ES2959514T3 - Plantas de tomate con fenotipo intenso y resistencia al TYLCV - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere al campo de las plantas de tomate que tienen un fenotipo intenso y resistencia al virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (TYLCV). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Plantas de tomate con fenotipo intenso y resistencia al TYLCV
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del fitomejoramiento, en concreto, al fitomejoramiento del tomate. La invención proporciona la combinación genética del gen recesivo que confiere el fenotipo"intenso" y el gen (parcialmente) dominante de resistencia Ty-1, que confiere resistencia frente al virus del rizado amarillo de la hoja del tomate ("Tomato Yellow Leaf Curl Virus", TYLCV). En concreto, se proporciona la combinación del alelointensorecesivo y el alelo Ty-1 en un único cromosoma deSolanum lycopersicum(cromosoma 6 del tomate) en configuracióncis,así como plantas de tomate que comprenden dicho cromosoma recombinante en su genoma. También se proporcionan semillas a partir de las cuales pueden cultivarse dichas plantas, partes de plantas, células, tejidos u órganos de dichas plantas y procedimientos de cultivo para transferir el cromosoma 6 recombinante que comprendeintensoy Ty-1 en configuracióncisa otras plantas de tomate cultivadas o células vegetales.
Antecedentes de la invención
El virus del rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) es un begomovirus (un género dentro de losGeminiviridae)transmitido por la mosca blanca de la batata(Bemisia tabaci,que causa graves pérdidas en las zonas de producción de tomate de todo el mundo. El TYLCV tiene una amplia gama de hospedadores, entre los que se incluyen el tomate, el tabaco, la patata y el pimiento. La infección provoca retraso del crecimiento, amarilleamiento, enrollamiento de las hojas y aborto de las flores. No se ha encontrado resistencia en el germoplasma de tomate cultivado,Solanum lycopersicum,propiamente dicho. Sin embargo, se han introgresado enSolanum lycopersicumregiones cromosómicas que confieren resistencia a partir de parientes silvestres del tomate y se han cartografiado los segmentos de introgresión. Hasta la fecha se han cartografiado cinco genes de resistencia, denominados Ty-1 a Ty-5.
Varias variedades comerciales de tomate tienen en el cromosoma 6 un fragmento de introgresión grande procedente deSolanum chilensen.° de registro LA1969, en el que se ubica el gen de resistencia Ty-1. El fragmento de introgresión de S.chilensees muy grande, de aproximadamente 30 millones de pares de bases (30 megabases o megapares de bases, 30 Mb) y cubre la mayor parte del brazo corto, el centrómero y parte del brazo largo del cromosoma 6, tal como se visualiza, por ejemplo, utilizando imágenes de hibridación fluorescenteinsitu (FISH) (figura 3 de Verlaanet al.,2011, Plant Journal, 68: 1093-1103).
La ubicación del gen Ty-1 en el segmento introgresado se ha cartografiado en varias poblaciones cartográficas, con el fin de identificar la localización exacta del gen Ty-1 en el cromosoma 6, con el objetivo de reducir el tamaño del fragmento de introgresión de S.chilensey los rasgos negativos (arrastre por ligamiento) que puedan localizarse en el fragmento de introgresión.
El Ty-1 fue cartografiado por primera vez en el pericentrómero del cromosoma 6 del tomate porZamiret al.,(1994, TAG, 88: 141-146) cerca del marcador molecular TG97. Sin embargo, estudios cartográficos posteriores arrojaron resultados contradictorios en cuanto a la ubicación de Ty-1 en el fragmento de introgresión de S.chilense.En 2011, Verlaanet al. (supra)demostraron que los intentos por localizar con precisión Ty-1 en el fragmento de S.chilensehabían fracasado con anterioridad debido a la baja cobertura del marcador combinada con una grave supresión de la recombinación en la región de Ty-1. Mediante el cartografiado físico de BAC ("Bacterial Artificial Chromosomes", cromosomas artificiales bacterianos) en la región de Ty-1 del cromosoma 6 y el desarrollo de marcadores CAPS ("Cleaved Amplified Polymorphic Sequence", marcadores de secuencias polimórficas amplificadas y cortadas) para estos BAC, se pudo cartografiar la ubicación de Ty-1 en el brazo largo del cromosoma 6, entre los marcadores CAPS MSc05732-14 y MSc05732-4 (que abarcan una región de aproximadamente 600 kb (kilobases o kilopares de bases).
Verlaanet al.(2011,supra)también hacen referencia a Ty-3, un gen de resistencia al TYLCV ubicado en el cromosoma 6 de S.lycopersicumen un fragmento de introgresión de la entrada LA2779 (o LA1932) de S.chilense.Descubrieron que la región de Ty-1 cartografiada se solapa parcialmente con la región donde se ha cartografiado Ty-3, entre los marcadores T0774 y cLEG-31-P16 (Huttonet al.,2010, Proceedings of Plant and Animal Genomes XVIII Conference CA, EE. UU., San Diego, pág. 204) y sugieren que Ty-1 y Ty-3 pueden ser alélicos, es decir, alelos del mismo gen de resistencia al TYLCV, ubicado en el brazo largo del cromosoma 6.
Las variedades de tomate Intense™, tales como las variedades comerciales NUN 3155 TO F1 y NUN 3362 TO (Nunhems B.V.), comprenden una mutación en un gen desconocido (del que también se desconocía la ubicación en el genoma), que convierte el gel locular que se encuentra en las cavidades de las semillas de los frutos del tomate en tejido carnoso. Para observar este "fenotipointenso"es necesario que la mutación esté presente en forma homocigótica, es decir, que el alelointensoque confiere el fenotipointensosea recesivo. Dado que el alelo mutanteintensoestá presente en el genoma cultivado de S.lycopersicum,que presenta un bajo grado de polimorfismo en muchas regiones genómicas, resulta difícil cartografiar el gen responsable.
Muchos intentos de los inventores de combinar el gen silvestre Ty-1 de resistencia al TYLCV con el fenotipointensodel tomate cultivado fracasaron, indicando que el alelointensomutante está localizado en el mismo cromosoma que el alelo Ty-1 y es muy probable que no pueda combinarse con Ty-1, debido a la supresión de la recombinación y/o a reordenamientos cromosómicos. El alelo Ty-1 se encuentra en un fragmento de introgresión silvestre muy grande (aproximadamente 30 Mb) y no ha sido cartografiado con precisión ni se ha reducido el tamaño de la introgresión silvestre, debido a la grave supresión de la recombinación alrededor de la región de introgresión de Ty-1. Se desconoce la causa exacta de la grave supresión de la recombinación, pero en Verlaanet al.,(2011, Plant J., 68: 1093-1103) en la página 1094 (columna RH, último párrafo) se especuló que la localización del gen Ty-1 en regiones de heterocromatina pericentromérica y/o reordenamientos cromosómicos entre tomates cultivados y silvestres puede desempeñar un papel. También demuestran que esta grave supresión de la recombinación no es específica de la población (página 1096) y que Ty-1 puede ser alélico con Ty-3, o estar muy estrechamente relacionado.
Es un objeto de la invención proporcionar una planta deSolanum lycopersicumque comprenda un fenotipointensoy un fenotipo de resistencia al TYLCV.
Definiciones generales
El artículo en singular "un/una" o "el/la" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. Así pues, el artículo en singular "un/una" o "el/la" suele significar "al menos uno".
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "planta" incluye la planta entera o cualquier parte o derivado de la misma, tales como órganos vegetales (por ejemplo, órganos de almacenamiento cosechados o no, tubérculos, frutos, hojas, semillas, etc.), células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de células o tejidos vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse plantas enteras, callos vegetales, grupos de células vegetales y células vegetales intactas en plantas, o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, ovarios, frutos (por ejemplo, tejidos u órganos cosechados, tales como tomates cosechados o partes de ellos), flores, hojas, semillas, tubérculos, bulbos, plantas propagadas clonalmente, raíces, portainjertos, tallos, puntas de raíces y similares. También se incluye cualquier estado de desarrollo, tales como plántulas, plantas inmaduras y maduras, etc.
La "variedad vegetal" es un grupo de plantas dentro del mismo taxón botánico del grado más bajo conocido, que (independientemente de si se cumplen o no las condiciones para el reconocimiento de los derechos de obtentor) puede definirse basándose en la expresión de características que surgen de un determinado genotipo o de una combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otro grupo de plantas por la expresión de al menos una de esas características, y puede considerarse como una entidad, porque puede multiplicarse sin ningún cambio. Por lo tanto, la expresión "variedad vegetal" no puede utilizarse para designar un grupo de plantas, aunque sean del mismo tipo, si todas ellas se caracterizan por la presencia de uno o dos loci o genes (o características fenotípicas debidas a estos loci o genes específicos), pero que, por lo demás, pueden diferir enormemente entre sí en lo que respecta a los demás loci o genes.
"F1, F2, etc." se refiere a las generaciones emparentadas consecutivas que siguen a un cruce entre dos plantas progenitoras o líneas progenitoras. Las plantas cultivadas a partir de las semillas producidas por el cruce de dos plantas o líneas se denominan generación F1. La autofecundación de las plantas F1 da lugar a la generación F2, etc.
La planta "híbrida F1" (o semilla híbrida F1) es la generación obtenida del cruce de dos líneas progenitoras endogámicas. Así pues, las semillas híbridas F1 son semillas a partir de las cuales crecen plantas híbridas F1.
El término "alelos" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus concreto, y todos estos alelos están relacionados con un rasgo o característica en un locus específico. En una célula diploide de un organismo, los alelos de un gen determinado se encuentran en un lugar específico o locus (loci en plural) de un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie vegetal diploide puede comprender un gran número de alelos diferentes en un locus concreto. Puede tratarse de alelos idénticos del gen (homocigóticos) o de dos alelos diferentes (heterocigóticos).
El término "gen" designa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN mensajero (ARNm) en una célula, y una región reguladora unida operativamente (por ejemplo, un promotor).
El término "locus" (loci plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o un marcador genético. El locusintensoes, por tanto, la localización en el genoma donde se encuentra el genintensoen el cromosoma 6 del genoma del tomate. De modo similar, el locus Ty-1 (o el locus Ty-3) es el locus de S.chilenseen el que el gen Ty-1 (o el gen Ty-3) se encuentra en el cromosoma 6 (ya sea en el cromosoma 6 del genoma de S.chilenseo en el fragmento introgresado del cromosoma 6 del genoma del tomate). Los loci ortólogos de Ty-1 o Ty-3 pueden encontrarse fundamentalmente en la misma posición en el cromosoma 6 de los parientes silvestresSolanumdel tomate.
La "distancia genética" entre loci del mismo cromosoma se mide por la frecuencia de entrecruzamiento, o frecuencia de recombinación (FR) y se indica en centimorgans (cM). Un cM corresponde a una frecuencia de recombinación del 1 %. Si no se encuentran recombinantes, la FR es cero y los loci están muy próximos físicamente o son idénticos. Cuanto más alejados estén dos loci, mayor será la FR.
Por "fragmento de introgresión" o "segmento de introgresión" se entiende un fragmento (o parte) cromosómico que se ha introducido en otra planta de la misma especie o de especies relacionadas mediante técnicas de mejora vegetal tradicionales o de cruce. En el tomate, los parientes silvestres del tomate se utilizan a menudo para introgresar fragmentos del genoma silvestre en el genoma del tomate cultivado, S.lycopersicum.Por tanto, una planta de tomate cultivada de este tipo tiene un "genoma de S.lycopersicum",pero comprende en el genoma un fragmento de un pariente silvestre del tomate, por ejemplo, un fragmento de introgresión del genoma de una especie silvestre relacionada, tal comoSolanum chilenseu otro pariente silvestre del tomate. Se entiende que la expresión "fragmento de introgresión" nunca incluye un cromosoma entero, sino sólo una parte de un cromosoma.
El "aleloIntenso"(o "Int") o "alelointenso"(o "i") se refiere en el presente documento al alelo de S.lycopersicumque confiere un "fenotipo de fruto normal" (Int) o un "fenotipo intenso" (i), respectivamente. El aleloIntensoes dominante, es decir, es el alelo que, cuando está presente en el genoma en una copia (heterocigótico) o en dos copias (homocigótico) produce frutos de tomate normales, con cavidades de semillas normales, es decir, con gel alrededor de las semillas (gel locular). Los frutos de tomate que tienen un "fenotipo de fruto normal" se refieren, por tanto, a frutos que tienen gel locular, tal como se muestra por ejemplo en la figura 3, lado izquierdo. El alelointensoes recesivo, es decir, sólo cuando el alelo dominanteIntensofalta en el genoma se observa el fenotipointenso.Así, las plantasIntenso/Intenso(Int/Int) y las plantasIntenso/intenso(Int/i) tienen un fenotipo de fruto normal, mientras que las plantas homocigóticasintenso/Intenso(i/i) tienen un "fenotipo de frutointenso",tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 3, lado derecho (véase más adelante).
El "aleloTy-1"se refiere a un alelo que confiere resistencia al TYLCV, o a una parte del mismo que confiere resistencia, introgresado originariamente en el tomate cultivado (en el cromosoma 6 de S.lycopersicum) a partir deSolanum chilense(anteriormente denominadoLycopersicon chilense),en concreto, de la entrada LA1969 de S.chilense.Por lo tanto, la expresión "alelo Ty-1" también abarca los alelos Ty-1 que pueden obtenerse de otras entradas de S.chilenseresistentes al TYLCV. Cuando uno o dos alelosTy-1están presentes en el genoma, la planta es resistente al TYLCV, es decir, tiene un fenotipo de resistencia al TYLCV. En el tomate cultivado que carece del fragmento de introgresión de S.chilense,el alelo de S.lycopersiconque se encuentra en el mismo locus se denomina en el presente documento alelo "+". Así, las plantas Ty-1/Ty-1 y Ty-1/+ muestran un fenotipo de resistencia a TYLVC, mientras que las plantas /+ son plantas que carecen del alelo Ty-1 y carecen del fenotipo de resistencia al TYLCV conferido por el alelo Ty-1 (es decir, son susceptibles al TYLCV). El "alelo Ty-3" se refiere a un alelo que confiere resistencia al TYLCV, o una parte del mismo que confiere resistencia, introgresado originalmente en el tomate cultivado (en el cromosoma 6 de S.lycopersicum)a partir deSolanum chilense(anteriormente denominadoLycopersicon chilense),en concreto, las entradas LA2779 o LA1932 de S.chilense.Por lo tanto, la expresión "alelo Ty-3" también abarca los alelos Ty-3 que pueden obtenerse de otras entradas de S.chilenseresistentes al TYLCV, cuyos alelos pueden introgresarse en el cromosoma 6 del tomate. Cuando uno o dos alelosTy-3están presentes en el genoma, la planta es resistente al TYLCV, es decir, tiene un fenotipo de resistencia al TYLCV.
Los "alelos ortólogos de Ty-1 o Ty-3" u "ortólogos de Ty-1 o Ty-3" son alelos de los genes de resistencia Ty-1 y Ty-3 presentes en otros parientes silvestres del tomate, en los cromosomas 6 ortólogos, en el locus equivalente donde se encuentran los alelos Ty-1 y Ty-3 en S.chilense.Por tanto, estos alelos ortólogos pueden encontrarse en el cromosoma 6 de parientes silvestres de S.lycopersicum,tales como S.peruvianum, S. pimpinellifolium, S. habrochaites, S. cheesmaniaey otros, y son transferibles, por introgresión, al cromosoma 6 de S.lycopersicum.
El "fenotipointenso"o "fenotipo de frutointenso"es el fenotipo conferido por la presencia de dos alelosintensomutantes deSolanum lycopersicumen el genoma, por lo que los alelosintensohomocigóticos(intenso/intenso)hacen que el gel locular que se encuentra en las cavidades de las semillas de los frutos del tomate se convierta en tejido carnoso. Por lo tanto, los frutos maduros del tomate carecen prácticamente de gel en las cavidades que rodean las semillas y el gel locular es sustituido por tejido carnoso. El fenotipointensose muestra, por ejemplo, en la figura 3, fruto de la derecha.
El "fenotipo de fruto normal" se refiere a los frutos de tomate que comprenden gel en las cavidades de las semillas (gel locular), debido a la presencia de un aleloIntensode S.lycopersicum,ya sea en forma homocigótica o heterocigótica(Intenso/intensooIntenso/intenso).El fenotipo de fruto normal se muestra, por ejemplo, en la figura 3, fruto de la izquierda.
Un "fenotipo de resistencia al TYLCV" o "resistencia al TYLCV" se refiere a la resistencia contra TYLCV conferida por el alelo Ty-1 de S.chilensey/o el alelo Ty-3 (u ortólogos de Ty-1 o Ty-3) cuando están presentes en el genoma del tomate en una o dos copias. El fenotipo de resistencia al TYLCV y la presencia del alelo Ty-1 y/o del alelo Ty-3 (u ortólogos de Ty-1 o Ty-3) pueden comprobarse utilizando el "ensayo de resistencia al TYLCV" y/o los ensayos de marcadores de Ty-1 o Ty-3 (o ensayos de marcadores ortólogos de Ty-1 o Ty-3). Un "+" puede utilizarse en el presente documento para indicar el alelo de S.lycopersicumen el cromosoma 6 en el locus en el que se encuentran los alelos Ty-1 o Ty-3 (o alelos ortólogos de Ty-1 o Ty-3).
Un "ensayo de resistencia al TYLCV" puede llevarse a cabo de diferentes maneras, ya sea como un ensayo de inoculación artificial o como un ensayo de campo, como también se describe en otra parte del presente documento o como se conoce habitualmente en el arte. En el ensayo de inoculación artificial se exponen preferentemente plántulas de tomate (por ejemplo, el primer estado de hoja verdadera o el estado de hoja 2-3) a moscas blancas virulíferas(Bemisia tabacibiotipo B portadora del TYLCV) y los síntomas de la enfermedad se evalúan aproximadamente 21 o 30 días después de la exposición a las moscas blancas en una escala de 0 (sin síntomas visibles), 1 (amarilleamiento muy leve de los márgenes de los foliolos en las plantas inoculadas), 2 (cierto amarilleamiento y rizado leve de los extremos de los foliolos), 3 (una amplia extensión de amarilleamiento, rizado y ahuecamiento de las hojas) a 4 (atrofia y amarilleamiento graves de la planta). Véase, por ejemplo, Lapidotet al.,2006, Phytopathology, 96, n.° 12, página 1405; o Jiet al.,2007, Mol. Breeding, 20: 271-284, página 273. Se considera que una planta de un genotipo concreto es resistente al TYLCV si la puntuación promedio de la enfermedad de una pluralidad de plantas de ese genotipo es significativamente más baja en comparación con los controles susceptibles (plantas que carecen de un fragmento de introgresión que comprende Ty-1 o Ty-3 o un ortólogo de Ty-1 o Ty-3, como el cultivar Moneymaker).
El "ensayo del marcador de Ty-1" es un ensayo de marcadores moleculares que puede utilizarse para comprobar si en el cromosoma 6 del tomate está presente una introgresión de S.chilenseque comprende el alelo Ty-1 en el genoma, por ejemplo, utilizando uno o más marcadores seleccionados de cLEG-31-P16, Msc05732-4 o cualquier marcador específico del genoma deS. chilenseentre cLEG-31-P16 y Msc05732-4. En algunas realizaciones se utilizan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en Msc05732-14, Msc05732-4, o cualquier marcador específico del genoma de S.chilensesituado entre Msc05732-14 y Msc05732-4.
El "ensayo de marcadores Ty-3" es un ensayo de marcadores moleculares que puede utilizarse para comprobar si en el cromosoma 6 del tomate está presente una introgresión deS. chilenseque comprende el alelo Ty-3 en el genoma, por ejemplo, utilizando uno o más marcadores seleccionados entre cLEG-31-P16, Msc05732-4, o cualquier marcador específico del genoma de S.chilenseentre cLEG-31-P16 y Msc05732-4. En algunas realizaciones se utilizan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en cLEG-31-P16, T0774, o cualquier marcador específico del genoma de S.chilenseentre cLEG-31-p16 y T0774, tal como MSc05732-4, MSc05732-3, M-M082G10, u otros.
Un "ensayo de marcadores de ortólogos de Ty-1 o Ty-3" es un ensayo de marcadores moleculares que puede utilizarse para comprobar si en el cromosoma 6 del tomate está presente una introgresión que comprende un alelo ortólogo de Ty-1 o Ty-3 procedente de un pariente silvestre del tomate que comprende el alelo ortólogo de Ty-1 o Ty-3 en el genoma.
Las "tomateras" o "tomateras cultivadas" son plantas de la especieSolanum lycopersicum,es decir, variedades, líneas de mejora o cultivares de la especieSolanum lycopersicum,cultivadas por el ser humano y con buenas características agronómicas; preferentemente, dichas plantas no son "plantas silvestres", es decir, plantas que generalmente tienen rendimientos y características agronómicas mucho peores que las plantas cultivadas y que, por ejemplo, crecen de forma natural en poblaciones silvestres. Las "plantas silvestres" incluyen, por ejemplo, ecotipos, líneas PI ("Plant Introduction", introducción de plantas), variedades locales o entradas silvestres o parientes silvestres de una especie. Las denominadas variedades o cultivares autóctonos, es decir, variedades o cultivares de polinización abierta habitualmente cultivados durante periodos anteriores de la historia de la humanidad y a menudo adaptados a regiones geográficas específicas, se incluyen en un aspecto de la invención como plantas de tomate cultivadas.
El tomate y los parientes silvestres del tomate son diploides y tienen 12 pares de cromosomas homólogos, numerados del 1 al 12. El "cromosoma 6 del tomate" se refiere al cromosoma 6 deSolanum lycopersicum,tal como se conoce en la técnica. El "cromosoma 6 ortólogo" se refiere al cromosoma 6 de parientes silvestres del tomate, partes del cual pueden introgresarse en el cromosoma 6 del tomate.
Los "parientes silvestres del tomate" incluyen S.arcanum, S. chmielewskii, S. neorickii( =L. parviflorum), S. cheesmaniae, S. galapagense, S. pimpinellifolium, S. chilense, S. corneliomulleri, S. habrochaites( =L. hirsutum), S. huaylasense, S. sisymbriifolium, S. peruvianum, S. hirsutumo S.pennellii.
"Promedio" se refiere en el presente documento a la media aritmética.
"En fase de acoplamiento" o "en configuración de acoplamiento" o"en cis"se refiere a la condición genética en la que los alelos de dos loci diferentes están genética y físicamente unidos como una unidad en un cromosoma y se heredan juntos como una unidad. Preferentemente, los loci están muy próximos entre sí, lo que reduce la probabilidad de que vuelvan a separarse por recombinación.
Un "cromosoma recombinante" se refiere a un cromosoma que tiene una nueva composición genética que surge a través del cruzamiento entre cromosomas homólogos, por ejemplo, un "cromosoma 6 recombinante", es decir, un cromosoma 6 que no está presente en ninguna de las plantas progenitoras y que surgió a través de un acontecimiento infrecuente de cruzamiento entre cromosomas homólogos de un par de cromosomas 6. En el presente documento, por ejemplo, se proporciona un cromosoma 6 de tomate recombinante que comprende Ty-1 eintensoen fase de acoplamiento (encis)y un cromosoma 6 de tomate recombinante que comprende Ty-3 eintensoen fase de acoplamiento (encis),así como un cromosoma 6 de tomate recombinante que comprende un alelo ortólogo de Ty-1 o Ty-3 eintensoen fase de acoplamiento (encis).
La expresión "técnicas tradicionales de mejora vegetal" abarca en el presente documento el cruce, la autofecundación, la selección, la producción de haploides dobles, el rescate de embriones, la fusión de protoplastos, la selección asistida por marcadores, la cría por mutación, etc., tal como los conoce el obtentor (es decir, procedimientos distintos de la modificación genética/transformación/procedimientos transgénicos), mediante los cuales, por ejemplo, se puede obtener y/o transferir un cromosoma 6 recombinante.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a una planta deSolanum lycopersicon,tal como se define en las reivindicaciones, que comprende un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipo de frutointenso,en el que dicha planta comprende al menos un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelointensorecesivo y un fragmento de introgresión (de un pariente silvestre del tomate) que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento. Preferentemente, la planta deSolanum lycopersicumes una planta no transgénica, por ejemplo, una planta que puede obtenerse por procedimientos de mejora vegetal tradicionales.
Se descubrió que el fenotipointensorecesivo puede combinarse con la resistencia al TYLCV conferida mediante fragmentos de introgresión, en el cromosoma 6 del genoma deSolanum lycopersicum,derivados de un pariente silvestre del tomate, S.chilense,que codifica el gen de resistencia al TYLCV Ty-1. Ty-1 y Ty-3 son probablemente alelos del mismo locus de resistencia al TYLCV en el cromosoma 6 (Verlaanet al.,2011,supra).
Ya existen en la técnica plantas deSolanum lycopersiconcon fragmentos de introgresión de los alelos Ty-1 y Ty-3 deS. chilense.Por ejemplo, las variedades híbridas comerciales Anastasia y Boludo (Seminis Vegetable Seeds) comprenden un fragmento de introgresión grande de la entrada LA1969 de S.chilense,que comprende el alelo Ty-1. También existen en la técnica líneas de mejora vegetal no comerciales que comprenden fragmentos de introgresión derivados del cromosoma 6 de S.chilense,que comprenden alelos Ty-1 o Ty-3, como LA1932-AL-F2, que comprende un fragmento de introgresión grande de S.chilense(aproximadamente 27 cM) que comprende el alelo Ty-3, y LA1931-AL-F2, que comprende un fragmento de introgresión de S.chilensemucho más pequeño (aproximadamente 6 cM) que comprende Ty-3 (véase Jiet al.,2007, Mol. Breeding, 20: 271-284).
Aunque las fuentes actuales de introgresiones de Ty-1 y Ty-3 se limitan a tres fuentes (las entradas de S.chilenseLA1969 de Perú, LA1932 de Perú y LA2779 de Chile), probablemente existen muchas otras entradas silvestres deSolanumque comprenden alelos Ty-1 o Ty-3 o alelos ortólogos en el mismo locus del cromosoma 6. Se divulga, pero no se reivindica, que tales alelos Ty-1 o Ty-3 también pueden combinarse con el alelointensotal como se describe en el presente documento, para generar un cromosoma 6 recombinante que comprenda un alelo Ty-1 o T-3 o un alelo ortólogo en fase de acoplamiento con el alelointensorecesivo.
Las entradas de parientes silvestres del tomate, tales como las entradas que pueden obtenerse en el TGRC (Tomato Genetic Resource Center, "Centro de recursos genéticos del tomate") u otras colecciones de semillas, pueden seleccionarse para la resistencia al TYLCV utilizando ensayos fenotípicos y/o de marcadores de Ty-1 y/o Ty-3 y/o ensayos de marcadores de ortólogos de Ty-1 o Ty-3, y las entradas resistentes pueden cruzarse con una planta deSolanum lycopersicumque comprenda un alelointensoen forma heterocigótica u homocigótica. La generación F2 (o una generación posterior, tal como la F3 o una generación de retrocruzamiento) puede entonces cribarse en busca de plantas recombinantes que presenten la combinación de resistencia al TYLCV y el fenotipo de frutointenso.Esta combinación sólo se encontrará si el cromosoma 6 deSolanum lycopersicum(que comprende el alelointenso)se ha recombinado con el cromosoma 6 que comprende el alelo Ty-1 o Ty-3 o el alelo ortólogo de Ty-1 o Ty-3. Véanse, por ejemplo, las figuras 4 A y B.
En una realización se proporciona una planta de tomate que comprende un cromosoma 6 recombinante, que comprende un Ty-1 acoplado enciscon el alelointensoy en la que la planta tiene un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipointenso.
En un aspecto, el locus de resistencia al TYLCV y el locusintensoestán muy próximos entre sí, es decir, la distancia genética y la distancia física entre los loci es preferentemente baja. En una realización, la distancia genética entre el locus de resistencia al TYLCV y el locusintensoes preferentemente de 5 cM o menos, tal como igual o menor que 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,5 cM, 0,25 cM, 0,1 cM, 0,05 cM, 0,01 cM, 0,001 cM o menos. En una realización, la distancia física entre el locus de resistencia al TYLCV y el locusintensoes preferentemente inferior a 10 Mb, tal como igual o inferior a 7 Mb, 6 Mb, 5 Mb, 4 Mb, 3 Mb o menos.
En una primera realización, se proporciona una planta de tomate que comprende un fenotipointenso,conferido por un alelointensoen cada uno de los cromosomas 6 homólogos (es decir, la planta es homocigótica para el alelointenso),y resistencia al TYLCV es conferida por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, en el que el fragmento de introgresión se deriva de un pariente silvestre del tomate y en el que el fragmento de introgresión comprende un alelo de resistencia Ty-1. El fragmento de introgresión en el cromosoma 6 que comprende el alelo Ty-1 procede de S.chilense.Se divulga, pero no se reivindica, que el fragmento de introgresión puede proceder de una entrada de S.chilenseseleccionada entre las entradas LA1969, LA1932 y LA2779 (disponibles en el TGRC). Se divulga, pero no se reivindica, que el fragmento de introgresión puede proceder de un cromosoma 6 ortólogo, tal como, por ejemplo, de una entrada resistente al TYLCV de un pariente silvestre del tomate, tal como S.peruvianum.El fragmento de introgresión es el fragmento de S.chilenseque se encuentra en las semillas depositadas con la entrada NCIMB 41930, o una parte del mismo que confiera resistencia.
La figura 1 a) a e) ilustra esquemáticamente los pares de cromosomas 6 que pueden estar presentes en las diferentes plantas de tomate que tienen un fenotipointenso(conferido por el alelointensoen ambos cromosomas 6 del par) y un fenotipo de resistencia al TYLCV conferido por un fragmento de introgresión que comprende un alelo Ty-1, o Ty-3, o un alelo ortólogo de Ty-1 o Ty-3. Esta figura ilustra los cromosomas 6 recombinantes que comprenden fragmentos de introgresión de S.chilense,portadores del alelo Ty-1 o Ty-3. Sin embargo, se entiende que (a lo largo de esta memoria descriptiva) las realizaciones que se refieren a fragmentos de introgresión de S.chilensese refieren igualmente a fragmentos de introgresión en el cromosoma 6 del tomate de otros parientes silvestres del tomate, que comprenden alelos ortólogos de Ty-1 o Ty-3 en los fragmentos de introgresión.
En una realización se proporciona una planta de tomate que comprende un cromosoma 6 recombinante, con Ty-1 eintensoen configuracióncis,y el otro cromosoma 6 con el alelointensosolamente, es decir, sin un fragmento de introgresión de S.chilense(u otro pariente silvestre del tomate) en el cromosoma 6 homólogo, tal como se ilustra en la figura 1 a) y c). El origen del otro cromosoma 6 es, por tanto, totalmente de S.lycopersicum.Dicho cromosoma 6 de S.lycopersicum,que comprende el alelointenso,pero carece de una introgresión que confiere resistencia al TYLCV procedente de un pariente silvestre del tomate, se encuentra en las variedades Intense™ comercializadas por Nunhems B.V. y en NCIM<b>41930. También se encuentra en NCIMB 41930 un cromosoma 6 recombinante que comprende un fragmento de introgresión deS. chilense,en el que dicho fragmento de introgresión comprende el alelo Ty-1, en fase de acoplamiento con el alelointenso.Por tanto, la combinación de Ty-1 eintensopuede obtenerse cruzando una planta de tomate cultivada a partir de NCIMB 41930 con otra planta de tomate.
En una realización se proporciona una planta de tomate que comprende dos cromosomas 6 recombinantes homólogos, cada uno con el alelointensoy Ty-1 en configuracióncis,tal como se ilustra en la figura 1 b) o cada uno con el alelointensoy Ty-3 en configuracióncis,tal como se ilustra en la figura 1 d). En una realización, los dos cromosomas 6 recombinantes homólogos son idénticos, por lo que los fragmentos de introgresión son del mismo tamaño y origen y comprenden el mismo alelo que confiere resistencia al TYLCV y el mismo alelointenso.Se puede generar una planta de tomate con estos cromosomas idénticos mediante autofecundación y selección de plantas progenitoras homocigóticas. En otra realización, los dos cromosomas recombinantes homólogos pueden ser diferentes, por ejemplo, uno puede comprender un fragmento de introgresión más corto que el otro.
Se describe una planta de tomate que comprende dos cromosomas 6 recombinantes homólogos, uno con el alelointensoy Ty-1 en configuracióncisy el otro con el alelointensoy Ty-3 en configuracióncis,tal como se ilustra en la figura 1 e).
En una realización preferida, las plantas de tomate anteriores son híbridos F1, producidos por el cruce de dos plantas progenitoras, P1 y P2, cada una homocigótica para uno de los cromosomas 6 mostrados en cualquiera de las figuras 1 a) a e). Así, por ejemplo, para producir el híbrido F1 que comprende el cromosoma recombinante de la figura 1 a), una variedad de tomate que tiene el fenotipointenso(tal como NUN 3155 TO) puede ser un primer progenitor que se cruza con un segundo progenitor, siendo dicho segundo progenitor una planta de tomate que es homocigótica para el cromosoma 6 recombinante (es decir, comprende un fenotipointensoy la resistencia al TYLCV conferida por el fragmento de introgresión Ty-1) y las semillas F1 (a partir de las cuales pueden cultivarse híbridos F1 según la figura 1 a)) se recogen a continuación de ese cruce.
Las plantas de tomate según la invención comprenden un fenotipointenso(conferido por la presencia del alelo homocigóticointenso)y un fenotipo de resistencia al TYLCV (conferido por el Ty-1 en el fragmento de introgresión).
Pueden generarse plantas de tomate que tienen el fenotipointensoy el fenotipo de resistencia al TYLCV cruzando una planta de tomate(Solanum lycopersicum)que comprende el alelointensoo, preferentemente, que comprende el fenotipointenso(es decir, homocigótica para el alelointenso;véase la figura 4 A) con una planta que comprende la resistencia al TYLCV conferida por un Ty-1 en el cromosoma 6 y seleccionando las plantas recombinantes en las generaciones de la progenie que tienen tanto el fenotipointensocomo el fenotipo de resistencia al TYLCV. El acoplamiento deintensoy la resistencia al TYLCV encispuede confirmarse mediante análisis de marcadores y/o por herencia conjunta completa de los dos fenotipos en las generaciones de la progenie, por ejemplo, en generaciones producidas por autofecundación de la planta seleccionada o por cruzamiento de la planta seleccionada con otra planta de tomate, teniendo dicha otra planta de tomate preferentemente un fenotipointenso.
Las plantas que tienen el fenotipointensoestán disponibles en el mercado, por ejemplo, las variedades comercializadas por Nunhems B.V. con el nombre comercial Intense™. También las plantas cultivadas a partir de las semillas depositadas en el presente documento con el número de registro NCIMB 41930 presentan el fenotipointenso.El fenotipo se reconoce y se selecciona con facilidad dejando que se desarrollen frutos de tomate maduros, cortándolos por la mitad y determinando visualmente si el fenotipo es "intenso" o "normal", es decir, casi sin gel en las cavidades de las semillas o con gel en las cavidades de las semillas del fruto, tal como se observa, por ejemplo, en la figura 3 (el fruto de la derecha tiene el "fenotipointenso"y el de la izquierda tiene un "fenotipo normal", es decir, un fenotipono intenso).Cabe señalar que el desarrollo de cavidades de aire (frutos "hinchados") también puede producirse en frutosintenso.La hinchazón es un problema causado por factores que afectan al cuajado de los frutos (tales como la temperatura). Sin embargo, el frutointensoserá igualmente fácil de distinguir del fenotipo de fruto normal, ya que no presenta gel locular. "Fundamentalmente sin gel" o "casi sin gel" en las cavidades de las semillas significa, en un aspecto, que los frutos de tomate comprenden, en promedio, cavidades de las semillas con al menos un 98 % de tejido carnoso y como máximo un 2 % de gel, más preferentemente al menos un 99 % de tejido carnoso y como máximo un 1 % de gel locular, más preferentemente un 100 % de tejido carnoso y sin gel locular.
Las plantas que comprenden alelos que confieren resistencia al TYLCV en el cromosoma 6 pueden ser, por ejemplo, plantas deSolanum lycopersicumque comprenden un fragmento de introgresión de S.chilenseen el cromosoma 6, tales como Boludo F1, Anastasia F1, la línea endogámica Ty52 (Michelsonet al.,1994, Phytopathology, 84, 928-933), plantas cultivadas a partir de semillas depositadas como NCIMB 41930 (todas ellas comprenden Ty-1 de S.chilenseLA1969) o LA1932-AL-F2 o LA1931-AL-F2 (comprenden Ty-3 deS. chilenseLA1932 y LA1931, respectivamente) u otras. Como alternativa, las plantas que comprenden alelos que confieren resistencia al TYLCV en el cromosoma 6 pueden ser parientes silvestres del tomate resistentes al TYLCV, o preferentemente plantas deSolanum lycopersicumque comprenden un fragmento de introgresión en el cromosoma 6 de un pariente silvestre del tomate.
El fenotipo de resistencia al TYLCV puede ensayarse utilizando un ensayo de resistencia al TYLCV, ya sea en el campo o en inoculaciones artificiales. También se pueden realizar ensayos de marcadores de Ty-1 y/o Ty-3, en especial cuando la fuente de la resistencia al TYLCV es un fragmento de introgresión de S.chilense.Del mismo modo, puede utilizarse el análisis FISH (descrito por Verlaanet al.,2011, supra) para demostrar que el cromosoma 6 del tomate comprende un fragmento de introgresión procedente de un pariente silvestre del tomate, y dicho fragmento de introgresión abarca al menos la región del brazo largo del cromosoma 6 donde se encuentran Ty-1 y/o Ty-3.
Por tanto, después de realizar un cruce entre una planta de tomate con un fenotipointensoy una planta de tomate con un fenotipo de resistencia al TYLCV conferido por un fragmento de introgresión en el cromosoma 6, es necesario cribar un gran número de plantas de la progenie para identificar la planta recombinante, muy infrecuente, que tiene tanto el fenotipointensocomo el fenotipo de resistencia al TYLCV. Se entiende que en cualquier ensayo de este tipo (de campo o en invernadero) se incluyen preferentemente plantas de control adecuadas, tales como plantas de S.lycopersicumcon un fenotipo de frutointenso,plantas con un fenotipo de fruto normal (por ejemplo, cv Moneymaker), entradas de plantas silvestres resistentes al TYLCV (por ejemplo, plantas de S. chilense LA1969, LA1932 o LA2779) y/o plantas de tomate con un fenotipo de resistencia al TYLCV conocido (por ejemplo, plantas Ty-1/Ty-1, plantas Ty-3/Ty-3 o plantas Ty-1/+ o Ty-3/+) y plantas susceptibles al TYLCV (como el cv Moneymaker). Opcionalmente, también puede incluirse un conjunto diferente de plantas hospedadoras, tal como el descrito por Lapidotet al.(2006, supra), que comprende STY-1, STY-2, STY-4,StY-5yStY-7(opcionalmente también STY-3 y STY-6) para determinar el nivel de resistencia al TYLCV.
Las plantas de la progenie pueden ser, por ejemplo, de las generaciones F2, F3, F4, BC1, BC2, BC1S1, BC1S2, etc. Tal como se mencionó anteriormente, el fenotipointensose selecciona mediante evaluación visual de los frutos maduros. El fenotipo de resistencia al TYLCV puede evaluarse utilizando diferentes ensayos de resistencia al TYLCV conocidos en la técnica y/o utilizando un ensayo de marcadores moleculares. Pueden utilizarse ensayos de campo en zonas infestadas de moscas blancas (véanse, por ejemplo, los ejemplos) y/o inoculaciones artificiales con moscas blancas portadoras del TYLCV (virulíferas), tal como se describe, por ejemplo, en Jiet al.,2007(supra).Dado que Ty-1 y Ty-3 son parcialmente dominantes, cabe señalar que la presencia heterocigótica de estos alelos puede conferir un nivel de resistencia inferior en comparación con la presencia homocigótica. Por ejemplo, Jiet al.,2007, demuestran que las plantas de las poblaciones F2 que comprenden Ty-3/Ty-3 tienen una puntuación media de gravedad de la enfermedad de 0,66 (en comparación con una puntuación media de gravedad de 2,83 en el control susceptible /+), mientras que las plantas Ty-3/+ tienen una puntuación media de gravedad de la enfermedad de 1,19. En ambos casos, la puntuación media de la enfermedad es mucho menor estadísticamente a la puntuación media de la enfermedad del control susceptible.
Una vez que se ha identificado una planta de la progenie que comprende tanto el fenotipo de frutointensocomo la resistencia al TYLCV, esta planta se selecciona para su posterior análisis y uso, por ejemplo, para generar plantas de tomate que comprenden pares del cromosoma 6 como se muestra en la figura 1. Una planta de tomate que tenga el fenotipointensoy resistencia al TYLCV sólo puede surgir a través de un acontecimiento infrecuente de entrecruzamiento cromosómico de cromosomas 6 homólogos, entre el locusintensoy el locus de resistencia al TYLCV. Cuando no se produce este acontecimiento de recombinación infrecuente, las plantas tienen un fenotipointenso, pero son susceptibles al TYLCV, o tienen un fenotipo de fruto normal y son resistentes al TYLCV. Véase la figura 4 B.
Para confirmar el acoplamiento encis,pueden realizarse análisis de marcadores, análisis FISH y/o de herencia conjunta del cromosoma 6 recombinante y puede confirmarse el fenotipointenso(y opcionalmente el fenotipo de resistencia al TYLCV) en las plantas de la progenie obtenidas de la planta seleccionada. También puede utilizarse la herencia conjunta de los dos fenotipos (resistencia al TYLCV y fenotipo de fruto intenso) sola o en combinación, por ejemplo, con el análisis de marcadores. Si se utiliza la herencia conjunta de los dos fenotipos para confirmar la transferencia/presencia del cromosoma 6 recombinante, hay que tener en cuenta que el fenotipointensosólo se observa si el alelointensoestá en forma homocigótica. La planta recombinante identificada como resistente al TYLCV y con un fenotipointensotendrá inicialmente sólo una copia del cromosoma 6 recombinante (Ty-1/+intenso/intenso).
Tras la autofecundación, la proporción de plantas que presentan tanto el fenotipointensocomo el fenotipo de resistencia al TYLCV (Ty-1/+ i/i o Ty-1/Ty-1 i/i) con respecto a las plantas que presentan el fenotipo de frutointensopero sin resistencia al TYLCV (+/+ i/i) es de 3:1 fenotípicamente y de 1:2:1 genotípicamente, es decir, aproximadamente el 25 % de las plantas de la progenie son homocigóticas para el cromosoma 6 de S.lycopersicum(no recombinante), aproximadamente el 50< % de las plantas de la progenie son heterocigóticas para el cromosoma 6 recombinante y aproximadamente el 25 % de las plantas de la progenie son homocigóticas para el cromosoma 6 recombinante. Al cruzar la planta recombinante identificada con una planta de tomate que tenga un fenotipointenso(+/+ i/i), aproximadamente el 50 % de la progenie tendrá un fenotipointensoy no tendrá resistencia al TYLCV, mientras que aproximadamente el 50 % de las plantas de la progenie tendrá tanto un fenotipointensocomo resistencia al TYLCV debido a la herencia del cromosoma 6 recombinante.
"Aproximadamente el 25 % de las plantas" y "aproximadamente el 50 % de las plantas" es bien entendido por la persona experta con conocimientos de genética y herencia como una referencia a la segregación mendeliana de una determinada característica. Se entiende que, en una población de 1000 plantas que se segrega para una determinada característica en una proporción 1:2:1, es decir, aproximadamente el 25 %:aproximadamente el 50 %:aproximadamente el 25 % de las plantas, no es necesario que exactamente 250, 500 y 250 plantas tengan los fenotipos o genotipos descritos, sino que estadísticamente aproximadamente el 25 %, el 50 % y el 25 % tengan los fenotipos o genotipos mencionados.
En una realización, el análisis de marcadores consiste en extraer ADN de tejido vegetal de una planta que presenta un fenotipo de frutointensoy resistencia al TYLCV, utilizar dicho ADN como molde en una reacción de PCR con pares de cebadores seleccionados del grupo de la tabla 1, preferentemente utilizando un par de cebadores que detecten al menos un marcador seleccionado de MSc05732-4, cLEG-31-P16, o un par de cebadores que pueda detectar cualquier ADN de S.chilensesituado entre estos dos marcadores, realizar la restricción del ADN amplificado con una enzima de restricción como se indica en la siguiente tabla 1, separar los fragmentos de ADN digeridos en un gel de agarosa y visualizar los fragmentos digeridos en luz UV (tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, como se describe en Verlaanet al.,2011, o Jiet al.,2007,supra).Uno o más de estos marcadores pueden utilizarse para determinar si la planta de tomate contiene ADN de S.chilense(es decir, un fragmento de introgresión procedente de S.chilense)en el locus o loci marcador, a fin de confirmar la presencia del fragmento de introgresión en las plantas recombinantes y, opcionalmente, el tamaño del fragmento de introgresión. Obviamente, pueden desarrollarse otros marcadores utilizando procedimientos conocidos en la técnica o los marcadores divulgados en el presente documento pueden detectarse utilizando procedimientos diferentes o convertirse en marcadores diferentes. Los marcadores CAPS proporcionados pueden distinguir entre ADN de S.lycopersicumhomocigótico, ADN de S.chilensehomocigótico y ADN de S.lycopersicum/S. chilenseheterocigótico en el locus marcador. Otros marcadores pueden ser, por tanto, cualquier marcador de ADN que sea capaz de distinguir el ADN de S.chilenseen el locus marcador del cromosoma 6 del ADN de S.lycopersicum.Otros marcadores capaces de detectar ADN de S.chilenseen los marcadores o entre los marcadores MSc05732-4 y cLEG-31-P16 pueden ser marcadores SNP ("single nucleotide polymorphism", polimorfismo de nucleótido único), marcadores CAPS, marcadores SCAR, marcadores SSR u otros.
Sin limitar el alcance de la invención, se cree que los alelos Ty-1 y Ty-3 se encuentran en la región del ADN de S.chilenseentre los marcadores MSc05732-4 y cLEG-31-P16. Así pues, preferentemente al menos el marcador MSc05732-4 y el cLEG-31-P16 (y/o cualquier marcador situado entre estos dos) detectan ADN de S.chilenseen plantas que presentan un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipointenso.
Tabla 1: Marcadores CAPS que pueden detectar ADN de S.chilenseen el cromosoma 6
Los marcadores también pueden utilizarse para transferir un cromosoma 6 recombinante (por ejemplo, desde una planta que tenga un fenotipointensoy resistencia al TYLCV) a plantas de la progenie, es decir, para seleccionar plantas de la progenie por la presencia/conservación del cromosoma 6 recombinante. Por ejemplo, si se cruza una planta según la figura 1 a) o 1c) con una planta que tenga un fenotipo de fruto normal y carezca de resistencia al TYLCV, aproximadamente el 50 % de la progenie F1 tendrá el cromosoma recombinante, mientras que el otro 50 % (aproximadamente) no lo tendrá y ninguna de las plantas tendrá un fenotipo de frutointenso.Los marcadores, u otros marcadores, pueden así utilizarse con facilidad en la mejora vegetal, con el fin de seleccionar plantas que tengan un cromosoma 6 recombinante según la invención. Sin embargo, como ya se ha mencionado, la selección fenotípica del fenotipointensoy del fenotipo de resistencia al TYLCV puede utilizarse igualmente o de forma adicional.
Así, se proporciona una planta de tomate que comprende un cromosoma 6 recombinante, que comprende el gen recesivointensoy un fragmento de introgresión que comprende un gen que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento, en la que el fragmento de introgresión comprende un marcador de ADN específico del genoma de S.chilenseseleccionado del grupo que consiste en MSc05732-4, cLEG-31-P16 o cualquier marcador específico del genoma de S.chilensesituado entre estos dos marcadores. En una realización, la planta de tomate comprende un fenotipointensoy resistencia al TYLCV y al menos el marcador específico del genoma de S.chilensecLEG-31-P16. En otra realización, la planta de tomate comprende un fenotipointensoy resistencia al TYLCV y al menos el marcador específico del genoma de S.chilenseMSc05732-4. En otra realización, la planta de tomate comprende un fenotipointensoy resistencia al TYLCV y al menos el marcador específico del genoma de S.chilenseMSc05732-4 y cLEG-31-P16.
En una realización, la planta de tomate comprende un fenotipointensoy resistencia al TYLCV y al menos un marcador específico del genoma de S.chilenseseleccionado del grupo que consiste en MSc05732-4, cLEG-31-P16 o P16 o cualquier marcador específico del genoma de S.chilensesituado entre el marcador MSc05732-14 y MSc05732-4.
Como los fragmentos de introgresión de parientes silvestres de S.lycopersicuma menudo también comprenden alelos no deseados, es deseable reducir el fragmento de introgresión tanto como sea posible, conservando al mismo tiempo la parte que confiere resistencia al TYLCV. Así, en una realización, el fragmento de introgresión en el cromosoma 6 del tomate tiene un tamaño igual o inferior a aproximadamente 4 Mb, 3 Mb, 2 Mb o 1 Mb, preferentemente igual o inferior a 0,8 Mb, tal como igual o inferior a 0,6 Mb, pero aún confiere resistencia al TYLCV. En una realización, el fragmento de introgresión no comprende, por tanto, marcadores específicos del genoma de S.chilensepor encima del marcador T0774, tales como el marcador M-H302A23 (véase, por ejemplo, la figura 2) u otros. En una realización, el fragmento de introgresión no comprende marcadores específicos del genoma de S.chilensepor encima del marcador MSc05732-4, tales como MSc05732-2, M-M082G10, T0774 y M-H302A23 y otros marcadores situados más arriba (más hacia el extremo del telómero del brazo corto del cromosoma 6).
Tal como se ha mencionado anteriormente, los fragmentos de introgresión de Ty-1 existentes de LA1969 son muy grandes, con un tamaño de aproximadamente 30 Mb. Para la introgresión de Ty-3 existente procedente de LA1932, el fragmento de introgresión es de aproximadamente 27 Mb y para la introgresión de Ty-3 existente procedente de LA1931 se ha reducido a aproximadamente 6 Mb (véase Jiet al.,2007,supra).
El cromosoma 6 recombinante según la invención comprende el alelointensoen fase de acoplamiento con un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV de una planta deL. chilenseresistente al TYLCV, tal como LA1969, LA1932 o LA1931, y el fragmento de introgresión tiene un tamaño de aproximadamente 30 Mb y comprende al menos un marcador específico del genoma de S. chilense seleccionado del grupo que consiste en T0774, M-M082G10, MSc05732-3, MSc05732-4, cLEG-31-P16 y cualquier marcador específico del genoma de S.chilensesituado entre Msc05732-14 y T0774. Se divulga que el fragmento de introgresión puede tener un tamaño significativamente inferior a aproximadamente 30 Mb, tal como igual o inferior a aproximadamente 25 Mb, 20 Mb, 15 Mb, 10 Mb, 8 Mb, 7 Mb, 6 Mb, 5 Mb, 3 Mb, 2 Mb, 1,2 Mb 1 Mb, 0.8Mb, 0,6 Mb y comprende al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en T0774, M-M082G10, MSc05732-3, MSc05732-4, cLEG-31-P16 y cualquier marcador específico del genoma de S.chilensesituado entre Msc05732-14 y T0774. Sin embargo, el fragmento de introgresión aún comprende la parte que confiere resistencia al TYLCV.
El tamaño de la introgresión puede reducirse utilizando procedimientos conocidos, en especial seleccionando recombinantes que conserven el fenotipo de resistencia al TYLCV, pero que carezcan de determinados marcadores específicos de S.chilense.Lo más sencillo es hacerlo comenzando con una planta que comprenda un cromosoma 6 recombinante según la invención y luego generando y seleccionando recombinantes en generaciones de la progenie que conserven el fenotipointensoy el fenotipo de resistencia al TYLCV, pero que comprendan un fragmento de introgresión de S.chilensemás corto, es decir, que no estén presentes, en especial, marcadores específicos del genoma de S.chilensepor encima del marcador T0774 o por encima del MSc05732-4 (y en su lugar estén presentes marcadores específicos del genoma de S.lycopersicon).Como alternativa, se pueden generar nuevas introgresiones, a partir de cruces con parientes silvestres, o se puede reducir primero el tamaño de las introgresiones existentes y, una vez que se haya identificado una introgresión más corta que confiera resistencia al TYLCV, se puede cruzar esta planta con una planta que tenga un fenotipointensoy seleccionar una planta que comprenda un cromosoma 6 recombinante (una planta que tenga tanto resistencia al TYLCV como el fenotipointenso).
En una realización de la invención, se proporciona una planta (preferentemente no transgénica) deSolanum lycopersiconque comprende un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipo de frutointenso,en la que dicha planta comprende al menos un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelointensorecesivo y que comprende un fragmento de introgresión originado a partir de un pariente silvestre de tomate que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento, en la que el alelo de resistencia al TYLCV se puede obtener a partir de una planta de S.chilenseresistente al TYLCV, por ejemplo, en la que el alelo resistente al TYLCV procede de las entradas LA1969, LA1932 o LA1931 de S.chilense,es decir, es el mismo alelo que se encuentra en estas entradas.
En una realización de la invención, se proporciona una planta deSolanum lycopersicon(preferentemente no transgénica) que comprende un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipo de frutointenso,en la que dicha planta comprende al menos un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelointensorecesivo y un fragmento de introgresión originado a partir de un pariente silvestre de tomate que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento, en la que el cromosoma 6 recombinante es el cromosoma 6 recombinante tal como se encuentra en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 41930, o se deriva de dicho cromosoma 6 recombinante, es decir, puede obtenerse a partir de éste. Así pues, el cromosoma 6 recombinante presente en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 41930 puede modificarse aún más, por ejemplo, reduciendo el tamaño del fragmento de introgresión como se ha descrito anteriormente, al mismo tiempo que se conserva la parte deS. chilenseque confiere resistencia al TYLCV y el alelointensodeS. lycopersicum.
Las semillas de tomate que comprenden el cromosoma 6 recombinante que comprende Ty-1 y el alelointensoen configuracióncishan sido depositadas por Nunhems B.V. con el número de registro NCIMB 41930 el 27 de enero de 2012. Las plantas cultivadas a partir de estas semillas son tomateras híbridas F1 que producen frutos con fenotipointensoy resistencia al TYLCV. Las semillas depositadas son conformes a la figura 1 a) y tienen un genotipo Ty-1/+intenso/intenso.
En otra realización, se proporcionan semillas y recipientes que contienen semillas a partir de las cuales pueden cultivarse plantas de tomate según la invención.
También se proporcionan plantas cultivadas a partir de dichas semillas que tienen un fenotipo de frutointensoy resistencia al TYLCV. Las plantas de tomate pueden ser determinadas, indeterminadas o semideterminadas. El cromosoma 6 recombinante según la invención puede introducirse fácilmente en cualquier planta de tomate, cualquier línea de mejora o cultivar, mediante cruzamiento y selección fenotípica y/o de marcadores. El fenotipointensoy el fenotipo de resistencia al TYLCV conferidos por el cromosoma 6 recombinante pueden así combinarse con otros genes y genomas deS. lycopersicum.Por ejemplo, otros genes de resistencia a enfermedades o insectos, genes de características de calidad del fruto, tamaño del fruto, uniformidad de la planta o del fruto, tamaño de la planta, características de floración, forma del fruto, sabor, tolerancia al estrés, textura del fruto, contenido de licopeno, betacaroteno o vitaminas del fruto, contenido total de sólidos solubles (Brix), caducidad larga, etc.
Preferentemente, la planta de tomate que comprende un cromosoma 6 recombinante según la invención es un tomate cultivado de la especie S.lycopersicum,es decir, una línea o variedad que produce altos rendimientos, tales como frutos de al menos 40 o 50 g de peso fresco promedio o superior, por ejemplo, al menos aproximadamente 80 g, 90 g, 100 g, 120 g, 150 g, 200 g, 250 g, 300 g o incluso hasta 600 g (tipos de tomate de carne). Sin embargo, también se incluyen los tipos pequeños, tales como el tomate cherry o de cóctel (que tienen, por ejemplo, un peso de fruto de 30 g o inferior, tal como 25 g, 15 g, 12 g o inferior). Los frutos pueden ser de tipo Roma, de tipo racimo, redondos, etc.
Puede ser un tomate destinado a la transformación o al consumo en fresco. También se incluyen en el presente documento tanto las variedades de polinización abierta como los híbridos. En una realización, la planta de tomate es una planta híbrida F1, cultivada a partir de una semilla híbrida F1. En otra realización, la planta de tomate es una línea progenitora endogámica, adecuada como progenitora en la producción de semillas híbridas F1. En una realización, la planta de tomate comprende sólo un cromosoma 6 recombinante según la invención, mientras que en otra realización la planta de tomate comprende dos cromosomas 6 recombinantes (que pueden ser cromosomas idénticos o diferentes). La planta de tomate también puede ser una planta doble haploide (DH), producida a partir de un cultivo celular o tisular de una planta según la invención, por lo que la planta DH comprende dos cromosomas 6 recombinantes idénticos de la invención.
Los frutos cosechados de tales plantas de tomate y que comprenden un cromosoma 6 recombinante según la invención son también una realización de la invención. Así, estos frutos de tomate presentan un fenotipointenso.Los frutos de tomate pueden ser de cualquier color (amarillo, rosa, rojo, naranja, blanco, morado, negro, multicolor, rayado, etc.), forma (redonda, oblonga, alargada, de pera, etc.) y tamaño (cereza, micro, mini, corazón de buey, uva, rodaja o globo, ciruela, pera, etc.). Los frutos pueden ser de tipo biloculado o multiloculado. Los frutos pueden destinarse al consumo en fresco o a la transformación. Como los frutos tienen un fenotipointenso,son especialmente adecuados para bocadillos y ensaladas. También se incluyen los productos alimentarios o piensos que comprenden frutos o partes de frutos según la invención, tales como frutos cortados en dados, frutos en rodajas, frutos picados, frutos deshidratados, frutos procesados (pasta de tomate, puré, sopas, zumo, salsas, kétchup, etc.), frutos enlatados, etc.
En otra realización, se proporciona una célula vegetal, un tejido vegetal o una parte de una planta (por ejemplo, un esqueje) de una planta según la invención, comprendiendo dicha célula, tejido o parte de la planta en su genoma al menos un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelo recesivointensoy un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento. También se proporciona un cultivo celular o tisularin vitrode una célula o un tejido que comprende un cromosoma 6 recombinante según la invención. Las células o tejidos vegetales pueden ser regenerables o no regenerables en plantas enteras. Otra realización proporciona una planta de tomate regenerada a partir de un cultivo celularin vitroo un cultivo de tejido según la invención, que comprende así un cromosoma 6 recombinante.
También se incluyen plantas de tomate de propagación vegetativa, por ejemplo, plantas producidas a partir de esquejes de una planta de tomate de la invención. Las plantas de tomate se reproducen con facilidad por vía vegetativa, tomando esquejes, dejando que éstos desarrollen raíces y hacer que crezca una planta entera. La planta reproducida vegetativamente es genéticamente idéntica a la parte de la planta (esqueje) que se utilizó al principio.
Además, en el presente documento se describe el uso de una planta de tomate o parte de una planta que comprende un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelointensorecesivo y un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento para la obtención de variedades de tomate para la mejora vegetal que tienen un fenotipointensoy resistencia al TYLCV. Para transferir el cromosoma 6 recombinante a cualquier otra planta de S.lycopersicumpueden utilizarse las técnicas de mejora vegetal tradicionales, como ya se ha descrito.
Se divulga un procedimiento de producción de plantas deSolanum lycopersicumque comprenden un fenotipo de resistencia al TYLCV y se proporciona un fenotipo de frutointenso,comprendiendo dicho procedimiento:
a) proporcionar una planta de tomate que comprende al menos un cromosoma 6 recombinante que tiene un alelo recesivointensoy un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento,
b) cruzar y/o autofecundar dicha planta de tomate con otra planta de tomate que comprende el alelo recesivointenso,y opcionalmente
c) seleccionar plantas de la progenie que presentan el fenotipointensoy resistencia al TYLCV.
La planta de tomate en a) puede comprender el cromosoma 6 recombinante tal como se encuentra en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 41930 o un cromosoma 6 recombinante derivado de las mismas. Como alternativa, las plantas de tomate pueden comprender un cromosoma 6 recombinante diferente, tal como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, el alelo de resistencia al TYLCV puede ser Ty-1, Ty-3 o un ortólogo de Ty-1 o Ty-3. El alelointensoes preferentemente el alelo que se encuentra en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 41930 o en las variedades comerciales Intense™. La planta de tomate de a) es preferentemente una línea o variedad con buenas características agronómicas. De modo similar, la planta de tomate de b) con la que se cruza la planta es preferentemente una planta de tomate con buenas características agronómicas. En c), las plantas de la progenie pueden seleccionarse fenotípicamente y/o mediante marcadores de ADN, tal como se ha descrito. Las etapas b) y c) pueden repetirse una o más veces.
La planta de tomate en a) puede ser una planta endogámica que comprende dos cromosomas 6 recombinantes idénticos, es decir, la planta es homocigótica para el alelo de resistencia TYLCV y es homocigótica para el alelointenso(por ejemplo, Ty-1/Ty-1, i/i o Ty-3/Ty-3, i/i). A continuación, esta planta se cruza con una planta endogámica susceptible al TYLCV que comprende el alelointensoen forma homocigótica (+/+ i/i) en la etapa b), con el fin de producir semillas híbridas F1, que cuando se cultivan para producir plantas son resistentes al TYLCV y tienen el fenotipo de frutointenso.Las semillas F1 se recogen de dicho cruce y, opcionalmente, se secan. Como alternativa, la planta endogámica de la etapa b) también puede comprender dos cromosomas 6 recombinantes idénticos, es decir, la planta es homocigótica para el alelo de resistencia al TYLCV y es homocigótica para el alelointenso(por ejemplo, Ty-1/Ty-1, i/i o Ty-3/Ty-3, i/i). Las semillas híbridas F1 recogidas de dicho cruce comprenden entonces dos cromosomas 6 recombinantes, uno derivado de cada progenitor, y las plantas cultivadas a partir de dichas semillas F1 son resistentes al TYLCV y presentan un fenotipo de frutointenso.
Se divulga un procedimiento para introducir un rasgo deseado, tal como un alelo de resistencia al TYLCV que se encuentra en otro cromosoma diferente al cromosoma 6, en una planta de tomate(Solanum lycopersicum)que comprende un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipo de frutointenso,comprendiendo dicho procedimiento:
(a) cruzar una planta de tomate que comprend3 un cromosoma 6 recombinante, que comprende el alelointensorecesivo y un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en fase de acoplamiento, con otra planta de tomate que comprende uno o más rasgos deseados, para producir plantas de progenie F1,
(b) opcionalmente, autofecundar las plantas de progenie F1 una o más veces para producir plantas de progenie F2, o F3, o de generaciones posteriores,
(c) seleccionar de dichas plantas de progenie aquellas que tiene el cromosoma 6 recombinante y el rasgo deseado;
(d) opcionalmente, retrocruzar las plantas de progenie seleccionadas con la planta progenitora de a) (que comprende el cromosoma 6 recombinante) para producir plantas de progenie retrocruzada;
(e) opcionalmente, seleccionar las plantas de progenie retrocruzada que tienen el cromosoma 6 recombinante y el rasgo deseado,
(f) opcionalmente, repetir las etapas d) y e) una, dos o más veces sucesivamente para producir plantas seleccionadas de progenie retrocruzada tres o más veces;
(g) opcionalmente, realizar la autofecundación de la progenie retrocruzada seleccionada para identificar plantas homocigóticas que comprenden el cromosoma 6 recombinante y el rasgo deseado;
(h) opcionalmente, cruzar al menos una de dichas progenies retrocruzadas o plantas autofecundadas con otra planta progenitora para generar una variedad híbrida con el rasgo deseado y un fenotipointensoy resistencia al TYLCV.
El rasgo deseado puede ser cualquier rasgo, pero puede ser un rasgo no localizado en el cromosoma 6 del tomate. Por ejemplo, el rasgo deseado puede ser el gen de resistencia Ty-2 presente en un fragmento de introgresión de S.habrochaitesen el cromosoma 11 del tomate, el gen de resistencia Ty-4 presente en un fragmento de introgresión de S.chilenseen el cromosoma 3 del tomate o el gen de resistencia Ty-5 presente en un fragmento de introgresión de S.peruvianumen el cromosoma 4 del tomate.
El rasgo deseado puede ser un rasgo que confiera cualquiera de las características mencionadas anteriormente, tal como un Brix alto, resistencia a enfermedades o insectos, forma del fruto, color, tamaño de la planta, características de floración, resistencia a herbicidas, etc. El rasgo deseado también puede ser un rasgo transgénico, conferido por un transgén, tal como un transgén que codifica una endotoxinade Bacillus thuringiensiso parte de ella, un transgén que confiere resistencia a herbicidas (contra, por ejemplo, glufosinato, glifosato, imidazolinona, triazina, sulfonilurea), etc.
Una planta de tomate que comprende un cromosoma 6 recombinante que puede obtenerse o se ha obtenido a partir de semillas depositadas con el número de registro NCIMB 41930, cruzando NCIMB 41930 con otra planta de tomate, también se incluye en el presente documento, al igual que el cromosoma 6 recombinante como tal y su uso para generar plantas de tomate que tengan resistencia al TYLCV y un fenotipo de frutointenso.
También se proporciona una planta de tomate, o una parte de la misma, habiéndose depositado una muestra representativa de sus semillas con el número de registro NCIMB 41930.
También se proporciona una semilla de tomate, habiéndose depositado una muestra representativa de estas semillas con el número de registro NCIMB 41930 y una planta, o una parte de la misma, producida por el cultivo de la semilla. En otro aspecto, se proporciona una planta de progenie de la variedad de tomate depositada con el número de registro NCIMB 41930, obtenida por mejoramiento vegetal adicional con dicha variedad, en la que dicha planta de progenie tiene fundamentalmente todas las características fisiológicas y morfológicas de la variedad de tomate (cuyas semillas se han depositado con el número de registro NCIMB 41930) cuando se cultiva en las mismas condiciones ambientales.
En otra realización más, se proporciona una planta de tomate transgénica (o semilla de la planta, célula de la planta, parte de la planta) que comprende un cromosoma 6 recombinante según la invención y un transgén integrado en el genoma.
En otra realización, se proporciona una planta de tomate transgénica (o semilla de la planta, célula de la planta, parte de la planta) que comprende un cromosoma 6 recombinante según la invención, en la que el cromosoma 6 recombinante, o una parte del mismo que comprende el locus de resistencia TYLCV y el locusintensoen acoplamiento, se introduce en la planta mediante procedimientos de transformación, por ejemplo, introduciendo un cromosoma artificial o minicromosoma en una célula de la planta y regenerando una planta entera a partir de la célula. Véase, por ejemplo, Linet al.,2011, Plant Methods, 7:10; y Yuet al.,Curr. Opin. Biotech., 2007, 18:425-431).
Leyendas de las figuras
Figura 1: Ilustración esquemática de los pares del cromosoma 6. Las líneas negras finas ilustran regiones de S.lycopersicum,las líneas gruesas ilustran fragmentos de introgresión de S.chilenseque comprenden Ty-1 (negro) o Ty-3 (gris). La letra "i" se refiere a la presencia del alelo "intenso" recesivo. Todas las plantas de tomate que comprenden un par cromosómico 6 de cualquiera de los apartados a) a e) son resistentes al TYLCV y tienen el fenotipointenso.Una planta de tomate que comprende el par cromosómico 6 de (a) también se denomina en el presente documento Ty-1/+intenso/intenso(o Ty-1/+ i/i). Una planta de tomate que comprende el par cromosómico 6 de (b) también se denomina en el presente documento Ty-1/Ty-1intenso/intenso(o Ty-1/Ty-1 i/i). Una planta de tomate que comprende el par cromosómico 6 de (c) también se denomina en el presente documento Ty-3/+intenso/intenso.Una planta de tomate que comprende el par cromosómico 6 de (d) también se denomina en el presente documento Ty-3/Ty-3intenso/intenso(o Ty-3/Ty-3 i/i). Una planta de tomate que comprende el par cromosómico 6 de (d) también se denomina en el presente documento Ty-1/Ty-3intenso/intenso(o Ty-1/Ty-3 i/i).
Figura 2: Ilustración esquemática de los marcadores CAPS específicos de S.chilenseque pueden utilizarse para detectar la presencia de un fragmento de introgresión de S.chilenseen el cromosoma 6 que comprende Ty-1 o Ty-3. Adaptado de Verlaanet al.,Plant J., vol. 68, n.° 6, págs. 1093-1103.
Figura 3: Fotografía de un fruto de tomate cortado y abierto con el fenotipointenso(derecha) y un fruto con el fenotipo normal (izquierda).
Figura 4: Ilustración esquemática de un esquema de entrecruzamiento que puede utilizarse para identificar plantas recombinantes infrecuentes que comprenden el fenotipo de frutointensoy la resistencia al TYLCV.
"Int" representa el alelo normal presente enSolanum lycopersicum,mientras que "i" representa el alelointensomutante (recesivo). En la figura 4 B, las plantas F2 se segregan fenotípicamente en una proporción 1:3 de 1 (fenotipo de frutointenso,susceptible al TYLCV) a 3 (fenotipo de fruto normal, resistente al TYLCV). Sólo si se produce un acontecimiento infrecuente de recombinación (entrecruzamiento) en un lugar entre el alelointensoy el alelo Ty-1 se producirá una planta que comprenda tanto un fenotipointensocomo la resistencia al TYLCV.
Depósitos de semillas
El 27 de enero de 2012, Nunhems B.V. depositó en el NCIMB Ltd. (Ferguson Building Craibstone Estate, Bucksbum Aberdeen, Escocia AB21 9YA, Reino Unido) una muestra representativa de semillas de una variedad de tomate con un cromosoma 6 recombinante de conformidad con el Tratado de Budapest, en virtud de Expert Solution (EPC 2000, artículo 32(1)). Las semillas recibieron los siguientes números de depósito: NCIMB 41930.
El solicitante pide que las muestras del material biológico y cualquier material derivado del mismo sólo se entreguen a un experto designado de conformidad con el artículo 32(1) EPC o la legislación relacionada de países o tratados que tengan normas y regulaciones similares, hasta la mención de la concesión de la patente, o durante 20 años a partir de la fecha de presentación si la solicitud es denegada, retirada o se considera retirada.
El acceso al depósito estará disponible durante la litispendencia de esta solicitud para las personas que el director de la Oficina de Patentes de EE. UU. determine que tienen derecho al mismo previa solicitud. Sujeto a 37 C.F.R. § 1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de la patente. El depósito se mantendrá durante un periodo de 30 años, o 5 años después de la solicitud más reciente, o durante la vida ejecutiva de la patente, según cuál sea el periodo más largo, y se sustituirá si alguna vez deja de ser viable durante ese periodo. El solicitante no renuncia a ningún derecho concedido en virtud de esta patente en esta solicitud o en virtud de la Ley de Protección de Variedades Vegetales (7 USC 2321et seq.).
Los siguientes ejemplos no limitantes describen cómo se pueden obtener plantas según la invención, que comprenden un cromosoma 6 recombinante. A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo según protocolos convencionales, como se describen en Sambrooket al.(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; y Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubelet al.(1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE. Uu . Los materiales y procedimientos convencionales para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993), de R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Los procedimientos convencionales de mejora vegetal se describen en Principies of Plant breeding, segunda edición, Robert W. Allard (ISBN 0-471-02309-4).
Ejemplo 1
1. 1 Materiales y procedimientos
1. 1.1 Desarrollo de la población
Individuos de una línea endogámica de L.esculentumque comprenden dos copias del gen mutado que confiere el rasgo fenotípicointenso(es decir, homocigóticos paraintenso;pertenecientes a la línea endogámica LH 8587*SR 97180-0-S-3-8) y susceptibles al TYLCV, se cruzaron con un híbrido deL. esculentum(Hy006, carente del alelo mutanteintenso)seleccionado en Jordania como resistente al virus. Mediante el análisis molecular se confirmó que la resistencia era conferida por el gen Ty-1, portado en forma heterocigótica.
Ambos individuos progenitores se seleccionaron por tener una forma de fruto similar (alargada) y por el hábito determinante de la planta, que facilitaba el cultivo de progenies en gran número en campo abierto.
La población F1 se cultivó en un número de 100 individuos, todos portadores del alelointensomutado en forma heterocigótica (teniendo así un fenotipo de fruto normal) y que se segregaban para el gen Ty-1 en una proporción de 1:1. Así pues, las progenies F1 se segregaban genotípicamente en una proporción 1 (+/+, I/i):1 (Ty-1/+, I/i).
Utilizando el análisis de marcadores moleculares se seleccionaron 15 individuos de la población F1 que tenían las características agronómicas deseadas y el gen Ty-1 en forma heterocigótica, es decir, heterocigótica tanto paraintensocomo para Ty-1 (Ty-1/+ I/i). Estas 15 plantas se autofecundaron para producir familias F2, cada una de ellas compuesta por 150 plantas F2. A continuación, se cultivaron los 150 individuos F2 para obtener una población F2 total de 2250 individuos.
1.1.2 Materiales vegetales y condiciones de crecimiento
Todas las plantas F2 se sembraron en un vivero y luego se trasplantaron a un campo de cultivo al aire libre. Las plantas se plantaron de acuerdo con las condiciones de cultivo de la zona, sólo que a una densidad menor, con un espaciado de 50 cm en la hilera y de 1,40 entre hileras, para facilitar la observación de cada planta individual (la densidad normal era de 40 x 1,20). El ciclo fue el típico de verano, con el trasplante a mediados de primavera y la cosecha a mediados/finales de verano. Para obtener dos ciclos completos al año, se alternó una temporada de cultivo en el hemisferio norte (Europa del Sur) y otra en el hemisferio sur (Chile).
La población F2 se seleccionó para determinar el fenotipo de fruto intenso y la resistencia al TYLCV, utilizando un análisis de marcadores moleculares para Ty-1. Un individuo F2 seleccionado que presentaba resistencia al TYLCV y frutosintenso,supuestamente portador de la recombinación entre Ty-1 eintenso,fue analizado mediante marcadores moleculares y autopolinizado para generar individuos F3, en los que se demostró la recombinación entre Ty-1 eintensomediante análisis fenotípico (véase 1.1.3 y 1.1.4) y análisis de marcadores moleculares (véase 1.2).
1.1.3 Análisis de la resistencia al TYLCV de los individuos F3
Individuos portadores de diferentes combinaciones (homocigóticos, heterocigóticos o sin gen Ty-1) para Ty-1 fueron sometidos a pruebas en Águilas (España) en una zona fuertemente afectada por TYLCV y la reacción a la enfermedad fue entonces verificada con marcadores moleculares para Ty-1, demostrando la correlación entre los resultados de los marcadores para el gen Ty-1 y la resistenciain vivo(fenotípica) al TYLCV.
Como referencia patrón se utilizaron híbridos comercializados. La variedad Super Red (Seminis) y NUN 5025 (Nunhems) se utilizaron como controles resistentes al TYLCV. NUN 6108 (Nunhems), Elliot (Nunhems) y H5656 (Hazera) se utilizaron como controles susceptibles al TYLCV. Los síntomas del TYLCV se puntuaron con arreglo a una escala de 0 a 4, en la que 0 = ausencia de síntomas, 1 = amarilleamiento muy leve, 2 = cierto amarilleamiento y rizado leve de las hojas, 3 = amarilleamiento y rizado importantes, 4 = amarilleamiento grave y atrofia de las plantas.
Los controles susceptibles se puntúan con 4, los parcialmente resistentes con 0.
Los individuos seleccionados que mostraban una buena resistencia parcial al TYLCV (al mismo nivel que las variedades comerciales resistentes utilizadas como control, es decir, que tenían una puntuación TYLCV = 0) y demostraron ser portadores del gen Ty-1 en forma homocigótica o heterocigótica.
1.1.4 Análisis del fenotipo de frutointenso
El fenotipo de frutointensose determinó visualmente en los frutos maduros cortándolos para exponer su interior. Las cavidades de las semillas de la sección transversal se comparan con las cavidades de las semillas de la sección transversal de frutos normales de plantas de control.
1.2 Resultados
En la población F2 se descubrió una planta recombinante que era resistente al TYLCV y tenía un fenotipo de frutointenso.Los marcadores moleculares demostraron que era heterocigótica para Ty-1 y que el fenotipo del fruto era"intenso".Así pues, el recombinante era fenotípicamente resistente al TYLCV y producía frutosintensoy era genotípicamente Ty-1/+ i/i.
La planta individual recombinante se autofecundó para producir una generación F3 y las progenies F3 se plantaron en la siguiente temporada (en España) para confirmar el acontecimiento de recombinación.
Las progenies F3 se segregaron en una proporción fenotípica de "TYLCV resistente eintenso"a "TYLCV susceptible eintenso"de 3 a 1. Genotípicamente, tal como lo confirma el análisis de marcadores moleculares, la proporción de segregación fue de 1 (Ty-1/Ty-1, i/i ) a 2 (Ty-1/+, i/i) a 1 (+/+, i/i). La observación de las progenies F3 confirmó así que la planta recombinante F2 seleccionada era homocigótica paraintensoy heterocigótica para Ty-1 (Ty-1/+, i/i).
La asociación del fenotipo y la confirmación con el análisis de marcadores moleculares demostró que, en la población F3, los individuos se segregaban en acoplamiento para Ty-1 eintenso,y los individuos homocigóticos tanto para Ty-1 como paraintenso(Ty-1/Ty-1, i/i) fueron seleccionados entre las progenies F3.
Ejemplo 2: Transferencia del acontecimiento de recombinación a otra variedad
2.1 Materiales y procedimientos
El cruce original ya implicaba a progenitores de alto valor. Se decidió continuar con las poblaciones homocigóticas para Ty-1 eintenso(anteriormente) y hacer una fuerte selección utilizando el procedimiento del pedigrí para fijar posibles líneas progenitoras que se utilizarían directamente en combinaciones híbridas.
En la fase F5, las progenies se ensayaron en unas cuantas combinaciones para comprobar su capacidad de combinación. En la fase F7 se fijaron unas cuantas líneas y se cruzaron con líneas progenitorasintensopara generar híbridos que se evaluaron en el nivel de cribado.
En concreto, se seleccionó la progenie LH 56237-15-2-1-3-1-0-10-0 (Ty-1/Ty-1, i/i), que se cruzó con otra línea progenitora endogámicaintenso(susceptible al TYLCV) para generar el híbrido depositado con el número de registro NCIMB 41930.
El híbrido y los progenitores endogámicos se sometieron a pruebas de resistencia al TYLCV, tanto en condiciones de infección natural (exponiendo las plántulas a la infección natural y dejando a las moscas blancas libres para multiplicarse e infectar las plantas, incluso después del trasplante, durante todo el ciclo del ensayo) como con inoculación semiartificial (criando moscas blancas virulíferas, poniéndolas en contacto con las plántulas en una jaula con red, dejando que se alimentasen de cada plántula y, por último, trasplantando las plántulas en un entorno protegido, dejando a las moscas blancas libres para seguir propagando el virus).
Ambas pruebas se llevaron a cabo en la estación de mejora vegetal de Nunhems en Águilas (España), en una zona fuertemente afectada por el TYLCV, y cada planta individual fue puntuada en cuanto a resistencia al TYLCV y fenotipo de frutointenso.Los síntomas del TYLCV se puntuaron en una escala de 0 a 4, en la que 0 indica individuos asintomáticos y 4 indica plantas no reproductivas completamente infectadas. Dado que el híbrido es un tomate indeterminado, las variedades de control fueron en ambos ensayos también variedades comerciales indeterminadas: la variedad Anemon (Nunhems) se utilizó como control resistente al TYLCV y la variedad Durinta (Western Seeds) como control susceptible.
2.2 Resultados
El progenitor susceptible al TYLCV se vio fuertemente afectado por el virus y no produjo ningún fruto comercial (con una puntuación TYLCV = 4). El progenitor homocigótico resistente al TYLCV no presentaba síntomas del TYLCV (puntuación TYLCV = 0) y el híbrido NCIMB 41930 tampoco presentaba síntomas (puntuación TYLCV = 0), producía frutosintensoy produjo un rendimiento comparable al de las variedades comerciales resistentes.
Claims (6)
1. Una planta deSolanum lycopersiconque comprende un fenotipo de resistencia al TYLCV y un fenotipo de frutointenso,por el que el gel locular se sustituye por tejido carnoso, en la que dicha planta comprende al menos un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelointensoy un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento,
en la que dicho alelo que confiere resistencia al TYLCV es el aleloTy-1de S.chilense,en la que dicho cromosoma 6 recombinante es el cromosoma 6 recombinante tal como se encuentra en las semillas depositadas con el número de registro NCIMB 41930 o se deriva de dicho cromosoma 6 recombinante y en la que dicho fragmento de introgresión comprende un marcador específico del genoma de S.chilenseseleccionado del grupo que consiste en el marcador MSc05732-4 que puede detectarse utilizando los cebadores de PCR de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y la enzima de restricciónDdeI, el marcador cLEG-31-P16 que puede detectarse utilizando los cebadores de PCR de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 y la enzima de restricción Hae III, o cualquier marcador específico del genoma de S.chilensesituado entre estos dos marcadores.
2. La planta según la reivindicación 1, en la que dicha planta comprende dos cromosomas 6 recombinantes, cada uno de los cuales comprende el alelointensoy un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento.
3. La planta según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha planta es un híbrido F1.
4. Semillas a partir de las cuales puede cultivarse una planta según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Un fruto de tomate cosechado de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho fruto de tomate carece prácticamente de gel en las cavidades de las semillas.
6. Una célula vegetal, tejido o parte vegetal de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de una semilla según la reivindicación 4 que comprende al menos un cromosoma 6 recombinante que comprende el alelointensoy un fragmento de introgresión que comprende un alelo que confiere resistencia al TYLCV en configuración de acoplamiento.
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