ES2954473T3 - Aditivo para alimentación de ganado - Google Patents

Abstract

Un aditivo alimentario para ganado que comprende 1,8 cineol y al menos uno de naringina o betalaína, y un producto alimentario que comprende los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aditivo para alimentación de ganado

La invención se refiere a un aditivo alimentario para el ganado y un producto alimenticio respectivo, que ayuda a los animales a reproducirse bajo estrés por calor.

ANTECEDENTES

Los aditivos zootécnicos se usan comúnmente para mejorar el valor nutricional de la dieta de un animal. Esta categoría incluye, entre otras, enzimas y ciertos fitogénicos. Los aditivos de alimentación fitogénicos (derivados de plantas, naturales, botánicos) son composiciones bien mezcladas de materias primas especiales basadas en plantas y portadores derivados de plantas y/o minerales. Para ello se pueden utilizar aceites esenciales y/o vegetales, así como una amplia gama de hierbas y especias de gran actividad con especiales propiedades aromáticas y apetecibles. Los productos fitogénicos se utilizan como aditivos zootécnicos, desarrollados para mejorar el rendimiento de los animales, p.ej., para mejorar la salud de las aves y/o para una producción avícola rentable, especialmente para el engorde y la producción de huevos. Los productos fitogénicos se consideran una alternativa natural a los productos sintéticos que los consumidores quieren evitar, incluidos los fabricantes de piensos, premezcladores y productores de animales.

En la Unión Europea, actualmente se encuentra en curso la revisión del REGLAMENTO (CE) N° 1831/2003 DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO del 22 de septiembre de 2003 sobre aditivos para uso en alimentación animal. Actualmente, la legislación define 5 categorías de aditivos de alimentación mencionados en el artículo 6: 1. Un aditivo para alimentos se asignará a una o más de las siguientes categorías, en función de sus funciones y propiedades, de conformidad con el procedimiento establecido en los artículos 7, 8 y 9:

a) aditivos tecnológicos: toda sustancia añadida al alimento con una finalidad tecnológica;

(b) aditivos sensoriales: cualquier sustancia cuya adición al alimento mejora o cambia las propiedades organolépticas del alimento o las características visuales del alimento derivado de animales;

(c) aditivos nutricionales,

(d) aditivos zootécnicos: cualquier aditivo utilizado para afectar favorablemente el desempeño de los animales en buen estado de salud o utilizado para afectar favorablemente el medio ambiente;

(e) coccidiostáticos e histomonostáticos.

En el reglamento revisado está previsto introducir una nueva subcategoría de (d), dedicada a los aditivos para alimentos que mejoran el bienestar animal.

Debido al crecimiento drástico de la población mundial, actualmente estimado para alcanzar casi10 mil millones de personas en 2050, la demanda de alimentos derivados de animales aumentará en un 40 % sobre la base actual. La mayor parte de ambos, el aumento de la población y la demanda de proteínas tendrá lugar en los países recién industrializados en Asia, África y Latinoamérica. Muchos de estos países tienen un clima tropical caliente y húmedo. Bajo estas condiciones climáticas, la cría intensiva de especies de ganado sufre de estrés por calor.

Por ejemplo, en los síntomas típicos de las aves de corral del estrés por calor se refleja en los siguientes signos i. ingesta de alimentos reducida y mayor ingesta de agua

ii. Movimiento reducido y acostarse

iii. Tasa de respiración fuertemente aumentada (hasta 250 jadeos/min) y jadeo para estimular la pérdida de calor por evaporación

iv. Alcalosis respiratoria por disminución de la presión parcial de CO² en la sangre

v. Aumento drástico de la actividad mitocondrial (= tasa metabólica total) para estos mecanismos de compensación vi. A una humedad relativa > 50 %, el enfriamiento por evaporación es casi inviable, lo que aumenta la morbilidad y la mortalidad.

En la literatura más reciente, la disminución del rendimiento y el aumento de la morbilidad general está relacionada con el daño a la integridad de la barrera intestinal en animales bajo estrés por calor. La barrera intestinal está compuesta por varias capas que proporcionan protección contra la invasión microbiana. La luz intestinal contiene péptidos antimicrobianos (AMP), inmunoglobulina A (IgA) secretada y bacterias comensales, que inhiben la colonización de patógenos mediante la inhibición competitiva y la producción de, p.ej., butirato, que tiene propiedades protectoras de barrera. Una capa de moco cubre la superficie intestinal proporcionando una barrera física. La capa epitelial consta de una sola capa de células epiteliales que está sellada por pequeñas proteínas de membrana, denominadas proteínas de unión estrecha, como claudinas, ocludinas y zona ocludens (ZO1), que impiden el paso paracelular de moléculas nocivas y patógenos. Esta capa también alberga linfocitos intraepiteliales, células M, células de Gobet productoras de moco y células de Paneth productoras de bacteriocina. La lámina propria contiene un gran número de células inmunitarias, tanto del sistema inmunitario innato como del sistema inmunitario adaptativo. Una figura esquemática de la barrera intestinal y los factores que afectan se describe por Konig y col. 2016.

Se supone que en condiciones de estrés por calor, en particular, las proteínas de unión estrecha se dañan, lo que resulta en una mayor exposición del organismo a las bacterias patógenas, sus lipopolisacáridos proinflamatorios de la pared celular y otros noxa tóxicos (Konig y col. 2016).

Pearce y col. (2013 A) describen un aumento de los niveles de endotoxinas séricas y un aumento de la expresión de la proteína de choque térmico intestinal en cerdos en crecimiento, que están expuestos a estrés por calor. Bajo estrés por calor, a nivel celular, se pueden observar niveles elevados de proteínas de choque térmico (HSP). Las HSP son acompañantes moleculares que intervienen en la citoprotección al mantener el plegamiento adecuado de las proteínas, liberar señales de supervivencia y preservar la integridad del citoesqueleto. Pearce y col. (2013 A) indican que las HSP desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la localización de proteínas de unión estrecha (TJ). Para compensar la pérdida de moléculas de unión ajustadas irreversiblemente dañadas, se observa una regulación positiva de su expresión génica y de proteínas bajo estrés por calor. Por lo tanto, cualquier daño a la función de barrera intestinal se acompaña de un deterioro sustancial del bienestar animal, salud animal y rendimiento animal.

Los defectos en la barrera intestinal son medibles por una Resistencia Eléctrica Transepitelial reducida (TEER -Transepithelial Electrical Resistance) o una mayor permeabilidad para moléculas grandes como el Dextrano de Isotiocianato de Fluoresceina (Dextrano de FITC) (Pearce y col. 2013 B).

Los cítricos, como naranjas, pomelos, limones, limas, tangerinas y mandarinas, pertenecen a las frutas más comúnmente cultivadas. La producción global aumenta anualmente para cumplir las demandas crecientes del consumidor. La industria de procesamiento de cítricos produce tremendas cantidades de desechos. Desechos de cáscara de cítricos representan casi el 50 % de la masa húmeda de la fruta. Los residuos de cítricos tienen un alto valor económico ya que contienen abundantemente varios flavonoides, carotenoides, fibra dietética, azúcares, polifenoles, aceites esenciales y ácido ascórbico, así como cantidades considerables de algunos elementos traza (Sharma y col. 2017). Los cítricos contienen cantidades individuales de flavonoides. Mientras que el flavonoide de sabor amargo Naringina se encuentra predominantemente en la pulpa y la cáscara de pomelos y toronjas, la hesperidina es el flavonoide predominante en naranjas y limones. Ambos flavonoides aparecen en los cítricos mencionados tanto como glicósidos (hesperidina y naringina), y como sus respectivas agliconas hesperitina y naringenina (Suntar y col. 2018).

Se proporciona una descripción general de los principales flavonoides contenidos en los cítricos en el siguiente esquema (esquema 1 de Suntar y col. 2018):

Para hesperidina y hesperitina, se pudo demostrar en células CaCo2, que la esperperitina aglicona se absorbe eficientemente en los enterocitos del intestino delgado. Posteriormente, los conjugados libres de heresperitina o hesperitina pueden entrar en la circulación sanguínea. El glucósido hesperidina se escinde predominantemente en el intestino grueso para rutinosa y hesperitina, que puede entrar en los colonocitos y la circulación sanguínea como se describió anteriormente. El metabolismo y la absorción de hesperidina y hesperitina es bien conocida (Brand y col.

2008).

En general, se sabe que los flavonoides median la citoprotección mediante la regulación positiva del sistema de enzima antioxidante endógena. Tanto para la hesperidina como para la naringina se pudo demostrar una regulación positiva de las enzimas antioxidantes que dependen del factor de transcripción Nrf2 como regulador maestro (Zhu y col. 2017, Chen y col.).

Naringina respalda la aparición de mecanismos de reparación del miocardio en ratas expuestas al estrés isquémico, mediante la regulación positiva de las proteínas de choque térmico (Rani y col. 2013). Para la hesperidina químicamente purificada aplicada a un nivel dietético de 20 mg/kg de dieta, ya sea sola o en combinación con genisteína a pollos de engorde estresados por el calor, se pudo observar una regulación diferencial de la proteína de choque térmico 70 en el músculo de la pechuga (Kamboh y col. 2013). Sin embargo, los resultados de este estudio están en duda, ya que la aplicación de hesperidina reguló negativamente la expresión de la proteína de choque térmico 70. Por el contrario, una regulación positiva de la respuesta de choque térmico por sustancias específicas indicaría un soporte de mecanismos de reparación.

Tanto para la hesperidina como para la naringina, se pudo demostrar en monocapas de células CaCo2, que apoyan la integridad de la barrera intestinal en condiciones no expuestas (Noda y col. 2012). No hay información disponible hasta ahora sobre los efectos protectores de los cítricos y en particular naringina en la protección de la función de la barrera intestinal en condiciones de estrés por calor.

La familia Lamiaceae, una de las familias herbales más importantes, incorpora una amplia variedad de plantas con aplicaciones biológicas y médicas. Los miembros más conocidos de esta familia son una variedad de especias aromáticas como el tomillo, la hierbabuena, el orégano, la albahaca, la salvia, la ajedrea, el romero, auto-cura, el hisopo, la melisa y algunas otras de uso más limitado.

Origanum Genus. Origanum es un género de herbáceas perennes y subarbustos de la familia Lamiaceae, nativa de Europa, el norte de África y también de las zonas templadas de Asia. Las pocas especies también se naturalizaron en América del Norte y en otras regiones. Las plantas tienen hojas fuertemente aromáticas y abundantes flores tubulares con brácteas de colores duraderos. El género incluye Origanum vulgare L. o mejorana común y Origanum majorana L. o mejorana dulce.

Origanum vulgare. O. vulgare es una planta perenne aromática de base leñosa, originaria de las laderas pedregosas y las regiones montañosas rocosas del área mediterránea (Portugal y Andalucía), Europa (incluidas las Islas Británicas) y el sur y centro de Asia. Los principales compuestos (terpenos) contenidos en aceite de Origanum son carvacrol (hasta 70 %), terpinen-4-ol (26 %), cis-sabineno (13,3 %), o-cimeno (9,3 %), Y-terpineno (5,8 %), trans-sabineno (5,7 %), p-ment-1-en-8-ol (5,1 %), b-tujeno (4,9 %) y a - terpineno (3,5 %).

En la medicina popular tradicional, Origanum se usaba para tratar varias enfermedades. Los efectos beneficiosos informados incluyen propiedades antiespasmódicas, antimicrobianas y de mejora de la digestión.

Thymus Genus. El género Thymus, como parte de la familia Lamiaceae, consta de más de 350 especies de plantas aromáticas con hojas perennes. Geográficamente, estas plantas se extienden a Asia, Norte de África y Europa. Aunque se cultiva más de una especie para uso culinario u ornamental, la especie más ampliamente estudiada es Thymus vulgaris. Utilizado durante miles de años en la medicina tradicional, las especies de Thymus despliegan un amplio espectro de propiedades terapéuticas, que incluyen efectos antimicrobianos, antiinflamatorios e incluso anticancerígenos por su contenido de apigenina.

Thymus vulgaris. Los análisis GC-MS y GC-FID revelaron que los principales componentes activos en un tipo de aceite esencial Thymus vulgaris L. son timol (41,0 %), geraniol (26,4 %), tujanol (42,2 % cis-sabineno hidrato y 7,3 % trans­ hidrato de sabineno) y linalol (72,5 %). Otros también contienen borneol y carvacrol. El quimiotipo de tomillo se determina en función de la composición del aceite. La procedencia geográfica y el clima influyen en el quimiotipo y la composición, lo que se ha demostrado en un estudio que compara aceites esenciales de dos regiones de Francia (quimiotipo linalol con 76,2 % de linalol y quimiotipo timol con 47,1 % de timol) y dos regiones de Serbia (quimiotipo geraniol con 59,8 % % de geraniol y quimiotipo de hidrato de sabineno con 30,8 % de hidrato de cis-sabineno). El timol (2-isopropil-5-metilfenol) y el 5-eugenol (4-alil-2-metoxifenol) son terpenoides de T. vulgaris que han demostrado tener efectos anestésicos. Además, se ha demostrado que el timol inhibe la síntesis de vitamina K, lo que conduce a su uso potencial como anticoagulante. T. vulgaris también tiene características espasmolíticas, antimicrobianas, antiinflamatorias, inmunomoduladoras y antioxidantes, efectos que se atribuyen al timol contenido en el aceite de tomillo volátil. Numerosos estudios han confirmado los efectos beneficiosos de T. vulgaris en patologías respiratorias por sus características espasmolíticas y mucolíticas. Otros estudios han indicado su potencial prometedor en el tratamiento de patologías gastrointestinales en modelos animales sin ejercer ningún potencial tóxico.

Rosmarinus Genus. En la familia Lamiaceae Rosmarinus es un género de hierbas leñosas perennes con fragantes hojas perennes en forma de aguja nativas de la cuenca del Mediterráneo.

Rosmarinus officinalis. Rosmarinus officinalis L., comúnmente llamado romero, es una hierba arbustiva mediterránea y está muy extendida en países europeos, americanos y asiáticos. Es una especia común utilizada en todo el mundo con fines culinarios, medicinales y comerciales en la industria de fragancias y alimentos. Las hojas de romero (frescas o secas) se utilizan por su aroma característico en la cocina o se consumen en pequeñas cantidades como infusiones, mientras que los extractos de romero se utilizan por sus propiedades antioxidantes para mejorar la vida útil de los alimentos perecederos. Recientemente, extractos de romero (E392) han sido aprobados como un antioxidante natural seguro y eficaz para la conservación de alimentos por la Unión Europea. Estudios fitoquímicos han revelado que las hojas contienen del 0,5 % al 2,5 % de aceite volátil. Los componentes principales del aceite de romero incluyen hidrocarburos monoterpénicos (alfa y beta pineno), canfeno, limoneno, alcanfor (10 % a 20 %), borneol, cineol, linalool y verbinol. El romero contiene una variedad generalizada de componentes volátiles y aromáticos. Los flavonoides en la planta incluyen diosmetina, diosmina, genkwanina, luteolina, galidulina y apigenina. Además, los componentes terpenoides del romero comprenden los triterpenos ácido oleanólico y ursólico y el diterpeno carnosol. Los fenoles del romero incluyen ácido cafeico, clorogénico, labiático, neoclorogénico y rosmarínico. El romero contiene altas cantidades de salicilatos. Estudios farmacológicos recientes han indicado que el romero y sus componentes, especialmente los derivados del ácido cafeico como el ácido rosmarínico, tienen varios usos tradicionales en la etnomedicina, incluidos analgésicos, antiinflamatorios, anticancerígenos, antirreumáticos, espasmolíticos, antihepatotóxicos, antiateroscleróticos. efectos carminativos y coleréticos (Uritu y col. 2018).

Hosseini y col. (2018) informaron que una mezcla de cinamaldehído y timol mostró una respuesta indiferente en pollos de engorde con estrés social (estrés por hacinamiento). En este estudio se ha utilizado una mezcla de aceite de tomillo con cinamaldehído. Otro estudio en pollos de engorde informó de efectos beneficiosos del aceite de tomillo sobre la integridad intestinal (Placha y col. 2014). Los efectos positivos del tomillo sobre la resistencia general de los animales a las condiciones de estrés pueden derivarse de su potencial para inducir una respuesta antioxidante endógena a través de la vía Nrf2 (Kluth y col. 2007, FangFang y col. 2018). Existe una situación similar también para orégano. Zou y col. (2016, (B)) informaron que en cerdos el aceite esencial de orégano contribuyó a una mejora de la morfología intestinal y la expresión estrecha de proteínas de unión, ligado a cambios en la microflora intestinal. Tanto in vivo como in vitro, se pudo demostrar que el carvacrol, el principal terpeno del aceite de orégano, respalda la inducción de la proteína de choque térmico como un desencadenante de la respuesta de las células T (Wieten y col. 2010). Como se informó de manera similar para el tomillo y la parte timol del antioxidante, los efectos del orégano pueden desencadenarse a través de la inducción de la vía Nrf2 (Zou y col. 2016 (A).

Para el romero solo existe un estudio en la bibliografía actual en el contexto con estrés por calor. Türk y col. (2016) informaron que la alimentación con aceite de romero en concentraciones muy altas, pero antieconómicas, de 125 y 250 g/t de alimento completo redujo la peroxidación lipídica en los testículos de codornices, lo que redujo fallas reproductivas.

En la nutrición animal, las estrategias practicadas comúnmente para mejorar los efectos adversos del estrés por calor sobre la salud y el rendimiento del animal incluyen el uso de:

• Vitaminas antioxidantes, en particular vitamina C

• Sustancias tampón y electrolitos, para compensar pérdidas y alcalosis

• Betaína sintética (N,N,N-trimetilamonioacetato), un donante de metilo que apoya en particular el metabolismo vitamínico de la vitamina B12 y el ácido fólico, así como el metabolismo de la metionina.

La betaína se dosifica rutinariamente a niveles de 0,5 a 1,0 kg/t de alimentación.

El uso de betaína en la industria de aves de corral para hacer frente al problema de estrés por calor es revisado por Saaed y col. (2017). Es necesario realizar más estudios sobre la base genética y molecular para dilucidar el mecanismo detrás de la betaína como un agente anti-calor natural para disminuir el problema del estrés por calor en la industria avícola.

Las betalaínas son una clase de pigmentos derivados del indol rojos y amarillos que se encuentran en las plantas de Caryophyllales, como la berbería, donde reemplazan a los pigmentos de antocianina. Las betalaínas también se encuentran en algunos hongos de orden superior como Tricholomopsis rutilans. Son más a menudo notables en los pétalos de flores, pero pueden colorear los frutos, las hojas, los tallos y las raíces de las plantas que las contienen. Incluyen pigmentos tales como los que se encuentran en las remolachas, en particular de raíz de remolacha. El nombre “ betalaína” proviene del nombre en latín de la remolacha común (Beta vulgaris), de la que se extrajeron por primera vez las betalaínas. El color rojo intenso de la remolacha, la buganvilla, el amaranto y muchos cactus se debe a la presencia de pigmentos de betalaína. Los tonos particulares de rojo a púrpura son distintivos y a diferencia de los pigmentos de antocianina encontrados en la mayoría de las plantas.

Existen dos categorías de betalaínas:

1. Las Betacianinas incluyen los pigmentos de betalaina rojizo a violeta. Entre las betacianinas presentes en las plantas se incluyen betanina, isobetanina, probetanina y neobetanina.

2. Las Betaxaninas son aquellas pigmentos de betalaina que parecen amarillo a naranja. Entre las betaxantinas presentes en las plantas se encuentran la vulgaxantina, la miraxantina, la portulaxantina y la indicaxantina.

La betanina es una betalaína, también llamada remolacha roja, porque puede extraerse de las raíces de la remolacha roja.

Se ha demostrado que las betalaínas ejercen antioxidantes directamente en comparación con el potencial antioxidante de Trolox® o mediante la inducción de enzimas antioxidantes y desintoxicantes a través de la vía nrf2 (Lee y col. 2005, Esatbeyouglu y col. 2015).

El documento AU2005229753A1 describe composiciones botánicas para la salud y prevención óptimas de la enfermedad a través del suministro de nutrientes, mejorando así una gran variedad de enfermedades. Se describe una serie de diferentes productos químicos para ciertos fines. Entre los productos químicos antifatiga, se menciona 1, 8-cineol. La lista de productos químicos anti-miorrelajantes divulgados incluye, entre otros, 1,8-cineol y timol. La lista de productos químicos antiinflamatorios incluye entre otros 1, 8-cineol y naringina.

El documento US-4759932 describe un método para reducir el estrés por calor en animales mediante la adición de zeolita a la alimentación.

US2008032021A1 divulga un aditivo para alimentos para aves que comprende un aceite esencial derivado de al menos una hierba y una especia y que contiene timol y carvacrol como sus ingredientes principales, y al menos un ácido orgánico derivado de al menos un ácido cítrico, fumárico, fúlvico y húmico. .

María Miguel brinda una revisión de las betalaínas presentes en algunas especies de la familia Amaranthaceae (Maria Miguel 2018).

El documento WO2017037157A1 divulga una composición de aditivo para alimentos para aves de corral que es una mezcla fluida de compuestos fitogénicos que comprende un aceite esencial de tomillo microencapsulado y saponina contenida en partículas de polvo de corteza de quillaja seca, para mejorar la digestibilidad y el rendimiento para el engorde, la puesta o la reproducción, hasta el punto de puesta.

Existe la necesidad de mejores alimentos para el ganado que permitan una mejor reproducción bajo estrés por calor, contribuyendo al bienestar animal.

Figuras

Fig. 1: A, B, C, D, E: Ensayo I: Extensión de vida en C . elegans bajo estrés por calor por sustancias de referencia (ácido ascórbico, betaína) y compuestos “A” , “ B” y “ C” .

Fig. 2: F, G, H, I, J, K: Ensayo I: Ejemplo comparativo: Extensión de vida en C. elegans bajo estrés por calor por sustancias adicionales, recomendadas con frecuencia para reducir las consecuencias negativas del estrés por calor (Piperina, capsaicina, Gingerol, aceite de eucalipto, aceite de hierbabuena, Eugenol).

Fig. 3: Ensayo II: Inducción dependiente de dosis de respuesta al choque térmico en células CaCo2 bajo estrés por calor por A) betaína de betaína (sustancia de referencia), B), C), D) compuestos “A” , “ B” , “ C” ; y E) la combinación de los compuestos “ B” y “ C” frente a los compuestos “ B” y “ C” solos.

Fig. 4: Ensayo II: Efecto de la betalaína (compuesto “ C” ) a 1,10 mg/L sobre el desarrollo TEER de cultivos celulares transwell CaCo2 expuestos a estrés por calor a 42 °C.

Fig. 5: Ensayo IV: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y el compuesto “A” en el peso corporal en los días 21 y 42 en los pollos de engorde expuestos a estrés por calor del día 22 al día 42 - A) peso corporal absoluto; B) diferencia relativa de betaína y compuesto A al control negativo; C) diferencia relativa del compuesto A a la betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 6: Ensayo IV: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y el compuesto “A” en el aumento de peso diario en los períodos 0-21d, 22-42d y 0-42d en pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42-A) ganancia de peso diario absoluto; B) diferencia relativa de betaína y compuesto “A” a control negativo; C) Diferencia relativa del compuesto “A” en comparación con la betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 7: Ensayo IV: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y el compuesto “A” en FCR en los períodos 0-21d, 22-42d y 0-42d en pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42 - A) FCR absoluto; B) con respecto al control negativo; C) con respecto a la betaína de control positivo; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre medias

Fig. 8: Ensayo V: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y combinaciones de compuesto “A” con diferentes concentraciones del compuesto “ B” en el peso corporal en los días 21 y 42 en los pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42 - A) peso corporal absoluto; B) diferencia relativa de betaína y combinaciones de compuesto “A” y “ B” al control negativo; C) Diferencia relativa de combinaciones de compuesto “A” y “ B” a betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 9: Ensayo V: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y combinaciones de compuesto “A” con diferentes concentraciones del compuesto “ B” en el aumento de peso diario en los períodos 0-21d, 22-42d y 0-42d en aves de engorde expuestas A estrés por calor del día 22 al día 42 - A) ganancia de peso diario absoluto; B) diferencia relativa de betaína y combinaciones de compuesto “A” y “ B” al control negativo; C) Diferencia relativa de combinaciones de compuesto “A” y “ B” a betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 10: Ensayo V: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y combinaciones de compuesto “A” con diferentes concentraciones del compuesto “ B” en FCR en los períodos 0-21d, 22-42d y 042d en pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42- A ) FCR absoluto; B) diferencia relativa de betaína y combinaciones de compuesto “A” y “ B” al control negativo; C) Diferencia relativa de combinaciones de compuesto “A” y “ B” a betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 11: Ensayo VI: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y combinaciones de compuesto “ B” con el compuesto “A” o “ C” en peso corporal en los días 21 y 42 en los pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42 - A) peso corporal absoluto; B) diferencia relativa de betaína y combinaciones de compuesto “ B” con los compuestos “A” o “ C” al control negativo; C) combinaciones relativas de diferencia del compuesto “ B” con los compuestos “A” o “ C” a betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 12: Ensayo VI: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y combinaciones de compuesto “ B” con el compuesto “A” o “ C” en el aumento de peso diario en los períodos 0-21d, 22-42d y 0-42d en pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42 - A) ganancia de peso diario absoluto; B) diferencia relativa de betaína y combinaciones de compuesto “ B” con los compuestos “A” o “ C” al control negativo; C) combinaciones relativas de diferencia del compuesto “ B” con los compuestos “A” o “ C” a betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre los medios.

Fig. 13: Ensayo VI: Efecto de la betaína (sustancia de referencia) y combinaciones de compuesto “ B” con el compuesto “A” o “ C” en FCR en los períodos 0-21d, 22-42d y 0-42d en pollos de engorde expuestos al estrés por calor del día 22 al día 42 - A) FCR absoluto; B) diferencia relativa de betaína y combinaciones de compuesto “ B” con los compuestos “A” o “ C” al control negativo; C) combinaciones relativas de diferencia del compuesto “ B” con los compuestos “A” o “ C” a betaína; *a, b,c: diferentes letras pequeñas indican diferencias significativas entre medias

Descripción detallada de la invención

Los términos específicos como se usan a lo largo de la memoria descriptiva tienen el siguiente significado.

El término “ libre de antibióticos” como se usa en la presente descripción con respecto a la alimentación de un animal, una dieta o un producto de alimentación, se referirá a la alimentación de un animal con un producto de alimentación desprovisto de antibióticos. Aunque el animal puede haber sido tratado con antibióticos tras la prescripción veterinaria, la dieta regular no contendría antibióticos adicionales como potenciador del crecimiento. Por lo tanto, se impide la acumulación de tales sustancias nocivas como antibióticos y similares en personas que han consumido la carne o huevos de aves de corral. Las composiciones que se describen en la presente descripción mejoran eficazmente la conversión de alimentos mediante el uso de los antibióticos en los productos de alimentación. Por lo tanto, es posible aumentar la productividad de la carne de buena calidad.

El término “ características biofísicas” de un animal como el ganado o las aves de corral se entiende aquí como la función biótica y abiótica de un animal o población, e incluye en particular los factores que influyen en su supervivencia, desarrollo y evolución, incluidos en particular los factores mejorar la eficiencia de conversión alimenticia en animales, p.ej., según lo determinado por modelos in vitro o in vivo. Dichos factores incluyen, p. permeabilidad de la membrana intestinal, digestibilidad de nutrientes, digestibilidad de proteínas (ileales), transporte de nutrientes, efectos antimicrobianos o antioxidantes.

La “ eficiencia de conversión de alimentación” (FCE) como se entiende en la presente descripción se refiere específicamente a una medida de la eficiencia de un animal en la conversión de la masa de alimentación en una mayor masa corporal (por ejemplo, masa muscular o de huevo). La eficiencia se puede determinar como la tasa de conversión de alimentación (FCR), que es la masa del alimento ingerido dividido por la ganancia de masa corporal, todo durante un período especificado. Por ejemplo, un animal que se alimenta con un aditivo de alimentación diseñado para una eficiencia mejorada de conversión de alimentos puede consumir menos alimentos que un animal que recibió alimento sin dicho aditivo para piensos, produciendo una cantidad similar de carne. Típicamente, la tasa de conversión de alimentación de aves de corral está en el intervalo de 1,2 a 2,5, y la tasa de conversión de alimentación de cerdos está en el intervalo de 1,5 a 3,0, dependiendo de la raza genética. Se puede determinar una mejora (es decir, una reducción) en la tasa de conversión alimenticia o un factor que influya en la eficiencia de conversión alimenticia, si la tasa de conversión alimenticia aumenta o el factor disminuye, por ejemplo, en al menos un 2 %, preferiblemente al menos 2,5 %.

Hay factores directos que influyen en la eficiencia de conversión alimenticia, p. incluyendo la digestibilidad de los nutrientes, la digestibilidad (ileal) de los nutrientes o las proteínas, la permeabilidad de la membrana intestinal, los sistemas de transporte de nutrientes de la membrana del borde en cepillo o factores indirectos, como los que mejoran el estado de salud del animal y reducen la demanda de energía y proteínas para las reacciones inmunitarias, incluyendo efectos antimicrobianos.

El término “ permeabilidad a la membrana intestinal” se entiende en el presente documento como un factor que determina la absorción intestinal de nutrientes, tal como al pasar a través de una membrana celular del intestino. Dichas características biofísicas pueden determinarse por el modelo ex vivo que emplea células colorrectales epiteliales para probar un cambio en la permeabilidad al entrar en contacto con sustancias específicas. El término “ sistemas de transporte de nutrientes” se entiende en el presente documento como un transporte activo de nutrientes, que incluye, por ejemplo, glucosa, péptidos y aminoácidos, del lumen del intestino delgado a través de la membrana de borde del cepillo en los enterocitos. Dichos sistemas de transporte de nutrientes son enzimas específicas, que incluyen, por ejemplo, el transportador de glucosa dependiente de sodio (SGLT1) y el pequeño transportador de péptidos y aminoácidos (PEPT1). Dichas características biofísicas pueden determinarse por el modelo ex vivo que emplea células colorrectales epiteliales para probar un cambio en la expresión génica de la enzima transportadora SGLT1 al entrar en contacto con sustancias específicas. El término “ efectos antimicrobianos” como se entiende en la presente descripción se refiere a los posibles efectos bacteriostáticos de bacterias que posiblemente son patógenos de animales monogástricos, que incluyen aves de corral. Dichas características biofísicas pueden determinarse por el modelo ex vivo que emplea células bacterianas para probar un cambio en el crecimiento de células bacterianas tras el contacto con sustancias específicas.

El término “ componente” con respecto a un aditivo de alimentación se entiende en la presente como parte de una composición, que puede incluir uno o más compuestos, componentes y excipientes adicionales. El aditivo para piensos descrito en el presente documento es una composición que comprende específicamente al menos un componente de aceite (esencial) que comprende 1,8-cineol como compuesto o compuesto activo, y al menos un componente adicional que incluye los compuestos (o compuestos activos) naringina y/o betalaína, pero puede incluir además componentes biológicos, principalmente componentes fitogénicos y otros excipientes, incluidos, por ejemplo, excipientes inorgánicos.

Específicamente, el componente de 1,8-cineol es un aceite esencial que comprende 1,8-cineol en una cantidad especificada. Materiales vegetales ilustrativos usados como fuente del compuesto de 1,8-cineol como se usa en la presente descripción, son uno o más de: tomillo, romero o eucalipto

El componente oleoso como se describe en el presente documento se obtiene específicamente extrayendo un aceite de un material vegetal, por ejemplo, mediante extracción en frío o técnicas de extracción en caliente, empleando una fase acuosa y opcionalmente una fase oleosa, para obtener una emulsión a/a del aceite.

Según un ejemplo específico, el componente 1,8-cineol se produce de la siguiente manera: En un mezclador que emplea tecnología de pulverización, el componente de aceite esencial se pulveriza sobre sílice en una cualquiera de las proporciones de 30:70 o 40:60 o 50:50 o 60:40 (p/p) y se mezcla completamente, por ejemplo, durante al menos 30 minutos.

Los aceites esenciales se extraen de forma típica de materiales vegetales mediante métodos de retirada que son adecuados para la parte de planta específica que contiene los aceites. Los métodos de extracción populares incluyen: destilación al vapor, extracción con solvente, extracción con CO2, maceración, enflorado, extracción por prensado en frío y destilación con agua.

De acuerdo con un aspecto específico, el método de producción emplea la preparación de una emulsión de a/a que incluye el aceite y, opcionalmente, un polímero, solubilizante y/o detergente, seguido de secado por pulverización a temperatura controlada para obtener un componente de aceite seco fluido.

Los aceites esenciales se pueden proporcionar en forma microencapsulada. Típicamente, la microencapsulación de un aceite esencial proporciona su aislamiento desde sus alrededores p. ej, aislar los aceites de los efectos de deterioro de sustancias adicionales en la fase acuosa p. ej, en el entorno gastrointestinal, retardando la evaporación del aceite volátil, protección contra la fricción y evaporación debido a la humedad y a la alta temperatura durante el procesamiento de alimentación (granulación) o mejorando las propiedades de manipulación del material pegajoso. Además, se puede controlar eficazmente la velocidad a la que el aceite sale de la microcápsula, como en la liberación sostenida o controlada del aceite en el tracto gastrointestinal, con el objetivo de proporcionar una cantidad eficaz de los compuestos activos en los intestinos. De este modo, la liberación del aceite y otros componentes se puede lograr en una forma sincronizada para lograr efectos sinérgicos in vivo.

Puede usarse una amplia gama de materiales y métodos para la encapsulación para crear el grado de durabilidad y método de liberación adecuado para el uso previsto. Los ejemplos de materiales poliméricos no limitativos adecuados para su uso con la microencapsulación de aceite pueden incluir polímeros naturales de origen eucariota o procariota, p. incluyendo hidrolizados de almidón, como dextrinas, almidón modificado, Gummi Arabicum, alginatos, derivados de celulosa, como hidroxipropilcelulosa, Na-carboxicelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, proteínas animales o vegetales o hidrolizados de proteínas, como gelatina, colágeno, yema de huevo, proteína de trigo, caseína, proteína de leche, proteína de soja, proteína de guisante o mezclas de las mismas. Pueden usarse diversos métodos físicos y químicos de microencapsulación, dependiendo del aceite y del recubrimiento de cubierta polimérica deseado a usar. Convenientemente, el aceite esencial se encapsula deshidratando una emulsión a/a por cualquier medio adecuado, incluyendo secado por pulverización, secado por congelación, secado en lecho fluido, secado por bandeja, adsorción y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el aceite microencapsulado se produce mediante secado por pulverización de una emulsión que tiene una fase acuosa como se definió anteriormente que contiene un agente de encapsulación polimérico. Los parámetros de secado por pulverización están dictados por las características físicas deseadas en el aceite microencapsulado final. Dichos parámetros físicos incluyen el tamaño de partícula, el flujo y el contenido de agua.

El componente oleoso típicamente tiene una buena fluidez y se puede distribuir de manera homogénea a lo largo de la composición. Convenientemente, el componente oleoso es un polvo. Se puede añadir cualquier aditivo adecuado al aceite p. ej, un agente de flujo tal como dióxido de silicio, para aumentar la fluidez del aceite.

El componente de naringina y/o el componente de betalaína como se describe en la presente descripción es específicamente un material vegetal que comprende los compuestos naringina y betalaína, respectivamente, en la cantidad especificada. Específicamente, el material vegetal se proporciona como polvo seco en partículas.

El término “ polvo” como se usa en la presente descripción se entiende específicamente como un material fluido que comprende una pluralidad de partículas. Las partículas pueden tener una superficie exterior lisa y/o una morfología aplanada. En determinadas realizaciones, el material vegetal particulado es un polvo de color beige a color marrón oscuro con un olor característico.

El material vegetal particulado usado en la presente descripción se obtiene específicamente triturando material vegetal seco para obtener un tamaño de partícula específico, por ejemplo, correspondiente al material fluido, p. ej, SiO² (polvo), una harina y/o sémola.

Las partículas pueden tener una dimensión media más grande de 250-500 μm. El material particulado típico tiene un tamaño de partícula de 95 % por debajo de 500 μm. Preferentemente, el material vegetal particulado tiene un tamaño medio de partícula de 100-350 μm.

El material en polvo vegetal puede derivarse de varias porciones de la planta, específicamente pueden usarse materiales vegetales fibrosos, por ejemplo incluyendo corteza, raíces, tallos, tallos, hojas, frutos, cáscaras, flores, semillas o combinaciones de los mismos.

Ejemplos de materiales vegetales usados como fuente del componente naringina como se usa en el presente documento son materiales vegetales de plantas de la familia Rutaceae, tales como frutas cítricas, por ejemplo, cáscaras u orujo de frutas cítricas. Específicamente, la naringina puede extraerse de dichos productos vegetales y usarse como componente aditivo de alimentación, o los productos vegetales pueden usarse como tales.

Ejemplos de materiales vegetales usados como fuente del componente de betalaína como se usa en el presente documento son materiales vegetales de plantas de Caryophyllales, tales como frutas, hojas, tallos y raíces de plantas, por ejemplo, remolacha. Específicamente, las betacadenas se pueden extraer de dichos productos vegetales y usarse como componente aditivo de alimentación, o los productos vegetales se pueden usar como tal.

De acuerdo con un ejemplo específico, el componente de naringina y/o el componente de betalaína se mezclan en un mezclador de alimentación al componente de aceite esencial sobre sílice y opcionalmente con otros excipientes.

El contenido de humedad del aditivo de alimentación o producto de alimentación descrito en la presente memoria es típicamente inferior al 12 %, preferiblemente inferior al 8 %.

El término “ excipientes” como se usa en la presente descripción se referirá a componentes aditivos comúnmente usados en composiciones de alimentación, por ejemplo, componentes de aditivos de alimentación fitogénicos y/o inorgánicos. Específicamente, el aditivo alimentario y sus componentes aditivos se entienden como productos utilizados en la nutrición animal con el fin de mejorar la calidad de la alimentación, o para mejorar el rendimiento y la salud de los animales. Los aditivos de alimentación se seleccionan de forma típica cuidadosamente que no tienen efectos perjudiciales, en la salud humana y animal y en el medio ambiente.

A este respecto, el término “ alimento” se refiere típicamente a cualquier mezcla de ingredientes de alimentos para animales que proporcionen requisitos de energía y nutrientes, por ejemplo, proteínas, grasas, carbohidratos, minerales y micronutrientes. Por ejemplo, la ingesta diaria de alimento para aves de corral suele oscilar entre 50 y 250 g/cabeza y día para un pollo de engorde. De acuerdo con otro ejemplo, la ingesta diaria de pienso porcino, de acuerdo con el estado fisiológico, está típicamente entre 50-1500 g/cabeza y día. De acuerdo con otro ejemplo, la ingesta diaria de alimento para rumiantes, de acuerdo con la especie y el estado fisiológico, está típicamente entre 150-35000 g/cabeza y día.

El aditivo de alimentación descrito en la presente descripción puede incluir específicamente excipientes, tales como aceites esenciales adicionales, hierbas secas, especias y excipientes adicionales, que incluyen colores, sustancias aromatizantes, conservantes o cualquier sustancia necesaria para formular la composición a la forma deseada, tal como agentes de carga, agentes antiaglomerantes, diluyentes, rellenos, aglutinantes, desintegrantes, adsorbentes o agentes de granulación. Los excipientes típicos son, por ejemplo, hojas de romero, bayas de enebro, cáscaras de psyllium, salvado de trigo, piedra caliza, SiO₂ o bentonitas.

El término “ fluido” como se usa en la presente descripción se referirá específicamente a una mezcla de componentes en forma de polvo, que incluye, por ejemplo, material particulado, que puede fluir. Por ejemplo, una mezcla fluida puede fluir a través de un embudo o tolva a otro recipiente bajo la influencia de la gravedad. En la presente invención, una mezcla de polvo fluida es adecuada para su uso con un dispositivo para la mezcla con material de alimentación y granulado. El término “ fluido” es bien conocido en la industria alimentaria y de alimentación y tiene un significado claro para el experto en la técnica.

Una mezcla fluida tiene varias ventajas en uso, particularmente a escala industrial. La mezcla puede manejarse, almacenarse y transportarse de manera relativamente fácil y energética, en comparación con, por ejemplo, materiales sólidos que no son fluidos. Esta ventaja es particularmente importante en combinación con la capacidad de evitar una etapa de licuefacción en el proceso de granulación.

La mezcla fluida como se usa aquí comprende específicamente al menos un componente de aceite (esencial) que comprende 1,8-cineol, y al menos un componente adicional que incluye naringina o betalaína, y opcionalmente otros componentes y excipientes, donde los componentes se mezclan todos juntos sin el inclusión de cualquier cantidad sustancial de líquido para formar una mezcla seca, que opcionalmente se muele en un polvo fluido, preferiblemente granulado.

Específicamente, un componente de 1,8-cineol, alimentado en una mezcla con al menos un componente adicional que incluye naringina o betalaína, proporciona un sistema fitogénico que mejora inherentemente las propiedades de liberación sostenida de los compuestos activos in vivo, para mejorar las características biofísicas según sea necesario. Preferentemente, uno cualquiera o más o todos los componentes de 1,8-cineol, el componente de naringina o el componente de betalaína no se disuelven o disuelven solo mal en el estómago. Los componentes de la composición de aditivo para pienso pueden proporcionarse suficientemente al intestino y/o al colon, de modo que los compuestos activos pueden actuar concomitantemente sobre las características biofísicas.

Por lo tanto, es posible obtener efectos sinérgicos en los intestinos cuando se usa el aditivo de alimentación o el producto de alimentación descrito en el presente documento.

El término “ aves de corral” , como se usa en el presente documento, se referirá específicamente a las aves domesticadas criadas principalmente para carne (pollos de engorde) y huevos (ponedoras); incluyendo aves del orden Galliformes, por ejemplo, pollo, pavo, pintada, faisán, codorniz y pavo real; y Anserigormes (aves nadadoras), por ejemplo, el pato y el ganso.

Las aves de corral pueden alimentarse con la misma composición de alimentación durante todo el período de crecimiento, o al menos durante un período de al menos 3 semanas, preferentemente al menos 4 semanas para mejorar la eficiencia del uso de alimentos o la eficiencia de alimentación, por ejemplo, la salida por unidad de alimentación. Se pueden encontrar diferencias significativas entre los tratamientos de control y experimentales en el peso corporal final y el aumento de peso en los períodos de crecimiento completos hasta 28 días después de la eclosión. Si bien la ingesta de alimentos puede ser casi igual entre tratamientos, la eficacia de la alimentación, es decir, g de alimentación/g de aumento de peso puede ser significativamente mejor para aves de corral y específicamente pollos alimentados con la composición de aditivo alimentario de la invención.

El término “ porcino” , como se usa en el presente documento, se referirá a mamíferos artiodáctilos omnívoros de patas cortas y cuerpo robusto (familia Suidae) con una piel gruesa y erizada y un hocico largo y flexible; especialmente el cerdo doméstico y el jabalí.

El alimento descrito en este documento como se usa para aves de corral o cerdos es específicamente granulado o triturado.

Las composiciones ilustrativas de una composición de aditivo alimentario descrita en la presente memoria para su uso en la cría de aves o cerdos se describen en el Ejemplo 1.

El término “ rumiante” , como se usa en este documento, se referirá a mamíferos rumiantes que incluyen, por ejemplo, ganado vacuno, cabras, ovejas, jirafas, yaks, ciervos, antílopes y algunos macrópodos (canguros).

El alimento descrito en este documento como se usa para rumiantes, como el ganado, específicamente se granula o se mezcla un aditivo para alimentos con uno o más de los siguientes: ensilaje de pasto, ensilaje de maíz, harina de soja o grano machacado.

Las composiciones ejemplares de una composición de aditivo alimentario descrita en la presente memoria para su uso en rumiantes de mejoramiento, tales como ganado, se describen en el Ejemplo 1.

Ejemplos adicionales proporcionados en la presente descripción se dirigen a los métodos analíticos para determinar las sustancias activas 1,8-cineol, naringina y betalaína en una composición de aditivo para pienso.

Otros ejemplos proporcionados en el presente documento están dirigidos a pruebas in vivo y ex vivo del efecto del aditivo de alimentación, tal como

i. Pruebas in vivo del efecto sobre la extensión de la vida útil en gusanos C. elegans que están expuestos al estrés por calor,

ii. Prueba Ex vivo el efecto de inducción de la proteína de choque térmico en células CaCo2;

iii. Función de barrera intestinal Ex vivo mediante resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en células CaCo2 transwell iv. Validación in vivo de efectos beneficiosos de naringina en el rendimiento del crecimiento en pollos de engorde bajo estrés por calor y evaluación de un nivel de dosis beneficioso;

v. Validación in vivo de efectos beneficiosos de combinaciones de naringina con diferentes concentraciones de 1,8-cineol sobre el rendimiento del crecimiento, respuesta de la proteína de choque térmico e integridad de la barrera intestinal en pollos de engorde bajo estrés por calor; y

vi. Validación In vivo de los efectos beneficiosos de las combinaciones de naringina con 1,8-cineol o 1,8-cineol con betalaína.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, dichos ejemplos son simplemente representativos de los métodos para poner en práctica una o más realizaciones de la presente invención y no deben leerse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Ejemplos de aditivos de alimentación denominados “ Nuevo aditivo de alimentación compatible con Bienestar Animal bajo condiciones de estrés por calor”

Las composiciones ilustrativas contienen los siguientes ingredientes, mezclados a una mezcla fluida seca. Mientras que el componente de aceite es un aceite específico de lamiaceae o una mezcla de aceites de lamiaceae (p. ej., de orégano y/o romero y/o tomillo), estandarizado a la concentración de 1,8 cineol, el componente flavonoide deriva de los flavonoides cítricos, con concentración de naringina estandarizada, y el componente de betalaína se deriva del polvo de remolacha, con concentración de betalaína estandarizada.

Tabla 1: Fórmula I; Composición de una nueva formulación de aditivos para piensos para aves (pollos de engorde, ponedoras, pavo) y cerdos

La fórmula de aditivo de alimentación ilustrativa I contiene 1,50 % de 1,8-cineol (p/p); y una relación eficaz de 0,65:1 (p/p de 1,8-cineol por naringina).

Tabla 2: Fórmula II; Composición de una nueva formulación de aditivos para piensos para aves (pollos de engorde, ponedoras, pavo) y cerdos

La fórmula II de aditivo para pienso ilustrativa contiene 1,50 % de 1,8-cineol (p/p); y una relación eficaz de 22:1 (componente de 1,8-cineol p/p por betalaína).

Tabla 3: Fórmula III; Composición de una nueva formulación de aditivo para pienso

El aditivo de alimentación ilustrativo fórmula III contiene 0,375 % de 1,8-cineol (p/p); y una relación eficaz de 0,5:1 (p/p de 1,8-cineol por naringina).

Tabla 4: Fórmula IV; Composición de una nueva formulación de aditivo para pienso

El aditivo de alimentación ilustrativo fórmula IV contiene 0,375 % de 1,8-cineol (p/p); y una relación eficaz de 12:1 (p/p de 1,8-cineol por betalaína)

El aditivo de alimentación llamado “ nuevo aditivo de alimentación compatible con Bienestar Animal bajo condiciones de estrés por calor” contiene

a) naringina en una proporción eficaz dentro del intervalo de 0,2:1-1,5:1, en particular 0,65:1 (p/p, 1,8-cineol por naringina); y/o

b) betalaína en una proporción eficaz dentro del intervalo de 4:1-64:1, en particular 22:1 (p/p, 1,8-cineol por betalaína). La fórmula se prueba en los sistemas de ensayo descritos en la presente memoria para mostrar un efecto sinérgico de las combinaciones de los compuestos individuales.

Por ejemplo, el efecto sinérgico se define como una eficacia mayor que realiza el crecimiento en comparación con un aditivo de referencia estándar, cuando se usa a un nivel de dosis recomendado.

De acuerdo con el ejemplo, la dosificación del “ nuevo aditivo de alimentación que soporta Bienestar Animal bajo condiciones de estrés por calor” se describe en un intervalo de 200 a 400 mg/kg o en un intervalo de 200 a 400 mg/kg de alimentación completa.

Además, en los sistemas de ensayo in vivo (ensayos en animales) se transporta una dosis generalmente recomendada de betaína (500 mg/kg de alimentación completa) como un grupo de control positivo. Este enfoque sirve para demostrar la mayor eficacia del “ nuevo aditivo de alimentación compatible con Bienestar Animal en condiciones de estrés por calor” en comparación con una solución comercial aplicada con frecuencia.

Ejemplo 2: Descripción de métodos analíticos y métodos de ensayo:

Descripción de la evidencia analítica de sustancia activa

1. 1,8 Cineol (compuesto “A” )

2. Naringina (compuesto “ B” )

3. betalaína (compuesto “ C” )

Descripción de la metodología de ensayo y resultados

4. Ensayo I: Prueba de extensión de la vida útil en gusanos C. elegans

5. Ensayo II: Ensayo in vitro de inducción de proteínas de choque térmico en células CaCo2

6. Ensayo III: Ensayo in vitro de la función de barrera intestinal mediante resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en células CaCo2 transwell

7. Ensayo IV: Validación in vivo de efectos beneficiosos de la naringina (Compuesto “A” ) en el rendimiento del crecimiento en pollos de engorde bajo estrés por calor y evaluación del nivel de dosis óptimo

8. Ensayo V: Validación in vivo de efectos beneficiosos de combinaciones de naringina (Compuesto “ B” ) con diferentes concentraciones de 1,8-cineol (Compuesto “A” ) en el rendimiento del crecimiento, respuesta de la proteína de choque térmico e integridad de la barrera intestinal en pollos de engorde bajo estrés por calor

9. Ensayo VI: Validación In vivo de efectos beneficiosos de las combinaciones de naringina con 1,8-cineol (AB) o 1,8-cineol con betalaína (AC).

Descripción:

Análisis de 1,8-cineol

GC MS

El análisis de cromatografía de gases se llevó a cabo usando un Focus GC acoplado a un DSQII MS adquirido de Thermo (Waltham, MA, EE. UU.) La inyección (volumen de inyección 1 j l ) se realizó en el modo sin división a la temperatura de inyección de 240 °C. La separación se llevó a cabo en una columna de sílice fundida Rx-5ms (30 m x 0,25 mm i.d. espesor de película de 0,25 jm ) de Restek (Bad Homburg, Alemania) a un flujo constante. El programa de horno comenzó a 50 °C y la temperatura se incrementó en la primera etapa a 190 °C a 5 °C min-1 y en la segunda etapa a 300 °C (mantenido durante 5 min) a 30 °C min-1. Se usó helio (4,6) como gas portador con un caudal de columna de 1,0 ml min-1.

El espectrómetro de masas se hizo funcionar en el modo de monitorización de iones (SIM) seleccionado con los iones seleccionados m/z 154, m/z 139, m/z 111, m/z 108. La temperatura de la fuente de iones se ajustó a 240 °C y la temperatura de la línea de transferencia se configuró a 300 °C.

Análisis de Naringina

LC MS

El experimento se realizó en un sistema de HPLC Agilent Series 1100. La columna de separación fue una Hooshell 120 EC-C18 Eclipse (50 x 3 mm ID, 2,7 jm de tamaño de partícula) obtenida de Agilent. La fase móvil consistió en un gradiente de agua y acetonitrilo, tanto con ácido fórmico al 0,1 %. Las condiciones iniciales fueron acetonitrilo al 15 % durante 5 minutos, después el gradiente se hizo pasar a un 20 % de acetonitrilo en 5 minutos. El 100 % de acetonitrilo dentro de los siguientes 5 minutos, y finalmente hasta el 15 % de acetonitrilo se mantuvo durante otros 5 min. El tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 20 minutos. El caudal se ajustó a 0,8 mL min - 1.

La detección de MS se llevó a cabo en un QTOF Agilent 6520 en el modo de iones negativos. Se usaron las siguientes condiciones de fuente de ión: temperatura de gas de secado 350 °C, flujo de gas de secado 10,5 L min-1, presión de nebulizador 45 psi, tensión de fragmentación 125 V y voltaje capilar 3750 V.

Análisis de BETALAINA

LC MS (Pires Goncalves y col. 2012)

La cromatografía en fase inversa se realizó en un sistema Waters (Milford, MA) 600 equipado con un detector de UV-Vis (doble longitud de onda, Waters 2489) y una Jauter-15 (300 A, 15 jm , 250 x 21,2 mm, Phenomenex, Torrance, CA) columna C¹⁸. Los gradientes se formaron entre dos disolventes desgasificados con helio: disolvente A: agua con HOAc; al 1 % v/v gradiente lineal de 5 % a 20 % B: en 60 min a 25 °C, velocidad de flujo: 10 mL/min.

Se usó un Bruker Daltonics Esquire 3000 Plus para los análisis ESI-MS. La temperatura del vaporizador fue 325 °C y la tensión se mantuvo a 4,0 kV. El gas de envoltura fue nitrógeno, operado a una presión de 26 psi (6,0 L/min). Los compuestos se ionizaron en el modo positivo.

Descripción de las metodologías de ensayo

Ensayo I: Prueba de extensión de vida útil en gusanos C . elegans

Para esta investigación un ensayo específico con C. elegans ha sido desarrollado. Bajo condiciones normales de temperatura C. elegans tiene una vida útil de aproximadamente 14 días, que incluye todas las etapas larvales. En 3 a 4 días, los gusanos llegan a su estado adulto. El aumento de la temperatura a 37 °C reduce drásticamente la vida útil restante del C. elegans de 10 a 15 h. En consecuencia, en este ensayo, se ha examinado el alargamiento de la vida útil por sustancias de control (ácido ascórbico y betaína) y numerosos otros compuestos fitogénicos (aceite de hierbabuena, aceite de eucalipto), así como algunos de sus constituyentes activos purificados (Piperina, capsaicina, Gingerol, Eugenol). Todas las sustancias probadas se han usado en concentraciones (mg/L) que podrían transferirse más tarde a concentraciones dietéticas (mg/kg) de estas sustancias en dietas completas.

Tabla 5: Ensayo I: Concentración de los compuestos A, B y C y otros ingredientes activos

C. elegans mantenimiento:

C. elegans La cepa de tipo silvestre N₂, variación Bristol se obtuvieron a partir de la C. elegans Genetics Center, CGC (Universidad de Minnesota, MN, EE. UU.). Los nematodos se mantuvieron en placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con E. coli OP50 a 20 °C de acuerdo con los protocolos estándar (Brenner S, 1974, The genetics of Caenorhabditis elegans. También se realizaron métodos tales como la congelación de nematodos y la obtención de poblaciones síncronas usando un método de blanqueo con tratamiento con hipoclorito de adultos en la puesta de huevos de acuerdo con los protocolos estándar (Stiternagle T, 2006; Maintenance of C. elegans. WormBook 1-11).

Tratamiento de nematodos con sustancias de referencia (ácido ascórbico, betaína) y los ingredientes principales del “ nuevo aditivo de alimentación compatible con Bienestar Animal en condiciones de estrés por calor”

Los nematodos síncronos se criaron en cultivo líquido utilizando líquido NGM y se empaquetó E. coli HT115 según Stiernagle. Se añadió Carbenicilina al líquido NGM para inactivar E.coli. Se dispensó un volumen de 56 μl de líquido NGM en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, a la que se añadieron 10 μl de tampón M9 que contenía 10 larvas L1 sincronizadas. Las larvas L1 se mantuvieron agitando a 20 °C y alcanzaron la etapa adulta dentro de los 3 días. Todas las sustancias de control (ácido ascórbico, betaína) y sustancias de prueba (Compuestos “A” y “ B” ) se prepararon como soluciones madre en tampón M9 y se sometieron a sonicación durante 5 min. Las soluciones madre (10 Veces) tenían las siguientes concentraciones (ácido ascórbico 500/1000 mg/L, betaína 5000 mg/L, Compuesto “A” 75 mg/L, Compuesto “ B” 500 mg/L, Compuesto “ C” 6,88 mg/L). Se añadieron 7 μl de cada solución madre de extracto al medio de incubación para alcanzar una concentración final de 100 mg/L (ácido ascórbico), 500 mg/L (betaína), 7,5 mg/L (Compuesto “ A” ), 50 mg/L (Compuesto “ B” ) y 0,6875 mg/L (Compuesto “ C” ). Los nematodos de Control siempre se trataron con volúmenes idénticos de tampón M9 en su lugar.

Determinación de la supervivencia bajo estrés por calor

Después de la incubación de nematodos con N₂ adultos jóvenes durante 48 h a 20 °C en presencia o ausencia de los aditivos de control (ácido ascórbico, betaína) y el nuevo aditivo de alimentación que soporta el Bienestar Animal bajo Condiciones de estrés por calor “A” y “ B”

La supervivencia se determinó usando un ensayo de termotolerancia de microplaca como se describe (Gill MS, Olsen A, Samayo JN, Lightgow GJ, 2003; Free Radic Biol Med 35:558-565). Brevemente, los nematodos se lavaron de los pocillos con tampón M9/Tween® 20 (1 % v/v) en tubos de 15 ml seguido de tres etapas adicionales de lavado. En cada pocillo de una placa de microtitulación negra de bajo volumen de 384 pocillos 6,5 μl de tampón M9/Tween® Se añadió 20 (1 % v/v) de solución. Posteriormente, se dispensó un nematodo en 1 μl de tampón M9 bajo un microscopio estéreo (Microscopio Buckhoven Systems) en cada pocillo y se mezcló con 7,5 μl de SYTOX verde para alcanzar una concentración final de 1 μM. Para evitar la evaporación de agua, las placas se sellaron con película de sellado de Rotilab y se cubrieron con una tapa. Se indujo un choque térmico (37 °C) y se midió la fluorescencia con un lector de placas de microtitulación Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Bonn, Alemania) cada 30 min. Para detectar la fluorescencia verde SYTOX, la longitud de onda de excitación se fijó en 485 nm y la emisión se midió en 538 nm.

Para determinar el tiempo de supervivencia para cada nematodos, se generó una curva de fluorescencia individual. El tiempo de muerte se definió como una hora después de que se observó un aumento de la fluorescencia sobre el nivel de referencia y se verificó por una provocación táctil en primer lugar. A partir de los tiempos individuales de muerte se extrajeron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.

Resultados: Pruebas de extensión de la vida útil en gusanos C . elegans (Ensayo I)

Para investigar los efectos protectores de estrés por calor de ambas sustancias de referencia (ácido ascórbico, betaína) y de compuestos fitogénicos, incluido el compuesto “A” , “ B” y “ C” del “ nuevo aditivo de alimentación que soporta Bienestar Animal en Condiciones de estrés por calor” , la extensión de vida útil en C. elegans se probó en condiciones de estrés por calor (Figura 1). Las concentraciones probadas de las sustancias de referencia y de las sustancias fitogénicas se eligieron para reflejar las concentraciones dietéticas finales en las dietas de los animales (por ejemplo, la sustancia de referencia betaína se usa en las dietas de los animales en concentraciones de 250 a 1000 mg/kg de dieta; en el C. elegans el modelo betaína se ensayó a un nivel de 500 mg/L = 500 mg/kg = 500 mg/kg). Ambas sustancias de referencia (ácido ascórbico y betaína) aumentaron la vida durante 0,5 a 1,5 horas. Los compuestos “A” (Figura 1D), “ B” (Figura 1C) y “ C” (Figura 1E) a las concentraciones probadas aumentaron la vida en 0,5 a 1,5 h.

Curiosamente, los ejemplos comparativos que utilizan sustancias picantes y aceites esenciales refrescantes, recomendados con frecuencia contra las consecuencias negativas del estrés por calor y parcialmente utilizados en productos de aditivos para piensos comúnmente disponibles, no mostraron beneficios en la extensión de la vida útil (Figura 2 F, G, H, I, J, K).

Ensayo II: Ensayo in vitro de inducción de proteínas de choque térmico en células CaCo2

Para esta investigación, se ha desarrollado un ensayo específico con células monocapa CaCo2. Las células CaCo2 se incuban regularmente a 37 °C. El aumento de la temperatura a 41 °C provoca una respuesta de choque térmico en estas células (inducción de proteínas de choque térmico) para contrarrestar el daño celular e iniciar los mecanismos de reparación. En consecuencia, en este ensayo, el potencial de betaína (sustancia de referencia) y de los compuestos “A” y “ B” se ha estudiado de una manera dependiente de la dosis para soportar y aumentar la respuesta de choque térmico natural.

Estudio con células CaCo2

Materiales

MEM con sales de Earle, suero fetal bovino (FBS), penicilina/estreptomicina y tripsina-EDTA se adquirieron de Biochrom GmbH (Berlín, Alemania). El medio de diferenciación del epitelio intestinal Entero-STIM y el extensor de suero MITO+ se obtuvieron de Corning (Wiesbaden, Alemania) y las placas de cultivo celular se adquirieron de Greiner Bio-One International GmbH (Kremsmünster, Austria). RNeasy Mini Kit se obtuvo de Quiagen (Hilden, Alemania), i Script cDNA Synthese Kit e iQ SYBR Green Supermixture de Bio-Rad (Munich, Alemania) y oligo dT-primers de Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemania).

Cultivo celular y diferenciación de células CaCo2

Células CaCo2 humanas (DSMZ, Braunschweig, Alemania) se mantuvieron en MEM con sales de Earle suplementadas con FBS al 10 % y 100 U/mL de penicilina/100 μg/mL de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada (> 95 %) con 5 % CO₂. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a 1,2 x 106 células por pocilio para alcanzar la confluencia al día siguiente. Las células se mantuvieron además en Medio de Diferenciación de Epitelio Intestinal Entero-STIM suplementado con 100 U/mL de penicilina/100 μg/mL de estreptomicina y 0,1 % de extensor de suero MITO+ y el medio se cambió diariamente. El experimento se llevó a cabo en el día 5 cuando las células estaban completamente diferenciadas.

Inducción de estrés por calor

Para analizar la influencia de la betaína (sustancia de referencia) y los compuestos “A” B “y” C “ en la expresión de la proteína de choque térmico HSP70, las sustancias se añadieron a las células el día 4 y las células se incubaron con el extracto durante 15 horas. Las sustancias de prueba se disolvieron en medio de diferenciación completa y se diluyeron a las siguientes concentraciones finales: Betaína (250/500/1000/1500 mg/L); Compuesto “A” , (7,5, 15, 30 y 60 mg 1,8-cineol/L); Compuesto “ B” , (6, 12, 18, 24, 30 y 60 mg Naringina/L); Compuesto “ C” , (0,55, 1,10, 2,20 mg Betalaina/L), respectivamente. Para inducir estrés por calor, las muestras se incubaron a 41 °C durante 1 hora, mientras que las muestras de control se incubaron a 37 °C durante el mismo tiempo.

Detección de la expresión de ARNm de HSP70 mediante PCR en tiempo real

La expresión de ARNm de HSP70 se midió cuantitativamente mediante PCR en tiempo Real (C1000 Thermal Cycler and CFX96 Real-Time System, Bio-Rad, Munich, Alemania). El ARN total se aisló con mini Kit RNeasy, seguido de la transcripción de 50 ng de ARN total en ADNc con el Kit de síntesis de ADNc de Secuencia i (volumen final: 20 μL) y la PCR en tiempo real con la supermezcla iQ SYBR Green según las instrucciones del fabricante. Brevemente, para la PCR en tiempo real se añadieron 2 μL de ADNc a 18 μL de mezcla maestra (10 μL de supermezcla verde iQ SYBR (2x), 2 μL de cebador [3 pmol/μL], 6 μL de agua libre de nucleasas). La desnaturalización del ADN y la activación por polimerasa durante 3 minutos a 95 °C fueron seguidas por 40 ciclos de PCR. Un ciclo de amplificación se divide en tres partes: desnaturalización a 95 °C por 15 segundos, hibridación y extensión a 60 °C durante 60 segundos seguido de una placa leída después de cada ciclo. Finalmente, se realizó un análisis de curva de fusión aumentando gradualmente la temperatura a 95 °C, para excluir la formación de dímeros de cebadores. Los valores de ^ct detectados se usaron para el cálculo de los niveles de expresión relativa de ARNm a través del método 2'ññcT (ZITAT LIVAK). Las diferencias en las cantidades de ADNc se normalizaron a la expresión del ARNm de p-actina. El análisis estadístico se llevó a cabo en Graphpad Prism (versión 6.02) usando prueba t no apareada. Para la amplificación se utilizaron los siguientes cebadores: p-actina directa: 5'-GCG GGA A^a T CGT GCG TGA CAT T-3' (S^eQ ID NO:1); inverso de pactina 5'-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3'(SEQ ID NO:2); HSP70 directo: 5'-CTA GCC TGA GGA GCT GCT GCG ACA G-3' (SEQ ID NO:3); Inverso:HSP70 5'-GTT CCC TGC TCT CTG TCG GCT CGG CT-3' (SEQ ID NO:4).

Resultados de la prueba in vitro de la inducción de proteínas de choque térmico en células CaCo2 (Ensayo II)

Para investigar los beneficios de los compuestos “A” , “ B” y “ C” en la inducción adicional de la respuesta al choque térmico diferenciadas, las células CaCo2 se expusieron a niveles crecientes de compuestos “A” , “ B” y “ C” , que representan el intervalo de dosis mencionado anteriormente aplicado en dietas animales (Figura 3 B, C, D). Como sustancia de referencia, el aditivo de alimentación de estrés por calor que se usa con frecuencia betaína se probó en consecuencia (Figura 3A). La betaína no mostró ninguna respuesta a la dosis clara sobre la inducción de la proteína de choque térmico 70 adicional sobre el control. Mientras que 100, 250 y 1000 mg/L de betaína incluso disminuyeron la inducción de la proteína de choque térmico 70 en comparación con las células de control no tratadas (-7 a -19 %), 500 y 2000 mg/L dieron como resultado un aumento no significativo en la respuesta de la proteína de choque térmico 70 (+ 10 A 12 %) (Figura 3 A). Por el contrario, los tres compuestos del “ nuevo aditivo de alimentación respaldando el Bienestar Animal bajo condiciones de estrés por calor” dio como resultado beneficios claros sobre el control e indicaron una respuesta de dosis o superación de concentraciones óptimas (Figura 3 B, C, D). Para el compuesto “ B” ya la concentración de Naringina más baja probada, dio como resultado un aumento claro pero no significativo de la inducción de HSP 70 en comparación con las células de control no tratadas (+ 16 %). Se pudo observar un aumento significativo en la inducción de HSP 70 casi al mismo nivel para concentraciones de Naringina entre 12 y 30 mg/L del compuesto “ B” (+ 24 a 27 %). Por el contrario, 60 mg de Naringina/L condujeron a un efecto adverso (-23 %), lo que indica que excede el intervalo de dosis óptimo. De manera similar ya 7,5 mg de 1,8-cineol/L del compuesto “A” dio como resultado un aumento del 15 % en la inducción de HSP 70 en comparación con las células de control. 15 y 30 mg de 1,8-Cineol/L del compuesto “A” aumentó la expresión del gen ^h S^p 70 en 22 y 24 %, respectivamente. La dosis más alta probada (45 mg de 1,8-Cineol/L) aumentó la expresión de HSP 70 incluso en un 44 %. Sin embargo, debido a las razones de precio de las materias primas, esta concentración no puede considerarse en una formulación de producto para un “ nuevo aditivo de alimentación compatible con Bienestar Animal en condiciones de estrés por calor” . La concentración más alta probada estaba en el intervalo, informado de Türk y col. (2016). Para probar si hay efectos adicionales de los compuestos individuales, como ejemplo de inducción de HSP 70 por el compuesto “A” y “ C” solo, así como de la combinación de ambas sustancias se dan en la Figura 3 E. En los niveles probados de sustancia “A” y “ C” solo con 20,8 % y 21,1 % de un aumento casi significativo o significativo de la expresión de HSP 70 podría lograrse, que estaba a un nivel comparable, como se indica en la Figura 3 C y D. La combinación de ambas sustancias casi duplicaba la inducción de HSP 70 al 40,2 % y mostró claramente el efecto mejorado de ambas sustancias (Figura 3 E).

Ensayo III: Ensayo in vitro de la función de barrera intestinal mediante resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en células CaCo2 transwell

Para probar si los compuestos “A” , “ B” y “ C” ayudan a mantener la integridad de la barrera intestinal en condiciones de estrés por calor, se han realizado experimentos con capas de células T ranswell CaCo2. En una campana de cultivo celular de nivel 2 de bioseguridad estéril, se colocaron insertos de PET transwell de 0,8 mm de poro en una placa de 24 pocillos (4 pocillos por condición). Todos los materiales que entran se esterilizaron con etanol antes.

El medio de cultivo celular que contenía medio DMEM complementado con 4,5 g/L de glucosa, 15 % de suero bovino fetal y 1 % Pen Strep, se preparó y se calentó a 37 °C en un baño de agua.

200-400 |jl de la solución celular de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2) en medio celular se colocaron la cámara superior (apical) del inserto de transwell, a una densidad de 1,5 x 105 células/cm2. La cámara inferior (basolateral) se llenó con 700-900 j l de medio celular.

Las células se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO₂ y 95 % de humedad durante 16 días, y el medio en la cámara superior e inferior se reemplazó cada 4 días. Después de esta incubación, las células se incubaron durante 24 horas adicionales con medio de cultivo tisular, que contenían los compuestos “A” , “ B” o “ C” se añadieron a niveles comparables al ensayo II. Después de este tiempo de incubación, se midió el TEER basal de acuerdo con Ghafania y Muro 2013. Posteriormente, la temperatura se incrementó a condiciones de estrés por calor (42 °C) y se continuó la medición de TEER durante hasta 6 h. A partir de la comparación de los valores de TEER de las células de control no tratadas, portadas a lo largo de cada experimento se compararon con las de células tratadas con los compuestos “A” , “ B” o “ C” en los efectos protectores de los compuestos sobre la función de la barrera intestinal.

Resultados de la prueba in vitro de la función de barrera intestinal por resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en células CaCo2 transwell (Ensayo III)

Dado que la betalaína pudo mostrarse por primera vez para mejorar la inducción de HSP 70 en monocapas de células CaCo2 (Figura 3 D), se han examinado sus efectos protectores sobre la integridad de la barrera intestinal. Se pudo demostrar que el pretratamiento con betalaína de células CaCo2 cultivadas en placas de cultivo transwell condujo a una disminución significativamente menor de TEER bajo condiciones de estrés por calor en comparación con las células de control no tratadas (Figura 4). A partir de este hecho, se pudo concluir por primera vez, que la betalaína desenrolle los efectos protectores sobre la integridad de la barrera intestinal.

ENSAYO IV: Validación in vivo de efectos beneficiosos de la naringina (Compuesto “ B” ) en el rendimiento del crecimiento en aves de engorde bajo estrés por calor y evaluación del nivel de dosis óptimo

No se ha informado que los efectos beneficiosos del compuesto “ B” mejoren el bienestar animal (rendimiento mejorado, respuesta al choque térmico e integridad de barrera intestinal) in vivo. Dado que el compuesto “ B” mostró una respuesta beneficiosa en todas las pruebas in vitro, el primer ensayo in vivo se dirigió en consecuencia a investigar los efectos beneficiosos de este compuesto sobre el rendimiento y la respuesta al choque térmico en pollos de engorde bajo estrés por calor. La betaína, utilizada con frecuencia como aditivo, que mejora el rendimiento de los animales bajo estrés por calor, se llevó a cabo en este ensayo como grupo de control positivo.

Diseño del ensayo

En el experimento se utilizaron 1152 pollos de engorde machos Ross 308 de un día de edad de un total de 1400. Se excluyó del proceso de selección cualquier pollo de engorde de un día que mostrara signos de problemas de salud, lesiones o que fuera demasiado pequeño o estuviera en malas condiciones. Los pollos de engorde fueron sexados en la incubadora. Todos los pollitos de un día fueron pesados individualmente y agrupados según el peso. Luego, las aves se asignaron a los 36 corrales (6 repeticiones de 6 tratamientos), y cada corral constaba inicialmente de 34 pollos de engorde. En el día 4 del experimento en cada corral, se retiraron los 2 pollos de engorde más débiles y todos los corrales se equipararon a 32 aves por corral mediante selección negativa. Las aves del grupo de control negativo se alimentaron con la dieta basal sin ningún aditivo fitogénico adicional. El grupo de referencia se alimentó con una dieta que proporcionaba 500 mg/kg de betaína en el alimento a partir de una fuente de betaína natural (Actibeet®, Agrana). A las dietas de los grupos 3, 4, 5 y 6 se agregaron las premezclas fitogénicas con el compuesto “ B” para lograr concentraciones dietéticas finales de Naringina de 12/18/24/30 mg/kg de alimento.

Tabla 5: Ensayo IV: Grupos de tratamiento Experimental

Manejo y alojamiento de animales

El ensayo se llevó a cabo en las instalaciones de investigación de Delacon (Stosíkovice na Louce, República Checa). Las aves se mantuvieron en corrales de piso, cada uno con un área de 2,1 m2 (1,65 x 1,275 m; 2,03 m2 de superficie útil = sin contar el espacio ocupado con el comedero), con viruta de madera fresca como material de cama. La densidad de población al final de la prueba fue de 14,78 pollitos/m2 (38,7 kg/m2). El edificio se suministró con luces artificiales, programables, calentamiento central automatizado y ventilación forzada. La temperatura se fijó de acuerdo con las recomendaciones de los criadores desde el día 1 hasta el día 21 de edad. El inicio del estrés por calor fue el día 22 de edad. De este modo se aplicó un régimen cíclico de estrés por calor. El período de estrés por calor fue de 09:00 por la mañana hasta 17:00 por la tarde. La temperatura promedio de la casa en este período fue de 34 °C. El “ período de enfriamiento nocturno” fue de 19:00 por la noche hasta 07:00 por la mañana. La temperatura ambiente promedio en este período fue de 26 °C. Los intervalos de tiempo de las 07:00 a las 09:00 por la mañana y de las 17:00 a las 19:00 por la noche se usaron para aumentar o disminuir gradualmente la temperatura a 34 °C y 26 °C, respectivamente. Para aumentar la humedad del gallinero bajo el régimen de estrés por calor, se humedecieron toallas en los paneles térmicos 5 veces por hora durante el período de estrés por calor. La humedad relativa se mantuvo aproximadamente al 70-80 %.

Dietas experimentales

Las aves se alimentaron con una dieta basal, basada en harina de trigo, maíz y soja. Para cada período de alimentación (inicio/crecimiento, crecimiento/finalización) se calculó que el alimento era isonutritivo (Tabla 6). Las concentraciones de nutrientes dietéticos se calcularon para cumplir las recomendaciones actuales de las aves de engorde de acuerdo con las recomendaciones de los criadores. De acuerdo con la alimentación de 2 fases aplicada, se ofreció una dieta de inicio/crecimiento desde los días 1 a 21 y una dieta de crecimiento/finalización de los días 22 a 42. La composición de las dietas, usada en los ensayos IV, V, VI, para las fases individuales y los contenidos de nutrientes calculados se dan en la Tabla. Todas las dietas se ofrecieron a las aves como alimento granulado.

Tabla 6: Ensayos IV, V, VI: Composición y análisis calculados de las dietas experimentales

Las premezclas se prepararon en la instalación Delacon Biotechnik GmbH en Steyregg (Austria). Se prepararon para proporcionar las concentraciones dietéticas finales previstas a un nivel de inclusión de 0,1 % (1,0 mg/kg). La concentración de sustancias activas en las premezclas se realizó inmediatamente después de la preparación de las premezclas.

La producción de las dietas granuladas completas con la adición de las premezclas a las dietas estuvo a cargo de la fábrica de piensos Biosta s.r.o. Blucina (República Checa).

Las muestras se tomaron directamente después de la fabricación. Se almacenará 1 kg de alimentación de cada tratamiento y período en la instalación de prueba en condiciones de enfriamiento y secado hasta la aprobación del informe final.

Las dietas se analizaron para determinar el contenido de nutrientes en Zemédélská oblastni laborator, Chotysany. Las dietas se analizaron para determinar la materia seca, la proteína cruda, la grasa cruda, la ceniza, el azúcar, el almidón, el Ca y el P. Además, los ingredientes activos se analizaron en las dietas.

Muestreo de tejidos

El día 21 y 42 del experimento 2 pollos de cada repetición se sacrificaron para recoger el hígado y el yeyuno para medir la expresión génica.

Análisis estadístico de los datos

Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete de software SAS. Después de comprobar la homogeneidad de los datos, se compararon los medios mediante los procedimientos de ensayo habituales (prueba de Tukey). La significación estadística se declaró a P < 0,05, con 0,05 < P < 0,10 considerado como una tendencia casi significativa.

Resultados de la validación in vivo de los efectos beneficiosos de la Naringina (Compuesto “ B” ) en el rendimiento del crecimiento en pollos de engorde bajo estrés por calor y evaluación del nivel de dosis óptimo (Ensayo IV)

La Tabla 7 muestra las concentraciones analizadas de naringina en las dietas del ensayo IV. En la recuperación de las dietas de la sustancia activa, la liberación fue casi del 100 %, por lo tanto, los contenidos especificados aparecen también en las dietas finales. También podría analizarse una tasa de recuperación similar a la de la sustancia de referencia betaína.

Tabla 7: Ensayo de IV- betaína y el contenido de Naringina de las dietas de prueba

Dado que los efectos positivos del compuesto “ B” (Naringina) sobre los aspectos de bienestar animal en condiciones de estrés por calor (por ejemplo, protección de la función de barrera intestinal, unidos a un aumento en el rendimiento) no se han informado aún, el objetivo del ensayo fue evaluar los efectos dependientes de la dosis del compuesto “ B” frente a una dosis estándar (500 mg/kg) de la sustancia de referencia betaína. Ya en el período de estrés previo al calor (d 0 a 21), tanto la sustancia de referencia (+ 4,9 %) como todas las dosis (12, 18, 24 y 30 mg/kg de dieta) del compuesto “ B” (+ 2,79 a 13 %) dieron como resultado efectos beneficiosos sobre el peso corporal y el aumento de peso corporal diario. En comparación con el control negativo, este efecto fue incluso significativo (+ 13 %) para la dosis más baja del compuesto “ B” probado (12 mg/kg) (Figuras 5 y 6). El efecto positivo de la sustancia de referencia y del compuesto “ B” en el desarrollo del peso corporal y la ganancia diaria continuó también en condiciones de estrés por calor (d22 a 42) (Figuras 5 y 6). Sin embargo, bajo estrés por calor, los efectos de la sustancia de referencia betaína en el desarrollo de peso corporal fueron de 2 a 5 % más altos en comparación con los del compuesto “ B” (Figuras 5 y 6). A diferencia del período de estrés por calor previo, se pudo observar una respuesta a la dosis clara del compuesto “ B” bajo estrés por calor (Figuras 5 y 6). Debido al hecho de que los aditivos contra los efectos negativos del estrés por calor se alimentan durante todo el último período, el fuerte efecto de preacondicionamiento de la dosis más baja del compuesto “ B” se mantuvo hasta el final de la prueba. En el día 42, las aves de los grupos tratados con la sustancia de referencia (+ 170 g) y con el compuesto “ B” (+ 80 a 140 g) tenían pesos corporales claramente más altos en comparación con las aves del control no tratado (Figuras 5 y 6). El mayor peso corporal final en comparación (+ 140 g) al control negativo podría obtenerse con la dosis más baja del compuesto “ B” . También se podrían observar resultados análogos para el desarrollo de peso corporal para la relación de conversión de alimentación (Figura 7).

Ensayo V: Validación in vivo de efectos beneficiosos de combinaciones de naringina (Compuesto “ B” ) con diferentes concentraciones de 1,8-cineol (Compuesto “A” ) en el rendimiento del crecimiento, respuesta de la proteína de choque térmico e integridad de la barrera intestinal en pollos de engorde bajo estrés por calor

En el ensayo de respuesta a la dosis para el compuesto “ B” (Ensayo IV), podrían observarse efectos beneficiosos sobre el rendimiento de las aves de engorde bajo estrés por calor. Resulta que la dosis más baja de 12 mg/kg de Naringina completa dio como resultado valores de rendimiento (peso/ganancia de peso/FCR del cuerpo) que eran ligeramente mejores que en el grupo de referencia de betaína. Las concentraciones más altas del compuesto “ B” no dieron como resultado beneficios adicionales para el rendimiento del crecimiento. En el ensayo de respuesta a la dosis para el compuesto “ B” se pudieron observar efectos beneficiosos sobre el rendimiento de las aves de engorde bajo estrés por calor. En consecuencia, en este ensayo se evaluó el valor adicional de añadir 1,8-cineol (compuesto “A” ) de una manera dependiente de la dosis (6/12/24 mg/kg de alimentación) al compuesto “ B” a constantemente 12 mg de una dieta de Naringina/kg. La adición de 500 mg/kg de betaína sola o 500 mg de betaína 12 mg de 1,8-cineol/kg sirvió como grupos de referencia.

En el experimento se utilizaron 1224 pollos de engorde machos Ross 308 de un día de edad de un total de 1400. Se excluyó del proceso de selección cualquier pollo de engorde de un día que mostrara signos de problemas de salud, lesiones o que fuera demasiado pequeño o estuviera en malas condiciones. Los pollos de engorde fueron sexados en la incubadora. Todos los pollitos de un día fueron pesados individualmente y agrupados según el peso. Luego, las aves se asignaron a los 36 corrales (6 repeticiones de 6 tratamientos), y cada corral constaba inicialmente de 34 pollos de engorde. En el día 4 del experimento en cada corral, se retiraron los 2 pollos de engorde más débiles y todos los corrales se equipararon a 32 aves por corral mediante selección negativa.

Las aves del grupo de control negativo se alimentaron con la dieta basal sin ningún aditivo fitogénico adicional. Los grupos de referencia 2 y 6 recibieron una dieta que proporcionaba 500 mg/kg de betaína de una fuente de betaína natural (Actibeet®, Agrana) o 500 mg/kg de betaína de una fuente de betaína natural (Actibeet®, Agrana) 12 mg/kg 1,8 cineol (compuesto “A” ). A las dietas de los grupos 3, 4 y 5 se añadieron las premezclas fitogénicas proporcionando 12 mg/kg de Naringina más 6, 12 o 24 mg de 1,8-cineol/kg (Tabla 8).

Tabla 8: Ensayo V: Grupos de tratamiento Experimental del ensayo de validación

La metodología del ensayo V, que incluye alojamiento y manejo de los animales, preparación y composición de las dietas experimentales, así como el muestreo de órganos y los procedimientos estadísticos, fueron análogos al ensayo IV.

Resultados de la validación in vivo de los efectos beneficiosos de las combinaciones de Naringina (compuesto ” B “ ) con diferentes concentraciones de 1,8-cineol (compuesto “A” ) en el rendimiento del crecimiento, respuesta de la proteína de choque térmico e integridad de la barrera intestinal en pollos de engorde bajo estrés por calor (Ensayo V)

La Tabla 9 muestra las concentraciones analizadas de Betaína, Naringina y 1,8 cineol en las dietas del ensayo V. Los valores analizados muestran que se alcanzaron o excedieron las especificaciones mínimas para todos los grupos experimentales.

Tabla 9: Ensayo V: Contenido calculado de Betaína, Naringina y 1,8-cineol de las dietas de prueba

Dado que el compuesto “ B” en el primer ensayo in vivo mostró efectos beneficiosos sobre los parámetros de rendimiento de las aves de engorde bajo estrés por calor, que fueron ligeramente mejores en comparación con la sustancia de referencia betaína, el objetivo de este ensayo fue probar un efecto sinérgico/beneficioso de las combinaciones de una dosis fija del compuesto “ B” (12 mg/kg) más dosis crecientes de compuesto “A” (6 a 24 mg/kg). La intención de este estudio consiste en explorar combinaciones de compuesto “A” y “ B” para el nuevo aditivo de alimentación que soporta Bienestar Animal bajo Condiciones de estrés por calor que superan los efectos de la sustancia de referencia betaína. Además, una combinación de betaína con la dosis intermedia del compuesto “A” (12 mg/kg) se eligió como una segunda referencia para probar, si existen efectos sinérgicos de la betaína y el compuesto “A” . De manera similar, como en el ensayo 1, todos los aditivos (betaína y combinaciones de compuestos “A” y “ B” ) ya desarrollaron efectos promotores del crecimiento en el período de estrés previo al calor (Figuras 8 y 9).

Mientras que la betaína sola aumentó la ganancia de peso diaria en un 2,5 % en comparación con el control negativo, la adición de 12 mg/kg del compuesto “A” redujo este efecto a casi el 1 %. En contraste, todas las combinaciones de compuesto “ B” más compuesto “A” excedieron el efecto promotor del crecimiento de betaína sola y con mayor cantidad de la combinación de betaína más sustancia A (Figuras 8 y 9). Además, se pudo observar un efecto de respuesta a la dosis claro para las combinaciones “AB” (+ 2,1 %; 2,5; 4,7 %) (Figuras 8 y 9). Como se observa en el primer ensayo, la sustancia de referencia betaína desarrolló un mejor efecto promotor del crecimiento en condiciones de estrés por calor (+ 2,0 %) en comparación con el control negativo. Bajo condiciones de estrés por calor, todas las combinaciones “AB” excedieron el crecimiento que realiza efectos de betaína sola claramente. El efecto de respuesta a la dosis, que se encuentra en el período de estrés por calor previo, no pudo observarse bajo estrés por calor para las combinaciones probadas “AB” . Todas las combinaciones probadas “AB” aumentaron el rendimiento de crecimiento en 5,2 a 5,6 % en comparación con el control negativo y en 3,0 % a 3,5 % en comparación con la sustancia de referencia betaína (Figuras 8 y 9), respectivamente. Lo más interesante es que la combinación de la sustancia de referencia betaína con la dosis media del compuesto “A” , que falló en el período previo al estrés por calor, desplegó en el período de estrés por calor efectos de promoción del crecimiento incluso ligeramente mejores en comparación con las combinaciones “AB” . Sin embargo, dado que los aditivos alimentarios que contrarrestan el estrés por calor se utilizan durante todo el último período, las combinaciones “AB” en general dieron como resultado la mayor mejora del peso corporal final en comparación con el control negativo (+4,8 %, 5,2 %, 4,9 %). con la sustancia de referencia betaína (+1,6 %, 2,0 %, 1,8 %) y también en comparación con la combinación de betaína más la concentración media del compuesto “A” (+0,2 %, 0,7 %, 0,4 %). También se podrían encontrar efectos muy similares, como se observa para el rendimiento del crecimiento para FCR (tasa de conversión de alimentos) (Figura 10).

Ensayo VI: Validación In vivo de efectos beneficiosos de las combinaciones de prototipos finales de 1,8-cineol con naringina (AB), o 1,8-cineol con Betalaina (AC).

En el ensayo de validación in vivo de los efectos beneficiosos de las combinaciones de Naringina (compuesto “ B” ) con diferentes concentraciones de 1,8-cineol (compuesto “A” ) resultó que todas las combinaciones probadas de “AB” fueron mucho más efectivas que el control positivo de betaína sola, e incluso como la combinación de betaína compuesto “A” . Por lo tanto, en consecuencia, el objetivo del último ensayo in vivo de la serie fue probar, si además de la combinación “AB” , así como la combinación “AC” se desarrolla una mayor protección y rendimiento de crecimiento en condiciones de estrés por calor que 500 mg/ kg de betaína como control positivo.

En el experimento se usaron las 308 aves de engorde macho de un día de edad de un total de 960. Se excluyó del proceso de selección cualquier pollo de engorde de un día que mostrara signos de problemas de salud, lesiones o que fuera demasiado pequeño o estuviera en malas condiciones. Los pollos de engorde fueron sexados en la incubadora. Todos los pollitos de un día fueron pesados individualmente y agrupados según el peso. Luego, las aves se asignaron a los 36 corrales (6 repeticiones de 6 tratamientos), y cada corral constaba inicialmente de 34 pollos de engorde. En el día 4 del experimento en cada corral, se retiraron los 2 pollos de engorde más débiles y todos los corrales se equipararon a 32 aves por corral mediante selección negativa.

Las aves del grupo de control negativo se alimentaron con la dieta basal sin ningún aditivo fitogénico adicional. El grupo de referencia 2 se alimentó con una dieta que proporcionó 500 mg/kg de betaína a partir de una fuente de betaína natural (Actibeet®, Agrana). A las dietas de los grupos 3 y 4 se agregaron las premezclas fitogénicas que aportaban 12 mg de naringina/kg de flavonoides cítricos o 0,55 mg de betalaína/kg de remolacha y berbería, cada una en combinación con 12 mg de 1,8-cineol/kg.de la mezcla de aceite de lamináceas (Tabla 10).

Tabla 10: Ensayo VI: Grupos de tratamiento Experimental

La metodología del ensayo VI, que incluye alojamiento y manejo de los animales, preparación y composición de las dietas experimentales, así como el muestreo de órganos y los procedimientos estadísticos, fueron análogos al ensayo IV.

Resultados de la validación in vivo de los efectos beneficiosos de la combinación del 1,8-cineol con Naringina (AB), o 1,8-cineol con Betalaina (AC) en el rendimiento del crecimiento, respuesta de la proteína de choque térmico e integridad de la barrera intestinal en pollos de engorde bajo estrés por calor en comparación con betaína como control positivo (Ensayo VI)

En la Tabla 11 se muestran los valores analizados de las concentraciones de Betaína, 1,8-Cineol, Naringina y Betalaina en el ensayo VI.

Tabla 11: Ensayo VI - Contenido de Betaína, 1,8-Cineol, Naringina y Betalaína de las dietas de prueba

Debido a los hallazgos positivos sobre los efectos adicionales de las sustancias “ B” y “ C” sobre la respuesta de choque térmico en las células CaCo2 (Figura 3E) en el último ensayo de esta serie, se ha evaluado, si bajo condiciones de estrés por calor no solo combinaciones de sustancias “AB” , sino también combinaciones de sustancias “AC” muestran efectos beneficiosos sobre el rendimiento del crecimiento de pollos de engorde estresados por calor. En la fase de estrés previo al calor, el control positivo (betaína) y ambas combinaciones “AB” y “AC” ya mejoraron el peso corporal de 3,60 a 4,65 % en comparación con el control negativo no tratado (Figura 11). “AC” resultó como la combinación más eficaz, mientras que en este ensayo “AB” fue ligeramente menos eficaz que la betaína (Figura 11). Sin embargo, durante el período de estrés por calor, ambas combinaciones “AB” y “AC” desarrollan su alto potencial para mejorar el rendimiento de las aves de engorde. Ambos aditivos mejoraron el peso corporal final en aproximadamente un 1 %, en comparación con el control positivo, correspondiente a un peso corporal final de 50 g más alto. El aumento de peso diario durante la fase de estrés por calor podría ser incluso mejorado en aproximadamente 1,5 % por ambas combinaciones de “AB” y “AC” en comparación con el control positivo de betaína (Figura 12). La mejora en el peso corporal final y la ganancia diaria también se reflejó por FCR (Figura 13), que mejoró en mayor medida mediante ambas combinaciones de “AB” y “AC” en comparación con el control positivo (betaína).

Referencias:

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un aditivo para alimentos para ganado que comprende al menos 1,5 % de 1,8 cineol (p/p) y al menos uno de naringina o betalaína.

2. El aditivo para alimentos de la reivindicación 1, que comprende hasta 6 % de 1,8 cineol (p/p).

3. El aditivo para alimentos de la reivindicación 1 o 2, que comprende al menos 3 % de naringina (p/p), preferiblemente hasta 6 % (p/p), y/o al menos 0,1 % de betalaína (p/p), preferiblemente hasta 3 % (p/p).

4. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende

a) 1,8 cineol y naringina en una relación de al menos 0,2:1 (p/p); y/o

b) 1,8 cineol y betalaína en una relación de al menos 4:1 (p/p).

5. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho 1,8 cineol está comprendido en un aceite esencial, preferiblemente de plantas lamiaceae, preferiblemente del género rosemarinus.

6. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha naringina está comprendida en material vegetal de cítricos, preferiblemente de naranja o pomelo.

7. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha betalaína está comprendida en material vegetal de plantas del orden Caryophyllales, preferiblemente de la familia Amaranthaceae, preferiblemente de beta vulgaris.

8. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una mezcla fluida de compuestos fitogénicos, que comprende preferiblemente uno o más de aceites esenciales, hierbas secas, especias, carbohidratos, agentes de carga o antitorta, u otros excipientes.

9. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además al menos un aceite esencial que comprende carvacrol y/o timol.

10. El aditivo para alimentos de la reivindicación 9, que comprende al menos 0,05 % de carvacrol (p/p) y/o al menos 0,05 % de timol (p/p).

11. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es una preparación seca granulado, estable al almacenamiento, con una estabilidad de al menos 18 meses a temperatura ambiente.

12. El aditivo para alimentos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se proporciona en una preparación para su uso en la preparación de un producto para alimentos para aves de corral, cerdos o rumiantes.

13. Un producto para alimentación que comprende la composición de aditivo para alimento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el producto para alimentación comprende

a) 1,8 cineol a una concentración de al menos 5 mg/kg; y

b) naringina a una concentración de al menos 10 mg/kg y/o betalaína a una concentración de al menos 0,3 mg/kg.