BR112021003313A2

BR112021003313A2 - aditivo alimentar para gado, e preparações alimentares comreendendo tal aditivo alimentar

Info

Publication number: BR112021003313A2
Application number: BR112021003313-0A
Authority: BR
Inventors: Andreas Stefan Mueller
Original assignee: Delacon Biotechnik Gmbh
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2021-05-25
Also published as: EP4252542A3; ES2954473T3; BR112021003313A8; EP4252542A2; PL3840588T3; EP3840588B1; CN113056204A; US20210236577A1; EP3840588A1; WO2020039059A1

Abstract

ADITIVO ALIMENTAR PARA GADO, E PREPARAÇÕES ALIMENTARES COMREENDENDO TAL ADITIVO ALIMENTAR. A presente invenção se refere a um aditivo alimentar para gado contendo1,8 cineol, e pelo menos naringina ou betalaína, e um produto alimentar que contenha os mesmos.

Description

1 / 59 “ADITIVO ALIMENTAR PARA GADO, E PREPARAÇÕES ALIMENTARES COMREENDENDO TAL ADITIVO ALIMENTAR”

[001] A invenção se refere a um aditivo alimentar para gado e um respectivo produto alimentar, que mantém a reprodução de animais sob estresse por calor.

HISTÓRICO

[002] Aditivos zootécnicos são comumente usados para melhorar o valor nutricional da dieta de um animal. Esta categoria inclui, entre outras, enzimas e certos fitogênicos. Aditivos fitogênicos (derivados de plantas, naturais, botânicos) para rações são composições bem misturadas de matérias-primas especiais à base de plantas e derivados de plantas e/ou transportadores à base de minerais. Para tanto, podem ser utilizados óleos essenciais e/ou vegetais, bem como uma vasta gama de ervas e especiarias altamente ativas com propriedades aromáticas e apetitosas especiais.

[003] Produtos fitogênicos estão sendo usados como um aditivo zootécnico, desenvolvido para melhorar o desempenho de animais, por exemplo, para melhorar a saúde das aves e/ou para a produção lucrativa de aves, especialmente para engorda e produção de ovos. Os produtos fitogênicos são considerados uma alternativa natural aos produtos sintéticos que os consumidores desejam evitar, incluindo fabricantes de rações, pré-misturadores e produtores de animais.

[004] Na União Europeia, está em curso a revisão do REGULAMENTO (CE) No 1831/2003 DO PARLAMENTO EUROPEU E DO CONSELHO, de 22 de setembro de 2003, relativo aos aditivos destinados à nutrição animal. Atualmente, a legislação define 5 categorias de aditivos para rações para animais mencionados no Artigo 6:

1. Um aditivo alimentar deve ser atribuído a uma ou mais das seguintes categorias, dependendo das suas funções e propriedades, de acordo com o procedimento estabelecido nos artigos 7, 8 e 9: a) aditivos tecnológicos: qualquer substância adicionada à ração para fins tecnológicos; b) aditivos sensoriais: qualquer substância cuja adição à ração melhora ou altera as propriedades organolépticas da ração ou as características visuais dos .

2 / 59 alimentos derivados de animais; (c) aditivos nutricionais; d) aditivos zootécnicos: qualquer aditivo utilizado para afetar favoravelmente o desempenho dos animais saudáveis ou para afetar favoravelmente o ambiente; (e) coccidiostáticos e histomonostáticos.

[005] No regulamento revisto, está prevista a introdução de uma nova subcategoria de (d), dedicada a aditivos alimentares que melhoram o bem-estar de animais.

[006] Devido ao crescimento dramático da população mundial, atualmente estimada em cerca de 10 bilhões de pessoas em 2050, a demanda por alimentos derivados de animais aumentará 40% na base atual. A maior parte de ambos, o aumento da população e a demanda por proteínas, ocorrerá nos países em processo de industrialização na Ásia, África e América Latina. Muitos desses países têm um clima tropical quente e úmido.

[007] Sob essas condições climáticas, a criação intensiva de espécies de gado sofre de estresse por calor.

[008] Por exemplo, em aves, os sintomas típicos de estresse por calor são refletidos pelos seguintes sinais i. Redução do consumo de ração e aumento do consumo de água ii. Movimento reduzido e postura iii. Taxa de respiração fortemente aumentada (até 250 suspiros/min) e respiração ofegante para estimular a perda de calor por evaporação iv. Alcalose respiratória por diminuição da pressão parcial de CO2 no sangue v. Aumento drástico da atividade mitocondrial (= taxa metabólica total) para esses mecanismos de compensação vi. A uma umidade relativa > 50%, o resfriamento por evaporação é quase inviável, resultando em aumento da morbidade e mortalidade

[009] Na literatura mais recente, a diminuição do desempenho e o aumento da morbidade geral estão relacionados a danos à integridade da barreira intestinal em animais sob estresse por calor. A barreira intestinal é composta por várias camadas .

3 / 59 que fornecem proteção contra invasão microbiana. O lúmen intestinal contém peptídeos antimicrobianos (AMPs), imunoglobulina A secretada (IgA) e bactérias comensais, que inibem a colonização de patógenos por inibição competitiva e produção de, por exemplo, butirato, que possui propriedades protetoras de barreira. Uma camada de muco cobre a superfície intestinal, fornecendo uma barreira física. A camada epitelial consiste de uma única camada de células epiteliais que é selada por pequenas proteínas de membrana, conhecidas como proteínas de junção estreita, como claudinas, ocludinas e zona ocludente (ZO1), impedindo a passagem paracelular de moléculas nocivas e patógenos. Esta camada também abriga linfócitos intraepiteliais, células M, células caliciformes produtoras de muco e células de Paneth produtoras de bacteriocina. A lâmina própria contém um grande número de células imunológicas, tanto do sistema imunológico inato quanto do sistema imunológico adaptativo. Uma figura esquemática da barreira intestinal e dos fatores que afetam é descrita por König et al. 2016.

[010] Supõe-se que sob condições de estresse por calor, em particular as proteínas de junção estreita são danificadas, resultando em uma maior exposição do organismo a bactérias patogênicas, seus lipopolissacarídeos pró-inflamatórios da parede celular e a outras noxas tóxicas (König et al. 2016).

[011] Pearce et al. (2013 A) descrevem um aumento dos níveis de endotoxina sérica e um aumento da expressão da proteína de choque térmico intestinal em porcos em crescimento, que são expostos ao estresse por calor. Sob estresse por calor, no nível celular, podem ser observados níveis elevados de proteínas de choque térmico (HSPs). HSPs são companheiras moleculares que medeiam a citoproteção, mantendo o enovelamento adequado da proteína, liberando sinais de sobrevivência e preservando a integridade do citoesqueleto. Pearce et al. (2013 A) indicam que as HSPs desempenham um papel crucial na manutenção da localização de proteínas de junção estreita (TJ). A fim de compensar a perda de moléculas de junção estreita irreversivelmente danificadas, uma regulação positiva de sua expressão gênica e proteica é observada sob estresse por calor. Assim, qualquer dano à função de barreira intestinal é acompanhado por um prejuízo substancial do bem-estar, saúde e .

4 / 59 desempenho do animal.

[012] Os defeitos na barreira intestinal são mensuráveis por uma resistência elétrica transepitelial reduzida (TEER) ou uma permeabilidade aumentada para moléculas grandes, como Isotiocianato de Fluoresceína Dextrano (FITC Dextrano) (Pearce et al. 2013 B).

[013] Frutas cítricas, incluindo laranjas, toranjas, limões, limas, tangerinas e mandarinas, pertencem às frutas mais comumente cultivadas. A produção global está aumentando anualmente para atender às crescentes demandas do consumidor. A indústria de processamento de frutas cítricas produz enormes quantidades de resíduos. Os resíduos da casca dos cítricos representam quase 50% da massa úmida da fruta. Resíduos cítricos são de alto valor econômico, pois contêm abundantemente vários flavonoides, carotenoides, fibra alimentar, açúcares, polifenóis, óleos essenciais e ácido ascórbico, bem como quantidades consideráveis de alguns oligoelementos (Sharma et al. 2017). As frutas cítricas contêm quantidades individuais de flavonoides. Enquanto o flavonoide Naringina de sabor amargo está predominantemente contido na polpa e nas cascas de toranjas e pomelos, a hesperidina é o flavonoide predominante de laranjas e limões. Ambos os flavonoides ocorrem nas frutas cítricas mencionadas tanto como glicosídeos (hesperidina e naringina), e como suas respectivas agliconas hesperitina e naringenina (Suntar et al. 2018).

[014] Uma visão geral dos principais flavonoides contidos em frutas cítricas é fornecida no esquema a seguir (esquema 1 de Suntar et al. 2018): .

5 / 59 Flavonoides Flavanonas Flavonas Flavonóis Hesperetina: R1 = OH; R2 = OH; R3 = OCH3 Apigenina: R1 = H; R2 = OH Kampferol: R1 = H Naringenina: R1 = OH; R2 = H; R3 = OH Luteolina: R1 = OH; R2 = OH Quercetina: R1 = OH Hesperidina: R1 = O-rutinoside; R2 = OH; R3 = Diosmetina: R1 = OH; R2 = OCH3 OCH3 Neohesperidina: R1 = O-rutinoside; R2 = OH; R3 = OCH3 Narirutina: R1 = O-rutinoside; R1 = H; R3 = OH Naringina: R1 = O-neohesperidose; R2 = H; R3 =

OH Polimetoxiflavonas Nobiletina : Tangeretin a: ESQUEMA 1: Estruturas químicas dos principais flavonoides contidos em C. aurantium.

[015] Para a hesperidina e a hesperitina, pode ser demonstrado nas células CaCo2 que a aglicona hesperitina é eficientemente absorvida pelos enterócitos do intestino delgado. Posteriormente, os conjugados de hersperitina livre ou hesperitina podem entrar na circulação sanguínea. O glicosídeo hesperidina é predominantemente clivado no intestino grosso para rutinose e hesperitina, que podem entrar nos colonócitos e na circulação sanguínea conforme descrito acima. O metabolismo e a absorção de hesperidina e hesperitina são bem conhecidos (Brand et al. 2008).

[016] Em geral, os flavonoides são conhecidos por mediar a citoproteção, .

6 / 59 regulando positivamente o sistema enzimático antioxidante endógeno. Para ambos, Hesperidina e Naringina, uma regulação positiva de enzimas antioxidantes dependendo do fator de transcrição Nrf2 como regulador mestre pode ser demonstrada (Zhu et al. 2017, Chen et al.).

[017] A naringina suportou o início de mecanismos de reparo miocárdico em ratos expostos ao estresse isquêmico, por meio da regulação positiva das proteínas de choque térmico (Rani et al. 2013). Para hesperidina quimicamente purificada aplicada no nível dietético de 20 mg/kg de dieta, sozinha ou em combinação com genisteína para frangos de corte sob estresse por calor, uma regulação diferencial da proteína de choque térmico 70 no músculo do peito pode ser observada (Kamboh et al. 2013). No entanto, os resultados deste estudo são duvidosos, uma vez que a aplicação de hesperidina regulou negativamente a expressão da proteína de choque térmico 70. Em contraste, uma regulação positiva da resposta ao choque térmico por substâncias específicas indicaria um suporte de mecanismos de reparo.

[018] Para ambas, hesperidina e naringina, foi demonstrado em monocamadas de células CaCo2, que elas mantêm a integridade da barreira intestinal sob condições não desafiadas (Noda et al. 2012). Nenhuma informação está disponível até o momento sobre os efeitos protetores dos flavonoides cítricos e, em particular, da naringina na proteção da função de barreira intestinal em condições de estresse por calor.

[019] A família Lamiaceae, uma das famílias de ervas mais importantes, incorpora uma grande variedade de plantas com aplicações biológicas e médicas. Os membros mais conhecidos desta família são uma variedade de especiarias aromáticas como tomilho, menta, orégano, manjericão, sálvia, segurelha, alecrim, brunéla, hissopo, erva-cidreira e alguns outros de uso mais limitado.

[020] Origanum Genus. Origanum é um gênero de herbáceas perenes e subarbustos da família Lamiaceae, nativas da Europa, norte da África e também em zonas temperadas da Ásia. Algumas espécies também são naturalizadas na América do Norte e outras regiões. As plantas apresentam folhas fortemente aromáticas e flores tubulares abundantes com brácteas coloridas de longa duração. O gênero .

7 / 59 contém Origanum vulgare L. ou manjerona comum e Origanum majorana L. ou manjerona doce.

[021] Origanum vulgare. O. vulgare é uma planta perene aromática de base lenhosa, nativa das encostas pedregosas e regiões montanhosas rochosas na área do Mediterrâneo (Portugal e Andaluzia), Europa (incluindo as Ilhas Britânicas) e sul e centro da Ásia. Os principais compostos (terpenos) contidos no óleo de Origanum são carvacrol (até 70%), terpinen-4-ol (26%), cis-sabineno (13,3%), o-cimeno (9,3%), γ- terpineno (5,8%), trans-sabineno (5,7%), p-ment-1-en-8-ol (5,1%), b-tujeno (4,9%), e α-terpineno (3,5%).

[022] Na medicina popular tradicional, Origanum era usado para tratar várias doenças. Os efeitos benéficos relatados, incluem propriedades antiespasmódicas, antimicrobianas e de melhora digestiva.

[023] Thymus Genus. O gênero Thymus, como parte da família Lamiaceae, consiste de mais de 350 espécies de plantas aromáticas com folhas perenes. Geograficamente, essas plantas se estendem pela Ásia, Norte da África e Europa. Embora mais de uma espécie seja cultivada para uso culinário ou ornamental, a espécie mais amplamente estudada é a Thymus vulgaris (Tomilho). Usado por milhares de anos na medicina tradicional, as espécies de Thymus possuem um amplo espectro de propriedades terapêuticas, incluindo efeitos antimicrobianos, antiinflamatórios e até anticancerígenos por seu conteúdo de apigenina.

[024] Thymus vulgaris. AS análises de GC-MS e GC-FID revelaram que os principais componentes ativos em um tipo de óleo essencial de Thymus vulgaris L. são timol (41,0%), geraniol (26,4%), tujanol (42,2% hidrato de cis-sabineno e 7,3% hidrato de trans-sabineno) e linalol (72,5%). Outros também contêm borneol e carvacrol. O quimiotipo do tomilho é determinado com base na composição do óleo. A procedência geográfica e o clima influenciam o quimiotipo e a composição, o que foi demonstrado em um estudo comparando óleos essenciais de duas regiões da França (quimiotipo linalol com 76,2% linalol e quimiotipo timol com 47,1% timol) e duas regiões da Sérvia (quimiotipo geraniol com 59,8 % geraniol e quimiotipo de hidrato de sabineno com 30,8% de hidrato de cis-sabineno). Timol (2-isopropil-5-metilfenol) e 5- .

8 / 59 eugenol (4-alil-2-metoxifenol) são terpenoides de T. vulgaris que demonstraram revelar efeitos anestésicos. Além disso, o timol demonstrou inibir a síntese de vitamina K, levando ao seu uso potencial como anticoagulante. T. vulgaris também possui características espasmolíticas, antimicrobianas, antiinflamatórias, imunomoduladoras e antioxidantes, efeitos esses atribuídos ao timol contido no óleo volátil de tomilho. Vários estudos confirmaram os efeitos benéficos da T. vulgaris em patologia respiratórias por suas características espasmolíticas e mucolíticas. Outros estudos indicaram seu potencial promissor no tratamento de patologias gastrointestinais em modelos animais sem exercer qualquer potencial tóxico.

[025] Rosmarinus Genus. Na família Lamiaceae, o Rosmarinus é um gênero de ervas lenhosas e perenes com folhas perenes perfumadas em forma de agulha nativas da Bacia do Mediterrâneo.

[026] Rosmarinus officinalis. Rosmarinus officinalis L., comumente chamada de alecrim, é uma erva arbustiva mediterrânea e amplamente difundida em países europeus, americanos e asiáticos. É uma especiaria comum usada em todo o mundo para fins culinários, medicinais e comerciais na indústria de fragrâncias e alimentos. As folhas de alecrim (frescas ou secas) são utilizadas por seu aroma característico na culinária ou consumidas em pequenas quantidades como chá de ervas, enquanto os extratos de alecrim são utilizados por suas propriedades antioxidantes para melhorar a vida útil de alimentos perecíveis. Recentemente, os extratos de alecrim (E392) foram aprovados como um antioxidante natural seguro e eficaz para a preservação de alimentos pela União Europeia. Estudos fitoquímicos revelaram que as folhas contêm 0,5% a 2,5% de óleo volátil. Os principais componentes do óleo de alecrim incluem hidrocarbonetos monoterpênicos (alfa e beta pineno), canfeno, limoneno, cânfora (10% a 20%), borneol, cineol, linalol e verbinol. O alecrim contém uma ampla variedade de componentes voláteis e aromáticos. Os flavonoides da planta incluem diosmetina, diosmina, genkwanina, luteolina, hispidulina e apigenina. Além disso, os componentes terpenoides do alecrim contém os triterpenos oleanólicos e ácido ursólico e o diterpeno carnosol. Os fenóis do alecrim incluem o ácido cafeico, - clorogênico, - labiático, - neoclorogênico e rosmarínico. O alecrim contém grandes .

9 / 59 quantidades de salicilatos. Estudos farmacológicos recentes indicaram que o alecrim e seus constituintes, especialmente derivados do ácido cafeico, como o ácido rosmarínico, têm vários usos tradicionais na etnomedicina, incluindo efeitos analgésicos, antiinflamatórios, anticarcinogênicos, anti-reumáticos, espasmolíticos, anti-hepatotóxicos, antiateroscleróticos, carminativos e coleréticos (Uritu et al. 2018).

[027] Hosseini et al. (2018) relataram que uma mistura de cinamaldeído e timol mostrou uma resposta indiferente em frangos de corte com estresse social (estresse de superlotação). Neste estudo, foi usada uma mistura de óleo de tomilho com cinamaldeído. Outro estudo em frangos de corte relatou efeitos benéficos do óleo de tomilho na integridade intestinal (Placha et al. 2014). Os efeitos positivos do tomilho na resiliência geral dos animais às condições de estresse podem derivar de seu potencial para induzir a resposta antioxidante endógena por meio da via Nrf2 (Kluth et al. 2007, FangFang et al. 2018). Uma situação semelhante existe também para o orégano. Zou et al. (2016, (B)) relataram que em porcos o óleo essencial de orégano contribuiu para uma melhora da morfologia intestinal e da expressão da proteína de junção estreita, ligada a alterações na microflora intestinal. Tanto in vivo quanto in vitro, o carvacrol, o principal terpeno do óleo de orégano, demonstrou suportar a indução da proteína de choque térmico como um disparador da resposta das células T (Wieten et al. 2010). Conforme relatado de forma semelhante para tomilho e timol parte do antioxidante, os efeitos do orégano podem ser desencadeados por meio da indução da via Nrf2 (Zou et al. 2016 (A)).

[028] Para o alecrim, existe apenas um estudo na literatura atual no contexto do estresse por calor. Türk et al. (2016) relataram que alimentar com óleo de alecrim em concentrações muito altas, mas não econômicas, de 125 e 250 g/t de ração completa, reduziu a peroxidação lipídica nos testículos de codornas, reduzindo assim as falhas reprodutivas.

[029] Na nutrição animal, as estratégias comumente praticadas para amenizar os efeitos adversos do estresse por calor na saúde e no desempenho dos animais incluem o uso de: • Vitaminas antioxidantes, em particular a vitamina C .

10 / 59 • Substâncias tampão e eletrólitos, para compensar perdas e alcalose • Betaína sintética (N, N, N-trimetilamônioacetato), um doador de metila que auxilia em particular no metabolismo da vitamina B12 e ácido fólico, bem como no metabolismo da metionina.

[030] A betaína é dosada rotineiramente em níveis de 0,5 a 1,0 kg/t de ração.

[031] O uso de betaína na indústria avícola para lidar com o problema de estresse por calor é revisado por Saeed et al. (2017). Mais estudos precisam ser conduzidos na base genética e molecular para elucidar o mecanismo por trás da betaína como um agente antitérmico natural para diminuir o problema de estresse por calor na indústria avícola.

[032] Betalaínas são uma classe de pigmentos derivados do indol vermelho e amarelo encontrados em plantas de Caryophyllales, como barbárie, onde substituem os pigmentos de antocianina. Betalaínas também ocorrem em alguns fungos de ordem superior, como o Tricholomopsis rutilans. Elas são mais frequentemente evidentes nas pétalas das flores, mas podem colorir os frutos, folhas, caules e raízes das plantas que as contêm. Incluem pigmentos como os encontrados na beterraba, em particular da raiz da beterraba. O nome "betalaína" vem do nome latino da beterraba comum (Beta vulgaris), da qual as betalaínas foram extraídas pela primeira vez. A cor vermelho profundo da beterraba, buganvílias, amaranto e muitos cactos resulta da presença de pigmentos de betalaína. Os tons particulares de vermelho a roxo são distintos e diferentes dos pigmentos de antocianina encontrados na maioria das plantas.

[033] Existem duas categorias de betalaínas:

1. As betacianinas incluem os pigmentos de betalaína avermelhados a violeta. Entre as betacianinas presentes nas plantas estão a betanina, isobetanina, probetanina e neobetanina.

2. As betaxantinas são aqueles pigmentos de betaína que aparecem de amarelo a laranja. Entre as betaxantinas presentes nas plantas estão a vulgaxantina, a miraxantina, a portulaxantina e a indicaxantina.

[034] A betanina é uma betalaína, também chamada de vermelho beterraba, .

11 / 59 porque pode ser extraída das raízes da beterraba vermelha.

[035] As betalaínas demonstraram manifestar antioxidantes diretamente em comparação com o potencial antioxidante do Trolox® ou pela indução de enzimas antioxidantes e desintoxicantes por meio da via nrf2 (Lee et al. 2005, Esatbeyouglu et al. 2015).

[036] AU2005229753A1 divulga composições botânicas para uma saúde ótima e prevenção de doenças por meio do fornecimento de nutrientes, melhorando assim uma grande variedade de doenças. Uma série de diferentes produtos químicos é divulgada para certos fins. Entre os produtos químicos antifadiga, é mencionado o 1,8-cineol. A lista de produtos químicos antimiorrelaxantes divulgada inclui entre outros 1,8-cineol e timol. A lista de produtos químicos antiinflamatórios inclui entre outros 1,8-cineol e naringina.

[037] US4759932 divulga um método para reduzir o estresse por calor em animais adicionando zeólito à ração.

[038] US2008032021A1 divulga um aditivo para ração para aves que contém um óleo essencial derivado de pelo menos de uma erva e uma especiaria e contendo timol e carvacrol como seus ingredientes principais, e pelo menos um ácido orgânico derivado de pelo menos um ácido cítrico, fumárico, fúlvico e húmico.

[039] Maria Miguel fornece uma revisão das betalaínas presentes em algumas espécies da família Amaranthaceae (Maria Miguel 2018).

[040] WO2017037157A1 divulga uma composição de aditivos para ração para aves que é uma mistura fluida de compostos fitogênicos que contendo um óleo essencial de tomilho microencapsulado e saponina contida em pó de casca de quilaia seca particulada, para melhorar a digestibilidade e o desempenho para engorda ou postura ou reprodução, até o ponto de postura.

[041] Há uma necessidade de melhores alimentos para o gado, que permita uma melhor reprodução sob estresse por calor, contribuindo para o bem-estar dos animais.

RESUMO DA INVENÇÃO

[042] O objeto da presente invenção é fornecer um novo aditivo ou produto .

12 / 59 alimentar para gado com componentes específicos para melhorar a resistência do animal ao estresse por calor durante a reprodução.

[043] O objeto é resolvido pelo assunto, conforme reivindicado.

[044] De acordo com a invenção, existe um aditivo fornecido para ração de gado que contém 1,8-cineol e pelo menos naringina ou betalaína.

[045] Especificamente, o aditivo para ração de gado contém pelo menos 1,5% de 1,8 cineol (p/p) e pelo menos naringina ou betalaína.

[046] Especificamente, o aditivo alimentar contém pelo menos 2% de 1,8- cineol (p/p), de preferência até 5,5% ou até 6% (p/p).

[047] Especificamente, o aditivo alimentar contém pelo menos 3% de naringina (p/p), de preferência até 6% (p/p), e/ou pelo menos 0,1% de betalaína (p/p), de preferência até 3% (p/p).

[048] Especificamente, o aditivo alimentar contém a) 1,8 cineol e naringina a uma proporção de pelo menos 0,2:1 (p/p); e/ou b) 1,8 cineol e betalaína a uma proporção de pelo menos 4:1 (p/p).

[049] Especificamente, a proporção de 1,8 cineol por naringina é pelo menos qualquer uma de 0,125:1; 0,2:1; 0,25:1; 0,5:1; 0,75:1; 1:1; 1,25:1, de preferência até 1,5:1 (p/p). Uma proporção preferida de 1,8 cineol por naringina é na faixa de 0,5:1 – 1,5:1 (p/p) ou 0,5:1 – 1:1 (p/p).

[050] Especificamente, a proporção de 1,8 cineol por betalaína é pelo menos qualquer uma de 4:1, 5:1, 6:1; 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 15:1, 20:1, 22:1, 25:1, 30:1, 33:1, 35:1, 40:1, 44:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, de preferência até 64:1 (p/p). Uma proporção preferida de 1,8 cineol por betalaína é na faixa de 10:1 – 30:1 (p/p).

[051] Especificamente, o 1,8 cineol é fornecido como um componente 1,8 cineol do aditivo alimentar.

[052] Especificamente, a naringina é fornecida como um componente de naringina do aditivo alimentar.

[053] Especificamente, a betalaína é fornecida como um componente de betalaína do aditivo alimentar.

[054] Especificamente, o aditivo alimentar contém componentes contendo 1,8 .

13 / 59 cineol e pelo menos um de um componente contendo naringina ou um componente contendo betalaína, cujos componentes são fitogênicos.

[055] Especificamente, o 1,8 cineol é fornecido como um composto puro ou purificado, ou como óleo essencial de plantas aromáticas contendo 1,8 cineol, como um óleo essencial natural ou nativo de plantas como da família Lamiaceae, por exemplo, de especiarias aromáticas como tomilho, hortelã, orégano, manjericão, sálvia, segurelha, alecrim, brunéla, hissopo, erva-cidreira, mas também de louro de cânfora, folhas de louro, melaleuca, absinto de manjericão doce, alecrim, sálvia comum ou Cannabis sativa. De acordo com modalidades específicas, óleos essenciais idênticos à natureza de qualquer uma das espécies de plantas mencionadas acima, ou composições artificiais contendo 1,8 cineol purificado ou puro, são usados como fontes de 1,8 cineol.

[056] Especificamente, o 1,8 cineol é composto por um óleo essencial, ou não essencial, de preferência de plantas lamiaceae, preferivelmente do rosemarinus genus. Especificamente, o óleo essencial é o óleo essencial de alecrim.

[057] De acordo com uma modalidade específica, o componente de óleo essencial não é microencapsulado. No entanto, de acordo com uma modalidade alternativa, os óleos essenciais microencapsulados podem servir como a fonte de 1,8 cineol. Especificamente, o óleo essencial que contém 1,8 cineol é microencapsulado.

[058] Especificamente, a naringina é fornecida como um composto puro ou purificado, ou como produto vegetal contendo flavonoides, como flavonoides cítricos contendo produtos originários de plantas cítricas.

[059] Especificamente, a naringina é constituída por material vegetal cítrico, de preferência de laranja ou toranja, em particular de cascas ou bagaços de frutas cítricas.

[060] Especificamente, a betalaína é fornecida como um composto puro ou purificado, ou como produto vegetal contendo pigmentos de betalaína, como originários da beterraba. Especificamente, a betalaína é qualquer uma ou mais entre betanina, isobetanina, probetanina e neobetanina. Especificamente, a betalaína é de raízes de beterraba vermelha.

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14 / 59

[061] Especificamente, a betalaína é composta por material biológico de plantas da ordem Caryophyllales, de preferência da família Amaranthaceae, de preferência de beta vulgaris, raiz de beterraba ou barbárie, ou de fungos (por exemplo, Tricholomopsis rutilans).

[062] Normalmente, o aditivo alimentar contém os componentes 1,8 cineol e naringina e/ou betalaína em uma quantidade padronizada e na forma concentrada.

[063] Especificamente, o aditivo alimentar contém ou consiste de uma mistura fluida de compostos fitogênicos e, opcionalmente, contém ainda agentes auxiliares ou excipientes.

[064] Especificamente, o aditivo alimentar contém ou consiste de uma mistura fluida que contém compostos fitogênicos. Especificamente, esses compostos fitogênicos são selecionados do grupo que consiste de óleos essenciais, carboidratos, ervas secas, especiarias. Especificamente, a mistura conhecível contém ainda qualquer um ou mais dos agentes de volume, agentes antiaglomerantes ou outros excipientes.

[065] Especificamente, o aditivo alimentar contém ainda um ou mais dos óleos essenciais, que são opcionalmente microencapsulados, ou na forma livre, ervas secas, especiarias, carboidratos, agentes de volume ou antiaglomerantes, ou outros excipientes.

[066] Especificamente, o óleo essencial que contém 1,8 cineol e, opcionalmente, outros óleos essenciais aqui descritos, são produzidos por secagem por pulverização de uma emulsão de óleo em água (o/a).

[067] Normalmente, o óleo essencial é homogeneamente misturado com substâncias secas para produzir o aditivo alimentar, que é um óleo seco e fluido em uma mistura ou dispersão sólida (o/s) que pode ser armazenada em temperatura ambiente por um período de tempo prolongado.

[068] Por exemplo, o aditivo alimentar aqui descrito pode ser peletizado como tal, ou junto com outras substâncias nutricionais para ração para produzir um produto alimentar peletizado sem perdas significativas de óleo essencial durante a produção e mesmo após armazenamento a longo prazo. Especificamente, o aditivo alimentar .

15 / 59 ou produto alimentar é fornecido como preparação estável em armazenamento, em pó ou em peletizável ou peletizada, com uma estabilidade de pelo menos 18 meses à temperatura ambiente ou uma temperatura de até 25°C. Após armazenamento prolongado, pelo menos 65% do óleo essencial ainda pode permanecer na ração, de preferência pelo menos 70%.

[069] O aditivo alimentar aqui descrito contém preferivelmente 20-60% (p/p) de ervas secas. Entre as ervas secas preferidas há pós de raiz de angélica, anis, maçã, alcachofra, bálsamo, bérberis, manjericão, folhas de bétula, laranja amarga, groselha preta, amora, mirtilo, cálamo, cássia, cedro, camomila, castanha, cimicifuga, canela, citronela, cravo, tussilagem, centauria menor, urtiga comum, dente de leão, endro, flor de sabugueiro, eucalipto, erva-doce, genciana, gengibre, ginko, semente de uva, sementes de uva, toronja, celidônia maior, chá verde, espinheiro branco, lúpulo, raiz-forte, cavalinha, hissopo, ipeca, limão, erva-cidreira, capim-limão, alcaçuz, ligústica, maca, calêndula, manjerona, alteia, hortelã, visco, artemísia, marapuama, carvalho, folhas de oliveira, laranja, orégano, salsa, passiflora, hortelã-pimenta, agulha de pinheiro, flor-de-cone roxa, psílio, quassia, quebracho, quilaia, folhas de framboesa, tanchagem, rosa, alecrim, arruda, cinorródio, cártamo, sálvia, sândalo, segurelha, ginseng siberiano, saponária, erva-de-são-joão, anis estrelado, raiz de taiga, chá, tomilho, tormentil, raiz de valeriana, absinto, milefólio ou casca de yohimbe.

[070] O aditivo alimentar aqui descrito pode conter especiarias secas, por exemplo, 1-15% (p/p), como pimenta da Jamaica, cânfora, alcaravia, cardamomo, pimenta caiena, cravo, coentro, cominho, cúrcuma, feno-grego, alho, zimbro, noz- moscada, cebola, páprica, pimenta ou açafrão da terra.

[071] Outros excipientes podem ser usados que são agentes de volume e antiaglomerantes, por exemplo, em uma quantidade que varia de 20-60% (p/p), fontes orgânicas como farelo de trigo, farelo de arroz ou outros farelos de grãos, amido modificado, lactose ou dextrose e fontes anorgânicas como dióxido de silício, calcário orbentonita.

[072] Especificamente, o aditivo alimentar contém uma saponina fitogênica, tal como contida em pó de casca de quilaia seca particulada, de preferência contendo .

16 / 59 saponina em uma quantidade que varia de 3 a 10% (p/p).

[073] Especificamente, o aditivo alimentar contém ainda pelo menos um óleo essencial contendo carvacrol e/ou timol.

[074] De acordo com uma modalidade específica, o componente de óleo essencial que contém 1,8 cineol também contém carvacrol e/ou timol. Assim, uma mistura de 1,8 cineol, carvacrol e/ou timol pode ser usada.

[075] De acordo com uma outra modalidade específica, uma mistura de óleos essenciais é usada, em que 1,8 cineol é fornecido em um componente de óleo essencial e qualquer um ou ambos de carvacrol ou timol são fornecidos em um componente de óleo essencial adicional.

[076] De preferência, o óleo essencial contendo carvacrol e/ou timol é um extrato vegetal. Fontes adequadas de carvacrol e/ou timol são espécies de plantas aromáticas, como tomilho ou orégano. Especificamente, o aditivo alimentar contém pelo menos 0,05% ou pelo menos 0,1% de carvacrol (p/p) e/ou pelo menos 0,05% ou pelo menos 0,1% de timol (p/p).

[077] Especificamente, os óleos essenciais estão contidos no aditivo alimentar aqui descrito em uma quantia variando de 4% a 16% (p/p) no total.

[078] Especificamente, os óleos essenciais usados no aditivo alimentar aqui descrito são fornecidos como extrato de óleo essencial de material vegetal.

[079] Especificamente, o aditivo alimentar é fornecido como uma preparação seca peletizada ou peletizável, estável em armazenamento, com uma estabilidade de pelo menos 18 meses em temperatura ambiente.

[080] Especificamente, o aditivo alimentar é usado para preparar um produto alimentar incluindo o dito aditivo alimentar, por exemplo, por mistura com nutrientes e/ou excipientes. Especificamente, o aditivo alimentar é fornecido em uma preparação para uso na preparação de um produto alimentar para aves, suínos ou ruminantes.

[081] A invenção fornece ainda um produto alimentar que contém o aditivo alimentar aqui descrito. Especificamente, o produto alimentar contém 1,8 cineol a uma concentração de pelo menos 5 mg/kg ou pelo menos 6 mg/kg. Os limites superiores preferidos de 1,8 cineol são qualquer um de 20, 12 ou 10 mg/kg.

.

17 / 59

[082] Especificamente, o produto alimentar contém 1,8 cineol a uma concentração na faixa de 5-20 mg/kg, ou 6-18 mg/kg, ou 6-12 mg/kg, em particular cerca de (+/-2 mg) 10 mg/kg.

[083] Especificamente, o produto alimentar contém naringina a uma concentração de pelo menos 5 ou 10 mg/kg, ou pelo menos 11 ou 12 mg/kg. Os limites superiores preferidos de naringina são qualquer um de 30, 24 ou 18 mg/kg.

[084] Especificamente, o produto alimentar contém naringina a uma concentração na faixa de 5-25 mg/kg, ou 12-30 mg/kg, em particular cerca de (+/-2 mg) 15 mg/kg.

[085] Especificamente, o produto alimentar contém betalaína a uma concentração de pelo menos 0,2 ou 0,3 mg/kg, ou pelo menos 0,4 ou 0,5 mg/kg. Os limites superiores preferidos de betalaína são qualquer um de 2,4, 1,2 ou 0,6 mg/kg.

[086] Especificamente, o produto alimentar contém betalaína a uma concentração na faixa de 0,2-2,0 mg/kg, ou 0,5-1,8 mg/kg, em particular cerca de (+/- 0,21 mg) 1,7 mg/kg.

[087] Especificamente, o produto alimentar é livre de antibióticos.

[088] De acordo com uma modalidade específica, o produto alimentar contém o aditivo alimentar a uma dose de pelo menos qualquer um de 100, 150, 200, 250, 300, 400 ou 500 g/t (grama de aditivo por tonelada de produto alimentar), de preferência dentro na faixa de 100-1000 g/t, ou 200-500 g/t, por exemplo, até 750 mg/kg, ou até 400 mg/kg do produto alimentar, ou em particular 400 g/t ou 500 g/t.

[089] Especificamente, o produto alimentar é fornecido como uma pré-mistura para produzir ração completa (usada como dieta completa), ou uma ração completa, não requerendo mais nutrientes. Especificamente, uma dosagem (concentração) preferida do aditivo alimentar varia de 200 a 500 mg/kg, ou varia de 200 a 400 mg/kg de ração completa.

[090] Por exemplo, o aditivo alimentar é misturado a um material alimentar, por exemplo, grãos triturados, subprodutos da produção de álcool com base em grãos, sementes oleaginosas como colza, linhaça, soja e subprodutos da produção de óleo como farelo de soja, farinha de colza, torta de colza, farinha de linhaça, torta de linhaça .

18 / 59 ou subproduto da indústria de processamento de peixe e carne, como farinha de peixe, farinha de carne, farinha de carne e ossos, farinha de penas, farinha de sangue e proteínas hidrolisadas derivadas de animais e pré-misturas minerais, e preferivelmente peletizadas.

[091] Especificamente, o produto alimentar é fornecido na forma peletizada.

[092] O aditivo alimentar ou produto alimentar aqui descrito é preferencialmente peletizado por um processo de compressão ou moldagem do material na forma de grânulos.

[093] De acordo com um aspecto específico, o aditivo alimentar ou o produto alimentar aqui descrito são usados para criação de gado.

[094] Especificamente, o aditivo alimentar ou o produto alimentar aqui descrito é usado para criação de gado que está em risco de ou sofrendo de estresse por calor.

[095] De acordo com um aspecto específico, o aditivo alimentar ou produto alimentar aqui descrito é usado para conversão alimentar aprimorada no gado. Especificamente, a conversão alimentar melhorada é determinada por uma digestibilidade de nutrientes aumentada ou uma taxa de conversão alimentar diminuída, por exemplo, conforme determinado pelos respectivo modelos in vitro ou in vivo.

[096] Especificamente, o aditivo alimentar ou produto alimentar aqui descrito é usado como melhorador de digestibilidade e desempenho, por exemplo, de acordo com a definição do Regulamento (CE) 1831/2003, em aves para engorda ou postura ou reprodução, até o ponto de postura.

[097] De acordo com um aspecto específico, a invenção prevê um método de criação de gado em risco de ou sofrendo de estresse por calor, incluindo fornecer o produto alimentar aqui descrito.

[098] De acordo com um aspecto específico, é fornecido ainda um método de alimentação de animal de criação com o produto alimentar aqui descrito, em que a dita ração resulta em uma melhoria em uma ou mais das características biofísicas do dito animal, quando comparada ao uso equivalente de um produto alimentar que não contém o aditivo alimentar aqui descrito, em particular em que o animal é exposto a .

19 / 59 estresse por calor durante um período de pelo menos 7 ou 14 dias (dias consecutivos ou no total durante o período de criação). O estresse por calor é aqui entendido como uma condição resultante de temperaturas elevadas do ambiente de procriação, normalmente em que a temperatura é de 28 a 35°C durante o dia e de 22 a 28°C durante a noite.

[099] Especificamente, a dita alimentação resulta em uma melhoria da eficiência da conversão alimentar. Normalmente, a dita melhoria é um aumento no ganho de peso diário (médio), de preferência de pelo menos 1,0% ou pelo menos 2,0%, ao longo de um período de 35 dias, quando a composição é dosada em uma quantidade de pelo menos 100 ou 200 mg por kg de produto alimentar.

[100] Em especial, a dita alimentação resulta em uma eficácia de desempenho de crescimento mais elevada do que a betaína comercialmente usada.

[101] Especificamente, a dita melhoria resulta em uma diminuição na taxa de conversão alimentar, de preferência de pelo menos 1,5% ou 2%, ao longo de um período de pelo menos 35 dias, quando a composição é dosada em uma quantidade de pelo menos 100 ou 200 mg por kg de produto alimentar.

[102] Especificamente, a dita melhoria resulta em um aumento da digestibilidade da proteína, de preferência de pelo menos 1% ao longo de um período de pelo menos 35 dias, quando a composição é dosada em uma quantidade de pelo menos 100 ou 200 mg por kg de produto alimentar. Uma faixa de dose exemplar para o aditivo é 200-400 mg/kg de ração ou 200-500 mg/kg de ração.

[103] O modo de ação muito específico do componente 1,8 cineol em combinação com o componente naringina ou o componente betalaína do aditivo alimentar aqui descrito permite a formulação de aditivos alimentares fitogênicos, produtos alimentares e respectivos alimentos visando a manutenção da função da barreira intestinal, e com ele o bem-estar, saúde e desempenho animal dos animais.

[104] Em particular, o aditivo alimentar é um aditivo alimentar fitogênico para aves domésticas que contribui para a manutenção do bem-estar dos animais na avicultura, como por exemplo, frango (frangos ou poedeiras) ou peru), porcos ou ruminantes.

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[105] Especificamente, o aditivo alimentar ou produto alimentar aqui descrito é indicado para reprodução em condições de estresse por calor, visando: ▪ Melhoria de desempenho e/ou ▪ Melhoria da resposta ao choque térmico e/ou ▪ Melhoria da integridade da barreira intestinal.

[106] Portanto, a presente invenção é baseada nas descobertas surpreendentes sobre os efeitos dos óleos essenciais de lamiaceae, como uma mistura de óleo de lamiaceae (por exemplo, uma mistura de óleos de uma ou mais fontes de plantas ou espécies) em combinação com naringina ou betalaína no regulação das proteínas de choque térmico nas células intestinais, resposta ao choque térmico e preservação da função de barreira intestinal em animais expostos ao estresse por calor.

FIGURAS

[107] Fig. 1: A, B, C, D, E: Teste I: Extensão do tempo de vida em C. elegans sob estresse por calor por substâncias de referência (Ácido ascórbico, Betaína) e compostos "A", "B" e "C".

[108] Fig. 2: F, G, H, I, J, K: Teste I: Exemplo comparativo: Extensão do tempo de vida em C. elegans sob estresse por calor por outras substâncias, frequentemente recomendadas para diminuir as consequências negativas do estresse por calor (Piperina, Capsaicina, Gingerol, Óleo de eucalipto, Óleo de hortelã, Eugenol).

[109] Fig. 3: Teste II: Indução dose-dependente da resposta ao choque térmico em células CaCo2 sob estresse por calor por A) Betaína (substância de referência), B), C), D) compostos “A”, “B”, “C”; e E) a combinação dos compostos "B" e "C" vs. compostos "B" e "C" sozinhos.

[110] Fig. 4: Teste II: Efeito da betalaína (composto "C") a 1,10 mg/L no desenvolvimento de TEER de culturas de células transwell CaCo2 expostas a estresse por calor a 42°C.

[111] Fig. 5: Teste IV: Efeito da betaína (substância de referência) e do composto “A” no peso corporal nos dias 21 e 42 em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) peso corporal absoluto; B) diferença relativa de betaína .

21 / 59 e composto A para o controle negativo; C) diferença relativa do composto A para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[112] Fig. 6: Teste IV: Efeito da betaína (substância de referência) e do composto “A” no ganho de peso diário nos períodos 0-21d, 22-42d e 0-42d em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) ganho de peso diário absoluto; B) diferença relativa de betaína e composto “A” para controle negativo; C) diferença relativa do composto "A" em comparação com a betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[113] Fig. 7: Teste IV: Efeito da betaína (substância de referência) e do composto “A” na FCR nos períodos 0-21d, 22-42d e 0-42d em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) FCR absoluta; B) em relação ao controle negativo; C) em relação ao controle positivo betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[114] Fig. 8: Teste V: Efeito da betaína (substância de referência) e combinações do composto “A” com diferentes concentrações do composto “B” no peso corporal nos dias 21 e 42 em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) peso corporal absoluto; B) diferença relativa de betaína e combinações dos compostos “A” e “B” para o controle negativo; C) diferença relativa de combinações do composto “A” e “B” para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[115] Fig. 9: Teste V: Efeito da betaína (substância de referência) e combinações do composto "A" com diferentes concentrações do composto "B" no ganho de peso diário nos períodos 0-21d, 22-42d e 0-42d em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) ganho de peso diário absoluto; B) diferença relativa de betaína e combinações dos compostos “A” e “B” para o controle negativo; C) diferença relativa de combinações do composto “A” e “B” para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[116] Fig. 10: Teste V: Efeito da betaína (substância de referência) e combinações do composto "A" com diferentes concentrações do composto "B" na FCR .

22 / 59 nos períodos 0-21d, 22-42d e 0 42d em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) FCR absoluta; B) diferença relativa de betaína e combinações dos compostos “A” e “B” para o controle negativo; C) diferença relativa de combinações do composto “A” e “B” para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[117] Fig. 11: Teste VI: Efeito da betaína (substância de referência) e combinações do composto “B” com o composto “A” ou “C” no peso corporal nos dias 21 e 42 em frangos expostos ao estresse por calor do dia 22 ao dia 42 - A) peso corporal absoluto; B) diferença relativa de betaína e combinações do composto “B” com os compostos “A” ou “C” para o controle negativo; C) combinações de diferença relativa do composto “B” com os compostos “A” ou “C” para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[118] Fig. 12: Teste VI: Efeito da betaína (substância de referência) e combinações do composto "B" com o composto "A" ou "C" no ganho de peso diário nos períodos 0-21d, 22-42d e 0-42d em frangos expostos ao estresse por calor a partir do dia 22 ao dia 42 - A) ganho de peso diário absoluto; B) diferença relativa de betaína e combinações do composto “B” com os compostos “A” ou “C” para o controle negativo; C) combinações de diferença relativa do composto “B” com os compostos “A” ou “C” para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

[119] Fig. 13: Teste VI: Efeito da betaína (substância de referência) e combinações do composto "B" com o composto "A" ou "C" na FCR nos períodos 0- 21d, 22-42d e 0-42d em frangos expostos ao estresse por calor a partir do dia 22 ao dia 42 - A) FCR absoluta; B) diferença relativa de betaína e combinações do composto “B” com os compostos “A” ou “C” para o controle negativo; C) combinações de diferença relativa do composto “B” com os compostos “A” ou “C” para betaína; * a, b, c: letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as médias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[120] Termos específicos usados em toda a especificação têm o seguinte significado.

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[121] O termo "livre de antibióticos", tal como aqui utilizado com relação à dieta de um animal, uma dieta ou um produto alimentar, deve referir-se à alimentação de um animal com um produto alimentar desprovido de antibióticos. Embora o animal possa ter sido tratado com antibióticos mediante prescrição veterinária, a dieta regular não conteria antibióticos adicionais como estimuladores do crescimento. Assim, evita- se o acúmulo de substâncias nocivas como antibióticos e semelhantes em pessoas que consumiram carne ou ovos de aves. As composições como aqui descritas melhoram de forma eficaz a conversão alimentar, substituindo assim os antibióticos em produtos alimentares. Assim, é possível aumentar a produtividade de carnes de boa qualidade.

[122] O termo "características biofísicas" de um animal, como gado ou aves domésticas, é entendido aqui como a função biótica e abiótica de um animal ou população e inclui particularmente os fatores que têm uma influência na sua sobrevivência, desenvolvimento e evolução, em particular incluindo fatores que melhoram a eficiência da conversão alimentar em animais, por exemplo conforme determinado por modelos in vitro ou in vivo. Esses fatores incluem, por exemplo, permeabilidade da membrana intestinal, digestibilidade de nutrientes, digestibilidade de proteínas (ileal), transporte de nutrientes, efeitos antimicrobianos ou antioxidantes.

[123] A "eficiência de conversão alimentar" (FCE), conforme aqui entendida, refere-se especificamente a uma medida da eficiência de um animal na conversão da massa alimentar em massa corporal aumentada (por exemplo, massa muscular ou de ovo). A eficiência pode ser determinada como a taxa de conversão alimentar (FCR), que é a massa do alimento ingerido dividida pelo ganho de massa corporal, ao longo de um período especificado. Por exemplo, um animal alimentado com um aditivo alimentar projetado para melhorar a eficiência da conversão alimentar pode consumir menos comida do que um animal que recebeu ração sem tal aditivo alimentar, produzindo uma quantidade semelhante de carne. Normalmente, a taxa de conversão alimentar das aves está na faixa de 1,2 a 2,5, e a taxa de conversão alimentar dos suínos está na faixa de 1,5 a 3,0, dependendo da raça genética. Uma melhoria (ou seja, uma redução) na taxa de conversão alimentar ou um fator que influencia a .

24 / 59 eficiência da conversão alimentar pode ser determinada, se a taxa de conversão alimentar for aumentada, ou o fator for diminuído, por exemplo, em pelo menos 2%, de preferência pelo menos 2,5%.

[124] Existem fatores diretos que influenciam a eficiência da conversão alimentar, por exemplo, incluindo digestibilidade de nutrientes, digestibilidade de nutrientes ou proteínas (ileal), permeabilidade da membrana intestinal, sistemas de transporte de nutrientes da membrana da borda em escova ou fatores indiretos, como aqueles que melhoram o estado de saúde do animal e reduzem a demanda de energia e proteína para reações imunológicas, incluindo efeitos antimicrobianos.

[125] O termo "permeabilidade da membrana intestinal" é aqui entendido como um fator que determina a absorção intestinal de nutrientes, como por passagem através de uma membrana celular do intestino. Tais características biofísicas podem ser determinadas pelo modelo ex vivo empregando células epiteliais colorretais para testar uma mudança na permeabilidade após o contato com substâncias específicas. O termo "sistemas de transporte de nutrientes" é aqui entendido como um transporte ativo de nutrientes, incluindo, por exemplo, glicose, peptídeos e aminoácidos, do lúmen do intestino delgado através da membrana da borda em escova até os enterócitos. Esses sistemas de transporte de nutrientes são enzimas específicas, incluindo, por exemplo, o transportador de glicose dependente de sódio (SGLT1) e o transportador de pequenos peptídeos e aminoácidos (PEPT1). Tais características biofísicas podem ser determinadas pelo modelo ex vivo empregando células epiteliais colorretais para testar uma mudança na expressão gênica da enzima transportadora SGLT1 após contato com substâncias específicas. O termo "efeitos antimicrobianos", conforme aqui entendido, refere-se aos possíveis efeitos bacteriostáticos de bactérias que são possivelmente patogênicas para animais monogástricos, incluindo aves. Tais características biofísicas podem ser determinadas pelo modelo ex vivo empregando células bacterianas para testar uma mudança no crescimento de células bacterianas em contato com substâncias específicas.

[126] O termo "componente" no que diz respeito a um aditivo alimentar é aqui entendido como uma parte de uma composição, que pode incluir um ou mais outros .

25 / 59 compostos, componentes e excipientes. O aditivo alimentar aqui descrito é uma composição que contém especificamente pelo menos um componente de óleo (essencial) contendo 1,8-cineol como um composto ou um composto ativo, e pelo menos um outro componente incluindo os compostos (ou compostos ativos) naringina e/ou betalaína, mas pode ainda incluir componentes biológicos, principalmente componentes fitogênicos e outros excipientes, incluindo, por exemplo, excipientes anorgânicos.

[127] Especificamente, o componente 1,8-cineol é um óleo essencial que contém 1,8-cineol em uma quantidade específica. Os materiais vegetais exemplares usados como uma fonte do composto de 1,8-cineol, conforme usado aqui, são qualquer um ou mais de: tomilho, alecrim ou eucalipto.

[128] O componente de óleo, como descrito neste documento, é obtido especificamente pela extração de um óleo de um material vegetal, por exemplo, por extração a frio ou técnicas de extração a quente, empregando fase aquosa e opcionalmente oleosa, de modo a obter uma emulsão a/o do óleo.

[129] De acordo com um exemplo específico, o componente 1,8-cineol é produzido da seguinte forma: Em um misturador que emprega tecnologia de pulverização, o componente de óleo essencial é pulverizado sobre sílica em qualquer uma das proporções de 30:70 ou 40:60 ou 50:50 ou 60:40 (p/p) e completamente misturado, por exemplo, por pelo menos 30 minutos.

[130] Os óleos essenciais são normalmente extraídos de materiais vegetais por meio de métodos de remoção adequados para a parte específica da planta que contém os óleos. Os métodos de extração populares incluem: destilação a vapor, extração por solvente, extração com CO2, maceração, enfleurage, extração por prensa a frio e destilação com água.

[131] De acordo com um aspecto específico, o método de produção emprega a preparação de uma emulsão o/a incluindo o óleo e opcionalmente um polímero, solubilizante e/ou detergente, seguido por secagem por pulverização em temperatura controlada para obter um componente de óleo seco fluido.

[132] Os óleos essenciais podem ser fornecidos na forma microencapsulada.

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26 / 59 Normalmente, a microencapsulação de um óleo essencial prevê o seu isolamento de seus arredores, por exemplo, isolar um óleo dos efeitos de deterioração de outras substâncias na fase aquosa, por exemplo, no ambiente gastrointestinal, retardando a evaporação do óleo volátil, proteção contra atrito e evaporação devido à umidade e alta temperatura durante o processamento do alimento (peletização) ou melhorando as propriedades de manuseio do material viscoso. Além disso, a taxa de saída do óleo da microcápsula pode ser controlada de forma eficaz, como na liberação sustentada ou controlada do óleo no trato gastrointestinal, com o objetivo de fornecer uma quantidade eficaz dos compostos ativos no intestino. Desse modo, a liberação do óleo e de outros componentes pode ser alcançada de forma sincronizada para obter efeitos sinérgicos in vivo.

[133] Uma ampla gama de materiais e métodos pode ser utilizada para encapsulação para criar o grau de durabilidade e método de liberação adequado para o uso pretendido. Os materiais poliméricos exemplares não limitadores adequados para uso com a microencapsulação de óleo podem incluir polímeros naturais de origem eucariótica ou procariótica, por exemplo, incluindo hidrolisados de amido, como dextrinas, amido modificado, Goma arábica, alginatos, derivados de celulose, como hidroxipropilcelulose, Na-carboxicelulose, metilcelulose, etilcelulose, proteínas animais ou vegetais ou hidrolisados de proteínas, como gelatina, colágeno, gema de ovo, proteína de trigo, caseína, proteína do leite, proteína de soja, proteína de ervilha ou suas misturas. Vários métodos físicos e químicos de microencapsulação podem ser usados, dependendo do óleo e da casca de revestimento polimérico desejado a ser usado. Convenientemente, o óleo essencial é encapsulado por desidratação de uma emulsão o/a por qualquer meio adequado, incluindo secagem por pulverização, secagem por congelamento, secagem em leito fluido, secagem em bandeja, adsorção e suas combinações. De preferência, o óleo microencapsulado é produzido por secagem por pulverização de uma emulsão tendo uma fase aquosa como definido acima contendo um agente de encapsulação polimérico. Os parâmetros de secagem por pulverização são ditados pelas características físicas desejadas no óleo microencapsulado final. Esses parâmetros físicos incluem tamanho de partícula, fluxo .

27 / 59 e conteúdo de água.

[134] O componente de óleo normalmente tem boa fluidez e pode ser distribuído homogeneamente por toda a composição. Convenientemente, o componente de óleo é um pó. Um aditivo adequado pode ser adicionado ao óleo, por exemplo, um agente de fluxo, como dióxido de silício, para aumentar a fluidez do óleo.

[135] O componente naringina e/ou o componente betalaína, conforme descrito neste documento, é especificamente um material vegetal que contém os compostos naringina e betalaína, respectivamente, na quantidade especificada. Especificamente, o material vegetal é fornecido como pó seco particulado.

[136] O termo "pó", conforme usado neste documento, é especificamente entendido como um material fluido que contém uma pluralidade de partículas. As partículas podem ter uma superfície externa lisa e/ou uma morfologia achatada. Em certas modalidades, o material vegetal particulado é um pó bege a marrom escuro com um cheiro característico.

[137] O material vegetal particulado aqui utilizado é obtido especificamente por trituração de material vegetal seco para obter um tamanho de partícula específico, por exemplo, correspondendo a um material fluido, por exemplo, SiO 2 (pó), uma farinha e/ou semolina.

[138] As partículas podem ter uma dimensão média maior de 250-500 µm. O material particulado típico tem um tamanho de partícula de no mínimo 95% abaixo de 500 µm. De preferência, o material vegetal particulado tem um tamanho médio de partícula de 100-350 µm.

[139] O material vegetal em pó pode ser derivado de várias porções da planta, especificamente podem ser usados materiais vegetais fibrosos, por exemplo, incluindo casca, raízes, caules, hastes, folhas, frutos, cascas, flores, sementes ou combinações dos mesmos.

[140] Os exemplos de materiais vegetais usados como uma fonte do componente naringina, como aqui utilizado, são materiais vegetais de plantas da família Rutaceae, tais como frutas cítricas, por exemplo, cascas de frutas cítricas ou bagaço. Especificamente, a naringina pode ser extraída de tais produtos vegetais e .

28 / 59 usada como componente de aditivo alimentar, ou os produtos vegetais podem ser usados como tal.

[141] Os exemplos de materiais vegetais usados como uma fonte do componente de betalaína, como aqui utilizado, são materiais vegetais de plantas de Caryophyllales, tais como frutas, folhas, caules e raízes de plantas, por exemplo, beterraba. Especificamente, as betalaínas podem ser extraídas desses produtos vegetais e usadas como componente de aditivo alimentar, ou os produtos vegetais podem ser usados como tal.

[142] De acordo com um exemplo específico, o componente de naringina e/ou componente de betalaína é misturado em um misturador de ração ao componente de óleo essencial em sílica e opcionalmente com outros excipientes.

[143] O teor de umidade do aditivo alimentar ou produto alimentar aqui descrito é tipicamente inferior a 12%, de preferência inferior a 8%.

[144] O termo "excipientes", conforme usado neste documento, deve se referir a componentes aditivos comumente usados em composições de rações, por exemplo, componentes fitogênicos e/ou aditivos para rações inorgânicas. Especificamente, o aditivo alimentar e seus componentes aditivos são entendidos como produtos usados na nutrição animal com o objetivo de melhorar a qualidade da alimentação ou para melhorar o desempenho e a saúde dos animais. Os aditivos alimentares normalmente são cuidadosamente selecionados e não têm efeitos nocivos na saúde humana e animal e no meio ambiente.

[145] A este respeito, o termo "ração" normalmente se refere a qualquer mistura de ingredientes de ração animal que forneça requisitos de energia e nutrientes, por exemplo, proteína, gordura, carboidratos, minerais e micronutrientes. Por exemplo, a ingestão diária de ração para aves é tipicamente entre 50 - 250 g/cabeça por dia para um frango na engorda. De acordo com outro exemplo, a ingestão diária de ração para suínos, de acordo com o estado fisiológico, é normalmente entre 50 - 1500 g/cabeça por dia. De acordo com outro exemplo, a ingestão diária de ração para ruminantes, de acordo com o estado fisiológico, é normalmente entre 150 - 35000 g/cabeça por dia.

.

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[146] O aditivo alimentar aqui descrito pode incluir especificamente excipientes, tais como óleos essenciais adicionais, ervas secas, especiarias e outros excipientes, incluindo cores, substâncias aromatizantes, conservantes ou qualquer substância necessária para formular a composição na forma desejada, como agentes de volume, agentes antiaglomerantes, diluentes, enchimentos, aglutinantes, desintegrantes, adsorventes ou agentes de granulação. Excipientes típicos são, por exemplo, folhas de alecrim, bagas de zimbro, cascas de psílio, farelo de trigo, calcário, SiO2 ou bentonitas.

[147] O termo “fluido” como utilizado neste documento refere-se especificamente a uma mistura de componentes na forma de pó, incluindo, por exemplo, material particulado que pode fluir. Por exemplo, uma mistura fluida pode fluir através de um funil ou cone alimentador para outro recipiente sob a influência da gravidade. Na presente invenção, uma mistura de pó fluida é adequada para uso com um dispositivo para mistura com material de alimentação e peletização. O termo "fluido" é bem conhecido na indústria de alimentos e rações e tem um significado claro para o especialista na técnica.

[148] Uma mistura fluida tem várias vantagens de uso, particularmente em escala industrial. A mistura pode ser manuseada, armazenada e transportada com relativa facilidade e eficiência energética, em comparação com, por exemplo, materiais sólidos que não são fluidos. Esta vantagem é particularmente importante em combinação com a capacidade de evitar uma etapa de liquefação no processo de peletização.

[149] A mistura fluida, como aqui utilizada especificamente contém pelo menos um componente de óleo (essencial) contendo 1,8-cineol e pelo menos um outro componente incluindo naringina ou betalaína e, opcionalmente, outros componentes e excipientes, em que os componentes são todos misturados sem o inclusão de qualquer quantidade substancial de líquido para formar uma mistura seca, que é opcionalmente moída em um pó fluido, de preferência peletizável.

[150] Especificamente, um componente 1,8-cineol, alimentado em uma mistura com pelo menos um componente adicional incluindo naringina ou betalaína, .

30 / 59 fornece um sistema fitogênico que melhora inerentemente as propriedades de liberação sustentada dos compostos ativos in vivo, para melhorar as características biofísicas conforme necessário. De preferência, qualquer um ou mais ou todos os componentes 1,8-cineol, o componente naringina ou o componente betalaína não se dissolvem ou se dissolvem apenas fracamente no estômago. Os componentes da composição do aditivo alimentar podem ser suficientemente fornecidos ao intestino e/ou cólon, de modo que os compostos ativos possam atuar concomitantemente nas características biofísicas.

[151] Assim, é possível obter efeitos sinérgicos nos intestinos ao usar o aditivo alimentar ou produto alimentar aqui descrito.

[152] O termo "aves domésticas", conforme aqui utilizado, deve referir-se especificamente a aves domésticas mantidas principalmente para carne (frangos) e ovos (poedeiras); incluindo pássaros da ordem Galliformes, por exemplo, galinha, peru, galinha d'angola, faisão, codorna e pavão; e Anserigormes (pássaros nadadores), por exemplo, o pato e o ganso.

[153] As aves domésticas podem ser alimentadas com a mesma composição alimentar ao longo do período de crescimento, ou pelo menos durante um período de pelo menos 3 semanas, de preferência pelo menos 4 semanas para melhorar a eficiência da utilização da ração ou a eficiência da ração, por exemplo, produção por unidade de alimento. Diferenças significativas podem ser encontradas entre os tratamentos controle e experimental no peso corporal final e ganho de peso em todos os períodos de crescimento até 28 dias após a eclosão dos ovos. Embora a ingestão de ração possa ser quase igual entre os tratamentos, a eficiência alimentar, ou seja, g de ração/g de ganho de peso pode ser significativamente melhor para aves e, especificamente, galinhas alimentadas com a composição de aditivo alimentar da invenção.

[154] O termo "suíno", tal como aqui utilizado, deve referir-se a mamíferos artiodáctilos onívoros de pernas curtas de corpo robusto (família Suidae) com uma pele eriçada espessa e um focinho longo e flexível; especialmente o porco doméstico e o javali.

.

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[155] A ração aqui descrita, conforme usada para aves ou porcos, é especificamente peletizada ou purê.

[156] Composições exemplares de uma composição de aditivo alimentar aqui descrita para uso em criação de aves ou porcos são descritas no Exemplo 1.

[157] O termo "ruminantes", como aqui utilizado, deve referir-se a mamíferos ruminantes, incluindo, por exemplo, gado, cabras, ovelhas, girafas, iaques, veados, antílopes e alguns macrópodes (cangurus).

[158] A ração descrita neste documento conforme usada para ruminantes, como gado, é especificamente peletizada ou um aditivo alimentar misturado a um ou mais dos seguintes: silagem de grama, silagem de milho, farinha de soja ou grãos moídos.

[159] Composições exemplares de uma composição de aditivo alimentar aqui descrita para uso em criação de ruminantes, como gado, são descritas no Exemplo 1.

[160] Outros exemplos aqui fornecidos neste documento são direcionados aos métodos analíticos para determinar as substâncias ativas 1,8-cineol, naringina e betalaína em uma composição de aditivo alimentar.

[161] Outros exemplos fornecidos neste documento são direcionados a testes in vivo e ex vivo do efeito do aditivo alimentar, como i. Teste in vivo do efeito na extensão do tempo de vida em vermes C. elegans que são expostos ao estresse por calor, ii. Teste ex vivo do efeito da proteína de choque térmico em células CaCo2; iii. Função de barreira intestinal ex vivo por resistência elétrica transepitelial (TEER) em células transwell CaCo2; iv. Validação in vivo dos efeitos benéficos da naringina no desempenho do crescimento em frangos sob estresse por calor e avaliação do nível de dose benéfica; v. Validação in vivo dos efeitos benéficos de combinações de naringina com diferentes concentrações de 1,8-cineol no desempenho de crescimento, resposta à proteína de choque térmico e integridade da barreira intestinal em frangos sob estresse por calor; e .

32 / 59 vi. Validação in vivo dos efeitos benéficos das combinações de naringina com 1,8- cineol ou 1,8-cineol com betalaína.

[162] A descrição anterior será melhor compreendida com referência aos exemplos a seguir. Tais exemplos são, no entanto, meramente representativos dos métodos de praticar uma ou mais modalidades da presente invenção e não devem ser lidos como limitativos do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Aditivos alimentares exemplares denominados "Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor"

[163] As composições exemplares contém os seguintes ingredientes, misturados a uma mistura fluida seca. Considerando que o componente do óleo é um óleo de lamiaceae específico ou uma mistura de óleos de lamiaceae (por exemplo, de Orégano e/ou Alecrim e/ou Tomilho), padronizada para a concentração de 1,8 cineol, o componente de flavonoide deriva de flavonoides cítricos, com concentração padronizada de Naringina, e o componente betalaína deriva do pó de beterraba, com concentração padronizada de betalaína.

Tabela 1: Fórmula I; Composição de uma nova formulação de aditivo alimentar para Aves (Frangos, Poedeiras, Peru) e Porcos Ingredientes Teor (%, p/p) Mistura de óleo de lamiaceae, no ≥ 4,00 (4,00 – 16,0) total 1,8-cineol ≥ 1,50 (1,50 – 6,00) Flavonoides cítricos, no total ≥ 5,50 (5,50 – 11,0) Naringina ≥ 3,00 (3,00 – 6,00) Excipientes Até 100%

[164] A fórmula I do aditivo alimentar exemplar contém 1,50% de 1,8-cineol (p/p); e uma proporção efetiva de 0,65:1 (p/p 1,8-cineol por naringina).

Tabela 2: Fórmula II; Composição de uma nova formulação de aditivo alimentar para Aves (Frangos, Poedeiras, Peru) e Porcos Ingredientes Teor (%, p/p) .

33 / 59 Mistura de óleo de lamiaceae, no ≥ 4,00 (4,00 – 16,0) total 1,8-cineol ≥ 1,50 (1,50 – 6,00) Pó de raiz de beterraba, no total ≥ 10,0 Betalaína ≥ 0,125 (0,125 – 0,25) Excipientes Até 100%

[165] A fórmula II do aditivo alimentar exemplar contém 1,50% de 1,8-cineol (p/p); e uma proporção efetiva de 22:1 (p/p 1,8-cineol por betalaína).

Tabela 3: Fórmula III; Composição de uma nova formulação de aditivo alimentar para Ruminantes Ingredientes Teor (%, p/p) Mistura de óleo de lamiaceae, no ≥ 1,00 (1,00 – 4,00) total 1,8-cineol ≥ 0,375 (0,375 – 1,50) Flavonoides cítricos, no total ≥ 1,30 (1,30 – 2,60) Naringina ≥ 0,75 (0,75 – 3,00) Glicerol (1,2,3-Propanetriol) ≥ 50,0 Excipientes Até 100%

[166] A fórmula III do aditivo alimentar exemplar contém 0,375 % de 1,8-cineol (p/p); e uma proporção efetiva de 0,5:1 (p/p 1,8-cineol por naringina).

Tabela 4: Fórmula IV; Composição de uma nova formulação de aditivo alimentar para Ruminantes Ingredientes Teor (%, p/p) Mistura de óleo de lamiaceae, no ≥ 1,00 (1,00 – 4,00) total 1,8-cineol ≥ 0,375 (0,375 – 1,50) Pó de raiz de beterraba, no total ≥ 5,00 Betalaína ≥ 0,033 (0,033 – 0,066) Glicerol (1,2,3-Propanetriol) ≥ 50,0 Excipientes Até 100%

[167] A fórmula IV do aditivo alimentar exemplar contém 0,375 % de 1,8- cineol (p/p); e uma proporção efetiva de 12:1 (p/p 1,8-cineol por naringina).

[168] Os aditivos alimentares exemplares denominados "Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor" .

34 / 59 contém a) naringina em uma proporção efetiva dentro da faixa de 0,2:1 – 1,5:1, em particular 0,65:1 (p/p, 1,8-cineol por naringina); e/ou b) betalaína em uma proporção efetiva dentro da faixa de 4:1 – 64:1, em particular 22:1 (p/p, 1,8-cineol por betalaína).

[169] A fórmula é testada nos sistemas de testes descritos neste documento para mostrar o efeito sinérgico de combinações de compostos individuais.

[170] Por exemplo, o efeito sinérgico é definido como maior eficácia do desempenho de crescimento em comparação com um aditivo de referência padrão, quando usado no nível de dose recomendado.

[171] De acordo com o exemplo, a dosagem do “Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor” é descrita em uma faixa de 200 a 400 mg/kg ou em uma faixa de 200 a 400 mg/kg de ração completa.

[172] Além disso, nos sistemas de teste in vivo (testes com animais), uma dose geralmente recomendada de betaína (500 mg/kg de ração completa) é transportada como um grupo de controle positivo. Esta abordagem serve para provar a maior eficácia do “Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor” em comparação com uma solução comercial frequentemente aplicada. Exemplo 2: Descrição dos métodos analíticos e metodologias de teste:

[173] Descrição da evidência analítica da substância ativa

1. 1,8 Cineol (composto “A”)

2. Naringina (composto “B”)

3. Betalaína (composto “C”)

[174] Descrição da metodologia de teste e resultados

4. Teste I: Teste de expansão do tempo de vida em vermes C. elegans

5. Teste II: Teste in vitro da indução da proteína de choque térmico em células CaCo2

6. Teste III: Teste in vitro da função de barreira intestinal por resistência elétrica transepitelial (TEER) em células transwell CaCo2 .

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7. Teste IV: Validação in vivo dos efeitos benéficos da naringina (Composto "A") no desempenho do crescimento em frangos sob estresse por calor e avaliação do nível de dose ideal

8. Teste V: Validação in vivo dos efeitos benéficos de combinações de naringina (Composto "B") com diferentes concentrações de 1,8-cineol (Composto "A") no desempenho de crescimento, resposta à proteína de choque térmico e integridade da barreira intestinal em frangos sob estresse por calor

9. Teste VI: Validação in vivo dos efeitos benéficos das combinações de naringina com 1,8-cineol (AB) ou 1,8-cineol com betalaína (AC).

[175] Descrição: Análise do 1,8-CINEOL

[176] GC MS

[177] A análise por cromatografia gasosa foi realizada usando um Focus GC acoplado a um DSQII MS adquirido da Thermo (Waltham, MA, EUA). A injeção (volume de injeção 1 µl) foi realizada no modo splitless à temperatura de injeção de 240°C. A separação foi realizada em uma coluna de sílica fundida Rxi-5ms (d.i. 30 m x 0,25 mm; 0,25 µm de espessura de filme) da Restek (Bad Homburg, Alemanha) em fluxo constante. O programa da estufa começou a 50°C e a temperatura foi aumentada na primeira etapa para 190°C a 5°C min-1 e na segunda etapa para 300°C (mantida por 5 min) a 30°C min-1. Hélio (4.6) foi usado como gás de arraste com uma taxa de fluxo da coluna de 1,0 ml min-1.

[178] O espectrômetro de massa foi operado no modo de monitoramento de íon selecionado (SIM) com os íons selecionados m/z 154, m/z 139, m/z 111, m/z 108. A temperatura da fonte de íons foi ajustada para 240°C e a temperatura da linha de transferência configurada para 300°C. Análise de naringina

[179] LC MS

[180] O experimento foi realizado em um sistema HPLC Agilent Series 1100. A coluna de separação foi uma Poroshell 120 EC-C18 Eclipse (DI 50 x 3 mm, tamanho de partícula de 2,7 µm) obtida da Agilent. A fase móvel consistiu de um gradiente de .

36 / 59 água e acetonitrila, ambas com 0,1% de ácido fórmico. As condições iniciais eram 15% de acetonitrila por 5 minutos, então o gradiente foi executado a 20% de acetonitrila em 5 minutos. 100% de acetonitrila dentro dos próximos 5 minutos, e finalmente a 15% de acetonitrila mantida por mais 5 minutos. O tempo total de execução cromatográfica foi de 20 minutos. A taxa de fluxo foi configurada para 0,8 mL min-1.

[181] A detecção de MS foi realizada em uma Agilent 6520 QTOF no modo de íon negativo. As seguintes condições de fonte de íons foram utilizadas: temperatura do gás de secagem 350° C, fluxo do gás de secagem 10,5 L min-1, pressão do nebulizador 45 psi, tensão do fragmentador 125 V e tensão capilar 3750 V. Análise da BETALAÍNA

[182] LC MS (Pires Goncalves et al. 2012)

[183] A cromatografia de fase reversa foi realizada em um sistema Waters (Milford, MA) 600 equipado com um detector de UV-Vis (comprimento de onda duplo, Waters 2489) e uma coluna C18 Júpiter-15 (300 Å, 15 µm, 250 x 21,2 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Os gradientes se formaram entre dois solventes desgaseificados com hélio: solvente A: água com 1% v/v HOAc; gradiente linear de 5% a 20% B: em 60 min a 25°C, taxa de fluxo: 10 mL/min.

[184] Um Bruker Daltonics Esquire 3000 Plus foi usado para as análises ESI- MS. A temperatura do vaporizador era de 325°C e a tensão foi mantida a 4,0 kV. O gás de revestimento era nitrogênio, operado a uma pressão de 26 psi (6,0 L/min). Os compostos foram ionizados no modo positivo.

[185] Descrição das metodologias de teste Teste I: Teste de expansão do tempo de vida em vermes C. elegans

[186] Para esta investigação, foi desenvolvido um teste específico com C. elegans. Em condições normais de temperatura, o C. elegans tem um tempo de vida de cerca de 14 dias, incluindo todos os estágios larvais. Os vermes atingem seu estado adulto após 3 a 4 dias. O aumento da temperatura para 37°C reduz o tempo de vida restante do C. elegans drasticamente para 10 a 15 h. Consequentemente, neste teste, o alongamento do tempo de vida por substâncias de controle (Ácido .

37 / 59 ascórbico e Betaína) e vários outros compostos fitogênicos (Óleo de hortelã, Óleo de eucalipto), bem como alguns de seus constituintes ativos purificados (Piperina, Capsaicina, Gengibre, Eugenol) foi rastreado. Todas as substâncias testadas foram utilizadas em concentrações (mg/L) que poderiam ser transferidas posteriormente para concentrações dietéticas (mg/kg) dessas substâncias em dietas completas.

Tabela: Teste I: Concentração de compostos A, B e C e outros ingredientes ativos Ingredientes Concentração (mg/L) Concentração equivalente na ração (mg/kg) ou água (mg/L) Ácido ascórbico 100 100 (água) Betaína 500 500 (ração) Flavonoides cítricos 250 250 (ração) • Disso Naringina (B) 50 50 (ração) Mistura de óleo de lamiaceae 25 25 (ração) • disso 1,8-cineol (A) 7,5 7,5 (ração) Pó de raiz de beterraba 250 250 (ração) • disso Betalaína (C) 0,6875 0,6875 (ração) Óleo de hortelã 50 50 (ração) Óleo de eucalipto 50 50 (ração) Eugenol 50 50 (ração) Oleorresina de pimenta 50 50 (ração) Oleorresina de pimenta de 50 50 (ração) Caiena Oleorresina de gengibre 50 50 (ração) Manutenção do C. elegans:

[187] A cepa de tipo selvagem N2 de C. elegans, variação Bristol, foi obtida do C. elegans Genetics Center, CGC (Universidade de Minnesota, MN, EUA). Os nematódeos foram mantidos em placas de ágar com meio de crescimento de nematódeos (NGM) semeadas com E. coli OP50 a 20°C de acordo com os protocolos padrão (Brenner S, 1974, The Genetics of Caenorhabditis elegans. Métodos como congelamento de nematódeos e obtenção de populações sincrônicas usando um método de branqueamento com tratamento com hipoclorito de adultos que põem ovos .

38 / 59 também foram realizados de acordo com protocolos padrão (Stiernagle T, 2006; Maintenance of C. elegans. WormBook 1-11). Tratamento de nematódeos com substâncias de referência (ácido ascórbico, betaína) os ingredientes principais do “Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem- estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor”

[188] Nematódeos síncronos foram criados em cultura líquida usando líquido NGM e E. coli HT115 embalada de acordo com Stiernagle. Carbenicilina foi adicionada ao líquido NGM para inativar a E. coli. Um volume de 56 µl de líquido NGM foi dispensado em cada poço de uma microplaca de 96 poços, ao qual foram adicionados 10 µl de tampão M9 contendo 10 larvas L1 sincronizadas. As larvas L1 foram mantidas em agitação a 20°C e atingiram a fase adulta em 3 dias. Todas as substâncias de controle (ácido ascórbico, betaína) e substâncias de teste (Compostos "A" e "B") foram preparadas como soluções estoque em tampão M9 e sonicadas por 5 min. As soluções de estoque (10 vezes) tinham as seguintes concentrações (ácido ascórbico 500/1000 mg/L, Betaína 5000 mg/L, Composto "A" 75 mg/L, Composto "B" 500 mg/L, Composto "C" 6,88 mg/L). 7 µl de cada solução estoque de extrato foram adicionados ao meio de incubação para atingir uma concentração final de 100 mg/L (ácido ascórbico), 500 mg/L (Betaína), 7,5 mg/L (Composto "A"), 50 mg/L (Composto “B”) e 0,6875 mg/L (Composto “C”). Nematódeos de controle foram sempre tratados com volumes idênticos de tampão M9. Determinação da sobrevivência sob estresse por calor

[189] Após a incubação de nematódeos N2 adultos jovens por 48 h a 20°C na presença ou ausência dos aditivos de controle (ácido ascórbico, betaína) e os componentes "A" e "B" do Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar dos Animais sob Condições de Estresse por Calor.

[190] A sobrevivência foi determinada usando um teste de termotolerância em microplaca conforme descrito (Gill MS, Olsen A, Sampayo JN, Lightgow GJ, 2003; Free Radic Biol Med 35: 558-565). Em resumo, os nematódeos foram lavados dos poços com tampão M9/Tween®20 (1% v/v) para tubos de 15 ml seguidos de três passos de lavagem adicionais. Em cada poço de uma placa de microtitulação de baixo .

39 / 59 volume de 384 poços preta, adicionou-se 6,5 μl de solução tampão M9/Tween®20 (1% v/v). Posteriormente, um nematódeo foi dispensado em 1 μl de tampão M9 sob um estereomicroscópio (Breukhoven Microscope Systems) em cada poço e misturado com 7,5 μl de SYTOX verde para atingir uma concentração final de 1 μM. Para evitar a evaporação da água, as placas foram seladas com filme selante Rotilab e cobertas com tampa. O choque térmico (37°C) foi induzido e a fluorescência medida com um leitor de placas de microtitulação Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Bonn, Alemanha) a cada 30 min. Para detectar a fluorescência verde SYTOX, o comprimento de onda de excitação foi configurado para 485 nm e a emissão foi medida a 538 nm.

[191] Para determinar o tempo de sobrevivência de cada nematódeo, foi gerada uma curva de fluorescência individual. A hora da morte foi definida como uma hora após um aumento na fluorescência sobre o nível basal ter sido observado e verificado pela provocação de toque primeiro. A partir dos tempos de morte individuais, as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram traçadas. Resultados: teste de expansão do tempo de vida em vermes C. elegans (Teste I)

[192] Para investigar os efeitos protetores contra o estresse por calor de ambas as substâncias de referência (ácido ascórbico, betaína) e de compostos fitogênicos, incluindo o composto “A”, “B” e “C” do “Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor”, a extensão do tempo de vida no C. elegans foi testada em condições de estresse por calor (Figura 1). As concentrações testadas das substâncias de referência e das substâncias fitogênicas foram escolhidas para refletir as concentrações dietéticas finais em dietas de animais (por exemplo, a substância de referência betaína é usada em dietas de animais nas concentrações de 250 a 1000 mg/kg de dieta; no modelo de C. elegans a betaína foi testada no nível de 500 mg/L = 500 mg/kg = 500 mg/kg). Ambas as substâncias de referência (ácido ascórbico e betaína) aumentaram o tempo de vida em 0,5 a 1,5 horas. Os compostos "A" (Figura 1D), “B” (Figura 1C) e “C” (Figura 1E) nas concentrações testadas aumentaram o tempo de vida em 0,5 a 1,5 h.

[193] Curiosamente, os exemplos comparativos usando substâncias .

40 / 59 pungentes e óleos essenciais de resfriamento, frequentemente recomendados contra consequências negativas do estresse por calor e parcialmente usados em produtos de aditivos alimentares comumente disponíveis, não mostraram benefícios na extensão da vida (Figura 2 F, G, H, I, J, K). Teste II: Teste in vitro da indução da proteína de choque térmico em células CaCo2

[194] Para esta investigação, foi desenvolvido um teste específico com células em monocamada CaCo2. As células CaCo2 normalmente são incubadas a 37°C. O aumento da temperatura para 41°C causa uma resposta de choque térmico nessas células (indução de proteínas de choque térmico) para neutralizar o dano celular e iniciar mecanismos de reparo. Consequentemente, neste teste, o potencial da betaína (substância de referência) e dos compostos “A” e “B” foi estudado de maneira dependente da dose para promover e aumentar a resposta natural ao choque térmico. Estudo com células CaCo2

[195] Materiais

[196] MEM com sais de Earle, soro fetal bovino (FBS), penicilina/estreptomicina e tripsina-EDTA foram adquiridos da Biochrom GmbH (Berlim, Alemanha). O meio de diferenciação do epitélio intestinal Entero-STIM e MITO+ Serum Extender foram obtidos da Corning (Wiesbaden, Alemanha) e as placas de cultura de células foram adquiridas da Greiner Bio-One International GmbH (Kremsmünster, Áustria). RNeasy Mini Kit foi obtido da Quiagen (Hilden, Alemanha), i Script cDNA Synthese Kit e iQ SYBR Green Supermixture da Bio-Rad (Munique, Alemanha) e oligo dT-primers da Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemanha). Cultura de células e diferenciação das células CaCo2

[197] Células CaCo2 humanas (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foram mantidas em MEM com sais de Earle suplementados com 10% de FBS e 100 U/mL de penicilina/100 µg/mL de estreptomicina e cultivadas a 37°C em uma atmosfera umidificada (≥ 95% ) com 5% de CO2. As células foram semeadas em placas de 12 poços a 1,2 x 106 células por poço para atingir a confluência no dia seguinte. As células foram ainda mantidas em Meio de Diferenciação de Epitélio Intestinal Entero-STIM .

41 / 59 suplementado com 100 U/mL de penicilina/100 µg/mL de estreptomicina e 0,1% de MITO+ Serum Extender e o meio foi trocado diariamente. O experimento foi realizado no dia 5, quando as células estavam completamente diferenciadas. Indução do estresse por calor

[198] Para analisar a influência da betaína (substância de referência) e dos compostos “A” “B” e “C” na expressão da proteína de choque térmico HSP70, as substâncias foram adicionadas às células no dia 4 e as células foram incubadas com o extrato durante a noite por 15 horas. As substâncias de teste foram dissolvidas em meio de diferenciação completo e diluídas para as seguintes concentrações finais: Betaína (250/500/1000/1500 mg/L); Composto “A”, (7,5, 15, 30 and 60 mg de 1,8- cineol/L); Composto “B”, (6, 12, 18, 24, 30 and 60 mg de Naringina/L); Composto “C”, (0,55, 1,10, 2,20 mg de Betalaína/L), respectivamente. Para induzir o estresse por calor, as amostras foram incubadas a 41°C por 1 hora, enquanto as amostras de controle foram incubadas a 37°C pelo mesmo tempo. Detecção da expressão de mRNA de HSP70 por PCR em tempo real

[199] A expressão de mRNA de HSP70 foi medida quantitativamente pelo PCR em tempo real (C1000 Thermal Cycler and CFX96 Real-Time System, Bio-Rad, Munique, Alemanha). O RNA total foi isolado com o RNeasy mini kit, seguido pela transcrição de 50 ng de RNA total em cDNA com o i Script cDNA Synthesis Kit (volume final: 20 µL) e o PCR em tempo real com o iQ SYBR Green Supermix de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, para PCR em tempo real, 2 µL de cDNA foram adicionados a 18 µL de mistura mestre (10 µL de iQ SYBR Green supermix (2x), 2 µL de primer [3 pmol/µL], 6 µL de água sem nuclease). A desnaturação do DNA e a ativação da polimerase por 3 min a 95°C foram seguidas por 40 ciclos de PCR. Um ciclo de amplificação é dividido em três partes: desnaturação a 95°C por 15 seg., anelamento e extensão a 60°C por 60 seg. seguido por uma placa lida após cada ciclo. Finalmente, uma análise da curva de fusão foi feita aumentando gradualmente a temperatura para 95°C, para excluir a formação de dímeros de primer. Os valores de cT detectados foram usados para o cálculo dos níveis relativos da expressão de mRNA por meio do método 2-∆∆cT (ZITAT LIVAK). Diferenças nas quantidades de .

42 / 59 cDNA foram normalizadas para a expressão de mRNA de ß-actina. A análise estatística foi realizada no Graphpad Prism (versão 6.02) usando o teste t não pareado. Os seguintes primers foram usados na amplificação: ß-actina para frente: 5’- GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT T-3‘ (SEQ ID NO:1); ß-actina reversa: 5’-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3‘(SEQ ID NO:2); HSP70 para frente: 5’-CTA GCC TGA GGA GCT GCT GCG ACA G-3’ (SEQ ID NO:3); HSP70 reversa: 5’-GTT CCC TGC TCT CTG TCG GCT CGG CT-3’ (ID SEQ NO:4). Resultados do teste in vitro da indução da proteína de choque térmico em células CaCo2 (Teste II)

[200] Para investigar os benefícios dos compostos "A", "B" e "C" na indução adicional de resposta ao choque térmico, células CaCo2 diferenciadas foram expostas a níveis crescentes dos compostos "A", "B" e "C", representando a faixa de dosagem mencionada acima aplicada em dietas de animais (Figura 3 B, C, D). Como substância de referência, o aditivo alimentar antiestresse por calor frequentemente utilizado, betaína, foi testado em conformidade (Figura 3 A). A betaína não mostrou uma resposta clara à dose na indução adicional da proteína de choque térmico 70 sobre o controle. Enquanto 100, 250 e 1000 mg/L de betaína diminuíram a indução da proteína 70 de choque térmico em comparação com células de controle não tratadas (-7 a - 19%), 500 e 2000 mg/L resultaram em um aumento não significativo na resposta da proteína 70 de choque térmico (+10 a +12%) (Figura 3 A). Em contraste, todos os três compostos do “Novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por calor” resultaram em benefícios claros sobre o controle e indicaram uma resposta à dose ou excesso de concentrações ideais (Figura 3 B, C, D). Para o composto "B", já a concentração de Naringina mais baixa testada resultou em um aumento claro, mas não significativo, da indução de HSP 70 em comparação com as células de controle não tratadas (+16%). Um aumento significativo na indução de HSP 70 quase no mesmo nível pode ser observado para concentrações de Naringina entre 12 a 30 mg/L do composto “B” (+24 a +27%). Em contraste, 60 mg de Naringina/L levou a um efeito adverso (-23%), indicando ultrapassagem da faixa de dose ideal. Da mesma forma, já 7,5 mg de 1,8 Cineol/L do composto “A” resultou em .

43 / 59 um aumento de 15% na indução de HSP 70 em comparação com as células de controle. 15 e 30 mg de 1,8-Cineol/L do composto “A” aumentaram a expressão gênica de HSP 70 em 22 e 24%, respectivamente. A dose mais alta testada (45 mg de 1,8- Cineol/L) aumentou a expressão de HSP 70 em até 44%. No entanto, devido a razões de preço das matérias-primas, essa concentração não pôde ser considerada em uma formulação de produto para um “Novo Aditivo Alimentar que Mantem o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor”. A concentração mais alta testada estava na faixa, relatada por Türk et al. (2016). Para testar se há efeitos adicionais dos compostos únicos, como um exemplo de indução de HSP 70 pelos compostos "A" e "C" sozinhos, bem como da combinação de ambas as substâncias é fornecido na Figura 3 E. Nos níveis testados das substâncias "A" e "C" sozinhas com 20,8% e 21,1%, um aumento quase significativo ou significativo da expressão de HSP 70 pôde ser alcançado, que estava em um nível comparável, conforme relatado na Figura 3 C e D. A combinação de ambas as substâncias quase dobrou a indução de HSP 70 para 40,2% e mostrou claramente o efeito melhorado de ambas as substâncias (Figura 3 E). Teste III: Teste in vitro da função de barreira intestinal por resistência elétrica transepitelial (TEER) em células transwell CaCo2

[201] Para testar se os compostos “A”, “B” e “C” ajudam a apoiar a integridade da barreira intestinal sob condições de estresse por calor, foram realizados experimentos com camadas de células transwell CaCo2. Em uma cabine de cultura de células de nível 2 de biossegurança estéril, inserções de transwell PET com poro de 0,8 mm foram colocadas em uma placa de 24 poços (4 poços por condição). Todos os materiais inseridos foram esterilizados com etanol antes.

[202] O meio de cultura de células contendo meio DMEM suplementado com 4,5 g/L de glicose, 15% de soro fetal bovino e 1% de Pen Strep foi preparado e aquecido a 37°C em banho-maria.

[203] 200-400 μl da solução celular de células de adenocarcinoma colorretal epitelial humano (Caco-2) em meio celular foram colocados na câmara superior (apical) da inserção transwell, a uma densidade de 1,5 x 105 células/cm2. A câmara .

44 / 59 inferior (basolateral) foi preenchida com 700 - 900 μl de meio celular.

[204] As células foram cultivadas a 37°C, 5% de CO2 e 95% de umidade por 16 dias, e o meio na câmara superior e inferior foi substituído a cada 4 dias. Após esta incubação, as células foram incubadas por 24 horas adicionais com meio de cultura de tecidos, contendo os compostos "A", "B" ou "C" foram adicionados em níveis comparáveis ao Teste II. Após este tempo de incubação, o TEER basal foi medido de acordo com Ghaffarian e Muro 2013. Posteriormente, a temperatura foi aumentada para condições de estresse por calor (42°C) e a medição TEER foi continuada por até 6 h. A partir da comparação dos valores TEER de células de controle não tratadas, realizadas em todos os experimentos, foram comparadas às de células tratadas com os compostos "A", "B" ou "C", e pode-se tirar conclusões sobre os efeitos protetores dos compostos na função da barreira intestinal. Resultados de teste in vitro da função de barreira intestinal por resistência elétrica transepitelial (TEER) em células transwell CaCo2 (Teste III)

[205] Uma vez que a betalaína demonstrou, pela primeira vez, melhorar a indução de HSP 70 em monocamadas de células CaCo2 (Figura 3 D), seus efeitos protetores sobre a integridade da barreira intestinal foram examinados. Pôde ser demonstrado que o pré-tratamento com betalaína de células CaCo2 cultivadas em placas de cultura transwell levou a uma diminuição significativamente menor de TEER sob condições de estresse por calor em comparação com células de controle não tratadas (Figura 4). Deste fato, pôde-se concluir pela primeira vez, que a betalaína desenvolve efeitos protetores sobre a integridade da barreira intestinal. TESTE IV: Validação in vivo dos efeitos benéficos da naringina (Composto "B") no desempenho do crescimento em frangos sob estresse por calor e avaliação do nível de dose ideal

[206] Os efeitos benéficos do composto “B” ainda não foram relatados melhorar o bem-estar do animal (melhor desempenho, resposta ao choque térmico e integridade da barreira intestinal) in vivo. Como o composto “B” mostrou uma resposta benéfica em todos os testes in vitro, o primeiro teste in vivo teve como objetivo investigar os efeitos benéficos desse composto no desempenho e na resposta ao .

45 / 59 choque térmico em frangos sob estresse por calor. A betaína, frequentemente usada como aditivo, que melhora o desempenho de animais sob estresse por calor foi levada adiante neste teste como um grupo de controle positivo. Desenho do teste

[207] 1152 frangos Ross 308 machos de um dia de idade de um total de 1400 foram usados no experimento. Foram excluídos do processo de seleção os frangos que apresentassem sinais de problemas de saúde, lesões, muito pequenos ou em mau estado. Os frangos foram sexados na incubadora. Todos os pintinhos de um dia foram pesados individualmente e agrupados de acordo com o peso. As aves foram então designadas para 36 baias (6 repetições de 6 tratamentos), e cada baia inicialmente consistia de 34 frangos. No dia 4 do experimento em cada baia, os 2 frangos mais fracos foram removidos e todas as baias foram igualadas com 32 aves por baia por seleção negativa. As aves do grupo de controle negativo foram alimentadas com a dieta básica sem qualquer aditivo fitogênico. O grupo de referência foi alimentado com dieta contendo 500 mg/kg de betaína de uma fonte natural de betaína (Actibeet®, Agrana). Às dietas dos grupos 3, 4, 5 e 6, as pré-misturas fitogênicas com o composto “B” foram adicionadas para atingir as concentrações finais de Naringina na dieta de 12/18/24/30 mg/kg de ração.

Tabela 5: Teste IV: Grupos de tratamento experimental Betaína (controle positivo), Naringina (composto B), Tratamento mg/kg de ração mg/kg de ração T1 - - T2 500 - T3 - 12 T4 - 18 T5 - 24 T6 - 30 Alojamento e manejo de animais

[208] O teste foi realizado na Delacon Research Facility (Stošíkovice na Louce, .

46 / 59 República Tcheca). As aves foram mantidas em baias de piso, cada uma com área de 2,1 m² (1,65 x 1,275 m; 2,03 m² de área útil = sem contar o espaço ocupado com o comedouro), com aparas de madeira frescas como material de cama. A densidade animal no final do experimento foi de 14,78 pintinhos/m² (38,7 kg/m²). O edifício foi provido com iluminação artificial programável, aquecimento central automatizado e ventilação forçada. A temperatura foi definida de acordo com as recomendações dos criadores do dia 1 ao dia 21 de idade. O início do estresse por calor ocorreu no dia 22 de idade. Desse modo, foi aplicado um regime cíclico de estresse por calor. O período de estresse por calor foi das 09:00 da manhã às 17:00 da tarde. A temperatura média do alojamento neste período foi de 34°C. O “período noturno de resfriamento” foi das 19h00 às 07h00 da manhã. A temperatura ambiente média neste período foi de 26°C. Os intervalos de tempo das 07:00 às 09:00 da manhã e das 17:00 às 19:00 da noite foram utilizados para aumentar ou diminuir gradativamente a temperatura para 34°C e 26°C, respetivamente. A fim de aumentar a umidade do aviário sob o regime de estresse por calor, toalhas nos painéis de calor foram umedecidas 5 vezes por hora durante o período de estresse por calor. A umidade relativa foi mantida em cerca de 70-80%. Dietas experimentais

[209] As aves foram alimentadas com dieta basal à base de trigo, milho e farelo de soja. Para cada período de alimentação (iniciadora/produtora, produtora/finalizadora), a alimentação foi calculada para ser iso-nutritiva (Tabela 6). As concentrações de nutrientes na dieta foram calculadas para atender às recomendações atuais dos frangos de acordo com as recomendações dos criadores. De acordo com a alimentação em duas fases aplicada, uma dieta iniciadora/produtora foi oferecida dos dias 1 a 21 e uma dieta produtora/finalizadora dos dias 22 a 42. A composição das dietas, utilizadas nos testes IV, V, VI, para as fases simples e os teores de nutrientes calculados são apresentados na Tabela. Todas as dietas foram oferecidas às aves como ração peletizada.

Tabela 6: Testes IV, V, VI: Composição e análises calculadas das dietas experimentais .

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Fórmulas das rações A) Iniciadora/Produtora B) Produtora/Finalizadora Matéria Prima Unidade Trigo % 31,750 34,190 Milho % 23,500 21,500 Farinha de colza % 4,000 4,500 Farinha de trigo % 2,500 4,500 Gérmen de milho % 1,500 Farinha de soja % 29,000 25,000 Gordura animal % 4,000 Proteína hidrolisada % 3,000 Óleo de soja % 1,000 L-Lisina HCl 98 % 0,370 0,300 L-Treonina 98 % 0,070 0,100 DL-Metionina líquida % 0,460 0,380 Calcário % 1,500 1,300 Sal % 0,200 0,230 Fosfato Monocálcio % 1,000 0,800 Carbonato de sódio % 0,150 0,200 Vitamina e pré-mistura mineral % 0,500 0,500 pré-mistura de teste com compostos ativos A,B,C % 1.000 1.000

Total % 100,00 100,00 Nutrientes calculados Matéria seca g/kg 889,614 892,194 MEp MJ 12,145 13,023 Proteína bruta g/kg 226,606 200,375 Fibra g/kg 27,203 27,776 Gordura g/kg 44,392 74,913 Cinzas g/kg 60,557 53,039 Lisina g/kg 14,433 12,077 Metionina g/kg 6,967 5,915 Met+Cys g/kg 10,475 9,508 Treonina g/kg 8,929 8,127 Arginina g/kg 14,405 12,462

Ca g/kg 9,243 8,039 P não fitato g/kg 3,341 2,907 Na g/kg 1,920 1,578 Cl g/kg 1,800 1,960 .

48 / 59

[210] As pré-misturas foram preparadas nas instalações da Delacon Biotechnik GmbH em Steyregg (Áustria). Elas foram preparadas para fornecer as concentrações dietéticas finais pretendidas no nível de inclusão de 0,1% (1,0 mg/kg). A concentração das substâncias ativas nas pré-misturas foi realizada imediatamente após a preparação das pré-misturas.

[211] A produção das dietas peletizadas completas com a adição das pré- misturas às dietas foi realizada pela fábrica de rações Biosta s.r.o. Blučina (República Tcheca).

[212] As amostras foram coletadas diretamente após a fabricação. 1 kg de ração de cada tratamento e período será armazenado na instalação do teste em condições frescas e secas até a aprovação do relatório final.

[213] As dietas foram analisadas quanto ao teor de nutrientes em Zemědělská oblastní laboratoř, Chotýšany. As dietas foram analisadas quanto à matéria seca, proteína bruta, gordura bruta, cinzas, açúcar, amido, Ca e P. Além disso, os ingredientes ativos foram analisados nas dietas. Amostragem de tecidos

[214] Nos dias 21 e 42 do experimento, 2 galinhas de cada repetição foram mortas para coleta de fígado e jejuno para medir a expressão gênica. Análise estatística dos dados

[215] As análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software SAS. Após verificar a homogeneidade dos dados, as médias foram comparadas pelos procedimentos usuais de teste (teste de Turkey). A significância estatística foi declarada em P ≤ 0,05, com 0,05 <P  0,10 considerada como uma tendência quase significativa. Resultados da validação in vivo dos efeitos benéficos da Naringina (Composto "B") no desempenho do crescimento em frangos sob estresse por calor e avaliação do nível de dose ideal (Teste IV)

[216] A Tabela 7 mostra as concentrações de naringina analisadas nas dietas do Teste IV. A recuperação da substância ativa Naringina foi de quase 100% nas .

49 / 59 dietas, consequentemente os teores especificados aparecem também nas dietas finais. Uma taxa de recuperação semelhantemente alta também pôde ser analisada para a substância de referência betaína.

Tabela 7: Teste IV- Teor de Betaína e Naringina das dietas de teste Tratament Betaína (controle positivo) Naringina (composto “B”) o mg/kg de ração mg/kg de ração analisado esperado analisado esperado T1 - - - - T2 470 500 - - T3 - - 12,3 12 T4 - - 17,4 18 T5 - - 24,2 24 T6 - - 29,4 30

[217] Uma vez que os efeitos positivos do composto “B” (Naringina) nos aspectos de bem-estar do animal sob condições de estresse por calor (por exemplo, proteção da função de barreira intestinal, associada a um aumento no desempenho) ainda não foram relatados, o objetivo do estudo foi avaliar efeitos dependentes de dose do composto “B” versus uma dose padrão (500 mg/kg) da substância de referência betaína. Já no período pré-estresse por calor (d 0 a 21), tanto a substância de referência (+4,9%) quanto todas as doses (12, 18, 24 e 30 mg/kg de dieta) de composto "B" (+2,79 a + 13%) resultaram em efeitos benéficos sobre o peso corporal e o ganho de peso corporal diário. Em comparação com o controle negativo, este efeito foi ainda significativo (+13%) para a menor dose de composto “B” testada (12 mg/kg) (Figuras 5 e 6). O efeito positivo da substância de referência e do composto "B" sobre o desenvolvimento peso corporal e ganho diário também continuaram sob condições de estresse por calor (d22 a 42) (Figuras 5 e 6). No entanto, sob estresse por calor, os efeitos da substância de referência betaína sobre o desenvolvimento de peso corporal foram de 2 a 5% foram maiores comparados aos do composto "B" (Figuras 5 e 6). Em contraste com o período de pré-estresse por calor, uma clara .

50 / 59 resposta à dose do composto “B” pode ser observada sob estresse por calor (Figuras 5 e 6). Como os aditivos contra os efeitos negativos do estresse por calor são fornecidos durante todo o período de engorda, o forte efeito de pré-condicionamento da dose mais baixa do composto "B" foi mantido até o final do teste. No dia 42 as aves dos grupos tratados com a substância de referência (+170g) e com o composto "B" (+80 a +140g) apresentaram pesos corporais distintamente mais elevados comparado com as aves de controle não tratadas (Figuras 5 e 6). O peso corporal final mais elevado (+140 g) comparado ao controle negativo pode ser obtido com a dose mais baixa do composto "B". Resultados análogos aos encontrados para o desenvolvimento do peso corporal também podem ser observados para a taxa de conversão alimentar (Figura 7). Teste V: Validação in vivo dos efeitos benéficos de combinações de naringina (Composto "B") com diferentes concentrações de 1,8-cineol (Composto "A") no desempenho de crescimento, resposta à proteína de choque térmico e integridade da barreira intestinal em frangos sob estresse por calor

[218] No teste de dose-resposta para o composto “B” (Teste IV), efeitos benéficos sobre o desempenho dos frangos sob estresse por calor puderam ser observados. Verificou-se que a dose mais baixa de 12 mg/kg de dieta completa de Naringina resultou em valores de desempenho (peso corporal/ganho de peso/FCR) que foram ligeiramente melhores do que no grupo de referência de betaína. Concentrações mais altas de composto “B” não resultaram em benefícios adicionais para o desempenho de crescimento. No teste de dose-resposta para o composto “B” os efeitos benéficos sobre o desempenho dos frangos sob estresse por calor puderam ser observados. Consequentemente, neste teste, o valor adicional da adição de 1,8- Cineol (composto "A") de uma forma dose-dependente (6/12/24 mg/kg de ração) do composto "B" com dieta constante de 12 mg de Naringina/kg foi avaliado. A adição de 500 mg/kg de betaína isolada ou 500 mg de betaína + 12 mg de 1,8-cineol/kg serviram como grupos de referência.

[219] 1224 frangos Ross 308 machos de um dia de idade de um total de 1400 foram usados no experimento. Foram excluídos do processo de seleção os frangos .

51 / 59 que apresentassem sinais de problemas de saúde, lesões, muito pequenos ou em mau estado. Os frangos foram sexados na incubadora. Todos os pintinhos de um dia foram pesados individualmente e agrupados de acordo com o peso. As aves foram então designadas para 36 baias (6 repetições de 6 tratamentos), e cada baia inicialmente consistia de 34 frangos. No dia 4 do experimento em cada baia, os 2 frangos mais fracos foram removidos e todas as baias foram igualadas com 32 aves por baia por seleção negativa.

[220] As aves do grupo de controle negativo foram alimentadas com a dieta básica sem qualquer aditivo fitogênico. Os grupos de referência 2 e 6 foram alimentados com uma dieta fornecendo 500 mg/kg de betaína de uma fonte natural de betaína (Actibeet®, Agrana) ou 500 mg/kg de betaína de uma fonte natural de betaína (Actibeet®, Agrana) + 12 mg/kg de 1,8 Cineol (composto “A”). As pré-misturas fitogênicas foram adicionadas às dietas dos grupos 3, 4 e 5, fornecendo 12 mg/kg de Naringina mais 6, 12 ou 24 mg de 1,8-Cineol/kg (Tabela 8).

Tabela 8: Teste V: Grupos de tratamento experimental do teste de validação Tratame Betaína (controle Naringina (composto 1,8-cineol (composto nto positivo), B), A) mg/kg de ração mg/kg de ração mg/kg de ração T1 - - - T2 500 - - T3 - 12 6 T4 - 12 12 T5 - 12 24 T6 500 - 12

[221] A metodologia do Teste V, incluindo alojamento e manejo dos animais, preparação e composição das dietas experimentais, bem como a amostragem de órgãos e procedimentos estatísticos, foram análogos ao test IV. Resultados da validação in vivo dos efeitos benéficos de combinações de Naringina (composto "B") com diferentes concentrações de 1,8-cineol (composto A) .

52 / 59 no desempenho de crescimento, resposta à proteína de choque térmico e integridade da barreira intestinal em frangos sob estresse por calor (Teste V).

[222] A Tabela 9 mostra as concentrações analisadas de Betaína, Naringina e 1,8 cineol nas dietas do Teste V. Os valores analisados mostram que as especificações mínimas foram atingidas ou ultrapassadas para todos os grupos experimentais.

Tabela 9: Teste V: teor calculado de Betaína, Naringina e 1,8-cineol das dietas de teste Tratament Betaína 1,8-cineol Naringina Proporção o (controle positivo) (composto A) (composto B) (A:B) mg/kg de ração mg/kg de ração mg/kg de ração T1 - - - - T2 500 - - - T3 - 6 12 0,5:1 T4 - 12 12 1:1 T5 - 18 12 1,5:1 T6 - 24 12 2:1 T7 500 12 - 1:0

[223] Uma vez que o composto "B" no primeiro teste in vivo mostrou efeitos benéficos nos parâmetros de desempenho de frangos sob estresse por calor, que foram ligeiramente melhores em comparação com a substância de referência betaína, o objetivo deste teste foi testar os efeitos sinérgicos/benéficos de combinações de uma dose fixa de composto "B" (12 mg/kg) mais doses crescentes de composto "A" (6 a 24 mg/kg). A intenção deste estudo consiste em explorar combinações dos compostos "A" e "B" para o novo Aditivo Alimentar que Mantém o Bem-estar de Animais sob Condições de Estresse por Calor que excedem os efeitos da substância de referência betaína. Além disso, uma combinação de betaína com a dose intermediária do composto "A" (12 mg/kg) foi escolhida como uma segunda referência a fim de testar, se existem efeitos sinérgicos da betaína e do composto "A". Da mesma .

53 / 59 forma, como no teste 1, todos os aditivos (betaína e combinações dos compostos “A” e “B”) já demonstraram os efeitos de promoção do crescimento no período pré- estresse por calor (Figuras 8 e 9). Enquanto a betaína sozinha aumentou o ganho de peso diário em 2,5% em comparação com o controle negativo, a adição de 12 mg/kg de composto "A" reduziu esse efeito para quase 1%. Em contraste, todas as combinações do composto "B" mais o composto "A" excederam o efeito de promoção de crescimento da betaína isolada e, mais ainda, da combinação de betaína mais substância A (Figuras 8 e 9). Além disso, um efeito claro da dose-resposta pôde ser observado para as combinações “AB” (+ 2,1%; +2,5; +4,7%) (Figuras 8 e 9). Conforme observado no primeiro teste, a substância de referência betaína desenvolveu um melhor efeito promotor de crescimento sob condições de estresse por calor (+2,0%) em comparação com o controle negativo. Sob condições de estresse por calor, todas as combinações "AB" excederam os efeitos de desempenho de crescimento da betaína isolada distintamente. O efeito dose-resposta, encontrado no período de pré- estresse por calor, não pôde ser observado sob estresse por calor para as combinações testadas “AB”. Todas as combinações “AB” testadas aumentaram o desempenho de crescimento em 5,2 a 5,6% em comparação com o controle negativo e em 3,0% a 3,5% em comparação com a substância de referência betaína (Figuras 8 e 9), respectivamente. O mais interessante é que a combinação da substância de referência betaína com a dose média do composto "A", que falhou no período de pré- estresse por calor, revelou no período de estresse por calor até mesmo efeitos de promoção de crescimento ligeiramente melhores em comparação com as combinações “AB”. No entanto, uma vez que os aditivos alimentares que neutralizam o estresse por calor são usados durante todo o período de engorda, as combinações "AB" em geral resultaram na maior melhoria do peso corporal final em comparação com o controle negativo (+4,8%, +5,2%, +4,9%), para a substância de referência betaína (+1,6%, +2,0%, +1,8%) e também em comparação com a combinação de betaína mais a concentração média do composto "A" (+ 0,2%, +0,7%, +0,4%). Efeitos muito semelhantes, como os observados para desempenho de crescimento também foram encontrados para FCR (taxa de conversão alimentar) (Figura 10).

.

54 / 59 Teste VI: Validação in vivo dos efeitos benéficos das combinações do protótipo final de 1,8-cineol com naringina (AB) ou 1,8-cineol com Betalaína (AC).

[224] No teste de validação in vivo dos efeitos benéficos das combinações de Naringina (composto "B") com diferentes concentrações de 1,8-cineol (composto "A"), verificou-se que todas as combinações testadas de "AB" eram muito mais eficazes do que a betaína de controle positivo sozinha, e até mesmo a combinação de betaína + composto “A”. Assim, consequentemente o objetivo do último teste in vivo da série foi testar, se além da combinação "AB", bem como a combinação "AC" apresenta maior proteção e desempenho de crescimento em condições de estresse por calor do que 500 mg/kg de betaína como controle positivo.

[225] 816 frangos Ross 308 machos de um dia de idade de um total de 960 foram usados no experimento. Foram excluídos do processo de seleção os frangos que apresentassem sinais de problemas de saúde, lesões, muito pequenos ou em mau estado. Os frangos foram sexados na incubadora. Todos os pintinhos de um dia foram pesados individualmente e agrupados de acordo com o peso. As aves foram então designadas para 36 baias (6 repetições de 6 tratamentos), e cada baia inicialmente consistia de 34 frangos. No dia 4 do experimento em cada baia, os 2 frangos mais fracos foram removidos e todas as baias foram igualadas com 32 aves por baia por seleção negativa.

[226] As aves do grupo de controle negativo foram alimentadas com a dieta básica sem qualquer aditivo fitogênico. O grupo de referência 2 foi alimentado com dieta contendo 500 mg/kg de betaína de uma fonte natural de betaína (Actibeet®, Agrana). Foram adicionadas às dietas dos grupos 3 e 4 pré-misturas fitogênicas fornecendo12 mg de Naringina/kg de flavonoides cítricos ou 0,55 mg de Betalaína/kg de beterraba e barbárie, cada uma em combinação com 12 mg de 1,8-Cineol/kg da mistura de óleo de laminaceae (Tabela 10).

Tabela 10: Teste VI: Grupos de tratamento experimental .

55 / 59 Trata Betaína 1,8-Cineol (A) Naringina (B) Betalaína Proporção mento (Controle +) mg/kg de mg/kg de (C) A:B/C mg/kg de ração ração mg/kg de ração ração T1 - - - - - T2 500 - - - - T3 - 12 12 - 1:1 T4 - 12 - 55 0,2:1

[227] A metodologia do Teste VI, incluindo alojamento e manejo dos animais, preparação e composição das dietas experimentais, bem como a amostragem de órgãos e procedimentos estatísticos, foram análogos ao teste IV. Resultados da validação in vivo dos efeitos benéficos da combinação de 1,8- cineol com Naringina (AB) ou 1,8-cineol com Betalaína (AC) no desempenho de crescimento, resposta da proteína de choque térmico e integridade da barreira intestinal em frangos sob estresse por calor em comparação com a betaína como controle positivo (Teste VI).

[228] A Tabela 11 apresenta os valores analisados das concentrações de Betaína, 1,8-Cineol, Naringina e Betalaína no Teste VI.

Tabela 11: Teste VI - Teor de Betaína, 1,8-cineol, Naringina e Betalaína das dietas de teste Trata Betaína 1,8-Cineol (A) Naringina (B) Betalaína (C) ment (Controle +) mg/kg de mg/kg de ração mg/kg de ração o mg/kg de ração ração calculado calculado calculado proporção calculado proporção A:B A:C T1 - - - - - - T2 50 - - - - - T3 - 30 30 1:1 - - T4 - 1,37 - - 1,37 1:1

[229] Devido aos resultados positivos nos efeitos adicionais das substâncias .

56 / 59 "B" e "C" na resposta ao choque térmico em células CaCo2 (Figura 3E), no último teste desta série foi avaliado se sob condições de estresse por calor, não apenas combinações de substâncias “AB”, mas também combinações de substâncias “AC” mostram efeitos benéficos no desempenho de crescimento de frangos sob estresse por calor. Na fase pré-estresse por calor, o controle positivo (betaína) e as duas combinações "AB" e "AC" já melhoraram o peso corporal em 3,60 a 4,65% em comparação com o controle negativo não tratado (Figura 11). “AC” revelou ser a combinação mais eficaz, enquanto que neste teste “AB” foi ligeiramente menos eficaz do que a betaína (Figura 11). No entanto, durante o período de estresse por calor, ambas as combinações “AB” e “AC” revelaram seu alto potencial para melhorar o desempenho dos frangos. Ambos os aditivos melhoraram o peso corporal final em cerca de 1%, em comparação com o controle positivo, correspondendo a um peso corporal final 50g maior. O ganho de peso diário durante a fase de estresse por calor pôde ser ainda melhorado em cerca de 1,5% por ambas as combinações de “AB” e “AC” em comparação com a betaína de controle positivo (Figura 12). A melhora no peso corporal final e no ganho diário também foi refletido pela FCR (Figura 13), que foi melhorada em maior medida por ambas as combinações de “AB” e “AC” em comparação com o controle positivo (betaína).

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57 / 59 Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. UM ADITIVO ALIMENTAR PARA GADO caracterizado por conter pelo menos 1,5% de 1,8 cineol (p/p) e pelo menos naringina ou betalaína.

2. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter até 6% de 1,8-cineol (p/p).

3. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por conter pelo menos 3% de naringina (p/p), de preferência até 6% (p/p), e/ou pelo menos 0,1% de betalaína (p/p), de preferência até 3% (p/p).

4. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por conter a) 1,8 cineol e naringina a uma proporção de pelo menos 0,2:1 (p/p); e/ou b) 1,8 cineol e betalaína a uma proporção de pelo menos 4:1 (p/p).

5. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito 1,8 cineol estr contido em um óleo essencial, de preferência de plantas lamiaceae, de preferência de rosemarinus genus.

6. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela dita naringina estar contida em material vegetal cítrico, de preferência de laranja ou toronja.

7. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela dita betalaína estar contida em material vegetal de plantas da ordem Caryophyllales, de preferência da família amaranthaceae, de preferência de beta vulgaris.

8. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo conter uma mistura fluida de compostos fitogênicos, de preferência contendo um ou mais óleos essenciais, ervas secas, especiarias, carboidratos, agentes de volume ou antiaglomerantes ou outros excipientes.

9. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo ainda conter pelo menos um óleo essencial contendo carvacrol e/ou timol.

10. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com a reivindicação 9, caracterizado .

pelo conter pelo menos 0,05% de carvacrol (p/p) e/ou pelo menos 0,05% de timol (p/p).

11. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo ser uma preparação seca peletizável, estável em armazenamento, com uma estabilidade de pelo menos 18 meses à temperatura ambiente.

12. O ADITIVO ALIMENTAR de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo ser fornecido em uma preparação para uso na preparação de um produto alimentar para aves, suínos ou ruminantes.

13. UM PRODUTO ALIMENTAR caracterizado por conter a composição do aditivo de alimentação de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o produto alimentar contém a) 1,8 cineol a uma concentração de pelo menos 5 mg/kg; e b) naringina a uma concentração de pelo menos 10 mg/kg e/ou betalaína a uma concentração de pelo menos 0,3 mg/kg.

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Petição 870210017507, de 23/02/2021, pág. 68/177 5 % de sobrevivência de nematódeos % de sobrevivência de nematódeos Controle Controle Ácido ascóbico

% de sobrevivência de nematódeos % de sobrevivência de nematódeos Controle Betaína Controle

% de sobrevivência de nematódeos

Controle Fig: 1 1 / 14