ES2948916T3 - Nanopartículas de óxido nítrico sintasa para el tratamiento de la enfermedad vascular - Google Patents

Nanopartículas de óxido nítrico sintasa para el tratamiento de la enfermedad vascular Download PDF

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Abstract

Se describe una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento de células endoteliales que incluye una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que comprende un polímero biocompatible. La composición de liberación sostenida se puede administrar como parte de una composición farmacéutica o se puede recubrir sobre un dispositivo médico. Las nanopartículas que contienen óxido nítrico sintasa se pueden utilizar en un método para inducir la formación de endotelio en un vaso sanguíneo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas de óxido nítrico sintasa para el tratamiento de la enfermedad vascular
ANTECEDENTES
El óxido nítrico (NO) es una de las moléculas reguladoras clave producidas por la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS, una isoterma constitutiva de la óxido nítrico sintasa producida en las células endoteliales), que desempeña un papel importante en la homeostasis vascular. El NO contrarresta los agentes pro-proliferativos y los factores de crecimiento, inhibe la agregación plaquetaria, la adhesión de leucocitos y mantiene las células del músculo liso vascular (VSMC) en un estado de reposo. La lesión vascular que lleva a la denudación del endotelio, como por ejemplo debido al inflado del globo y/o la colocación de endoprótesis, lleva a la pérdida de células endoteliales que producen eNOS vasoprotector, lo que lleva de este modo a una deficiencia vascular de NO en el sitio lesionado. Los estudios han demostrado una relación inversa entre la integridad endotelial y la proliferación de VSMC. Fishman et al., Lab Invest., 32:339-51 (1975).
Las modalidades de tratamiento para la lesión vascular se enfocan en inhibir la proliferación de VSMC o en promover la regeneración endotelial; sin embargo, una terapia antirestenótica ideal debería ser capaz de lograr ambos efectos así como prevenir la remodelación constrictiva de la arteria. La endotelización es clave para la permeabilidad a largo plazo de la arteria, que a menudo se retrasa o inhibe en la arteria con endoprótesis, y está implicada como una de las causas principales de reestenosis de rebote o trombosis fatal. Finn et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 27:1500-10 (2007). Por tanto, se espera que el aumento de la enzima vasoprotectora-eNOS y su presencia "sostenida" en la pared del vaso lesionado mantenga las funciones vasoprotectoras del endotelio hasta que tenga lugar la reendotelización a través de mecanismos naturales. Aunque el aumento de los niveles de NO en la pared del vaso lesionado es una estrategia terapéutica potencial, su uso es limitado debido a su corta vida media y alta reactividad. El uso de donantes de NO (por ejemplo, nitratos orgánicos, nitroglicerina, etc.) y aductos de NO con otros agentes farmacológicos (por ejemplo, aspirina NO, derivados de estatinas que liberan NO, etc.) está aún más limitado debido a la tolerancia y los posibles efectos adversos hipotensivos. Napoli et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol., 43:97-123 (2003). Se ha demostrado que la transferencia del gen eNOS localizado usando liposomas HVJ (von der Leyen et al., Proc Natl Acad Sci USA., 92:1137-41 (1995)) y adenovirus limita la hiperplasia de la íntima (Janssens et al., Circulation., 97:1274-81 (1998), Varenne et al., Circulation, 98:919-26 (1998)); sin embargo, el adenovirus conlleva el riesgo de una respuesta inflamatoria y expresión sistémica del transgén. Herz J, Gerard RD; Proc Natl Acad Sci USA., 90:2812-6 (1993). Las nanopartículas biodegradables (NP) cargadas con proteína eNOS recombinante podrían ser una mejor alternativa a la transferencia del gen eNOS, ya que las NP pueden liberar la proteína eNOS encapsulada en forma activa durante un período de tiempo prolongado, independientemente de la naturaleza funcional de la maquinaria celular, que puede estar comprometida en condiciones de enfermedad, influyendo de este modo en la eficiencia de la expresión génica. Además, dependiendo de la respuesta, la dosis y la duración de la administración de proteínas en la arteria objetivo pueden modularse con NP, lo que está limitado por los enfoques de terapia génica.
SUMARIO
Los inventores probaron la hipótesis de que la administración sostenida mediada por NP de la proteína eNOS recombinante en la arteria objetivo aumentaría la síntesis de NO que inhibiría el proceso inflamatorio, previniendo de este modo la hiperplasia posterior a la angioplastia y creando condiciones propicias para facilitar el proceso de reendotelización. Desarrollaron NP biodegradables funcionalizadas en superficie formuladas usando poli-(DL-lactidaco-glicólido) (PLGA) que dan como resultado una administración intracelular eficiente de la proteína encapsulada en forma activa. Vasir JK, Labhasetwar V., Biomateriales, 29:4244-52 (2008). Los resultados demostraron la administración localizada sostenida de la proteína eNOS en la arteria objetivo, proporcionando una actividad vasoprotectora de la eNOS que dio como resultado la inhibición de la hiperplasia de la íntima y volvió a endotelizar la arteria lesionada. Se demostró que el endotelio recién formado era funcional.
La WO2014/124142 A2 divulga un método para tratar una lesión de la médula espinal, la enfermedad neurodegenerativa o lesión neuronal administrando una cantidad eficaz de superóxido dismutasa y catalasa encapsuladas en una o más nanopartículas.
La US2006/067925 A1 divulga un método para inhibir la lesión por reperfusión en el cerebro inyectando en la arteria carótida o la vena yugular una nanopartícula cargada con antioxidante.
Perera Reschani P.A.: "Cleveland State University: Nitric Oxide Sxnthase in Confined Environments: Detection and Quantification of Nitric Oxide Released from Cells and Modified Liposomes Using a Sensitive Metal Catalyst-Pedot Modified Carbon Fiber Electrode", 1 de enero de 2009 (2009-01-01), páginas 1-185 divulga óxido nítrico sintasa encapsulada en liposomas o liposomas cargados con óxido nítrico sintasa producidos por medio del método de hidratación de película lipídica en donde los liposomas tienen un tamaño de 100 nm o menos.
La presente invención proporciona una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento celular endotelial, que comprende una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que tiene una estructura de tipo matriz y que comprende un polímero biocompatible.
La invención también proporciona un dispositivo médico implantable o administrare recubierto con una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento celular endotelial, que comprende una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que tiene una estructura de tipo matriz y que comprende un polímero biocompatible.
Las características preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las Figuras. 1a y 1b proporcionan gráficos e imágenes que muestran la administración citoplasmática sostenida de una enzima modelo, la peroxidasa de rábano picante (HRP). Las células del músculo liso vascular se incubaron con una dosis de 4 |jg de HRP o en solución o encapsuladas en NP durante 24 horas. El medio se cambió después de 24 horas y luego en días alternos. (A) Después de 1, 3 y 5 días, las células se lisaron y sus niveles de HRP se determinaron mediante un ensayo de actividad de HRP. La cantidad de HRP activa se normalizó a la proteína celular total. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, n=6, (*) p<0,05. (B) Después de 1 y 5 días, las células se lavaron con PBS, se fijaron y se incubaron con sustrato DAB/Ni2+ para teñir la enzima HRP activa en (i, ii) células tratadas con solución de HRP, (iii, iv) NP no modificadas cargadas con HRP y (v, vi) NP funcionalizadas cargadas con HRP.
Las Figuras 2a-2g proporcionan gráficos e imágenes que muestran la inhibición de la hiperplasia de la íntima con eNOS-NP en el modelo de lesión vascular de la arteria carótida de rata a las tres semanas. (a-c) Secciones arteriales teñidas con H&E de animales tratados con solución salina (a), solución de proteína eNOS (b) y con eNOS-NP (c). Las flechas negras delimitan la neoíntima. La barra de escala representa 200 nm. (d-g) Análisis morfométrico de las secciones arteriales para el espesor de la neoíntima (d), la relación íntima/media (e), el área de la neαntima (f) y el área de la luz (g). Los datos cuantitativos se derivaron de tres secciones transversales igualmente espaciadas para la arteria de cada animal en cada grupo. *p<0,005 para los grupos tratados (n=6) frente a los de solución salina (n=6).
Las Figuras 3a-3g proporcionan gráficos e imágenes que muestran la inmunotinción para actina de músculo liso a (a-SMA) para arterias de animales tratados con solución salina (a), solución de proteína eNOS (B) y eNOS-NP (c) . La barra de escala representa 200 nm. (d-j) Análisis inmunohistoquímico para Ki-67. Secciones arteriales representativas teñidas para Ki-67, del grupo: solución salina (d y g), solución de proteína eNOS (e y h) y eNOS-NP (f y h). La tinción nuclear marrón representa Ki-67, mientras que todos los núcleos se contrastaron (azul) con hematoxilina. La barra de escala representa 50 μm . Las figuras (g), (h) e (i) son imágenes ampliadas de los recuadros descritos en las Figuras (d), (e) y (f), respectivamente. Las flechas blancas indican los núcleos positivos de Ki-67 y las flechas negras indican los núcleos negativos de Ki-67. El número de células positivas para Ki-67 se calculó a partir de nueve secciones en serie por arteria (n=6 ratas por grupo). *p<0,005 para el grupo tratado frente al grupo salino.
Las Figuras 4a-4h proporcionan gráficos e imágenes que muestran la inhibición de la respuesta inflamatoria con eNOS-NP. (a-c) Inmunotinción para CD-45 (marcador para leucocitos) para arterias contralaterales no lesionadas (a), arterias lesionadas tratadas con solución salina (b) y eNOS-NP (c). (d-f) Inmunotinción para CD-68 (marcador para macrófagos) para arterias contralaterales no lesionadas (d), arterias lesionadas tratadas con solución salina (e) y eNOS-NP (f). La tinción marrón representa células positivas para CD-45 o CD-68, mientras que todos los núcleos se contratiñeron (azul) con hematoxilina. El número de células positivas CD-45 (g) y CD-68 (h) por sección. El número de células inmunopositivas se calculó a partir de nueve secciones en serie por arteria (n=3 ratas por grupo). *p<0,25 para el grupo tratado frente al de solución salina.
Las Figuras 5a-5i proporcionan gráficos e imágenes que muestran la reendotelización de la arteria denudada con eNOS-NP. (a-f) Inmunotinción para CD-31 (marcador para células endoteliales). Secciones arteriales representativas del grupo: solución salina (a y d), solución de proteína eNOS (b y e) y eNOS-NP (c y f) teñidas para c D-31 después de 3 semanas de lesión vascular. Las Figura (d), (e) y (f) (barra de escala = 50 μm ) son imágenes ampliadas de las Figuras (a), (b) y (c) (barra de escala = 200 nm), respectivamente. La tinción marrón representa células positivas para CD-31, mientras que todos los núcleos se contratiñeron (azul) con hematoxilina. Las flechas negras indican células positivas para CD-31. La reendotelización se calculó como el porcentaje de superficie luminal cubierta por células positivas para CD-31 (g) de tres secciones en serie por arteria (n=5 ratas por grupo). *p<0,001 para el grupo tratado frente al de solución salina. Las arterias representativas de ratas inyectadas con colorante azul Evans: eNOS-NP (h) muestran una mayor exclusión de colorante que la solución salina (i) lo que indica mayor reendotelización.
Las Figuras 6a-6f proporcionan imágenes que muestran la recuperación funcional del endotelio lesionado. (a-f) Inmunotinción para eNOS. Secciones arteriales representativas del grupo: solución salina (a y d), solución de proteína eNOS (b y e) y eNOS-NP (c y f) teñidas para eNOS después de 3 semanas de lesión vascular. Las Figuras (d) , (e) y (f) (barra de escala = 50 μm ) son imágenes ampliadas de las Figuras (a), (b) y (v) (barra de escala = 200 nm), respectivamente. La tinción marrón representa la eNOS inmunoteñida, mientras que todos los núcleos se contratiñeron (azul) con hematoxilina. Solo unas pocas células que revisten la luz arterial se tiñeron positivas para eNOS en solución salina (d), mientras que la actividad de eNOS se detectó en pequeñas áreas parcheadas que revisten la luz de la arteria en arterias tratadas con solución de proteína eNOS (e). En arterias tratadas con eNOS-NPs (f), se detectó proteína eNOS inmunocativa en VSMC presentes en la capa media así como en casi el 95% de las células que recubren la luz de la arteria.
Las Figuras 7a-7d proporcionan gráficos e imágenes que muestren la administración sostenida de proteína eNOS a través de eNOS-NP. Secciones arteriales representativas (400x) teñidas para la actividad de NADPH-diaforasa en el grupo tratado con solución salina (a) y eNOS-NP (b). Los niveles de proteína eNOS se determinaron mediante transferencia Western de los homogeneizados de arteria (c). Hileras (1) arteria ilesa, (2) lesionada, tratada con solución salina 1 semana, (3) lesionada, eNOS-NP tratada 1 semana, (4) lesionada, tratada con solución salina 3 semanas, (5) lesionada, eNOS-NP tratada 3 semanas y (6) proteína eNOS recombinante (control positivo). Los resultados de la transferencia Western indicados en unidades densitométricas arbitrarias, como una proporción de la proteína eNOS a la de la tubulina (control de carga) (d). UI: arteria no lesionada, S1: solución salina tratada a la 1 semana, N1: eNOS-NP tratadas a la 1 semana, S3: solución salina tratada a las 3 semanas, N3: eNOS-NP tratadas a las 3 semanas.
La Figura 8 proporciona las imágenes de una endoprótesis y un globo recubiertos con NP cargadas de proteína. Para ello, se pulverizó una emulsión de agua en aceite y agua sobre una endoprótesis o globo, y se dejó secar el recubrimiento. Las NP se forman in situ sobre la superficie de la endoprótesis o del globo. Las NP contienen un colorante de infrarrojo cercano del que pueden obtenerse imágenes usando el sistema de imagenología óptica Maestro. (a) imagen que muestra el extremo recubierto y no recubierto de la endoprótesis; (b) vista superior de la endoprótesis recubierta que muestra que el interior de la endoprótesis está recubierta con NP; (c) Microscopía electrónica de barrido de la endoprótesis recubierta que muestra depósitos de NP sobre la superficie de la endoprótesis; (D) imagen del globo recubierto con NP.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Definiciones
Como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas, se pretende que las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, las enumeraciones de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números subsumidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
“Tratar”, como se usa en la presente, significa mejorar los efectos o retrasar, detener o revertir el progreso de una enfermedad o trastorno. La palabra abarca reducir la gravedad de un síntoma de una enfermedad o trastorno y/o la frecuencia de un síntoma de una enfermedad o trastorno.
El lenguaje "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de la composición usada en la puesta en práctica de la invención que es eficaz para estimular el crecimiento de células endoteliales en el sitio de administración de nanopartículas. El tratamiento deseado puede ser profiláctico y/o terapéutico. Ese resultado puede ser la reducción y/o el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad o trastorno, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Una cantidad terapéutica apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando experimentación rutinaria.
Un "sujeto", como se usa en la presente, puede ser un animal humano o no humano. Los animales no humanos incluyen, por ejemplo, ganado y mascotas, como mamíferos ovinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y murinos, así como reptiles, aves y peces. Preferiblemente, el sujeto es humano.
"Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere en la presente a una composición adecuada para administrar un ingrediente farmacéutico activo, como la composición de la presente invención, a un sujeto sin toxicidad excesiva u otras complicaciones a la vez que se mantiene la actividad biológica del ingrediente farmacéutico activo. Los excipientes estabilizadores de proteínas, como el manitol, la sacarosa, la glucosa, el polisorbato-80 y los tampones de fosfato, los polímeros como el polietilenglicol (PEG), el alcohol polivinílico (PVA), los plurónicos, se encuentran típicamente en tales portadores, aunque no debe interpretarse que los portadores se interpreten se limitan únicamente a estos compuestos.
El término "biodegradable" como se usa en la presente se refiere a un polímero que puede descomponerse mediante un proceso químico o físico, tras la interacción con el entorno fisiológico posterior a la administración, y se erosiona o disuelve en un período de tiempo, típicamente en el plazo de días, semanas o meses. Un material biodegradable cumple una función temporal en el cuerpo y luego se degrada o se descompone en componentes que son metabolizables o excretables.
"Biocompatible", como se usa en la presente, se refiere a cualquier material que no provoque lesiones o muerte al animal ni induzca una reacción adversa en un animal cuando se pone en contacto estrecho con los tejidos del animal. Las reacciones adversas incluyen, por ejemplo, inflamación, infección, formación de tejido fibrótico, muerte celular o trombosis. Los términos "biocompatible" y "biocompatibilidad", cuando se usan en la presente, se reconocen en la técnica y significan que el referente no es ni tóxico en sí mismo para un huésped (por ejemplo, un animal o un humano), ni se degrada (si se degrada) a un ritmo que produce subproductos (por ejemplo, subunidades monoméricas u oligoméricas u otros subproductos) a concentraciones tóxicas, no provoca inflamación o irritación prolongada, o no induce más que una reacción inmunitaria basal en el huésped. No es necesario que ninguna de las composiciones en cuestión tenga una pureza del 100% para que se considere biocompatible. Por lo tanto, una composición en cuestión puede comprender un 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% o incluso menos de agentes biocompatibles, por ejemplo, incluyendo polímeros y otros materiales y excipientes descritos en la presente y seguir siendo biocompatible.
Nanopartículas que incluyen óxido nítrico sintasa
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento de células endoteliales, que comprende una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que comprende un polímero biocompatible. Se contemplan una variedad de cinéticas de liberación para la liberación sostenida de la óxido nítrico sintasa de la nanopartícula, incluyendo la liberación bi- o multi- fásica (como una liberación rápida inicial seguido de una fase de liberación posterior más lenta). Por ejemplo, la liberación puede incluir la disociación de la óxido nítrico sintasa de la nanopartícula rápidamente en el plazo de segundos o minutos seguido de una liberación sostenida adicional durante un período de por lo menos 2, 4, 6, 8 o más horas a semanas y meses. Dicha cinética de liberación puede ser ventajosa en ciertas circunstancias, por ejemplo, cuando se desea una acción sostenida, en comparación con, por ejemplo, una inyección de enzima libre.
Las nanopartículas de la presente invención son útiles para estimular el crecimiento de células endoteliales. El endotelio es la capa delgada de células escamosas que recubre la superficie interior de los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, formando una interfaz entre la sangre o la linfa que circula en la luz y el resto de la pared del vaso. Las células que forman el endotelio se denominan células endoteliales. Las células endoteliales en contacto directo con la sangre se denominan células endoteliales vasculares, mientras que las que están en contacto directo con la linfa se conocen como células endoteliales linfáticas. Si el endotelio se daña como resultado, por ejemplo, de una enfermedad o intervención quirúrgica, es importante reparar el endotelio para permitir que los vasos sanguíneos y/o linfáticos vuelvan a funcionar normalmente. Los inventores han demostrado que la liberación sostenida de óxido nítrico sintasa de las nanopartículas de la presente invención puede estimular el crecimiento de células endoteliales, reparando de este modo el endotelio, un proceso también denominado en la presente reendotelización. Estimular el crecimiento de células endoteliales se refiere a aumentar la tasa de crecimiento de células endoteliales. La presente invención puede hacer que se produzca el crecimiento de células endoteliales donde previamente no había crecimiento de células endoteliales, o puede aumentar una tasa existente de crecimiento de células endoteliales. Por ejemplo, la presente invención puede aumentar el crecimiento de células endoteliales en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más del 100%. La reendotelización también puede producirse debido a que las células progenitoras circulantes se anclen en la arteria lesionada y eNOS promueva su diferenciación a células endoteliales y la formación del endotelio.
Las óxido nítrico sintasas (EC 1.14.13.39) (NOS) son una familia de enzimas que catalizan la producción de óxido nítrico (NO) a partir de L-arginina. El óxido nítrico está mediado en los mamíferos por las isoenzimas controladas por calcio-calmodulina eNOS (NOS endotelial) y nNOS (NOS neuronal). La cantidad de óxido nítrico sintasa liberada por cada nanopartícula puede variar dependiendo del tamaño de las nanopartículas y la dosificación deseada. En algunas realizaciones, el porcentaje peso/peso (p/p) de la óxido nítrico sintasa en las nanopartículas es de aproximadamente el 3%. En otras realizaciones, el porcentaje p/p de las nanopartículas de óxido nítrico sintasa es de aproximadamente el 1 -10%.
La presente invención incluye nanopartículas que administran cualquier tipo de óxido nítrico sintasa, pero en algunas realizaciones, la óxido nítrico sintasa es óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). En los mamíferos, la isoforma endotelial es el principal generador de señales en el control del tono vascular, la secreción de insulina y el tono de las vías respiratorias, está implicada en la regulación de la función cardíaca y la angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos). Se ha demostrado que el NO producido por la eNOS es un vasodilatador idéntico al factor relajante derivado del endotelio producido en respuesta al cizallamiento del flujo sanguíneo aumentado en las arterias. Esto dilata los vasos sanguíneos al relajar el músculo liso en sus revestimientos. La eNOS es el principal controlador del tono del músculo liso. El NO activa la guanilato ciclasa, que induce la relajación del músculo liso.
La preservación de la función endotelial es importante para mantener la función renal normal. Una función clave del endotelio es producir óxido nítrico (NO), que es catalizado por la NO sintasa endotelial (eNOS) e induce un vasodilatador que ayuda a mantener la integridad de las células endoteliales con propiedades antitrombóticas.
La óxido nítrico sintasa puede incluirse en las nanopartículas de varias maneras diferentes. Por ejemplo, la óxido nítrico sintasa puede dispersarse dentro de la nanopartícula o puede encapsularse dentro de la nanopartícula. En algunas realizaciones, la óxido nítrico sintasa se dispersa de manera sustancialmente uniforme dentro de la nanopartícula. La óxido nítrico sintasa puede conjugarse con la superficie de la nanopartícula, o puede ser una combinación de la superficie asociada y encapsulada en el núcleo de la nanopartícula.
Las nanopartículas, como se usa el término en la presente, son partículas que tienen una estructura de tipo matriz con un tamaño de 1000 nanómetros o menos. Las nanopartículas son generalmente estructuras esféricas. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un tamaño de 500 nanómetros o menos. En algunas realizaciones, las partículas tienen un diámetro de 10 nanómetros a 1000 nanómetros. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro de 10 nanómetros a 500 nanómetros. En realizaciones adicionales, las partículas tienen un diámetro de 10 a 300 nanómetros, mientras que en otras realizaciones adicionales las partículas tienen un diámetro de 50 a 300 nanómetros. El diámetro de las nanopartículas se refiere a su diámetro hidrodinámico medio. El diámetro hidrodinámico puede determinarse fácilmente usando dispersión de luz dinámica (DLS).
Las nanopartículas de la invención pueden prepararse usando una amplia variedad de diferentes tipos de polímeros. Preferiblemente, la nanopartícula comprende uno o más polímeros biocompatibles. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen polímeros naturales o sintéticos como poliestireno, ácido poliláctico, policetal, butadieno estireno, terpolímero de estirenoacrílico-vinilo, polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, polialquilcianoacrilato, copolímero de estireno-anhídrido maleico, acetato de polivinilo, polivinilpiridina, polidivinilbenceno, tereftalato de polibutileno, acrilonitrilo, cloruro de vinilo-acrilatos, policaprolactona, poli(alquil cianoacrilatos), poli(ácido láctico-co-glicólico) y similares.
En realizaciones adicionales, la nanopartícula comprende uno o más polímeros biodegradables. El uso de polímeros biodegradables proporciona las ventajas de usar nanopartículas que eventualmente se disgregarán, lo que facilita la liberación de la óxido nítrico sintasa y la eliminación de las nanopartículas in vivo. Sin embargo, la óxido nítrico sintasa también puede liberarse de la matriz de polímeros no biodegradables como resultado del flujo de salida gradual de los canales dentro de la matriz polimérica, incluyendo los formados por materiales solubles incluidos en la matriz polimérica.
Los ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros de polilactida que incluyen poli(D,L-lactidas); copolímeros de poli(lactida-co-glicolida) (PLGA); poliglicólido (PGA) y polidioxanona; polímeros de caprolactona; quitosano; ácidos hidroxibutíricos; polianhídridos y poliésteres; polifosfacenos; y polifosfoésteres. Un polímero biodegradable preferido para su uso en las nanopartículas es poli-(DL-lactida-co-glicolida).
En las nanopartículas de la invención también pueden usarse poli(D,L-lactidas) funcionalizadas como polímeros biodegradables. Los ejemplos de poli(D,L-lactidas) incluyen poli(L-lactida), terminada en acrilato; poli(L-lactida), terminada en amina; poli(L-lactida), terminada en azida; poli(L-lactida), terminada en 2-bromoisobutirilo; poli(L-lactida), terminada en 2-bromoisobutirilo; poli(L-lactida) 4-ciano-4-[(dodecilsulfaniltiocarbonil)sulfanil]pentonato; poli(L-lactida) terminada en N-2-hidroxietilmaleimida; poli(L-lactida) 2-hidroxietilo, terminada en metacrilato; poli(L-lactida), terminada en propargilo; poli(L-lactida), terminada en tiol;
Otros polímeros biodegradables que pueden usarse en las nanopartículas incluyen copolímeros dibloque AB como poli(etilenglicol) metil éter-bloque-poli(D,L-lactida); poli(etilenglicol) éter metílico-bloque-poli(láctido-co-glicólido) PEG; poli(etilenglicol)-bloque-poli(£-caprolactona) éter metílico PEG; y polipirrol-bloque-poli(caprolactona). Polímeros biodegradables adicionales incluyen copolímeros tribloque ABA como poliláctido-bloque-poli(etilenglicol)-bloquepoliláctido PLA; poli(lactida-co-glicolida)-bloque-poli(etilenglicol)-bloque-poli(lactida-co-glicolida); poli(lactida-cocaprolactona)-bloque-poli(etilenglicol)-bloque-poli(lactida-co-caprolactona); policaprolactona-bloquepolitetrahidrofurano-bloque-policaprolactona; y poliglicolida-bloque-poli(etilenglicol)-bloque-poliglicolida PEG.
Otro polímero biodegradable que puede usarse en algunas realizaciones de la invención es un copolímero de N-alquilacrilamida. La N-alquilacrilamida es un monómero hidrófobo que tiene un grupo alquilo de C3 a C6. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polímero biodegradable es un copolímero de N-alquilacrilamida, un monómero de vinilo y un conjugado de polietilenglicol (PEG). Sin embargo, en algunas realizaciones, el polímero biodegradable es cualquiera de los polímeros biodegradables descritos en la presente distintos de un copolímero de una N-alquilacrilamida, un monómero de vinilo y un conjugado de PEG. El uso de nanopartículas que comprenden polímeros biodegradables, un copolímero de una N-alquilacrilamida, un monómero de vinilo y un conjugado de PEG se describen en la Patentes de Estados Unidos N° 9.138.416.
Los polímeros biodegradables también incluyen varios polímeros naturales. Los ejemplos de polímeros naturales incluyen polipéptidos que incluyen aquellos componentes no peptídicos modificados, como cadenas de sacáridos y lípidos; nucleótidos; biopolímeros a base de azúcar como polisacáridos; celulosa; carbohidratos y almidones; dextranos; ligninas; poliaminoácidos; proteínas de adhesión; lípidos y fosfolípidos (por ejemplo, fosforilcolina).
En algunas realizaciones, la nanopartícula comprende una nanopartícula modificada. Las nanopartículas modificadas, también denominadas nanopartículas funcionalizadas, se describen en la Patente de Estados Unidos N° 8.865.216. Las nanopartículas modificadas comprenden un polímero biocompatible que tiene una carga negativa neta a pH neutro, por lo menos un modulador de carga que es eficaz para invertir la carga superficial de negativa a positiva en un ambiente ácido y, opcionalmente, un emulsionante anfifílico. Las nanopartículas modificadas se preparan usando la combinación de alcohol polivinílico (u otro emulsionante anfifílico) con poli-L-lisina (u otro modulador de carga) y se denominan en la presente nanopartículas modificadas o modificadas en la superficie. Hablando de manera general, la modificación de superficie de nanopartículas produce un aumento significativo en la captación celular, en comparación con las nanopartículas no modificadas.
Las nanopartículas de la invención pueden incluir compuestos además de la óxido nítrico sintasa. Por ejemplo, las nanopartículas pueden incluir una proteína adicional como albúmina dentro de la nanopartícula. La presencia de una proteína adicional (por ejemplo, albúmina) puede ser útil para facilitar la liberación de eNOS de la nanopartícula al actuar como agente de carga. La presencia de una proteína adicional (por ejemplo, albúmina) también puede servir para proteger la eNOS de la inactivación interfacial por contacto con la interfaz orgánica/acuosa durante la preparación de las nanopartículas que contienen eNOS. En otras realizaciones, la nanopartícula incluye uno o más cofactores para ayudar a la formación de óxido nítrico sintasa de óxido nítrico. Las NOS son inusuales porque generalmente requieren cinco cofactores. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más cofactores de óxido nítrico sintasa. Los cofactores de óxido nítrico sintasa incluyen tetrahidrobiopterina (BH4 ), trifosfato de guanosina (GTP), ciclohidrolasa y L-arginina. En ciertas enfermedades (por ejemplo, diabetes), la deficiencia tisular de estos cofactores es responsable de la producción reducida de óxido nítrico.
Puede administrarse al sujeto un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional puede administrarse concurrentemente o después de la administración de las nanopartículas que contienen óxido nítrico sintasa. El agente terapéutico puede estar incluido en las nanopartículas o puede administrarse por separado. El agente terapéutico adicional puede ser la óxido nítrico sintasa que se administra en combinación con las nanopartículas que contienen óxido nítrico sintasa pero usando un método de administración diferente. Por ejemplo, la óxido nítrico sintasa puede coadministrarse con nanopartículas que contienen óxido nítrico sintasa en una solución farmacéuticamente aceptable o en un gel.
Los agentes terapéuticos que pueden utilizarse incluyen agentes cardiovasculares como agentes antihipertensivos; bloqueadores y estimuladores adrenérgicos (por ejemplo, doxazosina, guanadrel, guanetidina, feoxibenzamina, terazosina, clonidina, guanabenz); bloqueadores alfa-/beta-adrenérgicos (por ejemplo, labetalol); inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) (por ejemplo, benazepril, catopril, lisinopril, ramipril); antagonistas de los receptores de la ECA (por ejemplo, losartán); bloqueadores beta (por ejemplo, acebutolol, atenolol, carteolol, pindolol, propranolol, penbatolol, nadolol); bloqueadores de los canales de calcio (por ejemplo, amilorida, bepridil, nifedipina, verapamilo, nimodipina); antiarrítmicos, grupos I-IV (por ejemplo, bretilio, lidocaína, mexiletina, quinidina, propranolol, verapamilo, diltiazem, triclorometiazida, tartrato de metoprolol, clorhidrato de carteolol); y varios antiarrítmicos y cardiotónicos (por ejemplo, adenosina, digoxina, cafeína, clorhidrato de dopamina, digitalis).
Otros agentes terapéuticos que pueden usarse incluyen agentes antiinflamatorios. Los ejemplos representativos de dichos agentes incluyen agentes no esteroideos (AINE) como salicilatos, diclofenaco, diflunisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, piroxicam, ketoprofeno, ketorolaco, sulindaco, tolmetina. Otros fármacos antiinflamatorios incluyen agentes esteroideos como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, fluocinolona, flunisolida, hidrocortisona, prednisolona y prednisona. También se contemplan agentes inmunosupresores (por ejemplo, adenocorticosteroides, ciclosporina).
Otros agentes terapéuticos incluyen agentes que inhiben el daño tisular. Los ejemplos representativos de tales agentes incluyen antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa, glutatión, vitamina E; inmunomoduladores (por ejemplo, linfoquinas, monoquinas, interferón a y p); y reguladores del crecimiento (por ejemplo, IL-2, factor de necrosis tumoral, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, factor beta de crecimiento transformante, somatrem, fibronectina, GM-CSF, LCR, factor de crecimiento derivado de plaquetas, somatotropina, rG-CSF, factor de crecimiento epidérmico, IGF-1).
En ejemplos adicionales, el agente terapéutico es un agente antirestenótico o un agente antiapóptico. Los ejemplos de agentes antirestenóticos incluyen rapamicina (es decir, sirolimus) o un derivado o análogo de la misma, por ejemplo, everolimus o tacrolimus. Los ejemplos de agentes antiapópticos incluyen Galectina-3; (-) deprenilo; inhibidores de la monoaminooxidasa (MAO-I) como selegilina y rasagilina; rapamicina; o quercetina; paclitaxel
Inducción de la formación de endotelio usando nanopartículas de óxido nítrico sintasa
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para inducir la formación de endotelio en un vaso sanguíneo. El método incluye poner en contacto el vaso sanguíneo con una nanopartícula que comprende óxido nítrico sintasa dentro de un polímero biocompatible. La nanopartícula que contiene óxido nítrico sintasa puede incluir cualquiera de los polímeros y otros compuestos descritos para las nanopartículas de la invención. La inducción de la formación de endotelio implica la estimulación del crecimiento de células endoteliales, en el que las células endoteliales en crecimiento reparan o aumentan el diámetro de la capa endotelial dentro de un vaso sanguíneo. Los vasos sanguíneos son la parte del sistema circulatorio que transporta la sangre por todo el cuerpo. Los vasos sanguíneos incluyen las arterias, que transportan la sangre desde el corazón; capilares, que permiten el intercambio real de agua y productos químicos entre la sangre y los tejidos; y las venas, que transportan sangre desde los capilares de vuelta hacia el corazón. Los ejemplos de vasos sanguíneos incluyen las arterias coronaria, femoral, renal, hepática y cerebral.
En algunos aspectos, se induce la formación de endotelio en un vaso sanguíneo en un sujeto para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en el que el endotelio desempeña un papel. En particular, los métodos de la invención pueden estar dirigidos a inducir la formación de endotelio para aumentar o reemplazar el endotelio que se ha dañado o perdido como resultado de la enfermedad o trastorno. Los ejemplos de enfermedades o trastornos en los que el endotelio desempeña un papel incluyen remodelación negativa, trombosis, fibrosis vascular, inflamación, agregación de plaquetas, hiperplasia y reestenosis del vaso sanguíneo de un sujeto. En otros aspectos, el método se usa para tratar a un sujeto al que se le ha diagnosticado nefropatía diabética, mientras que en realizaciones adicionales el método se usa para tratar a un sujeto al que se le ha diagnosticado una enfermedad renal o hepática que implica disfunción endotelial. En algunos aspectos, las nanopartículas se usan para tratar la insuficiencia cardiaca, ya que la deficiencia de NO provoca disfunción endotelial pulmonar, considerada como la causa de la insuficiencia cardiaca. En otros aspectos, las nanopartículas se usan para tratar la cirrosis hepática. En la cirrosis hepática, la disfunción endotelial intrahepática está provocda por la eNOS y la deficiencia de otros cofactores (L-arginina y tetrahidrobiopterina, BH4) que es responsable de la producción de NO.
Dispositivos médicos recubiertos
Otro aspecto de la invención proporciona un dispositivo médico implantable o administrable recubierto con una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento de células endoteliales, que comprende una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que comprende un polímero biocompatible. La nanopartícula puede incluir cualquiera de los compuestos y usar cualquiera de los polímeros descritos en la presente para las nanopartículas de la invención. En algunas realizaciones, el dispositivo médico implantable o administrable está configurado para caber dentro de un vaso sanguíneo.
Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de dispositivos médicos que pueden recubrirse con una composición que comprende las nanopartículas que contienen óxido nítrico sintasa de la invención. Los ejemplos de dispositivos médicos incluyen endoprótesis, endoprótesis liberadoras de fármacos; globos, catéteres de doble globo; catéteres de infusión; injertos vasculares (sintéticos o biológicos); dispositivos de acceso a la sangre implantados para hemodiálisis; dispositivos médicos percutáneos; alambres guía; corazones artificiales, válvulas cardíacas, válvulas venosas, derivaciones), bobinas endovasculares usadas en aneurisma; cables de marcapasos; malla intravascular y cardiovascular; filtros de sangre; transductores; conectores de tubos de sangre; suturas; clips para injerto de derivación de arteria coronaria; fístula; desfibriladores cardioversores implantables; tornillos, pasadores, placas y varillas de metal; cánula de catéter intravenoso; catéteres guía; electrodos implantables, sensores, derivaciones cardiacas/cerebrales/pulmonares; bolsas; vendaje/pegamento para cerrar heridas; globos oclusores y tubos de extensión intravenosos. En algunas realizaciones, las nanopartículas se usan para recubrir dispositivos médicos no implantables, como herramientas quirúrgicas. Los ejemplos preferidos de dispositivos médicos implantables incluyen injertos vasculares, endoprótesis y catéteres con globo.
Los dispositivos médicos incluyen una amplia variedad de materiales médicos biocompatibles. Por ejemplo, los dispositivos médicos pueden incluir cerámicas biocompatibles como óxido de aluminio, óxido de calcio, hidroxiapatita y óxido de circonio (IV). Los dispositivos médicos también pueden incluir metales biocompatibles como el titanio o el acero inoxidable. También pueden usarse una amplia variedad de polímeros biocompatibles. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen poliacrílicos, poliamidas, poliimidas, policarbonatos, polidienos, poliésteres, poliéteres, polifluorocarbonos, poliolefinas, poliestirenos, acetales de polivinilo, cloruros de polivinilo y vinilideno, ésteres de polivinilo, éteres y cetonas de polivinilo, polivinilpiridina y polímeros de polivinilpirrolidona.
Pueden usarse una variedad de métodos para recubrir las nanopartículas sobre la superficie del dispositivo médico implantable. Los ejemplos de métodos de recubrimiento incluyen el recubrimiento por pulverización, el recubrimiento profundo y la pulverización por chorro en seco/dispersión de nanopartículas. Un primer paso para recubrir la superficie de un dispositivo médico implantable puede ser hacer que la superficie sea micro/nanoporosa para facilitar la incrustación de las nanopartículas en la superficie. Puede usarse un agente de reticulación para ayudar a adherir las nanopartículas a la superficie del dispositivo médico. Los ejemplos de agentes de reticulación adecuados incluyen dimetacrilato de di(etilenglicol), divinilbenceno y éter dimetílico de tetraetilenglicol.
En el recubrimiento de un dispositivo médico implantable con las nanopartículas pueden estar implicados una variedad de otros pasos específicos. Por ejemplo, a veces es ventajoso recubrir primero el dispositivo médico con hidrogel y luego recubrirlo con las nanopartículas. Alternativamente, las nanopartículas pueden mezclarse primero con el hidrogel y luego recubrirse sobre el dispositivo médico implantable. Otros métodos de recubrimiento incluyen la activación de la superficie primero con un agente de reticulación y luego el recubrimiento con nanopartículas; primero recubriendo con capas una capa de polímero cargada con fármaco y luego las nanopartículas; mezclando las nanopartículas con matriz polimérica (en caso de endoprótesis biodegradables); formación in situ de nanopartículas que contienen óxido nítrico sintasa en la superficie del dispositivo médico; recubrimiento con lípidos/fosfolípidos y luego nanopartículas; mezclando lípidos/fosfolípidos con nanopartículas y luego usando la combinación para el recubrimiento; y recubriendo primero con agentes poliiónicos o iónicos (polímeros, aminoácidos, lípidos, etc.) y luego con nanopartículas, formación in situ de nanopartículas sobre el dispositivo médico donde las nanopartículas se forman sobre el dispositivo médico, depósito iontoforético de nanopartículas, depósito capa por capa, con combinación de fármaco y nanopartículas. En algunas realizaciones, también puede ser útil formar un andamiaje sobre una superficie y luego incrustar nanopartículas en el andamiaje.
Formulación y administración
A menudo se proporcionan las nanopartículas en la superficie de un dispositivo médico como un dispositivo médico implantable. Por ejemplo, las nanopartículas pueden proporcionarse en endoprótesis recubiertas u otros dispositivos como se ha indicado anteriormente; como globos recubiertos (por ejemplo, globo de infusión; catéter de doble globo para infusión localizada). Otras formas de administración de nanopartículas incluyen el uso de un dispositivo de administración local transluminal de fármacos o un sistema de administración transendocárdico; administración cerebrovascular intravascular o intraarterial usando catéteres de infusión; administración periadventicial; administración perivascular; inyección directa en la pared arterial; inyección intravenosa/intraarterial; infusión intravenosa/intraarterial; inyección de tejido localizado cerca del vaso sanguíneo afectado; parches de microagujas; y administración usando un globo de inyección con microagujas.
En algunos aspectos, las nanopartículas se administran como parte de una composición farmacéutica. Por ejemplo, en algunos aspectos, una nanopartícula de la invención puede combinarse con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable para proporcionar una composición farmacéutica. Las nanopartículas pueden estar presentes en una composición farmacéutica en una cantidad del 0,001 al 99,9% en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 0,01 al 99% en peso, e incluso más preferiblemente del 0,1 al 95% en peso. Por ejemplo, en aspectos en los que las nanopartículas se administran por inyección (por ejemplo, por vía intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.), las composiciones se combinan preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares.
Las composiciones para administración comprenderán comúnmente una suspensión de las nanopartículas en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso, que se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales portadores son agua destilada, solución salina tamponada con fosfato fisiológico, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Estas suspensiones son estériles y generalmente están libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares.
Pueden administrarse administraciones individuales o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosificación y la frecuencia según lo requiera y tolere el sujeto. En cualquier caso, el régimen de administración debe proporcionar una cantidad suficiente de la composición de esta invención para tratar eficazmente al sujeto. Las nanopartículas formuladas pueden administrarse como dosis individuales o en dosis múltiples.
Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad de nanopartículas en las formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente sobre la base de los volúmenes de fluidos, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto. En un aspecto, la cantidad de nanopartícula administrada está entre aproximadamente 0,25 μmol/kg y aproximadamente 3 pmol/kg de equivalente de enzima. En otro aspecto, la cantidad de nanopartícula administrada está entre aproximadamente 0,5 pmol/kg y aproximadamente 1,5 pmol/kg equivalente. En otro aspecto más, la cantidad de nanopartícula administrada es de aproximadamente 1 pmol/kg de equivalente de enzimas. En otro aspecto más, la cantidad de nanopartícula administrada está entre aproximadamente 0,1 g/kg y aproximadamente 0,5 g/kg.
Los siguientes ejemplos se incluyen con propósitos de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Terapia de proteína eNOS mediada por nanopartículas para inhibir la hiperplasia posterior a la angioplastia en un modelo de lesión vascular en ratas
El endotelio es responsable de producir la enzima vasoprotectora, la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), que produce óxido nítrico (NO). El NO regula el tono vascular, previene la trombogenicidad y mantiene las células del músculo liso vascular (VSMC) en estado de reposo. Las intervenciones vasculares, como la angioplastia con globo o la colocación de endoprótesis, dan como resultado la denudación del endotelio, lo que provoca una deficiencia vascular de NO que lleva a la migración y proliferación de VSMC, provocando de este modo una hiperplasia de la íntima. Los inventores probaron la hipótesis de que la administración localizada y sostenida de la proteína eNOS recombinante aumentaría la síntesis de NO en la arteria objetivo e inhibiría de este modo la hiperplasia posterior a la angioplastia. Se usaron nanopartículas biodegradables funcionalizadas, diseñadas para mejorar la captación celular y la localización arterial, y liberar la proteína encapsulada en forma activa para administrar la proteína eNOS por vía intraluminal en un modelo de lesión vascular de la arteria carótida de rata. Los resultados demostraron (i) actividad sostenida de la proteína eNOS en la arteria objetivo, que se extendió durante tres semanas, (ii) inhibición de la hiperplasia (proporción de íntima a media, I/M = 1,15 ± 0,10 frente a 2,81 ± 0,27 (control); p <0,005), y (iii) reendotelización de la arteria lesionada (cobertura de endotelio; 91% frente a 34% (control); p<0,001). La administración de la proteína eNOS inhibió el reclutamiento de leucocitos y la infiltración de macrófagos en la arteria lesionada, previniendo de este modo el proceso inflamatorio que, a su vez, podría haber creado condiciones propicias para facilitar la reendotelización. Este es el primer trabajo que demuestra la eficacia de la administración vascular de la proteína eNOS para restaurar las funciones vasoprotectoras de NO.
Materiales y métodos
Formulación y caracterización de NP cargadas de proteína eNOS
Las NP que contienen proteína eNOS se formularon con polímero PLGA usando una técnica de evaporación de solvente de doble emulsión. Vasir JK, Labhasetwar V., Biomaterials, 29:4244-52 (2008). En resumen, se emulsionó una solución acuosa de proteína eNOS (1 mg) y albúmina de suero de rata (RSA) (10 mg) en 250 μl de tampón de trietanolamina 50 mmol/l (pH 7,5, que contiene 0,5 mmol/L EDTA) en una solución de polímero (27 mg de polímero PLGA y 3 mg de éster dimetílico del ácido tartárico [DMT] en 1 ml de cloroformo) usando un sonicador de sonda (55 W durante 1 min en un baño de hielo). Se usó RSA para estabilizar la proteína eNOS de la inactivación interfacial (Sah H., J Control Release, 58:143-51 (1999)) y DMT para facilitar la liberación de la proteína encapsulada de las NP. Labhasetwar V, Reddy M K., Patente de Estados Unidos N° 7.332.159. Esta emulsión primaria de agua en aceite se emulsionó adicionalmente en 8 ml de una solución acuosa que contenía alcohol polivinílico (PVA; 2,0% p/v) y poli-L-lisina (PLL; 0,5% p/v), usando el sonicador de sonda igual que antes durante 3 min para formar una emulsión doble de agua en aceite en agua. La emulsión doble se agitó continuamente durante la noche para evaporar el cloroformo; las NP con proteína encapsulada se recuperaron por ultracentrifugación y posteriormente se liofilizaron. Las NP se caracterizaron por tamaño de partícula, potencial zeta y carga de proteína.
Lesión con globo y administración local de eNOS-NP en modelo de rata
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la política de bienestar animal de la Asociación Americana del Corazón y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland. Se sometieron ratas macho Sprague Dawley (380 a 400 g, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) a un procedimiento de angioplastia con globo de la arteria carótida usando un catéter con globo Fogarty 2F (Edwards Life Sciences, Irvine, CA). Se usó un catéter PE 10 para infundir una suspensión de NP (210 μl de solución salina que contenía 3 mg de eNOS-NP, lo que equivale a 72 μg de proteína eNOS) en la arteria carótida lesionada durante 5 min a 2 atm de presión (tres infusiones de 70 μl cada uno, con un período de 1 min entre infusiones). La dosis anterior de proteína eNOS se basó en los resultados de nuestros estudios preliminares con dos dosis de NP cargadas con proteína eNOS (36 y 72 μg). Los animales se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 6 animales por grupo) y recibieron una infusión de (i) solución de proteína eNOS, (ii) una suspensión de eNOS-NP o (iii) solución salina (control). Los animales tratados con NP vacías muestran un grado de hiperplasia similar al del control con solución salina; por lo tanto, se usó solución salina como control en todos los experimentos.
Inmunohistoquímica
Los animales se sacrificaron el día 1 para evaluar la infiltración de leucocitos/macrófagos en el sitio de la lesión, los días 7 y 21 después de la angioplastia para evaluar la proliferación de células y la reendotelización. Las secciones de arterias en serie se inmunoteñeron usando diferentes anticuerpos: anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD-45 para leucocitos, anticuerpo anti-CD-68 de rata para macrófagos, anticuerpo policlonal de conejo anti-Ki-67 para células en proliferación, anticuerpo policlonal de conejo anti-actina del músculo liso para VSMC, anticuerpo policlonal de conejo anti-CD-31 para células endoteliales y anticuerpo policlonal de conejo anti-eNOS para eNOS.
Reendotelización
La reendotelización se calculó como el porcentaje de superficie luminal cubierta por células CD-31 positivas tres semanas después de la angioplastia. Además, en un experimento separado, se usó el grado de extravasación del colorante azul de Evan (tinción azul) como índice para la integridad del revestimiento de las células endoteliales. Treinta minutos antes de la eutanasia, las ratas recibieron una inyección intravenosa de la solución de colorante (0,5 ml de solución al 0,5%). Las arterias carótidas se recogieron después de la perfusión transcardiaca con solución salina heparinizada, se fijaron por inmersión en metanol al 100%, se diseccionaron longitudinalmente y se tomaron imágenes usando un escáner de superficie plana.
Tinción con NADPH-diaforasa
Para determinar la localización de la enzima eNOS funcional en las arterias tratadas, se realizó tinción con NADPH-diaforasa en las crio-secciones de arterias obtenidas después de 1, 7 y 21 días después de la angioplastia. Las secciones congeladas se permeabilizaron incubando con Tris-HCl 100 mmol/l que contenía Triton X-100 al 0,2% v/v (pH 8,0) durante 10 min. Las secciones se tiñeron incubando con NADPH 1 mmol/l, nitroazul de tetrazolio 0,2 mM en Tris-HCl 100 mmol/L que contenía Triton X-100 al 0,2% v/v (pH 8,0) durante 45 min a 37° C, se lavaron tres veces con PBS y se montaron con glicerol para microscopía óptica.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± error estándar de las medias (S.E.M). La significancia de las diferencias entre dos grupos experimentales cualquiera se determinó usando la prueba t de Student de dos colas, y las diferencias se consideraron significativas en valores de p <0,05.
Materiales
Se adquirió poli-(DL-lactida-co-glicólido) (PLGA, relación láctido-glicólido 50:50, viscosidad inherente 1,32 dl/g en hexafluoro-isopropanol a 30° C) de DURECT Corporation (Pelham, AL). Se adquirieron albúmina de suero de rata (RSA, Fracción V), alcohol polivinílico (PVA, peso molecular medio 30.000-70.000), bromhidrato de poli-L-lisina (PLL.HBr, peso molecular medio 30.000-70.000), éster dimetílico del ácido tartárico (DMT), sal tetrasódica reducida en p- nicotinamida adenina dinucleótida 2'-fosfato (p-NADPH), cloruro de azul de nitrotetrazolio, azul de Evan y tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de Sigma (St. Louis, MO). La óxido nítrico sintasa endotelial humana recombinante (eNOS) se obtuvo de Axxora, LLC (San Diego, CA). Cada lote de proteína eNOS recombinante se proporcionó (por Axxora LLC) con una concentración de más de 5 mg/ml y una actividad específica de >0,1 nmol/mg/min (U/mg). Se adquirió el kit de inmunoensayo de eNOS humano Quantikine® de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). Se adquirieron el kit de ensayo de proteína BCA y el sustrato de transferencia Western ECL de Pierce (Rockford, IL). Los estándares de color dual Precision Plus Protein™ y el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante eran de Bio-Rad Laboratories (Hercules, California). Se adquirieron el anticuerpo anti-eNOS policlonal de conejo y el anticuerpo anti-CD-45 monoclonal de ratón de BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Se adquirieron los anticuerpos anti-tubulina monoclonal de ratón, anti-Ki-67 policlonal de conejo y anti-actina de músculo liso policlonal de conejo de Abcam Inc. (Cambridge, MA). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD-68 de rata se obtuvo de Serotec Inc. (Raleigh, NC) y el anticuerpo policlonal de conejo anti-CD-31 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). El cóctel de inhibidores de proteasa era de Calbiochem (Gibbstown, NJ). La película KODAK BioMax MR se adquirió de Carestream Health Inc. (Rochester, NY).
Formulación y caracterización de NP cargadas de proteína eNOS
Las NP que contienen proteína eNOS se formularon con polímero PLGA usando una técnica de evaporación de solvente de doble emulsión. Vasir JK, Labhasetwar V., Biomateriales, 29:4244-52 (2008). En resumen, se disolvieron 1 mg de proteína eNOS y 10 mg de RSA en 250 μl de tampón de trietanolamina 50 mmol/l (pH 7,5, que contenía 0,5 mmol/l de EDTA). La solución de proteína se emulsionó en 1 ml de la solución de polímero (27 mg de polímero de PLGA y 3 mg de DMT en 1 ml de cloroformo) usando un sonicador de sonda (55 W durante 1 min en un baño de hielo; Sonicator® XL, Misonix, Farmingdale, NY). Se usó RSA en la formulación para estabilizar la proteína eNOS de la inactivación interfacial, y se usó DMT para facilitar la liberación de la proteína encapsulada de las NP. Esta emulsión primaria de agua en aceite se emulsionó en 8 ml de una solución acuosa de PVA (2,0% p/v) y PLL (0,5% p/v), usando el sonicador de sonda como antes durante 3 minutos para formar una emulsión doble de agua en aceite en agua. La emulsión doble se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, con agitación continua a 4° C durante ~18 horas y finalmente se agitó al vacío durante 1 hora para evaporar completamente el cloroformo. Las NP con proteína atrapada se recuperaron por ultracentrifugación (30.000 rpm durante 20 min a 4° C, Optima™ LE-80K, Beckman, Palo Alto, CA) y posteriormente se liofilizaron (-50° C a un vacío de 0,027 mBar, durante 48 h, FreeZone 4.5, Labconco, Kansas City, MO).
Caracterización de Nanopartículas
Tamaño de partícula: El tamaño de partícula y la polidispersidad de las NP se determinaron usando un analizador de tamaño de partícula ZetaPlus™ (Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, NY). Se preparó una suspensión de NP (0,1 mg/ml) en agua bidestilada y se sonicó durante 30 s sumergida en un baño de hielo.
Potencial zeta: El potencial zeta se midió en función del pH para demostrar el efecto del pH sobre la carga superficial de las NP. Se prepararon tampones de pH 4,0 y 7,4 usando una solución de ácido sulfónico de hidroxietil piperazina etano (HEPES) 1 mM y se ajustó el pH con soluciones de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio 0,1 N. Las NP se suspendieron en los tampones respectivos (0,1 mg/ml) y el potencial zeta se midió usando el analizador de potencial zeta ZetaPlus™ (Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, NY).
Carga de proteínas: La cantidad de proteína eNOS cargada en las NP se determinó a partir de la cantidad total de proteína añadida en la formulación y la proteína que no estaba encapsulada en las NP. La concentración de proteína eNOS en los lavados se determinó usando el kit de inmunoensayo de eNOS humano Quantikine®; los lavados de las NP de control funcionaron como una muestra en blanco.
Lesión con globo y administración local de eNOS-NP en modelo de rata
Se anestesiaron ratas macho Sprague Dawley (380 a 400 g, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Se expuso la arteria carótida común izquierda mediante disección roma a través de una incisión en la línea media del cuello bajo un microscopio de disección. Las arterias carótidas común, interna y externa izquierdas se ligaron con clips de vasos para interrumpir temporalmente el flujo de sangre al sitio de la manipulación quirúrgica. Se introdujo un catéter con globo 2F Fogarty (Edwards Life Sciences, Irvine, CA) en la arteria carótida externa izquierda mediante una arteriotomía y se hizo avanzar hasta el origen de la arteria carótida común izquierda. El globo se infló (con solución salina) lo suficiente como para generar una ligera resistencia en la pared arterial y se extrajo a través de la arteria carótida común, seguido de desinflado del globo. Este procedimiento se repitió tres veces consistentemente para producir una denudación endotelial de toda la longitud de la arteria carótida común izquierda. Tras extraer el catéter con globo, se insertó un catéter PE 10 en la arteria carótida común izquierda. Las partes media y distal de la arteria carótida común izquierda y la arteria carótida interna izquierda se ligaron temporalmente. Se infundió una suspensión de NP (210 μl de solución salina que contenía 3 mg de eNOS-NP que equivale a 72 μg de proteína eNOS) en la arteria carótida lesionada durante 5 min a 2 atm de presión (tres infusiones de 70 μl cada una, con un período de 1 min entre infusiones). Después de la infusión de NP, se liberaron los clips en las arterias carótida común e interna y se restableció el flujo sanguíneo. Las NP infundidas localmente penetran en la arteria lesionada a través del endotelio alterado. Los inventores y otros han mostrado una administración específica del sitio en la arteria objetivo con niveles casi indetectables en la arteria no objetivo. Joner et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 28:1960-6 (2008); Panyam et al., FASEB J., 16:1217-26 (2002). Los animales se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 6 animales por grupo) y recibieron una infusión de (i) solución de proteína eNOS, (ii) una suspensión de eNOS-NP, (iii) NP de control y (iv) solución salina.
Recogida de recipientes
Los animales se sacrificaron tres semanas después de la lesión vascular con una sobredosis de pentobarbital. Todos los animales recibieron perfusión transcardiaca a través del ventrículo izquierdo durante 2 min con solución salina heparinizada, seguido de formalina tamponada al 10% durante otros 5 min a presión fisiológica. Se extrajeron las arterias carótidas y se mantuvieron en formalina al 10% durante 24 h. Después de esto, cada arteria se cortó en tres piezas cada una de 5 mm desde el extremo proximal al distal, y luego las tres piezas se incluyeron en un único bloque de parafina. Tres secciones en serie (5 μm de espesor), seccionadas a intervalos espaciados igualmente, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para la morfometría y se usaron tres secciones adicionales incorporadas de manera similar (5 μm de espesor) para la inmunohistoquímica. Para crio-secciones, los animales se perfundieron con solución salina heparinizada como se ha mencionado anteriormente, seguido de una solución al 2% p/v de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las arterias se fijaron por inmersión en una solución de paraformaldehído al 2% p/v enfriada con hielo a 4° C durante 1 hora. Luego, las arterias se sumergieron en una solución de sacarosa al 5% p/v en PBS durante 30 min, una solución de sacarosa al 10% p/v durante 60 min y luego se almacenaron durante la noche sumergiéndolas en una solución de sacarosa al 20% p/v a 4° C. Luego, las arterias se incluyeron en el compuesto Tissue-Tek® OCT (Sakura, Torrance, CA) y se almacenaron a -80° C hasta que se tomaron para la evaluación histológica. Se usaron secciones en serie (8 μm de espesor) para inmunohistoquímica (CD-45 y CD-68) y tinción con NADPH-diaforasa. Las imágenes se adquirieron usando un microscopio Leica DMR (Leica Microsystems, GmbH, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara CCD refrigerada Retiga EXi (Qlmaging, Surrey, BC, Canadá) y se analizaron usando el software ImagePro Plus 6.1(MediaCybernetics, Bethesda, MD). El número de células teñidas positivamente se calculó en 9 secciones en serie por arteria (n=3 a 6 ratas por grupo). Para la transferencia Western, las arterias se recogieron después de la perfusión con solución salina y se congelaron al instante hasta la homogeneización.
Análisis morfométrico
El análisis morfométrico de las secciones arteriales teñidas con H&E se realizó a través de un sistema de análisis de imágenes computarizado (ImagePro Plus 6.1, MediaCybernetics, Bethesda, MD). Las mediciones cuantitativas se realizaron de forma ciega de las áreas correspondientes a la lámina elástica interna y externa y al diámetro de la luz. Se usaron tres secciones transversales espaciadas igualmente en todas las ratas para cuantificar las lesiones de la íntima. El área medial se calculó restando el área definida por la lámina elástica interna (IEL) del área definida por la lámina elástica externa (EEL) y el área íntima se determinó restando el área de la luz del área definida por el IEL. Finalmente, se calculó la relación del área íntima a la medial (I/M) de cada sección.
Niveles de proteína eNOS por transferencia Western
Para demostrar niveles sostenidos de proteína eNOS en la arteria objetivo, se realizó transferencia de Western en homogeneizados de arteria recogidos en diferentes puntos temporales. Las arterias congeladas al instante se homogeneizaron en tampón de lisis RIPA enfriado con hielo suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa. El homogeneizado se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 min a 4° C y el sobrenadante se recogió y procesó para electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Para determinar la concentración de proteínas en las muestras de homogeneizado se usó el kit de ensayo de proteínas BCA. Para cada experimento, se cargaron cantidades iguales de proteína total (30 μg) en cada hilera y se resolvieron mediante SDS-PAGE al 8% en condiciones reductoras. Luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante electrotransferencia semiseca (a 12 V, durante 1 h). La membrana se incubó en tampón de bloqueo que contenía 50 mmol/l de Tris-HCl (pH 7,4), 500 mmol/l de NaCl, 0,1% de Tween-20 y 5% de leche desnatada en polvo durante 60 min con agitación suave. Luego, las membranas se incubaron durante la noche a 4° C con anticuerpo anti-eNOS policlonal de conejo (dilución 1:1000 en tampón de bloqueo). La membrana se lavó en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mmol/l (pH 7,4), NaCl 500 mmol/l, Tween-20 al 0,1% y se incubó con una dilución 1:1000 de anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante) en el tampón de bloqueo durante 1 h. Los productos de la reacción se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada usando sustrato de transferencia Western ECL. La señal se detectó mediante exposición a película KODAK BioMax MR y se cuantificó mediante densitometría. Para las determinaciones de peso molecular se usaron marcadores de proteína preteñidos y se usó proteína eNOS recombinante como control positivo. Todas las membranas también se transfirieron para atubulina (usando anticuerpo monoclonal anti-tubulina de ratón) para controlar la carga de proteína igual en todas las hileras.
Cultivo celular
Se mantuvieron células de músculo liso vascular humano (Cascade Biologics, Portland, OR) en medio 231 suplementado con suplemento de crecimiento de músculo liso (Cascade Biologics) a 37° C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Las células típicamente se usaron en el pase 3-4.
Administración intracelular de una proteína modelo usando NP
Se sembraron células (15.000 células/ml/pocillo) en placas de 24 pocillos y se permitió que se adhirieran durante 24 horas. Para investigar la actividad sostenida de las NP cargadas con enzima HRP en comparación con la solución de HRP, las células se incubaron con 4 μg/ml de HRP (disuelto en medio de cultivo celular) o 100 μg/ml de NP cargadas con HRP (equivalente a 4 μg de HRP) durante 24 h. El medio se cambió después de 24 horas y luego en días alternos. Después de 1, 3 y 5 días, las células se lavaron dos veces con PBS helado y se lisaron en hielo en tampón de lisis celular (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, que contenía TritonX-100 al 1%). Los lisados celulares se centrifugaron a 14.000 rpm a 4° C durante 10 min; se analizó la actividad HRP de los sobrenadantes usando el ensayo colorimétrico SIGMAFAST™ OPD (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Las concentraciones de HRP en los lisados se determinaron comparando la actividad de HRP en el lisado con una curva estándar de HRP purificada. Esta comparación de una curva estándar de HRP purificada preparada en tampón de lisis celular con la preparada en lisados celulares libres de enzimas indicó que los componentes del lisado celular no afectaron a la determinación de la actividad enzimática. La cantidad de HRP activa se normalizó a la proteína celular total y se expresó como nanogramos por miligramo de proteína celular. Las células se cultivaron en cubreobjetos y se trataron con NP cargadas con HRP o solución de HRP como se ha descrito anteriormente, se lavaron con PBS, se fijaron y se incubaron con sustrato de DAB/Ni2+ (Vector Labs, Burlingame, CA.) para teñir la enzima HRP activa presente en las células.
Captación arterial de NP
Para determinar la captación arterial de NP en la arteria objetivo, se infundió una suspensión de NP marcadas con 6-cumarina en arterias carótidas de rata lesionadas (como se ha descrito anteriormente) y los animales se sacrificaron una hora después de la infusión. Se extrajeron las arterias carótidas, se enjuagaron con solución salina y luego se secaron usando un papel absorbente. Se registró el peso húmedo de cada arteria y la arteria se cortó finamente en pequeños pedazos con una tijera, se homogeneizó en 2 ml de agua destilada usando un homogeneizador de tejidos (Biospec Product Inc, Bartlesville, OK) a 1000 rpm durante 2 min, y los homogeneizados se liofilizaron durante 48 horas. El colorante fluorescente de las NP en los homogeneizados de arteria se extrajo agitando las muestras liofilizadas con 1 ml de diclorometano a 37° C durante 24 horas a 150 rpm usando un agitador orbital Environ® (Lab Line, Melrose Park, IL). Los extractos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min (microcentrífuga Eppendorf, 5417R, Brinkmann Instruments, Westbury, NY) para eliminar los restos celulares. El contenido de colorante de los sobrenadantes se analizó por HPLC, como se ha descrito anteriormente. Panyam et al., J Drug Target., 10:515-23 (2002).
Resultados
Formulación y Caracterización de eNOS-NPs
Las NP funcionalizadas con PLL que encapsulan la proteína eNOS tenían forma esférica con un tamaño hidrodinámico medio de 260 ± 20 nm, índice de polidispersidad <0,20 y potencial zeta (carga superficial) de -12 mV a pH 7. El tamaño medio de partícula por microscopía electrónica de transmisión fue de 81 ± 4 nm. Reddy et al., Appl Biochem Biotechnol., 151 (2-3):565-77 (2008). La carga de proteína eNOS en las NP fue del 1,2% p/p (es decir, 100 mg de NP contenían 1,2 mg de proteína eNOS), con una eficacia de encapsulación del 99% determinada mediante el inmunoensayo de eNOS. Para evaluar la eficiencia de nuestras NP funcionalizadas para administrar proteína bioactiva intracelularmente, se formularon NP que encapsulaban peroxidasa de rábano picante (HRP); al igual que con HRP, los niveles de proteína en las células pueden cuantificarse y visualizarse mediante tinción. La cantidad de HRP cargada en las NP y la liberada de las NP fue la misma tanto para las NP no modificadas como para las funcionalizadas. Las NP funcionalizadas cargadas con HRP demostraron una actividad enzimática 50 veces mayor en las VSMC en comparación con las NP no modificadas y la proteína en solución, y las NP funcionalizadas mantuvieron la actividad enzimática en las células durante el periodo experimental de una semana (fig. 1a-b). Además, las NP funcionalizadas mostraron una captación arterial 3 veces mayor que las NP no modificadas 1 hora después de la administración localizada en el modelo de arteria carótida de rata.
Inhibición de la hiperplasia neointimal
El análisis morfométrico demostró una reducción significativa (60%) en la hiperplasia de la íntima en el grupo tratado con eNOS-NP en comparación con los animales de control con solución salina (relación de íntima a media, i/m = 1,15 ± 0,10 frente a NP de control, 2,05 ± 0,09; solución salina, 2,81 ± 0,27; p<0,005) (Fig. 2a-f) con un aumento concomitante en el área de la luz (0,200±0,018 mm2 frente a control de solución salina 0,095±0,004 mm2; p<0.005) (Fig. 2g). No hubo diferencias significativas entre los animales tratados con solución salina y NP de control (I/M = NP de control, 2,05 ± 0,09; solución salina, 2,81 ± 0,27; p = 0,04). Los animales tratados con la solución de proteína eNOS mostraron una reducción marginal de la hiperplasia (27%) en comparación con el control de solución salina (I/M = 2,06 ± 0,07 frente a 2,81 ± 0,27; p = 0,04). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las áreas mediales, la circunferencia de EEL y las áreas de EEL para las arterias contralaterales no lesionadas y las arterias lesionadas en el control con solución salina, o tratadas con eNOS-NP o eNOS-solución. Por lo tanto, parece que la administración de proteína eNOS tuvo un efecto mínimo sobre la remodelación vascular adaptativa pero tuvo un efecto significativo sobre la inhibición de la hiperplasia neointimal.
Índice de proliferación de células del músculo liso
Las secciones arteriales obtenidas de ratas 3 semanas después de la angioplastia se inmunoteñeron para a­ SMA (marcador de VSMC). La mayoría de la población celular presente en la neαntima se tiñó positivamente para a­ SMA, demostrando por tanto que la hiperplasia se debió a la migración y proliferación de VSMC (Fig. 3a-c). Para determinar el mecanismo de inhibición de la proliferación de VSMC con la administración de proteína eNOS, las secciones arteriales se inmunoteñeron para Ki-67 (marcador de células en proliferación) (Fig. 3d-f). Ki-67 es un antígeno nuclear expresado por células en todas las fases del ciclo celular activo/proliferación (fase G1, S, G2 y M). Las secciones arteriales de los animales tratados con solución salina y solución de proteína eNOS mostraron una tinción positiva para Ki-67 (la inmunotinción marrón se superpone con la contratinción azul (hematoxilina) para el núcleo) (Fig. 3g y 3h), lo que indica que las células se encontraban en una etapa de proliferación activa del ciclo celular. Por el contrario, las secciones del grupo tratado con eNOS-NPs mostraron significativamente menos células positivas para Ki-67 (Fig. 3i), lo que indica que las células se encontraban en la fase G0 de reposo del ciclo celular. El índice de proliferación se calculó como el porcentaje de células totales que eran positivas para Ki-67. Los resultados demostraron una reducción significativa en el porcentaje de células en proliferación en las arterias tratadas con eNOS-NP en comparación con el control de solución salina (32 ± 4 frente a 95 ± 2; p<0,005) (Fig. 3j) o solución de proteína eNOS (80 ± 8 frente a 95 ± 2; p=0,12).
Inhibición de la infiltración de leucocitos/macrófagos
El análisis de las secciones arteriales 24 h después del procedimiento de angioplastia demostró una reducción significativa en el reclutamiento de leucocitos (eNOS-NP, 163 ± 20 frente a solución salina, 392 ± 74 células positivas paraCD-45/sección) (Fig. 4a-c, 4g) e infiltración de macrófagos (eNOS-NPs, 143 ± 22 frente a solución salina, 274 ± 6 células positivas para CD-68/sección) (Fig. 4d-f, 4h) en el grupo tratado con eNOS-NP que en el control con solución salina.
Reendotelialización de la arteria carótida denudada
La tinción de las secciones arteriales para CD-31 de los animales tratados con eNOS-NP demostró una reendotelización significativamente mayor de la arteria lesionada que en los animales de control con solución salina (91% frente a 34%; p<0,001) (Fig. 5a-g). La solución de proteína eNOS fue ineficaz para inducir la reendotelización y los resultados fueron casi similares a los del control de solución salina (41% frente a 34%; p = 0,44) (Fig. 5g). La reendotelización fue más evidente a partir de la extravasación reducida del colorante azul de Evan en el grupo tratado con eNOS-NP que en el control de solución salina (Fig. 5h,i). Para evaluar la recuperación funcional del endotelio recién formado, las secciones se inmunoteñeron para eNOS usando un anticuerpo específico de la isoforma que mostró un número significativamente mayor de células (95%) para la actividad de eNOS, mientras que solo unas pocas células mostraron actividad enzimática en el control de solución salina (Fig. 6a-f). Además, la inmunorreactividad de eNOS fue detectable en la capa medial de las arterias de los animales tratados con eNOS-NP, pero no en otros grupos (Fig. 6f).
Actividad de NOS en arteria tratada
Se usó la tinción con NADPH-diaforasa para determinar la localización de la proteína NOS funcional en la pared arterial. Este método detecta la actividad diaforasa de la eNOS que implica la catálisis de la oxidación de NADPH usando un aceptor de electrones (sal de tetrazolio) mediante el cual este último se reduce a un derivado de formazán insoluble de color púrpura. En el día 1, las arterias del grupo tratado con eNOS-NPs mostraron la presencia de actividad NOS localizada en la capa medial; sin embargo, a los 7 días, las secciones mostraron una intensa tinción de NADPH-diaforasa. Las secciones arteriales obtenidas a las 3 semanas demostraron actividad de NOS en la capa endotelial formada en el grupo tratado con eNOS-NP; mientras que las arterias del control con solución salina mostraron una tinción débil. Estos resultados demuestran por tanto la actividad sostenida de la proteína eNOS en el grupo tratado con eNOS-NP (Fig. 7a-b).
Determinación cuantitativa de la proteína eNOS en las arterias tratadas
Los niveles de proteína eNOS se determinaron mediante transferencia Western de los homogeneizados arteriales del grupo tratado con eNOS-NP. Se detectaron niveles significativos de proteína eNOS inmunorreactiva a los 7 días; mientras que el control de solución salina de las arterias mostró niveles mínimos de eNOS (Fig. 7c-d). El nivel de proteína eNOS en las arterias de los animales tratados con eNOS-NP fue comparable al presente en arteria no lesionada (contralateral).
Análisis
Los inventores han demostrado que la administración localizada y sostenida de la proteína eNOS recombinante inhibe la hiperplasia de la íntima y vuelve a endotelizar la arteria lesionada. La presencia sostenida de la actividad de eNOS restauró las funciones vasoprotectoras del endotelio, inhibió el reclutamiento de leucocitos y macrófagos y también evitó la proliferación descontrolada de VSMC en respuesta a la lesión vascular. El endotelio, la capa más interna de células que recubre la luz de los vasos sanguíneos, desempeña un papel importante en la homeostasis vascular y la patogénesis de muchas enfermedades. Las funciones predominantes del endotelio incluyen el mantenimiento del tono vascular, la prevención de la trombogenicidad y la regulación de la proliferación de VSMc . Garg UC, Hassid A., J Clin Invest., 83:1774-7 (1989). Las células endoteliales ejercen la mayoría de estas funciones produciendo una matriz diversa de proteínas reguladores y otras sustancias paracrinas (como prostaciclina, activador de plasminógeno tisular, factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1, NO etc). Una de las proteínas reguladoras principales producidas por las células endoteliales en la enzima eNOS que cataliza la NADPH y la oxidación dependiente del oxígeno de L-arginina a L-citrulina y NO. NO. Cooke J P, Dzau V J., Annu Rev Med., 48:489-509 (1997). Además de su función como el vasodilatador endógeno más potente, NO también actúa junto con TGF-p1 para mantener las VSMC subyacentes en un estado inactivo.
La denudación endotelial después de la angioplastia con globo lleva a la pérdida de factores vasoprotectores como eNOS, lo que da como resultado la deficiencia vascular de niveles de NO en el sitio de la lesión. Esto desencadena el proceso de hiperplasia a través de la adherencia de los leucocitos a la pared del vaso y la producción de factores mitogénicos, lo que da como resultado la proliferación de VSMC. Además, se ha sugerido que la falta de reendotelización es la causa principal de la aparición de trombosis y rebote de hiperplasia en pacientes tratados con endoprótesis liberadoras de fármacos. La administración localizada y sostenida mediada por NP de la proteína eNOS recombinante es un enfoque potencial para aumentar los niveles de NO en la pared del vaso lesionado después de la angioplastia con globo.
La administración de proteínas recombinantes está limitada por su vida media plasmática corta (debido a la degradación proteolítica) y la captación celular limitada (debido al alto peso molecular). La administración de proteínas localizada (por ejemplo, apolipoproteína A recombinante y factor de crecimiento de hepatocitos) a través de la administración intramural o el uso de bombas de infusión fue ineficaz debido a los factores anteriores. Kaul et al., Circulation, 107:2551-4 (2003); Yasuda et al., Circulation, 101:2546-9 (2000). Las PLGA-NP pueden proteger la proteína encapsulada de la proteólisis y liberarla de manera sostenida (Davda J, Labhasetwar V., J Biomed Nanotechnology, 1:74-82 (2005)); sin embargo, el secuestro endosómico y la exocitosis podrían limitar la eficacia de las NP para la administración intracelular de agentes terapéuticos. Panyam J, Labhasetwar V., Pharm Res., 20:212-20 (2003); Panyam et al., FASEB J., 16:1217-26 (2002). Para abordar estos problemas, se desarrollaron las PLGA-NP funcionalizadas con PLL, que en estudios anteriores de los inventores han demostrado que dan como resultado una administración citoplasmática significativamente más alta de la proteína bioactiva que la de las NP no modificadas debido a su mayor administración celular y escape del compartimento endosómico (Fig. 1). A pesar de la modificación con PLL catiónico, los parámetros de formulación se optimizaron para que las NP funcionalizadas permaneciesen cargadas negativamente a pH fisiológico para evitar interacciones con proteínas séricas y la posibilidad de agregación después de la administración in vivo.
Las NP funcionalizadas facilitaron la liberación sostenida de la enzima eNOS bioactiva en las arterias tratadas hasta 3 semanas después de la angioplastia. Además, una fracción de las NP podría haberse depositado en la pared arterial a través de su transporte a través de los vasa vasorum (Rome et al., Arterioscler Thromb. 14:148-61 (1994)), que son pequeños capilares que se originan en la luz de la arteria con una red que se extiende a la adventicia y la media. Gossl et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287:H2346-51 (2004). Después de la angioplastia, las NP fueron absorbidas principalmente por las VSMC y demostraron la presencia de actividad de eNOS. Para provocar su actividad, la eNOS requiere un cofactor, la tetrahidrobiopterina (BH4), cuyo nivel basal se muestra suficiente en las VSMC para respaldar la actividad de la eNOS. Kullo et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 17:2405-12 (1997). La tinción con NADPH-diforasa muestra actividad de eNOs principalmente en las cercanías de las NP localizadas en las paredes del vaso 1 día después de la angioplastia (Fig. 7b). Sin embargo, la extensa tinción de diaforasa observada el día 7 y 21 podría deberse a la liberación de la eNOS encapsulada, manteniendo por tanto la actividad biológica de la enzima en la arteria (Fig. 7b). Aunque la tinción con diaforasa no proporciona actividad específica de la isoforma, las arterias del control de solución salina mostraron una tinción mínima o nula en cualquier punto temporal (Fig. 7a), lo que concuerda con estudios anteriores de otros que no mostraron inmunotinción para la NOS inducible (iNOS) después de 5 y 14 días de angioplastia con globo en modelo de arteria carótida de rata. Janssens et al., Circulation, 97:1274-81 (1998). La transferencia Western proporciona una segunda confirmación de la presencia sostenida de la proteína eNOS en las arterias del grupo tratado con eNOS-NP (Fig. 7c-d). La inmunotinción de eNOS de las secciones arteriales obtenidas 3 semanas después de la angioplastia también mostró la presencia de la proteína eNOS en las capas mediales de las arterias del grupo tratado con eNOS-NP (Fig. 6f) mientras que no se detectó proteína eNOS en las arterias de animales de control con solución eNOS o solución salina. Estos resultados demuestran la capacidad de las NP para mantener la actividad de eNOS en la arteria tratada.
La mayoría de las estrategias terapéuticas se centran en la aceleración de la reendotelización usando factores de crecimiento (como el factor de crecimiento del endotelio vascular: VEGF (Asahara et al., Circulation. 91:2793-801 (1995)), factor de crecimiento de fibroblastos básico: b-FGF (Lindner et al., J Clin Invest. 85:2004-2008 (1990)), etc.) pero estos podrían provocar hiperplasia. La administración de enzimas eNOS con NP inhibió las vías básicas de la inflamación, como se desprende del análisis inmunohistoquímico de las secciones arteriales recogidas a las 24 horas, que demostró una reducción significativa de la infiltración de macrófagos y leucocitos en el sitio lesionado (Fig. 4g-h). Se ha observado una reducción similar en la respuesta inflamatoria a la lesión vascular después del tratamiento con aductos de aspirina que liberan NO en las arterias femorales de ratones ApoE (-/-) hipercolesterolémicos. Yu et al., Lab Invest., 82:825-32 (2002). Además, las arterias del grupo tratado con eNOS-NP teñidas para Ki-67 mostraron una inhibición significativa de la proliferación de VSMC en comparación con la solución de eNOS y los controles de solución salina (Fig. 3j). Este efecto antiproliferativo de la proteína eNOS se manifiesta mediante la producción de NO, que se sabe que reduce la proliferación celular a través de la regulación positiva de las moléculas inhibidoras del ciclo celular (como p21 y p27). Sato et al., Cardiovasc Res., 47:697-706 (2000). Además, se sabe que el NO reduce la proliferación de VSMC a través de un mecanismo dependiente de cGMP o vías independientes de cGMP. Ignarro et al., Proc Natl Acad Sci USA., 98:4202-8 (2001). Como Ki-67 es un marcador de células en una fase activa del ciclo celular; parece que el efecto antiproliferativo de eNOS estuvo mediado por un retraso en la progresión del ciclo celular y, por lo tanto, la mayoría de las células se detuvieron en la fase G0. Además, los resultados de la exclusión del colorante azul de Evan, la inmunotinción de CD-31 y eNOS, y la tinción de actividad de diaforasa confirman la integridad y la recuperación funcional del endotelio generado en animales tratados con eNOS-NP. Cooney et al., Gene Ther., 14:396-404 (2007). La administración de eNOS puede crear condiciones propicias al inhibir la infiltración de células inflamatorias en el sitio lesionado que podría haber favorecido un proceso local que implica la proliferación y migración endotelial adyacente al sitio de la lesión. Van Belle et al., Cardiovasc Res., 38:54-68 (1998). La otra posibilidad es que el NO podría haber facilitado el alojamiento de las células progenitoras endoteliales (EPC) en el sitio de la lesión y contribuido al proceso de reendotelización. Iwakura et al., Circulation, 108:3115-21 (2003).
En el modelo normal de lesión de la arteria carótida en ratas, los datos proporcionan evidencias de que la administración de proteína eNOS inhibe las vías básicas (inflamación y proliferación de VSMC) responsables de la hiperplasia y, por lo tanto, se espera que esta estrategia terapéutica también sea eficaz en la ateroesclerosis. Además, recientemente Sharif et al. han demostrado casi el mismo grado de inhibición de la hiperplasia y la reendotelización con endoprótesis recubiertos con el gen eNOS en conejos normocolesterolémicos e hipercolesterolémicos. Sharif et al., Mol Ther., 16:1674-80 (2008).
Nuestro enfoque es factible de usar en un entorno clínico, ya que las NP pueden infundirse en la vasculatura usando un catéter, ya sea solo o junto con una endoprótesis (ya sea recubierto en el endoprótesis o infundido localmente después de la colocación de la endoprótesis) para facilitar la reendotelización a la vez que se inhibe la hiperplasia. La terapia de proteína eNOS sostenida podría usarse de manera eficaz en otros trastornos vasculares que implican principalmente la pérdida genética o fisiopatológica de eNOS, como la hipercolesterolemia, la aterosclerosis, la hipertensión pulmonar inducida por hipoxia, etc., lo que significa que las aplicaciones más amplias de las NP cargadas con eNOS.
Ejemplo 2: Procedimiento para recubrir una endoprótesis y un globo con nanopartículas
Se formularon nanopartículas que contenían albúmina de suero bovino (BSA) como proteína modelo y colorante SDB5700 como marcador de infrarrojo cercano (NIR) con 1,32 dl/g de polímero de poli dl-lactida-co-glicólido (PLGA) usando una técnica de doble emulsión. Se emulsionó una solución acuosa de BSA a una concentración de 1 mg/l5 |jl en una solución de 15,25 mg/ml de PLGA en cloroformo que contenía 16,7 j l de colorante SDB5700 NIR. La emulsificación se realizó usando un sonicador de sonda (55 W durante 2 minutos en un baño de hielo; Sonicator XL, Misonix, Farmingdale, NY). Luego, la emulsión primaria se añadió a 4 ml de una solución acuosa del emulsionante poli(vinil alcohol) (PVA) y la poli-L-lisina moduladora de carga superficial (PLL) (relación de PVA a PLL de 2 a 0,5 p/p). Luego, la mezcla se agitó en vórtice durante 3 minutos y después se sonicó como anteriormente durante 5 minutos para formar una emulsión doble de agua en aceite en agua. Luego, la emulsión doble se centrifugó durante 10 minutos a 1000 rpm y la capa superior se guardó para su aplicación. Luego, se realizó el calibrado de partículas usando el sistema de calibrado de partículas Nicomp que confirma la producción de nanopartículas (NICOMP 380 ZLS; Santa Bárbara, California). Para recubrir uniformemente la emulsión anterior sobre la superficie de la endoprótesis o del globo, se hizo girar a aproximadamente 200 rpm. A continuación, se aplicó la emulsión usando un aerógrafo alimentado por sifón de doble acción Paasche VL (configuraciones del aerógrafo: 50 psi, boquilla cerrada, rueda de ajuste superior entre abertura de giro de % y ^ , distancia de trabajo de 6 pulgadas de la muestra). Cada capa consistía de 30 segundos con 20 minutos entre capas para asegurar un secado suficiente. Las nanopartículas se forman in situ sobre la superficie de la endoprótesis o del globo después de la evaporación de los solventes (cloroformo y agua).
Las imágenes con Maestro que detectan una señal de infrarrojo cercano mostraron extremos recubiertos y no recubiertos de la mismo endoprótesis (Fig. 8a). La imagen a través de la parte superior de la endoprótesis mostró que el interior de la endoprótesis también está recubierto (Figura 8b). La microscopía electrónica de barrido mostró el depósito de nanopartículas sobre la superficie de la endoprótesis (Figura 8c). Se ven nanopartículas incrustadas en el alcohol polivinílico (PVA), que se usa como emulsionante. La imagenología del globo recubierto muestra la señal de fluorescencia de las nanopartículas; no hay señal del globo sin recubrimiento (Figura 8d). Se ha probado el mismo procedimiento para el recubrimiento de nanopartículas en un injerto vascular

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento de células endoteliales, que comprende una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que tiene una estructura de tipo matriz y que comprende un polímero biocompatible.
2. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, en donde la óxido nítrico sintasa es la óxido nítrico sintasa endotelial.
3. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, que comprende además albúmina dentro de la nanopartícula.
4. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, en donde el polímero biocompatible es un polímero biodegradable.
5. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, en donde el polímero biocompatible es poli-(DL-láctido-co-glicólido).
6. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además uno o más cofactores de óxido nítrico sintasa.
7. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, en donde la nanopartícula es una nanopartícula modificada.
8. La composición de liberación sostenida de la reivindicación 1, en donde la nanopartícula tiene un diámetro hidrodinámico medio de 10 a 300 nanómetros, y en donde el diámetro hidrodinámico medio puede determinarse usando dispersión de luz dinámica.
9. Un dispositivo médico implantable o administrable recubierto con una composición de liberación sostenida para estimular el crecimiento de células endoteliales, que comprende una óxido nítrico sintasa dentro de una nanopartícula que tiene una estructura de tipo matriz y que comprende un polímero biocompatible.
10. El dispositivo médico implantable o administrable de la reivindicación 9, en donde la óxido nítrico sintasa es óxido nítrico sintasa endotelial.
11. El dispositivo médico implantable o administrable de la reivindicación 9, que comprende además albúmina dentro de la nanopartícula.
12. El dispositivo médico implantable o administrable de la reivindicación 9, en donde el polímero biocompatible es un polímero biodegradable.
13. El dispositivo médico implantable o administrable de la reivindicación 9, en donde el polímero biocompatible es poli-(DL-láctido-co-glicólido).
14. El dispositivo médico implantable o administrable de la reivindicación 9, en donde el dispositivo médico implantable está configurado para caber dentro de un vaso sanguíneo.
15. El dispositivo médico implantable o administrable de la reivindicación 14, en donde el dispositivo médico implantable se selecciona del grupo que consiste en injertos vasculares, endoprótesis y catéteres de globo.
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