Específicamente, los ratones tratados con CD20mAb-SD1 lograron una supervivencia del 100%, mientras que sólo sobrevivieron el 67% de los ratones administrados únicamente conRituxan®. Así, el CD20mAb-SD1 de la presente divulgación puede desarrollarse como un medicamento antitumoral con excelente eficacia, que puede utilizarse para tratar a pacientes con linfoma de células B o leucemia linfocítica de células B insensibles o tolerantes a Rituxan®.
Antes de la descripción detallada de la presente divulgación, debe entenderse que los procedimientos y condiciones utilizados en la presente divulgación pueden cambiar y no se limitan a los descritos específicamente. Debe entenderse además que los términos utilizados en la presente memoria tienen por objeto especificar las realizaciones y no deben interpretarse como limitativos. El alcance de la protección de la presente divulgación se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados conocidos por los expertos en la técnica. Cuando se utiliza con numerales específicos, el término "aproximadamente" significa que un número específico puede tener una variación no superior al 1%. Por ejemplo, en la presente memoria, "aproximadamente 100" se refiere a todos los números comprendidos entre 99 y 101, como 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.
Se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes en las realizaciones o pruebas desveladas en la presente divulgación, pero sólo se describirán aquí los procedimientos y materiales preferentes.
SIRPa
La proteína reguladora de señales a (SIRPa), también denominada sustrato de la proteína tirosina fosfatasa-1 que contiene el dominio SH2, es una proteína transmembrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas. SIRPa es un importante receptor de superficie de CD47, y la señalización CD47-SIRPa desempeña un papel regulador negativo en el sistema inmunitario.
La secuencia de aminoácidos del primer dominio extracelular de SIRPa se expone a continuación.
EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPAREL1YNQKEGHFPR
VTTVSESTKRENMDFSISISAITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS APVVSGPAARATPQH (SEQ ID NÚM.9)
Anticuerpo anti-CD20
CD20 es una proteína transmembrana que se expresa en la superficie celular de los linfocitos B. Se expresa en las membranas celulares de todas las células B, excepto las células pro-B y las células plasmáticas, y también se encuentra en los linfomas de células B, la leucemia linfocítica crónica de células B, la leucemia de células pilosas y las células madre del cáncer de melanoma. Los anticuerpos anti-CD20 aprobados y disponibles en el mercado incluyen Rituximab. Por lo tanto, en una realización preferente de la presente divulgación, el anticuerpo anti-CD20 para preparar la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en Rituximab.
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 se expone a continuación.
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGN GDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARS TYYGGDWYFNV W G AGTT VT V S A(SEQ ID NÚM. 5).
Puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos que se indica a continuación.
CAGGTCCAGCTGCAGCAGCCGGGCGCGGAGCTCGTGAAGCCGGGGGCCTCGGTC AAGAIGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACGAGC FACAAC AIGCACTGG GTGAAGCAGACCCCGGGCCGGGGGCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGG AACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCGACCCTGACGGC GGACAAGTCGAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCGGAGGA CAGCGCCGTCTACTACTGCGCCCGGTCCACGTACTACGGCGGCGACTGGTACTTC AACGTCTGCiGGGGCCGGCACGACCGTGACCGTGAGCGCG(SEQ id NÚM.6)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo anti-CD20 se expone a continuación.
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVP VRFSGSGSGTS YSLTISRVE AEDA ATY YCQQWTSNPPTFGGGTK.LH1K.(SEQ ID NÚM.7)
Puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos que se indica a continuación.
CAGATCGTGCTGAGCCAGTCGCCGGCCATCCTCAGCGCGAGCCCCGGCGAGAAG GTCACCATGACGTGCCGGGCCAGCAGCTCGGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGC AGAAGCCCGGGAGCAGCCCCAAGCCGTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCT CGGGCGTGCCCGTGCGCTTCAGCGGGAGCGGCAGCGGGACCAGCTACAGCCTGA CCATCTCGCGGGTCGAGGCCGAGGACGCTGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGA
CCTCCAACCCGCCCACGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTCGAGATCAAG(SEQ ID NÚM
8)
En otra realización preferente de la presente divulgación, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 (CD20mAb-SD1) es la siguiente.
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGN GDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNV WGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPEM.GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAA TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KITPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGEE ELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVT TVSESTKRENMDFSISISAITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQH (SEQ ID NÚM.3)
Puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos que se indica a continuación.
CAGGTCCAGCTGCAGCAGCCGGGCGCGGAGCTCGTGAAGCCGGGGGCCTCGGTC AAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACGAGCTACAACATGCACTGG GTGAAGCAGACCCCGGGCCGGGGGCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGG AACGGCGAC ACC AGCTAC AACCAGA AGTTC AAGGGC A AGGCGACCCTGACGGC GGACAAGTCGAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCGGAGGA CAGCGCCGTCTACTACTGCGCCCGGTCCACGTACTACGGCGGCGACTGGTACTTC AACGTCTGGGGGGCCGGC ACGACCGTGACCGTGAGCGCGGCT AGCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGC GC CCTG ACC AGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGIGACCGIGCCCTCCAGCAGCITGGGCACCC AGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA GAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC CTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC CCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACGCCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGCCGCAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATG ACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG
CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCGAGGAGG AGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCTGGAGAGTCGG CCATTCTGCACTGCACTGTGACCTCCCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTT CAGAGGAGCTGGACCAGCCCGGGAATTAATCTACAATCAAAAAGAAGGCCACTT CCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGAGTCCACAAAGAGAGAAAACATGGACTTTTC CATCAGCATCAGTGCCATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTGAAG TTCCGGAAAGGGAGCCCTGACACGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTG TCTGTGCGTGCCAAACCCTC TGCCCCCGTGG TATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCCA C ACCTC AGCACTGA (SEQ ID NÚM. 1)
En una realización preferente de la presente divulgación, el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo de cadena simple, en el que una región variable de cadena pesada está unida a una región variable de cadena liviana, opcionalmente con un péptido enlazador entre ellas. El péptido enlazador tiene preferentemente de 1 a 15 residuos de aminoácidos, y más preferentemente de 3 a 10 residuos de aminoácidos.
Proteínas de fusión bifuncionales CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb
Los inventores de la presente divulgación han descubierto inesperadamente que la proteína de fusión bifuncional construida en la presente divulgación (que contiene un dominio que se une específicamente a CD20 y un dominio que se une específicamente a CD47) tiene un efecto inhibidor evidente sobre los tumores CD20+, y puede potenciar la eficacia de Rituxan® contra los tumores CD20+. La proteína de fusión bifuncional puede utilizarse como sensibilizador para tratar tumores CD20+ tolerantes a Rituxan®.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una proteína de fusión bifuncional recombinante que contiene un primer dominio de unión (también denominado D1) y un segundo dominio de unión (también denominado D2), en el que D1 se une específicamente a CD20, y D2 se une específicamente a CD47, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 5, y una cadena liviana que comprende una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 7, el péptido que se une específicamente a CD47 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 9, y el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al extremo N- o C- de la cadena pesada del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo.
De acuerdo con la presente divulgación, la proteína de fusión bifuncional recombinante puede ser un único polipéptido con múltiples funciones, o un complejo que contenga dos o más polipéptidos unidos de forma covalente o no covalente. Evidentemente, todo constructo capaz de unirse a CD20 y CD47 simultáneamente puede considerarse una proteína de fusión recombinante bifuncional.
La proteína de fusión bifuncional recombinante o sus variantes pueden construirse mediante técnicas biológicas moleculares convencionales (por ejemplo, ingeniería genética y expresión de proteínas), como es sabido por los expertos en la técnica.
El dominio que se une específicamente a CD20 es un anticuerpo anti-CD20 que contiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NÚM.: 5 y una región variable de cadena liviana de SEQ ID NÚM.:7.
El dominio que se une específicamente a CD47 se deriva de SIRPa descrito anteriormente, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 9.
En otra realización preferente de la presente divulgación, en la proteína de fusión bifuncional recombinante, D2 está enlazada al C-terminal o al N-terminal de D1. Por ejemplo, el N-terminal de D2 puede estar enlazado al C-terminal o al N-terminal de D1. Alternativamente, el C-terminal de D2 puede estar enlazado al C-terminal o al N-terminal de D1. Las proteínas resultantes enlazadas de las maneras mencionadas pueden utilizarse en combinación.
Dominio de unión
La proteína de fusión recombinante de la presente divulgación contiene al menos dos dominios de unión independientes, D1 y D2. En la presente memoria, el término "dominio de unión" se refiere a un péptido, un polipéptido o un constructo que contiene un péptido que puede unirse específicamente a una proteína diana.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "de unión específica" significa que un dominio de unión a antígeno forma un complejo con un antígeno diana con una constante de disociación (K<d>) de 500 pM o menos, y que dicho dominio de unión a antígeno no se une sustancialmente a otras proteínas irrelevantes en condiciones de ensayo comunes. Preferentemente, una "proteína irrelevante" se refiere a una proteína, un péptido o un polipéptido con una identidad aminoacídica inferior al 95%.
El dominio de unión a antígeno ejemplar de la presente divulgación puede ser un anticuerpo, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo, un péptido que interactúa específicamente con un antígeno diana (p. ej., un pepticuerpo), un receptor que interacciona específicamente con un antígeno diana, una proteína que contiene una porción de unión a ligando de un receptor que se une específicamente a un antígeno diana, un andamio de unión a antígeno (por ejemplo, un DARPin, una repetición HEAT, una repetición armadillo, una repetición tetratricopéptido, y otras moléculas de andamiaje que contienen proteínas repetidas de origen natural, véase, por ejemplo, Boersma and Pluckthun, (2011) Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857y referencias allí citadas), o un aptámero o una porción del mismo.
El procedimiento para determinar la unión específica de una molécula a otra es bien conocido en la técnica, incluyendo la diálisis de equilibrio y la resonancia de plasmón superficial. Por ejemplo, como se menciona en la presente memoria, el dominio de unión a antígeno se refiere a un polipéptido que se une a un antígeno específico o a su porción con unKD inferior a aproximadamente 500 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 0,2 pM, aproximadamente 0,1 pM o aproximadamente 0,05 pM, medido por resonancia de plasmón superficial.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "resonancia de plasmón superficial" se refiere a una tecnología en la que el cambio de concentración de proteínas dentro de un biosensor se mide mediante, por ejemplo, un sistema BIAcore™ (Biacore Life Science, GEHealthcare, Piscataway, NJ) para analizar el fenómeno óptico en tiempo real.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "K<d>" se refiere a la constante de disociación relativa a la interacción proteína-proteína específica (por ejemplo, la interacción anticuerpo-antígeno). Amenos que se especifique lo contrario, el K<d>de la presente divulgación se refiere a un K<d>medido por resonancia de plasmón superficial a 25 °C.
Anticuerpo y fragmento de unión a antígeno
El término "dominio de unión a antígeno" (D1 y/o D2) puede contener o consistir en un anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo. En la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula o complejo de unión a antígeno que contiene al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que se une o interactúa específicamente con un antígeno específico (por ejemplo, CD20 o CD47). El término "anticuerpo" incluye una inmunoglobulina que contiene cuatro cadenas peptídicas (dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) conectadas por enlaces disulfuro) o un anticuerpo polimérico de las mismas (como IgM). Cada cadena pesada contiene una región variable de cadena pesada (abreviada HCVR o V<h>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada contiene tres dominios, C<h>1, CH2y C<h>3. Cada cadena liviana contiene una región variable de cadena liviana (abreviada LCVR o V<l>) y una región constante de cadena liviana. La región constante de la cadena liviana contiene un dominio C<l>1. La región V<h>y la región V<l>pueden dividirse a su vez en varias regiones hipervariables, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh o Vl se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, F<r>2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la presente divulgación, los FR del anticuerpo o de su porción de unión al antígeno pueden ser los mismos que los de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana, con o sin modificaciones naturales o artificiales. Las secuencias de aminoácidos conservadas pueden identificarse alineando dos o más CDR.
D1 y/o D2 en la proteína bifuncional recombinante de la presente divulgación pueden contener o consistir en un fragmento de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo completa. Como se utiliza en la presente memoria, la "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a un polipéptido o glicoproteína natural, obtenible con catálisis enzimática, sintetizada o modificada genéticamente que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Una técnica adecuada como la digestión enzimática o la ingeniería genética que implique la manipulación de expresiones de ADN que codifican regiones variables de anticuerpos y opcionalmente regiones constantes, puede utilizarse para, por ejemplo, obtener un fragmento de unión a antígeno a partir de un anticuerpo de longitud completa. Dichos a Dn son bien conocidos, están disponibles comercialmente, se pueden obtener a partir de bibliotecas de ADN (incluida, por ejemplo, la biblioteca de anticuerpos de visualización de fagos) y/o se pueden sintetizar fácilmente. Los ADN pueden secuenciarse y manipularse química o genéticamente para, por ejemplo, disponer adecuadamente una o más regiones variables y/o regiones constantes, insertar codones, producir residuos de cisteína o modificar, añadir o eliminar residuos de aminoácidos. Los ejemplos del fragmento de unión a antígeno incluyen (i) un fragmento Fab; (ii) un fragmento F(ab'<) 2>; (iii) un fragmento Fd; (iv) un fragmento Fv; (v) un Fv de cadena simple (scFc); (vi) un fragmento dAb; y (vii) una unidad mínima de identificación compuesta de residuos de aminoácidos en una región supervariable del anticuerpo (por ejemplo, un péptido de una región independiente determinante de la complementariedad (CDR) como CDR3), o un péptido FR3-CDR3-FR4. El término "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en la presente memoria, también pretende abarcar otras moléculas de ingeniería, como un anticuerpo específico de un dominio, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo con un dominio ausente, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con injerto de CDR, un diabodia, un triabodia, un tetracuerpo, un minicuerpo, un nanocuerpo (como un nanocuerpo univalente, un nanocuerpo divalente y similares), un pequeño inmunofármaco modular (SMIP) y una región variable de un anticuerpo IgNAR de tiburón.
El fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo contiene generalmente al menos una región variable. La región variable puede estar compuesta por un cierto número de residuos de aminoácidos, y normalmente contendrá al menos una CDR con uno o más marcos adyacentes en un marco de lectura. En un fragmento de oferta de antígeno que contenga un dominio Vh unido a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden disponerse en un orden apropiado. Por ejemplo, la región variable puede ser un dímero y puede contener una estructura Vh-Vh,Vh-Vl o Vl-Vl. Opcionalmente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un único dominioVH o Vl.
En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos una región variable unida covalentemente a al menos una región variable. La disposición ejemplar de las regiones variables y la(s) regiones constantes en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1, (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) V<l>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<l>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) V<l>-C<h>2-C<h>3; y(xiv) V<l>-C<l>. En cualquiera de las disposiciones anteriores, incluidas las ejemplares, la región variable y la región constante pueden estar enlazadas directamente o enlazadas a través de una región bisagra o una región adaptadora total o parcialmente. La región bisagra puede estar compuesta por al menos 2 (por ejemplo 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) residuos de aminoácidos que unen la región variable vecina y/o las regiones constantes con flexibilidad o semiflexibilidad en un único polipéptido. Además, el fragmento de unión a antígeno puede incluir homodímeros o heterodímeros (u otros anticuerpos poliméricos) compuestos de las estructuras región variable-región constante mencionadas anteriormente solas o con uno o más dominios Vh o Vl individuales adicionales mediante enlaces no covalentes, como los enlaces disulfuro.
La proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente divulgación puede contener o consistir en un anticuerpo humano y/o un anticuerpo humano recombinante o el fragmento del mismo. Como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que contiene las regiones variables y las regiones constantes derivadas de una inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, el anticuerpo humano puede contener residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, dentro de una CDR especialmente una CDR3) (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo).Sin embargo, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humano" no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón) se han injertado en secuencias marco humanas.
La proteína de fusión bifuncional recombinante puede contener o consistir en un anticuerpo humano recombinante o el fragmento de unión a antígeno del mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humano recombinante" pretende incluir todos los anticuerpos humanos preparados, expresados, producidos o aislados por ingeniería genética, como los anticuerpos expresados por vectores de expresión recombinantes transferidos a células huésped (descritos en detalle más adelante), los anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinantes (descritos en detalle más adelante), los anticuerpos aislados de animales transgénicos con genes de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones) (véase, por ejemplo, Taylor et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), o anticuerpos preparados, expresados o aislados por otros medios en los que los genes de inmunoglobulina humana se incorporan a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes contienen las regiones variables y las regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en algunas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesisin vitro(o mutación somáticain vivoen animales transgénicos con genes de inmunoglobulina humana). Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes se derivan de las secuencias
Vh y Vl de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, pero pueden no ser naturales.
Diana tumoral
En otro aspecto de la presente divulgación, la proteína de fusión bifuncional recombinante puede dirigirse a células tumorales.
La proteína de fusión bifuncional recombinante puede conjugarse con (acoplarse a) fármacos, toxinas, isótopos radiactivos o algunas otras sustancias perjudiciales para la supervivencia celular. Opcionalmente, los fármacos o toxinas pueden no matar las células directamente, sino hacerlas susceptibles a otras sustancias. En otras realizaciones que implican dianas tumorales, la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente divulgación puede no estar conjugada con fármacos, toxinas o isótopos radiactivos, sino que se utiliza en combinación con otras moléculas de unión a antígenos (denominadas moléculas auxiliares), como otros anticuerpos antitumorales.
En algunas realizaciones de la presente divulgación que implican dianas tumorales, la proteína de fusión bifuncional recombinante (o el anticuerpo auxiliar) puede conjugarse con uno o más fármacos citotóxicos seleccionados del grupo que consiste en Calicheamicina, Esperamicina, Metotrexato, Adriamicina, Melfala, Clorambucil, ARA-C, Vindesina, Mitomicina, Cisplatino, Etopósido, Bleomicina, 5-Fluorouracilo, Estramustina, Vincristina, Etopósido, Adriamicina, Taxol, Larotaxel, Tesetaxel, Orataxel, Docetaxel, Dolastatina10, Auristatina E, Auristatina PHE, y compuestos basados en Maitansina (como DM1 y DM4). Opcionalmente, la proteína de fusión bifuncional recombinante (o el anticuerpo auxiliar) puede conjugarse además con una toxina, como la toxina diftérica, la exotoxina A de pseudomonas aeruginosa, la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la volkensina, la alfa-sarcina, una proteína aleuritesfordii, la diantina y una toxina fitolaca dePhytolaca Americana.La proteína de fusión bifuncional recombinante
(o el anticuerpo auxiliar) puede conjugarse opcionalmente con uno o más isótopos radiactivos seleccionados del grupo formado por 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 1311,67Cu, 125I, 123I, 77Br, 153Sm, 166Ho, 64Cu, 1 y 223Ra. Por lo tanto, la presente divulgación comprende una proteína de fusión bifuncional recombinante presente como un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) o un conjugado anticuerpo-radioisótopo (ARC).
Composición farmacéutica y administración
La presente divulgación proporciona además una composición. En una realización preferente, la composición es una composición farmacéutica, que contiene el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo o una proteína de fusión del mismo descritos anteriormente, o la proteína de fusión bifuncional recombinante mencionada anteriormente, y un portador farmacéuticamente aceptable. Generalmente, estos ingredientes pueden formularse en un vehículo acuoso no tóxico, no reactivo y farmacéuticamente aceptable, normalmente con un pH de aproximadamente 5 a 8, preferentemente un pH de aproximadamente 6 a 8, aunque el pH puede cambiar dependiendo de las propiedades del ingrediente y de las enfermedades a tratar. La composición farmacéutica bien preparada puede administrarse por vías de administración convencionales, incluidas, entre otras, administración intratumoral, intraperitoneal, intravenosa y tópica.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede utilizarse para prevenir y tratar tumores. Pueden utilizarse otros agentes terapéuticos en combinación.
La composición farmacéutica de la presente divulgación contiene una cantidad segura y eficaz (por ejemplo, 0,001-99
% en peso, preferentemente 0,01-90 % en peso, más preferentemente 0,1-80 % en peso) de la molécula de unión (o su conjugado) mencionada anteriormente y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. El portador incluye, pero sin limitación, solución salina, una solución tampón, glucosa, agua, glicerol, etanol, y sus combinaciones. El preparado farmacéutico debe corresponderse con la vía de administración. La composición farmacéutica de la presente divulgación puede prepararse como una preparación parenteral formulada por procedimientos convencionales utilizando solución salina fisiológica o una solución acuosa que contenga glucosa y otros ingredientes inactivos. La composición farmacéutica, como una preparación parenteral o una preparación en solución, puede formularse en condiciones estériles. El principio activo debe administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz, como por ejemplo entre 1 microgramo/kilogramo de peso corporal y 5 miligramos/kilogramo de peso corporal al día.
El polipéptido de la presente divulgación puede administrarse con agentes terapéuticos adicionales.
Al administrar la composición farmacéutica, se administra a un mamífero una cantidad segura y eficaz del inmunoconjugado. La cantidad segura y eficaz es generalmente de al menos aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal, y en la mayoría de los casos no superior a aproximadamente 8 miligramos/kilogramo de peso corporal, y preferentemente oscila entre aproximadamente 10 microgramos/kilogramo de peso corporal y aproximadamente 1 miligramo/kilogramo de peso corporal. La dosis puede especificarse teniendo en cuenta la vía de administración, las condiciones del paciente, etc., que pueden depender de un médico experto.
Materiales y procedimientos
1. Construcción de vectores que expresan CD20mAb-SD1 o SD1-CD20mAb y expresión de proteínas
Se obtuvo una secuencia que codifica CD20mAb-H-SD1 o SD1-CD20mAb-H uniendo una secuencia que codifica el primer dominio extracelular de SIRPa humano (dominio 1 de SIRPa, SD1) al extremo 5' o 3' de una secuencia que codifica la cadena pesada de Rituximab y añadiendo después dos sitios de restricción (HindlII en el extremo 5' y Salí en el extremo 3') en ambos extremos. Las secuencias que codifican CD20mAb-H-SD1, SD1-CD20mAb-H y la cadena liviana de Rituximab (CD20mAb-L) se sintetizaron en Suzhou Shengxin Biotech Co., Ltd, y se insertaron en los vectores de expresión pMac-H y pMac-L (Macroimmune Inc.) para obtener los vectores de expresión pMac-CD20mAb-H-SD1, pMac-SD1-cD20mAb-H y pMac-CD20mAb-L.
El vector pMac-CD20mAb-H-SD1 o pMac-SD1-CD20mAb-H coinfectó células CHO (compradas a ATCC) con pMac-CD20mAb-L. Las células se sometieron a varias rondas de selección por presión para obtener células CHO que expresaran de forma estable CD20mAb-SD1 o SD1-CD20mAb. Las células se cultivaron a mayor escala para preparar 500 mg de proteínas CD20mAb-SD1 o SD1-CD20mAb.
2. Análisis SEC-HPLC
Un miligramo de CD20mAb-SD1 o SD1-CD20mAb se sometió a análisis SEC-HPLC.
3. Actividad de unión a la diana (FACS)
Se utilizaron dos líneas celulares tumorales para probar las actividades de unión de CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb a CD20 y CD47 en comparación con una única proteína de unión a diana. Específicamente, se utilizaron células Jurkat (CD20'CD47+) para la prueba de unión a CD47, mientras que se utilizaron células Raji-CD47KO (CD20+CD47') para la prueba de unión a CD20.
4. Unión de CD47 en ensayo competitivo (FACS)
CD20mAb-SD1, SD1-CD20mAb, SIRPa-Fc (como control positivo) y Rituximab diluidos en serie se mezclaron con SIRPa-Fc marcado con biotina 25 nM (biotina-SIRPa-Fc), respectivamente. La mezcla se cultivó a TA durante 30 minutos y, a continuación, se incubó con células Jurkat a TA durante 1 hora. Tras los lavados, se añadieron a las células estreptavidina marcada con fluorescencia (FITC-Strep) y se incubaron a TA durante 1 hora. Las células se lavaron, se suspendieron en 100 pl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) frío y se inyectaron en un citómetro de flujo para analizar la unión de SIRPa-Fc a las células mediante FACS.
5. ADCC
Células Raji o células Raji CD47 knockout (Raji-CD47KO),106/ml, las células diana, se mezclaron con 1 mM CFSE (1:500) y se incubaron a 37°C durante 30 min, por agitación cada 10 min para una mejor mezcla. NK92MI-CD16a, las células efectoras, con una densidad de 6 *105/ml, se mezclaron con las células diana en una proporción de 2:1. Estas células se añadieron con CD20mAb-SD1 diluido en serie, SD1-CD20mAb, Rituximab (como control positivo) y Herceptin/Trastuzumab (como control negativo), respectivamente, y se incubaron durante 4 horas en un incubador a 37°C y CO<2>5%. Tras la incubación, la placa que contenía las células se mantuvo inmóvil a TA durante 10 minutos para enfriar el cultivo a TA, y a cada célula de la placa se le añadieron 20 pl de yoduro de propodio (PI) a una concentración final de 5 pg/ml. A continuación, las células se sometieron a análisis FACS para determinar el % de células IP positivas en cada concentración de proteína y, en consecuencia, la actividad ADCC mediante la siguiente fórmula.
Lisis % = (células positivas PI % en un grupo con tratamiento de proteína/anticuerpo - células positivas PI % en un grupo sin tratamiento de proteína/anticuerpo / (células positivas PI % en un grupo sin tratamiento de proteína/anticuerpo) * 100
La lisis % se representó gráficamente frente a la concentración de proteína utilizando GraphPad Prism.
6. CDC
En una primera prueba, las células Raji (como células diana) se mezclaron con CD20mAb-SD1 diluido en serie, Rituximab (como control positivo) y Herceptin (como control negativo), respectivamente. En una segunda prueba, se mezclaron células Raji (como células diana) con CD20mAb-SD1 diluido en serie y SD1-CD20mAb, respectivamente. A continuación, se añadió a la mezcla complemento de conejo a una concentración determinada, y las células se incubaron durante 4 horas en un incubador a 37°C y CO<2>5%. Tras la incubación, la placa que contenía las células se mantuvo inmóvil a TA durante 10 minutos para enfriar el cultivo a TA, y a cada célula de la placa se le añadieron 20 |jl de yoduro de propodio (PI) a una concentración final de 5 jg/ml. A continuación, las células se sometieron a análisis FACs para determinar el % de células IP positivas en cada concentración de proteína y, en consecuencia, la actividad CDC mediante la siguiente fórmula.
Lisis % = Lisis % en un grupo con tratamiento de proteína/anticuerpo - lisis % en un grupo sin tratamiento de proteína/anticuerpo
La lisis % se representó gráficamente frente a la concentración de proteína utilizando GraphPad Prism.
7. Fagocitosis
La línea celular de macrófagos de ratón Ana-1 se sembró en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 1*105 células por pocillo, y se cultivó durante 16-18 horas en una incubadora a 37° C y 5% deCO<2>. Las células diana (HL-60) se marcaron con CFSE y, a continuación, se incubaron con CD20mAb-SD1, SD1-CD20mAb, SIRPa-Fc (como control positivo) y Rituximab (como control negativo) diluidos en serie durante 45 minutos a 37 °C y 5% de CO<2>. Las soluciones de células diana con las proteínas de ensayo se transfirieron a la placa que contenía células Ana-1. La mezcla se cultivó durante 2 horas a 37°C y 5% deCO<2>y después se lavó para eliminar las células diana no unidas. Se recogieron los macrófagos y se sometieron a análisis FACS para determinar la intensidad de CFSE.
8. Prueba antitumoral in vivo
En una primera prueba, se utilizó un modelo tumoral insitucon células Raji para investigar la actividad antitumoralin vivode CD20mAb-SD1. Treinta ratones desnudos fueron inyectados en la vena caudal con células Raji, 5*10® células por ratón. Al día siguiente, se distribuyeron aleatoriamente en cinco grupos, y a los ratones de los grupos 1 a 5 se les administró por vía intraperitoneal PBS, CD20mAb-SD1 (5 mg/kg), SD1-Fc (2,5 mg/kg), Rituximab (2,5 mg/kg), y SD1-Fc más Rituximab (2,5 2,5 mg/kg), respectivamente, una vez a la semana, con un total de cinco inyecciones. Se observaron las condiciones físicas de los ratones y se midió su peso corporal todos los días.
En una segunda prueba, se utilizó un modelo tumoral subcutáneo con células Raji para investigar las actividades antitumoralesin vivode CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb. Se inyectaron por vía subcutánea 40 ratones desnudos con células Raji,6*10® células por ratón. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 120 mm3, estos ratones se distribuyeron aleatoriamente en cinco grupos, 8 ratones por grupo. A los ratones de los grupos 1 a 5 se les administró por vía intraperitoneal PBS, rituximab con actividad ADCc mejorada (rituximab-ADCC+) (2,5 mg/kg), CD20mAb-SD1 (5 mg/kg), SD1-CD20mAb (5 mg/kg) y rituximab más SIRPaD1-Fc (3 3 mg/kg), respectivamente, una vez a la semana, con un total de cinco inyecciones. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron dos veces por semana, y las condiciones físicas se observaron y registraron todos los días. En el día 28, los ratones fueron sacrificados tras completar la medición, y los tumores fueron extirpados, pesados y fotografiados.
La presente divulgación presenta, entre otras, las siguientes ventajas:
(1) Las proteínas de fusión bifuncionales recombinantes (CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb) tienen actividades antitumorales evidentes, que son mucho mejores que las proporcionadas por Rituximab solo, o la combinación de dos fármacos de unión a diana única (Rituximab más SIRPaD1-Fc);
(2) La proteína de fusión recombinante bifuncional SD1-CD20mAb tiene una actividad antitumoral mucho mejor que CD20mAb-SD1;
(3) Las proteínas de fusión bifuncionales recombinantes, CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb, pueden utilizarse para tratar a pacientes insensibles o tolerantes al Rituximab.
La presente divulgación se describirá con más detalle mediante los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos se utilizan para ilustrar la presente divulgación pero no para limitarla. Los procedimientos de los ejemplos que no se describen con protocolos especificados se llevaron a cabo utilizando protocolos convencionales descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Coning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, o siguiendo el manual del fabricante. A menos que se especifique lo contrario, el porcentaje o parte se refiere a porcentaje en peso o parte en peso, y los materiales y reactivos utilizados en los ejemplos estaban disponibles comercialmente.
Ejemplo 1 Construcción de vectores que expresan CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb
Las estructuras de CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb se muestran en la Fig. 1 y Fig. 2, ambas compuestas por cuatro cadenas (dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas) conectadas por enlaces disulfuro correspondientes, en las que las cadenas pesadas y las cadenas livianas estaban codificadas por una secuencia codificadora de cadena pesada y una secuencia codificadora de cadena liviana, respectivamente. La secuencia codificante de la cadena pesada de CD20mAb-SD1 constaba de 1749 nucleótidos (Fig. 3A), de los cuales 1350 nucleótidos codificaban la cadena pesada de CD20mAb de 450 residuos de aminoácidos (1-450), y 399 nucleótidos codificaban SD1 de 133 residuos de aminoácidos (451-583). La secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la Fig. 4A. La secuencia codificante de la cadena pesada de SD1-CD20mAb constaba de 1782 nucleótidos (Fig. 3C), de los cuales 399 nucleótidos codificaban SD1 de 133 residuos de aminoácidos (1-133), 30 nucleótidos codificaban un péptido enlazador de 10 residuos de aminoácidos (134-143), y 1353 nucleótidos codificaban la cadena pesada de CD20mAb de 451 residuos de aminoácidos (144-597). La secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la Fig. 4C. Tanto CD20mAb-SD1 como SD1-CD20mAb contenían una cadena liviana de 213 residuos de aminoácidos (1-213) (Fig. 4B y Fig. 4D), codificada por 639 nucleótidos (Fig. 3B y Fig. 3D).
Ejemplo 2 Análisis SEC-HPLC
Se confirmó en la prueba SEC-HPLC que tanto CD20mAb-SD1 como SD1-CD20mAb tenían muy buena integridad proteica, con fragmentos peptídicos de bajo peso molecular que representaban del 1 al 3%, y había menos del 3% de polímeros proteicos (Fig. 5A y 5B).
Ejemplo 3 Capacidades de unión a dianas
Las capacidades de unión de CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb a CD20 y CD47 se probaron utilizando un citómetro de flujo. Los resultados mostraron que ambas proteínas tenían una alta capacidad de unión a ambas dianas, con EC<50>a nivel de nmol. Específicamente, la capacidad de unión de CD20mAb-SD1 a CD20 fue similar a la de Rituximab, y la EC<50>de ambos fue de 0,08 nM y 0,06 nM, respectivamente. La capacidad de unión de SD1-CD20mAb fue algo inferior, con una EC50 de 0,4 nM. SD1-CD20mAb tenía una capacidad de unión a CD47 mucho mejor que CD20mAb-SD1, la EC50 de los dos era de 0,09 nM y 2,72 nM, respectivamente.
Ejemplo 4 Unión de CD47 en ensayo competitivo
Utilizando células Jurkat, se probaron las actividades de unión de CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb a CD47 sobre SIRPa. Como se muestra en la Fig. 7, ambas proteínas inhibieron significativamente la unión de SIRPa a células Jurkat, y el efecto inhibidor de SD1-CD20mAb fue significativamente mejor que el de CD20mAb-SD1, la EC<50>de los dos fue de 19,74 nM y 476,2 nM, respectivamente.
Ejemplo 5 Actividades de ADCC y CDC
Tanto CD20mAb-SD1 como SD1-CD20mAb tuvieron actividades ADCC (Fig. 8A y 8B) y CDC (Fig. 8C y 8D). Específicamente, estas dos proteínas presentaron actividades ADCC similares que fueron significativamente superiores a la de Rituximab. Cuando se utilizaron células Raji como diana, las EC<50>de CD20mAb-SD1, SD1-CD20mAb y Rituximab fueron de 0,14 ng/ml, 0,15 ng/ml y 3,82 ng/ml, respectivamente. Para las células Raji-CD47KO, la EC<50>de CD20mAb-SD1, SD1-CD20mAb y Rituximab fue de 0,14 ng/ml, 0,10 ng/ml y 1,13 ng/ml, respectivamente. Además, ambas proteínas mostraron actividades CDC prometedoras, siendo la CDC de SD1-CD20mAb (EC50=3,36 nM) mucho mejor que la de CD20mAb-SD1 (EC50=10,97 nM).
Ejemplo 6 Fagocitosis por macrófagos
Las funciones de CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb en la promoción de la fagocitosis de células tumorales por macrófagos se probaron utilizando la línea celular de macrófagos de ratón Ana-1. Como se muestra en la Fig. 9, SD1-CD20mAb (EC50=0,3 jg/m l) indujo la fagocitosis a un nivel similar en comparación con SIRPaD1-Fc (EC50=0,14 |jg/ml), mientras que CD20mAb-SD1 no indujo la fagocitosis de macrófagos.
Ejemplo 7 Actividad antitumoral in vivo
La actividad antitumoralin vivode CD20mAb-SD1 se estudió utilizando un modelo tumoralin situcon células Raji. Como se muestra en la Fig. 10A, todos los ratones del grupo sin ningún tratamiento con proteínas/anticuerpos murieron en no más de 38 días desde que empezaron a recibir las administraciones de fármacos. En los grupos administrados con proteínas/anticuerpos de unión a diana única, es decir, Rituximab y SIRPaD1-Fc, sobrevivieron más ratones. Al final de la prueba, las tasas de supervivencia en estos dos grupos fueron del 67% y el 83%, respectivamente. Mientras que en el grupo de tratamiento con CD20mAb-SD1, el 100% de los ratones sobrevivió, lo que sugiere que el efecto antitumoral de CD20mAb-SD1 es significativamente mejor que el de los anticuerpos/proteínas de unión a dianas individuales.
Además, se probaron las actividades antitumoralesin vivode CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb en un modelo tumoral subcutáneo con células Raji. Como se muestra en la Fig. 10B, a los ratones del grupo sin tratamiento con proteínas/anticuerpos les crecieron rápidamente los tumores con volúmenes tumorales cada vez mayores, y los tumores tenían un tamaño aproximado de 2500 mm3 al final del ensayo. Por otra parte, los tumores crecieron lentamente en los ratones tratados con CD20mAb-SD1 o SD1-CD20mAb, e incluso disminuyó el volumen promedio del tumor. Al final de la prueba, el tamaño promedio de los tumores en estos dos grupos era menor que al principio de la prueba. Y lo que es más inesperado, entre los 8 ratones a los que se administró SD1-CD20mAb, en 5 desaparecieron los tumores. En el grupo en el que se administró CD20mAb-SD1, los tumores desaparecieron por completo en 2 de los 8 ratones. Todo ello sugería que la actividad antitumoralin vivode SD1-CD20mAb era superior a la de CD20mAb-SD1. Cuando se administró Rituximab en combinación con SIRPaD1-Fc, el efecto antitumoral no fue tan bueno como el conseguido por CD20mAb-SD1 o SD1-CD20mAb (panel superior derecho, Fig. 10B).
Los estudios de la presente divulgación sugirieron que las proteínas recombinantes bifuncionales CD20mAb-SD1 y SD1-CD20mAb eran proteínas de fusión novedosas con elevadas actividades de unión a dos dianas. Las pruebas demostraron que dichas proteínas eran capaces de inducir la ADCC y la CDC y de bloquear la interacción SIRPaDI-Fc-CD47, y pueden utilizarse en el tratamiento de cánceres CD20+CD47+.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión bifuncional recombinante, que comprende
- un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, y
- un péptido que se une específicamente a CD47,
en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20 comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 5, y una cadena liviana que comprende una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nú M.: 7
el péptido que se une específicamente a CD47 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 9, y
el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al extremo N o C de la cadena pesada del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo.
2. La proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es Rituximab.
3. La proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al extremo N-terminal de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20.
4. La proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que el péptido que se une específicamente a CD47 está unido al terminal C de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20.
5. La proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la cadena pesada y la cadena liviana en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20 comprenden las secuencias de aminoácidos de i) SEQ ID NÚM.: 3 y 4, respectivamente, o ii) SEQ ID NÚM.: 13 y 10, respectivamente.
6. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula huésped modificada genéticamente que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una célula huésped modificada genéticamente que tiene su genoma integrado con el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.
10. Una composición farmacéutica que contiene:
(i) la proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y
(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
11. La proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de un tumor CD20+.
12. La proteína de fusión bifuncional recombinante para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el tumor CD20+ se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de hígado, leucemia, tumor de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de intestino delgado, cáncer óseo, cáncer prostático, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de intestino grueso, cáncer prostático, cáncer cervical, cáncer suprarrenal y cáncer de vejiga.
13. Un procedimiento para preparar la proteína de fusión bifuncional recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:
(a) cultivar la célula huésped modificada genéticamente de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9 en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas; y
(b) aislar del cultivo celular la proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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