ES2955462T3 - Nuevos tiromiméticos con un esqueleto de bifenilmetano y su uso - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I) o una sal del mismo, en la que R1 es H, alquilo (C1-C3) o CF3; R2 es H, alquilo (C1-C3) o CF3; A es CH2COOH, XCH2COOCH2CH3, XCH2COOH, XCH2CH2NH2, donde X es un átomo de nitrógeno u oxígeno; Ar es un fragmento aromático seleccionado del grupo formado por (Ar1), (Ar2) y (Ar3); donde R3 es H, -CH3, -CH2CH3 o CH3CO-, R4 es H o -CH3, R5 es H o -CH3 y R6 es H o -CH3. Los compuestos de Fórmula (I) se pueden usar en el tratamiento de enfermedades moduladas por el receptor beta de la hormona tiroidea (TRb o TRβ). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos tiromiméticos con un esqueleto de bifenilmetano y su uso
Campo de la invención
La invención se refiere a nuevos tiromiméticos y su uso.
Antecedentes de la invención
Las hormonas tiroideas (HT) son moléculas reguladoras esenciales para el crecimiento y desarrollo normales y para mantener la homeostasis metabólica (1).
Las HT desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica corregida, por ejemplo la función cardíaca, el peso corporal, el metabolismo, el nivel de colesterol, los huesos, los músculos y la temperatura corporal. La disfunción tiroidea conduce a la aparición de estados patológicos, tales como el hipotiroidismo o el hipertiroidismo. En la actividad de las HT intervienen receptores (RT) de hormonas tiroideas. Existen dos isoformas principales de RT codificadas en genes separados, a saber, RTa y RTp, y ambas isoformas de RT se unen a 3,5,3'-triyodotironina (T3) e intervienen en la expresión génica regulada por HT a través de interacciones con elementos de respuesta del ADN y con varios coactivadores y correpresores nucleares.
En el sistema nervioso central (SNC), las hormonas tiroideas ejercen profundos efectos en el desarrollo y mantenimiento de la función cerebral, influyendo en diversas actividades tales como la diferenciación de células neuronales y gliales, la mielinización y la neurogénesis (2, 3).
En el hígado, las HT influyen en el metabolismo lipídico hepático a través de múltiples rutas, con efectos esclarecedores sobre el gasto de energía (4), la oxidación de grasas (5) y el metabolismo del colesterol (6). Se ha descrito de que la alteración de la señalización celular de HT provoca enfermedades asociadas al hígado, tales como enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y carcinoma hepatocelular (CHC) (7).
Desafortunadamente, no se pueden utilizar HT como tratamiento farmacológico debido a los graves efectos secundarios adversos que incluyen aumento de la frecuencia cardíaca, hipertrofia cardíaca, atrofia muscular y reducción de la densidad ósea.
Se ha demostrado que la modulación selectiva de receptor p de hormona tiroidea (RTp) soslaya muchos de estos efectos indeseados, lo que sugiere que el RTp es una potencial diana terapéutica para regular el metabolismo lipídico, que es esencial para el tratamiento y prevención de varias enfermedades crónicas tales como obesidad, diabetes y enfermedades cardiovasculares (ECV), sin efectos secundarios cardíacos.
Además, estudios in vitro e in vivo han proporcionado evidencia de la utilidad potencial de la activación de las rutas dependientes de T3 en el síndrome metabólico, la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) y en el tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC) (7). Por lo tanto, una estrategia terapéutica basada en su uso, como agente único o en asociación, podría ser eficaz para el tratamiento de enfermedades hepáticas (es decir, EHGNA, EHNA y CHC) que actualmente carecen de cualquier fármaco eficaz.
De manera regular, se ha reconocido desde hace tiempo a la T3 como un potente hepatomitógeno, y también parece que en dicha actividad interviene RT-p1(8). Aunque el efecto hepatomitógeno de la T3 podría representar una herramienta útil en condiciones patológicas caracterizadas por una capacidad regenerativa deteriorada (es decir, hígados envejecidos), donde se requiere una rápida estimulación del crecimiento del hígado (es decir, trasplante de hígado humano y resección hepática) [9], su uso se ve obstaculizado por sus efectos tóxicos.
Es importante destacar que las HT participan en varios mecanismos alternativos de regulación metabólica. De hecho, aunque el efecto directo sobre la transcripción de genes implicados en el metabolismo está bien establecido, recientemente han surgido también efectos indirectos, que implican la activación de rutas celulares alternativas (9).
Ciertas evidencias han revelado que los ácidos grasos libres que se generan a partir de gotitas lipídicas almacenadas en el hígado requieren la activación de rutas celulares reguladas por T3. Además, este proceso parece estar acoplado con la inducción de autofagia hepática, en la cual está implicada la señalización de proteína cinasa activada por 5'-AMP (AMPK, por sus siglas en inglés) (10).
La AMPK es una proteína cinasa de serina/treonina que desempeña un papel central en la regulación del metabolismo celular y el equilibrio energético en células de mamíferos (11). Una vez activada, la AMPK activa varias rutas, tales como la glucólisis, la oxidación de ácidos grasos y la lipólisis. Los efectos globales sobre el metabolismo de los lípidos consisten en estimular la oxidación de ácidos grasos (OAG) y bloquear la síntesis de colesterol y triglicéridos (11, 12). En última instancia, es bien sabido que las rutas de señalización AMPK/mTOR desempeñan un papel clave en el proceso de autofagia, que se está convirtiendo en una característica importante a la que apuntar en la prevención o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Basándose en esto, no sorprende que la AMPK pueda ser en sí misma una diana de la acción de las HT.
También se ha sugerido el posible uso de HT para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En particular, los agonistas selectivos de RTp pueden mejorar la diferenciación de oligodendrocitos (OL) y promover la mielinización (3, 13). El papel clave que desempeña el RTp en el crecimiento y desarrollo celular, así como en el metabolismo lipídico, confirma a este receptor como una diana valiosa para el desarrollo de nuevas terapias contra enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP). Desafortunadamente, hasta la fecha no ha sido introducido en la clínica ningún tiromimético selectivo para RTp, lo que convierte a esta clase de compuestos en un objetivo aún no explotado en la clínica.
Compendio de la invención
Teniendo en cuenta todos los efectos beneficiosos inducidos por los agonistas selectivos de RTp, se han desarrollado nuevas moléculas para ser utilizadas, como agente único o en asociación, en el tratamiento de enfermedades hepáticas (tales como EHGNA, EHNA, CHC) o enfermedades neurodegenerativas (como EM, EA, EP) que actualmente carecen de cualquier fármaco eficaz.
Así pues, los inventores han apuntado a desarrollar nuevas moléculas como moduladores selectivos de RTp que pudiesen ser útiles contra enfermedades asociadas al hígado, tales como la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) y el carcinoma hepatocelular (CHC).
Es un objeto de la invención proporcionar moléculas pequeñas capaces de inducir los siguientes efectos: modulación de RTp, inducción de efectos hepatomitogénicos, activación de AMPK, efectos lipolíticos.
El objeto antedicho se ha conseguido mediante un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000003_0001
donde
R1 es H, alquilo(C1-C3) o CF3;
R2 es H, alquilo(C1-C3) o CF3;
A es CH2COOH, XCH2COOCH2CH3, XCH2COOH, XCH2CH2NH2, donde X es átomo de nitrógeno o de oxígeno; Ar es un fragmento aromático seleccionado del grupo consistente en
Figure imgf000003_0002
donde
R3 es H, -CH3, -CH2CH3 o CH3CO-,
R4 es H o -CH3,
R5 es H o -CH3 y
R6 es H o -CH3.
Los compuestos de fórmula (I) han demostrado ser moduladores selectivos de receptor beta de hormona tiroidea (RTp). Por lo tanto, en otro aspecto la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) para uso como medicamento, específicamente como modulador selectivo de receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
Así, los inventores han descubierto compuestos tiromiméticos RTp que pueden emplearse en el tratamiento de enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) para uso en el tratamiento de enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
Las enfermedades que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención son enfermedades hepáticas (tales como enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y carcinoma hepatocelular (CHC)), dislipidemia y enfermedades neurodegenerativas (tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP)). Ventajosamente, los compuestos de fórmula (I) son capaces de tratar las enfermedades arriba enumeradas, al ser compuestos tiromiméticos selectivos para RTp.
Descripción de las figuras
Figura 1. IS25 y TG68 inducen lipólisis en células HepG2. Glicerol liberado en el medio de cultivo (0,5 ml) de células HepG2 al cabo de 24 horas de tratamiento con IS25, TG68 y T3 en dos dosis (1 y 10 μM). Se utilizaron como testigos positivos isoproterenol (ISO) 10 μM y cloroquina (CLO) 25 μM. Los valores representan la media ± EEM de 4 a 8 experimentos. Se compararon los grupos mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de rango de Tukey. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,005.
Figura 2. Efectos de IS25 y TG68 sobre la acumulación total de lípidos en células HepG2. Se trataron las células durante 24 h con IS25, TG68 o T3 en dos dosis (1 - 10 μM). Se utilizaron como testigos positivos isoproterenol (ISO) 10 μM y cloroquina (CLO) 25 μM. Se eluyeron con isopropanol gotitas de aceite intercelular teñidas con rojo aceite O y se cuantificaron mediante análisis espectrofotométrico a 510 nm. Los valores representan la media ± EEM de 4 a 8 experimentos. Los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de rango de Tukey. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,005.
Figura 3. IS25 y TG68 regulan el metabolismo en células HepG2 a través de la ruta AMPK/ACC. A) Imágenes de inmunotransferencia representativas y el análisis cuantitativo de la fosforilación de AMPK. B) Imágenes de inmunotransferencia representativas y el análisis cuantitativo de la fosforilación de ACC. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,005.
Figura 4. IS25 y TG68 no promueven toxicidad en células HepG2. Viabilidad celular al cabo de 24 horas de incubación con IS25 y TG68 o T3. Las concentraciones se encuentran en el intervalo de 1 a 10 μM. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT. Los valores representan la media ± EEM de tres experimentos independientes.
Figura 5. Determinación del perfil ADME-TOX Para evaluar el perfil ADME-TOX de nuevos compuestos sintetizados se realizó un panel completo de ensayos in vitro. Los efectos citotóxicos se evaluaron en 4 líneas celulares diferentes (U2-OS, HEK293, hTERT, MCF-7) a las 24 h y 48 h después del tratamiento con los nuevos compuestos. Se evaluó la toxicidad cardíaca evaluando el efecto de inhibición de los compuestos sobre el canal iónico hERG, una antidiana importante implicada en las funcionalidades cardíacas. Se evaluó la interferencia metabólica ensayando los efectos inhibidores de los nuevos compuestos en cuatro isoformas de CYP450 (CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4). Para evaluar efectos inconvenientes sobre dianas no deseadas, se han evaluado los efectos inhibidores frente a varias dianas no deseadas bien conocidas. Se eligieron HDAC6, HDAC8 y SIRT7 como representantes de una modulación epigenética indeseada. Además de ello, se realizó una evaluación rápida de los compuestos frente a fosfodiesterasa (PDE4C1) y cinasa Aurora-B, proteínas conocidas por su papel en la supervivencia celular y la tumorogénesis. Todos los experimentos de evaluación rápida se realizaron (por triplicado) a una concentración de 10 μM, normalizándose los resultados de cada compuesto mediante el uso de los datos brutos respectivos para los testigos altos y bajos. Los datos fueron recopilados y analizados en forma de un sistema de semáforo utilizando los criterios que se exponen a continuación.
Figure imgf000004_0001
Figura 6. Efecto de T3, IS25 y TG68 sobre la proporción peso del hígado/peso corporal. Se trataron ratas macho F344 durante 3 días con inyecciones intragástricas (IG) diarias de IS25 o TG68 (50, 75 y 100 μg/100 g de peso corporal) o T3 (20 μg/100 g de peso corporal). Un grupo testigo recibió el vehículo (5% de DMSO en aceite de maíz). Además, dos grupos recibieron inyecciones diarias de IS25 o de TG68 a una dosis de 75 μg/100 g de peso corporal, por vía intraperitoneal durante 3 días. **p < 0,01
Figura 7. Efecto de T3, IS25 y TG68 sobre la actividad mitótica de hepatocitos. Para medir la proliferación de hepatocitos, los animales recibieron bromodeoxiuridina (BrdU; 1 g/1 l) en agua potable durante el período de tratamiento de 3 días con IS25 o TG68 (i.g., 50, 75 y 100 μg/100 g de peso corporal; o i.p. 75 μg/100 g de peso corporal), o con T3 (20 μg/100 g de peso corporal). A. El índice de marcado (I. M.) de hepatocitos de ratas F344 sometidas al tratamiento con compuestos de prueba se expresó como número de núcleos de hepatocito positivos para BrdU/100 núcleos. Los resultados se expresaron como medias ± EE de 3 - 5 ratas por grupo. Se puntuaron al menos 3000 hepatocitos por hígado. *p < 0,05; **p < 0,01.
B. Microfotografía que ilustra la presencia de varios núcleos de hepatocito positivos para BrdU en el hígado de ratas tratadas con T3, IS25 y TG68 (secciones teñidas con anticuerpo anti-BrdU y contrateñidas con hematoxilina).
Figura 8.Tabla 1.Niveles séricos de colesterol, glucosa, transaminasas hepáticas, alfa-amilasa, lipasa, bilirrubina y triglicéridos en ratas expuestas al tratamiento con IS25 o TG68 (i.g., 50, 75 y 100 μg/100 g de peso corporal; o i.p., 75 μg/100 g de peso corporal) o T3 (20 μg/100 g de peso corporal) durante 3 días.
Figura 9. Ni TG68 ni IS25 provocan proliferación de células acinares pancreáticas. El experimento se realizó en ratas no tratadas (CO) o tratadas con T3, GC1, TG68 o IS25 durante una semana. Se administró T3 en la dieta (4 mg/kg de dieta); se administró GC1 (50 μg/kg) mediante alimentación forzada una vez al día; se disolvieron TG68 e IS25 en agua potable, a una dosis de 50 μg/kg. Se administró BrdU (1 mg/ml) en agua potable durante toda la duración del experimento. Se observan varias células acinares positivas para BrdU en el páncreas de ratas tratadas con T3 y GC1, pero no en animales tratados con TG68 e IS25; la figura muestra el I. M. de las células acinares pancreáticas de rata. El I. M. se expresó como número de núcleos de células acinares positivas para BrdU/100 núcleos. Se puntuaron al menos 2000 células acinares por páncreas. Los resultados se expresan como medias ± EE de 3 a 5 ratas por grupo (ANOVA unidireccional). ***Estadísticamente significativo respecto al testigo; p < 0,001.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo:
Figure imgf000005_0002
donde
R1 es H, alquilo(C1-C3) o CF3;
R2.es H, alquilo(C1-C3) o CF3;
A es CH2COOH, XCH2COOCH2CH3, XCH2COOH, XCH2CH2NH2, donde X es átomo de nitrógeno o de oxígeno; Ar es un fragmento aromático seleccionado del grupo consistente en
Figure imgf000005_0001
donde
R3 es H, -CH3, -CH2CH3 o CH3CO-,
R4 es H o -CH3,
R5 es H o -CH3 y
R6 es H o -CH3.
R1 es H, alquilo(C1-C3) o CF3. Preferiblemente R1 es alquilo(C1-C3), preferiblemente metilo.
R2 es H, alquilo(C1-C3) o CF3. Preferiblemente R2 es alquilo(C1-C3), preferiblemente metilo.
A es CH2COOH, XCH2COOCH2CH3, XCH2COOH, XCH2CH2NH2, donde X es átomo de nitrógeno o de oxígeno. Preferiblemente A es XCH2COOH, y más preferiblemente X es oxígeno.
Ar se selecciona del grupo consistente en Ar1, Ar2 y Ar3.
Preferiblemente Ar es Ar1. Más preferiblemente R3 es CH3CO-.
Cuando Ar es Ar2, R6 es preferiblemente CH3.
Cuando Ar es Ar3, R4 es preferiblemente CH3.
El compuesto de fórmula (I) se puede utilizar como base libre o en una forma de sal. Preferiblemente, la sal es una sal seleccionada entre hidrocloruro, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, hidrogenosulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, acetatos, citratos, oxalatos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos y tartratos. También se puede formar una sal entre un catión y un grupo cargado negativamente. Los cationes adecuados incluyen ion potasio, ion magnesio, ion calcio y un catión amonio tal como ion tetrametilamonio. Ejemplos de algunos iones amonio sustituido adecuados son los derivados de: etilamina, dietilamina, trietilamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, colina, meglumina y trometamina, así como aminoácidos, tales como lisina y arginina.
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo consistente en:
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (IS25),
4-(4-(2-aminoetoxi)-2,6-dimetilbencil)-N-etil-2-isopropilanilina (IS62),
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3-metilfenoxi)acético (TR29),
ácido (4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (TG68),
hidrocloruro de 4-(4-(2-aminoetoxi)-2-(trifluorometil)bencil)-N-etil-2-isopropilanilina (EP54),
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3-(trifluorometil)fenoxi)acético (TR30),
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-(trifluorometil)fenoxi)acético (TR45),
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM23),
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM33),
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-metilfenoxi)acético (GM21),
(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenil)glicina (PA8),
(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenil)glicinato de etilo (PA6),
N1-(4-((8-metoxi-2-metilquinolin-5-il)metil)fenil)etano-1,2-diamina (GM10),
ácido 2-((4-((8-metoxi-2-metilquinolin-5-il)metil)fenil)amino)acético (GM24),
(4-((1 -metil-1 H-indol-5-il)metil)fenil)glicina (TR201) y
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-metilfenil)acético (RM81).
A continuación se describen los compuestos antes citados, con su estructura general, y que han sido preparados como se describe en la parte experimental.
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Más preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo consistente en ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (TG68), ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (IS25), ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM23) y ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM33).
Aún más preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo consistente en ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (TG68) y ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (IS25).
Estos últimos compuestos han resultado ser muy solubles en agua; también fueron sometidos a una investigación preliminar para evaluar si dos nuevos agonistas de RTp podrían estimular la proliferación de hepatocitos. Por lo tanto, se disolvieron TG68 e IS25 en agua potable y se seleccionó la dosis más alta de los mismos en función de la actividad mitogénica en el hígado de rata y de ratón mostrada por una dosis similar del análogo GC-1 (sobetirome) [Endocrinology 2006;147(7):3211-8, J Hepatol 2010;53(4):686-92], que era conocido como compuesto insoluble en agua. Ventajosamente con respecto a GC-1, la administración oral resultó entonces la vía ideal de administración para futuros estudios traslacionales.
Además, y sorprendentemente, en un estudio preliminar que se muestra en la parte experimental a continuación, los compuestos TG68 e IS25 resultaron mitogénicos, a diferencia de T3 o GC-1 (elegido como fármaco de referencia), sólo para el hígado y no para otros tejidos, tales como el compartimento de células acinares del páncreas
Los compuestos de fórmula (I) han demostrado ser moduladores selectivos de receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
Por lo tanto, en otro aspecto la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) para uso como medicamento, específicamente como modulador selectivo de receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacológica que comprende el compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo. La sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula (I) se puede seleccionar del grupo consistente en hidrocloruro, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, hidrogenosulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, acetatos, citratos, oxalatos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos y tartratos. También se puede formar una sal entre un catión y un grupo cargado negativamente. Los cationes adecuados incluyen ion potasio, ion magnesio, ion calcio y un catión amonio tal como ion tetrametilamonio. Son ejemplos de algunos iones amonio sustituidos adecuados los derivados de: etilamina, dietilamina, trietilamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, colina, meglumina y trometamina, así como aminoácidos tales como lisina y arginina.
La composición puede comprender también excipientes farmacéuticamente aceptables y puede administrarse en una forma farmacéutica adecuada para la vía de administración deseada. Pueden ser aditivos farmacéuticamente aceptables excipientes, ligandos, agentes dispersantes, colorantes, humectantes, comúnmente utilizados para la preparación de comprimidos, cápsulas, píldoras, soluciones, suspensiones, emulsiones para administración oral. También se contemplan soluciones inyectables para la administración parental, que comprende la administración subcutánea, espinal y transdérmica.
La composición farmacéutica según la presente invención está destinada preferiblemente a la administración oral y parenteral.
Así, los inventores han descubierto compuestos tiromiméticos RTp que pueden emplearse en el tratamiento de enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) para uso en el tratamiento de enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
Las enfermedades que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención son enfermedades hepáticas (tales como enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y carcinoma hepatocelular (CHC)), dislipidemia y enfermedades neurodegenerativas (tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson (EP)).
Ventajosamente, los compuestos de fórmula (I) son capaces de tratar las enfermedades arriba enumeradas, al ser compuestos tiromiméticos selectivos para RTp.
La invención proporciona además un método para modular selectivamente receptor beta de hormona tiroidea (RTb). También se incluye en la invención un método para tratar enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTb o RTp), tales como enfermedades hepáticas (tales como enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y carcinoma hepatocelular (CHC)), dislipidemia y enfermedades neurodegenerativas (tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson (EP)). El método para tratar una enfermedad modulada por receptor beta de hormona tiroidea (RTb o RTp) en un sujeto que lo necesita comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, tratando o reduciendo así el riesgo de desarrollar dicha enfermedad.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden emplear solas o en combinación con, o pueden comprender, uno o más fármacos adicionales. Pueden ser fármacos adicionales, por ejemplo, agentes hipocolesterolémicos tales como estatinas y opcionalmente resinas de intercambio iónico o agentes antiinflamatorios tales como fármacos inhibidores de citocinas.
Se describirá ahora la invención, haciendo referencia a ejemplos.
Par te experimental
Preparación de los compuestos de fórmula (I)
Química. Materiales y métodos generales. Se utilizaron disolventes anhidros de calidad comercial, sin secado adicional. Los productos químicos disponibles comercialmente se adquirieron de Sigma-Aldrich o Alfa Aesar, y se utilizaron sin purificación adicional. La evaporación se realizó en vacío (evaporador rotatorio). Como agente desecante se utilizó siempre Na2SO4 anhidro. La cromatografía ultrarrápida se realizó sobre gel de sílice de alta pureza Merck 60 Á (0,40 - 63 μm). Las reacciones fueron seguidas mediante CCF, realizada en placas de gel de sílice de aluminio Merck (60 F254). Se observaron las manchas bajo una lámpara UV (254 nm) o con la ayuda de ácido fosfomolíbdico al 10% en EtOH. Las reacciones de hidrogenación se realizaron mediante un generador de hidrógeno HG2000 CLAIND®. Se utilizó como agente filtrante Celite® 545.
Los espectros RMN de 1H, 13C y 19F se obtuvieron utilizando un espectrómetro Bruker Avance 400, y se registraron a 400, 101 y 376 MHz, respectivamente. Los desplazamientos químicos se expresan como valores 5 en partes por millón (ppm), campo abajo desde la referencia interna tetrametilsilano (TMS) y referenciados a partir de la resonancia del disolvente como estándar interno: deuterocloroformo [5 7,26 (espectros 1H), 5 77,16 (espectros 13C)]; deuterodimetilsulfóxido [52,50 (espectros 1H), 539,52 (espectros 13C)]; deuterometanol [53,31 (espectros 1H)]. Las constantes de acoplamiento J están expresadas en hercios (Hz). Los espectros RMN de 19F y 13C están desacoplados de 1H. Los espectros RMN de 19F están sin referenciar, y corregidos a partir de ácido trifluoroacético (TFA) como estándar externo (-76,2 ppm). Los patrones de señal se indican de la siguiente manera: singlete (s), doblete (d), triplete (t), doble doblete (dd), doble triplete (dt), multiplete (m), singlete ancho (sa), doblete ancho (da), triplete ancho (ta) y multiplete ancho (ma).
Abreviaturas: DCM= diclorometano TFA= ácido trifluoroacético TBTU= tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronio; DIPEA= N,N-diisopropiletilamina; DMF= N,N-dimetilformamida; t.a. = temperatura ambiente.
Los compuestos IS25, TR29, TG68, TR30, TR45, GM23, GM33 y GM21 fueron preparados según el esquema 1. Una reacción de acoplamiento cruzado de Suzuki entre el compuesto 1 y el ácido fenilborónico adecuadamente sustituido condujo a los intermedios 2a-d, que fueron tratados con BBr3 a -10 °C para proporcionar los derivados fenólicos 3a-d. Después, la reacción de O-alquilación de 3a-d con ácido bromoacético condujo a los compuestos finales TG68, TR45, GM23, GM21. La reacción de desacetilación en presencia de ácido clorhídrico de grado concentrado proporcionó los compuestos finales IS25, TR29, TR30, GM33.
Esquema 1
Figure imgf000010_0003
Reactivos y condiciones: (a) K2CO3, PdCl2, acetona, H2O, t.a., 72 h; (b) BBr3, DCM, -10 °C, 1 h; (c) BrCH2COOH, DMF, Cs2CO3, t.a., 1 h; (d) HCl 37 %, H2O, 120 °C, 12 h
Los compuestos IS62 y EP54 fueron preparados según el esquema 2. En particular, el fenol 3a,d reacciona con bromoacetonitrilo dando el compuesto 4a,d, que luego fue sometido a una reducción con LiAIH4/AlCl3 para proporcionar los compuestos IS62 y EP54.
Esquema 2
Figure imgf000010_0001
Reactivos y condiciones: a: BrCH2CN, DMF, Cs2CO3, t.a., 30 min; b: LiAlH4, AlCh, THF, t.a. --> 66 °C, 12 h;
El bromuro de bencilo 1 fue obtenido siguiendo el procedimiento sintético expuesto en el esquema 3. Resumiendo, se llevó a cabo una reacción en un solo recipiente entre la anilina 5, anhídrido acético y bromo en ácido acético, que proporcionó el derivado de bromobenceno 6 con alto rendimiento. Después, la reacción de formilación de 6 con n-BuLi y DMF a -78 °C condujo al derivado de benzaldehído 7, que fue sometido a reducción con NaBH4 para proporcionar el alcohol bencílico 8. Por último, el compuesto 1 fue obtenido por bromación de 8, empleando CBr4 y PPh3.
Esquema 3
Figure imgf000010_0002
Reactivos y condiciones: (a') [1] Ac2O, AcOH, 118 °C, 1 h; [2]: Br2, AcOH, 65 °C, 30' (b') n-BuLi, DMF, THF, -78 °C ^ t.a., 3 h; (c') NaBH4, MeOH, 0 °C ^ t.a., 12 h; d') CBr4, P(Ph)a/DCM, 0 °C ^ t.a., 12 h
El compuesto RM81 ha sido sintetizado como se expone en el esquema 4. Resumiendo, el ácido 4-hidroximetilfenilborónico apropiado 9a-d reacciona con KHF2 para proporcionar la correspondiente sal de fluoroboronato 10a-d. La posterior reacción de acoplamiento cruzado de Suzuki-Myaura, asistida por microondas, con el compuesto 1 condujo al intermedio 11a-d, que fue sometido a una reacción de cloración con SOCl2, produciendo el intermedio 12a-d. Después, una reacción asistida por microondas de 13 con NaCN en una mezcla de H2O y AcCN, seguida de hidrólisis ácida con HCl, condujo a RM81.
Esquema 4
Figure imgf000011_0001
Reactivos y condiciones: (a) KHF2, MeOH/H2O, t.a., 12 h; (b) microondas, 1, Cs2CO3, PdCl2(dppf), H2O/1,4-dioxano, 160 °C, 20 min; (c) SOCl2, CHCl3, 0 °C, 90 min; (d) microondas, NaCN, AcCN/H2O, 100 °C, 20 min; (e) HCl 37%, H2O, 120 °C, 12 h;
En el esquema 5 se expone la síntesis de los compuestos PA8 y PA6. Resumiendo, la conversión del derivado 6 con bis(pinacolato)diboro condujo al compuesto 14, que fue sometido a una reacción de acoplamiento cruzado de Suzuki con el derivado de bromuro de 4-nitrobencilo apropiado, dando el derivado 15a-d. Después, la reducción selectiva de 15 con hidracina en presencia de FeCl3 como catalizador condujo a la amina 16. Por último, la N-alquilación de 16 con bromoacetato de etilo o ácido bromoacético proporcionó los productos finales.
Esquema 5
Figure imgf000011_0002
Reactivos y condiciones: (a) B2pin2, PdCl2dppf, KOAc, 1,4-dioxano, 100 °C, 4 h; (b) bromuro de 4-nitrobencilo apropiado, Na2CO3, PdCl2dppf, 1,2-dimetoxietano/H2O, 80 °C, 12 h; (c) hidracina, FeCl3, carbono, 12 h, 70 °C; (d) BrCH2COOEt, EtOH, AcONa, microondas, 20 min, t.a., 1 h; (e) BrCH2COOH, DMF, Cs2CO3, t.a., 1 h
Por último, el esquema 6 expone el procedimiento sintético para la preparación de los compuestos GM10 y GM24. Una reacción de acoplamiento cruzado de Suzuki entre el bromuro de 4-nitrobencilo apropiado y el ácido borónico 17 condujo al intermedio 18, que fue sometido a una reducción por hidrogenación en presencia de Pd/C para producir el intermedio 19. La posterior N-alquilación con ácido bromoacético o con 2-bromoetilamina condujo a los productos finales GM24 y GM10.
Esquema 6
Figure imgf000011_0003
Reactivos y condiciones: (a) bromuro de 4-nitrobencilo apropiado, K2CO3, PdCl2, acetona/hbO, 72 h, t.a.; (b) H2, Pd/C, MeOH, 12 h; (c) BrCH2COOH, DMF, Cs2CO3, t.a., 1 h; (d) BrCH2CH2NH2, DMF, Cs2CO3, t.a., 1 h
Preparación de intermedios para sintetizar los compuestos de la invención
Procedimiento general para la síntesis de 2a-d
Bajo atmósfera de nitrógeno, se mezcló con K2CO3 (431 miligramos; 3,12 mmol), compuesto 1 (1,25 mmol) y PdCl2 catalítico una solución del ácido borónico apropiado (1,25 mmol) en acetona (1,85 ml) y H2O (0,62 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 72 h. Después se concentró la mezcla de reacción, se extrajo en DCM y se secó la fase orgánica, se filtró y se evaporó.
N-(2-isopropil-4-(4-metoxi-2,6-dimetilbencil)fenil)acetamida (2a)
El producto bruto fue purificado mediante cromatografía en columna ultrarrápida, empleando como eluyente una mezcla de cloroformo y acetato de etilo (proporción 9:1). 1H-RMN (CDCta): 5 1,18 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,17 (s, 3H, CH3CO); 2,21 (s, 6H, CH3); 2,95 - 3,02 (m, 1H, CH); 3,79 (s, 3H, OCH3); 3,95 (s, 2H, CH2); 6,62 (s, 2H, Ar); 6,74 (dd, J = 1,6, 8,2 Hz, 1H, Ar); 6,96 (sa, 1H, NH); 6,99 (d, J = 1,6 Hz, 1H, Ar); 7,37 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C21H27NO2: C, 70,50 %; H, 8,36 %; N, 4,30 %; encontrado: C, 77,42 %; H, 8,25 %, N, 4,43.
N-(2-isopropil-4-(4-metoxi-2-(trifluorometil)bencil)fenil)acetamida (2d)
Siguiendo el procedimiento general se obtuvo el producto bruto. El disolvente fue 1,4-dioxano y tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,02 mmol) como catalizador. Después se añadió agua a la mezcla de reacción y se extrajo con DCM; se secó la fase orgánica, se filtró y se concentró proporcionando un bruto que fue purificado mediante columna ultrarrápida (eluyente: éter de petróleo/acetato de dietilo, proporción 9:1).
Rendimiento: 22 %. 1H-RMN (CDCl3): 51,20 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,20 (s, 3H, CH3); 2,97 - 3,03 (m, 1H, CH); 3,82 (s, 3H, OCH3); 4,07 (s, 2H, CH2); 6,92 - 6,96 (m, 2H Ar); 7,06 - 7,08 (m, 2H Ar); 7,18 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar); 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C20H22F3NO2: C, 65,74 %; H, 6,07 %; N, 3,83 %; encontrado: C, 65,43 %; H, 6,17 %, N, 3,71.
Síntesis de N-(4-(4-hidroxi-2,6-dimetilbencil)-2-isopropilfenil)acetamida (3a)
Se enfrió una solución de 2 (0,75 mmol) en DCM a -10 °C y se añadió gota a gota BBr3 (2,37 ml), bajo atmósfera de nitrógeno. Tras 1 h de agitación, se inactivó con H2O la reacción y se extrajo con DCM. Después se secó sobre Na2SO4 la fase orgánica, se filtró y se evaporó dando el compuesto 3, que fue utilizado sin purificación adicional. Rendimiento: 70 %. 1 H-RMN (CD3OD-d4): 5 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,12 (s, 3H, CH3CO); 2,14 (s, 6H, CH3); 3,05 - 3,08 (m, 1H, CH); 3,95 (s, 2H, CH2); 6,51 (s, 2H, Ar); 6,77 (dd, J = 1,8, 8,0 Hz, 1H, Ar); 7,01 (d, J = 1,8 Hz, 1H, Ar); 7,03 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, Ar) ppm. Anál. calculado para C21H25NO2: C, 77,14 %; H, 8,09 %; N, 4,50 %; encontrado: C, 76,98 %; H, 8,26 %, N, 4,32 %.
Síntesis de N-(4-(4-hidroxi-2-(trifluorometil)bencil)-2-isopropilfenil)acetamida (3d)
Bajo atmósfera de nitrógeno, a -10 °C, se añadió gota a gota BBr3 (0,60 ml) a una solución de 2 (0,19 mmol) en DCM; se agitó la mezcla obtenida durante 5 minutos a -10 °C y luego a 0 °C durante 1,5 h. Después, se inactivó con H2O la reacción y se extrajo con DCM. Se secó la fase orgánica, se filtró y se evaporó dando el compuesto final. Rendimiento: 88 %. 1 H-RMN (CDCl3): 51,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,22 (s, 3H, CH3); 2,97 - 3,01 (m, 1H, CH); 4,05 (s, 2H, CH2); 6,81 (dd, J = 2,4, 8,4 Hz, 1H, Ar); 6,89 (dd, J = 1,6, 8,4 Hz, 1H, Ar); 6,94 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar); 7,04 (sa, 1H, NH); 7,06 (d, J = 1,6 Hz, 1 H, Ar); 7,11 (d, J = 2,4 Hz, 1H, Ar); 7,41 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C19H20F3NO2: C, 64,95 %; H, 5,74 %; N, 3,99 %; encontrado: C, 64,91 %; H, 5,57 %, N, 3,94 %.
Síntesis de N-(4-(4-(cianometoxi)-2,6-dimetilbencil)-2-isopropilfenil)acetamida (4a)
Se añadieron simultáneamente Cs2CO3 (351 miligramos; 1,08 mmol) y BrCH2CN (0,21 mmol) a una solución de 3 (0,21 mmol) en DMF. Se agitó la mezcla obtenida durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se inactivó con agua y se extrajo con DCM. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para obtener el compuesto final. Rendimiento: 73 %. 1 H-RMN (CDCh): 51,18 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,19 (s, 3H, CH3CO); 2,22 (s, 6H, CH3); 2,95 - 3,04 (m, 1H, CH); 3,96 (s, 2H, CH2); 4,75 (s, 2H, CH2CN); 6,69 (s, 2H, Ar); 6,72 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar); 6,98 (s, 1H, Ar); 7,39 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C22H26N2O2: C, 75,40 %; H, 7,48 %; N, 7,99 %; encontrado: C 75,23 %; H, 7,52 %, N, 7,84 %.
Síntesis de N-(4-(4-(cianometoxi)-2-(trifluorometil)bencil)-2-isopropilfenil)acetamida (4d)
Se trató simultáneamente con Cs2CO3 (0,86 mmol) y BrCH2CN (0,17 mmol) una solución de 3 (0,17 mmol) en DMF, y se agitó la mezcla resultante durante 30 minutos a t.a. Después se inactivó con agua la mezcla de reacción y se extrajo con DCM. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para obtener el compuesto final. Rendimiento: 29 %. 1 H-RMN (CDCl3): 51,18 (d, J = 6,4 Hz, 6H, CH3); 2,20 (s, 3H, CH3); 2,96 - 3,01 (m, 1H, CH); 4,09 (s, 2H, CH2); 4,79 (s, 2H, CH2CN); 6,93 (dd, J = 1,6, 8,2 Hz, 1H, Ar); 7,00 (sa, 1H, NH); 7,05 (dd, J = 2,8, 8,8 Hz, 1H, Ar); 7,07 (d, J = 1,6 Hz, 1H, Ar); 7,15 (d, J = 8,8 Hz, 1H, Ar); 7,27 (d, J = 2,8 Hz, 1H, Ar); 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C21H21F3N2O2: C, 64,61 %; H, 5,42%; N, 7,18%; encontrado: C 64,81 %; H, 5,22 %, N, 7,48 %.
Síntesis de N-(4-(bromometil)-2-isopropilfenil)acetamida (1)
Se mezclaron CBr4 (1,87 mmol) y P(Ph)3 (1,87 mmol) con una solución de 8 (1,26 mmol) en DCM. Se agitó la mezcla durante una noche a t.a. y luego se lavó con agua y HCl al 10%. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó; el bruto fue purificado sucesivamente mediante columna ultrarrápida, empleando acetato de etilo como eluyente. Rendimiento: 45 %. 1H-RMN (CDCla): 51,25 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH3); 2,21 (s, 3H, CH3CO); 2,99 - 3,03 (m, 1H, CH); 4,48 (s, 2H, CH2Br); 7,04 (sa, 1H, NH); 7,23 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar); 7,29 (s,1H, Ar); 7,66 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C12H16BrNO: C, 53,35 %; H, 5,97 %; N, 5,18 %; encontrado: C, 53,09 %; H, 5,80 %; N, 5,39 %
Síntesis de N-(4-bromo-2-isopropilfenil)acetamida (6)
A temperatura ambiente, se añadió anhídrido acético (1,33 ml; 14,13 mmol) a una solución de 2-isopropilanilina en ácido acético. Se calentó la mezcla a 120 °C y se agitó a reflujo durante 1 h. Después de enfriar la mezcla de reacción hasta 65 °C se añadió gota a gota una solución de bromo (0,73 ml; 14,13 mmol) en ácido acético, y se agitó durante 30 minutos la mezcla obtenida. Después se enfrió la mezcla con hielo y se neutralizó el bromo sin reaccionar, añadiendo Na2S2O3. Se filtró sobre un septo la suspensión obtenida y se lavó con agua, proporcionando un bruto constituido principalmente por compuesto 6. Rendimiento: 98 %. 1H-RMN (CDCta): 5 1,23 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,20 (s, 3H, CH3CO); 2,95 - 3,01 (m, 1H, CH); 6,98 (sa, 1H, NH); 7,31 (dd, J = 2,0, 8,6 Hz, 1H, Ar); 7,38 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar); 7,54 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para CnHuBrNO: C, 51,58 %; H, 5,51 %; N, 5,47 %; encontrado: C, 51,23 %; H, 5,39 %, N, 5,68 %.
Síntesis de N-(4-formil-2-isopropilfenil)acetamida (7)
A -78 °C, bajo atmósfera de nitrógeno, se añadió n-BuLi (9,79 mmol) a una solución del derivado de bromobenceno 6 (4,42 mmol) en THF anhidro. Se agitó la mezcla durante 30 minutos a -78 °C; luego se añadió DMF (8,84 mmol) y se agitó la mezcla de reacción durante 1 h a -78 °C y 1,30 h a temperatura ambiente. T ranscurrido este tiempo, se diluyó la mezcla de reacción con Et2O y se lavó con agua, HCl al 10 % y salmuera. Se secó la fase orgánica, se filtró y se concentró. El bruto fue purificado mediante columna ultrarrápida empleando una mezcla de éter de petróleo y acetato de etilo (proporción 7:3) como eluyente.
Rendimiento: 39 %. 1 H-RMN (CDCl3): 51,32 (d, J = 6,4 Hz, 6H, CH3); 2,25 (s, 3H, CH3); 2,99 - 3,04 (m, 1H, CH); 7,23 (sa, 1H, NH); 7,72 (dd, J = 1,8, 8,2 Hz, 1H, Ar); 7,83 (d, J = 1,8 Hz, 1H, Ar); 8,12 - 8,23 (m, 1H, Ar); 9,94 (s, 1H, CHO) ppm. Anál. calculado para C12H15NO2: C, 70,22 %; H, 7,37 %; N, 6,82 %; encontrado: C, 70,56 %; H, 7,09 %, N, 6,61 %.
Síntesis de N-(4-hidroximetil-2-isopropilfenil)acetamida (8)
A 0 °C, se añadió gota a gota una solución de NaBH4 (0,60 mmol) en agua al compuesto 7 (0,60 mmol) previamente disuelto en metanol. Se agitó la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente; después se concentró la mezcla y se extrajo en DCM la fase acuosa residual. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó, proporcionando el compuesto 8 deseado. Rendimiento: 80 %. 1 H-RMN (CDCta): 51,22 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,20 (s, 3H, CH3); 3,01 - 3,05 (m, 1H, CH); 4,66 (s, 2H, CH2OH); 7,06 (sa, 1H, NH); 7,18 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar); 7,27 (s, 1H, Ar); 7,51 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar) ppm. Anál. calculado para C12H17NO2: C, 69,54 %, H, 8,27 %, N, 6,76 %; encontrado: C, 69,80 %; H, 8,10 %; N, 6,61 %.
Ejemplo 1
Síntesis de ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (TG68)
Se trató con Cs2CO3 (473 mg; 1,45 mmol) y BrCH2COOH (0,29 mmol) una solución de derivado fenólico 3a-d (0,29 mmol) en DMF. Se agitó la mezcla obtenida durante 1 hora a t.a. y después se inactivó con agua. Tras extracción con DCM, se acidificó la fase acuosa con HCl al 10 % y se extrajo nuevamente con DCM. Después se recogieron las fases orgánicas, se secaron, se filtraron y se concentraron para obtener un bruto que fue purificado mediante precipitación en hexano, proporcionando el compuesto final. Rendimiento: 82 % (polvo blanco); 1H-RMN (CD3OD-d4): 5 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,12 (s, 3H, CH3CO); 2,18 (s, 6H, CH3); 3,05 - 3,08 (m, 1H, CH); 3,98 (s, 2H, CH2); 4,35 (s, 2H, CH2); 6,67 (s, 2H, Ar); 6,76 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H, Ar); 7,00 - 7,08 (m, 2H, Ar) ppm. 13C-RMN (CD3OD-d4): 5 180,44 (COOH); 172,91 (CH)3CO); {158,17, 145,59, 140,71, 139,23, 132,96, 130,42, 128,55, 126,41, 126,32, 115,34} Ar; 68,49 (OCH2); 34,84 (CH2); 29,06 (CH); 24,18 (CHCH3); 23,70 (CH3); 22,81 (CH3CO;); 20,52 (CH3) ppm. Anál. calculado para C22H27NO4: C, 71,52 %; H, 7,37 %; N, 3,79 %; encontrado: C, 71,41 %; H, 7,42 %; N, 3,59 %.
Ejemplo 2
Síntesis de ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (IS25)
Se mezclaron TG68 (0,29 mmol) y HCl conc. (0,83 ml) con 4,19 ml de agua y se hicieron refluir a 120 °C durante 12 h. Después se concentró la mezcla de reacción y el bruto obtenido fue purificado mediante cromatografía ultrarrápida, eluyendo con una mezcla de hexano y acetato de etilo (proporción 1:1). Rendimiento: 10 % (aceite marrón). 1H-RMN (CD3OD-d4): 5 1,15 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,19 (s, 6H, CH3); 2,92 - 2,99 (m, 1H, CH); 3,87 (s, 2H, CH2); 4,67 (s, 2H, OCH2); 6,52 (dd, J = 1,8, 8,0 Hz, 1H, Ar); 6,61 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar); 6,62 (s, 2H, Ar); 6,79 (d, J = 1,8 Hz, 1H, Ar) ppm. 13C-RMN (CD3OD-d4): 5 171,77, 157,28, 142,51, 139,50, 134,79, 132,24, 131,59, 126,44, 125,77, 117,72, 115,03, 66,02, 52,53, 34,52, 28,32, 23,05, 20,52 ppm. Anál. calculado para C20H25NO3: C, 73,37 %; H, 7,70 %; N, 4,28 %; encontrado: C, 73,52 %; H, 7,68 %; N, 4,19 %.
Ejemplo 3
Síntesis de ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3-metilfenoxi)acético (TR29)
La síntesis de TR29 fue realizada siguiendo el procedimiento descrito para IS25 y partiendo de GM21. Se concentró la mezcla de reacción y el producto bruto obtenido fue purificado mediante cromatografía ultrarrápida, eluyendo con una mezcla de hexano y acetato de etilo (proporción 1:1). 1H-RMN (CD3OD-d4): 5 1,15 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,18 (s, 3H, CH3); 2,88 - 2,94 (m, 1H, CH); 3,87 (s, 2H, CH2); 4,64 (s, 2H, OCH2); 6,70 - 6,82 (m, 4H, Ar); 7,10 - 7,13 (m, 2H, Ar) ppm. 13C-RMN (CD3OD-d4): 5170,03, 158,23, 141,00, 133,50, 131,51, 131,22, 131,19, 129,71, 127,37, 121,12, 115,43, 64,70, 39,12, 28,40, 23,3, 19,84 ppm. Anál. calculado para C19H23NO3: C, 72,82 %; H, 7,40 %; N, 4,47 %; encontrado: C, 72,52 %; H, 7,58 %; N, 4,59 %.
Ejemplo 4
Síntesis de ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3-(trifluorometil)fenoxi)acético (TR30)
La síntesis de TR30 fue realizada siguiendo el procedimiento descrito para IS25 y partiendo de TR45. El bruto fue purificado mediante cromatografía, eluyendo con hexano/AcOEt (3:7). 1H-RMN (CD3OD-d4): 51,18 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 2,86 - 2,93 (m, 1H, CH); 3,87 (s, 2H, CH2); 4,64 (s, 2H, OCH2); 6,75 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar); 6,79 (s, 2H, Ar); 7,11 - 7,18 (m, 3H, Ar) ppm. 13C-RMN (CD3OD-d4): 5169,3, 158,23, 141,00, 133,50, 131,51, 131,24, 129,5, 128,3, 127,4, 124,1, 121,5, 118,1, 116,2, 109,7, 64,70, 39,12, 28,40, 23,3 ppm. Anál. calculado para C19H20F3NO3: C, 62,12 %; H, 5,49 %; N, 3,81 %; encontrado: C, 63,52 %; H, 5,33 %; N, 3,75 %.
Ejemplo 5
Síntesis de 4-(4-(2-aminoetoxi)-2,6-dimetilbencil)-N-etil-2-isopropilanilina (IS62)
Bajo atmósfera de nitrógeno, se añadió AlCl3 (180 mg; 1,35 mmol) a una solución de LiAlH4 (1,35 ml; 1,35 mmol) en THF. Se agitó la mezcla a t.a. durante 5 minutos; después se añadió gota a gota una solución del derivado 4 (0,15 mmol) en THF, y se hizo refluir la mezcla durante 12 h. Después de enfriar a 0 °C se diluyó la mezcla con agua, se acidificó con HCl al 10% y se lavó con Et2O. Se alcalinizó la fase acuosa con NaOH 1 N y se extrajo con cloroformo; después se filtró la fase orgánica a través de Celite, se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. Después se transformó el producto bruto en la sal de hidrocloruro correspondiente. Rendimiento: 15 %. 1H-RMN (CD3OD-d4): 51,23 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3); 1,36 (t, J = 7,4 Hz, 3H, CH2); 2,20 (s, 6H, CH3); 3,02 - 3,06 (m, 1H, CH); 3,36 - 3,40 (m, 4H, CH2NH2, CH2); 4,07 (s, 2H, CH2); 4,22 (t, J = 4,8 Hz, 2H, OCH2); 6,77 (s, 2H, Ar); 6,97 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H, Ar); 7,21 (d, J = 1,4 Hz, 1H, Ar); 7,27 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar) ppm. 13C-RMN (CD3OD-d4): 5157,89, 144,36, 143,49, 139,71, 130,74, 130,50, 128,61, 127,99, 124,54, 115,19, 65,06, 40,42, 34,67, 28,66, 24,46, 20,43, 20,36, 11,36 ppm. Anál. calculado para C22H33CN 2O: C, 70,10 %; H, 8,82 %; N, 7,43 %; encontrado: C, 70,24 %; H, 8,75 %; N, 7,56 %.
Ejemplo 6
Síntesis de 4-(4-(2-aminoetoxi)-2-(trifluorometil)bencil)-N-etil-2-isopropilanilina (EP54)
El producto bruto fue obtenido siguiendo el mismo procedimiento sintético descrito para IS62. El bruto fue purificado mediante transformación en sal de hidrocloruro y posterior recristalización en isopropanol/éter isopropílico. Rendimiento: 17 %. 1H-RMN (CD3OD-d4): 51,27 (d, J = 6,4 Hz, 6H, CH3); 1,36 (t, J = 7,4 Hz, 3H, CH3); 2,20 (s, 6H, CH3); 3,03 - 3,04 (m, 1H, CH); 3,38 - 3,41 (m, 4H, CH2NH2, CH2); 4,19 (s, 2H, CH2); 4,29 (t, J = 8,0 Hz, 2H, CH2O); 7,11 (dd, J = 2,0, 8,4 Hz, 1H, Ar); 7,23 (dd, J = 2,4, 8,4 Hz, 1H, Ar); 7,28 - 7,37 (m, 4H, Ar) ppm. 13C-RMN (CD3OD-d4): 5158,10, 143,52, 135,03, 134,77, 132,28, 131,02, 130,72, 129,55, 128,94, 124,40, 124,19, 119,09, 113,96, 65,76, 40,20, 37,67, 28,74, 24,41, 17,28, 11,42 ppm. Anál. calculado para C21H28C F 3N2O: C, 60,50 %; H, 6,77 %; N, 6,72 %; encontrado: C, 60,51 %; H, 6,72 %; N, 6,71 %.
Ejemplo 7
Síntesis de ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM23)
El producto bruto fue obtenido siguiendo el mismo procedimiento sintético descrito para TG68. El bruto fue purificado mediante suspensión en hexano. Rendimiento: 64 %. 1H-RMN (CD3OD): 5 1,64 (d, 6H, J = 6,8 Hz, CH3); 2,13 (s, 3H, CH3CO); 3,08 (m, 1H, J = 6,8 Hz, CH); 3,89 (s, 2H, CH2); 4,61 (s, 2H, CH2COOH); 6,83 (d, 2H, J = 8,4 Hz, Ar); 6,98 (dd, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz, Ar); 7,08 (d, 1H, J = 8 Hz, Ar); 7,12 (d, 2H, J = 8,4 Hz, Ar); 7,17 (d, 1H, J = 2 Hz, Ar) ppm.
13C-RMN (CD3OD): 5 172,81 (COOH); 172,71 (COCH3); {157,74, 145,62, 142,06, 135,55, 133,10, 130,74, 128,54, 127,48, 127,16, 115,51} Ar; 65,88 (CH2COOH); 41,56 (CH2); 29,02 (CH); 23,59 (CH3); 22,67 (CH3CO) ppm.
Ejemplo 8
Síntesis de ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-metilfenoxi)acético (GM21)
La síntesis fue realizada siguiendo el mismo procedimiento descrito para el compuesto GM23. El bruto fue purificado mediante precipitación en una mezcla de AcOEt/hexano. Rendimiento: 40 %. 1H-RMN (CD3OD): 5 1,14 (d, 6H, J = 6.8 Hz, CH3), 2,13 (s, 3H, CH3CO), 2,93 - 3,05 (m, 1H, CH), 3,88 (s, 2H, CH2), 4,68 (s, 2H, CH2COOH); 6,85 - 7,11 (m, 3H, Ar); 7,15 - 7,35 (m, 3H, Ar) ppm.
Ejemplo 9
Síntesis de ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-(trifluorometil)fenoxi)acético (TR45)
La síntesis fue realizada siguiendo el mismo procedimiento descrito para el compuesto GM21. El bruto fue purificado mediante precipitación en una mezcla de AcOEt/hexano. Rendimiento: 25 %. 1H-RMN (CD3OD): 5 1,18 (d, 6H, J = 6.9 Hz, CH3), 2,02 (s, 3H, CH3CO), 2,19 (s, 3H, CH3), 3,08 (m, 1H, J = 6,8 Hz, CH), 3,91 (s, 2H, CH2), 4,70 (s, 2H, CH2COOH); 6,72 - 6,78 (m, 2H, Ar); 6,89 (dd, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz, Ar); 7,03 (d, 1H, J = 8,4 Hz Ar), 7,07 (d, 1H, J = 8,0 Hz, Ar); 7,10 (s, 1H, Ar) ppm.
Ejemplo 10
Síntesis de ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM33)
El producto bruto fue obtenido siguiendo el mismo procedimiento sintético descrito para TG68. El bruto fue purificado en hexano. Rendimiento: 96 %. 1H-RMN (CD3OD): 5 1,26 (d, 6H, J = 6,8 Hz, CH3); (m, 1H, J = 6,8 Hz, CH); 3,94 (s, 2H, CH2); 4,62 (s, 2H, CH2COOH); 6,86 (d, 2H, J = 8,4 Hz, Ar); 7,12 (d, 3H, J = 8,8 Hz, Ar); 7,25 (d, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz, Ar); 7,34 (s, 1H, Ar); 7,91 (s, 1H, COOH) ppm. 13C-RMN (CD3OD): 5 171,44 (COOH); {157,82, 144,57, 143,37, 135,01, 130,83, 128,63, 128,60, 124,20, 115,67} Ar; 66,03 (CH2COOH); 41,29 (CH2); 28,64 (CH); 23,79 (CH3) ppm.
Ejemplo 11
Síntesis de ácido 2-((4-((8-metoxi-2-metilquinolin-5-il)metil)fenil)amino)acético (GM24)
Se añaden simultáneamente Cs2CO3 (0,59 mmol) y ácido bromoacético (0,12 mmol) a una solución de amina 19 (0,12 mmol) en DMF, y se deja la reacción a temperatura ambiente y se controla mediante CCF (CHCh/iPrOH 9:1). Al cabo de 24 h se extrae la reacción con diclorometano y se seca la fase orgánica, se filtra y se evapora. El producto bruto fue purificado mediante cromatografía ultrarrápida, eluyendo con DCM/isopropanol.
Ejemplo 12
Síntesis de N1-(4-((8-metoxi-2-metilquinolin-5-il)metil)fenil)etano- 1,2-diamina (GM10)
A una solución de amina 19 (0,10 mmol) en H2O se añadió bromoetilamina (0,05 mmol), y se agitó la reacción a 95 °C durante 12 h. Después se dejó la reacción a temperatura ambiente y se diluyó con AcOEt. A continuación se alcaliniza la fase acuosa y se reextrae con diclorometano. Después se anhidrificó la fase orgánica, se filtró y se evaporó. El producto bruto fue purificado mediante cromatografía ultrarrápida, eluyendo con DCM/isopropanol.
Ejemplo 13
Síntesis de ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-metilfenil)acético (RM81)
Se hizo refluir durante 30 minutos una solución de derivado 13 (92 mg, 0,287 mmol) en ácido sulfúrico concentrado y agua destilada (50 % v/v). Pasado ese tiempo se añade agua destilada hasta la formación de un precipitado, que se filtra y se purifica mediante cristalización en isopropanol/diisopropiléter. 1H-RMN (MeOD): 5 1,15 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3), 2,13 (s, 3H, CH3), 2,21 (s, 3H, CH3), 3,08 (m, J = 6,8 Hz, 1H, CH), 3,54 (s, 2H, CH2), 6,91 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H, Ar), 7,04 - 7,09 (m, 4H, Ar), 7,13 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar) ppm.
Ejemplo 14
Síntesis de 2-((4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenil)amino)acetato de etilo (PA6)
Se añaden bromoacetato de etilo (0,355 mmol) y AcONa (0,355 mmol) a una solución de anilina 16a (0,355 mmol) en EtOH. Se pone a reaccionar la mezcla resultante en un reactor de microondas a 118 °C durante 15 minutos. Después de este período se enfría la reacción y se diluye con agua. Se observa la precipitación de un sólido, que se filtra y se seca para proporcionar el producto final, que fue posteriormente purificado mediante cromatografía, eluyendo con una mezcla de CHCl3 y MeOH (99:1). Rendimiento: 32 %. 1H-RMN (MeOD): 5 1,18 (d, 6H, J = 7 Hz, c H3); 1,25 - 1,31 (m, 3H, CH3); 2,14 (s, 3H, CH3CO); 3,10 (m, 1H, J = 7 Hz, CH); 3,85 (s, 2H, CH2); 4,17 - 4,23 (m, 2H,CH2); 6,54 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Ar); 6,98 (dd, 1H, J = 2,0 Hz, J = 8,2 Hz, Ar); 7,04 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Ar); 7,08 (d, 1H, J = 8,2 Hz, Ar); 7,17 (s, 1H, Ar) ppm. 13C-RMN (MeOD): 514,49; 22,78; 23,72; 29,14; 42,75; 54,45; 62,13; 113,46, 127,22, 127,57, 128,58, 130,57, 131,94, 133,06, 142,57, 145,65, 147,61; 172,99; 173,06 ppm.
Ejemplo 15
Síntesis de ácido 2-((4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenil)amino)acético (PA8)
A una solución de PA6 (0,052 mmol) en EtOH (cantidad suficiente) se añadieron 0,01 ml de NaOH al 10 %. Se deja en agitación a reflujo a 78 °C la mezcla así obtenida durante 30 minutos y, transcurrido este período, se añade HCl hasta pH ácido. Se extrae la mezcla de reacción con DCM. Las capas orgánicas evaporadas dieron el producto final, que fue purificado mediante precipitación en AcOEt/hexano. Rendimiento 67 %. 1H-RMN (MeOD): 5 1,16 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3); 2,12 (s, 3H, CH3CO); 3,04 - 3,11 (m, 1H, CH); 3,85 (s, 2H, CH2); 4,15 (s, 2H, CH2); 6,51 (d, 1H, J = 8,4 Hz, Ar); 6,57 (d, 1H, J = 8,4 Hz, Ar); 6,96 - 6,99 (m, 2H, Ar); 7,01 - 7,11 (m, 2H, Ar); 7,16 (s, 1H, Ar) ppm.
13C-RMN (MeOD): 5 22,80; 23,68; 29,13; 41,87; 47,27; 121,63, 123,15, 124,08, 127,45, 127,67, 128,89, 131,60, 131,83, 131,95, 140,90; 146,01; 173 ppm.
Evaluación de los compuestos de fórmula (I)
Se ensayó la actividad de los compuestos frente a RTalfa y RTbeta, utilizando métodos conocidos en la técnica y/o métodos expuestos en la presente memoria.
MÉTODOS
Cultivo y tratamiento de células
Se cultivaron células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2), obtenidas de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.), en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa (LG) (5,5 nM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) o DMEM con alto contenido de glucosa (HG) (30 nM) suplementado con 10 % de suero fetal de bovino (SFB) y 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina, en una atmósfera con 5 % de CO2, a 37 °C. Después se trataron estas células con compuestos ensayados a diversas concentraciones durante 24 h. Concluidos los tratamientos, se lisaron las células en un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl al 0,9%, Triton X-100 al 0,2% y 1% de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, Milán, Italia) y luego se conservaron a -80 °C para su posterior análisis por transferencia Western. Todos los análisis se realizaron en células entre el tercer y el sexto pase.
Análisis por transferencia Western
Se separaron proteínas (20 - 30 |ug) en gel CriterionTGX TM (4 - 20%) y se transfirieron a una membrana Immuno-PVDF (Biorad, Milán, Italia) durante 1 h. Las transferencias fueron incubadas con el anticuerpo primario a 4 °C durante una noche. Todos los anticuerpos policlonales para la proteína de interés fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EE. UU. A continuación se lavaron las transferencias 3 veces durante 10 minutos con 1X TBS, Tween® 20 al 0,1%, y se incubaron durante 1 h con anticuerpo secundario (contra conejo, acoplado a peroxidasa, en 1X TBS, Tween® 20 al 0,1%). Después de lavar 3 veces durante 10 minutos, se revelaron las señales reactivas mediante un sistema de análisis por transferencia Western ECL mejorado (Amersham). El análisis densitométrico de bandas fue realizado utilizando el software Image Lab (Biorad, Milán, Italia).
Determinación de la acumulación total de lípidos mediante tinción con rojo aceite O
Se evaluó la acumulación total de lípidos según el método descrito previamente por Liu et al. [20]. Se sembraron células a una densidad de 3,5 x 104 células/pocillo en placas de 24 pocillos, y se trataron durante 24 h con compuesto IS25, TG68 o T3 a dos dosis diferentes, 1 y 10 |uM. Se utilizaron cloroquina (25 |uM) e isoproterenol (10 |uM) como testigos positivos. Posteriormente, después de recolectar el medio de crecimiento que se empleará para efectuar mediciones del nivel de glicerol (como se detalla a continuación), se lavaron las células dos veces con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos. A continuación se tiñeron las células con solución de trabajo de rojo aceite O durante 1 h a temperatura ambiente y posteriormente se enjuagaron con agua.
La solución madre de rojo aceite O se preparó disolviendo 0,35 g de rojo aceite O (Sigma Aldrich, Milán, Italia) en 100 ml de isopropanol mediante calentamiento suave, y enfriando después y filtrando a través de un filtro de 0,45 |um. La solución de trabajo se preparó diluyendo tres partes de la solución madre en dos partes de agua MilliQ (solución madre:agua MilliQ; 3:2 v/v). Las imágenes de las células se captaron con un microscopio Leitz Fluovert FU (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Los lípidos aparecían de color rojo. Para el análisis cuantitativo de los lípidos celulares se añadió 1 ml de isopropanol a cada pocillo de la placa de cultivo teñida. Se eliminó inmediatamente el colorante extraído, mediante pipeteo suave, y se midió su absorbancia a 510 nm.
Determinación de la liberación de glicerol
Se analizaron muestras de los medios recolectados de células HepG2 utilizadas para probar la acumulación de lípidos mediante tinción con rojo aceite O (como se ha detallado más arriba), con el fin de determinar los niveles de glicerol utilizando el kit de ensayo de glicerol (Cell Based-ab133130-Abcam).
Ensayo de viabilidad celular, ensayo MTT
Se sembraron células HepG2 en una placa de 96 pocillos (Corning, EE. UU.) a una densidad de 1,0 x 104 células/pocillo con DMEM (200 μl/pocillo), y después se incubaron durante 24 h conforme al procedimiento de rutina. Después de ser tratadas con compuestos de prueba (1 - 10 μM) e incubadas durante 24 h (8 pocillos para cada muestra), se añadieron a cada pocillo 20 μl/pocillo de MTT (5 g/l). Después se eliminó el medio al cabo de 4 h de incubación, y se agregaron 100 μl/pocillo de solución de dodecilsulfato de sodio (SDS)-HCl para disolver el producto de formazano reducido tras la incubación durante 16 h a 37 °C. Por último se leyó la placa a 570 nm, utilizando un lector de microplacas (BioRad 680, EE. UU.).
Determinación del perfil ADME-TOX in vitro
Ensayo de citotoxicidad
Utilizando el manipulador de líquidos Echo 550 Liquid Handler se añadieron compuestos de prueba (20 nl de concentración máxima 10 mM en DMSO al 100 % v/v), testigo positivo (TP; valinomicina a una concentración final de 10 μM y DMSO al 0,1 % v/v) y blanco sin compuesto (al 0,1 % v/v final en DMSO) a una placa de poliestireno para microtitulación de cultivos celulares, de 384 pocillos, vacía, y se conservaron a temperatura ambiente antes de la siembra con células. Se cultivaron células U2OS, hTERT, MCF-7 y HEK293 en matraces para cultivo de células T175 de superficie modificada, en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10 % de suero fetal de bovino (FBS), 5 % de ácido L-glutámico, 5 % de estreptomicina. y 5 % de penicilina G. Aproximadamente al 80% de confluencia se lavaron las células, se tripsinizaron, se resuspendieron y se contaron en DMEM antes de sembrarlas (por triplicado) en placas de microtitulación blancas de 384 pocillos, que contenían compuestos (20 μl) a razón de 4000 células/pocillo, y se incubaron a 37 °C en presencia de 5% de CO2. Al cabo de 24 h y 48 h después del tratamiento se agregaron 20 μl/pocillo de mezcla de detección de CTG y se leyeron las placas utilizando un lector EnVision Multilabel 2103 después de una incubación de 10 minutos en la oscuridad. Se normalizaron frente al porcentaje de crecimiento celular los datos sin procesar, utilizando el correspondiente blanco sin compuesto que contenía solo 0,1 % v/v de DMSO. Se convirtió la señal de luminiscencia de cada muestra (S) en porcentaje de crecimiento celular comparado con la señal promedio de NC. Se utilizó la siguiente fórmula: % de efecto = (S - PC)/NC x 100.
Ensayo de inhibición de citocromo (CYP) P450
Estos ensayos (al menos por duplicado) utilizan preparaciones microsomales de CYP450 (2C9, 2C19, 2D6 y 3A4) procedentes de células de insecto infectadas con baculovirus (Corning Inc.) y citocromo c reductasa (citocromo b5 para CYP4503A4). Para detectar la actividad de CYP450 se utilizó el sistema de ensayo P450-Glo (Promega Corp.) basado en luminiscencia, que contenía un sustrato luminógeno de CYP450, reactivo de detección de luciferina liofilizado y tampón de reconstitución. Los sustratos eran derivados de luciferina de sustratos específicos de CYP450 que producen ácido (4S)-4,5-dihidro-2-(6-hidroxibenzotiazolil)-4-tiazolcarboxílico (D-luciferina) tras escisión por CYP450 (CYP450 3A4, luciferina-IPA; CYP450 2C19, luciferina-H EGE; CYP450 2C9, luciferina-H; CYP450 2D6, luciferina-ME EGE). Las reacciones con CYP450 fueron iniciadas mediante la adición del sistema de regeneración de NADPH a la mezcla de enzima y sustrato, deteniendo la reacción el reactivo de detección de luciferina y siendo convertida la D-luciferina en oxiluciferina con producción de luz que es proporcional a la actividad de CYP450. Se añadieron los compuestos a una placa vacía de 384 pocillos (10 nl/pocillo en DMSO al 0,1 % v/v) utilizando el manipulador de líquidos Echo 550 Liquid Handler, seguido de la adición de 5 μl/pocillo de mezcla de CYP450 y sustrato, y de la incubación durante 30 min a 37 °C, tras de lo cual se inició la reacción mediante la adición de 5 μl/pocillo del sistema de regeneración de NADPH. Tras una incubación adicional de 30 minutos a 37 °C, se detuvo la reacción de CYP450 y se inició simultáneamente la reacción de luciferasa, mediante la adición de 10 μl/pocillo de reactivo de detección de luciferina, seguido de una incubación adicional de 30 minutos a 37 °C. La señal de luminiscencia fue detectada utilizando un lector EnVision Multilabel 2103.
Ensayo de cardiotoxicidad hERG
Se utilizó el ensayo de polarización de fluorescencia Predictor hERG (Thermo) para ensayar los compuestos (por triplicado) en busca de cardiotoxicidad potencial. A cada pocillo de una placa de ensayo se añadieron 100 nl del compuesto de prueba o testigo, seguido de la adición de 5 μl de solución de membrana homogeneizada (sin diluir) y 5 μl de trazador (concentración final en el ensayo 1 nM). Se incubaron las placas durante 2 h a 25 °C en un incubador con humedad controlada, y se midió la polarización de fluorescencia utilizando un lector EnVision Multilabel 2103. Para normalizar los datos sin procesar se utilizaron los blancos sin compuesto (0 % de inhibición) y los testigos positivos con E-4031, un bloqueador de canales de potasio de tipo hERG (que produce 100 % de inhibición).
Ensayo HDAC
Se determinó la inhibición de enzimas HDAC utilizando (por triplicado) el ensayo bioluminogénico HDAC-Glo I/II, homogéneo y de adición única (Promega Corp.). El kit contiene un sustrato proluminogénico con una secuencia peptídica de lisina acetilada derivada de la histona 4 conjugada con aminoluciferina. La desacetilación del residuo de lisina, en la que interviene HDAC, facilita la susceptibilidad del sustrato luminogénico a la escisión proteolítica específica por parte de la enzima en el reactivo revelador. La aminoluciferina producto de esa escisión actúa como sustrato para la luciferasa, y la cantidad de luz producida en esta reacción es proporcional a la actividad de la enzima HDAC. Se adquirieron enzimas HDAC recombinantes humanas de BPS Bioscience (San Diego, CA), y se disolvió el inhibidor estándar tricostatina A (Sigma-Aldrich) para obtener una solución madre en DMSO al 100 % v/v, que se conservó a -20 °C. La manipulación de las placas se realizó con un manipulador de líquidos Echo 550 Liquid Handler y las mediciones de luminiscencia se registraron con un lector EnSpire Multilabel 2300. Utilizando el manipulador de líquidos Echo 550 Liquid Handler se añadieron a las placas de 384 pocillos los compuestos (10 nl/pocillo; DMSO al 0,1 % v/v) o el testigo positivo (tricostatina A con una concentración final de 10 μM y DMSO al 0,1 % v/v) y el testigo alto (DMSO al 0,1 % v/v, final). El reactivo del ensayo HDAC-Glo I/II fue preparado mediante (1) rehidratación del sustrato HDAC-Glo I/II liofilizado (con una concentración 100 μM de péptido acetilado) en 10 ml de tampón de ensayo HDAC-Glo I/II y (2) adición de 10 μL de reactivo revelador (que contenía tripsina). Se mezclaron brevemente las placas de microtitulación mediante agitación orbital por sacudidas (500 - 700 rpm) y se midió la luminiscencia en la señal de estado estacionario: fondo, que se logró al cabo de 20 minutos.
Ensayo SIRT7
Se determinó (por triplicado) la inhibición de enzima SIRT7 utilizando el ensayo luminiscente SIRT-Glo™, homogéneo y de adición única (Promega Corp.). El ensayo utiliza un sustrato peptídico luminogénico acetilado que puede ser desacetilado por actividades de SIRT. La desacetilación del péptido sustrato de aminoluciferina se mide empleando un sistema enzimático acoplado en donde una proteasa del reactivo revelador escinde el péptido desacetilado del sustrato de aminoluciferina, liberando aminoluciferina, que es cuantificada en una reacción empleando una luciferasa adecuada. La aminoluciferina producto de esa escisión actúa como sustrato para la luciferasa, y la cantidad de luz producida en esta reacción es proporcional a la actividad de enzima SIRT. La enzima SIRT7 recombinante humana fue adquirida de BPS Bioscience (San Diego, CA). La manipulación de las placas se realizó utilizando un manipulador de líquidos Echo 550 Liquid Handler, y las mediciones de luminiscencia se registraron con un lector EnSpire Multilabel 2300. Utilizando el manipulador de líquidos Echo 550 Liquid Handler se añadieron a las placas de 384 pocillos (10 nl/pocillo; DMSO al 0,1 % v/v) los compuestos (concentración final 10 μM y DMSO al 0,1 % v/v) y el testigo bajo/alto (DMSO al 0,1 % v/v, final. El reactivo de ensayo SIRT-Glo™ fue preparado mediante (1) rehidratación de sustrato SIRT liofilizado (con una concentración 100 μM de péptido acetilado) en 10 ml de tampón de ensayo SIRT-Glo™ y (2) adición de 10 μl de reactivo revelador. Se mezclaron brevemente las placas de microtitulación mediante agitación orbital por sacudidas (500 - 700 rpm) y se midió la luminiscencia en la señal de estado estacionario: fondo, que se logró al cabo de 30 minutos.
Inhibición de la PDE
Se utilizó el ensayo de polarización de fluorescencia Predictor hERG (Thermo) para ensayar los compuestos (por triplicado) en busca de cardiotoxicidad potencial. Las fosfodiesterasas catalizan la hidrólisis del enlace fosfodiéster en monofosfatos cíclicos marcados con colorantes. Las perlas se unen selectivamente al grupo fosfato del producto nucleotídico. Esto aumenta el tamaño del nucleótido en relación con el monofosfato cíclico que no ha reaccionado. En el ensayo de polarización, se excitan selectivamente moléculas de colorante con vectores de transición de absorción paralelos a la luz de excitación polarizada linealmente. Los colorantes unidos a los monofosfatos cíclicos de rápida rotación alcanzarán orientaciones aleatorias y emitirán luz con baja polarización. Los colorantes unidos a los complejos nucleótido-perla que giran lentamente no tendrán tiempo de reorientarse y, por lo tanto, emitirán luz muy polarizada. A cada pocillo de una placa de ensayo se añadieron 5 nl de compuesto de prueba o de testigo, seguido de la adición de 2,5 μL/pocillo de solución de sustrato (concentración final en el ensayo 100 nM) y 2,5 μL/pocillo de solución de enzima (concentración final en el ensayo 20 μM). Se incubaron las placas durante 1 h, protegidas de la luz, a t.a. Después se agregaron a cada pocillo 10 μL de agente aglutinante y se incubaron las placas a t.a. durante 20 minutos, protegidas de la luz. Se midió la polarización de fluorescencia utilizando un lector EnVision Multilabel 2103. Para normalizar los datos sin procesar se utilizaron los blancos sin compuesto (0 % de inhibición) y los testigos positivos (sin enzima, que proporcionan 100 % de inhibición).
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se efectuaron empleando GraphPad Prism versión 6.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.). Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza unidireccional para la comparación de medias, y según la prueba de rango múltiple HSD (diferencia significativa honesta) de Tukey se calcularon las diferencias significativas entre los diferentes tratamientos. Los datos se expresan como media ± EEM. Las diferencias con p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Todos los análisis se realizaron por triplicado.
Ejemplo 16
Estudios tempranos de toxicidad mediada por compuestos y responsabilidad
Los nuevos tiromiméticos fueron evaluados utilizando un panel de ensayos de toxicidad temprana que comprendían citotoxicidad (U2OS, células epiteliales de osteosarcoma óseo humano, HEK 293, células de riñón embrionario humano, MCF-7, línea celular de adenocarcinoma de mama humano, líneas celulares inmortalizadas con hTERT), inhibición de hERG, inhibición de citocromo P450 (CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4), cinasas fuera de diana (inhibición de cinasa Aurora B), inhibición de PDE y actividad inhibidora sobre moduladores epigenéticos (SIRT7, HDAC6 y HDAC8). Estos experimentos fueron realizados utilizando 10 μM de cada compuesto, y se expresó el resultado como % de inhibición, que se representa en forma de mapa de calor en la figura 5. Un perfil aceptable para compuestos en esta fase del proceso de descubrimiento de fármacos debe presentar < 50 % de inhibición a 10 μM en el caso de hERG, isoformas CYP y Aurora B cinasa, mientras que el porcentaje de viabilidad en citotoxicidad celular debería ser > 50 %. Casi todos los compuestos evaluados mostraron un perfil seguro. En particular, IS25 y TG68 mostraron un perfil más seguro (y fueron así seleccionados para investigaciones in vivo).
Ejemplo 17
Evaluación de los compuestos de fórmula (I)
Se ensayaron los compuestos de fórmula (I, II) en la prueba biológica denominada LANTHASCREEN TR-FRET NUCLEAR RECEPTOR COREGULATOR a SSa Y (Invitrogen Corporation, Life Technologies).
Por tanto, se sometieron los compuestos sintetizados al ensayo de corregulador LanthaScreen™ TR-FRET. En este ensayo se añade receptor nuclear LBD a compuestos de prueba ligandos, seguido de la adición de una mezcla del péptido corregulador de fluoresceína y el anticuerpo anti-GST con terbio. Después de un período de incubación a temperatura ambiente se obtiene una proporción TR-FRET de 520:495, que se utiliza para determinar la CE50 a partir de una curva de dosis-respuesta de los compuestos. Basado en la biología de la interacción receptor nuclear-péptido corregulador, esta CE50 de ligando es un valor compuesto que representa la cantidad de ligando necesaria para unirse al receptor, efectuar un cambio conformacional y reclutar el péptido corregulador.
Como ejemplo de la actividad se exponen los valores CE50 para IS25 y TG68.
Figure imgf000019_0001
En la tabla también se exponen los datos recopilados en el ensayo corregulador de receptor nuclear LanthaScreen TR-FRET para la hormona tiroidea T3. Los datos recopilados indican que IS25 no interactúa con el receptor RTalfa, y tampoco lo hace TG68.
Ejemplo 18
Evaluación del efecto in vitro de los nuevos IS25 y TG68 sobre la activación de AMPK
El hígado es un órgano importante, responsable de la mayoría de las funciones del metabolismo celular y un mediador entre las fuentes de energía dietética y endógena para los tejidos extrahepáticos. En este contexto, la AMPK constituye un sensor de energía intrahepático que regula la dinámica energética fisiológica limitando el anabolismo y estimulando el catabolismo, aumentando de esta manera la disponibilidad de ATP. Una vez activada, la AMPK fosforila sus sustratos aguas abajo para reducir las rutas anabólicas que consumen ATP, incluida la síntesis de colesterol, de ácidos grasos y de triacilglicerol, y aumenta las rutas catabólicas generadoras de ATP, incluida la oxidación de ácidos grasos y la lipólisis. Una diana aguas abajo importante de la AMPK fosforilada (fosfo-AMPK) es la acetil-CoA carboxilasa (ACC), que cataliza la producción de malonil-CoA a partir de acetil-CoA y es uno de los pasos iniciales de la síntesis de ácidos grasos (14, 15). Cuando la actividad de ACC es alta, se genera una mayor concentración de malonil-CoA. El malonil-CoA se une a CPT1 y la inhibe, reduciendo así la cantidad de acil-CoA graso que entra a las mitocondrias y, en consecuencia, la OAG. Para investigar si los compuestos regulan el metabolismo en células HepG2 a través de la ruta AMPK, se examinaron los niveles proteicos de AMPK fosforilada (p-AMPK) y ACC fosforilada (p-ACC). Como se demuestra en la figura 3A, veinticuatro horas de tratamiento con compuesto IS25, TG68 o T3 aumentaron significativamente (p < 0,05) la expresión de p-AMPK de manera dependiente de la dosis. En particular, conjuntamente con la estimulación de AMPK se observó también una fosforilación significativa de ACC (figura 3B).
Ejemplo 19
Efectos inducidos sobre la acumulación de lípidos y la lipólisis
En los hepatocitos de mamíferos obesos puede producirse una acumulación anormal de triglicéridos en forma de gotitas lipídicas. In vitro, se puede observar una espectacular acumulación de lípidos en células HepG2 tratadas con compuestos inductores de esteatosis tales como la cloroquina. Los triglicéridos almacenados en estas gotitas lipídicas pueden hidrolizarse para dar ácidos grasos libres y glicerol, que posteriormente son liberados al entorno circundante. La cantidad de glicerol liberada en el medio es proporcional a la tasa de ciclo de triglicérido/ácido graso. En la figura 2 se muestran los resultados de la tinción con rojo aceite O. Las células HepG2 tratadas con cloroquina 25 μM contienen una gran cantidad de gotitas lipídicas de color rojo fusionadas entre sí, lo que indicó que se había implantado con éxito el modelo acumulado de lípidos en células HepG2. Las gotitas lipídicas de color rojo en HepG2 muestran una tendencia decreciente significativa (p < 0,05), dependiente de la dosis, después del tratamiento con compuestos de prueba.
Como se muestra en la figura 1, la incubación con compuestos de prueba desencadenó una pronuncada liberación de glicerol por parte de HepG2, de una manera dependiente de la dosis, lo que confirma que los tiromiméticos recientemente diseñados son capaces de inducir eficazmente lipólisis en células HepG2.
Ejemplo 20
Efectos inducidos sobre la viabilidad de células HepG2
Utilizando el ensayo MTT se determinó la viabilidad de células HepG2 tratadas con los análogos IS25, TG68 o T3 a 1 - 10 μM. Los resultados mostraron que tras 24 h de tratamiento ninguno de los compuestos ensayados provocó significativamente (p < 0,05) muerte celular con respecto al testigo (figura 4).
Ejemplo 21
Actividad mitogénica de TG68 e IS25
Se mantuvieron con una dieta de laboratorio estándar (Ditta Mucedola, Milán, Italia) ratas F-344 macho de cinco semanas de edad adquiridas de Charles River (Milán, Italia). Los animales recibieron alimento y agua ad libitum con un ciclo diario de luz/oscuridad de 12 h, y fueron aclimatadas durante 1 semana antes del inicio del experimento. Todos los procedimientos se realizaron según las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Ministerio italiano de sanidad. Los animales fueron tratados con inyecciones intragástricas (i.g.) diarias durante 3 días de IS25 o TG68 (50, 75 y 100 μg/100 g de peso corporal) o T3 (20 μg/100 g de peso corporal). Un grupo testigo recibió el vehículo (DMSO al 5% en aceite de maíz). Dos grupos adicionales recibieron inyecciones diarias de IS25 o de TG68 a una dosis de 75 μg/100 g de peso corporal, por vía intraperitoneal, durante 3 días. Para medir la proliferación de hepatocitos, los animales recibieron bromodeoxiuridina (BrdU; 1 g/1 l) en agua potable durante el período de tratamiento de 3 días (figuras 7A y B).
Efectos de T3, IS25 y TG68 sobre la proporción peso del hígado/peso corporal
Se trataron ratas macho F344 durante 3 días con inyecciones intragástricas (i.g.) diarias de IS25 o TG68 (50, 75 y 100 μg/100 g de peso corporal) o T3 (20 μg/100 g de peso corporal). Un grupo testigo recibió el vehículo (DMSO al 5% en aceite de maíz). Dos grupos adicionales recibieron inyecciones diarias de IS25 o TG68 a una dosis de 75 μg/100 g de peso corporal, por vía intraperitoneal, durante 3 días. En el momento del sacrificio se observó una disminución de la proporción peso del hígado/peso corporal después del tratamiento con T3, mientras que no se observó tal efecto con ninguna de las dosis de IS25 o de TG68 (figura 6).
Efecto de T3, IS25 y TG68 sobre la actividad mitótica de hepatocitos
Dado que la T3 ejerce un potente efecto mitogénico en el hígado, los autores investigaron si IS25 y TG68 también podrían provocar una respuesta proliferativa en este órgano.
Como se muestra en la figura 7, la administración intragástrica (i.g.) de IS25 o de TG68 indujo una proliferación de hepatocitos dependiente de la dosis, según lo evaluado mediante la incorporación de BrdU. Por el contrario, cuando se administraron ambos compuestos mediante inyección i.p. se perdió el efecto mitogénico. Dado que ambos compuestos resultaron ser muy solubles en agua, también fueron sometidos a una investigación preliminar para evaluar si dos nuevos agonistas de RTb o RTp podrían estimular la proliferación de hepatocitos.
Se disolvieron TG68 e IS25 en agua potable a 3 concentraciones diferentes (12,5, 25 y 50 μg/100 g de peso corporal). La dosis más alta de ambos compuestos fue seleccionada en función de la actividad mitogénica en el hígado de rata y ratón mostrada por una dosis similar del análogo GC-1 [Endocrinology 2006;147(7):3211-8, J Hepatol 2010;53(4):686-92], mientras que la administración oral fue elegida como vía ideal de administración para futuros estudios traslacionales.
El examen histológico no mostró ninguna evidencia clara de daño hepático en los animales tratados, en comparación con los testigos. La falta de toxicidad hepática grave se confirmó midiendo los niveles de transaminasas séricas y bilirrubina (figura 8), que estaban dentro del rango de valores normales para ratas F-344 de la misma edad (hoja de datos de Charles River). También se evaluó el daño pancreático midiendo los niveles de amilasa y lipasa. No se observaron cambios significativos con ninguno de los dos compuestos (figura 8). Aunque no se observaron cambios en el contenido de colesterol y glucosa en suero, el nivel de TG en suero se redujo significativamente después de la administración intragástrica de IS25 o de TG68, lo que confirma el efecto lipolítico observado al tratar las células HepG2 con los dos compuestos.
Efecto de actividad mitogénica de IS25 y TG68 con respecto a GC-1 como fármaco de referencia
El experimento se realizó en ratas no tratadas o tratadas con T3, GC1, TG68 o IS25 durante una semana. La T3 fue administrada en la dieta (4 mg/kg de dieta); el GC1 (50 μg/kg) fue administrado mediante alimentación forzada una vez al día; TG68 e IS25 fueron disueltos en agua potable a una dosis de 50 μg/kg. Se administró BrdU (1 mg/ml) en agua potable durante toda la duración del experimento. Se observaron varias células acinares positivas para BrdU en el páncreas de ratas tratadas con T3 y GC1, pero no en animales tratados con TG68 e IS25; La figura 9 muestra el I. M. de células acinares pancreáticas de rata. Se expresó el I. M. como número de núcleos de células acinares positivas para BrdU/100 núcleos. Se puntuaron al menos 2000 células acinares por páncreas. Por lo tanto, los resultados preliminares mostraron que, a diferencia de T3 o GC-1 (elegidos como fármacos de referencia), IS25 y TG68 eran mitogénicos sólo para el hígado y no para otros tejidos, por ejemplo el compartimento de células acinares del páncreas.
Referencias citadas
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo:
Figure imgf000022_0002
donde
R1 es H, alquilo(C1-C3) o CF3;
R2 es H, alquilo(C1-C3) o CF3;
A es CH2COOH, XCH2COOCH2CH3, XCH2COOH, XCH2CH2NH2, donde X es átomo de nitrógeno u oxígeno;
Ar es un fragmento aromático seleccionado del grupo consistente en
Figure imgf000022_0001
donde
R3 es H, -CH3, -CH2CH3 o CH3CO-,
R4 es H o -CH3,
R5 es H o -CH3 y
R6 es H o -CH3.
2. El compuesto según la reivindicación 1, donde R1 es alquilo(C1-C3), preferiblemente metilo.
3. El compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde R2 es alquilo(C1-C3), preferiblemente metilo.
4. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde A es XCH2COOH.
5. El compuesto según la reivindicación 4, donde X es oxígeno.
6. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, donde Ar es Ar1.
7. El compuesto según la reivindicación 6, donde R3 es CH3CO-.
8. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, donde Ar es Ar2 o Ar3.
9. El compuesto según la reivindicación 8, donde R6 y R4 son, de manera independiente entre sí, -CH3.
10. El compuesto según la reivindicación 1, donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo consistente en: ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (IS25),
4-(4-(2-aminoetoxi)-2,6-dimetilbencil)-N-etil-2-isopropilanilina (IS62),
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3-metilfenoxi)acético (TR29)
ácido (4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3,5-dimetilfenoxi)acético (TG68),
hidrocloruro de 4-(4-(2-aminoetoxi)-2-(trifluorometil)bencil)-N-etil-2-isopropilanilina (EP54),
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)-3-(trifluorometil)fenoxi)acético (TR30),
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-(trifluorometil)fenoxi)acético (TR45),
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM23),
ácido 2-(4-(4-amino-3-isopropilbencil)fenoxi)acético (GM33),
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-metilfenoxi)acético (GM21),
(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenil)glicina (PA8),
(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)fenil)glicinato de etilo (PA6),
N1-(4-((8-metoxi-2-metilquinolin-5-il)metil)fenil)etano-1,2-diamina (GM10),
ácido 2-((4-((8-metoxi-2-metilquinolin-5-il)metil)fenil)amino)acético (GM24),
(4-((1 -metil-1 H-indol-5-il)metil)fenil)glicina (TR201) y
ácido 2-(4-(4-acetamido-3-isopropilbencil)-3-metilfenil)acético (RM81).
11. Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para uso como medicamento.
12. El compuesto para uso según la reivindicación 11, donde el medicamento es un modulador selectivo de receptor beta de hormona tiroidea (RTp).
13. Una composición farmacológica que comprende el compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un vehículo.
14. Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para uso en el tratamiento de enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTb o RTp).
15. El compuesto para uso según la reivindicación 14, donde las enfermedades moduladas por receptor beta de hormona tiroidea (RTb o RTp) son enfermedades hepáticas (tales como enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y carcinoma hepatocelular (CHC)), dislipidemia y enfermedades neurodegenerativas (tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson (EP).
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