ES2870674T3 - Aditivo para pienso de aves de corral - Google Patents

Abstract

Uso de una composición de aditivo de pienso de aves de corral que es una mezcla fluida de compuestos fitogénicos que comprenden al menos a. un componente de aceite que es aceite esencial de tomillo microencapsulado, y b. un componente de saponina que es corteza de Quillaja en polvo seca en partículas que contiene saponina, conteniendo dicha mezcla al menos 0,5 % de componente saponina (p/p) y el componente de aceite en una relación eficaz de al menos 0,2:1 (p/p, componente de aceite por componente de saponina), para mejorar la eficiencia de conversión del pienso en producción de aves de corral sin antibióticos.

Description

DESCRIPCIÓN

Aditivo para pienso de aves de corral

La invención se refiere al uso de una composición de aditivo para pienso de aves de corral a base de una mezcla fluida de compuestos fitogénicos, que comprende en particular una relación eficaz de aceites esenciales y saponinas.

Antecedentes

Los aditivos zootécnicos se utilizan comúnmente mejorar el valor nutricional de una dieta de animales. Esta categoría incluye, entre otros, enzimas y ciertos fitogénicos. Los aditivos para piensos fitogénicos (derivados de plantas, naturales, botánicos) son composiciones bien mezcladas de materias primas a base de plantas especiales y vehículos derivados de plantas y/o a base de minerales. Para este fin, se pueden utilizar aceites esenciales y/o vegetales, así como una inmensa gama de hierbas y especias altamente activas con propiedades especiales aromáticas y apetitosas. Dado su alto potencial para resolver problemas, una nueva generación de aditivos ha tomado una fuerte posición en la industria de la nutrición de animales, especialmente desde la prohibición de los antibióticos como promotores del crecimiento en la UE. Se pueden utilizar productos fitogénicos como aditivos zootécnicos, desarrollados para mejorar el rendimiento de animales, p.ej., para mejorar la salud de aves de corral y/o la producción de aves de corral rentable, especialmente, para la producción de engorde y huevos. Los productos fitogénicos se consideran una alternativa natural a los productos sintéticos que los consumidores desean evitar, incluyendo los fabricantes de piensos, fabricantes de premezclas y productores animales.

Las saponinas son glucósidos anfipáticos agrupados fenomenológicamente según la formación de espuma de tipo jabón que producen cuando se agitan en soluciones acuosas y, estructuralmente, por su composición de una o más fracciones de glucósido hidrófilas combinadas con un derivado esteroide o triterpeno lipófilo. Se ha notificado que los aditivos para piensos que incluyen saponinas tienen menores emisiones de amoníaco, lo cual puede explicarse por la unión directa de amoníaco a saponinas y/o la inhibición de la enzima bacteriana ureasa (Nazeer et al. (Int. J. Poult. Sci.

2002; 1:174-178). Se han descrito también saponinas extraídas de material vegetal en combinación con material de arcilla para reducir las emisiones de gas del ganado (documento WO2012113838A1).

El documento EP1129627A1 describe un aditivo para pienso natural que comprende un componente que contiene oligosacárido, un componente saponina obtenido de un material vegetal derivado de una o más plantas seleccionadas entre los géneros Yucca, Quillaja y otros, o un material sintético que comprende las correspondientes sustancias idénticas a las sustancias naturales, y otro componente que comprende una sustancia activa antibacteriana obtenida de un material vegetal derivado de una o más plantas seleccionadas entre cítricos, lúpulo, uvas y otros, incluyendo material vegetal derivado de Saturela, orégano, tomillo, romero o menta. De acuerdo con ejemplos específicos, se proporciona el aditivo para pienso como una mezcla de polvos vegetales mezclados en estado seco.

El documento US2009004308A1 describe una composición de pienso que comprende ácido benzoico en combinación con una mezcla de al menos dos compuestos activos seleccionados del grupo que consiste en tomillo, eugenol y piperina.

El documento EP1419811A1 se refiere a microencapsulación de sustancias volátiles, como aceites esenciales, para mejorar la estabilidad en almacenamiento y la fabricabilidad de mezclas de extractos vegetales.

Se ha proporcionado un producto disponible en el mercado llamado Biostrong 510 (Delacon, Steyregg, Austria) como aditivo para piensos fitogénico para aves de corral, que consiste en una combinación de aceites esenciales microencapsulados y sustancias de hierbas alineados a las necesidades de aves de corral de alto rendimiento.

Las composiciones Biostrong 510 para su uso junto con antibióticos se describen p.ej., en Scheuermann et al (Ciencia Rural 2009, 39(2):522-527), Purser et al. (Poultry Science 2012, 91(suppl. 1):126), y Buchanan et al. (J. Appl. Poultry Sci. 2008, 17:202-210), véase también Simon "Nutrient Digestibility with Phytogenic Feed Additives" en el informe de Delacon "Trends in Animal Nutrition" 2009, S13-16. Según la descripción dichas composiciones contenían compuestos fitogénicos, si bien con un contenido de saponina y un efecto sin definir.

Yaghoobzadeh et al. (Poultry Science 2012, 92 (E-Suppl.1):119-132, P363 (resumen)) describen los efectos de saponinas y extractos de aceite de hierbas mezclados con pienso en las características del rendimiento y el cuerpo del pollo de engorde.

Sin embargo, existe la necesidad de optimizar el rendimiento de los animales y aumentar la capacidad de digestión de nutrientes. El objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo aditivo para pienso o composición de pienso de aves de corral con componentes específicos para mejorar las características biofísicas de los animales.

Sumario de la invención

El objeto se resuelve según la materia objeto, tal como se reivindica.

De acuerdo con la invención se proporciona el uso de una composición de aditivo de pienso de aves de corral que es una mezcla fluida de compuestos fitogénicos, que comprende al menos

a. un componente de aceite que es aceite esencial de tomillo microencapsulado, y

b. un componente de saponina que es corteza de Quillaja en polvo seca en partículas que contiene saponina, conteniendo dicha mezcla al menos 0,5 % de componente saponina (p/p) y el componente de aceite en una relación eficaz de al menos 0,2:1 (p/p, componente de aceite por componente de saponina para mejorar la eficiencia de conversión del pienso en producción de aves de corral sin antibióticos.

Específicamente, la relación eficaz está dentro del intervalo de 0,2:1 - 10:1, preferentemente en el intervalo 1:1 a 5:1, preferentemente en el intervalo 2:1 a 4:1.

Específicamente, la mezcla contiene el menos 0,2 % (p/p) de aceite esencial de tomillo, preferentemente al menos 0,5, 1, 2, 3, 4 o 5 %, p.ej., hasta 10 % (p/p).

La composición, tal como se describe en el presente documento comprende específicamente el componente de aceite en una cantidad en el intervalo de 0,2 % a 5 % (p/p), y el componente de saponina en una cantidad en el intervalo de 0,5 a 5% (p/p).

De acuerdo con una realización específica, la corteza de Quillaja en polvo contiene saponina en una cantidad en el intervalo de 3 a 10 % (p/p).

El material adicional que se puede utilizar adicionalmente como componente saponina se pueden seleccionar de otras especies vegetales o partes de la planta que contienen saponinas, p.ej., se pueden seleccionar del grupo que consiste en el material vegetal derivado de la familia botánica Quillajaceae que define el género Quillaja, Agavoideae que define el género Yucca, Fabaceae que define el género Trigonella, Sapindaceae que define el género Sapindus (moras de jabón o nueces de jabón), y las familias Aceraceae (arce) íntimamente relacionadas, Hippocastanaceae (castaño de indias) y Sapotaceae. Se encuentra profusamente también en la cubierta de las semillas de Amaranthacea y en Gynostemma pentaphyllum (Gynostemma, Cucurbitaceae) en una forma denominada gipenosidas, y ginseng o ginseng rojo (Panax, Araliaceae) en una forma denominada ginsenosidas. Dentro de estas familias, esta clase de compuestos químicos se encuentra en varias partes de la planta: hojas, tallos, raíces, bulbos, florescencias y frutos.

Específicamente, la mezcla contiene al menos 0,5% de componente saponina (p/p), preferentemente al menos 1 % o al menos el 2 %, p.ej., hasta 3, 4, 5 % (p/p).

Específicamente, la composición comprende adicionalmente otros aceites esenciales provistos en una forma microencapsulada y/o libre, hierbas secas, especias y excipientes adicionales, incluyendo opcionalmente, agentes de volumen y agentes antiapelmazantes.

De acuerdo con una realización específica, el aceite esencial adicional es aceite de anís estrellado, preferentemente al menos 0,2 % (p/p) o al menos 0,5, 1, 2, 3, 4 o 5 %, p.ej., hasta 10 % (p/p).

Específicamente, el aceite esencial de tomillo y, opcionalmente, los aceites esenciales adicionales, están microencapsulados por secado por pulverización o emulsión o/w. Dicha microencapsulación proporcionaría una biodisponibilidad a largo plazo del aceite esencial simultánea con la biodisponibilidad del componente saponina. La biodisponibilidad a largo plazo se denomina también en el presente documento liberación sostenida. Por lo tanto, la composición de la invención proporciona la liberación sostenida de los componentes activos, que son el componente de aceite y el componente saponina.

El aceite esencial microencapsulado proporciona un componente de aceite mezclado homogéneamente con otras sustancias secas para proporcionar la mezcla o dispersión a/s (aceite en sólido) fluida que se puede almacenar a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado de al menos 18 meses, preferentemente al menos 2 años, p.ej. en la forma en polvo o en forma de gránulos. Por ejemplo, la composición de la invención puede granularse con otras sustancias de pienso nutricionales para proporcionar composiciones de pienso granuladas sin pérdida significativa del aceite esencial incluso tras un almacenamiento a largo plazo. Específicamente, Se puede proporcionar la composición como una preparación granulable, estable en almacenamiento, con una estabilidad de al menos 18 meses a temperatura ambiente, o a una temperatura de hasta 25 °C. Tras el almacenamiento, al menos un 65 % del aceite esencial permanecería en la mezcla, preferentemente al menos un 70 %.

La composición, tal como se describe en el presente documento, contiene preferentemente 20-60 % (p/p) de hierbas secas. Entre las hierbas secas preferidas se incluyen polvos de raíz de angélica, anís, manzana, achicoria, bálsamo, agracejo, albahaca, hojas de abedul, naranja amarga, grosella, zarzamora, arándano, cálamo, cassia, cedro, camomila, castaña, cimicifuga, canela, citronela, trébol, fárfara, centáurea menor, ortiga mayor, diente de león, eneldo, flor de saúco, eucalipto, hinojo, genciana, jengibre, ginko, grano de uva, pepitas de uva, pomelo, celidonia mayor, té verde, espino blanco, lúpulo, rábano picante, cola de caballo, hisopo, ipecac, limón, melisa, limoncillo, regaliz, levistico, maca, caléndula, mejorana, malvavisco, menta, muérdago blanco, artemisa, muira puama, quercus, hojas de olivo, naranja, orégano, perejil, flor de la pasión, menta piperita, acícula de pino, equinácea, psyllium, quassia, quebracho, quillaja, hojas de frambuesa, llantén menor, rosa, romero, ruda, escaramujo, cártamo, salvia, sándalo, ajedrea, ginseng siberiano, saponaria, hipérico, anís estrellado, raíz de planta siberiana, té, tomillo, tormentilla, raíz de valeriana, ajenjo, milenrama, corteza de yojimbe.

La composición puede incluir además especias, p.ej., 1-15% (p/p), como pimienta inglesa, alcanfor, alcaravea, cardamomo, pimienta de cayena, clavo, cilantro, comino, cúrcuma, fenogreco, ajo, enebro, nuez moscada, cebolla, pimentón, pimiento, azafrán indio

Se pueden utilizar excipientes adicionales que son agentes de volumen o antiapelmazantes, p.ej., en una cantidad en el intervalo de 20-60 % (p/p), fuentes orgánicas, como salvado de trigo, salvado de arroz u otros salvados de grano, almidón modificado, lactosa o dextrosa y fuentes inorgánicas, como dióxido de silicio, caliza o bentonita.

Se proporciona además la composición tal como se describe en el presente documento, que está contenida en un producto de pienso, preferentemente, en una dosis de al menos 100 mg por kg de producto de pienso, opcionalmente, se proporciona en forma de gránulos. Las dosis preferidas son al menos 150, opcionalmente, al menos 200 o 250 mg/kg u, opcionalmente, cantidades más altas, p.ej., hasta 750 mg/kg.

Por ejemplo, se mezcla la composición de aditivo para pienso con un material de pienso, p.ej., grano partido, subproductos de destilería a base de granos, semillas oleosas, como aceite de colza, linaza, soja y subproductos de la producción de aceite, como harina de soja, harina de colza, torta de colza, harina de linaza, torta de linaza y subproducto de la industria de procesamiento del pescado y de la carne, como harina de pescado, harina de carne, carne y harina de huesos, harina de plumas, harina de sangre y proteínas de origen animal hidrolizadas y premezclas minerales y, opcionalmente, granuladas a través de un proceso de compresión o moldeo de un material en la forma de gránulos.

De acuerdo con la invención, se proporciona además el uso de la composición de aditivo para pienso o un producto de pienso para una mejor conversión del pienso en aves de corral. Específicamente, la mejor conversión del pienso se determina por un aumento de la digestibilidad ileal de nutrientes o una menor tasa de conversión del pienso, p.ej., determinado según los correspondientes modelos in vitro o in vivo.

Específicamente, se utiliza el material como potenciador de la digestibilidad y el rendimiento, p.ej., de acuerdo con la definición del reglamento (CE) 1831/2003, en aves de corral para engorde o puesta o cría, en el lugar de la puesta. De acuerdo con la invención, se proporciona además un método para alimentar a un animal ave de corral con un producto de pienso que comprende la administración de la composición, tal como se describe en el presente documento con una dieta sin antibióticos, donde dicho pienso da como resultado una mejora de la eficiencia de conversión del pienso.

Específicamente, dicha mejora da como resultado un aumento de la ganancia de peso diaria (promedio), preferentemente de al menos 1,0 % o al menos el 2,0 %, durante un período de tiempo de 35 días, cuando se dosifica la composición en una cantidad de al menos 100 mg por kg de producto de pienso.

Específicamente, dicha mejora da como resultado una disminución de la relación de conversión del pienso, preferentemente de al menos 1,5 % o al menos el 2 %, durante un período de tiempo de al menos 35 días, cuando se dosifica la composición en una cantidad de al menos 100 mg por kg de producto de pienso.

Específicamente, dicha mejora da como resultado un aumento de digestibilidad ileal de proteínas, preferentemente de al menos un 1 % durante un período de tiempo de al menos 35 días, cuando se dosifica la composición en una cantidad de al menos 100 mg por kg de producto de pienso.

Figuras

Figura 1: Aparato para determinar aceites esenciales en fármacos

Figura 2: efecto dependiente de dosis de Componente A aceite esencial en el reclutamiento de membrana de transportador de glucosa dependiente de sodio SGLT1 y de di- y tripéptidos

Descripción de las barras:

Concentración relativa del componente A aceite esencial (factor de cambio en comparación con el nivel de dosis de la dieta)

1: 0-control; 2: 0,13-veces más; 3: 0,25-veces más; 4: 0,50-veces más; 5: 1,00-veces más; 6: 2,50-veces más; 7: 5,00veces más; 8: 7,50-veces más; 9: 10,0-veces más; 10: 17,5-veces más; 11: 25,0-veces más

Figura 3: efecto dependiente de dosis de Componente B saponina en el reclutamiento de membrana de transportador de glucosa dependiente de sodio SGLT1 y transportador de di- y tripéptido PEPT1 en células CaCo2.

Descripción de las barras:

Concentración relativa del componente B saponina (factor de cambio en comparación con el nivel de dosis de la dieta) 1: 0-control; 2: 0,13-veces más; 3: 0,25-veces más; 4: 0,50-veces más; 5: 1,00-veces más; 6: 2,50-veces más; 7: 5,00-veces más; 8: 7,50-veces más; 9: 10,0-veces más; 10: 17,5-veces más; 11: 25,0-veces más

Figura 4: efecto dependiente de dosis de Componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos a B, en el reclutamiento de membrana y la expresión de ARNm del transportador de glucosa dependiente de sodio epitelial SGLT1 en células CaCo2.

Figura 5: efecto dependiente de dosis de Componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos AB, en el reclutamiento de membrana y la expresión de ARNm del transportador de di- y tripéptidos PEPT1 en células CaCo2.

Descripción detallada de la invención

Los términos específicos que se usan a lo largo de la memoria descriptiva tienen los siguientes significados.

La expresión "in antibiótico" tal como se utiliza en el presente documento con respecto a alimentar a un animal, una dieta o un producto de pienso, hará referencia a la alimentación de un animal con un producto de pienso desprovisto de antibióticos. Aunque el animal pueda haber sido tratado con antibióticos por prescripción veterinaria, la dieta regular no contiene antibióticos adicionales como potenciadores del crecimiento. Por lo tanto, se evita la acumulación de sustancias nocivas como antibióticos y similares en las personas que hayan consumido la carne o los huevos de las aves de corral. Las composiciones, tal como se describen en el presente documento mejoran la conversión de alimento al sustituir así los antibióticos en los productos de pienso. Por lo tanto, es posible aumentar la productividad de carne de buena calidad.

La expresión "características biofísicas" de un animal como un ave de corral, se entiende en el presente documento como la función biótica y abiótica de un animal, o población, e incluye particularmente los factores que tienen una influencia en su supervivencia, desarrollo y evolución, incluyendo en particular factores que mejoran la eficiencia de conversión del pienso en animales, p.ej., tal como se determina en modelos in vitro o in vivo. Dichos factores incluyen, p.ej., permeabilidad de la membrana intestinal, digestibilidad de nutrientes, digestibilidad ileal de proteínas, transporte de nutrientes, efectos antimicrobianos o antioxidantes.

La "eficiencia de conversión del pienso" tal como se entiende en el presente documento se refiere específicamente a una medición de la eficiencia de un animal al convertir la masa de pienso en una mayor masa corporal (p.ej., músculo o masa de huevo). La eficiencia se puede determinar como la tasa de conversión del pienso, que es la masa del alimento consumido dividido por la ganancia de masa corporal, durante un período especificado. Por ejemplo, un animal al que se le alimenta con un aditivo para pienso diseñado para mejorar la eficiencia de conversión del pienso puede consumir menos alimento que un animal que recibe pienso sin dicho aditivo para pienso, produciendo una cantidad similar de carne. Normalmente, la tasa de conversión del pienso de las aves de corral está en el intervalo de 1,2 a 2,5, dependiendo de la raza genética.

Se puede determinar una mejora de la tasa de conversión del pienso o un factor que influya en la eficiencia de conversión del pienso, si la tasa o el factor de conversión del pienso disminuye p.ej., en al menos un 2%, preferentemente al menos un 2,5 %.

Se determina específicamente un "efecto sinérgico" del componente de aceite y el componente de saponina en la composición de aditivo para pienso de la invención, si el efecto de la mezcla proporcionada en la relación eficaz es inesperadamente más alto que los efectos que se obtienen con los componentes individuales.

Existen factores directos que influyen en la eficiencia de conversión del pienso, entre los que se incluyen p.ej., la digestibilidad de nutrientes, digestibilidad ileal de proteínas o nutrientes, permeabilidad de la membrana intestinal, sistemas de transporte de nutrientes de la membrana de borde en cepillo, o factores indirectos, como puedan ser los que mejoran el estado de salud del animal y reducen la demanda de energía y proteínas para reacciones inmunitarias, incluyendo efectos antimicrobianos.

La expresión "permeabilidad de membrana intestinal" se entiende en el presente documento como un factor que determina la absorción intestinal de nutrientes, como pueda ser al pasar a través de la membrana celular del intestino. Dichas características biofísicas pueden determinarse mediante el modelo ex vivo que emplea células colorrectales epiteliales para analizar un cambio de la permeabilidad tras el contacto con sustancias específicas. La expresión "sistemas de transporte de nutrientes" se entiende en el presente documento como un transporte activo de nutrientes, incluyendo p.ej., glucosa, péptidos y aminoácidos, desde el lumen del intestino delgado a lo largo de la membrana de borde en cepillo en los enterocitos. Dichos sistemas de transporte de nutrientes son enzimas específicas, que incluyen, p.ej., el transportador de glucosa dependiente de sodio (SGLT1) y el transportador de péptido pequeño y aminoácido (PEPT1). Dichas características biofísicas pueden determinarse mediante el modelo ex vivo que emplea células colorrectales epiteliales para analizar la expresión génica de la enzima transportadora SGLT1 tras el contacto con sustancias específicas. La expresión "efectos antimicrobianos" tal como se entiende en el presente documento se refiere a los posibles efectos bacteriostáticos de bacterias que posiblemente sean patógenas para animales monogástricos, incluyendo aves de corral. Dichas características biofísicas pueden determinarse mediante el modelo ex vivo que emplea células bacterianas para analizar un cambio en el crecimiento celular bacteriano tras el contacto con sustancias específicas.

El término "componente" en relación con una composición se entiende en el presente documento como una parte de la composición, que puede incluir otro u otros componentes y excipientes adicionales. La composición de aditivo para pienso de la invención comprende al menos un componente de aceite y el componente de saponina, pero puede incluir además componentes biológicos, principalmente componentes y excipientes fitogénicos, incluyendo, p.ej., excipientes inorgánicos.

El componente de aceite tal como se utiliza de acuerdo con la invención se proporciona específicamente en la forma microencapsulada. Normalmente, La microencapsulación del aceite esencial proporciona su aislamiento del entorno, p.ej., aislando los aceites de los efectos de deterioro de saponinas en la fase acuosa, p.ej., en el entorno gastrointestinal, retardando la evaporación del aceite volátil, protegiendo contra la fricción y la evaporación debido a la humedad y la alta temperatura durante el procesamiento del pienso ((granulado) o mejorando las propiedades de manejo del material pegajoso. Asimismo, se puede controlar eficazmente la velocidad a la que el aceite sale de la microcápsula, como la liberación sostenida o controlada del aceite al tracto gastrointestinal, dirigida a proporcionar una cantidad eficaz de los componentes activos en los intestinos. De esta forma, se puede conseguir la liberación del aceite y el componente de saponina de manera sincronizada para conseguir los efectos sinérgicos in vivo.

Se puede utilizar una amplia gama de materiales y métodos para la encapsulación para crear el grado de durabilidad y el método de liberación adecuados para el uso pretendido. Entre los ejemplos de materiales poliméricos no exhaustivos para su uso con la microencapsulación de aceite se incluyen polímeros naturales de origen eucariota o procariota, p.ej., incluyendo hidrolizados de almidón, como dextrinas, almidón modificado, goma arábiga, alginatos, derivados de celulosa, como hidroxipropilcelulosa, Na-carboxicelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, proteínas o hidrolizados de proteínas animales o vegetales, como gelatina, colágeno, yema de huevo, proteína de trigo, caseína, proteínas de la leche, proteína de soja, proteína de guisante y mezclas de los mismos. Se pueden emplear varios métodos de microencapsulación físicos y químicos, dependiendo del aceite y el recubrimiento de cubierta polimérica que se utilice. De manera conveniente, se encapsula el aceite esencial por deshidratación de una emulsión o/w a través de cualquier medio adecuado, incluyendo secado por pulverización, criodesecación, secado de lecho fluidizado, secado en bandeja, absorción y combinaciones de los mismos. Preferentemente, se produce el aceite microencapsulado por secado por pulverización de una emulsión que tiene una fase acuosa, tal como se ha definido anteriormente, que contiene un agente de encapsulación polimérico. Los parámetros de secado por pulverizado vienen dictados por las características físicas deseadas en el aceite microencapsulado final. Dichos parámetros físicos incluyen tamaño de partícula, flujo y contenido de agua.

Un método preferido emplea la preparación de una emulsión o/w que incluye el aceite, el polímero y un solubilizante o detergente, seguido de secado por pulverización a una temperatura controlada para obtener un componente de aceite seco fluido que consiste en aceite microencapsulado. En el documento EP1419811A1 se describe un método ilustrativo.

El aceite microencapsulado tiene normalmente una buena fluidez y el aceite se puede distribuir homogéneamente en toda la composición. De manera conveniente, el componente de aceite es un polvo. Se puede añadir cualquier aditivo adecuado al aceite microencapsulado, p.ej., un agente de flujo como dióxido de silicio, para aumentar la fluidez del aceite microencapsulado.

El componente de saponina, tal como se utiliza de acuerdo con la invención, es una saponina que contiene partículas de corteza de Quillaja en polvo secas.

El término "polvo", tal como se utiliza en el presente documento se entiende específicamente como un material fluido que comprende una pluralidad de partículas. Las partículas pueden tener una superficie exterior lisa y/o una morfología aplanada. En determinadas realizaciones, el material vegetal en partículas es un polvo beige a marrón oscuro con un olor característico.

El material en polvo de corteza de Quillaja en partículas utilizado en el presente documento se obtiene específicamente triturando material vegetal seco para obtener un tamaño de partícula específico, p.ej., que corresponda al material fluido, p.ej., SiO2 (polvo), una harina y/o semolina.

Las partículas pueden tener una dimensión máxima promedio de 250-500 □m. El material en partículas típico tiene un tamaño de partícula de un mínimo de 95 % por debajo de 500 □m. Preferentemente, el material vegetal en partículas tiene un tamaño de partícula medio de 100-350 □m.

El material en polvo vegetal puede derivarse de varias porciones de la planta, específicamente, se pueden utilizar materiales vegetales fibrosos, p.ej., incluyendo corteza, raíces, vástagos, tallos, hojas, flores, semillas o combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de materiales se incluyen los derivados de Quillajaceae, Agavoideae, Fabaceae, Sapindaceae, Aceraceae, Hippocastanaceae, Sapotaceae, Amaranthacea, Cucurbitaceae o Araliaceae, y combinaciones de las mismas. Son de interés los materiales vegetales derivados de corteza de Quillaja y Yucca.

El contenido de saponina en el material vegetal en partículas se puede determinar a través de métodos convencionales, p.ej. determinando el índice de espuma.

El componente de saponina seco o la composición de aditivo para pienso puede ser analizado p.ej. en cuanto a su capacidad para proporcionar la cantidad de espuma deseada, empleando un método tal como se describe en la sección de los ejemplos. El volumen de la capa de espuma determinado de esta manera es el "índice de espuma" del material de ensayo, índice de espuma que está correlacionado con el contenido de saponina.

El contenido de humedad del material vegetal en partículas o la composición de aditivo para pienso de la invención es normalmente menos de 12 %, preferentemente inferior al 8 %.

El término "excipientes" tal como se utiliza en el presente documento se referirá específicamente a componentes de aditivo utilizados comúnmente en composiciones para pienso, p.ej., componentes de aditivo para pienso fitogénicos y/o inorgánicos. Específicamente, el aditivo para pienso y sus componentes de aditivo se entienden como productos utilizados en la nutrición animal con fines de mejorar la calidad del pienso o para mejorar el rendimiento y salud de los animales. Los aditivos para pienso se seleccionan normalmente de manera cuidadosa para que no tengan efectos perjudiciales, en la salud humana y animal y en el entorno. A este respecto, el término "pienso" se refiere a cualquier mezcla de ingredientes para pienso animal que proporcione los requisitos de energía y nutrientes, por ejemplo, proteína, grasa, hidratos de carbono, minerales y micronutrientes. Por ejemplo, un consumo diario de pienso de aves de corral está comprendido normalmente entre 50 - 250 g/cabeza y día para pollos de engorde.

La composición de aditivo para pienso de la invención puede incluir específicamente excipientes, como puedan ser aceites esenciales adicionales, hierbas secas, especias y excipientes adicionales, incluyendo colores, sustancias aromatizantes, conservantes o cualquier sustancia necesaria para las fórmulas de la composición para la forma necesaria, como puedan ser agentes de volumen, antiapelmazantes, diluyentes, cargas, aglutinantes, disgregantes, adsorbentes o agentes de granulado. Entre los excipientes típicos se incluyen por ejemplo hojas de romero, bayas de enebro, cáscaras de psyllium, salvado de trigo, piedra caliza, SiO2 o bentonitas.

El término "fluido" tal como se utiliza en el presente documento se referirá específicamente a una mezcla de componentes en forma de polvo, incluyendo, p.ej., material en partículas, que puede fluir. Por ejemplo, una mezcla fluida puede fluir a través de un embudo o una tolva hacia otro recipiente bajo el influjo de la gravedad. En la presente invención, una mezcla en polvo fluida es adecuada para su uso con un dispositivo para mezclado con material de pienso y granulado. El término "fluido" es muy conocido en la industria de alimentación y piensos y tiene un significado claro para las personas expertas en la materia.

Una mezcla fluida tiene varias ventajas de uso, particularmente a escala industrial. La mezcla se puede manejar, almacenar y transportar de una forma relativamente fácil y con eficiencia energética, en comparación, por ejemplo, con los materiales sólidos que no son fluidos. Esta ventaja es particularmente importante en combinación con la capacidad de evitar una etapa de licuación en el proceso de granulado.

La mezcla fluida tal como se utiliza en el presente documento comprende específicamente el aceite y el componente saponina y, opcionalmente, otros componentes y excipientes, donde los componentes se mezclan todos juntos sin incluir ninguna cantidad sustancial de líquido para formar la mezcla seca, que se muele opcionalmente en un polvo fluido, preferentemente granulable.

La expresión "liberación sostenida" tal como se utiliza en el presente documento se referirá específicamente a la composición que permite que el sistema gastro-retentivo proporcione la entrega de nutrientes en el intestino. La tarea de la liberación sostenida de la composición de aditivo para pienso es específicamente la liberación controlada de los componentes activos en las condiciones de los intestinos, donde influye principalmente en la eficiencia de conversión del pienso. La administración de los componentes activos requiere el uso de un vehículo apropiado para llevar una cantidad eficaz de los componentes activos al lugar de acción deseado. El nivel deseado de liberación controlada o sostenida variará, dependiendo de la relación de los componentes empleados, las propiedades físicas de la composición, el método de mezclado de los componentes, y similares. Pueden estar presentes otros aditivos adicionales que pueden modificar las características de la mezcla y sus propiedades de liberación.

La naturaleza microencapsulada del componente de aceite y el componente saponina, que es un polvo vegetal en partículas, permite específicamente un sistema fitogénico que mejora inherentemente las propiedades de liberación sostenida de los componentes activos, p.ej., en la relación eficaz para mejorar las características biofísicas, según se requiera. La composición comprende los componentes que no se disuelven o que solo se disuelven escasamente en el estómago. Los componentes de la composición de aditivo para pienso pueden proporcionarse suficientemente para el intestino y/o colon, de modo que ambos componentes puedan actuar conjuntamente en las características biofísicas. Por lo tanto, es posible obtener efectos sinérgicos de liberación sostenida en los intestinos cuando se proporcionan el componente de aceite y el componente de saponina en la relación eficaz, que es capaz de mejorar una o más de las características biofísicas, tal como se describe en el presente documento.

La relación eficaz se basa específicamente en las cantidades eficaces de los componentes de la composición de la invención, que proporciona la actividad necesaria en el animal tratado durante el período de tiempo deseado.

El resultado fue que la relación eficaz entre el componente de aceite y el componente de saponina consiguió unas características biofísicas sorprendentemente mejoradas, tal como se determina en modelos in vitro o in vivo. Aunque se pensaba que el aceite y las saponinas producirían efectos contradictorios, la textura específica como microcápsulas distribuidas homogéneamente con sólidos (dispersión a/s) y el material vegetal en partícula que contenía los componentes de saponificación, y la relación específica entre ambos componentes dio como resultado una mejora eficaz de la eficiencia de conversión del pienso en aves de corral. Si bien se sabía que las saponinas actúan como agentes espumantes y emulsionantes en soluciones acuosas, los aceites esenciales tienen una solubilidad en agua muy limitada.

En la técnica anterior, Se había utilizado también aceite esencial de tomillo como aceite antibacteriano, que actúa en su hidrofobia, lo cual permite la división de lípidos de la membrana de célula bacteriana y las mitocondrias, alterando las estructuras y haciendo que sean más permeables (Knobloch et al. 1986); y la alta cantidad de compuestos fenólicos antioxidativos, tales como carvacrol y timol, está correlacionada con las fuertes propiedades antibacterianas contra patógenos transportados en los alimentos (Lambert et al. 2001). Parece razonable que su mecanismo de acción fuera por tanto similar al de otros fenólicos; generalmente, se considera que se trata de la alteración de la membrana citoplásmica, que altera la fuerza protón-motriz (FPM), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación del contenido celular (Denyer y Hugo, 1991b; Sikkema et al., 1995; Davidson, 1997). Las actividades antimicrobianas se han explicado ya como factor clave de los efectos de potenciación del rendimiento (Kamphus and Hebeler 1999) in vivo. Wald (2004) ha investigado los efectos antimicrobianos in vivo de aceites esenciales que fueron seleccionados por sus efectos antimicrobianos in vitro. Se han descrito los efectos antimicrobianos solamente cuando se dosificaba 10­ 1000 veces más el aceite esencial que el control positivo de antibiótico. No se ha determinado el efecto de potenciación del rendimiento in vivo.

Por tanto, resultó de lo más sorprendente que el aceite esencial y la saponina pudieran actuar conjuntamente en los intestinos, p.ej., para mejorar la eficiencia de conversión del pienso, p.ej., con dosis de aceite esencial de tomillo bastante por debajo de las cantidades que se habían explicado hasta la fecha para mejorar el rendimiento de los animales.

El término "ave de corral" tal como se utiliza en el presente documento se referirá específicamente a aves de corral domesticadas reservadas principalmente para carne y huevos; incluyendo aves del orden de las galliformes, por ejemplo, pollos, pavos, pintadas, faisanes, codornices y pavos reales; y Anserigormes (aves nadadoras) por ejemplo, patos y gansos.

Se puede alimentar a las aves de corral con la misma composición de pienso a lo largo del período de crecimiento o al menos durante un período de al menos 3 semanas, preferentemente, al menos 4 semanas para mejorar la eficiencia de uso del pienso o la eficiencia de alimentación, p.ej., producción por unidad de pienso. Se pueden observar diferencias significativas entre los tratamientos de control y experimentales en el peso del cuerpo y la ganancia de peso finales en los períodos de crecimiento totales hasta 28 días después de la incubación. Si bien el consumo de pienso puede ser casi igual entre tratamientos, la eficiencia del pienso, es decir g de pienso/g de ganancia de peso puede ser significativamente mejor y específicamente los pollos alimentados con la composición de aditivo para pienso de la invención.

Un ejemplo específico de una composición de aditivo para pienso está relacionado con una nueva composición y su fórmula.

Otros ejemplos están dirigidos a la determinación de las características biofísicas para demostrar la acción sinérgica de los componentes activos de la composición.

Se comprenderá de forma más completa la descripción anterior haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo I: Nuevo aditivo para pienso de aves de corral

La composición contiene los siguientes ingredientes, mezclados para dar una mezcla fluida seca. Mientras que el componente de aceite es aceite de tomillo microencapsulado, el componente de saponina es polvo de corteza de Quillaja.

T l 1: N v iiv r i n v rr l

Este nuevo aditivo para pienso de aves de corral contiene una relación eficaz de 1,5:2,2 (p/p componente de aceite por componente de saponina de Quillaja). Se analiza la fórmula en el sistema de análisis que se describe a continuación para demostrar el efecto sinérgico del componente de aceite, denominado en el presente documento Componente "A" y el componente de saponina, denominado en el presente documento componente "B", donde el efecto sinérgico es más de la suma del efecto de los componentes individuales: AB> A+ B.

Ejemplo II: Descripción de los métodos de análisis pertinentes y metodologías de ensayo

Descripción de las pruebas analíticas de sustancia activa

1. Contenido esencial

2. Contenido de timol

3. Saponinas - índice de espuma

4. Microencapsulación

Descripción de metodologías de ensayo

5. Evaluación in vitro de transporte de nutrientes

6. Validación in vivo de sistemas de transporte de nutrientes de la membrana de borde en cepillo y su relevancia para el rendimiento de animales

a. digestibilidad ileal de nutrientes en aves de corral

b. Evaluación de ruta metabólica y de señalización en el hígado y el yeyuno

c. Eficacia de conversión del pienso en aves de corral

Descripción de las pruebas analíticas de sustancia activa

1. Contenido esencial

Se puede analizar el contenido de aceite esencial en las hierbas y espacies, así como los productos de los mismos, incluyendo la nueva fórmula de la Tabla 1 u otros productos de la presente invención, a través del método No. 2.8.12 descrito en la farmacopea europea (versión 7.5).

Principio del análisis

Se lleva a cabo la determinación de los aceites esenciales por destilación de vapor en un aparato especial en las condiciones que se describen a continuación. Se recoge el destilado en el tubo graduado, utilizando xileno para extraer el aceite esencial; se retorna automáticamente la fase acuosa al matraz de destilación.

Instrumentos

◦ matraz de fondo redondo de 250 ml, 500 ml o 1.000 ml con esmerilado (NS 29)

◦ pinzas para esmerilado

◦ manto de calefacción

◦ embudo

◦ balanza

◦ vasos de precipitados

◦ pipetagraduada

◦ cilindro graduado

◦ piedras de ebullición

◦ guantes desechables

◦ gafas

◦ aparato para determinar aceites esenciales en fármacos

Sustancias químicas

◦ Xylene puriss. p.a., React. ACS (33817; Sigma-Aldrich; GER)

◦ Agente antiespumante "Silicon-Antischaum US" (Brelu; AUT)

◦ HCl 0,1 mol/l (9,8 ml de HCI 32 % por litro de agua destilada)

Determinación de aceites esenciales

a) Con xileno: (Algunos productos, que contienen aceites de alta densidad, necesitan el uso de xileno)

Para tal fin, ha de retirarse el tapón "K'" y añadirse 0,5 ml de xileno a través de la abertura.

Al cabo de 15 minutos de destilación, se desconecta el manto de calefacción. El agua deja de hervir al cabo de aproximadamente 10 minutos.

Se drena el xileno hacia el tubo de medición. Al cabo de 10 minutos más, se determina el volumen de xileno. A continuación, se vuelve a abrir la válvula.

El procedimiento sigue funcionado a "b.) sin xileno", véase la descripción a continuación.

b) Sin xileno: (procedimiento convencional)

Se coloca la cantidad prescrita de la muestra en el matraz de fondo redondo, se añaden el medio de destilación y quizá parte del agente anti-espumante y, a continuación, se arranca la destilación. Si se utiliza el mismo matraz de fondo redondo para la destilación de la muestra que la "destilación de limpieza", se tiene que probar, que se ha enfriado el matraz a temperatura ambiente antes de añadir la muestra.

Para recoger el contenido de aceite esencial total, se debe desconectar la refrigeración, una vez transcurrido el período de tiempo de destilación prescrito.

Una vez que el vapor alcanza el fondo de refrigerador, se vuelve a permitir la refrigeración y se desconecta el manto de calefacción.

Cuando el agua deja de hervir (al cabo de aproximadamente 10 minutos), se deja salir la fase orgánica hacia el tubo de medición y al cabo de otros 10 minutos más, se mide el volumen de la fase orgánica.

Cálculo del contenido de aceite esencial

a) Con xileno:

Se tiene que restar del volumen total de la fase orgánica medido el volumen del xileno añadido. La diferencia es la cantidad total del aceite esencial en la muestra.

_{C [%]} (V2 - Vi) x 100

EW

Contenido total de C del aceite esencial en la muestra en [%]

V1 Volumen del xileno añadido en [ml]

V2 Volumen del fase orgánica en [ml]

EW cantidad tomada de la muestra en [g]

b) Sin xileno:

C [%] = EW X 100

Contenido total de C del aceite esencial en la muestra en [%]

V Volumen del fase orgánica en [ml]

EW cantidad tomada de la muestra en [g]

2. Contenido de timol

Se realizó la detección cuantitativa de la sustancia principal timol en el aceite esencial de tomillo por Cromatografía de gases - Espectrometría de masas (CG-EM).

Principio del análisis

CG es un tipo de cromatografía común utilizado para separar y analizar compuestos volátiles sin descomposición. Se analizaron los gases a medida que interactuaban con las paredes de columna, que habían sido recubiertas con diferentes fases estacionarias. Este recubrimiento da como resultado compuestos que eluyen a diferentes tiempos, que se denomina tiempo de retención de cada compuesto. Estos compuestos se analizan después por comparación con gases patrón calibrados.

Instrumentos

◦ Aparato: GC VARIAN 3800

◦ Columna capilar:

DB 5, longitud: 30 m, D.I.: 0,25 mm

espesor de película 0,25 pm

◦ Inyección:

Volumen de inyección: 1 pl

División: 1:50

Viales: 2 ml vial CG

◦ Detección: EM

Trama iónica 220 °C, corriente iónica 10 pA, objetivo 20,000,

multiplicador 1850 V, 0,25 exploraciones/s

intervalo de masa: m/z: 35-350,

◦ Programa de temperatura:

Inyector-Temperatura 180 °C

velocidad de calentamiento 40 °C: 1 min

40 °C - 220 °C: 20 °C/min

◦ Gas portador: He 1 ml/min flujo constante

Sustancias químicas

◦ Timol p.a.

◦ Etanol p.a.

◦ Bifenilo p.a.

Determinación de contenido de timol en la mezcla

Determinación cuantitativa de timol utilizando un patrón interno: Bifenilo

◦ Soluciones patrón de timol

Concentración de timol: 1 -100 pg /ml (Etanol)

Concentración de bifenilo en soluciones normales: 20 pg/ ml

◦ Preparación de solución de muestra

10 ml vial CG: 60 mg premezcla y en adición 10 ml de etanol

extracción: 1 hora ultrasonido, temperatura ambiente, filtrado: Filtro 0,2 |jm

Concentración de bifenilo en solución de muestra: 20 jg / ml

3. Saponinas - índice de espuma

Las saponinas son una clase de compuestos químicos, sobre la base de una amplia variedad de agliconas (sapogenina) unidas a un diferente número de sacáridos. Las sapogeninas son esteroides, alcaloides esteroides (esteroides nitrogenosos) o triterpenos. Una característica de las saponinas es su capacidad para producir espuma en soluciones acuosas. El índice de espuma es un análisis sencillo para determinar la presencia de saponinas en las premezclas y el pienso compuesto.

Principio del análisis

Se prepara una solución acuosa de la muestra que se va a examinar, que se agita vigorosamente en un matraz volumétrico. Se obtiene el índice de espuma a partir de la altura de la espuma que queda sobre el líquido en centímetros.

Instrumentos

◦ balanza

◦ vaso de precipitados

◦ varilla de agitación

◦ cilindro graduado de 500 ml

◦ embudo

◦ papel de filtro plegado

◦ regla

◦ pipeta graduada de 10 ml

◦ guantes desechables

Determinación de saponinas en premezclas

Se mezclan 5 g del material de muestra con 95 g de agua corriente y se agita bien con una varilla de vidrio.

A continuación, se deja que empape esta suspensión durante al menos 12 horas, idealmente durante toda la noche. Al cabo de un período de tiempo de empapamiento suficiente, se agita la suspensión y se filtra a través de un filtro de pliegues.

Se colocan 350 ml de agua corriente (T: 18 °C) en un cilindro graduado (500 ml) y se mezcla con 5 ml del filtrado. Se cierra el cilindro con una parapelícula y se agita vigorosamente durante 30 s horizontalmente. Al cabo de otros 30 s de tiempo de reposo, se determina la altura de la espuma en cm (espuma por encima de la superficie líquida). Se calcula el índice de espuma como la media de una determinación por duplicado.

Cálculo del contenido de saponinas en las premezclas

El índice de formación de espuma es un instrumento para estimar el contenido de saponina. Es posible asegurar el contenido mínimo requerido, pero no establecer el contenido de saponina exacto. La conversión del índice de espuma a contenido de saponina no es lineal y solamente es posible dentro de un contenido de saponina de 0,5 % a 5 %.

Índice de espuma [cm]

Contenido de saponina [%] = —:------- :------------ - —_{factor de conversión}

factor de conversión:

Evidencia de microencapsulación de aceites esenciales

4. Microencapsulación

Para asegurar una liberación lenta y constante de aceites esenciales en el tracto digestivo, se someten a una microencapsulación específica los aceites esenciales. La microencapsulación se caracteriza por la estabilidad en diferentes disolventes.

Sustancias químicas

◦ Agua desionizada

◦ Jugo gástrico sintético

◦ Jugo intestinal sintético

Instrumentos

◦ microscopio

Determinación de microencapsulación en agua desionizada

Se evalúa la estructura de la partícula encapsulada microscópicamente. Con la posterior adición de agua desionizada, se mantiene la estructura de encapsulación de las partículas durante al menos 30 minutos.

Determinación de microencapsulación de jugo gástrico sintético

Se evalúa la estructura de la partícula encapsulada microscópicamente. Con la posterior adición de jugo gástrico sintético (pH 2), se mantiene la estructura de encapsulación de las partículas durante 2 horas y se liberan los aceites esenciales.

Determinación de microencapsulación de jugo intestinal sintético

Se evalúa la estructura de la partícula encapsulada microscópicamente. Con la posterior adición de jugo intestinal sintético (pH 7,5), se mantiene la estructura de encapsulación de las partículas durante 2 horas y se liberan los aceites esenciales.

Descripción de metodologías de ensayo

5. Eficiencia de conversión del pienso en aves de corral

Evaluación in vitro de transporte de nutrientes

La capacidad para el transporte de nutrientes de la membrana de borde en cepillo es esencial para aumentar la eficiencia de nutrientes del animal. Los transportadores de membrana median el transporte de nutrientes a través de las membranas celulares, permiten así un transporte de nutrientes celular eficiente.

Para evaluar los efectos del componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos AB, en el sistema de transporte de nutrientes de la membrana del borde en cepillo, se utilizó un modelo de células CaCo-2 para medir los valores de intensidad de fluorescencia, que indica la presencia de proteínas transportadoras de nutrientes. Se seleccionaron los transportadores más relevantes para la observación, que median el transporte de nutrientes desde el lumen intestinal a través de las células de la membrana de borde en cepillo, SGLT1 y PEPT1. Se transporta la glucosa desde el lumen del intestino delgado a través de la membrana del borde en cepillo hacia el enterocito principalmente mediante el transportador de glucosa dependiente de sodio, SGLT1 (Hediger y Rhoads, 1994; Wright y Turk, 2004).

El transportador PEPT1 está localizado para la membrana del borde en cepillo del epitelio intestinal y media la absorción de di- y tripéptidos desde el lumen hacia los enterocitos. Esta proteína desempeña un importante papel en la absorción de proteínas de la dieta. PEPT1 también es conocido como miembro 1 de la familia 15 de transportadores de solutos (SLC15A1), una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen SLC15A1.

Cultivo de la línea de células CaCo-2

Se compraron células CaCo-2 humanas de DSMZ (Bnraunschweig, Alemania). Se cultivaron las células CaCo-2 en MEM con medio de sales de Earle, suplementado con 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina y 0,1% 2-mercaptoetanol. Se desarrollaron las células a 37 °C en una incubadora humidificada (> 95 %) con 5 % CO2. Se sembraron células CaCo-2 para los experimentos con microscopio de fluorescencia a 150.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos con DMEM suplementado con 10 % FBS, 1 % penicilina/estreptomicina y 1 % aminoácidos no esenciales durante 24 horas. Se reemplazaron los medios con Medio de Diferenciación de Enterocitos suplementado con 10 % FBS, 1 % penicilina/estreptomicina y MITO+ extensor de suero y se cambió al menos cada día y se llevó a cabo el experimento el día 5 tras la siembra de células.

Posteriormente, Se lavaron las células dos veces con PBS, se fijaron y se permeabilizaron por adición de 100 pl de metanol frío a -20 °C sobre hielo durante 20 minutos. Se lavaron las células dos veces con PBS y después se bloquearon con 5 % suero bovino fetal y 5 % albúmina de suero bovino en PBS (100 pl/pocillo) a temperatura ambiente durante 45 minutos. Finalmente, tras una etapa de lavado con PBS adicional, se tiñeron las células con anticuerpo policlonal de SGLT1, ALEXA FLUOR® 647 conjugado (1:100 en PBS) o anticuerpo policlonal de SLC7A5, ALEXA FLUOR® 647 conjugado (1:200 en PBS) durante toda la noche a 4 °C (50 pl/pocillo).

En resumen: El día 5, se incubaron las células durante toda la noche con el Medio de Diferenciación antes descrito, que contenía la sustancias de análisis A, B y la combinación de las mismas. En la primera etapa, se identificó el intervalo de dosis eficaz añadiendo los aditivos de pienso fitogénicos. Se suplementaron los componentes A y B en las siguientes concentraciones:

Mezcla de aceite esencial: 3,6, 7,3, 14,5, 21,8, 54,4, 109, 218, 544 mg/l

Saponinas de Quillaja: 3,8, 7,6, 15,3, 23,0, 57,5, 115, 230, 575 mg/l

La concentración máxima de las sustancias fitogénicas corresponde así exactamente a los niveles de suplementación de la dieta de 21,8mg/kg (aceites esenciales) y 23,0 mg/kg (saponinas), respectivamente. Dependiendo del experimento, se incubaron las células con el primer anticuerpo anti-SGLT1 (dilución 1:50) o anti-PEPT1 (1:100) durante 3 horas. Después de lavar las placas cinco veces con MEM, se incubaron las células con anticuerpo secundario acoplado a ALEXA-flúor para anti-SGLT1 y anti-PEPT1. Después de lavar las células cinco veces con m Em , se estudió la abundancia de SGLT1 y PEPT1 reclutado en la membrana de citoplasma con un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total.

Fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Se estableció el sistema de detección en un microscopio de epifluorescencia (Olympus IX81). Se utilizó un láser de diodo (Toptica Photonics, Muchich, Alemania) para excitación de fluorescencia selectiva de Alexa647 a 640 nm. Se iluminaron las muestras en la configuración de reflexión interna total (TIR) (CellTIRF, Olympus) utilizando 60 x objetivo de inmersión de aceite (NA = 1,49, APON 60XO TIRF, Olympus, Múnich, Alemania). Después del filtrado apropiado utilizando conjuntos de filtro normales, se creó la imagen de fluorescencia sobre una cámara CCD (Orca-R2, Hamamatsu, Japón). Se montaron las muestras sobre una etapa x-y (CMR-STG-MHIX2-tabla monitorizada; Marzhauser, Alemania) y la exploración de áreas más grandes fue corroborada con un sistema de retención de foco automático guiado por láser (ZDC-2; Olympus).

Análisis de los datos

Los registros de imagen iniciales fueron corroborados mediante software Olympus XcellenceRT. Se exportaron las imágenes como marcos-TIRF y se llevó a cabo el análisis de intensidad de fluorescencia utilizando una estructura Soptty (Borgmann et al., 2012).

Evaluación de intervalo de dosis eficaz

Para ambos componentes, la concentración de hasta 2,5 veces más el nivel de dosis de la dieta, no se documentó ningún efecto en el reclutamiento de membrana de SGLT1 y PEPT1 en células CaCo2. En cambio, una concentración de 50 veces más el nivel de dosis de la dieta mostró efectos tóxicos para la célula en células CaCo2 para ambos componentes. Los resultados se presentan en la Fig. 2 y la Fig. 3. Estos resultados demostraron claramente que el modelo CaCo2 es adecuado principalmente para estudiar los efectos de sustancias fitogénicas en el reclutamiento de membrana de transportadores de nutrientes.

Reclutamiento de membrana y expresión de ARNm

Partiendo de los resultados anteriores como base, en los siguientes experimentos se estudió el reclutamiento de membrana de SGLT1 y PEPT1 y la expresión génica con el componente A, B y la combinación de los mismos A+B (AB), a concentraciones en el intervalo equivalente a 5,0 veces más a 25 veces más las concentraciones de dieta recomendadas.

En consecuencia, el nuevo intervalo para aceites esenciales y saponinas incluyó concentraciones de 115mg/l a 575 mg/l.

Los aceites esenciales (A) no mostraron ninguna respuesta a dosis clara en el reclutamiento de ambos transportadores de nutrientes SGLT1 y PEPT1 (Fig.4 y 5). Entre 0 mg/l y 115 mg/l, el componente A aumentó ligeramente el reclutamiento de membrana tanto de SGLT1 como PEPT1 aproximadamente 1,4 veces más. Concentraciones más altas no dieron como resultado un aumento adicional en el reclutamiento.

En contraste con los aceites esenciales, el componente B saponina presentó un reclutamiento de membrana dependiente de dosis más pronunciado en SGLT1 y, en particular, en PEPT1. Por lo que respecta al reclutamiento de SGLT1, se observó un aumento entre 0 y 115 mg/l y entre 115 y 173 mg/l antes de alcanzar un nivel estable a concentraciones más altas de hasta 575 mg/l. Las saponinas causaron claramente una respuesta a dosis incontrovertible a lo largo de todo el intervalo de concentración investigado. (Fig. 4 y 5).

La combinación de ambos componentes AB no mostró ningún efecto adicional en el reclutamiento de SGLT1, en comparación con el componente B, mientras que se documentó claramente un sorprendente posterior aumento de reclutamiento de membrana de PEPT1 (Fig. 4 y 5).

Por lo que respecta a la expresión de ARNm en ambos transportadores de nutrientes SGLT1 y PEPT1, una suplementación solamente del aceite esencial componente A para el medio de cultivo de tejido permaneció sin efecto. Por el contrario, el componente B saponina causó una clara e incontrovertible respuesta a dosis por lo que respecta a la expresión de ARNm de ambos transportadores. La suplementación de ambos componentes AB para el medio de cultivo de tejido de células CaCo2 mostró un sorprendente mayor aumento por lo que respecta a la expresión de SGLT1, mientras que, en comparación con la suplementación solamente del componente B saponina, no se observó ningún aumento adicional en la expresión de PEPT1. Los resultados se presentan en las Figuras 4 y 5.

Conclusión

El modelo CaCo2 es adecuado para estudiar tanto el reclutamiento de membrana como la expresión génica de transportadores de nutrientes. En particular, las saponinas poseen un efecto diferenciado en la expresión génica y el reclutamiento de membrana de SGLT1 y PEPT1. Los aceites esenciales soportan y aumentan inesperadamente los efectos de saponina por lo que respecta al reclutamiento de membrana de PEPT1 y por lo que respecta a la expresión de SGLT1. Para este fin, la combinación de aceites esenciales y saponinas parece ser significativa en lo que se refiere a la absorción de nutrientes.

6. Validación in vivo de sistemas de transporte de nutrientes de la membrana de borde en cepillo y su relevancia para el rendimiento de animales

a. Digestibilidad ileal de nutrientes en aves de corral

Para validar la relevancia de los efectos beneficiosos del sistema de transporte de nutrientes in vitro, se llevó a cabo un ensayo in vivo para evaluar el efecto del componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos AB en la digestibilidad ileal de nutrientes de aves de corral. Se mezclaron los componentes A, B y AB con mezclas de iniciación con dietas de aves de corral sin antibiótico. En la Tabla 2 a continuación, se describe el diseño del ensayo. Asimismo, se tomaron muestras de tejido de este ensayo para evaluar posibles mecanismos moleculares, utilizando tecnología de micromatriz, analizando los diferentes patrones de expresión génica en el yeyuno y el hígado de aves.

T l 2: E m n r l l i ñ x rim n l

Dietas y régimen de alimentación

Se mezclaron el componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos AB con dietas de inicio de aves de corral comerciales sin antibiótico, a base de maíz, harina de soja y trigo, iso-calóricas e isonutritivas y que satisfacían los requerimientos nutricionales de pollos de corral en crecimiento tal como lo recomienda la Sociedad de Fisiología de la Nutrición (1999). Durante todo el periodo experimental completo de 21 días, se proporcionaron las dietas a demanda y en forma de masa. Se prepararon dietas sin la inclusión de ninguna enzima, promotor de crecimiento, antibiótico o coccidiostato.

Animales y cría

Se asignaron al azar un número total de 127 pollos de corral Cobb 500 macho de un día de vida a los 4 grupos experimentales con 36 aves por grupo (Tabla 2). Se distribuyeron las 36 aves de cada grupo experimental en 9 jaulas con 4 aves cada una (9 repeticiones por grupo). La duración del período de alimentación fue de 21 días. Se colocan las jaulas de acero inoxidable con un área base de 0,19 m2 (=34 cm x 55 cm) en una nave experimental aclimatada. En la primeras dos semanas del experimento, se mantiene la temperatura ambiente de la sala a 25 °C, y se reduce en la tercera semana a 23 °C. La duración de la iluminación es 24 horas durante los 3 primeros días y 18 horas a partir del día 4 en adelante. Se ajusta la humedad a 65 %. Las aves tienen acceso libre a agua corriente y las dietas individuales, proporcionadas como "harina de pienso".

Digestibilidad ileal de proteínas

Se analizó la digestibilidad de nutrientes para las 27 aves de cada grupo experimental el día 21. Para este fin, se sacrificó a las aves el día 21, 2 horas después de iniciar el ciclo de iluminación. Se extirpó el íleo completo (comienzo: divertículo de Meckel, final: 3 cm craneal a ostium ileocecal). se recogió el quimo ileal por purgado de íleo con una cantidad definida (5 a 10 ml) de agua o solución de cloruro sódico fisiológica. Se agrupó el contenido ileal de 3 aves de una jaula. Se analizó la concentración de materia orgánica, proteína en bruto, lípidos en bruto, cenizas en bruto, calcio y fósforo en la digesta ileal agrupada y en las dietas, se calculó la digestibilidad prececal de los nutrientes mencionados a partir de la concentración de nutrientes analizados en la dieta y la digesta. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Ta l : Ef l m n n A B AB n l i i ili l l n ri n n v rr l l í 21 vi

De acuerdo con el aumento significativo de la digestibilidad ileal de proteínas en bruto, también se pueden analizar cambios significativos en la digestibilidad de numerosos aminoácidos esenciales y no esenciales en todos los grupos que recibieron dietas con la adición de aditivos para el pienso fitogénicos en comparación con los animales de control (Tabla 4).

Tabla 4: Efecto del com onente A B AB en la dis estibilidad ileal de aminoácidos en aves de corral el día 21 de vida.

continuación

Conclusión

De los resultados, se puede concluir que la combinación del componente A aceite esencial y el componente B saponina presentaron efectos estadísticamente positivos en la digestibilidad ileal de proteínas en pollos de corral. El efecto beneficioso de AB en la digestibilidad ileal de proteínas se corresponde con los resultados del modelo in vitro descrito anteriormente.

b. Evaluación de los análisis mediante micromatriz de la ruta metabólica y de señalización en el hígado y el yeyuno de expresión génica diferencial en el yeyuno y el hígado

Por lo que respecta al nivel transcripcional, las comparaciones de los grupos de dieta con control sin tratar revelaron únicamente diferencias en las abundancias de transcrito entre el componente B saponina y un grupo de control sin tratar. En consecuencia, se consideró un conjunto de 613 y 610 genes para análisis en el hígado y el yeyuno, respectivamente. En el fondo del metabolismo y la señalización, en la Tabla 5 se enumeran las rutas canónicas específicas de tejido más prominentes. En general, las rutas de señalización presentaron niveles de significación más altos en comparación con las rutas metabólicas.

Tabla 5. La alimentación con saponina indujo cambios en las rutas metabólica y de señalización, que se obtuvieron del An li i R In n i i l x r i n if r n i l n l hí l n B> N.

Para obtener un examen de los efectos de las diferencias transcripcionales relacionadas con la suplementación con saponina, se analizaron biofunciones con puntuaciones de activación previstas de categorías IPA en particular. En el hígado, se seleccionaron categorías funcionales por lo que respecta a su relación con el metabolismo energético ("metabolismo de hidratos de carbono", "metabolismo de lípidos" y "barrido de radicales libres"). En el yeyuno, las categorías funcionales seleccionadas pertenecían a la absorción de nutrientes e interacción celular ("Señalización e Interacción célula a célula" y "Transporte molecular"). Por lo que respecta a las biofunciones asignadas al "Metabolismo de hidratos de carbono", se obtuvieron las puntuaciones Z máximas para "Aclaramiento de D-glucosa" (1.131),

"Síntesis de D-glucosa"(-0,896) y "Síntesis de monosacáridos" (-0,788). En la categoría funcional de "Metabolismo de lípidos", las biofunciones relacionadas con la conversión y el almacenamiento se predijeron sistemáticamente para ser inactivadas por el grupo saponina en comparación con el grupo de control. Las biofunciones referentes a la producción de especies de oxígeno reactivas y superóxido presentaron puntuaciones Z elevadas relacionadas con la inactivación de estas funciones en el tejido del hígado (B>CON).

Por lo que respecta a la categoría de proceso biológico de "Señalización e Interacción célula a célula", se predijo que la biofunción relacionada con la adhesión se activaría significativamente en el yeyuno de los animales tratados con saponina en comparación con el control. Adicionalmente, la predicción de la activación reveló efectos de activación sólidos en el transporte y absorción de proteína, glucosa y ácidos grasos para la comparación de saponina y el grupo de control.

Por lo que respecta a las biofunciones notificadas, se analizaron las diferencias de transcripción de los tres grupos de tratamiento en comparación con el grupo de control. En relación con las categorías funcionales de "metabolismo de lípidos" y "Señalización e interacción célula a célula, el conjunto de genes seleccionados se basó en las biofunciones activadas previstas (Tabla 6) obtenidas para la comparación de B>CON.

Tabla 6. Biofunciones IPA enriquecidas con estados de activación previstos (puntuación Z) de categorías IPA funcionales B>BON.

Los genes asignados a la categoría de "Metabolismo de lípidos" están relacionados con la regulación y transducción de procesos relacionados con la conversión y almacenamiento de lípidos Tabla 7. Disminuyó la abundancia de transcritos de genes que afectan a la oxidación beta y el almacenamiento de ácidos grasos (p.ej., APOB, CROT y LPL), al tiempo que se enriquecieron los transcritos que median la transducción de señal en B en comparación con CON (p.ej. FFAR2 y NFKBIA). Los patrones de expresión de transcritos fueron muy coherentes en las tres comparaciones, pero no se alcanzaron muchas diferencias significativas de otros contrastes distintos a B>CON.

Tabla 7. Factor de cambio de conjunto de genes asignado para metabolismo de lípidos en el hígado. Las columnas indican comparaciones de diferentes grupos de tratamiento de la dieta, concretamente aceites esenciales saponinas

AB i n i l A nin B n l r nr l.

En el yeyuno, los análisis de los transcritos asignados a "Señalización e Interacción célula a célula" revelaron diferencias específicas de grupo diferenciadas (p.ej. AKT1, CD47 y EGR1) (Tabla 8). Se obtuvieron diferencias coherentes y también significativas en las tres comparaciones, tal como se representa para ADD3, ARHGAP21, MYH9 y VEGFA. Los genes con función en asociación e interacción celular, incluyendo TJP1 yLAMA3 presentaron una abundancia de transcrito elevada en comparación con el grupo de control.

Tabla 8. Factor de cambio de conjunto de genes asignado a "Señalización célula a célula" en yeyuno. Las columnas indican comparaciones de diferentes grupos de tratamiento de la dieta, concretamente aceites esenciales saponinas

AB i n i l A nin B n l r nr l.

continuación

El conjunto de genes seleccionado para la categoría de "Metabolismo de hidratos de carbono" se guió por el papel de los genes en la regulación del metabolismo de hidratos de carbono y su enriquecimiento significativo en la comparación de B>CON. En el tejido hepático, se obtuvo una mayor abundancia de transcrito para regulaciones clave de glicolisis y gluconeogénesis, concretamente PCK2, PFKFB4, PFKL yPKM2 (Tabla 9). Adicionalmente, la comparación de A>COPN y AB>CON se reveló como coherente si bien sin diferencias significativas para los niveles de ARNm de estas enzimas reguladoras clave. En general, los patrones de expresión implican efectos de solapamiento en el metabolismo de hidratos de carbono para todos los grupos de tratamiento en comparación con el control.

Tabla 9. Factor de cambio de conjunto de genes asignado para metabolismo de hidratos de carbono en el hígado. Las columnas indican comparaciones de diferentes grupos de tratamiento de la dieta, concretamente aceites esenciales nin AB i n i l A nin B n l r nr l.

En lo que se refiere a la categoría "Transporte molecular", se investigó la abundancia de transcritos diferencial con el foco en el transporte de péptidos y aminoácidos. Los perfiles de expresión de genes que codifican proteínas de transporte de soluto seleccionadas aumentaron sistemáticamente en la comparación B>c Oo (Tabla 10). El factor de cambio máximo de abundancia de ARNm se obtuvo para los transportadores de aminoácido neutro SLC38A2 y SLC6A19. Las diferencias significativas en la abundancia de transcrito se solaparon principalmente para los grupos alimentados con componente de saponina (B>CON y AB>CON).

Tabla 10. Factor de cambio de conjunto de genes asignado a "Transportadores de péptido y aminoácido" en yeyuno.

Las columnas indican comparaciones de diferentes grupos de tratamiento de la dieta, concretamente aceites n i l nin AB i n i l A nin B n l r nr l.

continuación

c. Eficiencia de conversión del pienso en aves de corral

Para evaluar la relevancia de los efectos observados en la digestibilidad de nutrientes y los sistemas de transporte de nutrientes en la eficiencia del pienso de aves de corral, se mezclaron el componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos AB con dietas de aves de corral comerciales. En la Tabla 11 se describe el diseño experimental. Se supervisaron el rendimiento de crecimiento y el consumo de pienso de pollos de corral desde el día 1 al día 42 de vida.

T l 11: E m nr l l i ñ x rimn l

Dietas y régimen de alimentación

se mezclaron el componente A aceite esencial, el componente B saponina y la combinación de los mismos AB con dietas de aves de corral sin antibiótico comerciales a través de premezclas a un nivel de 1.000 mg/kg pienso. Los niveles de dieta de las dietas experimentales y los análisis de los componentes A y B se dan en la Tabla 12 rsp. Tabla 13 a continuación. Durante el período experimental de 42 días se proporcionaron dos dietas de fase alimentación a base de maíz, harina de soja y trigo, en forma de mezcla de 01 a 21 días (dieta de inicio), de 22 a 42 días de vida (dieta final), iso-calóricas e iso-nutritivas y que satisfacían los requerimientos nutricionales de pollos de corral en crecimiento tal como lo recomienda la Sociedad de Fisiología de la Nutrición (1999). Se prepararon dietas sin la inclusión de ninguna enzima, promotor de crecimiento, antibiótico o coccidiostato.

Tabla 12: m iin n rin nliz k n^ l i l r x rimn l imples

_______

T l 1: Íni f rm i n m nliz n r mzl iml nliz n i ml

Animales y cría

Se asignaron cuatro cientos ocho pollos de corral macho sanos de un día de vida (Cobb 500) en 24 gallineros (3,1 m2) con lechos de virutas de madera blanda. Se determinó el sexo de los pollos y se los vacunó en la cámara de incubación. Se equipó la nave avícola con un clima controlado y ventilación forzada (velocidades e aire de 0,3 (1 a 18 días de vida) hasta 1,0 m/s (de 19 días de vida en adelante). Se redujo gradualmente la temperatura ambiente de 32 °C el día 1 de vida a aproximadamente 28 °C el día 21 de vida. Se controló la humedad relativa dentro de 50 a 65 %. Se proporcionó luz (45 lux) durante los 4 primeros días durante 24 horas de forma continua. A partir del día 5 de vida en adelante, se redujo la luz diaria (45 lux) a 18 h. Se suministró continuamente pienso y agua fresca a demanda.

Rendimiento productivo

Se midió el rendimiento productivo (peso corporal, ganancia de peso corporal, consumo de alimento y relación de conversión del pienso) por gallinero (unidad replicada) desde 1 día a 42 días de vida. Para el cálculo de la ganancia de peso corporal por pollo de corral, se utilizó la siguiente fórmula:

Ganancia de peso promedio por ave para cada período ^ F - S (corregido según la ganancia de peso de pollos muertos o desechados)

F - peso promedio de las aves vivas en el gallinero el día de la ponderación

S - peso promedio de las aves vivas en el gallinero en la ponderación previa

Se calcula el consumo de pienso (corregido para el pienso dispersado) utilizando la siguiente fórmula:

Se estima la relación de conversión del pienso utilizando la siguiente fórmula:

Análisis estadístico

Se llevó a cabo el análisis estadístico de los datos experimentales con el programa de estadísticas SAS. Los datos se presentan como las medias ± desviación típica (DT). Se evaluaron las diferencias significativas entre las medias (P<0,05) con el ensayo LSD.

Resultados

Desarrollo de peso corporal

La tasa de crecimiento de todos los grupos estuvo dentro del rendimiento normal que dio el criador. Los detalles del desarrollo de peso corporal se dan en la Tabla 14 a continuación. Al cabo de 21 días, el peso corporal de las aves que recibieron la combinación AB fue un 2,3 % por encima del control. Si bien el peso corporal del grupo de tratamiento AB mejoró significativamente en comparación con el control sin tratar, la suplementación solamente con los componentes A o B en solitario, no aumentó el peso corporal de las aves hasta el día 21 de vida. Durante el período final del día 21 a 42 días de vida, aumentó esta diferencia del peso corporal entre los tratamientos. Al cabo de 42 días, todos los grupos de tratamiento presentaron una mejora significativa del peso corporal en comparación con el control sin tratar. Una suplementación del componente de aceite esencial aumentó el peso corporal en un 3,5 % y el componente B saponina en un 4,3 %, en comparación con el control. La combinación de AB mejoró significativamente el peso corporal en un 5,3 % en comparación con el control y en un 1,9 % en comparación con A.

T l 14: Ef A B AB n l rr ll l r r l l v rr l

Los valores en la misma columna sin ningún superíndice en común son significativamente diferentes (P< 0,05) Consumo de pienso

El consumo de pienso en global de las aves alimentadas en la dieta de inicio y final sin suplementación de A, B o AB ascendió a 3,69 kg por pollo de corral u 88,0 g por ave y día. Por lo que se refiere al peso de mercado a los 42 días de vida, se pudieron mostrar efectos comparables en el consumo de pienso entre los tratamientos A y AB. La suplementación de A y AB de las dietas de control aumentó ligeramente el consumo de alimento global en 52 g y 33 g por ave a lo largo de todo el período. El consumo de pienso de las aves de corral alimentadas con la dieta suplementada sin el componente B saponina, demostró ser significativamente más alto en comparación con el control en un 3 %.

Conversión del pienso

La conversión del pienso global (kg de pienso por kg de ganancia de peso corporal) durante el período de alimentación de 42 días para las aves de corral alimentadas con dietas de inicio y finales sin suplementación de A, B o AB sumó hasta 1,34 g/g. La suplementación del componente B saponina mejoró solo ligeramente la conversión de pienso a 1,32 g/g. El componente A aceite esencial mejoró estadísticamente la tasa de conversión del pienso en un 2,1 %, mientras que la combinación AB mejoró estadísticamente la conversión del pienso en un 4,3% a 1,28 g/g. En comparación con la suplementación con componentes A y B en solitario, la combinación AB mejoró estadísticamente la conversión del pienso en un 2,2 % y 2,8 %, respectivamente.

T l 1 : Ef ^ A B AB n l r n imi n r iv l v rr l 1 42 í vi

Los valores en la misma columna sin ningún superíndice en común son significativamente diferentes (P< 0,05).

Conclusión

De los resultados, se puede concluir que la combinación del componente A aceite esencial y el componente B saponina presentaron efectos estadísticamente positivos en el rendimiento de los pollos de corral durante el período global de 42 días de vida. La eficacia se centró principalmente en la reducción de la cantidad de pienso por kg de ganancia de peso corporal. Este efecto fue estadísticamente más alto que si se suplementaran los componentes A y B en solitario lo cual indica un efecto sinérgico para la combinación AB.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición de aditivo de pienso de aves de corral que es una mezcla fluida de compuestos fitogénicos que comprenden al menos

a. un componente de aceite que es aceite esencial de tomillo microencapsulado, y

b. un componente de saponina que es corteza de Quillaja en polvo seca en partículas que contiene saponina, conteniendo dicha mezcla al menos 0,5 % de componente saponina (p/p) y el componente de aceite en una relación eficaz de al menos 0,2:1 (p/p, componente de aceite por componente de saponina), para mejorar la eficiencia de conversión del pienso en producción de aves de corral sin antibióticos.

2. El uso de la reivindicación 1, donde la relación eficaz está en el intervalo de 0,2:1 - 10:1, preferentemente en el intervalo 1:1 a 5:1, preferentemente en el intervalo 2:1 a 4:1.

3. El uso de la reivindicación 1 o 2, donde la composición comprende el componente de aceite en una cantidad en el intervalo de 0,2 % a 5 % (p/p), y el componente de saponina en una cantidad en el intervalo de 0,5 % a 5,0 % (p/p).

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la corteza de Quillaja en polvo contiene saponina en una cantidad en el intervalo de 3 a 10 % (p/p).

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la composición comprende adicionalmente aceites esenciales adicionales, hierbas secas, especias y excipientes adicionales, incluyendo opcionalmente, agentes de volumen y agentes antiapelmazantes.

6. El uso de la reivindicación 5, donde el aceite esencial adicional es aceite de anís estrellado.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el componente de aceite se prepara por secado por pulverización o una emulsión o/w del aceite de tomillo esencial.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición es una preparación estable en almacenamiento, granulable, con una estabilidad de al menos 18 meses a temperatura ambiente.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde se proporciona la composición en un producto de pienso que comprende la composición a una dosis de al menos 100 mg por kg de producto de pienso, opcionalmente, se proporciona en forma de gránulos.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la mejor conversión del pienso se determina por una mayor digestibilidad ileal de nutrientes o una menor tasa de conversión de pienso.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para mejorar la digestibilidad y rendimiento para engorde o puesta o cría, en el lugar de la puesta.

12. Un método de alimentación de un animal ave de corral con un producto de pienso que comprende la administración de la composición, tal como se utiliza de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con una dieta sin antibiótico, donde dicho pienso da como resultado una mejora de la eficiencia de conversión del pienso.

13. El método según la reivindicación 12, donde dicha mejora da como resultado un aumento de la ganancia de peso diaria promedio, preferentemente de al menos un 2,0 % durante un período de tiempo de 35 días, cuando se dosifica la composición en una cantidad de al menos 100 mg por kg de producto de pienso.

14. El método según la reivindicación 12 o 13, donde dicha mejora da como resultado una disminución de la relación de conversión del pienso, preferentemente, de al menos un 2,5 % durante un período de tiempo de al menos 35 días, cuando se dosifica la composición en una cantidad de al menos 100 mg por kg de producto de pienso.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde dicha mejora comprende resultados en una mayor digestibilidad ileal de proteínas, preferentemente de al menos un 1 % durante un período de tiempo de al menos 35 días, cuando se dosifica la composición en una cantidad de al menos 100 mg por kg de producto de pienso.