ES2950246T3 - Medio de recuperación para la detección de microorganismos por fluorescencia - Google Patents

Medio de recuperación para la detección de microorganismos por fluorescencia Download PDF

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Sarah Smith
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Abstract

Se proporciona un medio de recuperación que es particularmente adecuado para seguir reacciones enzimáticas en las que el producto fluorescente se excita a una longitud de onda de 320 a 370 nm y emite a una longitud de onda de 420 a 460 nm. El medio de recuperación es de color transparente y no contiene la combinación de compuestos que participan en la reacción de Maillard. El medio de recuperación es adecuado para sistemas de indicadores biológicos autónomos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medio de recuperación para la detección de microorganismos por fluorescencia
Campo técnico
La presente solicitud se refiere a un método y dispositivo para detectar microorganismos viables por fluorescencia, en particular, para evaluar la efectividad de los procesos de esterilización. Más particularmente, la presente invención se refiere a un medio de recuperación para un indicador biológico.
Antecedentes
Los indicadores biológicos, que normalmente comprenden microorganismos de prueba (p. ej., esporas), se usan para evaluar la eficacia de los procesos de esterilización. El indicador biológico se pone en una cámara de esterilización y se somete a un proceso de esterilización junto con la carga destinada a la esterilización (por ejemplo, un producto sanitario). Una vez finalizado el proceso de esterilización, el indicador biológico se expone a un medio de soporte de crecimiento líquido en condiciones que promoverían el crecimiento de cualquier célula del organismo de prueba superviviente. Un proceso de esterilización exitoso está indicado por una inactivación completa (sin crecimiento) de los microorganismos de prueba. Un proceso de esterilización no exitoso está indicado por una inactivación incompleta (crecimiento detectado) de los microorganismos de prueba. El medio de recuperación puede contener un sustrato fluorogénico que, al contacto con enzimas sintetizadas por microorganismos, se escinde y se vuelve fluorescente. La detección de la actividad biológica se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un fluorómetro.
Sumario
Los indicadores biológicos usados en el aseguramiento de la esterilidad pueden contener un medio de recuperación que proporcione el cultivo de organismos de prueba viables. El medio normal de recuperación para las bacterias aeróbicas es el caldo de soja tríptica (TSB, por sus siglas en inglés), que es un caldo complejo de uso general que se usa comúnmente en los laboratorios microbiológicos. El TSB ha sido el punto de partida para medios para numerosos indicadores biológicos comerciales para varios métodos de esterilización, incluidos vapor, peróxido de hidrógeno en fase de vapor, óxido de etileno, etc. Estas formulaciones de caldo pueden contener tintes que responden al pH, lo que proporciona evidencia visual del crecimiento de organismos, o que responden a la actividad enzimática, produciendo un resto fluorescente que se lee con un fluorómetro.
Los indicadores biológicos se usan para garantizar que los artículos sometidos a un proceso de esterilización se hayan vuelto estériles al final de un ciclo exitoso. Los indicadores biológicos para procesos de esterilización hacen uso del “organismo más resistente” (MRO, por sus siglas en inglés) para el proceso. Este es generalmente un organismo formador de esporas, ya que las esporas son un estado de supervivencia del organismo muy difícil de destruir. En el caso de la esterilización con peróxido de hidrógeno en fase de vapor y vapor, el organismo normalmente es la bacteria Geobacillus stearothermophilus, que forma esporas cuando se somete a condiciones deficientes.
Un aspecto de los indicadores biológicos que ha experimentado continuos esfuerzos de mejora es el tiempo requerido para determinar una respuesta negativa. Una respuesta negativa indica un ciclo de esterilización exitoso. A los efectos de presentar un nuevo indicador biológico a la Administración de Alimentos y Medicamentos para su autorización, se considera que el tiempo de incubación estándar para determinar una respuesta de crecimiento negativa es de siete días. Cualquier tiempo menor que siete días se considera un tiempo de incubación reducido (RIT, por sus siglas en inglés).
Con la llegada de productos sanitarios y procedimientos médicos más complicados y la necesidad de mantener bajos niveles de inventario para lograr costes operativos reducidos, las clínicas médicas y los hospitales no desean esperar siete días para determinar si una carga de instrumentos es estéril. Por lo tanto, los indicadores biológicos (BI, por sus siglas en inglés) con RIT más cortos han sido probados y autorizados para su uso por la FDA. Los RIT comunes para un BI de cambio de color visual son de varias horas a uno o dos días. El BI de cambio de color visual no requiere equipo especial más que una unidad para mantener el BI a la temperatura deseada.
Debido a que la medición de moléculas fluorescentes es más sensible que los métodos colorimétricos, se hizo un avance con los primeros BI fluorescentes, donde el RIT es de 30 minutos a 4 horas. El BI fluorescente requiere una unidad capaz de mantener la temperatura, suministrar luz de una longitud de onda específica y detectar la luz generada a otra longitud de onda. Los lectores/incubadoras autorizados por la FDA también contienen algunos medios para determinar la diferencia entre una respuesta positiva (no estéril) y una respuesta negativa (esterilización exitosa). La respuesta positiva puede ser expresada más rápidamente por el lector/incubadora que una respuesta negativa. Por lo tanto, la notificación de un resultado no estéril puede ocurrir más rápidamente que la garantía de un resultado estéril.
El TSB es un medio complejo que contiene dos componentes principales de características menos definidas. El primero es la triptona, que es un digerido de la caseína por la proteasa, lo que da como resultado una mezcla de péptidos. El segundo es la fitona, un digerido enzimático de harina de soja. El TSB también contiene cloruro de sodio (un mediador osmótico), fosfato dipotásico (un tampón) y glucosa (un azúcar reductor y una fuente de alimento).
Los dos primeros componentes son productos naturales y, aunque el proceso está controlado, los constituyentes del producto natural pueden cambiar en función de las materias primas. El origen de la caseína y/o la soja puede inducir cambios debido a las condiciones climáticas de crecimiento, variaciones de crecimiento para animales o plantas, variaciones nutricionales, etc. Por lo tanto, los productos finales no pueden estar bien definidos y, si bien son apropiados para un medio de propósito general, añadirá variación en un método de detección sensible en que se use fluorescencia.
De particular importancia con el TSB es el hecho de que los componentes del medio son de color pardo amarillento y, cuando se mezclan con un azúcar reductor, están sujetos a la reacción de Maillard. La reacción de Maillard abarca el pardeamiento no enzimático que ocurre cuando se calienta una mezcla de aminoácidos y azúcares reductores. Esta reacción de pardeamiento es reconocible, por ejemplo, por el color pardo de los productos horneados y las marcas de sellado en las carnes cocinadas. También se ha encontrado que la reacción de Maillard ocurre a temperatura ambiente.
Por lo tanto, un medio de TSB inicialmente será de color pardo amarillento y continuará aumentando de color con las posteriores exposiciones a la esterilización por vapor y/o el envejecimiento. Esto se evidencia midiendo la absorbancia de una disolución a una longitud de onda de 420 nm. Es más, la reacción de Maillard también produce una mezcla de compuestos fluorescentes, algunos indicados con espectros de emisión en el intervalo de longitudes de onda de 420 nm a 440 nm. Esta fluorescencia de fondo puede afectar negativamente a la precisión y velocidad a la que se detecta la actividad enzimática del indicador biológico.
Una familia de indicadores fluorescentes comunes, los metilumbeliferil-piranósidos (también conocidos como hidroximetilcumarinas), emite una señal fluorescente en la región de 445 nm. El metilumbeliferil-gluco- o galactopiranósido se usa en la determinación de glucosidasas o galactosidasas (enzimas). Cuando la enzima apropiada actúa sobre el precursor fluorescente, la molécula se escinde, liberando glucosa o galactosa y el compuesto fluorescente, 4-metilumbelliferona (4MU). La 4MU se excita a 365 nm en un tampón de glicina y emite a 445 nm.
La presencia tanto de los componentes coloreados en el medio TSB como de los compuestos fluorescentes generados por la reacción de Maillard interferirá con la variación en la señal de salida de interés o aumentará esta, por ejemplo, luz emitida a aproximadamente 445 nm.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de recuperación definido que es de color claro y no contiene la combinación de compuestos que participan en la reacción de Maillard. Los medios de recuperación descritos en el presente documento son particularmente adecuados para las siguientes reacciones enzimáticas en las que el producto fluorescente se excita a una longitud de onda de 320 nm a 370 nm y emite a una longitud de onda de 420 nm a 460 nm.
Si bien el uso de los medios de recuperación se describe en el presente documento como particularmente adecuado como medio de recuperación para un sistema indicador biológico autónomo, los medios de recuperación descritos en el presente documento también se pueden usar para determinar una concentración de enzima o para seguir una reacción enzimática mediante el uso de un resto fluorescente. Los medios de recuperación también se pueden usar para producir un estándar de calibración para los lectores/incubadoras mencionados anteriormente.
En un aspecto de la presente invención, un medio de recuperación para detectar la presencia de microorganismos incluye al menos una sal mineral; y al menos un sustrato fluorogénico; en donde el medio de recuperación es de color claro y está sustancialmente exento de azúcar reductor. El medio de recuperación puede incluir además al menos un aminoácido y/o al menos una vitamina.
El sustrato fluorogénico del medio de recuperación puede incluir un derivado de 4-metilumbeliferilo. El derivado de 4-metilumbeliferilo puede incluir 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranósido.
En una realización, el sustrato fluorogénico del medio de recuperación incluye un grupo fluoróforo escindible que emite fluorescencia en el intervalo de 420 nm a 460 nm para una longitud de onda de excitación en el intervalo de 320 nm a 370 nm. El fluoróforo escindible puede incluir 4-metilumbeliferona (4-MU).
En una realización, el medio de recuperación no absorbe energía luminosa en el intervalo de longitudes de onda de 420 nm a 450 nm.
En un aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la eficacia de un procedimiento de esterilización, incluyendo el método las etapas siguientes: (i) poner un indicador biológico que contenga al menos una enzima activa en una cámara de esterilización; (ii) realizar el procedimiento de esterilización dentro de la cámara en donde el indicador biológico se expone a un medio de esterilización; (iii) poner en contacto el indicador biológico con un medio de recuperación que incluya al menos una sal mineral y al menos un sustrato fluorogénico que comprenda un grupo fluoróforo escindible, en donde el medio de recuperación es de color transparente y está sustancialmente exento de azúcar reductor; (iv) incubar el indicador biológico durante un período de tiempo; y (v) detectar la presencia o ausencia de señal fluorescente emitida por el grupo fluoróforo.
El medio de esterilización del procedimiento de esterilización puede incluir vapor, calor seco, radiación, plasma, uno o más esterilizantes gaseosos y/o uno o más esterilizantes líquidos.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un monitor de esterilización que incluye un primer compartimento que contiene un indicador biológico, conteniendo el indicador biológico al menos una enzima activa, estando adaptado el primer compartimento para permitir que el indicador biológico se ponga en contacto con un medio de esterilización durante un proceso de esterilización; y un segundo compartimento que contiene un medio de recuperación, estando adaptado el segundo compartimento para mantener el medio de recuperación separado del indicador biológico durante el proceso de esterilización, y para permitir que el medio de recuperación entre en contacto con el indicador biológico después de que el indicador biológico haya sido expuesto al medio de esterilización, en donde el medio de recuperación incluye al menos una sal mineral; y al menos un sustrato fluorogénico; en donde el medio de recuperación es de color claro y está sustancialmente exento de azúcar reductor.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una ilustración esquemática de un monitor de esterilización adecuado para usar con la presente invención, mostrándose el monitor de esterilización en una configuración preactivada.
La figura 2 es una ilustración esquemática del monitor de esterilización de la figura 1 en una configuración activada.
La figura 3 es una ilustración esquemática de otra realización de un monitor de esterilización adecuado para usar con la presente invención, mostrándose el monitor de esterilización en una configuración preactivada.
Descripción detallada
El término “microorganismo” se refiere a un organismo vivo microscópico. Los microorganismos pueden ser unicelulares, multicelulares o en forma de agrupaciones de células. Los microorganismos pueden comprender bacterias, arqueas, protozoos, hongos, algas, virus, parásitos animales multicelulares (helmintos), o una combinación de dos o más de estos. Los microorganismos pueden comprender esporas. Los microorganismos pueden comprender esporas bacterianas.
El término “bacteria” se refiere a un dominio de microorganismos procarióticos. Las bacterias pueden ser microorganismos unicelulares. Las células pueden describirse como procariotas porque carecen de núcleo. Las células bacterianas pueden tener una de cuatro formas principales: bacilo (forma de bastón), coco (forma esférica), espirilla (forma espiral) o vibrio (forma curva). Las bacterias pueden tener una pared de peptidoglucano. Las bacterias pueden dividirse por fisión bacteriana. Las bacterias pueden poseer flagelos para la movilidad. Las bacterias pueden clasificarse como grampositivas o gramnegativas cuando se usa la tinción de Gram. Las bacterias se pueden dividir según su respuesta al oxígeno gaseoso en los siguientes grupos: aeróbicas (que viven en presencia de oxígeno), anaeróbicas (que viven sin oxígeno) y anaeróbicas facultativas (pueden vivir en ambos entornos). Las bacterias pueden clasificarse como heterótrofas o autótrofas. Las autótrofas elaboran su propio alimento usando la energía de la luz solar o reacciones químicas, en cuyo caso se denominan quimioautótrofas. Las heterótrofas obtienen su energía consumiendo otros organismos. Las bacterias que usan formas de vida en descomposición como fuente de energía pueden llamarse saprófitas.
El término “espora” se refiere a una unidad de reproducción asexual que puede adaptarse para la dispersión y la supervivencia durante períodos prolongados de tiempo en condiciones desfavorables. Las esporas son tipos de células latentes altamente resistentes. Las endosporas (o simplemente esporas) se forman dentro de la célula madre vegetativa en respuesta a cambios adversos en el entorno, más comúnmente agotamiento de nutrientes. La célula madre experimenta una división celular asimétrica, donde replica su material genético, que entonces se rodea de múltiples capas concéntricas y específicas de esporas. Entonces, la célula madre se disgrega, liberando la espora inactiva madura que no requiere nutrientes, agua ni aire para sobrevivir y está protegida contra diversos traumas, que incluyen temperaturas extremas, radiación y ataques químicos.
El término “espora bacteriana” se refiere a una espora producida por una bacteria.
El término “microorganismo de prueba” se refiere a un microorganismo que puede usarse para probar la eficacia de un proceso de esterilización. El microorganismo de prueba puede ser más resistente a un proceso de esterilización que los organismos que se destruyen durante el proceso de esterilización. En teoría, si los microorganismos de prueba murieran durante un proceso de esterilización, entonces todos los organismos que se destruyen durante el proceso de esterilización que son menos resistentes a la esterilización que los microorganismos de prueba también morirían. Los microorganismos de prueba pueden comprender bacterias. Los microorganismos de prueba pueden comprender esporas. Los microorganismos de prueba pueden comprender esporas bacterianas. Los microorganismos de prueba pueden comprender esporas de los géneros Bacillus o Clostridia. Los microorganismos de prueba pueden comprender esporas de Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, o una mezcla de dos o más de estos. Los microorganismos de prueba pueden comprender esporas de Geobacillus stearothermophilus, esporas de Bacillus atrophaeus o una mezcla de estos.
El término “indicador biológico” se refiere a un artículo o material que puede usarse para determinar la eficacia de un proceso de esterilización. El indicador biológico puede comprender microorganismos de prueba (por ejemplo, bacterias, esporas o esporas bacterianas). El indicador biológico puede comprender microorganismos de prueba en un vehículo. El indicador biológico puede comprender bacterias, las bacterias pueden estar presentes dentro de un espacio definido o depositadas en un vehículo. El indicador biológico puede comprender esporas (p. ej., esporas bacterianas), las esporas pueden estar presentes dentro de un espacio definido o en un vehículo. El indicador biológico puede comprender una tira de esporas.
El término “esterilización” se refiere a hacer que una sustancia sea incapaz de reproducirse, metabolizarse y/o crecer. Si bien esto se considera a menudo como ausencia total de organismos vivos, el término puede usarse en el presente documento para referirse a una sustancia exenta de organismos vivos en un grado previamente acordado como aceptable. A menos que se indique lo contrario, el término esterilización se usa en el presente documento para referirse también a métodos y procedimientos menos rigurosos que la esterilización, por ejemplo, desinfección, higienización y similares. El indicador biológico y los procesos y aparatos descritos en el presente documento se pueden usar en campos de atención médica, campos científicos y similares. Estos pueden usarse en aplicaciones comerciales e industriales en las que puede desearse esterilización, desinfección, higienización, descontaminación, limpieza y similares. Las aplicaciones comerciales e industriales pueden incluir procesos tales como procesamiento de alimentos, pasteurización, remediación de suelos, remediación de aguas y similares.
En un aspecto de la presente invención, un medio de recuperación para un indicador biológico incluye un soporte nutritivo líquido en el que se solubiliza al menos un sustrato fluorogénico. El medio es de color transparente, lo que aumenta la eficacia de la fluorescencia medida y la sensibilidad de medición para ensayos fluorescentes basados en precursores de metilumbeliferil-piranósido y/o cualquier otro ensayo en que se generen moléculas fluorescentes con longitudes de onda de emisión en el intervalo de 400 nm a 450 nm.
El término “de color claro” descrito anteriormente significa que el medio es sustancialmente incoloro en la región de luz visible de aproximadamente 390 nm a 700 nm.
El medio de recuperación incluye una mezcla de aminoácidos, vitaminas, iones metálicos, sales minerales y una solución tampón. El componente de aminoácido puede incluir mezclas de dos o más de ácido L-glutámico, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina y L-valina, y sales de sodio y/o clorhidrato de los aminoácidos. Los ejemplos de vitaminas pueden seleccionarse entre D-biotina, tiamina y ácido nicotínico. El medio puede contener uno o más de cloruro de hierro, cloruro de calcio, sulfato de zinc, cloruro de manganeso, cloruro de amonio, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato de potasio y dipotasio como base.
El medio de recuperación incluye un sustrato enzimático, que cuando la enzima indicadora actúa sobre él, se convierte en un producto modificado con enzima. El sustrato enzimático puede comprender un sustrato fluorogénico, definido en el presente documento como un material sobre el que actúa una enzima para producir un compuesto fluorescente.
Hay dos tipos básicos de sustratos fluorogénicos que pueden usarse para la detección de enzimas indicadoras específicas. Al primer tipo de sustrato fluorogénico se le puede dar una fórmula química como AB. Cuando actúa sobre la enzima indicadora, AB, puede descomponerse en A+B. B, por ejemplo, puede ser fluorescente. En una realización, dos compuestos B pueden reaccionar entre sí para producir la señal fluorescente. Un ejemplo específico de sustrato fluorogénico de este tipo puede ser el fosfato de 4-metilumbeliferilo. En presencia de la enzima indicadora fosfatasa, el sustrato puede descomponerse en 4-metilumbeliferona y fosfato. Otros sustratos fluorogénicos de este tipo pueden incluir los derivados de 4-metilumbeliferilo, 7-amido4-metilcumarina, indoxilo y fluoresceína.
El segundo tipo de sustrato fluorogénico puede estar dado por la fórmula química CD, por ejemplo, que puede convertirse mediante una enzima específica en C+D. Sin embargo, ni C ni D pueden ser fluorescentes, pero D puede reaccionar además con el compuesto Z para dar un compuesto fluorescente, lo que indica actividad enzimática. Un ejemplo fluorogénico específico de este tipo puede ser el aminoácido lisina. En presencia de la enzima lisina descarboxilasa, la lisina puede perder una molécula de CO2. La parte restante de la lisina puede entonces llamarse cadaverina, que es fuertemente básica. Se puede incorporar un indicador básico como 4-metilumbeliferona y puede ser fluorescente en presencia de una base fuerte.
Se pueden usar varios sustratos enzimáticos para enzimas indicadoras de diversos orígenes. Estos pueden incluir derivados fluorógenos de 4-metilumbeliferilo (hidrolizables a 4-metilumbeliferona (4-MU)); derivados de 7-amido-4-metil-cumarina; derivados de diacetilfluoresceína; y fluorescamina.
Los derivados de 4-metilumbeliferilo que pueden usarse como sustrato enzimático pueden incluir: 4-metilumbeliferil-2-acetamido-4,6-O-bencilideno-2-desoxi-beta-D-lucopiranósido; acetato de 4-metilumbeliferilo; 4-metilumbeliferil-N-acetil-beta-D-galactosaminida; 4-metilumbeliferil-N-acetil-alfa-D-glucosaminida; 4-metilumbeliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminida; ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-alfa-D-N-acetilneuramínico; 4-metilumbeliferil-alfa-L-arabinofuranósido; 4-metilumbeliferil-alfa-L-arabinósido; butirato de 4-metilumbeliferilo; 4-metilumbeliferil-beta-D-celobiósido; metilumbeliferil-beta-D-N, N'-diacetilquitobiósido; elaidato de 4-metilumbeliferilo; 4-metilumbeliferil-beta-D-fucósido; 4-metilumbeliferil-alfa-L-fucósido; iferil-beta-L-fucósido de 4-metilum bell; 4-metilumbeliferil-alfa-D-galactósido; 4-metilumbeliferil-beta-D-galactósido; 4-trifluorometilumbeliferil-beta-D-galactósido; 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil-beta-D-galactósido; 4-metilumbeliferil-alfa-D-glucósido; 4-metilumbeliferil-beta-D-glucósido; 4-metilumbeliferil-7,6-sulfo-2-acetamido-2-desoxi-beta-D-glucósido; 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido; 6,8-difluor-4-metilumbeliferilbeta-D-glucurónido; p-guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferilo; heptanoato de 4-metilumbeliferilo; annopiranósido de 4-metil etilum bell iferil-alfa-D-m; 4-metilumbeliferil-beta-D-manopiranósido; oleato de 4-metilumbeliferilo; oleato de 4-trifluorometilumbeliferilo; palmitato de 4-metilumbeliferilo; fosfato de 4-metilumbeliferilo; propionato de 4-metilumbeliferilo; estearato de 4-metilumbeliferilo; sulfato de 4-metilumbeliferilo; 4-metilumbeliferil-beta-D-N, N', N"-triacetilquitotriosa; 4'-metilumbeliferil-2,3,5-tri-betabenzoil-alfa-L-arabinofuranósido; cloruro de 4-metilumbeliferil-beta-trimetilamonio cinamato; 4-guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferilo y 4-metilumbeliferil-beta-D-xilósido.
Los derivados de 7-amido-4-metilcumarina que pueden usarse como sustrato enzimático pueden incluir: L-alanina-7-amido-4-metilcumarina; L-prolina-7-amido-4-metilcumarina; L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina; L-arginina-7-amido-4-metilcumarina; L-citrulina-7-amido-4-metilcumarina; L-leucina-7-amido-4-metilcumarina; L-metionina-7-amido-4-metilcumarina; ácido L-piroglutámico 7-amido-4-metilcumarina; ácido L-aspártico beta-(7-amido-4-metilcumarina); ácido L-glutámico 1-(7-amido-4-metilcumarina); L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina; y 7-glutaril-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina.
Los derivados peptídicos de la 7-amido-4-metilcumarina que pueden usarse como sustrato enzimático pueden incluir: N-t-BOC-Ile-Glu-Gly-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-CBZ-Phe-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-succinil-Leu-Tyr-7-amido-4-metilcumarina; Gly-Pro 7-amido-4-metilcumarina; Pro-Phe-Arg 7-amido-4-metilcumarina; N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-amido-4-metilcumarina; y N-glutaril-Gly-Arg 7-amido-4-metilcumarina.
Los derivados de diacetilfluoresceína que se pueden usar como sustrato enzimático pueden incluir diacetato de fluoresceína, dibutirato de fluoresceína, diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína, diacetato de fluoresceína-(beta-D-N-acetilgalactosamina), di-(beta-D-galactósido)-fluoresceína, mono-(beta-D-galactósido)-fluoresceína y dilaurato de fluoresceína.
El sustrato enzimático usado puede depender de la identidad de la enzima indicadora cuya actividad se está estudiando. Cuando la enzima indicadora cuya actividad deba detectarse sea la alfa-D-glucosidasa, la quimiotripsina o la esterasa de ácidos grasos, un sustrato enzimático fluorogénico que puede usarse puede ser 4-metilumbeliferil-alfa-D-glucósido, 7-glutarilfenilalanina-7-amido-4-metilcumarina o heptanoato de 4-metilumbeliferilo, respectivamente. Cuando la enzima indicadora cuya actividad se va a detectar sea alfa-L-arabinofuranosidasa, un sustrato de enzima fluorogénico que se puede usar puede ser 4-metilumbeliferil-alfa-L-arabinofuranósido. Cuando la enzima indicadora cuya actividad se va a detectar es la beta-D-glucosidasa, un sustrato enzimático fluorogénico que se puede usar puede ser el 4-metilumbeliferil-beta-D-glucósido.
En una realización, la molécula precursora fluorescente es 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranósido (MUD) en dimetilsulfóxido (DMSO). La escisión enzimática libera 4-MU, lo que da como resultado una fluorescencia asociada con el anión 4-MU que tiene una longitud de onda de emisión de 445 nm a una longitud de onda de excitación de 365 nm. Pueden usarse otras moléculas precursoras fluorescentes disueltas en otros disolventes.
Un constituyente adicional del medio de recuperación puede ser un azúcar no reductor. Un azúcar no reductor es un carbohidrato que no es oxidado por un agente oxidante débil (un agente oxidante que oxida los aldehidos, pero no los alcoholes) en disoluciones acuosas básicas. La propiedad característica de los azúcares no reductores es que, en medio acuoso básico, no generan ningún compuesto que contenga un grupo aldehído. Los ejemplos de azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, rafinosa y melezitosa. Se prefieren los azúcares no reductores, que no participan en la reacción de Maillard, ya que no imparten un color pardo amarillento al medio tras la interacción con los aminoácidos. Adicionalmente, proporcionan una fuente de energía/alimento para las bacterias.
El pH del medio de recuperación es preferiblemente de aproximadamente 7.2 a 7.5 para permitir las condiciones para el metabolismo de los microorganismos. El pH también podría variar desde valores ácidos hasta aproximadamente pH 11. El medio es de color claro y no absorbe luz en la región de 420-450 nm en la medida en que lo hace el medio TSB, lo que aumenta la eficiencia de la fluorescencia medida y la sensibilidad de la medición.
El medio no incluye un azúcar reductor y, por lo tanto, no está sujeto a la reacción de Maillard. Los azúcares reductores incluyen maltosa, lactosa, melibiosa, celobiosa, gentiobiosa, fructosa, galactosa, glucosa, gliceraldehído, ribosa y xilosa. La ausencia de un azúcar reductor también reduce la posibilidad de que se generen moléculas fluorescentes extrañas que podrían interferir, como un sesgo positivo, con la determinación precisa de la enzima de interés. Como se analizó anteriormente, el medio no es de color pardo amarillento y, por lo tanto, permitirá un aumento en la sensibilidad de detección de enzimas.
Incluso en ausencia de una fuente de azúcar, se ha encontrado que los medios de recuperación permiten el crecimiento de organismos en matraces de agitación.
En un aspecto de la presente invención, el medio de recuperación contiene los siguientes constituyentes dentro de los intervalos de concentración indicados en la Tabla 1 a continuación.
TABLA 1
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La concentración de sustrato enzimático en el medio de recuperación puede depender de la identidad del sustrato enzimático y la enzima indicadora, la cantidad de producto modificado con enzima que debe generarse para ser detectable y la cantidad de tiempo requerida para determinar si una enzima indicadora está presente. La cantidad de sustrato enzimático que puede ser suficiente puede ser la cantidad necesaria para reaccionar con cualquier enzima indicadora que pueda estar presente después de que se haya completado la esterilización, de modo que un producto modificado con enzima a una concentración molar de al menos aproximadamente 10-15 molar puede producirse en un período de hasta aproximadamente 4 horas, o una concentración molar de al menos aproximadamente 10-8 molar en un período de hasta aproximadamente 2 horas.
El medio de recuperación se puede combinar con el indicador biológico después de que el indicador biológico se haya sometido al ciclo de esterilización. Entonces, se puede incubar el medio de recuperación que contiene el indicador biológico. La incubación puede continuar durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para liberar una cantidad detectable de la enzima indicadora, suponiendo que alguno de los indicadores biológicos permanezca funcional. En general, la cantidad de enzima indicadora que puede detectarse puede ser tan baja como aproximadamente 1 x 10-15 molar. Las condiciones de incubación pueden ser suficientes para generar al menos aproximadamente 1 * 10-8 molar de enzima indicadora, o desde aproximadamente 1 * 10-6 hasta aproximadamente 1 * 10-5 molar de enzima indicadora. El tiempo y la temperatura de incubación necesarios para producir una cantidad detectable de enzima indicadora pueden depender de la identidad de la enzima indicadora y de la concentración de la enzima indicadora en el medio de recuperación. La temperatura de incubación puede estar en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 70 °C. El tiempo de incubación puede estar en el intervalo de hasta aproximadamente 4 horas, o en el intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 4 horas, o en el intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 3 horas, o en el intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 2 horas, o en el intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 hora. La enzima indicadora actúa sobre el sustrato enzimático para formar un producto modificado con enzima que puede detectarse. La detección se puede lograr dentro de un período de tiempo de hasta aproximadamente 4 horas, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 4 horas, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 3 horas, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 2 horas, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.7 horas, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 horas.
El indicador biológico, aunque en el presente documento se describe principalmente en términos de una única enzima indicadora, puede proporcionar una pluralidad de enzimas indicadoras. Por ejemplo, el indicador biológico puede proporcionar tres tipos de enzimas indicadoras, siendo una enzima resistente al calor, una segunda resistente a medios esterilizantes gaseosos y una tercera resistente a la radiación, por ejemplo, radiación gamma o beta.
En una realización, la composición del medio de recuperación es como se muestra en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2
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El medio de recuperación descrito en el presente documento se puede usar en un monitor de esterilización. En una realización, el monitor de esterilización es un monitor de esterilización autónomo que incluye un contenedor con dos compartimentos separados. Uno de los compartimentos puede contener el indicador biológico. El otro compartimento puede contener el medio de recuperación. En uso, el monitor de esterilización y los artículos para esterilizar están expuestos al medio de esterilización. Después de la esterilización, el monitor de esterilización se activa para que el indicador biológico entre en contacto con el medio de recuperación lo suficiente como para determinar si el proceso de esterilización es efectivo. El monitor de esterilización se puede usar con cualquier proceso de esterilización en donde el indicador biológico se exponga al medio de esterilización, por ejemplo, procesos de esterilización en que se empleen esterilizantes gaseosos.
Haciendo referencia a las Figs. 1 y 2, se describe un monitor 10 de esterilización. El monitor 10 de esterilización incluye la tapa 20 que está montada en el contenedor 30. El contenedor 30 incluye un extremo 31 inferior cerrado, un extremo superior abierto y un espacio 34 interior. La tapa 20 tiene una pared 22 externa, un extremo inferior abierto y un extremo 23 superior cerrado. La tapa 20 también incluye una pared 24 interna y una cámara 26 interna. La cámara 26 interna incluye una abertura 25 adyacente al extremo inferior de la pared 24. La cámara 26 interna contiene el medio 50 de recuperación. La tapa 20 incluye una barrera 40 rompible que cubre la abertura 25 y encapsula el medio 50 de recuperación dentro de la cámara 26. El monitor 10 de esterilización está configurado para que la tapa 20 se monte en el contenedor 30 en una relación de encaje a presión. En otras realizaciones, no mostradas, el monitor 10 de esterilización puede configurarse para que la tapa 20 se monte en el contenedor 30 en una relación roscada en la que la tapa 20 se acopla con el contenedor 30 mediante roscas y el sistema se activa girando la tapa 20 con respecto al contenedor 30, es decir, enroscando más la tapa 20 sobre el contenedor 30.
El contenedor 30 incluye una proyección 32 anular que forma una cresta o labio adyacente o cerca del extremo superior del contenedor 30. La tapa 20 incluye una proyección 29 anular que forma una cresta o labio adyacente a la parte inferior de la tapa 20. La tapa 20 puede montarse sobre el contenedor 30 deslizando la cresta 29 de la tapa sobre la cresta 32 del contenedor. La cresta 32 del contenedor 30 se acopla con la cresta 29 de la tapa 20 para evitar que la tapa 20 y el contenedor 30 se desacoplen. La tapa 20 y el contenedor 30 pueden tener un tamaño tal que la cresta 32 ejerza suficiente presión contra la tapa 20 para evitar que la tapa 20 se deslice hacia abajo sin aplicar una fuerza externa hacia abajo a la tapa 20.
El contenedor 30 incluye uno o más miembros 36 de perforación que están adaptados para romper o perforar la barrera 40 rompible cuando la tapa 20 se mueve hacia abajo, y la barrera 40 hace contacto con el punto 38 del miembro 36 de perforación. El miembro 36 de perforación se muestra extendiéndose hacia arriba desde la pared 37 inferior del contenedor 30. En otra realización, no mostrada, el miembro 36 de perforación puede extenderse hacia arriba desde la pared 35 lateral, o desde la pared 35 lateral y la pared 37 inferior.
Para evaluar un proceso de esterilización, se coloca una concentración calibrada del indicador biológico dentro del interior 34 del contenedor 30. El indicador biológico puede colocarse directamente en las paredes 35 del contenedor o proporcionarse en un miembro de soporte (p. ej., el miembro 70 de soporte) que se coloca dentro del contenedor 30. La cámara 26 interna está llena de medio 50 de recuperación. Entonces se ensambla el monitor 10 de esterilización montando la tapa 20 en el contenedor 30. La tapa 20 puede montarse encajando a presión la tapa 20 en el contenedor 30 como se ha descrito anteriormente o, por ejemplo, mediante un montaje roscado. Con referencia a la Fig. 3, la tapa 20 está montada en el contenedor 30 en una primera posición no activada (o abierta) de manera que la barrera 40 rompible permanece intacta y no es perforada por el miembro 36 de perforación.
Con el monitor 10 de esterilización ensamblado como se muestra en la Fig. 1, el monitor 10 de esterilización puede someterse entonces a un proceso de esterilización. La tapa 20 tiene aberturas 28 a través de las cuales ingresa un vapor esterilizante al monitor 10 de esterilización. El esterilizante ingresa a la tapa a través de las aberturas 28 (en el espacio entre la pared 22 y la pared 24) y fluye hacia el contenedor 30 a través de un espacio 60 definido entre la superficie exterior de la pared interna 24 de la tapa 20 y la superficie interna de la pared 35. El vapor esterilizante fluye hacia el contenedor 30 y entra en contacto con el indicador biológico.
Después de completar el proceso de esterilización, el monitor 10 de esterilización se puede activar moviendo la tapa 20 hacia abajo, hacia el contenedor 30 a una segunda posición (o cerrada o activada), que se ilustra en la figura 2. La tapa 20 se mueve hacia abajo aplicando una fuerza o presión hacia abajo suficiente sobre la tapa 20. A medida que la tapa 20 se mueve hacia abajo, la barrera 40 rompible se pone en contacto con la punta 38 del miembro 36 perforador y finalmente se mueve a una posición tal que la punta 38 perfora la barrera 40 rompible. Cuando se perfora la barrera 40 rompible, el medio 50 de recuperación drena en el espacio 34 interno del contenedor 30 y entra en contacto con el indicador biológico. Puede ser deseable mover la tapa 20 hacia abajo con un movimiento giratorio para efectuar una apertura mayor o máxima de la barrera 40 rompible para asegurar el drenaje completo del fluido inductor al contenedor.
La superficie interna de la tapa 20 incluye una segunda proyección 27 anular. La tapa 20 se puede mover hacia abajo hasta una posición tal que la parte superior de la proyección 27 se acople con la parte inferior de la cresta 32 del contenedor 30 para que la tapa 20 quede en una segunda posición cerrada/activada. La posición cerrada/activada queda la tapa 20 en una relación sellada con el contenedor 30. Entonces, el monitor 10 de esterilización se incuba durante un período de tiempo suficiente para permitir que se determine la viabilidad del microorganismo. Durante la incubación, cualquier microorganismo viable del indicador biológico se metabolizará y crecerá. Este metabolismo libera subproductos al medio 50 de recuperación. Los subproductos pueden detectarse mediante cualquier propiedad seleccionada incluyendo, por ejemplo, cambio de pH, cambio de color, opacidad, fluorescencia y similares.
En otra realización, la tapa 20 no incluye la segunda proyección 27 para mantener el contenedor en la posición cerrada. El contenedor 30 puede incluir otra proyección anular o un conjunto de retenes (no mostrados) en el exterior del contenedor 30 y ubicados debajo de la cresta 32, cuya proyección o cuyos retenes se pueden adaptar para acoplar la cresta 29 en la tapa para mantener el contenedor 30 en posición cerrada. La Patente de EE. UU. número 5,770,393 ilustra una configuración de este tipo, por sus explicaciones relativas a las configuraciones de tapa y contenedor.
En otra realización, la superficie interna de la tapa 20 y la superficie externa del contenedor 30 se pueden roscar, y la tapa 20 se puede mover y mantener en una posición cerrada enroscando la tapa 20 en el contenedor 30, en el que la tapa 20 se puede enroscar como se muestra, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. número 8,173,388 B2.
La tapa 20, en la realización ilustrada en las Figs. 1 y 2 se muestra con la abertura 28 para permitir la entrada de esterilizante en el monitor 10 de esterilización. Sin embargo, se apreciará que la tapa 20 no necesita estar provista de tal rasgo. El número, el tamaño, la forma y/o la ubicación de la(s) abertura(s) puede(n) seleccionarse según se desee, teniendo en cuenta el esterilizante particular con el que se usará el indicador de esterilización. Por ejemplo, la ubicación, la forma y el tamaño de las aberturas en la tapa 20 y/o el contenedor 30 pueden seleccionarse para proporcionar un camino tortuoso para la entrada y salida del medio de esterilización entre el indicador biológico y los entornos circundantes. En otra realización, el espacio entre la pared lateral de la tapa 22 y la pared externa del vial 30 puede ser suficiente para proporcionar un camino tortuoso sin tener que proporcionar una abertura ni en la tapa ni en el vial. El camino tortuoso también puede servir para inhibir o prevenir la contaminación por agentes exógenos y para asegurarse de que se dispone de una cantidad adecuada de esterilizante. Al incluir el camino tortuoso, es más probable que toda la carga quede expuesta al esterilizante destruyendo así cualquier microorganismo existente antes de que se destruya el organismo de prueba en el monitor 10 de esterilización.
Se pueden proporcionar aberturas en el contenedor 30 además de proporcionar aberturas o como alternativa a proporcionar aberturas en la tapa 20. Adicionalmente, si se proporcionan aberturas en el contenedor 30, pueden ubicarse de manera que el medio 50 de recuperación no se escape o se derrame a través de tales aberturas cuando se active el monitor 10 de esterilización y se rompa la barrera 40.
La figura 3 representa el monitor 10 de esterilización en el que se forma una abertura 80 en la pared 35 lateral del contenedor 30 en una posición apropiada, además de las aberturas 28 en la tapa 20. La abertura 80 está en la pared 35 lateral del contenedor 30 cerca de la parte superior del contenedor 30, cerca de la punta 38 del miembro 36 de perforación, para evitar fugas o derrames después de la activación. Después de la activación, la abertura 80 en esta ubicación quedará cubierta por la tapa 20 en la posición activada. Se observa que el monitor 10 de esterilización incluye la abertura 28 en la tapa 20, pero esto puede no ser necesario. En una realización (no mostrada), el contenedor 30 incluye la abertura 80 y se usa con una tapa similar a la tapa 20, pero que no incluye la abertura 28. Por tanto, se puede proporcionar una abertura en la tapa 20 o en el contenedor 30, o tanto en la tapa 20 como en el contenedor 30. Alternativamente, puede que no se requiera ninguna abertura siempre que se proporcione un camino entre la tapa 20 y el contenedor 30 mientras se encuentra en el estado no activado.
Una vez completado el proceso de esterilización, la tapa 20 se presiona o se gira hacia abajo de manera que la punta 38 del elemento 36 de perforación penetre y rompa la barrera 40 rompible liberando el medio 50 de recuperación en el espacio 26 para mezclarlo con cualquiera de los microorganismos del indicador biológico, e incubar cualquiera de los microorganismos del indicador biológico, que pueda haber sobrevivido al proceso de esterilización.
Si bien la invención descrita se ha explicado en relación con varias realizaciones detalladas, debe entenderse que varias modificaciones de esta pueden resultar evidentes para los expertos en la técnica al leer la memoria descriptiva. Por lo tanto, debe entenderse que la invención en el presente documento especificada incluye las modificaciones que puedan encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de recuperación para detectar la presencia de microorganismos, que comprende:
al menos una sal mineral; y
al menos un sustrato fluorogénico;
en donde el medio de recuperación es de color claro y está sustancialmente exento de azúcar reductor.
2. El medio de recuperación de la reivindicación 1, en donde al menos un sustrato fluorogénico comprende un derivado de 4-metilumbeliferilo.
3. El medio de recuperación de la reivindicación 2, en donde el derivado de 4-metilumbeliferilo comprende 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranósido.
4. El medio de recuperación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sustrato fluorogénico comprende un grupo fluoróforo escindible que tiene una emisión de fluorescencia en el intervalo de 420 nm a 460 nm para una longitud de onda de excitación en el intervalo de 320 nm a 370 nm.
5. El medio de recuperación de la reivindicación 4, en donde el fluoróforo comprende 4-metilumbeliferona.
6. El medio de recuperación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medio no absorbe energía luminosa en el intervalo de 420 nm a 460 nm.
7. El medio de recuperación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende al menos un aminoácido y/o al menos una vitamina.
8. El medio de recuperación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un azúcar no reductor, preferiblemente en donde el azúcar no reductor se selecciona entre sacarosa, trehalosa, rafinosa y melecitosa.
9. El medio de recuperación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los microorganismos comprenden esporas, preferiblemente en donde las esporas comprenden esporas de los géneros Geobacillus, Bacillus o Clostridia.
10. Un método para determinar la efectividad de un procedimiento de esterilización, comprendiendo el método las etapas siguientes:
poner un indicador biológico que contenga al menos una enzima activa en una cámara de esterilización;
realizar el procedimiento de esterilización dentro de la cámara en donde el indicador biológico se exponga a un medio de esterilización, preferiblemente en donde el medio de esterilización comprenda vapor, calor seco, radiación, plasma, uno o más esterilizantes gaseosos y/o uno o más esterilizantes líquidos;
poner en contacto el indicador biológico con un medio de recuperación que comprenda al menos una sal mineral y al menos un sustrato fluorogénico que comprenda un grupo fluoróforo escindible, en donde el medio de recuperación sea de color claro y esté sustancialmente exento de azúcar reductor;
incubar el indicador biológico durante un período de tiempo; y
detectar la presencia o ausencia de una señal fluorescente emitida por el grupo fluoróforo.
11. El método de la reivindicación 10, en donde al menos un sustrato fluorogénico comprende un derivado de 4-metilumbeliferilo.
12. El método de la reivindicación 11, en donde el derivado de 4-metilumbeliferilo comprende 4-metilumbeliferila-D-glucósido.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el grupo fluoróforo escindible tiene una emisión de fluorescencia en el intervalo de 420 nm a 460 nm para una longitud de onda de excitación en el intervalo de 320 nm a 370 nm.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el medio de recuperación no absorbe energía luminosa en el intervalo de 420 nm a 450 nm.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde el medio de recuperación comprende además al menos un aminoácido y/o al menos una vitamina.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde el medio de recuperación comprende además un azúcar no reductor, preferiblemente en donde el azúcar no reductor se selecciona entre sacarosa, trehalosa, rafinosa y melecitosa.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en donde la enzima activa está asociada con esporas de bacterias, preferiblemente en donde las esporas de bacterias comprenden esporas de los géneros Geobacillus, Bacillus o Clostridia.
18. Un monitor de esterilización, que comprende:
un primer compartimento que contiene un indicador biológico, conteniendo el indicador biológico al menos una enzima activa, estando adaptado el primer compartimento para permitir que el indicador biológico se ponga en contacto con un medio de esterilización durante un proceso de esterilización; y
un segundo compartimento que contiene un medio de recuperación, estando adaptado el segundo compartimento para mantener el medio de recuperación separado del indicador biológico durante el proceso de esterilización, y para permitir que el medio de recuperación entre en contacto con el indicador biológico después de que el indicador biológico haya sido expuesto al medio de esterilización, en donde el medio de recuperación consiste en el medio de recuperación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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