ES2944062T3 - Células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) que expresan receptores de antígenos quiméricos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia, en particular a la inmunoterapia para el tratamiento del cáncer, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes. Más específicamente, la invención se refiere a células T invariantes asociadas a mucosas (MAIT) que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR), en las que la célula MAIT es alogénica con respecto al sujeto a tratar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) que expresan receptores de antígenos quiméricos Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia, en particular a la inmunoterapia para el tratamiento del cáncer, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunitarias. Más específicamente, la invención se refiere a células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR).
Antecedentes de la invención
La inmunoterapia usando células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR-T) ha mostrado resultados clínicos notables en el tratamiento de la leucemia y es una de las nuevas estrategias más prometedoras para tratar el cáncer y otras enfermedades tales como infecciones o autoinmunidad. Entre los CAR más exitosos usados hasta la fecha se encuentran los que seleccionan como diana CD19, que ofrecen la posibilidad de remisiones completas en pacientes con neoplasias hematológicas malignas recidivantes o resistentes al tratamiento. La terapia con células CAR-T representa una inmunoterapia en la que los linfocitos se modifican genéticamente para expresar un CAR que permite el reconocimiento de un antígeno específico. Tras el reconocimiento del antígeno, estas células T modificadas se activan a través de dominios de señalización que las convierten en potentes linfocitos citolíticos. Los protocolos clínicos actuales utilizan principalmente células T autólogas que se recogen de un paciente mediante aféresis, se modifican genéticamente para expresar CAR, se cultivan in vitro para aumentar el número de células y finalmente se reinfunden de nuevo al mismo paciente. Este enfoque requiere la fabricación de células específicas para el paciente, lo que inevitablemente da como resultado una variabilidad de paciente a paciente en el producto celular final, con potencia y seguridad variables. Este enfoque basado en la transferencia de células autólogas tiene otros inconvenientes, tales como el tiempo de producción (aproximadamente 2 meses entre la aféresis y la reinfusión). Este retraso es crítico, ya que algunos pacientes enfrentan una emergencia vital. Además, las células inmunitarias de pacientes enfermos pueden ser poco funcionales o estar presentes en cantidades muy bajas. Por tanto, tal tratamiento que usa los propios linfocitos del paciente es costoso, requiere mucho tiempo y no es apropiado para el uso generalizado de células CAR T.
A partir de lo anterior, sería deseable desarrollar una inmunoterapia en la que las células alogénicas de terceros pudieran prefabricarse, caracterizarse en detalle y ponerse a disposición para su administración inmediata a los pacientes. Sin embargo, el uso de células alogénicas (es decir, células obtenidas de diferentes individuos de la misma especie) plantea algunas dificultades. En particular, las células alogénicas son susceptibles de ser rechazadas por las células inmunitarias del receptor en un proceso denominado rechazo de huésped contra injerto (HCI), lo que limita su eficacia. De manera más importante, las células alogénicas pueden desencadenar una enfermedad de injerto contra huésped (EICH). De hecho, las células T alogénicas conservan su receptor de células T endógeno (TCR) que puede reconocer el tejido del huésped como extraño, lo que da como resultado una EICH que puede provocar daños graves en los tejidos y la muerte. Un enfoque actual consiste en la generación de células CAR-T universales en las que el t Cr endógeno se inactiva genéticamente (Qasim et al., Sci Transl Med., 25 de enero de 2017, 9(374)). Otras estrategias se basan en el uso de poblaciones de células inmunitarias menos propensas a la alorreactividad, tales como las células CAR-NK que carecen de TCR endógeno o las células CAR-NKT (Rotolo et al., Cancer Cell. 8 de octubre de 2018;34(4):596-610). Sin embargo, la frecuencia de las células NKT en la sangre humana es muy baja (0,01-0,5%).
Por tanto, todavía se necesitan inmunoterapias alternativas y/o mejoradas basadas en células CAR-T alogénicas. Las células T asociadas a la mucosa (MAIT) son una población de células T que aún no se ha usado para la inmunoterapia (Rudak et al., J. Leucocyte Biol. 2018, 104(3), 473-486; Salou et al., Curr. Op. Immunol. 2017, 48, 7-14; Lantz y Legoux, Immunol. Biol celular. 2018, 96(6)).
Sumario de la invención
La invención proporciona una célula T invariante asociada a la mucosa (MAIT) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), para su uso en el tratamiento de un cáncer, una enfermedad inmunitaria o una enfermedad infecciosa en un sujeto, en la que la célula MAIT es alogénica con respecto al sujeto.
En una realización particular, la célula MAlT que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) es para su uso en el tratamiento de un cáncer.
El cáncer puede ser una neoplasia maligna hematológica. En otra realización particular, el cáncer puede ser un tumor sólido, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro y cáncer de pulmón.
En un aspecto, la célula CAR-MAIT va a administrarse a un sujeto inmunodeprimido. En particular, la célula CAR-MAlT va a administrarse después de un tratamiento de acondicionamiento que hace que el sujeto esté inmunodeprimido. El tratamiento de acondicionamiento puede consistir en quimioterapia, radioterapia y/o anticuerpos que disminuyen el número de linfocitos.
En una realización particular, la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica. En esta realización, la célula CAR-MAIT se administra preferiblemente antes de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC) o justo después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC).
En una realización particular, el cáncer es una neoplasia maligna hematológica, tal como leucemia, linfoma o mieloma múltiple, en un estadio de enfermedad residual mínima (MRD).
Preferiblemente, la célula MAlT expresa un CAR que se une específicamente a un antígeno asociado a tumor (TAA).
El TAA puede expresarse en la superficie de las células tumorales. Preferiblemente, el TAA es CD19, GD2, EGFR, CD20, CD22, CD33, CD138, CD52, CD30, ROR1, HER2, EpCAM, MUC-1, MUC5AC, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, CD123, IL-13Ra2, HER2, LeY, MUC16 o PSMA. Más preferiblemente, el TAA es CD19, CD20, CD22, CD33, CD138, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, IL-13Ra2 o HER2.
En otra realización, la célula MAlT expresa un CAR que selecciona como diana específicamente una oncoproteína intracelular o antígeno asociado a tumor intracelular, en particular WT-1, NY-ESO-1, MAGE, PRAME, RAS, mesotelina, c-Met, CEA, CSPG-4, EBNA3C, CA-125 o GPA7.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: las células MAIT no proliferan in vitro en respuesta a células mononucleares de sangre periférica alogénicas (PBMC).
Se cultivaron PBMC respondedoras marcadas con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) con PBMC alogénicas irradiadas (razón 1:1). Las células T respondedoras se identificaron al final del cultivo de 6 días adquiriendo selectivamente células vivas y luego células T CD3+. Se cuantificó la proliferación de células T CD3 convencionales (Tconv) y células MAIT Va 7.2+ CD161alto mediante dilución de CFSE (% de células con CFSEbajo).
A) Tinción de CFSE representativa adquiriendo selectivamente células Tconv (paneles de la izquierda) y MAlT (paneles de la derecha) después de un cultivo de 6 días en presencia de PBMC alogénicas (paneles superiores) o autólogas (paneles inferiores). Los números en los cuadrantes indican el porcentaje de células en proliferación (CFSEbajo) (barras horizontales) entre la población indicada.
B) Valores individuales y medias ± DE de células en proliferación (CFSEbajo) Tconv y MAIT (n= 6 experimentos usando diferentes pares de receptor/donante). Se indica el valor de p (prueba de la t para datos emparejados). Figura 2: las células MAIT no participan en la inducción de EICH en un modelo de ratón humanizado. Se les inyectaron 3 * 106 PBMC humanas a los ratones NOD-Scid-IL-2Rynul° inmunodeprimidos irradiados (1,3 Gy) (NSG) (n = 3), se monitorizaron para evaluar la progresión de la EICH y se sacrificaron cuando presentaban una pérdida de peso >15% (± día 45). El gráfico muestra la proporción de células T CD3 y células MAIT entre leucocitos humanos (CD45+) medida mediante citometría de flujo en el inóculo inicial (huPBMC) y 45 días después de la transferencia en sangre periférica (PB), bazo, médula ósea (MO), hígado, colon y pulmón de ratones enfermos.
Figura 3: expansión de células MAIT in vitro
Se cultivaron PBMC (106/ml) de donantes sanos durante 17 días en presencia de citocinas y ligando de células MAIT sintético. El porcentaje y números absolutos de células MAIT se cuantificaron mediante citometría de flujo antes (día 0) y en los días 6, 10 y 17 del periodo de cultivo.
A) Tinción representativa de células MAIT Va 7.2+ CD161alto (adquiriendo selectivamente células T CD3) durante el periodo de cultivo. Los números indican el porcentaje de células MAIT entre las células T CD3.
B) Expansión (número absoluto de cambio de veces) de células MAIT durante el periodo de cultivo.
Figura 4: detección de la expresión de CAR en células MAIT
Se activaron células T CD3 purificadas in vitro con perlas anti-CD3/CD28 durante 24 horas y se transdujeron con un vector lentiviral que codifica para un CAR y una proteína indicadora de fluorescencia (BFP) para permitir la monitorización de las células T CAR+. La expresión superficial de BFP entre células transducidas (panel superior) o células de control no transducidas (panel inferior) se determinó 6 días después en células T CD3 convencionales y células MAIT. Los números en los cuadrantes (barras horizontales) indican el porcentaje de células BFP+ entre la población indicada.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR), denominadas en el presente documento células CAR-MAIT, para su uso en el campo de la inmunoterapia adoptiva alogénica.
Las células CAR-MAIT no muestran ningún potencial alorreactivo; no proliferan in vitro en respuesta a células alogénicas y no participan en la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), al contrario que las células T convencionales. Según la invención, las células CAR-MAIT pueden producirse y expandirse fácilmente in vitro, en grandes volúmenes.
Las células CAR-MAIT pueden almacenarse, por ejemplo, en unidades congeladas, y están “listas para su uso”, para una administración rápida a varios receptores. Su preparación es rentable y representan un tratamiento universal, independientemente de la disparidad de HLA entre sujetos, y sin riesgo de inducir EICH.
Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto”, “huésped”, “individuo” o “paciente” se refiere a un mamífero, preferiblemente a un ser humano, hombre o mujer de cualquier edad que necesita una terapia.
Los términos “antígeno asociado a tumor”, “TAA”, “antígeno tumoral” y “antígeno de células cancerosas” se usan de manera intercambiable en el presente documento. En cada caso, los términos se refieren a péptidos, proteínas, glicoproteínas o hidratos de carbono que las células cancerosas expresan específica o preferiblemente.
El término “enfermedad de injerto contra huésped (EICH)” se refiere a una complicación común y grave en la que hay una reacción de los linfocitos inmunológicamente competentes donados contra los propios tejidos del receptor de un trasplante. La EICH es una posible complicación de cualquier trasplante que use o contenga células madre hematopoyéticas de un donante emparentado o no emparentado. “Tratar” o el tratamiento de una enfermedad o afección se refiere a cualquier acto destinado a mejorar el estado de salud de los pacientes. El “tratamiento” puede incluir, pero no se limita a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución del alcance de la enfermedad, estabilización del estado patológico (por ejemplo, mantener a un paciente en remisión), prevención de la enfermedad o prevención de la propagación de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico, disminución de la recurrencia de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total). Un tratamiento puede incluir efectos curativos, de alivio o profilácticos. Puede considerarse que el término “profiláctico” significa reducir la gravedad o la aparición de una afección particular. “Profiláctico” también incluye prevenir la recurrencia de una afección particular en un paciente al que se le ha diagnosticado previamente la afección. “Terapéutico” también puede reducir o retrasar la gravedad de una afección existente. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado patológico y la remisión o mejora del pronóstico. El alivio puede producirse antes de que aparezcan los signos o síntomas de la enfermedad o afección, así como después de su aparición. Por tanto, “tratar” o “tratamiento” puede incluir “prevenir” o “prevención” de una enfermedad o afección indeseable. En una realización, tratar un cáncer incluye inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas o destruir células cancerosas. En una realización particular, tratar un cáncer incluye reducir el riesgo o el desarrollo de metástasis. En otra realización particular, tratar un cáncer puede referirse a prevenir una recaída. Tratar un cáncer también puede referirse a mantener a un sujeto en remisión. Tal como se usa en el presente documento, los términos “trastorno” o “enfermedad” se refieren al órgano, parte, estructura o sistema del cuerpo que funciona incorrectamente como resultado del efecto de errores genéticos o de desarrollo, infección, venenos, deficiencia o desequilibrio nutricional, toxicidad o factores ambientales desfavorables. Preferiblemente, estos términos se refieren a un trastorno de salud o enfermedad, por ejemplo, una enfermedad que interrumpe las funciones físicas o mentales normales. Más preferiblemente, el término trastorno se refiere a enfermedades inmunitarias y/o inflamatorias que afectan a animales y/o seres humanos. Preferiblemente, el término trastorno o enfermedad se refiere a cánceres, enfermedades infecciosas o enfermedades inmunitarias.
El término “cáncer”, tal como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo.
El término “enfermedades infecciosas” se refiere a trastornos provocados por organismos, tales como bacterias, virus, hongos o parásitos.
El término “enfermedad inmunitaria” o “enfermedad autoinmunitaria”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una afección en un sujeto caracterizada por una lesión celular, tisular y/u orgánica provocada por una reacción inmunológica del sujeto a sus propias células, tejidos y /u órganos.
La célula CAR-MAIT
La “célula CAR-MAIT” de la invención designa una célula T invariante asociada a la mucosa (MAIT) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) son un subconjunto de las células T no convencionales. En los seres humanos, las células MAIT se encuentran en la sangre, el hígado y las mucosas, protegiendo contra la actividad microbiana y la infección. Las células MAIT se caracterizan por una cadena alfa de receptor de células T semiinvariante (TCRa ) (Va 7.2-Ja 33/20/12 en seres humanos), que puede combinarse con un número limitado de posibles cadenas TCRp. Este TCR semiinvariante está restringido por la molécula monomórfica, altamente conservada, relacionada con el MHC de clase I 1 (MR1). A diferencia de las células T convencionales que reconocen complejos MHC-péptido clásicos, las células MAIT reconocen derivados precursores de riboflavina derivados de microbios, tales como 5-OP-RU o 5-OE-RU, presentados por MR1. Las células MAIT adultas se identifican fácilmente mediante citometría de flujo como CD3+ CD4' Va 7.2+ CD161alto (o IL-18aalto o CD26alto) usando la tinción correspondiente. Tras el reconocimiento de los ligandos de MR1, las células MAIT liberan citocinas inflamatorias (IFNy, TNFa , IL-17) y median en la citotoxicidad dependiente de perforina de las células diana. Las células MAIT se localizan preferiblemente en hígado y mucosas, incluyendo pulmón e intestino, y también son abundantes en sangre periférica adulta (1-10% de células T) mientras que son muy escasas en sangre de cordón umbilical (< 0,1% de células T).
La presente invención se refiere al uso de células MAIT que son alogénicas, es decir, las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto del sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular. Tal como se usa en el presente documento, el término “alogénico” se refiere a células o tejidos obtenidos de diferentes individuos de la misma especie, donde el donante y el receptor no son genéticamente idénticos. En algunas realizaciones, el segundo sujeto expresa el mismo genotipo HLA que el primer sujeto. Se ha demostrado que las CAR-MAIT no median en el daño tisular del huésped relacionado con la EICH. Por tanto, como potentes células efectoras, las CAR-MAIT son útiles como herramientas universales para la inmunoterapia adoptiva en un entorno alogénico.
En el contexto de la presente invención, la célula MAIT se modifica genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR).
“Receptores de antígenos quiméricos (CAR)”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a receptores de células T artificiales, receptores de células T quiméricos o inmunorreceptores quiméricos, y abarcan receptores modificados por ingeniería que injertan una especificidad artificial en una célula efectora inmunitaria particular, es decir, la célula MAlT.
Un CAR normalmente comprende un ectodominio (dominio extracelular) y un endodominio (dominio citoplasmático), unidos por un dominio transmembranario. El ectodominio, expresado en la superficie de la célula, comprende un dominio de unión al antígeno o dominio receptor y, opcionalmente, una región espaciadora (o bisagra) que une el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembranario. El dominio transmembranario es normalmente una hélice alfa hidrófoba que se extiende a lo largo de la bicapa lipídica de la membrana celular. El endodominio del CAR se compone de un módulo de señalización intracelular que induce la activación de las células MAIT tras la unión al antígeno. El endodominio puede incluir varios dominios de señalización, tal como se explica a continuación.
Dominio de unión a antígeno
El dominio extracelular del CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une o reconoce específicamente un antígeno diana.
Tal como se usa en el presente documento, “unir” o “unión” se refiere a péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión y anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) que reconocen y contactan con un antígeno. Preferiblemente, se refiere a una interacción de tipo antígeno-anticuerpo. Por “unión específica” quiere decirse que el dominio de unión a antígeno del CAR reconoce un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra dada. La “unión específica” depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo). Tal como se usa en el presente documento, el término “unión específica” significa el contacto entre un dominio de unión a antígeno del CAR y un antígeno con una afinidad de unión de al menos 10-6 M. En determinados aspectos, el dominio de unión a antígeno del CAR se une con afinidades de al menos aproximadamente 10-7 M, y preferiblemente 10-8 M, 10­ 9 M, 10-10 M. La afinidad de unión puede medirse mediante cualquier método disponible para el experto en la técnica, en particular por resonancia de plasmón superficial (SPR).
En una realización, tal dominio de unión a antígeno es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo de cadena sencilla. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En particular, tal dominio de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo seleccionado de fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), fragmentos de anticuerpos de un solo dominio (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo), diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En realizaciones particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, tal como scFv. Particularmente, tal dominio de unión a antígeno se selecciona de un Fab y un scFv.
En realizaciones en las que el dominio de direccionamiento a antígeno es un scFv, el scFv puede derivarse de las regiones de cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable (VL) de un AcM específico de antígeno unidas por un ligador flexible. El scFv conserva la misma especificidad y una afinidad similar que el anticuerpo completo del que se deriva. El ligador peptídico que conecta los dominios VH y VL de scFv une el extremo carboxilo de un dominio de región variable al extremo amino del otro dominio variable sin comprometer la fidelidad de los sitios de unión a antígeno y de unión VH-VL. Los ligadores peptídicos pueden variar de desde 10 hasta 30 aminoácidos de longitud. En una realización, el ligador peptídico de scFv es un ligador Gly/Ser y comprende una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 1) o Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2).
El dominio extracelular del CAR puede comprender uno o más dominios de unión a antígeno.
En una realización particular, el CAR se une específicamente a un antígeno asociado a tumor (TAA). En particular, el CAR se une específicamente a cualquier TAA expresado en la superficie de las células tumorales, preferiblemente CD19, GD2, EGFR, CD20, CD22, CD33, CD138, CD52, CD30, ROR1, HER2, EpCAM, MUC-1, MUC5AC, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, CD123, IL-13Ra2, HER2, LeY, MUC16, PSMA, más preferiblemente el TAA es CD19, CD20, CD22, CD33, CD138, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, IL-13Ra2 o HER2.
En una realización particular, el CAR se une específicamente a CD19.
En otra realización particular, el CAR selecciona como diana una oncoproteína intracelular o un antígeno asociado a tumor intracelular, en particular WT-1, NY-ESO-1, MAGE, PrAm E, RAS, mesotelina, c-Met, CEA, CSPG-4, EBNA3C, CA-125, GPA7. En particular, dicha oncoproteína intracelular o antígeno asociado a tumor intracelular se procesan y se expresan en la superficie celular como péptidos unidos a moléculas de histocompatibilidad (HLA).
En otra realización particular, la célula CAR-MAIT es para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa. En esta realización, el CAR puede seleccionar como diana un componente de un patógeno expresado en la superficie de las células infectadas, preferiblemente el CAR selecciona como diana una proteína viral expresada en la superficie celular, más preferiblemente el CAR selecciona como diana la proteína de la envuelta del VIH.
En otra realización particular, la célula CAR-MAIT es para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria. En esta realización, el CAR selecciona como diana preferiblemente los anticuerpos autorreactivos expresados en la superficie de las células B autoinmunitarias, por ejemplo, el CAR selecciona como diana los anticuerpos autorreactivos dirigidos a la desmogleína 3 en el pénfigo vulgar.
Dominio espaciador o bisagra
El CAR comprende opcionalmente un dominio espaciador o bisagra que une el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembranario.
En algunas realizaciones, CAR comprende una secuencia de región bisagra entre el dominio de unión al antígeno y el dominio transmembranario y/o entre el dominio transmembranario y el dominio citoplásmico. Un experto habitual en la técnica apreciará que una secuencia de región bisagra es una secuencia corta de aminoácidos que facilita la flexibilidad.
En particular, el dominio espaciador o bisagra que une el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembranario está diseñado para ser suficientemente flexible para permitir que el dominio de unión al antígeno se oriente de una manera que permita el reconocimiento del antígeno.
La región bisagra puede derivarse de o incluir al menos una porción de una región Fc de inmunoglobulina, por ejemplo, una región Fc de IgG1, una región Fc de IgG2, una región Fc de IgG3, una región Fc de IgG4, una región Fc de IgE, una región Fc de IgM, o una región Fc de IgA. En determinadas realizaciones, el dominio bisagra incluye al menos una parte de una región Fc de inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM o IgA que se encuentra dentro de sus dominios CH2 y CH3.
Las regiones bisagra a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una región bisagra CD8a, una región bisagra CD28, secuencias IgG1/IgG4 (región bisagra-porción Fc), región bisagra de IgG4 sola, región bisagra de IgG4 unida a los dominios CH2 y CH3 o región bisagra de IgG4 unida al dominio CH3, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, número de publicación de solicitud de patente internacional WO201403l687, patente estadounidense n.° 8.822.647 o solicitud publicada n.° US2014/0271635. Como dominio bisagra, la invención se refiere a la totalidad o una parte de los residuos 118 a 178 de CD8a (n.° de registro de GenBank NP_001759.3), pueden usarse los residuos 135 a 195 de CD8 (n.° de registro de GenBank AAA35664), residuos 315 a 396 de CD4 (n.° de registro de GenBank NP_000607.1) o los residuos 137 a 152 de CD28 (n.° de registro de GenBank NP_006130.1). Además, como dominio espaciador, puede usarse una parte de una región constante de una cadena H o una cadena L del anticuerpo (región CHI o región CL). Además, el dominio espaciador puede ser una secuencia sintetizada artificialmente.
En algunas realizaciones, por ejemplo, la secuencia de región bisagra se deriva de una molécula alfa CD8 o una molécula CD28.
Dominio transmembranario
El dominio transmembranario del CAR funciona para anclar el receptor en la superficie celular. La elección del dominio transmembranario puede depender de las secuencias espaciadoras e intracelulares vecinas.
En algunas realizaciones, el dominio transmembranario se deriva de una fuente o bien natural o bien sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína unida a la membrana o transmembranaria. Las regiones transmembranarias incluyen aquellas derivadas de (es decir, comprenden al menos la(s) región/regiones transmembranaria(s) de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, moléculas CD28, CD3 zeta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD3 delta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D y DAP. Alternativamente, en algunas realizaciones el dominio transmembranario es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembranario sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembranario sintético. Un dominio transmembranario es termodinámicamente estable en una membrana. Puede ser una sola hélice alfa, un cuerpo beta transmembranario, una hélice beta de gramicidina A o cualquier otra estructura.
Opcionalmente, un ligador oligo o polipeptídico corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar la unión entre el dominio transmembranario y el/los dominio(s) de señalización intracelular del CAR. Un doblete de glicina-serina puede proporcionar un ligador adecuado.
Dominio intracelular
Los términos “dominio intracelular”, “dominio citoplásmico” y “dominio de señalización intracelular” se usan de manera intercambiable en el presente documento. El papel del dominio intracelular del CAR es producir una señal de activación para la célula MAIT tan pronto como el dominio extracelular haya reconocido el antígeno. En particular, el dominio intracelular de CAR desencadena o provoca la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula MAIT.
Los ejemplos de secuencias de dominios intracelulares que son de uso particular en la invención incluyen aquellas derivadas de un dominio de señalización intracelular de una cadena receptora de linfocitos, una proteína del complejo TCR/CD3, una subunidad del receptor Fc, una subunidad del receptor IL-2, CD3^, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, CD278(ICOS), FcsRI, DAP10 y DAP12. Se prefiere particularmente que el dominio intracelular en CAR comprenda una secuencia de señalización citoplasmática derivada de CD3^.
El dominio intracelular del CAR puede diseñarse para comprender un dominio de señalización (tal como el dominio de señalización CD3Q por sí solo o en combinación con dominio(s) coestimulador(es). Una molécula coestimuladora puede definirse como una molécula de superficie celular que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, CD244 (2B4), ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LiGhT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, bTn L3 y NKg2d . La porción de señalización intracelular de los dominios coestimuladores citados anteriormente puede usarse sola o en combinación con otros dominios coestimuladores.
En particular, el CAR puede comprender cualquier combinación de dos o más dominios coestimuladores del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, CD244 (2B4), ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3 y NKG2D.
Así, por ejemplo, el CAR puede diseñarse para comprender un dominio de señalización tal como el dominio de señalización CD3^ y dos dominios de señalización coestimuladores seleccionados de CD28 y CD40, CD28 y 4-1BB (CD137), CD28 y OX40 (CD134), y CD28 y LFA-1.
Los “CAR de primera generación” contienen un solo dominio de señalización. Los CAR que contienen un dominio de señalización junto con un dominio coestimulador adicional se denominan “segunda generación”, mientras que los que contienen un dominio de señalización junto con dos dominios coestimuladores adicionales se enumeran como “tercera generación”. Por ejemplo, los CAR de primera generación contienen únicamente la cadena CD3^ como único dominio de señalización. Los CAR de segunda y tercera generaciones consisten en uno o dos dominios de señalización coestimuladores adicionales, respectivamente, tales como CD28, CD27, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137). Por ejemplo, CAR de segunda generación puede contener dominios de señalización CD3^ y CD28, mientras que CAR de tercera generación puede contener CD3^, CD28 y OX40 (CD134) o 4-1BB (CD137).
El CAR de la invención puede ser un CAR de primera, segunda o tercera generación, tal como se describió anteriormente. Preferiblemente, el CAR es un CAR de segunda o tercera generación.
Los “TRUCK” representan los CAR de “cuarta generación” desarrollados recientemente. Los TRUCK (células T redirigidas para la destrucción universal por citocinas) son células T redirigidas por CAR usadas como vehículos para producir y liberar un producto transgénico que se acumula en el tejido seleccionado como diana. El producto, por ejemplo, una citocina proinflamatoria, puede producirse o inducirse constitutivamente una vez que el CAR activa la célula T. Otras sustancias, tales como enzimas o moléculas inmunomoduladoras, pueden producirse de la misma manera y depositarse por las células T redirigidas por CAR en la lesión seleccionada como diana. Esta estrategia implica dos transgenes separados que expresan, por ejemplo, (i) el CAR y (ii) un promotor sensible a la activación celular unido a una citocina tal como IL-12. Por consiguiente, la citocina inmunoestimuladora, tal como la IL-12, se secreta tras la interacción con CAR.
En una realización particular, el CAR es un CAR de cuarta generación tal como se definió anteriormente.
En una realización particular, una sola célula MAIT puede expresar múltiples CAR, tales como los CAR que se unen a diferentes antígenos.
Producción de células CAR-MAIT
Adquisición de células MAIT
La producción de células CAR-MAIT comprende una etapa de proporcionar células MAIT de un cultivo celular o de una muestra de sangre de un sujeto individual o de un banco de sangre. Las células MAIT proceden preferiblemente de un sujeto donante, en particular de un sujeto donante sano.
Las células pueden adquirirse a partir de muestras de sangre (incluyendo sangre periférica y sangre de cordón umbilical), así como de muestras resultantes de una o más etapas de procesamiento, tales como separación, centrifugación, ingeniería genética, lavado y/o incubación. En una realización particular, la muestra del donante comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En una realización particular, las células MAIT se recogen de cualquier lugar en el que residan en el sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre periférica, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, sangre del cordón umbilical.
En una realización particular, las células MAIT se recogen mediante aféresis, en particular por leucoféresis. Aislamiento de células MAIT
Tal como conocen los expertos en la técnica, diversos métodos están fácilmente disponibles para aislar células inmunitarias de un sujeto o pueden adaptarse a la presente solicitud, por ejemplo, usando el sistema Dynabeads® de Life Technologies; kits de separación celular EasySep™, RoboSep™, Rosettesep™, SepMate™ de STEMcell Technologies; MACS™ de Miltenyi Biotec, kits de expresión de marcador de superficie celular y otros kits de aislamiento y separación celular disponibles comercialmente (por ejemplo, ISOCELL de Pierce, Rockford, IL). Las células MAIT pueden aislarse mediante el uso de perlas u otros agentes de unión disponibles en tales kits específicos para marcadores de superficie de células MAIT.
En algunas realizaciones, el aislamiento es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células MAIT basándose en la expresión o el nivel de expresión de uno o más marcadores en las células, normalmente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo o pareja de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por etapas de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o pareja de unión de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o pareja de unión. Tales etapas de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células MAIT que se han unido a los reactivos se conservan para su uso posterior, y/o la selección negativa, en la que se conservan las células MAIT que no se han unido al anticuerpo o a la pareja de unión. En algunas realizaciones, se llevan a cabo múltiples rondas de etapas de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de una etapa se somete a otra etapa de separación, tal como una selección positiva o negativa posterior.
En algunas realizaciones, la población de células MAIT se recoge y se enriquece mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica, tal como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluyendo la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten las selecciones positiva y negativa basadas en múltiples marcadores simultáneamente.
En algunas realizaciones, el aislamiento de células MAIT se basa en la expresión superficial alta o positiva de CD3, CD8, Va 7.2, CD161, CD26 y/o IL-18Ra (CD218a) y/o en la expresión negativa de CD4 y/u opcionalmente en la presencia de receptores NKG2D o NKp30.
En una realización particular, las células MAIT se aíslan positivamente usando perlas recubiertas con un anticuerpo, en particular un anticuerpo anti-Va 7.2 y un anticuerpo anti-IL18Ra o anti-CD161 o anti-CD26.
Las células MAIT aisladas pueden usarse directamente o pueden almacenarse durante un periodo de tiempo tal como mediante congelación.
Activación y expansión de células MAIT
Ya sea antes o después de la modificación genética de las células MAIT para expresar un CAR deseable, las células pueden activarse y/o expandirse. En algunas realizaciones, las células MAIt se incuban en condiciones estimulantes o en presencia de un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células MAIT, para imitar la exposición al antígeno y/o preparar las células para la ingeniería genética, tal como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante. Las condiciones pueden incluir uno o más medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimulantes, tales como citocinas, quimiocinas, antígenos, parejas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células MAlT.
Por ejemplo, las células MAIT pueden incubarse con un anticuerpo anti-CD3 y/o un anticuerpo anti-CD28 en condiciones que estimulen la proliferación de las células.
En algunas realizaciones, las células MAIT de la invención pueden expandirse in vitro cocultivando con tejido o células. En algunas realizaciones, las células MAIT se expanden cocultivando con células alimentadoras, tales como PBMC no en división. En algunos aspectos, las células alimentadoras no en división pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas, en particular PBMC irradiadas autólogas o alogénicas.
En una realización particular, las células MAIT se expanden in vitro mediante estimulación con CD3/CD28 en presencia de PBMC irradiadas autólogas o alogénicas y citocinas IL-2, IL-7, IL-12, IL-18 y/o IL-15.
En una realización particular, las células MAIT se expanden y/o activan in vitro en presencia de ligandos activadores de células MAIT tales como 5-OP-RU y/o 5-Oe-RU.
En otra realización particular, el método comprende una etapa de expansión de células MAIT preferente in vitro a partir de una muestra de células de un donante, en particular de PBMC de un donante. La expansión de células MAIT preferente in vitro puede llevarse a cabo mediante el cultivo de PBMC de un donante en presencia de 5-OP-RU sintética y, opcionalmente, con citocinas. En particular, las PBMC de un donante se cultivan en presencia de 5-OP-RU e IL-2 (tal como rhulL-2).
En una realización particular, las células MAIT se expanden preferiblemente ex vivo durante al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente no menos de aproximadamente 10 días, más preferiblemente no menos de aproximadamente 15 días y lo más preferiblemente no menos de aproximadamente 20 días antes de la administración al paciente.
En otra realización, las células MAIT se han expandido al menos aproximadamente 100 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 200 veces, y más preferiblemente al menos aproximadamente 400 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 600 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 1000 veces e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 1500 veces en comparación con el día 0 de expansión, antes de la administración a un paciente.
En algunas realizaciones, el método de preparación incluye etapas para congelar, por ejemplo, crioconservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, la incubación y/o la ingeniería.
Transducción y selección de células
En determinadas realizaciones, las células MAIT se transducen para expresar uno o más CAR.
Se contempla que un constructo de ácido nucleico que codifica para CAR pueda introducirse en las células MAIT como ADN desnudo o en un vector adecuado.
El ADN desnudo generalmente se refiere al ADN que codifica para un receptor quimérico contenido en un vector de expresión de plásmido en la orientación adecuada para la expresión. Los métodos físicos para introducir un constructo de ácido nucleico en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Pueden usarse otros medios que incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. En una realización particular, el constructo de ácido nucleico que codifica para CAR se introduce en la célula MAIT mediante un vector viral tal como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus y lentivirus. En particular, el vector es un vector lentiviral.
Para confirmar la presencia de la secuencia de CAR en la célula MAlT, puede realizarse una variedad de ensayos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de “biología molecular” bien conocidos tales como transferencia de tipo Southern y de tipo Northern, rT-PCR y PCR cuantitativa; ensayos “bioquímicos”, tales como detectar la presencia o ausencia de un péptido particular; ensayos “inmunológicos”, tales como detectar la expresión de CAR en la superficie celular mediante citometría de flujo.
Composición farmacéutica
Se describe además una composición farmacéutica o veterinaria que comprende la célula CAR-MAIT tal como se describió anteriormente.
La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Un “portador aceptable”, tal como se hace referencia en el presente documento, es cualquier compuesto o combinación de compuestos conocido que los expertos en la técnica saben que son útiles en la formulación de composiciones farmacéuticas o veterinarias. En una realización específica, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea estadounidense o europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y seres humanos.
El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la célula CAR-MAIT. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH.
En un aspecto adicional, la composición farmacéutica o veterinaria puede comprender una o más poblaciones de células MAIT, en la que cada población expresa un CAR diferente.
La composición farmacéutica o veterinaria puede formularse para cualquier vía de administración convencional, incluyendo la administración parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea y similares.
Cuando se administra por vía parenteral, la composición farmacéutica o veterinaria se administra preferiblemente por la vía de administración intravenosa.
Deseablemente, se emplea una forma farmacéuticamente aceptable que no afecta negativamente a los efectos potenciadores inmunitarios deseados de las células CAR-MAIT.
La composición farmacéutica o veterinaria contiene las células CAR-MAIT en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, tal como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. La cantidad deseada puede administrarse mediante una sola administración de la composición, mediante múltiples administraciones de la composición o mediante la administración continua de la composición. La cantidad de células CAR-MAIT que van a administrarse puede determinarse mediante un procedimiento convencional bien conocido por los expertos habituales en la técnica. Deben tenerse en cuenta los datos fisiológicos del paciente (por ejemplo, edad, estatura, peso y estado de salud y peso del receptor, tipo de tratamiento simultáneo, si lo hay, frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado) y las vías de administración para determinar la dosificación apropiada, de modo que se administre al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz.
Usos
La invención se refiere a una célula CAR-MAIT para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en la que la célula MAIT es alogénica con respecto al sujeto.
En una realización preferida, las células CAR-MAIT de la invención se usan como un producto terapéutico, idealmente como un producto “disponible para la venta”.
En un aspecto, la enfermedad o trastorno que va a tratarse es una afección seleccionada de una enfermedad o trastorno proliferativo, preferiblemente cáncer; una enfermedad o trastorno infeccioso, preferiblemente una infección viral, bacteriana o fúngica; una enfermedad o trastorno inflamatorio; y una enfermedad o trastorno inmunitario, preferiblemente enfermedades de autoinmunidad o autoinmunitarias.
En una realización particular, la célula CAR-MAIT y/o la composición farmacéutica son adecuadas para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VIH, infecciones por el virus de la hepatitis A, B o C, infección por el virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV y EBV) y la infección por el virus de la gripe. Los ejemplos no virales pueden incluir enfermedades fúngicas crónicas tales como aspergilosis, candidiasis, coccidioidomicosis y enfermedades asociadas con Cryptococcus e histoplasmosis. Ejemplos no limitativos de agentes infecciosos bacterianos crónicos pueden ser Chlamydia pneumoniae, Listeria monocytogenes y Mycobacterium tuberculosis. Las enfermedades infecciosas también incluyen enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia, gonorrea), difteria o cólera.
En una realización particular, la célula CAR-MAIT y/o la composición farmacéutica son adecuadas para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios. Los trastornos autoinmunitarios pueden afectar a casi todos los sistemas de órganos del sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades de los sistemas nervioso, gastrointestinal y endocrino, así como la piel y otros tejidos conjuntivos, ojos, sangre y vasos sanguíneos. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, pénfigo vulgar, tiroiditis de Hashimoto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, esclerodermia, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia grave y diabetes.
En una realización particular, la célula CAR-MAIT y/o la composición farmacéutica son para su uso en el tratamiento de un cáncer. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a métodos para inhibir el crecimiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita y/o prevenir la formación de cáncer y/o la propagación del cáncer en un paciente que lo necesita.
En una realización particular, la célula CAR-MAIT es para su uso en el tratamiento de la recidiva del cáncer. En particular, el cáncer es un tumor sólido o un cáncer hematopoyético.
En particular, el cáncer es un tumor sólido, tal como sarcomas y carcinomas, incluyendo fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, tumor maligno linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (tal como un glioma (tal como el glioma del tronco encefálico y los gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, craneofaringioma, schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).
Los cánceres hematopoyéticos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfoide aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide aguda y leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucémica), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mieloide crónica y leucemia linfoide crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
En una realización particular, la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica, más preferiblemente leucemia, linfoma o mieloma.
En una realización particular, la célula MAIT va a administrarse a un sujeto inmunodeprimido. En huéspedes inmunocompetentes, el sistema inmunitario del huésped puede rechazar las células alogénicas. Por tanto, para evitar el rechazo de las células CAR MAIT alogénicas, el sistema inmunitario del huésped se suprime o se deprime preferiblemente de manera eficaz.
En particular, la célula CAR-MAIT se administra después de un tratamiento de acondicionamiento que hace que el sujeto esté inmunodeprimido.
En particular, el tratamiento de acondicionamiento es un tratamiento mieloablativo o no mieloablativo, o una quimioterapia que disminuye el número de linfocitos.
En particular, el tratamiento de acondicionamiento consiste en quimioterapia y/o radioterapia y/o anticuerpos que disminuyen el número de linfocitos.
Durante el tratamiento de acondicionamiento, pueden usarse agentes inmunodepresores, tales como azatioprina, metotrexato, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida, fludaribina, pentostatina, romidepsina (FR901228), anticuerpo anti-CD52 (CAMPATH, alemtuzumab), anti-CD3, anti-CD20 (rituximab) u otras terapias con anticuerpos, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides.
En una realización particular, la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica y la célula MAlT va a administrarse antes de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC) o justo después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC).
En particular, la célula CAR-MAIT es para su uso en el tratamiento de una neoplasia maligna hematológica, en un estadio de enfermedad residual mínima (MRD).
La enfermedad residual mínima (MRD) se refiere a células cancerosas, en particular células cancerosas leucémicas, que quedan en el cuerpo después del tratamiento y que constituyen la principal causa de recidiva. En particular, el término enfermedad residual mínima (MRD) se usa para describir la enfermedad de bajo nivel que no es detectable por citomorfología convencional (véase, por ejemplo, Brüggemann y Kotrova; Blood Advances 20171:2456-2466).
En particular, las células CAR-MAIT se usan para eliminar las células tumorales propagadas o leucémicas residuales durante una ventana terapéutica. Las células CAR-MAIT pueden usarse como puente para el trasplante en pacientes con neoplasias malignas hematológicas, o como tratamiento de la enfermedad residual mínima (MRD) o recidiva (o terapia complementaria para pacientes de alto riesgo) después del trasplante de células madre hematopoyéticas.
La administración de las células CAR-MAIT puede realizarse de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inyección, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente mediante inyección intravenosa o por vía intratumoral, intranodal o intraperitoneal. En una realización, las composiciones celulares se administran preferiblemente mediante inyección intravenosa.
Ejemplos
Material y métodos
Citometría de flujo
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Eurobio) y se usaron inmediatamente o se congelaron. Se realizaron análisis multiparamétricos de citometría de flujo de 10 colores usando combinaciones de los siguientes anticuerpos durante 15 min a 4°C: anticuerpos anti-CD45 Krome Orange, anti-CD3 ECD, anti-CD8p PE o ECD, anti-TCR Va 24 PE Cy7 (todos de Beckman Coulter); anti-TCR Va .7.2 FITC o APC (clon 3C10), anti-CD161 PerCP Cy5.5 o BV421, anti-CD4 AF700 (Biolegend); anti-CD161 APC, anti-CD3 APC Vio770 (Miltenyi Biotec); anti-CD4 APC AF750 (Invitrogen); anti-CD3 PerCP (BD Biosciences); Zombie aqua vivo/muerto (BioLegend). Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo Navios (Beckman Coulter) recogiendo un total de al menos 100.000 eventos en una ventana de adquisición selectiva de eventos de interés (live gate). Las ventanas se definieron mediante tinciones de isotipo y fluorescencia menos uno (FMO). La estrategia de adquisición selectiva fue CD45 frente a dispersión lateral y las células MAlT se definieron como células T CD3+ CD4- CD161alto Va 7.2+. Los recuentos celulares absolutos se calcularon en la misma muestra usando perlas de recuento CountBright Absolute (Invitrogen). Los datos se analizaron usando el software FlowJo.
Reacción mixta de linfocitos
Las PBMC respondedoras se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) 1 |iM; se cultivaron 2*105 células respondedoras marcadas con CFSE con o sin 2 * 105 PBMC alogénicas o autólogas (control negativo) irradiadas en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 6 días. Las células T respondedoras se identificaron al final del periodo de cultivo adquiriendo selectivamente células CD3+ vivas. La proliferación de células T convencionales (Tconv) y MAIT se cuantificó mediante dilución de CFSE (% de células CFSEbajo). Transferencia adoptiva de células xenogénicas
Se alojaron ratones NSG (Jackson Laboratory, Bar Harbor, MI) en las instalaciones para animales libres de patógenos del Institut de Recherche Saint-Louis (París). Se irradiaron (1,3 Gy) NSG hembra de ocho a 10 semanas de edad 24 horas antes de la inyección de 3*106 PBMC humanas en la vena caudal. Se evaluó la supervivencia de los ratones diariamente y se pesaron semanalmente. El desarrollo de la EICH aguda se monitorizó en función de la pérdida de peso, la postura (encorvamiento) y la movilidad reducida. Los ratones se sacrificaron cuando la pérdida de peso fue >15% (media ± 45 días). Se recogieron sangre periférica, bazo, médula ósea, hígado, pulmones e intestino. Los tejidos se sometieron a disociación mecánica y las suspensiones de células individuales se filtraron a través de un filtro celular (70 |im, BD Biosciences). La proporción de células T CD3 y células MAIT entre leucocitos humanos (CD45+) se determinó mediante citometría de flujo en el inóculo inicial y 45 días después de la transferencia.
Expansión de células MAIT in vitro
Se sembraron PBMC de voluntarios sanos (106/ml) en 96 pocillos de fondo redondo y se cultivaron en RPMI-suero humano al 10% en presencia de 5-OP-RU sintética 300 nM (producida en el Institut Curie mediante síntesis química de 5-A-RU (F. Shmidt, departamento de química) que luego se mezcló con metilglioxal en la misma molaridad) e IL-2 100 UI/ml. Después de 6 días, se contaron las células y se evaluó la viabilidad y el número de células MAIT mediante citometría de flujo tal como se describió anteriormente. Las células se propagaron con 5-OP-RU 100 nM e IL-2100 UI/ml cada 3-4 días durante un máximo de 17 días.
Transducción de células MAlT
Se purificaron inmunomagnéticamente células T CD3 a partir de PBMC (kit de aislamiento de células T CD3+ humanas, Miltenyi Biotec), se activaron con perlas anti-CD3/CD28 (razón 1:1, Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28, ThermoFisher Scientific) durante 24 horas y se transdujeron con un vector lentiviral que codifica para un CAR dirigido a un antígeno tumoral y una proteína indicadora de fluorescencia (proteína fluorescente azul, BFP) para permitir la monitorización de las células T CAR+. Las células se resuspendieron en medio X-VIVO™ 15 recién preparado (Lonza) complementado con suero humano al 5% e IL-2100 UI/ml. La eficacia de transducción se determinó 6 días después mediante citometría de flujo como porcentaje de células BFP+ entre células T CD3 convencionales y células MAIT.
Eficacia de células CAR-MAIT in vitro
Se incubaron 5*104 células tumorales que expresan luciferasa que expresan el antígeno seleccionado como diana por CAR con células CAR-T clasificadas por FACS, células CAR-MAIT o células MAIT transducidas de manera simulada a diversas razones E/T en una microplaca de 96 pocillos durante 24 horas. La viabilidad de las células diana se cuantificó midiendo la intensidad de la luminiscencia.
Resultados
1. Las células MAIT no proliferan in vitro en la reacción mixta de linfocitos (MLR).
Para investigar el potencial in vitro de las células MAIT para reconocer células alogénicas y contribuir a la respuesta aloinmunitaria, se usó un método MLR basado en citometría de flujo para cuantificar la proliferación de células MAIT en presencia de células alogénicas de terceros. Tal como se muestra en la figura 1 (A y B), las células MAIT mostraron ninguna proliferación o una proliferación mínima en respuesta a las células alogénicas, en contraste con las células T CD3 convencionales.
2. Las células MAIT no participan en la inducción de EICH en un modelo de ratón humanizado.
Para investigar el potencial in vivo de las células MAIT para contribuir a la EICH aguda, se usó la transferencia de PBMC humanas en ratones NOD-Scid-IL-2Rynulo (NSG) inmunodeprimidos irradiados (figura 2). En este modelo, el injerto, la expansión y la activación de linfocitos T humanos en un entorno xenogénico y linfopénico provocan síntomas de EICH xenogénica aguda (± día 45 después del trasplante), con infiltración de células humanas en diversos tejidos y, en última instancia, la muerte.
Se monitorizaron ratones NSG irradiados (1,3 Gy) a los que se les inyectaron 3,106 PBMC humanas para evaluar la progresión de la EICH (pérdida de peso, postura encorvada, pelaje despeinado, movilidad reducida) y se sacrificaron cuando la pérdida de peso fue > 15 % (media de 45 días después de la transferencia). Los análisis mediante citometría de flujo de leucocitos CD45+ humanos en sangre periférica, bazo, médula ósea, hígado, colon y pulmón de ratones enfermos no detectaron la presencia de MAlT, en contraste con la acumulación masiva de células T CD3 convencionales (figura 2).
En conjunto, estos resultados indican que las células MAIT tienen un potencial alorreactivo bajo y allanan el camino para usar las células MAIT como fuente de linfocitos para el desarrollo de células CAR-T alogénicas universales.
3. Expansión eficaz de células MAIT y transducción de CAR lentiviral
Un requisito previo para usar células MAIT como una nueva fuente de células CAR-T es que las células MAIT puedan expandirse in vitro en cantidad suficiente y puedan transducirse de manera eficaz mediante un vector lentiviral. Se establecieron condiciones experimentales para la expansión de células MAIT preferente in vitro a partir de PBMC de donantes sanos. La estimulación repetida con 5-OP-RU e IL-2 durante un periodo de 21 días dio como resultado un enriquecimiento preferente de las células MAIT (más del 80% de las células MAIT entre las células T CD3 en el día 21) y una expansión de 2400 veces de los números absolutos de células MAIT durante el periodo de cultivo (figuras 3A y B).
Independientemente del procedimiento de expansión de células MAIT, también se determinó que la transducción de CAR lentiviral de células MAIT era tan eficaz como la de las células T CD3 convencionales. Tal como se muestra en la figura 4, las células T CD3 estimuladas con anticuerpo anti-CD3/CD28 transducidas con lentivirus CAR-BFP contenían células MAIT GFP+ en una proporción similar a la de las células T CD3.
4. Las células CAR-MAIT destruyen células diana relevantes con la misma eficacia que las células CAR-T Para demostrar la eficacia in vitro de las células CAR-MAIT, se realizaron experimentos de destrucción contra células tumorales que expresan la diana de CAR relevante. Se incubaron 5*104 células diana que expresan luciferasa con células efectoras CAR-MAIT, CAR-T o MAIT no transducidas (NT) a diversas razones de efector/diana (E/T) durante 24 horas. La viabilidad de las células diana se cuantificó midiendo la intensidad de la luminiscencia (células diana vivas). Las células CAR-MAIT, pero no las células MAIT no transducidas (NT), destruyeron las dianas tumorales con la misma eficacia que las células CAR-T convencionales a una razón E:T baja.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Célula T invariante asociada a la mucosa (MAIT) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), para su uso en el tratamiento de un cáncer, una enfermedad inmunitaria o una enfermedad infecciosa en un sujeto, en la que la célula MAlT es alogénica con respecto al sujeto.
2. Célula MAIT para su uso según la reivindicación 1, en la que el cáncer es una neoplasia maligna hematológica.
3. Célula MAIT para su uso según la reivindicación 1, en la que el cáncer es un tumor sólido, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro y cáncer de pulmón.
4. Célula MAIT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la célula MAIT va a administrarse a un sujeto inmunodeprimido.
5. Célula MAIT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la célula MAIT va a administrarse después de un tratamiento de acondicionamiento que hace que el sujeto esté inmunodeprimido.
6. Célula MAIT para su uso según la reivindicación 5, en la que el tratamiento de acondicionamiento consiste en quimioterapia, radioterapia y/o administración de anticuerpos que disminuyen el número de linfocitos.
7. Célula MAlT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica, preferiblemente la célula MAIT se administra antes de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC) o justo después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC).
8. Célula MAIT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el CAR se une específicamente a un antígeno asociado a tumor (TAA).
9. Célula MAIT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el CAR se une específicamente a cualquier TAA expresado en la superficie de células tumorales, preferiblemente CD19, GD2, EGFR, CD20, CD22, CD33, CD138, CD52, CD30, ROR1, HER2, EpCAM, MUC-1, MUC5AC, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, CD123, IL-13Ra2, HER2, LeY, MUC16 o PSMA, y más preferiblemente el TAA es CD19, CD20, CD22, CD33, CD138, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, IL-13Ra2 o HER2.
10. Célula MAIT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que CAR selecciona como diana específicamente una oncoproteína intracelular, un fragmento de anticuerpo o un antígeno asociado a tumor intracelular, en particular WT-1, NY-ESO-1, MAGE, PRAME, RAS, mesotelina, c-Met, CEA, CSPG-4, EBNA3C, CA-125 o GPA7.
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