ES2956509T3 - Conjugados de montelukast y péptidos - Google Patents

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ES2956509T3 ES19856467T ES19856467T ES2956509T3 ES 2956509 T3 ES2956509 T3 ES 2956509T3 ES 19856467 T ES19856467 T ES 19856467T ES 19856467 T ES19856467 T ES 19856467T ES 2956509 T3 ES2956509 T3 ES 2956509T3
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Ming Gu
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Abstract

Se proporciona un compuesto que contiene péptido que comprende un componente peptídico que es una secuencia de aminoácidos de 2 a 45 aminoácidos, cuyo componente peptídico está unido covalentemente a uno o más compuestos de fórmula (I), en la que: se selecciona R1 del grupo formado por -C(CH3)2OH, -COCH3, -C(CH3)=CH2 y -C(CH3)2H; yn es 0, 1 ó 2, así como regioisómeros, estereoisómeros y sales farmacéutica o cosméticamente aceptables de dicho compuesto que contiene péptido. El compuesto de fórmula I es preferentemente montelukast, montelukast estireno o montelukast estireno hidrogenado. El compuesto que contiene péptido es particularmente útil en el tratamiento de la inflamación, incluyendo heridas, hemorroides, quemaduras, psoriasis, acné, dermatitis atópica, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad inflamatoria intestinal (tal como colitis ulcerosa). El compuesto que contiene péptido también es útil en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de montelukast y péptidos
Campo de la invención
Esta invención se refiere a conjugados de un compuesto antiinflamatorio conocido unido covalentemente a secuencias peptídicas específicas, como se define en las reivindicaciones, al uso de tales conjugados en medicina humana, como se define en las reivindicaciones, y a composiciones farmacéuticas que los comprenden, como se define en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere al uso de esos conjugados y composiciones en el tratamiento de la inflamación, como se define en las reivindicaciones.
Antecedentes y estado de la técnica
La inflamación se caracteriza típicamente como una respuesta tisular localizada a, por ejemplo, la invasión de microorganismos, ciertos antígenos, células dañadas o factores físicos y/o químicos. La respuesta inflamatoria es normalmente un mecanismo protector que sirve para destruir, diluir o secuestrar tanto el agente nocivo como el tejido lesionado, así como para iniciar la curación del tejido.
La inflamación puede ser el resultado de un trauma físico, infección, algunas enfermedades crónicas (por ejemplo, psoriasis y enfermedades autoinmunitarias, tal como artritis reumatoide) y/o reacciones químicas y/o fisiológicas a estímulos externos (por ejemplo, como parte de una respuesta alérgica). Puede participar una serie compleja de eventos, en los que los mediadores inflamatorios aumentan el flujo sanguíneo y la dilatación de los vasos sanguíneos locales, lo que resulta en enrojecimiento y calor, la exudación de fluidos, que a menudo resulta en hinchazón localizada, migración leucocítica al área inflamada, y dolor.
Muchas afecciones/trastornos se caracterizan y/o tienen como causa una inflamación anormal, que daña los tejidos. Tales afecciones se caracterizan típicamente por la activación de mecanismos de defensa inmunitaria, que resulta en un efecto que es más dañino que beneficioso para el huésped, y generalmente se asocia con diversos grados de hiperemia o enrojecimiento tisular, hinchazón, hipertermia, dolor, picazón, muerte celular, destrucción de tejidos, proliferación celular y/o pérdida de función. Los ejemplos incluyen enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, glomerulonefritis y rechazo a trasplantes.
Típicamente, una serie compleja de eventos produce cambios inflamatorios tales como un aumento del flujo sanguíneo a través de la dilatación de vasos sanguíneos locales, lo que resulta en enrojecimiento y calor, la extravasación de leucocitos y plasma, que a menudo resulta en hinchazón localizada, activación de los nervios sensoriales (que resulta en dolor en algunos tejidos) y pérdida de función. Estos cambios inflamatorios se desencadenan por una cascada de eventos celulares y bioquímicos en los que participan células como neutrófilos, monocitos, macrófagos y linfocitos junto con mediadores inflamatorios tales como aminas vasoactivas, citocinas, factores del complemento y especies reactivas del oxígeno.
Entre otras cosas, la inflamación desempeña una función clave en el proceso de cicatrización de heridas. Por lo tanto las heridas y las quemaduras pueden clasificarse como afecciones con las que se asocia la inflamación. El pensamiento tradicional en la técnica es que los fármacos antiinflamatorios no deben aplicarse directamente a las heridas abiertas, ya que esto sería perjudicial para el progreso de cicatrización de heridas.
Montelukast es un compuesto inmunomodulador no esteroideo activo oralmente que se administra perioralmente al tracto gastrointestinal para el tratamiento de mantenimiento y la prevención de síntomas de alergias estacionales (ver, por ejemplo, Hon et al, Drug Design, Development and Therapy, 8, 839 (2014)). Actúa mediante el bloqueo de la acción de, principalmente, leucotrienos D4 (así como leucotrienos C4 y E4) en el receptor cisteinal de leucotrienos CysLT1 en las vías respiratorias.
Las solicitudes de patente internacional WO 02/34237 y WO 2003/020200 describen agentes activos unidos covalentemente a polipéptidos, más específicamente homo y heteropolímeros de aminoácidos naturales y/o sintéticos. El documento EP 3 326 639 A1 divulga que la proteína adhesiva de mejillón (MAP) suprime la inflamación cutánea mientras que Ahn Jung-Mo et al (Immunological Investigations, (2018), 1-13) divulga que la MAP conjugada con vitronectina induce la actividad antiinflamatoria.
Sener et al, Burns, 31, (2005), 587-596 divulga que montelukast administrado de forma sistémica puede disminuir la respuesta inflamatoria a las quemaduras infligidas a la piel en un modelo animal.
Previamente, hemos descubierto, inesperadamente, que montelukast muestra un efecto antiinflamatorio cuando se administra localmente, por ejemplo, tópicamente, por ejemplo en la piel (véase la solicitud de patente internacional no publicada PCT/CN2018/094441). Ahora hemos descubierto que el montelukast acoplado covalentemente a ciertas secuencias de aminoácidos da lugar a nuevos compuestos que son de uso potencial en diversas afecciones, incluido el tratamiento tópico de afecciones de la piel tales como inflamación y heridas.
Descripción de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento, diagnóstico o cirugía se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento, diagnóstico o cirugía del cuerpo humano o animal.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto que contiene péptido que comprende un componente peptídico como se define en lo sucesivo en el presente documento, cuyo componente peptídico está unido covalentemente a uno o más compuestos de fórmula I:
Figure imgf000003_0001
en donde:
R1 se selecciona del grupo que consiste en C(CH3)2OH, -COCH3, -C(CH3)=CH2 y -C(CH3)2H; y
n es 0, 1 o 2,
así como regioisómeros, estereoisómeros y sales farmacéutica o cosméticamente aceptables de dicho compuesto que contiene péptido,
cuyos compuestos que contienen péptidos, regioisómeros, estereoisómeros y sales se denominan juntos en lo sucesivo en la presente descripción como "los compuestos de la invención".
Los compuestos de la invención contienen al menos un enlace amida primario a través del cual uno o más compuestos de fórmula I se acoplan al componente peptídico. El enlace amida se mediante la reacción del grupo o grupos ácido carboxílico en el uno o más compuestos de fórmula I con uno o más grupos -NH2 libres en el componente peptídico. El enlace amida puede formarse en el grupo -NH2 del extremo N-terminal y/o a través de uno o más de otros grupos -NH2 libres en los aminoácidos que están presentes en la secuencia peptídica.
Se prefiere en consecuencia que al menos uno de los aminoácidos en el componente peptídico en un compuesto de la invención comprenda un grupo cargado positivamente (es decir, un grupo -NH2 libre) que no sea el extremo N-terminal. Los aminoácidos en el componente peptídico de los compuestos de la invención pueden ser aminoácidos naturales (pero no necesariamente proteinogénicos) y/o aminoácidos sintéticos. Preferentemente, los aminoácidos del componente peptídico son aminoácidos de origen natural.
Por ejemplo, al menos uno de los aminoácidos que no está presente en el extremo N-terminal del componente peptídico puede comprender lisina (Lys).
A este respecto, se prefiere que al menos aproximadamente el 5 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 10 %, tal como al menos aproximadamente el 15 %, que incluye al menos aproximadamente el 20 % (en número y/o en peso) de los aminoácidos que están presentes en el componente peptídico comprenden tales aminoácidos (es decir, Lys).
El componente peptídico de los compuestos de la invención es un heteropolímero de al menos cuatro aminoácidos diferentes, con la máxima preferencia al menos cinco aminoácidos diferentes.
Las secuencias de aminoácidos que se pueden mencionar incluyen fragmentos de la proteína adhesiva del mejillón (MAP), también conocida como proteína del pie Mytilus edulis (mefp), que es una proteína secretada por especies de mariscos marinos, tales como Mytilus edulis, Mytilus coruscus y Perna viridis, incluidos los once subtipos de proteínas adhesivas separados identificados que se han derivado de los mejillones, que incluyen los colágenos pre-COL-P, pre-COL-D y pre-COL-NG; las proteínas de la matriz del pie del mejillón PTMP (proteína de la matriz del hilo proximal) y DTMP (proteína de la matriz del hilo proximal distal); y proteínas mfp mfp-2 (a veces denominadas "mefp-2", en lo sucesivo en el presente documento se usa indistintamente), mfp-3/mefp-3, mfp-4/mefp-4, mfp-5/mefp-5, mfp-6/mefp-6 y, con la máxima preferencia mfp-1/mefp-1 (véase, por ejemplo, Zhu et al, Advances in Marine Science, 32, 560 (2014) y Gao et al, Journal of Anhui Agr. Sci., 39, 19860 (2011)).
Una porción significativa de mefp-1 consiste en de 70 a 90 repeticiones en tándem del decapéptido: Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SeQ ID No: 4; véase Waite, Int. J. Adhesión and Adhesives, 7, 9 (1987)). Esta secuencia decapéptido puede aislarse como un derivado de bajo peso molecular de las MAP de origen natural o puede sintetizarse, por ejemplo, según lo descrito por Yamamoto en J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 613 (1987). Ver, además, Dalsin et al, J. Am. Chem Soc., 125, 4253 (2003).
Se proporciona además un compuesto que contiene péptido como se define anteriormente en el que al menos aproximadamente el 5%, tal como al menos aproximadamente el 10% (en número) de los aminoácidos en el componente peptídico contienen grupos aromáticos, tales como tirosina y/o 3, 4-dihidroxifenilalanina (DOPA). Alternativamente, ninguno de los aminoácidos de la cadena peptídica contiene grupos aromáticos, es decir, ninguno de los aminoácidos es tirosina y/o DOPA.
Se prefiere además que el componente peptídico dentro de un compuesto de la invención comprenda entre 5 y 12 tal como 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos.
Los compuestos de la invención que pueden mencionarse a este respecto incluyen aquellos en los que el componente peptídico es de la secuencia de aminoácidos:
X-Pro-Y-Z (SEQ ID No: 5),
en donde:
X representa una cadena de 1 a 2 residuos de aminoácidos, cada uno de los cuales se selecciona independientemente del grupo que consiste en Ala y Lys;
Y se selecciona del grupo que consiste en Ser y pSer;
Z representa una cadena de 1 (por ejemplo, 2, tal como 3) a 7 residuos de aminoácidos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en Tyr, pTyr, Hyp (es decir, 3Hyp o 4Hyp), Thr, pThr, DOPA y Lys; y al menos uno de los residuos Ala y/o Lys está unido a uno o más compuestos de fórmula I, como se ha definido anteriormente.
Una secuencia de aminoácidos particular que puede mencionarse es Ala-Pro-Ser-Hyp-Hyp-Thr (SEQ ID No: 6).
Los compuestos preferidos de la invención que pueden mencionarse incluyen aquellos en los que el componente peptídico es de la secuencia de aminoácidos:
G1-Lys-Pro-G2-T-Hyp-G3-Lys (SEQ ID No: 7),
en donde:
G1 está ausente o representa Ala;
G2 se selecciona del grupo que consiste en Ser y pSer;
T se selecciona del grupo que consiste en DOPA o, más preferentemente, Tyr y pTyr;
Hyp se selecciona del grupo que consiste en 3Hyp y 4Hyp;
G3 representa una cadena de 1 a 4 (por ejemplo 1 a 3) residuos de aminoácidos cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr y DOPA; y
al menos uno de los residuos de Lys, y/o, donde está presente, el residuo de Ala, está unido a uno o más compuestos de fórmula I, como se ha definido anteriormente.
Los componentes peptídicos que pueden mencionarse incluyen los de la secuencia de aminoácidos:
Lys-Pro-G2-T-Hyp-G3-Lys (SEQ ID No: 8),
en donde G2, T, Hyp y G3 se definen anteriormente, G2 es más preferentemente Ser y G3 es más preferentemente Tyr o, especialmente, d OpA.
Sin embargo, se prefiere además que:
G1 represente Ala;
G2 represente Ser;
T represente Tyr;
G3 represente de 1 a 4 (por ejemplo, de 1 a 3) residuos de aminoácidos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en Tyr, 3Hyp, 4Hyp y Thr, tal como la cadena de aminoácidos está representada por -V1-Thr-Tyr-V2-, en donde V1 está unido a Hyp y V2 está unido a Lys, y V1 y V2 están, independientemente, ausentes o representan uno o dos grupos Hyp.
A este respecto, la secuencia -V1-Thr-Tyr-V2 puede representarse, en orden creciente de preferencia, por las secuencias parciales:
-Hyp-Thr-Tyr--Hyp-Thr-Tyr-Hyp- o,
-Thr-Tyr-Hyp-.
Por tanto, los componentes peptídicos preferidos incluyen los de la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-G2-T-Hyp-Hyp-Thr-G4-Lys (SEQ ID No: 9),
en donde G2, T e Hyp se definieron anteriormente y G4 se selecciona del grupo que consiste en Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr y DOPA, con G2 que es más preferentemente Ser, T es más preferentemente Tyr y G4 es más preferentemente Tyr o DOPA.
Los componentes peptídicos preferidos incluyen además los de la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-G2-T-Hyp-Thr-G4-Hyp-Lys (SEQ ID No: 10),
en donde G2, T, Hyp y G4 se definieron anteriormente, con G4 que es más preferentemente DOPA o, especialmente, Tyr. Los componentes peptídicos preferidos incluyen los de la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 4);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 11);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 12);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 13);
Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID No: 14) y
Lys-Pro-Ser-pTyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID No: 15).
En la lista anterior de secuencias de aminoácidos, la más preferida es Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 12).
Otros componentes peptídicos preferidos incluyen los de la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 16) y
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 17).
Otros componentes peptídicos preferidos incluyen los de la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 18);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 19);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 20);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 21);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 22),
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 23);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 24);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 25);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 26) y
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 27).
En la lista anterior de secuencias de aminoácidos, la más preferida es Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 24).
Otros componentes peptídicos preferidos incluyen los de la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA(SEQ ID No: 28);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA (SEQ ID No: 29);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr (SeQ ID No: 30);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr (SEQ ID No: 31);
Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-DOPA (SEQ ID No: 32);
Lys-Pro-Ser-pTyr-Hyp-DOPA(SEQ ID No: 33);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA (SEQ ID No: 34);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr (SEQ ID No: 35);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID No: 36);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID No: 37);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SeQ ID No: 38);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID No: 39);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID No: 40),
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID No: 41);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID No: 42);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID No: 43);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA-Hyp (SEQ ID No: 44);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr-Hyp (SEQ ID No: 45);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp (SEQ ID No: 46) y
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp (SEQ ID No: 47).
El experto en la materia apreciará que los metabolitos de los compuestos de la invención que pueden formarse después de la administración están incluidos dentro del alcance de la invención.
En particular, los compuestos de la invención que comprenden componentes peptídicos con secuencias de aminoácidos de SEQ ID No: 28 a SEQ ID No: 47 pueden formarse como metabolitos de los correspondientes compuestos de la invención que comprenden aminoácidos relevantes en el extremo C-terminal, que pueden escindirse de otros compuestos de la invención después de la administración.
Por ejemplo, los compuestos de la invención que comprenden componentes peptídicos con secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 30, SEQ ID No: 46 y SEQ ID No: 47 pueden formarse como metabolitos de los compuestos de la invención que comprenden componentes peptídicos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 12. De manera similar, los compuestos de la invención que comprenden componentes peptídicos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 42 y SEQ ID No: 47 pueden formarse como metabolitos de los compuestos de la invención que comprenden componentes peptídicos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 24.
Sin embargo, los compuestos de la invención que comprenden componentes peptídicos con secuencias de aminoácidos de SEQ ID No: 28 a SEQ ID No: 47 también son compuestos de la invención por derecho propio y pueden prepararse, formularse y administrarse a pacientes exactamente de la misma manera que otros compuestos de la invención que se describen en la presente descripción y/o se ilustran a continuación.
Para evitar dudas, como se usa en la presente descripción, Pro representa prolina, Ala representa alanina, Ser representa serina y pSer representa fosfoserina, Tyr representa tirosina, pTyr representa fosfotirosina, Hyp representa hidroxiprolina (3Hyp representa 3-hidroxiprolina y 4Hyp representa 4-hidroxiprolina). Thr representa treonina, pThr representa fosfotreonina (o fosfonotreonina) y Lys, Ala y DOPA son como se definieron anteriormente. Los derivados fosfonados de aminoácidos que comprenden un grupo hidroxi libre (por ejemplo, Ser, Tyr y Thr) comprenden el grupo OP(=O)(OH)2 en lugar de -OH.
Uno o más compuestos de fórmula I pueden unirse al componente peptídico mencionado anteriormente mediante uno o más, por ejemplo, restos Ala o Lys, que incluye a través de un resto Ala o Lys N-terminal y/o un resto Lys C-terminal. Tres compuestos de fórmula I, preferentemente dos compuestos de fórmula I, y más preferentemente un compuesto de fórmula I pueden unirse covalentemente al componente peptídico mencionado anteriormente en un compuesto de la invención.
Es ventajoso que el componente peptídico de los compuestos de la invención comprenda al menos un residuo de aminoácido que contiene al menos un grupo libre -NH2. Los residuos de aminoácidos particulares que contienen al menos un grupo -NH2 libre incluyen Lys. Por ejemplo, cuando el componente peptídico es una secuencia de G1-Lys-Pro-G2-T-Hyp-G3-Lys (SEQ ID No: 7), al menos uno de los residuos de Lys tiene un grupo -NH2 libre (es decir, al menos uno de los residuos de Lys no está unido covalentemente a un compuesto del grupo de fórmula I).
En los ejemplos de los compuestos de la invención donde dos o más (por ejemplo, tres, preferentemente dos) compuestos de fórmula I están unidos covalentemente al componente peptídico, se prefiere que el componente peptídico comprenda al menos un residuo de aminoácido que contenga al menos un grupo -NH2 libre. Por ejemplo, el componente peptídico comprende al menos un residuo de Lys que no está unido covalentemente a un compuesto de fórmula I.
Sin desear estar ligado por la teoría, se cree que la presencia de grupos -NH2 libres en el componente peptídico (por ejemplo, cuando uno o más de los residuos de Lys que pueden estar presentes no están unidos covalentemente a un compuesto de fórmula I) es beneficioso para la solubilidad (por ejemplo, acuosa) de los compuestos de la invención.
Los compuestos de fórmula I contienen un doble enlace y, por tanto, pueden existir como isómeros geométricos E (entgegen) y Z (zusammen) alrededor del doble enlace. Todos estos isómeros y las mezclas de estos se incluyen dentro del alcance de la invención. Para evitar dudas, en los compuestos de fórmula I indica que el anillo de 7­ cloroquinolina puede estar ubicado cis (como el isómero geométrico Z) o trans (como el isómero geométrico E) a través del doble enlace al anillo de fenilo 1,3-disustituido central. Preferentemente, el anillo de 7-cloroquinolina está ubicado en trans a través del doble enlace al anillo de fenilo 1,3-disustituido central, es decir, el isómero geométrico E.
Los compuestos particulares de fórmula I que pueden mencionarse incluyen aquellos en los que R1 se selecciona del grupo que consiste en -C(CH3)2OH, -COCH3 y -C(CH3)=CH2.
Los compuestos preferidos de fórmula I incluyen aquellos en los que R1 es -C(CH3)2OH y/o n es 0 (por ejemplo, montelukast).
Para evitar dudas, montelukast tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000007_0001
Otros compuestos de fórmula I incluyen aquellos en los que R1 es -C(CH3)=CH2 y/o n es 0 (por ejemplo, montelukast estireno).
Para evitar dudas, montelukast estireno tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000007_0002
Otros compuestos de fórmula I que pueden mencionarse incluyen aquellos en los que R1 es -C(CH3)2H y/o n es 0 (por ejemplo, montelukast estireno hidrogenado).
Para evitar dudas, el montelukast estireno hidrogenado tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000008_0001
Los compuestos de la invención, ya sea en forma de sales o de otra manera, incluyen regioisómeros dentro de los aminoácidos del componente peptídico (por ejemplo, restos Hyp y Tyr), así como mezclas de tales regioisómeros. Por ejemplo, dentro de la definición de Tyr se incluyen no solo tirosina (4-hidroxifenilalanina), sino también 2- y 3-hidroxifenilalanina, y se incluyen dentro de la definición de Hyp la 4-hidroxiprolina (4Hyp), 3-hidroxiprolina (3Hyp) y 5-hidroxiprolina (5Hyp). Se prefiere más que los residuos de Hyp sean 4-hidroxiprolina.
Además, adicionalmente al átomo de carbono central estándar de los aminoácidos en el componente peptídico de los compuestos de la invención (que normalmente, pero no exclusivamente, están en la configuración L), ciertos aminoácidos de la secuencia comprenden átomos de carbono quirales adicionales. Todos estos estereoisómeros y las mezclas de estos (que incluyen las mezclas racémicas) se incluyen dentro del alcance de la invención. Al respecto, dentro de la definición de Hyp se incluyen trans-4-hidroxi-L-prolina, cis-4-hidroxi-L-prolina, trans-3-hidroxi-L-prolina, cis-3-hidroxi-L-prolina, trans-5-hidroxi-L-prolina y cis-5-hidroxi-L-prolina, sin embargo se prefiere que el Hyp que se emplea en los compuestos de la invención sea 4-hidroxi-L-prolina. De manera similar, los enantiómeros individuales de los compuestos de fórmula I que pueden formar parte de un compuesto de la invención se incluyen dentro del alcance de la invención.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma de sales. Las sales que pueden mencionarse incluyen sales farmacéuticamente aceptables y/o cosméticamente aceptables, tales como sales de adición de ácidos y sales de adición de bases farmacéuticamente y/o cosméticamente aceptables. Tales sales pueden formarse por medios convencionales, por ejemplo, por reacción de un compuesto de la invención con uno o más equivalentes de un ácido o base apropiado, opcionalmente en un solvente, o en un medio en que la sal sea insoluble, seguido de la eliminación de dicho solvente, o dicho medio, usando de técnicas estándar (por ejemplo, al vacío, por liofilización o por filtración). Las sales pueden prepararse, además, mediante el intercambio de un contraión de un principio activo en la forma de una sal con otro contraión, por ejemplo, usando de una resina de intercambio iónico adecuada.
Las sales preferidas incluyen, por ejemplo, acetato, clorhidrato, bisulfato, maleato, mesilato, tosilato, sales de metales alcalinotérreos, tales como calcio y magnesio, o sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y potasio. Con la máxima preferencia, los compuestos de la invención pueden estar en forma de sales de acetato.
Los compuestos de la invención pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, puede prepararse un compuesto de la invención por acoplamiento de uno o más compuestos de fórmula I al componente peptídico, por ejemplo, como se describe en lo sucesivo en el presente documento. Los compuestos de la invención (y los componentes peptídicos de estos) pueden sintetizarse a partir de materiales de partida disponibles usando reactivos y condiciones de reacción apropiados. En este sentido, el experto puede referirse, entre otros, a “Comprehensive Organic Synthesis" de B. M. Trost e I. Fleming, Pergamon Press, 1991. Otras referencias que pueden emplearse incluyen “Heterocyclic Chemistry’’ de J. A. Joule, K. Mills y G. F. Smith, 3a edición, publicado por Chapman y Hall, “Comprehensive Heterocyclic Chemistry II” de A. R. Katritzky, C. W. Rees y E. F. V. Scriven, Pergamon Press, 1996 y “Science of Synthesis”, volúmenes 9-17 (Hetarenes and Related Ring Systems), Georg Thieme Verlag, 2006.
El componente peptídico de la invención puede, si es necesario, prepararse mediante técnicas estándar de síntesis de péptidos, usando técnicas de acoplamiento de aminoácidos estándar y reactivos y solventes de acoplamiento estándar, por ejemplo, como se describe a continuación.
El experto comprenderá que los sustituyentes como se definen en el presente documento, y los sustituyentes de estos, pueden modificarse una o más veces, después o durante los procesos descritos anteriormente para la preparación de los compuestos de la invención mediante los métodos que conocen bien los expertos en la técnica. Los ejemplos de tales métodos incluyen sustituciones, reducciones, oxidaciones, deshidrogenaciones, alquilaciones, desalquilaciones, acilaciones, hidrólisis, esterificaciones, eterificaciones, halogenaciones y nitraciones. Los grupos precursores pueden cambiarse a un grupo diferente, o a los grupos definidos en un compuesto de la invención, en cualquier momento durante la secuencia de reacción. El experto también puede hacer referencia a "Comprehensive Organic Functional Group Transformations" de A. R. Katritzky, O. Meth-Cohn y C. W. Rees, Pergamon Press, 1995 y/o “Comprehensive Organic Transformations’’ de R. C. Larock, Wiley-VCH, 1999.
Los compuestos de la invención pueden aislarse de sus mezclas de reacción y, si es necesario, pueden purificarse mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Por lo tanto, los procesos para la preparación de los compuestos de la invención descritos en la presente descripción pueden incluir, como una etapa final, el aislamiento y, opcionalmente, la purificación del compuesto de la invención.
Los expertos en la técnica apreciarán que, en los procesos descritos anteriormente y a continuación, los grupos funcionales de los compuestos intermedios pueden necesitar protección mediante grupos protectores. La protección y desprotección de los grupos funcionales puede tener lugar antes o después de una reacción en los esquemas mencionados anteriormente.
Los grupos protectores pueden aplicarse y retirarse de acuerdo con técnicas que conocen bien los expertos en la técnica y como se describe a continuación. Por ejemplo, los compuestos/productos intermedios protegidos descritos en el presente documento pueden convertirse químicamente en compuestos desprotegidos usando técnicas de desprotección estándar. El tipo de química involucrada indicará la necesidad y el tipo de grupos protectores así como la secuencia para lograr la síntesis. El uso de grupos protectores se describe completamente en “Protective Groups in Organic Synthesis”, 3a edición, T.W. Greene & PGM. Wutz, Wiley-Interscience (1999).
Los compuestos de la invención son útiles porque poseen actividad farmacológica. Por tanto, los compuestos de la invención son útiles como medicina humana y animal. Por tanto, están indicados como productos farmacéuticos (y/o en la ciencia veterinaria), aunque también pueden usarse como cosméticos y/o como parte de un dispositivo médico.
A pesar de que los compuestos de la invención pueden tener actividad farmacológica como tales, algunos derivados farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, "protegidos”) de los compuestos de la invención pueden existir o prepararse de modo que no tengan dicha actividad, pero que pueden administrarse y posteriormente metabolizarse o transformarse químicamente para formar los compuestos de la invención. Tales compuestos (que pueden poseer alguna actividad farmacológica, siempre que dicha actividad sea apreciablemente menor que la de los compuestos activos a los que se metabolizan/transforman) pueden por lo tanto describirse como "profármacos" de los compuestos de la invención, pero no son parte de la invención.
Como se usa en el presente documento, las referencias a los profármacos incluirán los compuestos que forman un compuesto de la invención, en una cantidad detectable experimentalmente, dentro de un tiempo predeterminado, después de la administración.
Los compuestos de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de la inflamación.
El "tratamiento de la inflamación” incluye el tratamiento de la inflamación en cualquier órgano del cuerpo (que incluyen los tejidos blandos, articulaciones, nervios, el sistema vascular, órganos internos, especialmente superficies mucosas y, particularmente, la piel), independientemente de la causa e incluye, además, todos los trastornos o afecciones inflamatorias y/o trastornos o afecciones caracterizadas por inflamación (por ejemplo, como un síntoma).
Las afecciones inflamatorias pueden caracterizarse (y típicamente se caracterizan) por la activación de mecanismos de defensa inmunitaria, lo que resulta en un efecto que es más dañino que beneficioso para el huésped. Tales afecciones generalmente se asocian con diversos grados de enrojecimiento o hiperemia tisular, hinchazón, edema, hipertermia, dolor (que incluye sufrimiento), exudación de fluidos corporales, picazón (prurito), muerte celular y destrucción de tejidos, proliferación celular y/o pérdida de la función.
Las afecciones inflamatorias que pueden mencionarse incluyen arteritis, diabetes mellitus, síndrome metabólico, rosácea, asma y alergia, espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis gotosa, enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), esclerosis múltiple, osteoartritis, pancreatitis, prostatitis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, tendinitis, bursitis, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, uveítis, urticaria, vasculitis, mastocitosis, complicaciones vasculares diabéticas, migraña, aterosclerosis y trastornos cardiovasculares asociados. Una patología caracterizada por inflamación que puede mencionarse es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Otra patología caracterizada por inflamación que puede mencionarse son las enfermedades inflamatorias del intestino que incluyen la enfermedad de Crohn y, especialmente, la colitis ulcerosa. Las afecciones inflamatorias que pueden mencionarse más especialmente incluyen inflamaciones de la piel o la mucosa (que incluyen las mucosas oral, nasal, ocular, vaginal, cervical y/o anorrectal, más particularmente las mucosas oral o nasal), tal como la inflamación resultante de infecciones (tales como infecciones virales y/o bacterianas), o afecciones alérgicas/atópicas (tales como rinitis (por ejemplo, rinitis alérgica), faringitis, periodontitis, gingivitis, xeroftalmia, conjuntivitis (por ejemplo, conjuntivitis alérgica), dermatitis, urticaria (ronchas) y alergia alimentaria); y otras afecciones inflamatorias, tales como herpes, erupciones por fármacos, erupciones polimorfas leves, quemaduras solares, manifestaciones tempranas de cánceres de piel (lesiones cutáneas similares a eritema), pérdida de cabello patológica (que incluye las que siguen a un injerto de piel), sarpullido por quimioterapia, psoriasis, eritema multiforme, foliculitis, eccema y otitis externa. Un estado patológico que puede mencionarse son las erupciones polimorfas leves.
Más particularmente, los compuestos pueden usarse para tratar ciertas afecciones caracterizadas por inflamación y/o con las cuales se asocia la inflamación. Tales afecciones pueden incluir heridas (que incluyen abrasiones (rasguños), incisiones (que incluyen incisiones quirúrgicas), laceraciones, punciones, avulsiones, hematomas y cicatrices), y quemaduras (que incluyen la inflamación resultante de la cirugía después de quemaduras, tal como injertos de piel), y otras afecciones, tales como las hemorroides. Las heridas pueden ser agudas o crónicas y/o pueden resultar de uno o más trastornos inflamatorios como se define en el presente documento.
Las heridas de la piel o la mucosa pueden surgir a partir de una lesión física interna o externa en la superficie de la membrana, o pueden tener como causa (es decir, ser un síntoma de) un trastorno fisiológico subyacente.
Las heridas físicas (por ejemplo, “abiertas”) pueden tener como causa objetos afilados (cortes, incisiones, punciones) u objetos contundentes/fuerzas mecánicas (laceraciones, abrasiones, avulsiones), golpes físicos (contusiones), calor o productos químicos (quemaduras y ampollas), luz UV (quemaduras solares), frío (sabañones o congelación). Las heridas pueden ser superficiales (daño solamente en la epidermis y/o dermis) o pueden ser heridas de espesor completo (daño debajo de la epidermis y/o dermis). En casos graves, pueden dañarse tejidos subcutáneos y/o submucosos, tales como músculos, huesos, articulaciones, e incluso órganos internos.
Los compuestos de la invención pueden usarse para aliviar el dolor (que incluye sufrimiento) asociado con la inflamación y/o las heridas. En particular, los compuestos de la invención pueden usarse para aliviar el dolor de procedimiento y/o el dolor no relacionado con procedimiento. El experto comprenderá que la expresión "dolor de procedimiento" (es decir, dolor de operación) se refiere al dolor agudo que está asociado con investigaciones médicas y tratamientos realizados con fines de atención médica. La expresión "no relacionado con procedimiento" se refiere al dolor general que está asociado con inflamación y/o heridas (por ejemplo, dolor asociado con úlceras dentales, quemaduras y/o cicatrices) y no es una consecuencia de una intervención médica particular.
Los compuestos de la invención pueden usarse para tratar no solamente la inflamación, el dolor (que incluye sufrimiento) y/o el prurito (picazón) asociados con la propia herida y el proceso de curación, sino que pueden usarse, además, para prevenir la exudación de fluidos corporales de las heridas, el riesgo de infección, y, además, en la prevención de reacciones fisiológicas que resultan de la inflamación y/o procesos de curación de heridas, tales como la cicatrización y la pigmentación por la melanina.
La cicatrización es una consecuencia de la inflamación y/o curación de heridas y es un término general para la formación de tejido fibrótico que es consecuencia de tal inflamación/curación.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles, además, en la supresión de la producción de pigmentación por la melanina que puede o no resultar de la inflamación y/o la curación de heridas. Los compuestos de la invención pueden ser útiles, además, en la supresión de trastornos asociados con la pigmentación por la melanina, tales como cloasma, pecas, melanosis, sarpullido malar y otras cromatosis, cánceres de piel con melanoma y cromatosis causada por la exposición al sol o enfermedades de la piel como el acné.
Las heridas pueden surgir, además, como consecuencia de enfermedades o trastornos (por ejemplo, inflamatorios). Tales heridas pueden incluir ampollas y/o úlceras de la piel y la mucosa. Estas son afecciones comunes que a menudo son duraderas y difíciles de tratar. Los tejidos de la piel a menudo pueden dañarse, eliminarse, licuarse, infectarse y/o necrotizarse. Las úlceras pueden tener consecuencias secundarias para la salud particularmente si se infectan, son difíciles de curar y son de tratamiento costoso. Además, pueden causar estrés psicológico significativo y pérdida económica a los pacientes, y afectan tanto el bienestar general como la calidad de vida.
Como alternativa, las afecciones o enfermedades inflamatorias de la piel en las que los compuestos de la invención encuentran utilidad particular incluyen psoriasis, acné, eccema y dermatitis, especialmente dermatitis alérgica/atópica, así como en el tratamiento de la inflamación de la mucosa caracterizada por rinitis, especialmente rinitis alérgica, hemorroides, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y colitis ulcerosa, por ejemplo.
La psoriasis es una enfermedad de la piel crónica, inflamatoria con una tendencia a la recurrencia (algunos pacientes nunca curan durante toda su vida). Las manifestaciones clínicas de la psoriasis incluyen principalmente eritema y escamas. Puede ocurrir en todo el cuerpo, pero se observa más comúnmente en el cuero cabelludo y las extremidades. El acné es una enfermedad de la piel crónica, inflamatoria, folicular (unidad pilosebácea), cuya ocurrencia se relaciona estrechamente con factores principales como hiperesteatosis, bloqueo de los conductos pilosebáceos (que incluyen comedones cerrados y abiertos), infección bacteriana y reacciones inflamatorias, que tiende a ocurrir durante la juventud, caracterizada por lesiones cutáneas multiformes en la cara. Por lo tanto el término acné incluye acné regular y acné rosácea (es decir, nariz de cobre).
El eccema es una reacción inflamatoria de la piel con picazón fuerte causada por una variedad de factores internos y externos. Tiene tres fases, aguda, subaguda, y crónica. En la fase aguda, existe una tendencia a la producción de exudados, mientras que la fase crónica incluye infiltración e hipertrofia. Las lesiones cutáneas a menudo pican y recurren fácilmente.
La dermatitis es una enfermedad cutánea común caracterizada por aspereza, enrojecimiento, picazón, eccema, y sequedad. Pequeños bultos, úlceras refractarias, y manchas pigmentadas causadas por dermatitis pueden, si no se tratan con prontitud, desarrollar carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, y melanoma maligno. La dermatitis puede tener como causa varios factores infecciosos o no infecciosos internos y externos, que incluyen sustancias (dermatitis de contacto) o alergia (dermatitis alérgica/atópica). Se incluye, además, dermatitis seborreica (eccema seborreico) y todas las formas de dermatitis dependiente de esteroides (que incluyen dermatitis seborreica sensible a la luz, dermatitis perioral, dermatitis similar a rosácea, rosácea de esteroides, rosácea inducida por esteroides, iatrosácea, dermatitis de esteroide que asemeja rosácea, dermatitis similar a rosácea inducida por corticosteroides tópicos y, más particularmente, dermatitis adictiva por corticosteroides facial (FCAD) o dermatitis dependiente de corticosteroides facial (FCDD), caracterizada por enrojecimiento, eritema, telangiectasia, atrofia, pápulas y/o pústulas en el área facial después del tratamiento a largo plazo con (que incluye el uso no controlado, abuso o mal uso de) corticosteroides tópicos; ver, por ejemplo, Xiao et al, J. Dermatol., 42, 697 (2015) y Lu et al, Clin. Exp. Dermatol., 35, 618 (2009)).
La rinitis es la irritación e inflamación de la membrana mucosa dentro de la nariz. Los síntomas comunes de la rinitis incluyen congestión nasal, secreción nasal, estornudos y goteo posnasal. El tipo más común de rinitis es la rinitis alérgica, causada por un alérgeno, como polen, polvo, moho o escamas de piel de ciertos animales. Se ha descubierto sorprendentemente que los pacientes con rinitis alérgica que fueron tratados con compuestos de la invención experimentaron un alivio del picor ocular, incluso cuando los compuestos de la invención se administraron por vía nasal (es decir, en la mucosa nasal).
Las hemorroides son hinchazones causadas por la inflamación de los vasos sanguíneos hemorroidales que se encuentran dentro o alrededor del recto y el ano. Los síntomas incluyen sangrado (es decir, heridas) después de defecar, prolapso de las hemorroides, secreción de moco y picazón, dolor, enrojecimiento e hinchazón en el área del ano. Se cree que las hemorroides son consecuencia de un aumento de la presión en el abdomen, por ejemplo, como resultado de estreñimiento o diarrea.
Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es el nombre de un grupo de afecciones pulmonares que causan dificultades respiratorias, incluido el enfisema (daño a los alvéolos) y bronquitis crónica (inflamación prolongada de las vías respiratorias). La EPOC ocurre cuando los pulmones se inflaman, dañan y estrechan. El daño a los pulmones habitualmente es irreversible y da como resultado una alteración del flujo de aire que entra y sale de los pulmones. Los síntomas de la EPOC incluyen dificultad para respirar, tos productiva, infecciones frecuentes del pecho y sibilancias persistentes. La causa más común de la enfermedad es fumar, aunque otros factores de riesgo incluyen altos niveles de contaminación del aire y exposición ocupacional al polvo, productos químicos y humos.
Los compuestos de la invención pueden tener efectos positivos en la mitigación del eritema, enrojecimiento e hinchazón, edema, ampollas, y penfigoide ampolloso causados por diversas afecciones que incluyen las mencionadas específicamente y de manera general en el presente documento, y pueden inhibir la exudación del fluido tisular subcutáneo, y suprimir la picazón y el dolor causados por tales afecciones inflamatorias.
Otras afecciones inflamatorias que pueden mencionarse incluyen:
(a) Inflamación de la mucosa, tal como mucositis oral, úlceras aftosas, otitis media, laringitis, traqueítis, esofagitis, gastritis, enteritis y enterocolitis (que incluye disentería bacilar, disentería amebiana crónica, esquistosomiasis, colitis ulcerosa no específica y enteritis regional), cervicitis y endocervicitis, endometritis, inflamación causada por lesión por inhalación y similar, así como inflamación de la mucosa asociada con cánceres, e infecciones (por ejemplo, infecciones virales, como el resfriado común o la gripe), que afectan las superficies mucosas, tales como aquellas en la cavidad oral, la nasofaringe, el oído, la garganta, la tráquea, el tracto gastrointestinal, el cuello uterino, etc.
(b) Inflamación ortopédica asociada con, por ejemplo, fracturas óseas, infección piogénica de huesos y articulaciones, inflamación causada por enfermedades óseas reumáticas, así como osteomielitis piogénica (aguda, crónica, localizada, esclerótica, postraumática), artritis piogénica; tumores óseos (osteoma, osteoma osteoide, condroma), quistes óseos, osteoclastoma, sarcoma óseo primario (osteosarcoma, condrosarcoma, osteofibrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma no Hodgkin, mieloma, cordoma), tumores óseos metastásicos, lesiones similares a tumores de huesos (quiste óseo, quiste óseo aneurismático, granuloma eosinofílico, displasia fibrosa); y artritis reumática.
(c) Inflamación de los nervios, tal como polineuritis periférica, neuritis facial, neuritis periférica, neuritis subcutánea, neuritis cubital, neuritis intercostal, etc.
(d) Inflamación de los tejidos blandos submucosos y subcutáneos, tal como miositis, ligamentitis, tendinitis, paniculitis, capsulitis, linfadenitis, bubonadentitis, amigdalitis, sinovitis, fascitis, e inflamación de los tejidos blandos causada por lesiones, contusión o laceración de músculos, ligamentos, fascia, tendones, membrana sinovial, grasa, cápsulas articulares, y tejido linfoide.
(e) Inflamación vascular, tal como vasculitis leucocitoclástica alérgica, vasculitis cutánea alérgica, poliarteritis nodosa, vasculitis trombótica, vasculitis granulomatosa, vasculitis linfocítica, vasculitis con anomalías en la composición sanguínea, y vasculitis reumática, así como inflamación vascular asociada con cánceres vasculares causados por vasculitis leucocitoclástica alérgica, poliarteritis nodosa, vasculitis trombótica, vasculitis granulomatosa, vasculitis linfocítica, vasculitis con anormalidades en la composición sanguínea, y vasculitis reumática.
(f) Inflamación de los órganos internos, tales como corazón, estómago, intestino, pulmón, hígado, bazo, riñón, páncreas, vejiga, ovario, y próstata, que incluyen miocarditis, endocarditis, neumonía, hepatitis, esplenitis, nefritis, pancreatitis, cistitis, ooforitis, prostatitis y tratamiento de úlcera gástrica.
(g) Inflamación del ojo y el área circundante, como conjuntivitis, queratitis (por ejemplo, queratitis epitelial aguda, queratitis numular, queratitis intersticial, queratitis disciforme, queratitis neurotrófica, queratitis de placa mucosa, queratitis por herpes simple, queratitis por herpes zóster, queratitis bacteriana, queratitis fúngica, queratitis por Acanthamoeba, queratitis oncocercal, queratitis punteada superficial, queratitis ulcerosa, queratitis por exposición, (fotoqueratitis y ojo rojo agudo por lentes de contacto), neuritis óptica, etc.
(h) Inflamación de las encías y de la cavidad bucal, como periodontitis, gingivitis, úlceras dentales, etc.
(i) Inflamación asociada con reumatismo, como vasculitis reumática, artritis reumatoide, enfermedades óseas reumáticas, espondilitis anquilosante, bursitis, enfermedad de Crohn, gota, artritis infecciosa, artritis idiopática juvenil, osteoartritis, osteoporosis, polimialgia reumática, polimiositis, artritis psoriásica, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, lupus eritematoso sistémico, tendinitis, etc.
Los compuestos de la invención también pueden usarse en el tratamiento de ciertas enfermedades específicas del sistema respiratorio, tales como fibrosis quística pulmonar, neumonía intersticial habitual, neumonía alérgica, asbestosis, enfisema, enfermedad cardíaca pulmonar, embolia pulmonar, etc. Una patología específica que puede mencionarse en la fibrosis pulmonar idiopática.
La fibrosis pulmonar idiopática es una enfermedad intersticial pulmonar difusa y letal con características patológicas que incluyen daño epitelial alveolar, proliferación masiva de fibroblastos pulmonares, depósito excesivo de matriz extracelular, que finalmente conduce a daño irreversible del tejido pulmonar. En las últimas etapas de la enfermedad, los sujetos con fibrosis pulmonar idiopática experimentan insuficiencia respiratoria y muerte. Se ha descubierto que los compuestos de la invención pueden encontrar utilidad en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática y/o el alivio de los síntomas asociados con la enfermedad.
Los compuestos de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de las siguientes afecciones pulmonares y/o fibróticas (ya sea que se mencionen o no, de otra manera en el presente documento): fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, silicosis, bronquitis aguda, bronquitis crónica, traqueobronquitis, asma bronquial, estado asmático, bronquiectasia, infecciones del tracto respiratorio superior, (que incluyen el resfriado común y la gripe), inflamación alérgica de las vías respiratorias, neumonía bacteriana, neumonía viral, neumonía por micoplasma, reckettsia, neumonía radiactiva, neumonía neumocócica (que incluye estafilococos, estreptococos y bacilos gramnegativos), candidiasis pulmonar (que incluye aspergilosis, mucormicosis, histoplasmosis, actinomicosis y nocardiosis), micosis pulmonar, criptococosis, abscesos pulmonares, neumonía anafiláctica (síndrome de Leoffer), alveolitis alérgica extrínseca, eosinofilia pulmonar (eosinofilosis), enfisema pulmonar obstructivo, edema pulmonar, tuberculosis pulmonar, alcalosis respiratoria (acidosis), lesión pulmonar aguda, enfermedad pulmonar intersticial, empiema, fibroma pulmonar y cor pulmonale.
Los trastornos y enfermedades de la mucosa particulares en los que los compuestos de la invención encuentran utilidad incluyen enfermedades anorrectales, tales como diarrea, hemorroides, abscesos, fístula, fisuras, prurito anal, sinusitis anal, verrugas y prolapso rectal; enfermedad inflamatoria del intestino, que incluye la enfermedad de Crohn y, en particular, colitis ulcerosa; enfermedades ginecológicas, como cervicitis, vaginitis, dolor y trastornos pélvicos; y enfermedades dentales, como paradentitis, por ejemplo.
Los compuestos de la invención pueden poseer además un efecto antioxidante, aumentando la producción de SOD (superóxido dismutasa) y reducir la oxidación de lípidos. Por lo tanto, puede considerarse que los compuestos de la invención tienen propiedades antioxidantes.
Los compuestos de la invención también pueden poseer propiedades antipiréticas que permitan el tratamiento de la fiebre y/o alivien los síntomas de esta; por ejemplo, reduciendo la temperatura corporal de un sujeto, lo que resulta en una reducción de la fiebre. Por lo tanto, los compuestos de la invención y las formulaciones que los incluyen pueden considerarse antipiréticos.
De acuerdo con un aspecto más de la invención se proporciona un método de tratamiento de la inflamación, de un trastorno inflamatorio, y/o de un trastorno/afección caracterizado por inflamación (por ejemplo, como síntoma), cuyo método comprende la administración de un compuesto de la invención a un paciente que necesite tal tratamiento.
Para evitar dudas, en el contexto de la presente invención, las expresiones “tratamiento”, “terapia” y “método de terapia” incluyen el tratamiento terapéutico, o paliativo de los pacientes que lo necesitan, así como el tratamiento profiláctico y/o diagnóstico de pacientes susceptibles a, inflamación y/o trastornos inflamatorios.
Los compuestos de la invención pueden poseer además propiedades antivirales que pueden permitir el tratamiento de una infección viral per se, es decir, el tratamiento de una infección viral, o una enfermedad viral, interfiriendo con la replicación del virus dentro de un huésped, en contraposición al tratamiento de cualquier síntoma de cualquier infección o enfermedad viral, como dolor y/o inflamación. Tales propiedades antivirales pueden permitir además la prevención de la aparición de dicha infección o enfermedad, la protección de las células en un huésped de una infección viral (por ejemplo, adicional), la prevención o detención de la propagación de una infección o enfermedad viral (dentro de un huésped único, o a partir de un huésped a un nuevo huésped), o para la prevención de la reactivación de un virus después de la latencia en un huésped.
De acuerdo con un aspecto más de la invención, se proporciona un método de tratamiento de una infección viral, cuyo método comprende la administración de un compuesto de la invención o una sal de este a un paciente que necesita tal tratamiento.
Las infecciones virales que pueden mencionarse incluyen las causadas por virus en las siguientes familias: adenoviridae (por ejemplo, adenovirus), papillomaviridae (por ejemplo, papilomavirus humano), poliomaviridae (por ejemplo, virus BK; virus JC), herpesviridae (por ejemplo, herpes simple, tipo 1; herpes simple, tipo 2; virus de la varicela-zóster; virus de Epstein-Barr; citomegalovirus humano; virus del herpes humano, tipo 8), poxviridae (por ejemplo, viruela), hepadnaviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis B), parvoviridae (por ejemplo, parvovirus B19), astroviridae (por ejemplo, astrovirus humano), caliciviridae (por ejemplo, norovirus; virus de Norwalk), picornaviridae (por ejemplo, coxsackievirus, virus de la hepatitis A; poliovirus; rinovirus), coronoviridae (por ejemplo, virus del síndrome respiratorio agudo severo), flaviviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C; virus de la fiebre amarilla; virus del dengue; Virus del Nilo Occidental; virus de la encefalitis transmitida por garrapatas), retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana; VIH), togaviridae (por ejemplo, virus de la rubéola), arenaviridae (por ejemplo, virus de Lassa), bunyaviridae (por ejemplo, hantavirus; virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo; virus Hantaan), filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola; virus de Marburg; Virus Ravn), ortomixoviridae (por ejemplo, virus de la influenza, que incluye el virus de la influenza A (por ejemplo, virus H1N1 y H3N2), virus de la influenza B o virus de la influenza C), paramixoviridae (por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la parainfluenza, virus sincicial respiratorio), rabdoviridae (por ejemplo, virus de la rabia), hepeviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis E), reoviridae (por ejemplo, rotavirus; orbivirus; coltivirus; virus de Banna), así como virus no asignados a familias, como el virus de la hepatitis D.
Los virus que pueden mencionarse más específicamente incluyen virus herpes simple, tipo 1 y herpes simple, tipo 2, virus del papiloma humano, virus de la influenza y virus de la parainfluenza.
Los compuestos de la invención pueden poseer además propiedades antibacterianas y/o bacteriostáticas que pueden permitir el tratamiento de una infección bacteriana per se, es decir, el tratamiento de una infección bacteriana o una enfermedad bacteriana, interfiriendo con el crecimiento o la proliferación bacteriana en un huésped, a diferencia del tratamiento de cualquier síntoma de cualquier infección o enfermedad bacteriana, como dolor y/o inflamación. Por lo tanto, los compuestos de la invención pueden considerarse agentes bactericidas y/o, preferentemente, bacteriostáticos. Tales propiedades antibacterianas pueden permitir además la prevención de la aparición de dicha infección o enfermedad, la protección de las células en un huésped de una infección bacteriana (por ejemplo, adicional), la prevención o detención de la propagación de una infección o enfermedad bacteriana (dentro de un huésped único, o de un huésped a un nuevo huésped), o para la prevención de la reactivación de una bacteria después de la latencia en un huésped.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de tratamiento de una infección bacteriana, cuyo método comprende la administración de un compuesto de la invención o una sal de este a un paciente que necesita dicho tratamiento.
Como se divulga en el presente documento, los compuestos de la invención pueden poseer además propiedades anticancerígenas que pueden permitir el tratamiento de un cáncer per se, es decir, el tratamiento de un cáncer interfiriendo con el cáncer en oposición al tratamiento de cualquier síntoma del cáncer, como dolor y/o inflamación. Tales propiedades anticancerígenas pueden incluir además la prevención de la aparición de dicha enfermedad, por ejemplo, tratando la inflamación y por consiguiente evitar dicha aparición.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de tratamiento del cáncer, cuyo método comprende la administración de un compuesto de la invención o una sal de este a un paciente que necesita dicho tratamiento.
Los cánceres particulares que pueden mencionarse incluyen cáncer oral, cáncer de nasofaringe, cáncer de oído medio, cáncer de conjuntiva, cáncer de garganta, cáncer de tráquea, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de piel y similares causados por mucositis oral, rinitis, otitis media, conjuntivitis, faringitis, laringitis, traqueítis, esofagitis, gastritis, enterocolitis, cervicitis, endometritis, lesiones cutáneas de tipo eritema y similares. Un cáncer de piel particular que puede mencionarse es el carcinoma de células basales.
Los “pacientes” incluyen pacientes reptiles, aves y, preferentemente, mamíferos (en particular seres humanos).
De acuerdo con la invención, los compuestos de la invención se administran, preferentemente, por vía local o sistémica, por ejemplo, por vía oral, intravenosa o intraarterial (que incluye por otras formas de dosificación/dispositivos perivasculares e intravasculares (por ejemplo, stents)), intramuscular, cutánea, subcutánea, transmucosal (por ejemplo, sublingual o bucal), rectal, intravaginal, transdérmica, nasal, pulmonar (por ejemplo, traqueal o bronquial), preferentemente tópica, o por cualquier otra vía parenteral, en forma de una preparación farmacéutica que comprende el o los compuestos en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables.
La administración por inhalación (por ejemplo, por vía nasal) es particularmente útil cuando la afección a tratar es rinitis o inflamación resultante de infecciones virales de las vías respiratorias (por ejemplo, infecciones del tracto respiratorio superior, como el resfriado común y la gripe).
La administración pulmonar es particularmente útil cuando la afección a tratar es EPOC o IPF. Las formas tópicas de administración pueden mejorarse mediante la creación de una pulverización que comprenda principios activos, por ejemplo, usando un aerosol en polvo o por una niebla acuosa usando una técnica o aparato de atomización apropiado, tal como un nebulizador.
La administración anorrectal es particularmente útil cuando la afección a tratar es hemorroides o colitis ulcerosa, usando un medio de administración apropiado, como una solución de espuma para inyectar o un supositorio.
La administración al tracto gastrointestinal inferior también puede lograrse mediante suministro parenteral, y particularmente perioral, por medio de técnicas estándar de recubrimiento de liberación retardada o prolongada conocidas por los expertos en la materia. En particular, pueden dirigirse a distintas partes del intestino superior o inferior. Por ejemplo, la administración colónica puede lograrse además por medio de suministro de fármacos dirigidos al colon que se administran inicialmente por vía perioral o parenteral.
Los modos de suministro preferidos de los compuestos de la invención incluyen por vía tópica al sitio de la inflamación (por ejemplo, las mucosas, que incluyen la mucosa oral y/o nasal, el pulmón, el área anorrectal y/o el colon o, más preferentemente, la piel) en un vehículo apropiado (por ejemplo, farmacéutica y tópicamente aceptable) adecuado para la aplicación a la piel y/o la superficie mucosa apropiada, y/o una formulación disponible en el mercado, pero puede incluir además la administración oral, intravenoso, cutáneo o subcutáneo, nasal, intramuscular, intraperitoneal o pulmonar.
Los compuestos de la invención generalmente se administrarán en forma de uno o más, por ejemplo, formulaciones farmacéuticas mezcladas con un adyuvante, diluyente o portador (por ejemplo, farmacéuticamente aceptable), que puede seleccionarse teniendo en cuenta la vía de administración deseada (por ejemplo, tópica a la mucosa relevante (que incluye el pulmón) o, preferentemente, la piel) y la práctica farmacéutica estándar u otra (por ejemplo, cosmética). Tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser químicamente inertes a los compuestos activos y pueden no tener efectos secundarios perjudiciales o toxicidad bajo las condiciones de uso. Tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden impartir además una liberación inmediata o modificada del principio activo.
Las formulaciones farmacéuticas adecuadas pueden estar disponibles en el mercado o de lo contrario prepararse de acuerdo con las técnicas que se describen en la bibliografía, por ejemplo, Remington The Science and Practice de Pharmacy 22a edición, Pharmaceutical Press (2012) y Martindale - The Complete Drug Reference, 38a edición, Pharmaceutical Press (2014) y los documentos a los que se hace referencia en ellos. Por otro lado, el experto en la materia puede lograr la preparación de formulaciones adecuadas que incluyen los compuestos de la invención de manera no inventiva usando técnicas de rutina.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma de una formulación acuosa tal como una emulsión, una suspensión y/o una solución (por ejemplo, una formulación acuosa (opcionalmente) tamponada (por ejemplo, una solución), tal como una formulación que contiene solución salina fisiológica (por ejemplo, una solución), una formulación que contiene fosfato (por ejemplo, una solución), una formulación que contiene acetato (por ejemplo, una solución) o una formulación que contiene borato (por ejemplo, una solución) o un polvo liofilizado.
El principio activo puede combinarse adicionalmente y/o alternativamente con excipientes apropiados para preparar: • formulaciones de gel (para las cuales los materiales de matriz de gel adecuados incluyen derivados de celulosa, carbómero y alginatos, goma tragacanto, gelatina, pectina, carragenina, goma gellan, almidón, goma xantana, goma guar catiónica, agar-agar, polisacáridos no celulósicos, sacáridos tales como glucosa, glicerina, propanodiol, polímeros de vinilo, resinas acrílicas, alcohol polivinílico, polímero de carboxivinilo y, particularmente, ácido hialurónico);
• lociones (para las cuales los materiales de matriz adecuados incluyen derivados de celulosa, glicerina, polisacáridos no celulósicos, polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares y propanodiol);
• pastas o pomadas (para las cuales los materiales de matriz de pasta adecuados incluyen glicerina, vaselina, parafina, polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares, etc.);
• cremas o espumas (para las cuales los excipientes adecuados (por ejemplo, agentes espumantes) incluyen hidroxipropilmetilcelulosa, gelatina, polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares, dodecilsulfato de sodio, alcohol graso de sodio, polioxietilen éter sulfonato, polvo de gluten de maíz y acrilamida);
• aerosoles en polvo (para los cuales los excipientes adecuados incluyen manitol, glicina, dextrina, dextrosa, sacarosa, lactosa, sorbitol y polisorbatos; por ejemplo, un polvo seco inhalante); y/o
• líquidos, por ejemplo, pulverizaciones acuosas (en aerosol) para uso oral o para inhalación (para las cuales los excipientes adecuados incluyen modificadores de la viscosidad, tales como ácido hialurónico, azúcares, tales como glucosa y lactosa, emulsionantes, agentes tamponantes, alcoholes, agua, conservantes, edulcorantes, saborizantes, etc.);
• soluciones o suspensiones inyectables (que pueden ser acuosas o de otra manera y para las cuales los excipientes adecuados incluyen solventes y cosolventes, agentes solubilizantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes espesantes, agentes quelantes, antioxidantes, agentes reductores, conservantes antimicrobianos, tampones y/o modificadores de pH, agentes de carga, protectores y agentes modificadores de la tonicidad).
Pueden incluirse en tales formulaciones, además, agentes hidratantes, tales como glicerol, glicerina, polietilenglicol, trehalosa, glicerol, vaselina, aceite de parafina, aceite de silicona, ácido hialurónico y sales de estos (por ejemplo, sales de sodio y potasio), triglicéridos octanoicos/caprílicos, y similares; y/o antioxidantes, tales como vitaminas y glutatión; y/o modificadores de pH, tales como ácidos, bases y tampones de pH, según corresponda. Además, pueden incluirse tensioactivos/emulsionantes, tales como hexadecanol (alcohol cetílico), ácidos grasos (por ejemplo, ácido esteárico), dodecilsulfato de sodio (laurilsulfato de sodio), ésteres de sorbitán (por ejemplo, estearato de sorbitán, oleato de sorbitán, etc.), glicéridos de monoacilo (tales como monoestearato de glicerilo), alcoholes polietoxilados, alcoholes polivinílicos, ésteres de poliol, alquiléteres de polioxietileno (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán), derivados de aceite de ricino de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos etoxilados, polioxilglicéridos, óxido de lauril dimetilamina, sales biliares (por ejemplo, desoxicolato de sodio, colato de sodio), fosfolípidos, N,N-dimetildodecilamina-N-óxido, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, poloxámeros, lecitina, esteroles (por ejemplo, colesterol), ésteres de azúcar, polisorbatos y similares; conservantes, tales como fenoxietanol, etilhexilglicerina y similares; y espesantes, tales como copolímero de acriloildimetiltaurato/VP En particular pueden incluirse ácido esteárico, monoestearato de glicerilo, hexadecanol, estearato de sorbitán, alcohol cetílico, glicérido octanoico/cáprico etc., particularmente en formulaciones de crema.
Los compuestos de la invención, y las formulaciones (por ejemplo, farmacéuticas) que los incluyen (por ejemplo, soluciones acuosas, geles, cremas, pomadas, lociones, espumas, pastas y/o polvos secos como se describió anteriormente), pueden combinarse, además, con un material de matriz apropiado para preparar un apósito o un parche terapéutico para su aplicación en una superficie biológica, tal como la piel o una superficie mucosa. Tales formulaciones pueden emplearse para impregnar un material de matriz, tal como una gasa, tela no tejida o papel de seda. El parche terapéutico puede ser alternativamente, por ejemplo, una tirita, una máscara facial, una máscara para los ojos, una máscara para las manos, una máscara para los pies, etc.
La vaselina puede emplearse para el uso en la aplicación de tales apósitos a las heridas, pero se ha descubierto además, que las pomadas a base de PEG (por ejemplo, PEG 400) pueden combinarse con materiales de matriz para preparar apósitos sin la necesidad de usar vaselina.
Los compuestos de la invención pueden administrarse por inhalación mediante suspensión, polvo seco o solución. Los dispositivos de inhalación adecuados incluyen inhaladores de dosis medidas presurizados ( pMDI), que pueden activarse con la mano o la respiración y emplearse con o sin un dispositivo espaciador estándar), inhaladores de polvo seco (DPI), que pueden ser de dosis única, dosis múltiples, e nebulizadores o inhaladores de niebla suave (SMI), en los que el fármaco en aerosol en forma de niebla fina se suministra con una velocidad más lenta que una pulverización que se suministra usando, por ejemplo, un pMDI.
En los pMDI, los compuestos de la invención pueden administrarse como una suspensión presurizada de partículas micronizadas distribuidas en un propulsor (por ejemplo, HFA, junto con excipientes, como manitol, lactosa, sorbitol, etc.), o como soluciones etanólicas, para suministrar una o más dosis medidas de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 μl con cada activación. La activación puede realizarse a mano (por ejemplo, por presión) o por inhalación (activación por respiración), lo que implica un sistema activado por flujo impulsado mediante un resorte.
En los DPI, los compuestos de la invención pueden administrarse en forma de partículas de fármaco micronizadas (de un tamaño entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 |jm), solos o mezclados con un excipiente inactivo de mayor tamaño de partícula (por ejemplo, manitol), dentro de una cápsula, que puede precargarse o cargarse manualmente en el dispositivo. La inhalación de un DPI puede desagregar las partículas del medicamento y dispersarlas dentro de las vías respiratorias.
En los SMI, los compuestos de la invención pueden almacenarse como una solución dentro de un cartucho, el cual se carga en el dispositivo. Un resorte puede liberar la dosis en una microbomba, de modo que la dosis se libera cuando se presiona el botón, lo que libera chorros de solución de fármaco.
También pueden usarse varios nebulizadores para administrar los compuestos de la invención en forma de una niebla fina de solución aerosolizada. Los nebulizadores pueden incluir un nebulizador de chorro mejorado con la respiración (en el que, con la ayuda de un compresor, una corriente de aire se mueve a través del chorro lo que causa que la solución del fármaco se aerosolice); nebulizadores de chorro activados por la respiración (en los que, después de que un paciente inhala, con la ayuda de un compresor, una corriente de aire se mueve a través del tubo lo que causa que la solución del fármaco se aerosolice); nebulizadores ultrasónicos (en los que los cristales piezoeléctricos vibran lo que causa aerosolización por calentamiento que causa nebulización); nebulizadores de malla vibratoria (en los que los cristales piezoeléctricos hacen vibrar una placa de malla que causa que la aerosolización produzca gotas muy finas sin un cambio significativo en la temperatura de la solución durante la nebulización).
De acuerdo con un aspecto más de la invención se proporciona un proceso para la preparación de una composición/formulación farmacéutica, como se ha definido en el presente documento, cuyo proceso comprende asociar un compuesto de la invención, como se ha definido anteriormente en el presente documento, con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Los compuestos de la invención pueden combinarse, además, en el tratamiento con uno o más factores de crecimiento seleccionados de factores de crecimiento similares a plaquetas (que incluyen factores de crecimiento derivados de plaquetas, PDGF); factores de crecimiento derivados de osteosarcoma (ODGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento transformantes (TGFa y TGFp), factores de crecimiento de fibroblastos (aFGF, pFGF), factores de crecimiento similares a insulina (IGF-1, IGF-E), factores de crecimiento de nervios (NGF), factores de crecimiento similares a interleucina (IL-1, IL-1, IL-3), eritropoyetina (EPO) y factor estimulante de colonias (CSF).
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición (por ejemplo, farmacéutica) que comprende un compuesto de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como un adyuvante, diluyente o portador. Las formulaciones preferidas son adecuadas para su aplicación local, por ejemplo, en la mucosa (que incluye la mucosa oral y/o nasal, el pulmón, el área anorrectal y/o el colon) o, más preferentemente, la piel y por lo tanto, comprenden un adyuvante, diluyente o portador tópicamente aceptable.
Por lo tanto, se proporcionan además composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención que son adecuados, adaptados y/o envasados y presentados para administración tópica (por ejemplo, en la mucosa, que incluye la mucosa oral y/o nasal, el pulmón, el área anorrectal y/o el colon, o, preferentemente, a la piel), así como el uso de dicha formulación en el tratamiento de un trastorno que incluye inflamación, una afección y/o un trastorno inflamatorio caracterizado por inflamación (por ejemplo, como síntoma) mediante administración tópica directa de esa formulación (por ejemplo, a la mucosa, que incluye la mucosa oral y/o nasal, el pulmón, el área anorrectal y/o el colon, o, preferentemente, a la piel).
En relación con este aspecto de la invención, para evitar dudas, las formulaciones tópicas que comprenden los compuestos de la invención pueden usarse en todas y cada una de las afecciones descritas en el presente documento, que incluye tratamientos de la inflamación, en el tratamiento de todos y cada uno de los trastornos inflamatorios, y/o en el tratamiento de todas y cada una de las afecciones caracterizadas por inflamación, como se ha mencionado, definido o descrito anteriormente en el presente documento. De manera similar, las formulaciones tópicas que comprenden los compuestos de la invención que pueden mencionarse incluyen todas y cada una de las mencionadas, definidas o descritas anteriormente en el presente documento. Todas y cada una de las descripciones relevantes en el presente documento se incorporan como referencia junto con este aspecto de la invención.
Las formulaciones tópicas (por ejemplo, a base de solución (por ejemplo, acuosa) o líquidas) que comprenden los compuestos de la invención pueden ser particularmente útiles en la recuperación de heridas, y pueden aliviar el dolor (que incluye sufrimiento) y, en particular, el prurito/picor asociado con la propia herida y el proceso de cicatrización de las heridas. Tales formulaciones tópicas que comprenden los compuestos de la invención pueden ser particularmente útiles en la prevención y/o supresión de la exudación de fluidos corporales de las heridas, particularmente durante la etapa de inflamación aguda, por ejemplo, durante las primeras 48 horas, después de que se inflige una quemadura o herida. Esto evita el riesgo de infección, y otras reacciones fisiológicas. Tales formulaciones tópicas que comprenden los compuestos de la invención pueden además ser particularmente útiles en la prevención y/o supresión de cicatrices y pigmentación de melanina (vide supra), ya sea asociado con heridas o de otra manera.
La administración de los principios activos puede ser continua o intermitente. El modo de administración puede determinarse, además, por el momento y la frecuencia de administración, pero depende, además, en el caso del tratamiento terapéutico de la inflamación, de la gravedad de la afección.
Dependiendo del trastorno y del paciente a tratar, así como de la vía de administración, los compuestos de la invención pueden administrarse a dosis con eficacia terapéutica variable a un paciente que lo necesite.
De manera similar, la cantidad de principio activo en una formulación dependerá de la gravedad de la afección y del paciente a tratar, pero el experto puede determinarla.
En cualquier caso, el médico, u otra persona experta, podrá determinar de manera rutinaria la dosis real, que será la más adecuada para un paciente individual, en dependencia de la gravedad de la afección y la vía de administración. Las dosis mencionadas en el presente documento son a modo de ejemplo del caso promedio; puede haber, por supuesto, casos individuales donde se necesitan intervalos de dosis más altos o más bajos, y estos están dentro del alcance de la presente invención.
Las dosis pueden administrarse entre una y cuatro (por ejemplo, tres) veces al día.
Las concentraciones apropiadas de los compuestos de la invención en un producto de solución acuosa pueden ser de aproximadamente 0,01 (por ejemplo, aproximadamente 0,1) a aproximadamente 15,0mg/ml, en todos los casos calculados como el compuesto libre (sin sal).
Las dosis tópicas apropiadas de los compuestos de la invención están en el intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50 μg/cm2 de área tratada, tal como de aproximadamente 0,1 (por ejemplo, aproximadamente 0,5) a aproximadamente 20 μg/cm2 de área tratada, que incluye de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 μg/cm2 de área tratada, tal como aproximadamente 5 μg/cm2 de área tratada, en todos los casos calculado como el compuesto libre (sin sal).
Las dosis apropiadas de los compuestos de la invención para la administración nasal (por ejemplo, por inhalación) están en el intervalo de aproximadamente 0,01 μg a aproximadamente 2000 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 500 mg, o entre 1 μg a aproximadamente 100 mg. Las dosis particulares para la administración nasal que pueden mencionarse incluyen entre aproximadamente 10 μg y aproximadamente 1 mg, particularmente una dosis de aproximadamente 0,1 mg (es decir, aproximadamente 100 μg). Se ha descubierto que la administración nasal de aproximadamente 0,1 mg por día de los compuestos de la invención es particularmente eficaz en el tratamiento de afecciones asociadas con la inflamación de los conductos y las mucosas nasales, tales como rinitis (por ejemplo, rinitis alérgica).
Las dosis apropiadas de los compuestos de la invención para la administración pulmonar (por ejemplo, por inhalación) están en el intervalo de aproximadamente 0,01 μg a aproximadamente 2000 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 μg y aproximadamente 500 mg o entre 1 μg y aproximadamente 100 mg. Las dosis particulares para la administración pulmonar que pueden mencionarse incluyen entre aproximadamente 10 μg y aproximadamente 10 mg, particularmente una dosis de aproximadamente 0,6 mg (es decir, 60 μg) a 6 mg (por ejemplo, para el uso en el tratamiento de la EPOC o la fibrosis pulmonar idiopática).
Se prefiere que los valores de pH de las formulaciones que comprenden los compuestos de la invención estén en el intervalo de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 9,0 (por ejemplo, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 8,0).
En cualquier caso, la dosis administrada a un mamífero, en particular a un ser humano, en el contexto de la presente invención debería ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica en el mamífero durante un período de tiempo razonable (como se describió anteriormente en el presente documento). Un experto en la materia reconocerá que la selección de la composición y dosis exactas y el régimen posológico más adecuado se verán influenciados además, entre otras cosas, por las propiedades farmacológicas de la formulación, la naturaleza y gravedad de la afección a tratar, y la condición física y agudeza mental del receptor, así como la edad, condición, peso corporal, sexo y respuesta del paciente a tratar, y la etapa/gravedad de la enfermedad, así como las diferencias genéticas entre los pacientes.
En los usos y métodos descritos en el presente documento, los compuestos de la invención también pueden combinarse con uno o más principios activos que son útiles en el tratamiento de la inflamación y/o trastornos inflamatorios (otros agentes antiinflamatorios). Por lo tanto, tales pacientes pueden además recibir (y/o estar ya recibiendo) terapia en función de la administración de uno o más de tales otros principios activos, lo que significa recibir una dosis recetada de uno o más de los principios activos mencionados en el presente documento, antes, además y/o después del tratamiento con el compuesto de la invención.
Tales agentes antiinflamatorios que pueden usarse en combinación con los compuestos de la invención en el tratamiento de la inflamación incluyen agentes terapéuticos que son útiles en el tratamiento de la inflamación y/o de enfermedades caracterizadas por la inflamación como uno de sus síntomas. Dependiendo de la afección a tratar, tales agentes antiinflamatorios pueden incluir AINEs, antagonistas del receptor de leucotrienos (por ejemplo, el propio montelukast), corticosteroides, analgésicos y ciertas enzimas, tales como tripsina, por ejemplo, como se describe en lo sucesivo en el presente documento. Los compuestos de la invención pueden combinarse además con leucotrieno B4 (LTB4).
En este contexto, los compuestos de la invención pueden combinarse además para el uso en el tratamiento de la inflamación con una o más proteínas adhesivas del mejillón (MAP), las cuales incluyen cualquier proteína adhesiva que puede derivarse de especies de mejillones, tal como Mytilus edulis (mejillón azul), que incluye proteínas de longitud completa, que incluyen todos los subtipos, que se derivan o pueden derivarse de mejillones, tales como los colágenos pre-COL-P, pre-COL-D y pre-COL-NG, las proteínas de la matriz del pie del mejillón PTMP y DTMP y, con mayor preferencia, mfps o mefps, tales como mefp-2, mefp-3, mefp-4, mefp-5, mefp-6 y especialmente mefp-1, e incluye mezclas o combinaciones de cualquiera de estas proteínas, tales como mefps. Las MAP de origen natural pueden prepararse, por ejemplo, mediante cromatografía de adsorción mixta (véase la Patente china núm. ZL200710179491.0), mediante cromatografía de intercambio iónico de carboximetilo (véase la Patente china núm. ZL200710179492.5) y/o mediante precipitación salina y diálisis (Patente china núm. ZL200910087567.6). Las fuentes comerciales de MAP incluyen USUN Bio Co. (China; comercializado como MAP Medical Device®), BD Biosciences (EE. UU.), Kollodis (Corea del Sur) y Biopolymer (Suecia). Las MAP pueden producirse alternativamente usando métodos conocidos de ADN recombinante.
Los derivados (por ejemplo, derivados farmacéuticamente aceptables) de MAP pueden combinarse además con los compuestos de la invención e incluir compuestos con, por ejemplo, pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 500 Da a aproximadamente 2000 Da (por ejemplo, aproximadamente 1500, tal como aproximadamente 1200, que incluye aproximadamente 800 Da). Tales derivados pueden incluir, además, otros compuestos que comprenden secuencias de aminoácidos que son las mismas, o son variantes (por ejemplo, menores) (como se ha definido anteriormente en el presente documento) de, secuencias que se identificaron en MAP de origen natural, y que pueden sintetizarse mediante procesos químicos y/o biológicos (por ejemplo, modificaciones químicas de las MAP naturales o síntesis directa).
Por ejemplo, como se analizó anteriormente, los compuestos decapéptidos aislados de las secuencias:
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (mefp-1 decapéptido, SEQ ID No: 4) y
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 12)
son derivados de MAP de bajo peso molecular farmacéuticamente aceptables que pueden combinarse con un compuesto de la invención.
Otros agentes preferidos que pueden combinarse con los compuestos de la invención incluyen LTB4 (para tratar heridas y quemaduras), montelukast (para tratar la inflamación en general) y tripsina (para tratar la inflamación de la mucosa asociada, por ejemplo, con infecciones virales).
Los compuestos de la invención pueden combinarse además con otros agentes terapéuticos que, cuando se administran, se sabe que dan lugar a inflamación como efecto secundario.
Cuando los compuestos de la invención pueden "combinarse" con otros agentes terapéuticos de esta manera, los principios activos pueden administrarse juntos en la misma formulación, o administrarse por separado (simultánea o secuencialmente) en diferentes formulaciones.
Tales productos combinados proporcionan la administración de los compuestos de la invención junto con el otro agente terapéutico, y por tanto, pueden presentarse como formulaciones separadas, en donde al menos una de esas formulaciones comprende un compuesto de la invención, y al menos una comprende el otro agente terapéutico, o pueden presentarse (es decir, formularse) como una preparación combinada (es decir, presentarse como una formulación única que incluye un compuesto de la invención y el otro agente terapéutico).
Por lo tanto, se proporciona, además:
(1) una formulación farmacéutica que incluye un compuesto de la invención; otro agente antiinflamatorio, o agente conocido por dar lugar a inflamación como efecto secundario; y un excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, adyuvante, diluyente o portador), cuya formulación se denomina en lo sucesivo en el presente documento una "preparación combinada"; y
(2) un kit de partes que comprende los componentes:
(A) una formulación farmacéutica que incluye un compuesto de la invención mezclado con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y
(B) una formulación farmacéutica que incluye otro agente antiinflamatorio, o un agente conocido por dar lugar a inflamación como efecto secundario, en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable,
cuyos componentes (A) y (B) se proporcionan cada uno en una forma que es adecuada para la administración junto con el otro.
En un aspecto más de la invención, se proporciona un proceso para la preparación de una preparación combinada como se ha definido anteriormente en el presente documento, cuyo proceso comprende poner en asociación un compuesto de la invención, el otro agente antiinflamatorio, o agente conocido que da lugar a inflamación como un efecto secundario y al menos un excipiente (por ejemplo, farmacéuticamente aceptable).
En un aspecto más de la invención, se proporciona un proceso para la preparación de un kit de partes como se ha definido anteriormente en el presente documento, cuyo proceso comprende poner en asociación los componentes (A) y (B). Como se usa en el presente documento, las referencias a la asociación significarán que los dos componentes se vuelven adecuados para la administración en conjunto.
Por lo tanto, con relación al proceso para la preparación de un kit de partes como se ha definido anteriormente en el presente documento, con “asociar” los dos componentes entre sí, se incluye que los dos componentes del kit de partes pueden:
(i) proporcionarse como formulaciones separadas (es decir, independientemente entre sí), que se combinan posteriormente para el uso en conjunto de ambos en la terapia combinada; o
(ii) envasarse y presentarse juntos como componentes separados de un “envase combinado” para el uso en conjunto de ambos en la terapia combinada.
Por lo tanto, se proporciona, además, un kit de partes que comprende:
(I) uno de los componentes (A) y (B) como se define en el presente documento; junto con
(II) instrucciones para usar ese componente junto con el otro de los dos componentes.
Los kits de partes descritos en el presente documento pueden comprender más de una formulación que incluye una cantidad/dosis apropiada de un compuesto de la invención, y/o más de una formulación que incluye una cantidad/dosis apropiada de otro agente antiinflamatorio, con el objetivo de proporcionar la repetición de la dosificación. Si está presente más de una formulación (que comprende cualquiera de los compuestos activos), tales formulaciones pueden ser las mismas, o pueden ser diferentes en términos de la dosis de cualquiera de los compuestos, composición o composiciones químicas y/o forma o formas físicas.
Con respecto a los kits de partes como se describen en el presente documento, mediante “administración junto con”, se incluye que las formulaciones respectivas que comprenden un compuesto de la invención y otro agente antiinflamatorio se administran de forma secuencial, separada y/o simultánea, durante el transcurso del tratamiento de la afección relevante.
Por lo tanto, en relación con el producto combinado de acuerdo con la invención, la expresión “administración junto con” incluye que los dos componentes del producto combinado (compuesto de la invención y otro agente antiinflamatorio) se administran (opcionalmente, de forma repetida), ya sea juntos, o lo suficientemente cercanos en el tiempo, para permitir un efecto beneficioso para el paciente, que es mayor, en el transcurso del tratamiento de la afección relevante, que si se administra ya sea una formulación que comprende el compuesto de la invención, o una formulación que comprende el otro agente (opcionalmente de forma repetida) solo, en ausencia del otro componente, durante el mismo transcurso del tratamiento. La determinación de si una combinación proporciona un mayor efecto beneficioso con respecto a, y durante el transcurso del tratamiento de, una afección particular dependerá de la afección a tratar o prevenir, pero el experto en la materia puede lograrla habitualmente.
Además, en el contexto de un kit de partes de acuerdo con la invención, la expresión “junto con” incluye que una u otra de las dos formulaciones puede administrarse (opcionalmente de manera repetida) antes de, después, y/o al mismo tiempo que se administra el otro componente. Cuando se usa en este contexto, las expresiones “administrado de forma simultánea” y “administrado al mismo tiempo que” incluyen que las dosis individuales del compuesto relevante de la invención y otro agente antiinflamatorio se administran dentro de las 48 horas (por ejemplo, 24 horas) entre sí.
Dondequiera que se emplee la palabra “aproximadamente” en el presente documento, por ejemplo, en el contexto de cantidades, tales como concentraciones y/o dosis de principios activos, pesos moleculares o pH, se apreciará que tales variables son aproximadas y como tales pueden variar en ± 10 %, por ejemplo ± 5 % y, preferentemente, ± 2 % (por ejemplo, ± 1 %) de los números especificados en el presente documento. A este respecto, la expresión “aproximadamente 10 %” significa, por ejemplo, ± 10 % alrededor del número 10, es decir, entre 9 % y 11 %.
Los compuestos de la invención tienen la ventaja de que pueden usarse en una variedad de afecciones caracterizadas por inflamación, ya sea que esa afección sea una enfermedad inflamatoria orgánica per se o esté asociada con, o se caracterice por, inflamación (por ejemplo, una herida, una quemadura o una infección viral).
Los usos y métodos descritos en el presente documento pueden tener además la ventaja de que, en el tratamiento de las afecciones mencionadas anteriormente en el presente documento, pueden ser más convenientes para el médico y/o el paciente, ser más eficaces, ser menos tóxicos, tener un intervalo de actividad más amplio, ser más potentes, producir menos efectos secundarios, o este/estos pueden tener otras propiedades farmacológicas útiles respecto a, los compuestos o métodos (tratamientos) similares conocidos en la técnica anterior, ya sea para el uso en el tratamiento de la inflamación, los trastornos inflamatorios, o los trastornos caracterizados por inflamación como síntoma (que incluye heridas) o de otro tipo.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, en los que, para varios compuestos, que incluye los compuestos de la invención, la Figura 1 muestra las tasas de hinchazón en un modelo de edema auricular en ratón; la Figura 2 muestra el contenido de Hyp (y por tanto el nivel de recuperación) y la Figura 3 muestra los niveles de factor de crecimiento endotelial vascular y factor de crecimiento transformante beta 1 en tejidos de heridas, en un modelo agudo de herida en ratón; la Figura 4 muestra la tasa de herida sin cicatrizar, la Figura 5 muestra la regeneración de la piel y la Figura 6 muestra las puntuaciones de proliferación de fibroblastos, en un modelo de herida diabética en ratón; la Figura 7 muestra la relación del área restante de la herida en comparación con la herida inicial, las Figuras 8 a 11 muestran los resultados de los análisis histopatológicos en términos de varios marcadores de cicatrización de heridas (regeneración de la piel, proliferación fibroblástica, inflamación y tinción de Masson, respectivamente), y la Figura 12 muestra los niveles de edema, en diferentes grupos en un modelo adicional de herida diabética; las Figuras 13 y 17 muestran el efecto de los compuestos de la invención sobre el edema causado por la inflamación aguda en modelos adicionales de edema auricular en ratón; la Figura 14 muestra la tasa de heridas sin cicatrizar en un modelo adicional de herida aguda en ratón; la Figura 15 muestra una comparación entre los compuestos de la invención y los esteroides antiinflamatorios conocidos en un modelo de edema auricular en ratón y la Figura 16 muestra el contenido de IL-1p de la Figura 1 en tejidos pulmonares para diferentes compuestos de la invención en un modelo de lesión pulmonar en ratón.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Síntesis de Montelukast Estireno-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (es decir, montelukast estireno unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 12 en el extremo N-terminal)
Para sintetizar 3 mmol del péptido de la SEQ ID No: 12, se siguió el siguiente procedimiento.
Se cargó resina Fmoc-Lys-Boc-Wang (9,15 g, GLS180322-41301, GL Biochem, Shanghái, China) en una columna de reacción de vidrio.
Se añadió cloruro de metileno (DCM, 200 ml; Shandong Jinling Chemical Industry Co Ltd, Shandong, China) a la columna y se dejó en remojo la resina durante aproximadamente media hora. A continuación, se eliminó el DCM mediante filtración al vacío.
La resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF, 200 ml; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Shandong, China).
Se añadió una solución de piperidina 20 % en DMF (200 ml; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Shandong, China) como solución de desprotección y se hizo reaccionar durante 20 minutos. A continuación, la solución se eliminó mediante filtración al vacío y la columna se lavó con DMF seis veces.
Se añadieron Fmoc-Tyr(tBu)-OH (4,14 g; GLS170916-36901, GL Biochem , Shanghái, China) y tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (TBTU, 2,89 g; GLS170805-00705, GL Biochem, Shanghái, China) a la resina. Se añadió DMF (150 ml) a la columna de reacción, seguido de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA, 2,33 g; Suzhou Highfine Biotech Co. Ltd, Jiangsu, China). Se detectó una reacción de color en la resina después de 30 minutos, lo que indica que la reacción se completó. El solvente se eliminó mediante filtración al vacío.
Las etapas de acoplamiento anteriores se repitieron para acoplar los aminoácidos restantes en las mismas cantidades (en moles): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH y Fmoc-Ala-OH.
Finalmente, se añadió montelukast (5,47 g; MedChemExpress, MCE China, Shanghái, China) a la resina. A continuación, se drenó el líquido después de 15 minutos y se lavó la columna con DMF, DCM y metanol, 3 veces cada uno, respectivamente.
Se añadieron 91,5 ml (es decir, 10 ml por gramo de resina) de lisado, que estaba compuesto por 95% de ácido trifluoroacético (TFA), 2,5 % de agua y 2,5 % de triisopropilsilano (Tis), para sumergir el compuesto que contiene péptido unido a resina. Las cadenas laterales también se desprotegieron durante la escisión. Después de la escisión, el soporte sólido se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida. El péptido escindido se precipitó con éter dietílico y se liofilizó para producir 600 mg del compuesto del título en bruto.
Se disolvió 1 mg de producto en bruto en 1 ml de una mezcla de acetonitrilo y agua (1:3) y se detectó usando una bomba HPLC P3000A y equipo de semipreparación LC3000 (modelo de columna de preparación: GS-120-10-C18-AP de 30 mm; Beijing Chuangxintongheng Science & Technology Co., Ltd., Pekín, China). Se calculó el gradiente apropiado para la elución y se detectó el pico objetivo a 11,035 con LCMs (modelo de columna de análisis: GS-120-5-C18-BIO, 4,6 * 250 mm; detección: UV a 220 nm; solvente A: TFA al 0,1 % en MeCN, solvente A: TFA al 0,1 % en agua; caudal 1,0 ml/min; volumen: 10 jl).
El compuesto en bruto se desaló usando una resina de intercambio aniónico, se analizó y se liofilizó. Se obtuvieron aproximadamente 50 mg de péptido purificado después de la purificación, el cual se reevaluó para su confirmación. MS: m/z 866,90[M+2H]2+.
Basándose en los datos de caracterización disponibles y presentados en el presente documento, se entiende que el compuesto preparado por medio de este ejemplo es el que se identificó anteriormente como el compuesto del título. Por lo demás, el compuesto que se prepara en el Ejemplo 1 es un compuesto de la invención en el que, en el compuesto de fórmula I, n es 0 y el compuesto de fórmula I está unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 12 en el extremo N-terminal. En cualquier caso, el compuesto del Ejemplo 1 se denomina en lo sucesivo en el presente documento "Compuesto A".
Ejemplo 2
Síntesis de Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (Montelukast Estireno) (es decir, montelukast estireno unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 4 en el extremo C-terminal de Lys)
Se empleó un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 anterior que comienza con Fmoc-Lys (Dde)-OH (N.° CAS: 150629-67-7) sobre una resina Wang.
Se añadió una solución de piperidina al 25 % en DMF (200 ml; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Shandong, China) para eliminar el grupo protector Fmoc.
Se añadió el segundo aminoácido protegido Fmoc-DOPA (acetónido)-OH, junto con TBTU y DIPEA, hasta que se completó la reacción.
Las etapas de acoplamiento anteriores se repitieron para acoplar los aminoácidos restantes en las mismas cantidades (en moles): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH y Fmoc-Ala-OH.
La peptidil-resina se colocó en un matraz y se trató con hidrazina monohidrato al 2 % en DMF (25 ml/g). Se tapó el matraz y se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después, la resina se lavó con DMF. Se añadió montelukast (5,47 g; MedChemExpress, MCE China, Shanghái, China) a la resina, junto con TBTU y DIPEA y la mezcla se hizo reaccionar durante 1 hora.
La peptidil-resina protegida se trató con 91,5 ml de lisado (una mezcla de TFA al 95 %, agua al 2,5 % y Tis al 2,5 %) durante 1 hora. Después de la escisión, el soporte sólido se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida. El péptido escindido se precipitó con éter dietílico y se liofilizó para producir aproximadamente 600 mg del compuesto del título en bruto.
Después de la purificación, se obtuvieron 50 mg de producto puro.
MS: m/z 875,75[M+2H]2+.
Basándose en los datos de caracterización disponibles y presentados en el presente documento, se entiende que el compuesto preparado por medio de este ejemplo es el que se identificó anteriormente como el compuesto del título. De lo contrario, el compuesto que se prepara en el Ejemplo 2 es un compuesto de la invención en el que, en el compuesto de fórmula I, n es 0 y el compuesto de fórmula I está unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 4 en el extremo C-terminal de Lys. En cualquier caso, el compuesto del Ejemplo 2 se denomina en lo sucesivo en el presente documento "Compuesto B".
Ejemplo 3
Síntesis de montelukast estireno-Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (es decir, montelukast estireno unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 13 en el extremo N)
Se empleó un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 4 a continuación que comienza con Fmoc-Lys (Dde)-OH (CAS No.: 150629-67-7) sobre una resina Wang.
Se añadió una solución de piperidina al 25 % en DMF (200 ml; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Shandong, China) para eliminar el grupo protector Fmoc.
Se añadió el segundo aminoácido protegido Fmoc-Tyr(tBu)-OH (GLS170916-36901, GL Biochem, , China), junto con ByBOP y DIPEA, hasta que se completó la reacción.
Las etapas de acoplamiento anteriores se repitieron para acoplar los aminoácidos restantes en las mismas cantidades (en moles): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-pSer(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH y Fmoc-Ala-OH.
La peptidil-resina se colocó en un matraz y se trató con hidrazina monohidrato al 2 % en DMF (25 ml/g). Se tapó el matraz y se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después, la resina se lavó con DMF. Se añadió montelukast (1,8 g; MedChemExpress, MCE China, Shanghái, China) a la resina, junto con TBTU y DIPEA y la mezcla se hizo reaccionar durante 1 hora.
Se añadió el lisado (10 ml por gramo de resina), que estaba compuesto por ácido trifluoroacético (TFA) al 95 %, agua al 2,5 % y triisopropilsilano (Tis) al 2,5 %, para sumergir el compuesto que contiene péptido unido a resina. Las cadenas laterales también se desprotegieron durante la escisión. Después de la escisión, el soporte sólido se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida. El péptido escindido se precipitó con éter dietílico y se liofilizó para producir 1,4 g de péptido en bruto.
Se disolvió 1 mg de producto en bruto en 1 ml de una mezcla de acetonitrilo y agua (1:3) y se detectó usando una bomba HPLC P3000A y equipo de semipreparación LC3000 (modelo de columna de preparación: GS-120-10-C18-AP 30 mm; Beijing Chuangxintongheng Science & Technology Co., Ltd., Pekín, China). Se calculó el gradiente apropiado para la elución y se detectó el pico objetivo con LCMS (modelo de columna de análisis: GS-120-5-C18-BIO, 4,6*250 mm).
El compuesto en bruto se desaló usando una resina de intercambio aniónico, se analizó y se liofilizó, el cual se reevaluó para su confirmación.
Después de la purificación, se obtuvieron 98 mg de producto puro (una tasa de rendimiento de aproximadamente el 7 % del producto en bruto).
MS: m/z 907,3 [M+2H]2+.
Basándose en los datos de caracterización disponibles y presentados en el presente documento, se entiende que el compuesto preparado por medio de este ejemplo es el que se identificó anteriormente como el compuesto del título. De lo contrario, el compuesto que se prepara en el Ejemplo 3 es un compuesto de la invención en el que, en el compuesto de fórmula I, n es 0 y el compuesto de fórmula I está unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 13 en el extremo N-terminal. En cualquier caso, el compuesto del Ejemplo 3 se denomina en lo sucesivo en el presente documento "Compuesto C".
Ejemplo 4
Síntesis de Ala-Lys(montelukast estireno)-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys(montelukast estireno) (es decir, dos moléculas de montelukast estireno unidas covalentemente a través de los residuos de Lys al aminoácido de la SEQ ID No: 12)
Para sintetizar 1 mmol de péptido de la SEQ ID No: 12, se siguió el siguiente procedimiento.
Se cargó Fmoc-Lys(Dde)-OH (CAS No.: 150629-67-7) en una resina Wang (3 g, GL Biochem, Shanghái, China) en una columna de reacción de vidrio.
Se añadió cloruro de metileno (DCM, 60 ml; Shandong Jinling Chemical Industry Co Ltd, Shandong, China) a la columna y se dejó en remojo la resina durante aproximadamente media hora. A continuación, se eliminó el DCM mediante filtración al vacío.
La resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF, 60 ml; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Shandong, China).
Se añadió una solución de piperidina 20 % en DMF (30 ml; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Shandong, China) como solución de desprotección y se hizo reaccionar durante 20 minutos. A continuación, la solución se eliminó mediante filtración al vacío y la columna se lavó con DMF seis veces.
Se añadió Fmoc-Tyr(tBu)-OH (1,4 g; GLS170916-36901, GL Biochem, Shanghái, China) y hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (ByBOP, 1,56 g; Suzhou Highfine Biotech Co. Ltd, Jiangsu, China) a la resina, seguido de DIPEA (1 ml; Suzhou Highfine Biotech Co. Ltd, Jiangsu, China). Se detectó una reacción de color en la resina después de 30 minutos, lo que indica que la reacción se completó. El solvente se eliminó mediante filtración al vacío.
Las etapas de acoplamiento anteriores se repitieron para acoplar los aminoácidos restantes en las mismas cantidades (en moles): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH y Boc-Ala-OH.
La peptidil-resina se colocó en un matraz y se trató con hidrazina monohidrato al 2 % en DMF (25 ml/g). Se tapó el matraz y se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después, la resina se lavó con DMF. Se añadió montelukast (3,6 g; MedChemExpress, MCE China, Shanghái, China) a la resina, junto con TBTU y DIPEA y la mezcla se hizo reaccionar durante 1 hora.
Se añadió el lisado (30 ml; 10 ml por gramo de resina), el cual estaba compuesto por de ácido trifluoroacético (TFA) al 95 %, agua al 2,5 % y triisopropilsilano (Tis) al 2,5 %, para sumergir el compuesto que contiene péptido unido a resina. Las cadenas laterales también se desprotegieron durante la escisión. Después de la escisión, el soporte sólido se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida. El péptido escindido se precipitó con éter dietílico y se liofilizó para producir 1,6 g de péptido en bruto.
Se disolvió 1 mg de producto en bruto en 1 ml de una mezcla de acetonitrilo y agua (1:3) y se detectó usando una bomba HPLC P3000A y equipo de semipreparación LC3000 (modelo de columna de preparación: GS-120-10-C18-AP 30 mm; Beijing Chuangxintongheng Science & Technology Co., Ltd., Pekín, China). Se calculó el gradiente apropiado para la elución y se detectó el pico objetivo con LCMS (modelo de columna de análisis: GS-120-5-C18-BIO, 4,6*250 mm).
El compuesto en bruto se desaló usando una resina de intercambio aniónico, se analizó y se liofilizó, el cual se reevaluó para su confirmación. Se obtuvieron 20 mg de péptido purificado (del 90% al 95% de pureza) a partir de 1,6 g de péptido en bruto.
MS: m/z 762,2 [M+3H]3+.
Basándose en los datos de caracterización disponibles y presentados en el presente documento, se entiende que el compuesto preparado por medio de este ejemplo es el que se identificó anteriormente como el compuesto del título. De lo contrario, el compuesto que se prepara en el Ejemplo 4 es un compuesto de la invención en el que, en el compuesto de fórmula I, n es 0 y el compuesto de fórmula I está unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 12 a través de los residuos de Lys. En cualquier caso, el compuesto del Ejemplo 4 se denomina en lo sucesivo en el presente documento "Compuesto D".
Ejemplo 5
Modelo de edema auricular en ratón I
35 ratones BALB/c machos sanos de 6-8 semanas de edad y un peso corporal promedio de 18-25 g suministrados por Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd. se alojaron y atendieron durante aproximadamente 1 semana antes del experimento. La temperatura del alojamiento fue de 25-27 °C con un 74 % de humedad, con períodos alternos de 12 horas de luz y oscuridad, y libre acceso a alimentos y agua. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 7 grupos como se describe en la Tabla 1 a continuación, con 5 ratones en cada grupo.
La oreja izquierda de cada ratón se usó como control autólogo. La oreja derecha de cada ratón se trató mediante varios tratamientos diferentes, como se resume en la Tabla 1 a continuación. Se aplicaron 20 μl de xileno (Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd., Shanghái, China) a la oreja derecha de cada ratón, tanto en el interior como en el exterior. La oreja comenzó a hincharse en aproximadamente 4 minutos. Después, se aplicaron 0,08 g de los tratamientos o vehículos de cada estudio en las orejas derechas de cada grupo. Los ratones se pusieron nuevamente en sus jaulas.
Se preparó una crema a base de montelukast sódico (Mon), que consiste en los siguientes componentes: montelukast sódico (200 mg; Arromax Pharmatech Co., Ltd, Suzhou, China), ácido esteárico (2 g), monoestearato de glicerina (2 g), hexadecanol (2 g), glicerina (5 g) e hidróxido de sodio (0,25 g) (todos de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd, Shanghái, China); copolímero de acriloildimetiltaurato de amonio/VP (0,13 g; Clariant Chemical (Guangzhou) Co., Ltd., Guangzhou, China); fenoxietanol (0,3 g) y etilhexil glicerina (0,1 g) (ambos de Shanghai Rayson Chemicals Co., Ltd., Shanghái, China) y agua purificada (88,42 g).
El ácido esteárico, el monoestearato de glicerina y el hexadecanol se mezclaron y se calentaron a 85 °C con agitación hasta que la mezcla se fundió por completo. El copolímero de acriloildimetiltaurato de amonio/VP, el agua purificada y el hidróxido de sodio se mezclaron con agitación a 85 °C para formar una suspensión coloidal homogénea. El montelukast sódico, glicerina, el fenoxietanol y la etilhexilglicerina se combinaron después con agitación hasta que el montelukast se disolvió por completo.
La mezcla de copolímero/agua se adicionó a la mezcla que contenía ácido esteárico, la cual se emulsionó mediante agitación rápida durante cinco minutos usando un equipo de emulsificación. La emulsión resultante se enfrió hasta 55 °C, la mezcla que contenía montelukast se añadió con mezclado. La mezcla resultante se dejó enfriar a temperatura ambiente para obtener el producto terminado.
La crema de dexametasona (DEX) se preparó usando el mismo procedimiento, excepto que el montelukast se reemplazó por 0,4 mg de dexametasona (Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD, Shanghái, China).
Se preparó un gel que incluía el Compuesto A ("gel A"), que consiste en los siguientes componentes: 0,5 g del Compuesto A en polvo (obtenido de g L Biochem, Shanghái, China; preparado como se describe en el Ejemplo 1 anterior), metilcelulosa (2,2 g; Shandong Guangda Technology Development Co., Ltd., ShanDong, China), glicerina (11 g) y propanodiol 11 g (ambos de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.) y agua purificada (75,3 g).
La metilcelulosa y el agua se mezclaron y se agitaron hasta que se formó una suspensión coloidal homogénea. Después, el Compuesto A en polvo, la glicerina y el propanodiol se añadieron a la mezcla de metilcelulosa/agua, y la mezcla resultante se agitó rápidamente durante 5 minutos para obtener el producto terminado.
Un gel a base de Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (Compuesto 1 (SEQ ID No: 12); 1,5 g; obtenido en forma de polvo de GL Biochem, Shanghái, China y preparado esencialmente mediante el mismo proceso que el descrito en el Ejemplo 1 anterior, sin acoplar montelukast al final) se preparó mediante el mismo proceso descrito anteriormente para el Compuesto A ("gel 1").
El Vehículo 1 en la Tabla 1 a continuación es la base de crema sin principios activos. El Vehículo 2 en la Tabla 1 a continuación es la base de gel sin principios activos. Ambos se prepararon usando el mismo procedimiento que se describió anteriormente, sin añadir principio activo.
T l 1
Figure imgf000024_0001
Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical después de 40 minutos. Se cortaron las orejas izquierda y derecha. Se usó una bolsa de piel (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU.) con un diámetro de 8 mm para extraer un pedazo de la oreja del mismo sitio de ambas orejas. Se registraron los pesos y las tasas de hinchazón se calcularon como sigue:
Tasa de hinchazón = (peso de la oreja derecha - peso de la oreja izquierda) / peso de la oreja izquierda * 100 % y los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación y en la Figura 1.
T l 2
Figure imgf000024_0002
Los resultados anteriores muestran que ambos compuestos de prueba reducen la hinchazón inducida por xileno.
Ejemplo 6
Modelo agudo de herida I
Los ratones C57BL/6 machos de 6-8 semanas de edad se suministraron por Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd. Antes de realizar cualquier experimento, los ratones se alojaron en condiciones estandarizadas (a una temperatura constante o 22 ± 2 °C, con períodos alternos de 12 horas de luz y oscuridad), y se alimentaron con una dieta estándar de ratones con agua, durante aproximadamente una semana.
Se indujo anestesia general usando hidrato de cloral al 3 % intraperitoneal (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.; 1 ml/10 g de peso corporal). El pelo en la parte posterior se afeitó con una afeitadora para pelo de bebés y se depiló con crema. El área de la piel se limpió y esterilizó dos veces con alcohol al 75 %.
Se usó un punzón de biopsia de piel de EMS (Electron Microscopy Sciences, PO Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440) con un diámetro de 18 mm para hacer una herida redonda en la línea media de la parte posterior. Se retiró la piel de grosor completo y la profundidad alcanzó la fascia. Las heridas quedan abiertas sin sutura.
Se administraron diferentes fármacos tópicamente a 50 μl/herida, una vez al día desde el día 0 hasta el día 7. El grupo modelo recibió la misma cantidad de solución salina normal. Hubo 7 grupos que incluían 56 ratones en este experimento, como se muestra en la Tabla 3 a continuación.
Se adquirió factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (rhEGF, Shanghai Haohai Biological Technology Co. Ltd, Shanghái, China) y preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El polvo de rhEGF liofilizado (100000 lU/vial) se disolvió en 20 ml de solución salina normal para obtener una solución con una concentración de 5000 lU/ml. La dosis de trabajo de rhEGF para este experimento fue de 1285 lU/herida.
El compuesto B se obtuvo en forma de polvo a GL Biochem, y se preparó como se describió en el Ejemplo 2 anterior. Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (Compuesto 2; s Eq iD No: 4) se obtuvo en forma de polvo a GL Biochem, y se preparó esencialmente como se describió en el Ejemplo 2 anterior, pero sin acoplar montelukast al final. Los polvos se almacenaron a -20 °C y se disolvieron en solución salina a las concentraciones indicadas en la Tabla 3 a continuación (L y H indican dosis bajas y altas, respectivamente).
T l
Figure imgf000025_0001
La hidroxiprolina (Hyp) es un aminoácido no proteinogénico, que se encuentra en el colágeno, que contiene aproximadamente un 12-14% de Hyp en masa. El contenido de Hyp en los hidrolizados de tejido es, por tanto, una medida directa de la cantidad de colágeno presente, y el contenido de Hyp presente en el tejido de la herida indica directamente el nivel de recuperación. El contenido de Hyp en cada grupo y el día 4 y el día 7 después del comienzo del tratamiento se muestran en la Figura 2.
Los resultados mostraron que los compuestos de prueba mejoran el contenido de Hyp en todos los grupos de tratamiento. La dosis más baja del Compuesto 2 y el Compuesto B muestran efectos en la etapa temprana (día 4 (D4)). Las dosis más altas de ambos compuestos de prueba muestran además efectos acelerados sobre la producción de Hyp en el día 7 (D7).
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1) desempeñan papeles importantes en el proceso de cicatrización de heridas. El VEGF y el TGF-p1 a menudo se coexpresan en tejidos en los que se produce la angiogénesis. Se detectó además el contenido de estos dos factores en los tejidos de la herida y se muestra en la Figura 3.
Los resultados mostraron que los dos péptidos podrían estimular la producción de VEGF y TGF-p1.
Ejemplo 7
Modelo de herida diabética l
Se realizó un experimento similar con el mismo protocolo esencialmente que el descrito en el Ejemplo 6 anterior en ratones db/db machos de 8 a 12 semanas de edad (C57BL/KsJ-db/db), con un peso corporal de 35-45 g/ratón (Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd.).
Se usó un punzón de biopsia de piel de EMS con un diámetro de 18 mm para hacer las heridas.
Se administraron diferentes fármacos tópicamente a 50 μl/herida, una vez al día desde el día 0 hasta el día 12. El grupo modelo recibió la misma cantidad de solución salina normal. Hubo 7 grupos que incluían 52 ratones en este experimento que se muestra en la Tabla 4 a continuación.
T l 4
Figure imgf000026_0001
Se tomaron fotografías de cada herida cada dos días a partir del día 0. Las fotos se escanearon en una computadora y se calcularon las áreas de la herida usando el programa de análisis de imágenes ImageJ (National Institute of Health, EE. UU.).
El área de la herida sin cicatrizar se expresó como un porcentaje del área de la herida original:
At/Ao ^ 100%,
donde Ao y At se refieren al área inicial en el día 0 y al área de la herida en la fecha de medición (tiempo t), respectivamente.
La tasa de heridas sin cicatrizar se mostró en la Figura 4. El resultado mostró que el Compuesto Atuvo el mejor efecto en la mejora de la recuperación de la herida y fue mejor que la combinación del Compuesto 1 con montelukast.
Las muestras histológicas se analizaron y se estimó la regeneración de la piel, la proliferación de fibroblastos, las puntuaciones de regeneración de colágeno (puntuación de Masson) y las puntuaciones de inflamación como sigue. Los cortes teñidos con HE y Masson se observaron bajo un microscopio óptico y se puntuaron (1, 2 o 3 puntos) de acuerdo con los siguientes criterios. La puntuación de regeneración de la piel fue de 1 punto cuando el área cubierta de piel recién generada no era más de un tercio del área de la herida; la puntuación fue de 2 puntos cuando la piel recién generada cubrió un área mayor a un tercio pero menor a dos tercios del área de la herida; y la puntuación fue de 3 puntos cuando el área cubierta de piel recién generada era al menos dos tercios del área de la herida.
Las puntuaciones de regeneración de la piel se muestran en la Figura 5.
La proliferación de fibroblastos se puntuó según los criterios siguientes y se presentó en la Figura 6.
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Los resultados del análisis patológico mostraron que el Compuesto A y el Compuesto 1 podrían promover la regeneración de la piel y la proliferación de fibroblastos. El compuesto A conjugado fue ligeramente mejor, especialmente en relación con la puntuación de proliferación de fibroblastos.
Ejemplo 8
Modelo de herida diabética II
Se realizó un experimento similar con el mismo protocolo esencialmente que el descrito en el Ejemplo 7 anterior en ratones db/db machos de 8 a 12 semanas de edad (C57BL/KsJ-db/db) con un peso corporal de 35-45 g/ratón (Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd.).
Se prepararon diferentes concentraciones del Compuesto A y el Compuesto 1 ("A" y "1" respectivamente, como se indica en la Tabla 5 a continuación) sustancialmente de la misma manera que se describe en los Ejemplos 6 y 7 anteriores. Se disolvieron dosis medias y bajas de montelukast sódico ("Mon" en la Tabla 5 a continuación; MedChemExpress, MCE China, Shanghái, China) en agua ultrapura para obtener soluciones con las concentraciones descritas en la Tabla 5 a continuación (L, M y H indican dosis baja, media y alta, respectivamente). En vista de la baja solubilidad de montelukast en agua, la muestra de prueba de montelukast a dosis alta se preparó disolviendo montelukast en etanol al 100% y después, añadiendo agua ultrapura para formar una solución con una concentración de 20 |jg/|jl en etanol 20 %.
Se administraron diferentes fármacos por vía tópica a 50 jl/herida, una vez al día desde el día 0 hasta el día 12, como se muestra en la Tabla 5 a continuación. El grupo control no tenía heridas infligidas.
T l
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El grupo modelo recibió la misma cantidad de solución salina normal. Hubo 8 ratones en cada grupo. 4 ratones estaban en el grupo control. Los pedazos de piel extraídos durante la creación de la herida se usaron como las muestras del día 7 para el grupo control.
Los efectos de los fármacos sobre la cicatrización de heridas en los primeros 12 días se mostraron en la Tabla 6 a continuación y en la Figura 7, que muestra la relación del área de la herida restante de la herida inicial en los diferentes grupos (± SD en el caso de la Tabla 6).
T l
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Los datos muestran que la dosis baja del Compuesto 1 provocó la cicatrización de la herida en las primeras etapas después de infligir la herida y que la dosis media del Compuesto A provocó mejores efectos en las etapas posteriores. Las muestras histológicas se analizaron como se describió en el Ejemplo 7 anterior, excepto que el criterio de puntuación de deposición de colágeno para la muestra teñida con Masson fue el siguiente. Se realizó una comparación con tejido normal. Se asignó una puntuación de 0 a la ausencia de tinción azul clara; la aparición de fibra azul en un patrón disperso se puntuó como 1 punto; si aparecía más fibra azul, se puntuó como 2 puntos y un color azul difuso recibió 3 puntos.
Los resultados del análisis histopatológico se muestran en las Figuras 8 a 11 y muestran que todos los grupos de tratamiento aceleraron la cicatrización de heridas, especialmente la dosis media de Compuesto A, que mostró un efecto promotor significativo sobre la deposición de colágeno.
Los niveles de edema en los diferentes grupos se evaluaron además mediante análisis histopatológico y los resultados se muestran en la Figura 12. Los datos muestran que la dosis media del Compuesto A dio el mejor resultado.
Ejemplo 9
Modelo de edema auricular en ratón II
Se llevó a cabo un experimento similar con el mismo protocolo esencialmente que el descrito en el Ejemplo 5 anterior en 35 ratones BALB/c machos sanos. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 7 grupos como se describe en la Tabla 7 a continuación, con 5 ratones en cada grupo.
Los compuestos A, B, C y D se obtuvieron todos de GL Biochem Ltd.
En la Tabla 7 a continuación, se prepararon hidrogeles de los compuestos A, B, C y D que consisten en las cantidades de principios activos descritos, junto con metilcelulosa (2,5%), propanodiol (11%), glicerol (11%), ácido acético (regulador de pH; 0 a 0,5 g). Todos los excipientes se obtuvieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.). Los geles se prepararon con agua para inyección.
Se usó crema de acetato de dexametasona (DEX 5 mg en 10 g de crema, Fuyuan Pharmaceutical Co. Ltd., Anhui, China) como control positivo.
Se aplicaron 40 μl de los diversos fármacos de tratamiento en el oído derecho de cada grupo.
T l 7
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Los resultados se muestran en la Figura 13. Todos los conjugados tuvieron un efecto muy bueno en la eliminación del edema causado por la inflamación aguda.
Ejemplo 10
Modelo agudo de herida II
Se llevó a cabo un experimento similar con el mismo protocolo esencialmente que el descrito en el Ejemplo 6 anterior en ratones C57BL/6 machos de 6 a 8 semanas de edad,
se usó un punzón de biopsia de piel de EMS con un diámetro de 12 mm para realizar dos heridas redondas en la línea media de la parte posterior. Los dos círculos eran tangenciales entre sí y la piel entre los círculos se cortó a lo largo de las tangentes superior e inferior. Se usaron tijeras para recortar la herida. La herida tenía forma ovalada.
Se administraron diferentes fármacos tópicamente a 50 μl/herida, una vez al día desde el día 0 hasta el día 7. El grupo modelo recibió la misma cantidad de solución salina normal. Hubo 10 grupos que incluían 80 ratones en este experimento que se muestra en la Tabla 8 a continuación.
T l
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Se tomaron fotografías de cada herida cada dos días a partir del día 0, y se expresó el área de la herida sin cicatrizar, como se describió en el Ejemplo 6 anterior.
La tasa de heridas sin cicatrizar se muestra en la Figura 14. Los resultados muestran que los cuatro conjugados (A, B, C y D) tuvieron efectos comparables en la promoción de la cicatrización de heridas en comparación con los otros grupos. Ejemplo 11
Formulación en crema
Estearato de sorbitán (0,6 g), polisorbato-80 (1 g), hexadecanol (2 g), ácido octanoico/glicérido de ácido decanoico (5 g), parafina líquida (4 g), monoestearato glicérido (2 g) y vaselina (5 g) (todos de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.) se mezclaron, con agitación y calentamiento a 85 °C, hasta que la mezcla se fundió por completo.
Se mezclaron metilcelulosa (0,5 g), glicerina (4 g), trehalosa (0,5 g), polietilenglicol 200 (4 g), fenoxietanol (0,3 g) y etilhexil glicerol (0,1 g) (todos de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.) con agua purificada (69,45 g), con agitación y calentamiento a 85 °C para dar una suspensión coloidal homogénea.
Las dos mezclas obtenidas anteriormente se mezclaron con aceite de silicona (0,5 g) con agitación rápida usando un equipo de emulsificación durante 5 minutos. La emulsión resultante se enfrió a 55 °C.
El compuesto A (50 mg; véase el ejemplo 1 anterior) se disolvió en agua purificada (1 g) y después se combinó con la mezcla de emulsión con agitación hasta que fue uniforme. La mezcla resultante se dejó enfriar a temperatura ambiente para obtener el producto terminado.
Ejemplo 12
Formulación de pulverización I
Se agitaron hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC; 0,1 g), hidroxietilcelulosa (0,1 g), glucosa (5 g), fenoxialcohol (0,5 g) (todos de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.) y agua purificada (93,25 g) con calentamiento a 85 °C para proporcionar una suspensión coloidal homogénea. Después, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente.
Se disolvió el compuesto A (50 mg; véase el Ejemplo 1 anterior) en 1 g de agua purificada. Esta solución se añadió a la mezcla coloidal. La mezcla uniforme dio el producto terminado.
Ejemplo 13
Formulación de pulverización II
Se preparó una segunda pulverización usando sustancialmente el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 12 anterior añadiendo la misma solución acuosa del Compuesto A a una mezcla coloidal hecha con algo más de HPMC e hidroxietilcelulosa (0,2 g de cada uno), junto con los otros componentes en las mismas cantidades y 94,05 g de agua purificada.
Ejemplo 14
Formulación en gel I
Esta formulación se obtuvo usando esencialmente el mismo procedimiento que se describe en los Ejemplos 12 y 13 anteriores, añadiendo la misma solución acuosa del Compuesto A a una mezcla coloidal hecha con 1 g de HPMC e hidroxietilcelulosa, junto con los otros componentes en las mismas cantidades y 91,45 g de agua purificada.
Ejemplo 15
Formulación en gel II
Se obtuvo un segundo gel usando esencialmente el mismo procedimiento que se describe en los Ejemplos 12 a 14 anteriores, añadiendo la misma solución acuosa del Compuesto A a una mezcla coloidal hecha con 0,5 g de HPMC y 1,5 g de hidroxietilcelulosa, junto con los otros componentes en las mismas cantidades y 91,45 g de agua purificada. Ejemplo 16
Formulación en gel III
Se obtuvo un tercer gel usando sustancialmente el mismo procedimiento que se describe en los Ejemplos 12 a 15 anteriores. Primero se mezclaron metilcelulosa (2,2 g) y propanodiol 11 g (ambos de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.) y glicerol (11 g) con 74,75 g de agua purificada. La adición de la misma solución acuosa del Compuesto A a la mezcla coloidal resultante proporcionó el producto terminado.
Ejemplo 17
Ejemplo clínico I - Paciente con rinitis alérgica
Una paciente femenina de 45 años con rinitis alérgica presentaba lloriqueos periódicos y obstrucción nasal.
La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización nasal, se administró a cada fosa nasal por separado, de 2 a 3 veces al día durante 5 días.
Se le indicó a la paciente que no usara su medicación actual (montelukast sódico oral y budesonida) desde la primera dosis de la formulación de pulverización.
Los lloriqueos y la obstrucción nasal se aliviaron aparentemente a partir de la segunda administración. La paciente descubrió que no sentía la necesidad de tomar montelukast sódico por vía oral durante el transcurso de la administración de la nueva formulación. Se descubrió que la budesonida había perdido eficacia tras un par de meses de uso.
Ejemplo 18
Ejemplo clínico II - Alivio de los síntomas en un paciente con quemaduras
Un paciente masculino tuvo una sensación de picazón severa en la parte media superior del brazo durante el transcurso de la recuperación de quemaduras graves de segundo grado con una VAS de 4 a 5.
Se administró a la herida la formulación de pulverización I (véase el Ejemplo 12 anterior) y el picor se alivió en un minuto. Ejemplo 19
Ejemplo clínico III: Alivio de los síntomas en un paciente herido
Un paciente se operó y posteriormente tuvo un dolor intenso por la incisión quirúrgica.
Se administró la formulación de pulverización I (véase el Ejemplo 12 anterior) a la incisión y el dolor se alivió en un minuto.
Ejemplo 20
Ejemplo clínico IV: Pacientes con rinitis alérgica
Se inscribieron 38 sujetos en este estudio con rinitis alérgica estacional y/o persistente. La mayoría de los sujetos padecieron la enfermedad durante años y probaron el tratamiento con varios medicamentos, incluidos esteroides. Se indicó a los sujetos que no usaran su medicación actual desde la primera dosis de la formulación de pulverización. La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización nasal, se administró a cada fosa nasal por separado, 2 veces al día durante 7 días.
4 sujetos no completaron el estudio. La retroalimentación recogida de los 34 sujetos restantes se muestra en la Tabla 9 a continuación.
La tasa de incidencia de síntomas es igual al número de sujetos con el síntoma particular, dividido por el número total de sujetos. La tasa efectiva es igual al número de sujetos cuyos síntomas se aliviaron, dividido por el número total de sujetos con el síntoma en particular.
T l
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El paciente descubrió que la formulación de pulverización era fácil de administrar y no producía irritación. La congestión nasal se alivió rápidamente, junto con los estornudos persistentes y la picazón de los ojos 16 de los sujetos se examinaron por un médico después de usar la pulverización durante 7 días. El 50 % de los pacientes mostró menos hinchazón de los cornetes, el 68,75 % presentó menos secreciones nasales y el 43 % mostró reducción del edema mucoso. No se informaron efectos secundarios.
Ejemplo 21
Ejemplo clínico V - Alivio del dolor de garganta mediante inhalación de atomización
Un hombre caucásico de 80 años tenía sensaciones asociadas con la aparición del resfriado común. Los síntomas incluían picazón y dolor de garganta y congestión nasal. Se cargaron 5 ml de la formulación de pulverización I (véase el Ejemplo 12 anterior) en un nebulizador portátil (Feellife Medical INC, Sehnzhen, China). Se colocó la boquilla de succión del nebulizador en la boca y se accionó el dispositivo. El tratamiento duró aproximadamente 10 minutos. La inhalación se realizó solo una vez. A la mañana siguiente, todos los síntomas de resfriado habían desaparecido.
Ejemplo 22
Ejemplo clínico VI: Alivio del dolor por operación en un paciente quemado
Un paciente con quemaduras grandes y profundas de segundo grado que cubrían toda su espalda se hospitalizó en el departamento de quemados del Hospital Jishuitan de Pekín. Se trató por quemaduras graves y sufrió lo que describió como un dolor por operación insoportable cada vez que le cambiaban el apósito, con una VAS de 7 a 9.
La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización, se pulverizó directamente sobre la superficie de la herida por quemadura. Después de 5 minutos, se quitó el apósito y se cambió por uno nuevo. Después del uso de la pulverización, el dolor por la operación se redujo en aproximadamente dos tercios, de acuerdo con la evaluación del médico.
Ejemplo 23
Ejemplo clínico VII: Alivio del dolor por operación en pacientes sometidos a cirugía láser
En este estudio se evaluaron dos sujetos. Los sujetos recibieron cirugía de eliminación de pigmentación de la piel mediante tratamiento con láser fraccionado.
La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización, se pulverizó sobre la superficie del área de operación. Después de 10 minutos, comenzó la operación del láser. Después del uso de la pulverización, el dolor operatorio se redujo en aproximadamente un tercio, de acuerdo con la evaluación del médico. Es normal además que los sujetos que se someten a dicha cirugía láser experimenten un dolor ardiente durante aproximadamente 30 minutos después del tratamiento. Sin embargo, en este estudio, los sujetos no sintieron ningún dolor ardiente después.
Ejemplo 24
Ejemplo clínico VIII: Alivio de la tos y la fiebre
Un niño de 5 años se resfrió y desarrolló una tos fuerte. Su temperatura corporal alcanzó los 38 °C durante la noche y se quejó de dolor de garganta.
Se administró una formulación de pulverización I (véase el Ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización, en forma de pulverización oral, 4 veces al día. Los síntomas de fiebre y dolor de garganta desaparecieron al día siguiente. La tos desapareció a los 3 días.
Ejemplo 25
Ejemplo clínico IX: Alivio de la dermatitis de contacto
Una mujer de 53 años tenía dermatitis de contacto en el cuello. Aparecieron erupciones y picazón al llevar un collar de metal.
La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización, se pulverizó sobre el área afectada. La sensación de picazón se alivió en 5 minutos. Después de 2 dosis (una por la noche y otra a la mañana siguiente), todos los síntomas habían desaparecido.
Ejemplo 26
Ejemplo clínico X: Alivio del resfriado
Los pacientes eran una mujer de 42 años y su hijo de 10 años. Ambos se habían resfriado, sufrían de dolor de garganta y secreción nasal.
La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización, se administró en forma de pulverización oral. Después de 2 dosis (una por la noche y otra a la mañana siguiente), todos los síntomas habían desaparecido.
Ejemplo 27
Ejemplo clínico XI: Trastorno alérgico de la piel
Una mujer de 27 años con piel sensible tenía un trastorno cutáneo alérgico similar al acné con un ligero picor en la cara. También tenía manchas de enrojecimiento e hinchazón en la cara.
La formulación de pulverización I (véase el ejemplo 12 anterior), envasada en un frasco de pulverización, se administró directamente sobre las áreas afectadas de la cara, 2 pulverizaciones a la vez, 3 veces al día. La sensación de picazón se alivió en 30 minutos. Las lesiones desaparecieron por completo después de dos semanas.
Ejemplo 28
Modelo animal I - Fibrosis pulmonar idiopática (IPF)
Animales experimentales y agrupación: 72 ratas Sprague Dawley machos adultas, después de 7 días de alimentación adaptativa, se dividieron en 6 grupos: grupo de operación simulada (sin infección y sin tratamiento), grupo del modelo de IPF (sin tratamiento), grupo de prueba de dosis alta del fármaco, grupo de prueba de dosis media del fármaco, grupo de prueba de dosis baja del fármaco y grupo control positivo.
Las dosis del Compuesto A (Ejemplo 1) se fijaron en 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml y 0,02 mg/ml, como dosis alta, media y baja, respectivamente. La administración oral de pirfenidona (Etuary®, Beijing Continent Pharmaceutical Co., Ltd., Pekín, China) en forma de una dosis de bolo único de 30 mg/kg sirvió como fármaco control positivo.
Modelado y administración: Se establece un modelo de fibrosis pulmonar mediante la instilación intratraqueal de bleomicina. Las ratas se anestesiaron y se colocaron en una mesa de operaciones en posición supina, para exponer la tráquea. Se inyectó solución salina de bleomicina (5 mg/kg) en la tráquea a través del espacio entre los anillos del cartílago traqueal. El grupo de la operación simulada recibió un volumen igual de solución salina normal. Inmediatamente después de la administración, las ratas se elevaron verticalmente y se rotaron para dispersar uniformemente el fármaco. Una vez recuperadas las ratas, después de 5 días aproximadamente, se les administraron diferentes fármacos de acuerdo con el plan del modelo durante 28 días, de forma consecutiva. El plan experimental se muestra en la Tabla 10 a continuación.
T l 1
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Se investigaron los siguientes indicadores de observación.
1) Observación diaria y general de la actividad de las ratas, sensibilidad a estímulos externos, brillo del pelaje, color del pelo, boca, labios, nariz, peso, dieta, respiración y mortalidad.
2) Determinación del coeficiente de órgano pulmonar de las ratas y la relación de peso seco-húmedo de los pulmones (es decir, la relación entre el peso del pulmón del animal y el peso corporal del animal, es decir, la relación entre la víscera y el peso corporal).
3) Durante la formación de la fibrosis pulmonar, se midieron la expresión del factor de crecimiento (TGF-p), el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y otras citocinas que están implicadas en la aparición de la fibrosis. Se usaron métodos ELISA estándar para detectar el contenido de TGF-p, TNF-a, IL-1p, malondialdehído (MDA) y la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en el tejido pulmonar.
4) Detección del contenido de colágeno y metabolito de fibrina (hidroxiprolina) en los pulmones, como indicadores específicos para evaluar el grado de fibrosis pulmonar.
5) Detección de cambios histopatológicos en el tejido pulmonar, que es el indicador más importante y objetivo para evaluar la fibrosis pulmonar.
Los resultados muestran que el Compuesto A inhibe la sobreproducción de TGF-p y citocinas inflamatorias. Los resultados también muestran que el fármaco de prueba tiene un efecto antioxidante, aumentando la producción de SOD y reduciendo la oxidación de lípidos.
Ejemplo 29
Modelo animal II - Experimento antitusivo: método de tos inducida por amoníaco en ratones.
Se dividieron aleatoriamente 60 ratones en 5 grupos de acuerdo con su peso corporal: grupo control negativo de CMC-Na, grupo control positivo de bromhidrato de dextrometorfano y grupos de dosis alta, media y baja (del Compuesto A, Ejemplo 1). Cada grupo contenía 12 ratones, 6 machos y 6 hembras.
El fármaco de prueba se administró a través de inhalación de atomización (0,15 ml/min) durante 1 min, una vez al día durante 5 días. El fármaco control positivo se administró una vez al día mediante administración intragástrica a 10 mg/kg durante 5 días.
Los ratones se colocaron en un vaso de precipitado invertido 1, 2 y 4 horas después de la última administración del fármaco (ya sea el Compuesto A o el fármaco control positivo). Se colocó 1 ml de amoniaco acuoso (25,0 a 28,0 %) en la parte superior de un baño de agua hirviendo y se evaporó en el vaso de precipitado. Los ratones se estimularon mediante vapor de amoniaco durante un tiempo predeterminado de 63,1, 50,1, 39,8, 31,6, 25,1, 20,0, 15,9 o 12,6 segundos. La diferencia en el logaritmo de dos tiempos de estimulación adyacentes se fijó en 0,1, y es 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 y 1,1. Después, los ratones se trasladaron rápidamente a una campana de cristal. El número de toses en 1 minuto se detectó con un estetoscopio. Las toses habituales que ocurren tres o más veces en un minuto se denominan "tos" y las que ocurren menos de tres veces en un minuto son "sin tos".
El tiempo de estimulación con amoniaco para el siguiente ratón se determinó de acuerdo con el principio del método secuencial, es decir, si el primer ratón estaba "tosiendo", el siguiente ratón se estimuló durante un período de tiempo más corto. Por el contrario, si el primer ratón estaba "sin tos", el siguiente ratón se estimulaba durante un período de tiempo más largo.
El EDT50 se definió como el tiempo de estimulación del amoníaco en el que la mitad de los ratones desarrollaron una "tos" y se calculó mediante la ecuación:
EDT50 = lg-1c/n
(c es igual a la suma de r y x, r es el número de animales en cada grupo de tiempo de estimulación, x es el logaritmo del tiempo de estimulación y n es el número de animales en cada grupo). Los resultados se muestran en la Tabla 11 a continuación.
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Los resultados muestran que el Compuesto A tiene un efecto positivo sobre el alivio de la tos.
Ejemplo 30
Modelo animal III - Experimento expectorante: método de excreción de rojo fenol en ratones.
Se dividieron al azar 50 ratones en 5 grupos de acuerdo con el peso corporal: solución salina normal, grupo control negativo, grupo control positivo de cloruro de amonio y dosis alta, media y baja del fármaco de prueba (Compuesto A, anterior, o compuesto E, a continuación). 10 ratones en cada grupo, 5 machos y 5 hembras.
El Compuesto A se administró mediante inhalación de atomización (0,15 ml/min) durante 1 min, una vez al día durante 5 días y el fármaco control positivo se administró mediante administración intragástrica durante 5 días.
Media hora después de la última administración del Compuesto A, se inyectó una solución de rojo fenol al 5 % en la cavidad abdominal. Los ratones se sacrificaron después de otra media hora. Se retiró la piel del cuello y se separó la tráquea desde el cartílago tiroides hasta la bifurcación, se sumergió en solución de bicarbonato de sodio al 5 % con agitación constante. La solución de bicarbonato de sodio se usó para detectar el contenido de rojo fenol.
La absorbancia a 558 nm se detectó mediante espectrofotometría (espectrofotómetro 721G, Shanghai Jingke, Shanghái, China). El valor de densidad óptica se usó para calcular el contenido de rojo fenol en la tráquea mediante referencia a la curva estándar del rojo fenol. Los resultados de cada grupo y el grupo control negativo se evaluaron para una prueba t significativa. Los resultados del experimento expectorante se muestran en la Tabla 12 a continuación.
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Los resultados muestran que el Compuesto A reduce la producción de moco y, por lo tanto, reduce el esputo.
Ejemplo 31
Efecto del compuesto A sobre la actividad del virus del herpes simple humano, tipo II (HSV-II)
Se preparó un medio 1640 sin suero usando RPMI1640 en polvo (dosis de 1000 ml; Thermo Fisher Scientific China), L-glutamina (0,29 g; Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd, Shanghái, China), bicarbonato de sodio (2,2 g; Sinopharm Chemical Reagent Co.), HEPES (2,39 g; Thermo Fisher Scientific China) y agua desionizada (1000 ml).
Los reactivos se mezclaron hasta que se disolvieron y la solución se esterilizó por filtración. La mezcla se formuló en forma de un medio completo que contenía suero al 10 % añadiendo suero bovino neonatal 10 % antes de su uso o la mezcla se formuló en forma de una solución de mantenimiento añadiendo un 2 % de suero bovino neonatal.
Se disolvieron 20 mg del Compuesto A (Ejemplo 1) en 1 ml de solución acuosa al 0,9% de cloruro de sodio para preparar una solución madre de 20 μg/μl. Se añadieron 0,05 ml de la solución madre a 1,95 ml del medio completo (10 %) para formular una solución de fármaco de 500 μg/ml. Se usó la solución de mantenimiento (2 %) en lugar del medio completo en las pruebas antivirus núm. 3 y 4, a continuación.
Las soluciones de trabajo con concentraciones de 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,8125, 3,9063, 1,9531 y 0,9766 μg/ml se prepararon mediante doble dilución.
Se disolvieron 20,34 mg de lauril sulfonato de sodio (SDS; fabricado por AMRESCO LLC, Solon, OH, EE. UU. y envasado por Biosharp Company, Hefei, China; pureza: 99 %) en 10,17 ml del medio de cultivo completo para producir una solución madre de 2000 μg/ml. Se preparó además una solución madre similar de la misma manera usando la solución de mantenimiento para las pruebas antivirales. Las soluciones de trabajo, con las concentraciones descritas anteriormente, se prepararon después mediante doble dilución.
Se disolvieron 2,25 mg de aciclovir (ACV; Zhiyuan Pharmaceutical Co., Ltd, ciudad de Wuxi, China; pureza: 99,3 %) en 2,25 ml del medio de cultivo completo para formar una solución madre de 1000 g/ml. Se preparó además una solución madre similar de la misma manera usando la solución de mantenimiento para las pruebas antivirales. Se diluyeron dos veces 0,8 ml de cada solución madre para proporcionar soluciones de trabajo con concentraciones de 500, 250 y 125 |jg/ml. Se añadieron 0,2 ml de cada solución madre a 1,95 ml del medio de cultivo completo para proporcionar una concentración de 100 jg/ml, que después se diluyó para proporcionar soluciones con concentraciones de 50, 25 y 12,5 jg/ml.
1. Prueba de toxicidad viral sobre HSV-2
Se inocularon 0,5 ml de una suspensión de virus del herpes simple humano tipo II (HSV-2; cepa SAV; Shanghai Institute of Cell Biology) en el cultivo de células Vero en monocapa (Shanghai Institute of Cell Biology) y se eliminó la suspensión de virus 1 hora después de la adsorción.
Se añadió la solución de mantenimiento y se cultivó a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %, hasta que más del 95 % de las células mostraron cambios patológicos evidentes al microscopio (microscopio invertido de control de fase Nikon ECLIPSE TS100, con sistema de imágenes). Las células se recolectaron, se congelaron y descongelaron repetidamente (3 ciclos) y después se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga médica de baja velocidad modelo 400C (Beijing Baiyang Centrifuge Co., Ltd ). El sobrenadante se recogió como solución viral.
La suspensión de células Vero con una densidad de 2 * 105 (número de células) se inoculó en una placa de cultivo de 96 pocillos (Costar, Corning Inc., Oneonta, NY, EE. UU.) a 0,1 ml/pocillo y se cultivó a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 % en una incubadora de CO2 Thermo Scientific durante 18 horas, hasta que una monocapa fue visible al microscopio. El virus que se recogió anteriormente se inoculó en las células Vero de la monocapa con una dilución de 10 veces en la solución de mantenimiento en cada 0,1 ml/pocillo. La solución de mantenimiento se repuso y se cultivó a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %. Se observaron cambios patológicos de las células al microscopio después del cultivo durante 24 horas. Cada dilución se repitió en 3 pocillos. Se usaron células normales como control para el experimento. La prueba de virulencia del virus se repitió 3 veces.
Se observaron tres campos visuales para cada pocillo. Se determinó el porcentaje promedio de células patológicas (P) en el campo de visión.
La dosis infecciosa media del virus (TCID50, 50 % de la dosis infecciosa de un virus en cultivo de tejidos) se calculó de acuerdo con el método convencional de Reed y Muench, es decir, TCID50, que es el logaritmo de la dilución que muestra una mortalidad inmediatamente superior al 50 % - (diferencia de logaritmos * logaritmo del factor de dilución). Generalmente, la siguiente fórmula se usa para calcular la "diferencia de logaritmos" (la diferencia de logaritmos se conoce además como "distancia proporcional" o "valor interpolado"): Diferencia de logaritmos = [(mortalidad a la dilución inmediatamente superior al 50 %) - 50 %]/[(mortalidad inmediatamente superior al 50 %) -(mortalidad inmediatamente inferior al 50 %)].
2. Citotoxicidad del compuesto A y fármacos controles
Se inocularon células Vero en una placa de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron en monocapas. Se añadieron 0,2 ml de la solución del Compuesto A (Ejemplo 1) o fármacos controles (20,34 mg de lauril sulfonato de sodio o 2,25 mg de aciclovir, como se describió anteriormente) a cada pocillo que contenía una concentración diferente de medio completo correcto (como se describió anteriormente). Esto se repitió en 3 pocillos para cada concentración.
El solvente y los cultivos de células normales se usaron como control negativo. Las células se cultivaron a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %, y se observaron el crecimiento y los cambios morfológicos de las células al microscopio durante 2 días. Se seleccionaron tres campos visuales bajo un microscopio para cada pocillo, se contó el porcentaje de células patológicas y se calcularon los valores promedio. El momento de evaluación de la prueba se estableció en 24 horas y se calcularon la concentración tóxica media (TC50) y la concentración no tóxica máxima (TC0). El experimento se repitió 3 veces.
Las células se inocularon como se describió anteriormente. El solvente y los cultivos de células normales se usaron como controles negativos. 24 horas después de añadir el Compuesto A o el fármaco control, se introdujeron 5 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolio (MTT, Sigma-Aldrich (China), Shanghái, China) en PBS (diluido de una solución madre 10x, Sigma-Aldrich (China)) (20 jl/pocillo) y el cultivo continuó durante 4 horas. A continuación, se desechó el sobrenadante de cada pocillo y se añadieron 150 μl de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich (China)), seguido de 10 minutos de agitación en la oscuridad a temperatura ambiente.
El valor de absorción óptica a 550 nm (DO550) se midió mediante un medidor inmunoabsorbente ligado a enzimas (Multiskan Spectrum; Thermo Scientific, Shanghái, China).
3. Efecto del fármaco de prueba y SDS sobre el efecto citopático de los virus después de actuar directamente sobre el HSV-2
El virus HSV-2, conservado a -80 °C (en un congelador de temperatura ultrabaja Haier DW-86L486) con un TCID50 determinado, se diluyó a 200 TCID50 al título determinado (el valor de TCID50 se determinó inicialmente cada vez, lo que permite determinar el 200 TCID50). Las soluciones de 200 TCID50 se mezclaron con un volumen igual del compuesto A o del líquido SDS en el que el título viral era 100 TCID50. La solución mezclada se incubó en un baño de agua (baño de agua electrotérmico a temperatura constante DK-8B; Shanghai Jinghong Biotech Co., Ltd.) a 37 °C durante 1 hora y después se inoculó en una placa de cultivo de 96 pocillos que contenía una monocapa de células Vero. A cada pocillo se le añadió 0,1 ml de la solución mezclada.
El sobrenadante que contenía virus y fármaco se descartó después de 1 hora de adsorción. Las células Vero de la monocapa se lavaron después dos veces con la solución de mantenimiento. Finalmente, se añadieron 0,2 ml de la solución de mantenimiento a cada pocillo. La mezcla resultante se cultivó de manera continua a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %, hasta que la tasa citopática del cultivo libre de fármaco alcanzó el 95 % bajo el microscopio. El momento de evaluación de la prueba se estableció en 24 horas.
Además de los grupos experimentales, se evaluaron tres grupos controles en paralelo: solvente, control sin fármaco (control de virus) y control de células normales. Cada grupo estaba formado por 3 pocillos y el experimento se repitió 4 veces.
El cultivo de virus se diluyó a 0,1, 1, 10, 100 y 1000 TCID50 y se inoculó en cultivos de células en monocapa. Cada dilución se realizó por triplicado. Se observaron las tasas citopáticas para cada pocillo. No debería haber efectos citopáticos a 0,1 TCID50, mientras que debería observarse un efecto citopático a 100 TCID50; de lo contrario, no se establecieron las pruebas de neutralización.
Los indicadores de evaluación fueron los mismos que los de la prueba de toxicidad viral. Se observaron tres campos visuales bajo un microscopio para cada pocillo. Se determinó el porcentaje medio de células patológicas (P) en el campo de visión y se calculó la dosis infecciosa media (TCID50) del virus de acuerdo con el método de Reed y Muencl (como se describió anteriormente).
La toxicidad del fármaco para las células Vero se determinó mediante el método de morfología celular, mientras que las pruebas antivirales se realizaron a concentraciones no tóxicas. Después de la incubación con diferentes concentraciones del fármaco de prueba y SDS durante 1 hora, se inocularon 100 TCID50 HSV-2 (cepa SAV) en cultivo de células Vero en monocapa.
Los resultados muestran que el efecto citopático de las células causado por la infección viral se inhibió en diversos grados, lo que sugiere que el Compuesto A tiene un efecto inhibidor sobre HSV-2.
4. Efecto del fármaco de prueba y ACV sobre HSV-2 (método directo)
El virus se diluyó a 100 TCID50 y se inoculó en un cultivo de células Vero en monocapa a 0,1 ml en cada pocillo. El sobrenadante se desechó después de 1 hora de adsorción y el cultivo se lavó 2 veces con la solución de mantenimiento. A continuación, se añadieron soluciones de diferentes concentraciones del Compuesto A o el fármaco control (aciclovir) a 0,2 ml/pocillo. Los cultivos se cultivaron de manera continua a 37 °C, en atmósfera de CO2 al 5 %. Cada concentración se repitió por triplicado.
Además de los grupos experimentales, se evaluaron tres grupos controles en paralelo: solvente, control sin fármaco (control de virus) y control de células normales.
Durante el período de cultivo, los cambios patológicos se observaron al microscopio y las pruebas se terminaron cuando la tasa citopática del control del virus alcanzó > 95 %. El momento de evaluación de la prueba fue de 24 horas y los experimentos se repitieron 3 veces.
Los criterios de juicio fueron los mismos que los usados en la prueba de toxicidad viral, es decir, se seleccionaron tres campos visuales para el examen microscópico de cada pocillo, se determinó el porcentaje promedio de células patológicas (P) en el campo de visión, se tomó el promedio de los tres campos visuales.
La ecuación de regresión lineal se calculó de acuerdo con el porcentaje de efecto citopático para cada grupo de concentración de reactivo hacia la concentración de fármaco. Se calcularon los valores de IC50 y se calculó además la prueba de significación del coeficiente de correlación.
Los resultados muestran que el Compuesto A tiene un efecto antiviral.
Ejemplo 32
Síntesis de Montelukast-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (es decir, montelukast unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 12 en el extremo N-terminal)
Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Se detectó un segundo pico de producto a los 5,813 minutos por LCMS (modelo de columna de análisis: GS-120-5-C18-BIO, 4,6 x 250 mm; detección: UV a 220 nm; solvente A: TfA al 0,1 % en MeCN, solvente A: TFA al 0,1 % en agua; caudal 1,0 ml/min.; volumen: 10 |jl) y el compuesto.
MS: m/z 875,90[M+2H]2+.
Basándose en los datos de caracterización disponibles y presentados en el presente documento, se entiende que el compuesto aislado por medio de este ejemplo es el que se identificó anteriormente como el compuesto del título. El compuesto del Ejemplo 32 se denomina en lo sucesivo en el presente documento "Compuesto E".
La relación de rendimiento del Compuesto E al Compuesto A fue 1:9.
Ejemplo 33
Síntesis de montelukast estireno hidrogenado-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (es decir, montelukast estireno hidrogenado unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 12 en el extremo N-terminal)
La síntesis del compuesto mencionado anteriormente fue exactamente la misma que el procedimiento para el Compuesto A como se describió en el Ejemplo 1, excepto que se usó montelukast estireno como reactivo en lugar de montelukast.
MS: m/z 867,91 [M+2H]2+.
En base a los datos de caracterización disponibles y presentados en el presente documento, se entiende que el compuesto preparado por medio de este ejemplo es el que se identificó anteriormente como el compuesto del título. De lo contrario, el compuesto que se preparó en el Ejemplo 33 es un compuesto de la invención en el que, en el compuesto de fórmula I, y n es 0 y el compuesto de fórmula I está unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 12 en el extremo N-terminal. En cualquier caso, el compuesto del Ejemplo 33 se denomina en lo sucesivo en el presente documento “Compuesto F”.
Ejemplo 34
Ejemplo clínico XII - Alivio de la fiebre
Un niño de 11 años presentó síntomas de fiebre, con una temperatura de 39 °C a las 21:00 horas. El sujeto también tosía intermitentemente y tenía secreción nasal.
Se administró una formulación de pulverización del Compuesto E (2 mg; véase el Ejemplo 32 anterior) en solución salina normal (5 ml) a cada fosa nasal en forma de niebla por atomización (dispositivo: nebulizador de mano, Lifetrons Beaute NS-400) a las 22:00 horas, durante un período de 5 minutos.
A las 22:15 horas el sujeto se durmió. Alrededor de la medianoche, el sujeto comenzó a sudar y su temperatura bajó un poco. Se administró una segunda dosis de Compuesto E (1 mg) en solución salina normal (2,5 ml) de la misma forma, a las 00:30.
A las 03:30, la temperatura del sujeto descendió a 37,0 °C. A las 08:00, el sujeto tenía una temperatura normal. Así, entre las 22:15 horas del día anterior y las 08:00 horas del día siguiente, solo se observó tos durante medio minuto en total. Durante el sueño esa noche, no hubo obstrucción nasal observable. Por la mañana, aunque había vuelto la secreción nasal, había mejorado significativamente en comparación con las 11 horas anteriores.
El sujeto recibió una tercera dosis de Compuesto E (1 mg) en solución salina normal (2,5 ml), que se le administró de la misma forma, a las 08:30 horas de la misma mañana. Dos horas después, su nariz había dejado de gotear. Posteriormente y hasta las 15:00 horas del mismo día, el sujeto no tuvo fiebre, tos ni secreción nasal.
A las 15:30 horas del segundo día, el sujeto recibió una cuarta dosis de Compuesto E (1 mg) en solución salina normal (10 ml) por atomización (aparato: Yuyue, Nebulizador de compresión de aire, 403 M). A las 20:45 horas, el sujeto tenía una temperatura de 37,1 °C. A las 21:00 horas, el sujeto recibió una quinta dosis de Compuesto E (1 mg) en solución salina normal (10 ml) por atomización. A las 22:15 horas, la temperatura del sujeto era de 36,8 °C.
Ejemplo 35
Comparación de los compuestos A y E en un modelo de edema auricular en ratón (III)
Se llevó a cabo un experimento similar con el mismo protocolo esencialmente que el descrito en el Ejemplo 5 anterior en 30 ratones BALB/c macho sanos. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 6 grupos como se describe en la Tabla 13 a continuación, con 5 ratones en cada grupo.
Tabla 13
Figure imgf000038_0001
Los compuestos A y E se obtuvieron de GL Biochem Ltd y se sintetizaron como se describe en los Ejemplos 1 y 32, respectivamente. Se prepararon soluciones acuosas de los compuestos A y E disolviendo 0,5 mg de polvo en 1 ml de solución salina normal (solución de NaCl al 0,9 % p/v). Se aplicaron 40 μl de la solución preparada al oído derecho de cada grupo.
Se usaron como controles positivos la crema de acetato de dexametasona (5 mg de DEX en 10 g de crema, Fuyuan Pharmaceutical Co. Ltd., Anhui, China), la pulverización nasal de budesonida (32 μg/pulverización X120 pulverizaciones, 0,64 mg/ml, AstraZeneca AB, SE-151 85, Sódertalje, Suecia) y la pulverización nasal de propionato de fluticasona (50 mcg/pulverización, 0,05% p/p, Glaxo Wellcome, S.A., Avenida de Extremadura núm. 3-09400, Aranda de Duero, Burgos, España). La crema se colocó en una jeringa de 1 ml para medir la dosis basada en la calibración del peso y el volumen. Se abrieron los frascos de la pulverización y se pipetearon 40 μl del líquido y se aplicaron en el oído derecho de cada grupo.
Los resultados se muestran en la Figura 15.
Todos los conjugados tuvieron un efecto muy bueno en la eliminación del edema causado por la inflamación aguda. Los efectos antiinflamatorios de los Compuestos A y E fueron equivalentes.
Ejemplo 36
Síntesis de Montelukast-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (es decir, montelukast unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 22 en el extremo N-terminal) y Montelukast Estireno-Ala-Lys- Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (es decir, montelukast estireno unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 22 en el extremo N-terminal)
Se empleó esencialmente el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 1 anterior, pero en el que se ajustó el orden de las etapas de acoplamiento para proporcionar de acuerdo con la secuencia de aminoácidos anterior, para sintetizar un péptido modificado con la SEQ ID No: 22.
Después de esto, montelukast se acopló al extremo N-terminal de Ala. Los dos compuestos del título se separaron y por consiguiente se purificaron mediante LCMS, de manera similar a la descrita en el Ejemplo 32 anterior. Los compuestos se denominan en lo sucesivo en el presente documento Compuesto G (que comprende montelukast) y Compuesto H (que comprende montelukast estireno), respectivamente.
La relación para el rendimiento de los compuestos G: H 1:7
MS (Compuesto G): m/z 876,6 [M+2H]2+
MS (compuesto H): m/z 867,6 [M+2H]2+
Ejemplo 37
Prueba de antagonista de CysLTR1 FLIPR in vitro
El efecto antagonista in vitro de los Compuestos A y E (véanse los ejemplos 1 y 32 anteriores, respectivamente) en una línea celular CYSLTR1 se midió usando el kit de ensayo de calcio Fluo-4 Direct™[Cat núm. F10471, Thermo Fisher Scientific]. Como comparación, se evaluaron además montelukast sódico y montelukast estireno y se usó pranlukast como control positivo. Se evaluaron 10 concentraciones diferentes por duplicado para cada compuesto.
Se usó una línea celular CYSLTR1/HEK293. Las células se prepararon y se añadieron 20 μl de la suspensión celular a las placas de 384 pocillos (20 K/pocillo; placa de revestimiento de proteína poli-D-lisina, Greiner núm. 781946). La placa se colocó a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % hasta el día siguiente.
Se preparó probenecid en tampón de ensayo FLIPR a partir del paquete de inicio correspondiente (Cat. núm. F10471): se preparó una solución madre de 250 mm de probenecid soluble en agua añadiendo 1 ml de tampón de ensayo de calcio Fluo-4 Direct™ a viales de 77 mg que contienen probenecid (Componente B para los cat. núm. F10471). Se añadieron 10 ml de tampón de ensayo de calcio Fluo-4 Direct™ y 200 j l de la solución madre de probenecid 250 mm a un frasco de reactivo de calcio Fluo-4 Direct™ (Componente A). Esta solución de carga de reactivo de calcio 2 x Fluo-4 Direct™ fue suficiente para dos microplacas. La solución se agitó con vórtex y se dejó reposar durante 5 minutos (protegida de la luz), para asegurar que el reactivo se disolviera completamente. El reactivo se preparó fresco cada día Todos los compuestos se disolvieron y se diluyeron en serie en tampón de ensayo de calcio Fluo-4 Direct™ (sin probenecid). La placa de células se retiró de la incubadora y el medio se decantó suavemente. Se transfirieron 20 j l de los compuestos a la placa de células y se añadieron 20 j l de tampón de carga sin lavado Fluo-4 Direct™ 2x. Las concentraciones finales de cada compuesto fueron 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 y 0,03 jM. La placa se incubó durante 50 minutos a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió usando los ajustes del instrumento apropiados para la excitación a 494 nm y la emisión a 516 nm.
Los datos se analizaron usando Prism (GraphPad Software, EE. UU.) y se calcularon las IC50 para cada compuesto. Los resultados se muestran en la Tabla 14 a continuación.
T l 14
Figure imgf000039_0001
Los resultados muestran que montelukast tiene 11 veces más afinidad por CysLTR1 que montelukast estireno. Por lo tanto, el Compuesto E tenía 5 veces más afinidad que el Compuesto A y la afinidad por los compuestos evaluados por CysLTR1 estuvo determinada en gran medida por la estructura del compuesto de la fórmula I.
Ejemplo 38
Prueba de antagonista de CysLTR1 FLIPR in vitro
Se repitió el procedimiento de ensayo descrito en el Ejemplo 37 anterior para el Compuesto G (véase el Ejemplo 36 anterior) y el Compuesto E adicional (véase el Ejemplo 32 anterior) como comparación. Los resultados se muestran en la Tabla 15.
T l 1
Figure imgf000039_0002
Los resultados muestran que los Compuestos G y H tenían el mismo nivel de afinidad por CysLTR1, lo que indicó que el cambio en la secuencia de aminoácidos del péptido tenía poco impacto en la afinidad del conjugado.
Ejemplo 38
Lesión pulmonar inducida por lipopolisacáridos en ratones
Se alojaron 36 ratones macho BALB/c, con un peso corporal de entre 20 y 22 g, en una instalación para animales a entre 22 y 26 °C y entre el 55 y el 75 % de humedad relativa y un ciclo de 12/12 horas día/noche con comida y agua a libre demanda.
Los ratones se dividieron aleatoriamente en 6 grupos como se indica en la Tabla 16 a continuación.
T l 1
Figure imgf000040_0002
El compuesto A se preparó de manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 1 anterior y el compuesto G se preparó de manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 36 anterior.
Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 3% (0,1 ml/10g). Se apartaron las lenguas con unas pinzas. Se administró lipopolisacárido (LPS, 1 mg/ml, 50 jl) con pipeta en la pared posterior de la faringe. Se soltó la lengua y se pellizcó la nariz inmediatamente durante 30 segundos. Después, se liberaron los ratones de la retención y se colocaron nuevamente en jaulas, se despertaron de forma natural. Los ratones del grupo control se trataron con el mismo volumen de solución salina.
Los compuestos de prueba se administraron mediante atomización/inhalación durante 30 minutos después de la inducción de LPS. 24 horas después, se sacrificaron los ratones.
La cavidad torácica se abrió rápidamente y se extrajo todo el pulmón. Se pesó con precisión un pedazo de tejido pulmonar y se añadió solución salina en una relación de 9 ml de solución salina por 1 g de tejido pulmonar. Después, el tejido se homogeneizó y se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm. El homogeneizado se usó para detectar TGF-p1 usando el kit ELISA (Beijing 4A Biotech Co., Ltd, China) y los resultados se muestran en la Figura 16.
Los resultados mostraron que ambos compuestos de la invención reducen las citocinas inflamatorias en los tejidos pulmonares. La concentración de IL-1p en tejido pulmonar en el grupo del Compuesto A fue del mismo nivel que en el grupo de dosis baja para el Compuesto G. El Compuesto G también muestra una eficacia dependiente de la dosis en la reducción de citocinas inflamatorias.
Por tanto, aunque se ha demostrado que ambos compuestos de la invención son eficaces en el tratamiento de la lesión pulmonar aguda inducida por LPS en ratones, la potencia del compuesto G fue aproximadamente 5 veces mayor que la del compuesto A.
Ejemplo 39
Modelo de fibrosis pulmonar idiopática (IPF) en ratas
Se adquirieron 60 ratas SD adultas (30 machos, 30 hembras) del Zhejiang Experimental Animal Center, China. Los animales se alojaron entre 21 y 26 °C y entre 40 y 70 % de humedad relativa con libre acceso a comida y agua.
Después de 7 días de alimentación adaptativa, las ratas se dividieron al azar en 6 grupos como se muestra en la Tabla 17 a continuación.
T l 17
Figure imgf000040_0001
Las ratas se anestesiaron y colocaron sobre una mesa de operaciones en posición supina, para exponer la tráquea. Se inyectaron bleomicina (5 mg/kg, clorhidrato de bleomicina para inyección, Haizheng Pfizer Pharmaceutical Co., Ltd.) y solución salina en la tráquea a través del espacio entre los anillos del cartílago traqueal.
El grupo de la operación simulada recibió un volumen igual de solución salina normal en lugar de bleomicina. Las ratas se levantaron verticalmente inmediatamente después de la administración y se rotaron para permitir que la bleomicina se dispersara uniformemente.
Una vez que las ratas se recuperaron, después de aproximadamente 7 días, se les administraron diferentes fármacos de acuerdo con el plan modelo. Se disolvieron con precisión 6,5 mg de compuestos de prueba de la invención en forma de polvo en 5 ml de solución salina para preparar una solución de 1,3 mg/ml. Para cada rata se atomizaron 0,15 ml de la solución para su inhalación. La inhalación se realizó una vez al día.
Para el grupo de pirfenidona, se abrieron 12 cápsulas de pirfenidona (Beijing Contini Pharmaceutical Co., Ltd., Pekín, China; 100 mg) y el contenido se suspendió completamente en 25 ml de solución de CMC-Na 0,5 % para obtener una suspensión de 48 mg/ml. La dosis de pirfenidona fue de 1,0 ml/200 g en ratas, es decir, 240 mg/kg, y se administró por sonda oral.
Después de 28 días de administración, las ratas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral y después se sacrificaron. La cavidad torácica se abrió rápidamente y se extrajo todo el tejido pulmonar. Se pesó el peso húmedo del pulmón y se calculó el coeficiente pulmonar (peso húmedo del pulmón /peso de la rata x 1000) y se muestran en la Tabla 18 a continuación.
T l 1
Figure imgf000041_0002
Los resultados muestran que los compuestos A, E y H reducen el edema pulmonar causado por la inducción de bleomicina.
Se ligó el bronquio derecho y se perfundió el pulmón izquierdo con solución de formalina in vitro. Se cortó el pulmón izquierdo y se fijó en solución de formalina para examen patológico. El tejido restante se almacenó en nevera a -80 °C para su uso posterior.
El tejido pulmonar fijado se incluyó en parafina y se tiñeron secciones secuenciales de 4 μm con hematoxilina-eosina (HE) y tricrómica de Masson modificada. La lesión pulmonar fibrótica se evaluó morfológicamente mediante parámetros semicuantitativos. Todos los cambios morfológicos se puntuaron de acuerdo con la gravedad de los daños. Las puntuaciones se dieron como 1-4 de acuerdo con el grado ligero, leve, moderado y grave, respectivamente. Ninguna lesión se puntuó como 0. La evaluación de las secciones teñidas con HE fue la suma del grado de fibrosis e inflamación. La evaluación de las secciones teñidas con Masson fue el grado de deposición de colágeno en el intersticio pulmonar. Los resultados se muestran en la Tabla 19 a continuación.
T l 1
Figure imgf000041_0001
Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de operación simulada, la fibrosis pulmonar y la neumonía bronquial en el grupo del modelo fueron más graves. En comparación con el grupo del modelo, los cambios patológicos en el grupo tratado con fármaco fueron similares y el grado de cambios patológicos fue menor. El orden de los cambios patológicos fue el siguiente: Modelo, pirfenidona > Compuesto E > Compuesto A> Compuesto H> operación simulada. Estos resultados indicaron que los compuestos A, E y H evitan la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones y su eficacia fue más fuerte que la de la pirfenidona.
Ejemplo 40
Síntesis de Montelukast-Ala-Lvs-Pro-Ser-Tvr-Hvp-Hvp-Thr-Tvr-Hyp-Lvs (es decir, montelukast estireno unido covalentemente al aminoácido de la SEQ ID No: 20 en el extremo N-terminal)
Se empleó esencialmente el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 1 anterior, pero en el que se ajustó el orden de las etapas de acoplamiento para proporcionar de acuerdo con la secuencia de aminoácidos anterior, para sintetizar un péptido modificado con la SEQ ID No: 20.
Después de esto, montelukast se acopló al extremo N-terminal de Ala. El compuesto se purificó mediante LCMS, de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 32 anterior. El compuesto del título se denominará a continuación en el presente documento Compuesto J.
MS: m/z 924,15 [M+2H]2+
Ejemplo 41
Modelo de edema auricular en ratón IV
Se llevó a cabo esencialmente el mismo protocolo que el descrito en el Ejemplo 5 anterior en 15 ratones BALB/c macho sanos, usando el Compuesto J (véase el Ejemplo 40 anterior) como compuesto de prueba. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos como se describe en la Tabla 20 a continuación, con 5 ratones en cada grupo.
Se preparó un hidrogel del Compuesto J que comprendía 0,5 mg/g de principio activo v metilcelulosa (2,5 %), propanodiol (11 %), glicerol (11 %), ácido acético (regulador de pH; de 0 a 0,5 g). Todos los excipientes se obtuvieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. El gel se completó con agua para invección.
Se usó crema de acetato de dexametasona (Crema DEX; 5 mg de dexametasona en 10 g de crema; Fuvuan Pharmaceutical Co. Ltd., Anhui, China) como control positivo. Se aplicaron 40 μl de los diversos fármacos de tratamiento en el oído derecho de cada grupo.
T l 2
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Los resultados se muestran en la Figura 17. El Compuesto J mostró un efecto muv bueno en la eliminación del edema causado por la inflamación aguda.
Ejemplo 42
Ejemplo clínico - conjuntivitis alérgica
Se diagnosticó a una paciente de 52 años con conjuntivitis alérgica v experimentó hinchazón de los párpados, picazón v nariz acuosa.
Se envasaron 0,5 mg/ml del Compuesto G en solución salina en un frasco de pulverización. La pulverización se administró a cada ojo, de 2 a 3 veces al día durante 7 días.
La paciente sintió alivio de la picazón en los ojos después de un tratamiento. En el segundo día de tratamiento, sus párpados estaban menos hinchados. La recuperación completa de todos los síntomas tuvo lugar en una semana.
Ejemplo 43
Ejemplo clínico - colitis ulcerosa
Un paciente hospitalizado con colitis ulcerosa padecía síntomas graves que incluían dolor abdominal intenso v calambres, diarrea frecuente (más de 20 veces al día) v no respondía a los medicamentos de venta libre. El paciente experimenta sangrado rectal, expulsión de pequeñas cantidades de sangre con las heces, urgencia de defecar v fiebre. Se prepararon hidrogeles del Compuesto G que consistían en 0,5 mg/g de principio activo, metilcelulosa (2,5%), propanodiol (11 %), glicerol (11 %), ácido acético (regulador de pH; de 0 a 0,5 g). Todos los excipientes se obtuvieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. El gel se completó con agua para inyección.
El paciente recibió 2 g del gel anterior mediante administración anal, una vez al día. El segundo día después de la administración, la diarrea se redujo a solo 5-6 veces al día, con menos sangrado.
El paciente continuó usando el gel con el fin de determinar la eficacia a largo plazo.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que contiene péptido que comprende un componente peptídico que comprende o consiste en: a) la secuencia de aminoácidos:
X-Pro-Y-Z (SEQ ID No: 5),
en donde:
X representa una cadena de 1 a 2 residuos de aminoácidos, cada uno de los cuales se selecciona independientemente del grupo que consiste en Ala y Lys;
Y se selecciona del grupo que consiste en Ser y pSer; y
Z representa una cadena de 1 a 7 residuos de aminoácidos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en Tyr, pTyr, 3Hyp o 4Hyp, Thr, pThr, DOPA y Lys;
(b) la secuencia de aminoácidos:
G1-Lys-Pro-G2-T-Hyp-G3-Lys (SEQ ID No: 7),
en donde
G1 está ausente o representa Ala;
G2 se selecciona del grupo que consiste en Ser y pSer;
T se selecciona del grupo que consiste en DOPA, Tyr y pTyr;
Hyp se selecciona del grupo que consiste en 3Hyp y 4Hyp; y
G3 representa una cadena de 1 a 3, o 1 a 4, residuos de aminoácidos seleccionados cada uno independientemente del grupo que consiste en Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr y DOPA;
(c) la secuencia de aminoácidos:
Lys-Pro-G2-T-Hyp-G3-Lys (SEQ ID No: 8),
en donde G2, T, Hyp y G3 son como se ha definido anteriormente; o
(d) la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-G2-T-Hyp-Hyp-Thr-G4-Lys (SEQ ID No: 9),
en donde G4 se selecciona del grupo que consiste en Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr y DOPA, y G2, T e Hyp son como se han definido anteriormente; y
al menos uno de los residuos Lys y/o, cuando esté presente, el residuo Ala, del componente peptídico está unido covalentemente a uno o más compuestos de fórmula I,
Figure imgf000044_0001
en donde:
R1 se selecciona del grupo que consiste en -C(CH3)2OH, -COCH3, -C(CH3)=CH2 y -C(CH3)2H; y
n es 0, 1 o 2,
así como regioisómeros, estereoisómeros y sales farmacéutica o cosméticamente aceptables de dicho compuesto que contiene péptido.
2. Un compuesto que contiene péptido como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde
G1 representa Ala;
G2 representa Ser;
T representa Tyr y/o
G3 o G4 (según corresponda) representa Tyr o DOPA.
3. Un compuesto que contiene péptido como se reivindicó en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el componente peptídico comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos:
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 4);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 11);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 12);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 13);
Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID No: 14);
Lys-Pro-Ser-pTyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID No: 15);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 18);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 19);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 20);
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 21);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 22),
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 23);
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 24); y
Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 25).
4. Un compuesto que contiene péptido como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más compuestos de fórmula I son montelukast, montelukast estireno o montelukast estireno hidrogenado.
5. Un compuesto que contiene péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este, para el uso como un producto farmacéutico.
6. Una formulación farmacéutica que comprende un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este, y un adyuvante, diluyente o portador farmacéutica o cosméticamente aceptable.
7. Un compuesto que contiene péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este, o una formulación como se definió en la reivindicación 6, para el uso en el tratamiento de la inflamación, un trastorno inflamatorio y/o un trastorno caracterizado por inflamación o para el uso en el tratamiento de fibrosis pulmonar idiopática.
8. Un compuesto, o una formulación, para el uso como se reivindica en la reivindicación 7, en donde:
(a) el trastorno inflamatorio comprende inflamación de uno o más de los tejidos blandos, las articulaciones, los nervios, el sistema vascular, uno o más órganos internos, una o más superficies mucosas o la piel;
(b) el trastorno inflamatorio comprende inflamación de una o más de las superficies mucosas y se selecciona entre mucositis oral, úlceras aftosas, otitis media, laringitis, traqueítis, esofagitis, gastritis, enteritis y enterocolitis, disentería bacilar, disentería amébica crónica, esquistosomiasis, colitis ulcerosa no específica, enteritis regional, cervicitis y endocervicitis, endometritis, inflamación causada por lesión por inhalación, inflamación de las mucosas asociada con cánceres e inflamación de las mucosas asociada con una infección;
(c) el trastorno inflamatorio comprende inflamación del corazón, el estómago, el intestino, el pulmón, el hígado, el bazo, el riñón, el páncreas, la vejiga, el ovario o la próstata, pericarditis, miocarditis, endocarditis, neumonía, hepatitis, esplenitis, nefritis pancreatitis, cistitis, ooforitis, prostatitis o una úlcera gástrica;
(d) el trastorno inflamatorio se selecciona de psoriasis, acné, eccema, dermatitis, dermatitis seborreica, rinitis, conjuntivitis, hemorroides, una enfermedad pulmonar obstructiva crónica, que incluye enfisema o bronquitis crónica y una enfermedad inflamatoria del intestino;
(e) el trastorno inflamatorio comprende inflamación del ojo y el área circundante, conjuntivitis, queratitis o neuritis óptica; y/o
(f) el trastorno caracterizado por inflamación es, o resulta en, una herida o una quemadura.
9. Un compuesto o una formulación, para el uso como se reivindica en la reivindicación 8, en donde:
(a) el trastorno inflamatorio es asma, rinitis alérgica, dermatitis alérgica/atópica o dermatitis seborreica;
(b) la enfermedad inflamatoria del intestino es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn;
(c) el trastorno inflamatorio del ojo se selecciona entre conjuntivitis alérgica, queratitis epitelial aguda, queratitis numular, queratitis intersticial, queratitis disciforme, queratitis neurotrófica, queratitis de placa mucosa, queratitis por herpes simple, queratitis por herpes zóster, queratitis bacteriana, queratitis fúngica, queratitis por Acanthamoeba, queratitis oncocercal, queratitis punteada superficial, queratitis ulcerosa, queratitis por exposición, fotoqueratitis y ojo rojo agudo por lentes de contacto;
(d) la herida comprende una abrasión, un rasguño, una incisión, una laceración, una punción en la piel, una avulsión, un hematoma, una cicatriz o una ampolla; y/o
(e) el trastorno que resulta en una herida es hemorroides o colitis ulcerosa.
10. Un compuesto que contiene péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este, o formulación como se define en la reivindicación 6, para el uso en el tratamiento de una afección pulmonar y/o una afección fibrótica, seleccionada de fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, silicosis, bronquitis aguda, bronquitis crónica, traqueobronquitis, asma bronquial, estado asmático, bronquiectasia, infecciones del tracto respiratorio superior, (que incluyen el resfriado común y la gripe), inflamación alérgica de las vías respiratorias, neumonía bacteriana, neumonía viral, neumonía por micoplasma, reckettsia, neumonía radiactiva, neumonía neumocócica, neumonía estafilocócica, neumonía estreptocócica y neumonía por bacilos gramnegativos, candidiasis pulmonar, aspergilosis, mucormicosis, histoplasmosis, actinomicosis y nocardiosis, micosis pulmonar, criptococosis, abscesos pulmonares, neumonía anafiláctica, síndrome de Leoffer, alveolitis alérgica extrínseca, eosinofilia pulmonar, eosinofilosis, enfisema pulmonar obstructivo, edema pulmonar, tuberculosis pulmonar, alcalosis respiratoria (acidosis), lesión pulmonar aguda, enfermedad pulmonar intersticial, empiema, fibroma pulmonar y cor pulmonale.
11. Un compuesto, o una formulación, para el uso como se reivindica en la reivindicación 10, en donde la afección se selecciona entre fibrosis pulmonar idiopática o lesión pulmonar aguda.
12. Un compuesto que contiene péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de este, o una formulación como se define en la reivindicación 6, para el uso en el tratamiento de una infección viral, causada por uno o más virus seleccionados entre un adenovirus, virus del papiloma humano, virus BK, virus JC, virus del herpes simple de tipo 1, virus del herpes simple de tipo 2 virus, virus de la varicela-zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus humano, virus del herpes humano de tipo 8, viruela, virus de la hepatitis B, parvovirus B19, astrovirus humano, un norovirus, virus de Norwalk, coxsackievirus, virus de la hepatitis A, poliovirus, un rinovirus, un coronovirus, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la rubeola, virus de Lassa, hantavirus, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus Hantaan, virus del Ébola, virus de Marburg, virus Ravn, un virus de la influenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la parainfluenza, virus respiratorio sincicial, rhabdoviridae, virus de la hepatitis E, rotavirus, orbivirus, coltivirus, virus de Banna y virus de la hepatitis D.
13. Un compuesto, o una formulación para el uso como se reivindica en la reivindicación 12, en donde el virus se selecciona de un adenovirus, virus del papiloma humano, virus del herpes simple de tipo 1, virus del herpes simple de tipo 2, un rinovirus, un coronavirus, un virus de la influenza A, un virus de la influenza B o virus de la influenza C, un virus de parainfluenza y un virus sincicial respiratorio.
14. Un compuesto, o una formulación, para el uso como se reivindica en la reivindicación 13, en donde el virus causa una infección de las vías aéreas.
15. Un compuesto, o una formulación para el uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 14 (según corresponda), en donde el compuesto o compuestos o la sal de estos se administran en forma de una formulación tópica para tratar la afección relevante mediante administración tópica directa a la piel, o a la superficie de la mucosa.
16. Un compuesto, o una formulación para el uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 15 (según corresponda), en donde el compuesto o los compuestos se administran mediante suministro oral, intravenoso, intraarterial, intravascular, perivascular, intramuscular, cutáneo, subcutáneo, transmucosal, sublingual, bucal, rectal, intravaginal, transdérmico, nasal, pulmonar, traqueal, bronquial, intraperitoneal o anorrectal.
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