ES2942164T3

ES2942164T3 - Implante de malla biodegradable para reparación de tejidos blandos, en particular reparación de hernias

Info

Publication number: ES2942164T3
Application number: ES20707273T
Authority: ES
Inventors: Hans Ulrich Baer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2040-03-03
Also published as: US20220143274A1; WO2020178274A1; SG11202108165QA; EP3705143A1; EP3934707B1; JP2022523406A; EP3934707A1

Abstract

La presente invención se refiere a un implante de malla biodegradable para su uso en la reparación de tejidos blandos, en particular, hernias quirúrgicas, curación de heridas crónicas o reparación de fístulas, dentro del cuerpo de un paciente. El implante de malla comprende una malla transportadora polimérica biodegradable hidrófila porosa (10) y fibroblastos (16) sobre o dentro de la malla transportadora polimérica. La malla transportadora (10) comprende una estructura similar a una esponja con poros interconectados de diferentes tamaños, tiene un ángulo de contacto con el agua de menos de 75° y está hecha de al menos un primer polímero que comprende ácido poliláctico como componente principal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Implante de malla biodegradable para reparación de tejidos blandos, en particular reparación de hernias

La presente invención se refiere a un implante de malla biodegradable que comprende una malla de sostén polimérica sembrada con fibroblastos para uso en la reparación de tejidos blandos en general y en particular para la reparación quirúrgica de hernias como se reivindica en la reivindicación 1. La presente invención se refiere además a un procedimiento para preparar el implante de malla y a un kit que comprende el implante de malla y una malla de soporte polimérica adicional.

La cicatrización de heridas es un proceso complejo que implica la coordinación de una serie de acontecimientos celulares y cascadas de citocinas interrelacionados. Las principales fases de la cicatrización de heridas incluyen la formación de coágulos de fibrina, seguido por la infiltración de células inflamatorias y fibroblastos, la generación de tejido de granulación y angiogénesis, y la reepitelización. Un papel importante lo desempeñan los factores de crecimiento y las citocinas que primero suministran las plaquetas degranulantes y después los fibroblastos y las células inflamatorias, en particular los neutrófilos y los macrófagos. Debido a su naturaleza compleja, el proceso de cicatrización de las heridas también es frágil y susceptible de interrupción o fracaso, lo que conduce a la formación de heridas crónicas cuya cicatrización resulta gravemente afectada. Por lo tanto, en función del tamaño y el tipo de defecto de los tejidos blandos, puede ser necesaria una reparación quirúrgica para facilitar el proceso de cicatrización de la herida y reducir el riesgo de complicaciones.

En el campo de la reparación quirúrgica de tejidos blandos, a menudo se utiliza un implante de malla consistente en un material reabsorbible o no reabsorbible que se inserta para revestir el área del defecto tisular. El implante de malla se utiliza como cierre mecánico del defecto y para proporcionar una estructura de soporte para el tejido en regeneración, es decir, para las células en crecimiento que forman un fuerte tejido fibroso cicatricial alrededor del implante de malla.

Aparte de las heridas crónicas, los implantes de malla se utilizan a menudo en la reparación quirúrgica de defectos hemiarios, en particular en la pared abdominal, que pueden ser consecuencia de un traumatismo, la resección de un tumor o un prolapso. En términos generales, una hernia puede describirse como el paso de órganos o partes de órganos fuera de la cavidad natural del cuerpo a través de un hueco preformado o adquirido. Los tipos de hernia más frecuentes son la hernia inguinal o hernia femoral, la hernia hiatal, la hernia umbilical y la hernia incisional, siendo esta última una hernia que empuja a través de una incisión u operación quirúrgica anterior. En la reparación quirúrgica de hernias, el implante de malla se inserta para revestir el área del defecto en la pared abdominal y lograr un cierre libre de tensión, con o sin coser los músculos y la fascia circundantes. Puede realizarse con anestesia local o general mediante una técnica de incisión abierta, o con un laparoscopio en un procedimiento mínimamente invasivo.

Las razones por las que se producen las hernias aún no son completamente conocidas. Una teoría sugerida en el campo es que algunos pacientes, debido a trastornos metabólicos del colágeno, tienen una predisposición genética a desarrollar hernias recurrentes, especialmente en pacientes de edad avanzada. Se cree que una relación alterada de los tipos I y III de colágeno en estos pacientes, con un aumento del colágeno de tipo III, reduce la resistencia mecánica de los tejidos conjuntivos. Aparentemente, la disminución de la resistencia a la tracción del colágeno de tipo III desempeña un papel clave en el desarrollo de hernias incisionales, véase KLINGE, U. et al. Abnormal collagen I to III distribution in the skin of patients with incisional hernia. Eur Surg Res. 2000, vol.32, no.1, p.43-48. También se cree que un trastorno en la producción de colágeno es un factor que contribuye al desarrollo de heridas crónicas, es decir, heridas que no cicatrizan correctamente y se abren una y otra vez, especialmente en pacientes diabéticos y con trastornos vasculares.

En la actualidad, las mallas disponibles en el mercado que se utilizan en la reparación quirúrgica de tejidos blandos no son degradables o son totalmente degradables y se absorben en el organismo del paciente pasado un cierto tiempo.

Los implantes de malla no reabsorbible suelen estar fabricados con diversos plásticos, que es sabido que permanecen bioestables y seguros durante varios años tras su implantación. Sin embargo, la introducción de un material extraño en el cuerpo humano o animal puede ir acompañada de efectos secundarios tal como migración de la malla, inflamación crónica, riesgo de infección, etc. La introducción de una pieza de plástico relativamente grande en el cuerpo también puede inducir una reacción de cuerpo extraño provocada por el sistema inmunitario de defensa del organismo. Como resultado, el implante de malla puede arrugarse y perder su función de soporte de los tejidos. Otro problema es que los materiales plásticos utilizados para las mallas, por ejemplo el polipropileno, muestran un efecto estimulante limitado del crecimiento celular. Por lo tanto, el crecimiento de las células en el defecto suele ser limitado y la cicatrización de la herida se prolonga.

Por otro lado, las mallas totalmente absorbibles (biodegradables) cuentan con la ventaja de que no hay tejido extraño que permanezca dentro del cuerpo. Se ha demostrado que algunos materiales totalmente biodegradables, tal como el ácido poliláctico (PLA) o el colágeno, favorecen la fibrogénesis, es decir, el crecimiento interno de células en el defecto de tejido blando, lo cual es importante para la cicatrización rápida y sostenida de las heridas. No obstante, si la malla se degrada y absorbe demasiado rápido, la placa cicatricial que se construye gradualmente sobre el defecto tisular aún no podrá soportar las tensiones aplicadas al tejido blando reparado durante las actividades cotidianas. Esto es especialmente importante en el caso de la reparación de hernias, ya que la placa cicatricial que reviste el defecto debe soportar la presión intraabdominal; de lo contrario, la recidiva de la hernia está casi garantizada. Además, las mallas fabricadas, por ejemplo, con PLA tienen la desventaja de ser bastante quebradizas y tienden a romperse si se doblan o enrollan para introducir la malla a través de una herramienta laparoscópica.

El documento de G. Chen et al., Biomaterials 26(15), 2559-2566 (2004) desvela el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos en una fina malla híbrida de PLGA-colágeno. La malla híbrida se construye formando microesponjas de colágeno en forma de red en las aberturas de una malla tejida con PLGA.

El problema resuelto por la presente invención es, por lo tanto, proporcionar un implante de malla biodegradable, que permita el cierre rápido, seguro y estable de un defecto de tejido blando, en particular un defecto de hernia, mientras se reduce la formación de adherencias. Al mismo tiempo, la fabricación de los componentes del implante de la malla debe ser fácil y económica, y permitir su uso en procedimientos quirúrgicos convencionales abiertos y laparoscópicos.

Este problema se resuelve mediante el implante de malla de acuerdo con la Reivindicación 1, el procedimiento de preparación de acuerdo con la Reivindicación 9 y el kit de implante de acuerdo con la Reivindicación 13. Las realizaciones preferidas son objeto de las reivindicaciones dependientes.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un implante de malla para su uso en la reparación de tejidos blandos, en particular la reparación quirúrgica de hernias o fístulas, o la cicatrización de heridas crónicas, dentro del cuerpo de un paciente. El implante de malla comprende una malla de sostén polimérica porosa, hidrófila y biodegradable, fabricada con al menos un primer polímero que comprende ácido poliláctico como componente principal. El término "componente principal" significa que el contenido de PLA del primer material polimérico es mayor que el contenido de cualquier otro polímero que pueda estar incluido en el primer material polimérico.

La malla de sostén polimérica (que en lo sucesivo también se denominará "malla de sostén") tiene una estructura esponjosa con poros interconectados de diferentes tamaños y un ángulo de contacto con el agua inferior a 75°, lo que significa que es hidrófila. El implante de malla (que en lo sucesivo también puede denominarse "implante") de la presente invención comprende además fibroblastos que están presentes sobre o dentro de la malla de sostén.

Un elemento clave de la presente invención es que la malla de sostén es hidrófila a pesar de comprender como componente principal ácido poli(láctico) (generalmente abreviado como "PLA" o en el caso del ácido poli-L-láctico como "PLLA"), es decir, un polímero sintético biodegradable que generalmente es de naturaleza hidrófoba. Gracias a unas etapas de procesamiento específicas en la preparación de la malla de sostén, que se describirán en detalle más adelante, se puede dotar a la malla de sostén de propiedades hidrófilas, que son importantes para favorecer la penetración y la adhesión celular.

Otro elemento clave de la presente invención es que la malla de sostén porta fibroblastos. Sorprendentemente, se ha descubierto que la formación de nuevo tejido, especialmente tejido cicatricial, para cerrar un defecto de tejido blando puede evocarse aportando fibroblastos adicionales (de cualquier origen, por ejemplo, autólogo, heterólogo, xenófilo) en el área del defecto. Por lo tanto, en lugar de centrarse en promover el crecimiento tisular de, por ejemplo, células musculares lisas y fibroblastos del tejido adyacente en el defecto de tejido blando, por ejemplo, en una herida crónica, una fístula o una hernia, el implante de la presente invención utiliza la malla de soporte degradable para llevar un mayor número de fibroblastos al área del defecto. Los fibroblastos ayudan a construir tejido de matriz extracelular y varios tipos de fibras de colágeno, formando así una placa cicatricial que cierra el defecto de tejido blando. De este modo, la placa de cicatrización formará una conexión firme entre la malla de sostén polimérica degradable (y, por tanto, temporal) y los bordes del defecto, así como las demás estructuras circundantes (por ejemplo, la pared abdominal en caso de hernia abdominal) para garantizar la función de soporte deseada mediante la creación de una cicatrización adicional.

En la presente solicitud, se aplican las siguientes definiciones:

El término "biodegradable" significa que la malla puede absorberse con el tiempo si se coloca dentro de un organismo vivo, en el que está rodeada de fluidos corporales.

El término "malla", tal como se utiliza a lo largo de esta solicitud, se refiere a un soporte tridimensional, es decir, una matriz o un armazón, con una estructura similar a una esponja, que es adecuado para ser colonizado por células. En este sentido, la malla sirve de plantilla tridimensional que puede ser colonizada por células o tejidos. Esta colonización puede tener lugar in vitro o in vivo. Además, en relación con los trasplantes, la malla sirve para situar el trasplante y también como soporte para el tejido que se forma gradualmente in vivo.

A este respecto, el término "poroso" se refiere a una estructura que comprende poros, es decir, cavidades o regiones vacías. Estos poros pueden tener una forma redonda y/o una forma angular en una sección bidimensional y/o una forma inclinada cuando se ven tridimensionalmente. La forma de los poros también puede caracterizarse por extensiones tales que pueden compararse con la forma de las células nerviosas. Aunque en general, el término "poros" también se refiere a cavidades formadas por filamentos que encierran una región vacía, los poros en el sentido de la presente invención son cavidades formadas en una estructura similar a una esponja. De este modo, las cavidades están encerradas por paredes, como en las esponjas naturales o los corales. Al menos algunos de los poros o cavidades están interconectados, lo que significa que las paredes de los poros entre dos poros adyacentes pueden comprender orificios, formando una conexión entre dichos poros adyacentes. A este respecto, cabe señalar que los poros también pueden estar formados por las regiones vacías entre los gránulos de un hidrogel.

Como se ha mencionado anteriormente, la malla de sostén polimérica de la presente invención tiene una estructura tridimensional, porosa y esponjosa que comprende poros de diferentes tamaños. Esto contrasta con una estructura de malla tejida. Al menos algunos de los poros están interconectados de esta manera, de forma que dividen el espacio en una red intersticial conectada fluídicamente. De este modo, las células pueden propagarse a través de la estructura de la malla.

El término "hidrófilo" o "hidrofilia" utilizado en el contexto de la presente invención se refiere a un ángulo de contacto con el agua de un área superficial de la malla inferior a 75°. Preferentemente, se refiere a un ángulo de contacto inferior a 60°.

Como se ha mencionado, los polímeros sintéticos biodegradables, como tal el PGA o el PLA, son generalmente hidrófobos y, por lo tanto, las superficies de los andamios porosos o mallas preparadas a partir de estos polímeros suelen ser también hidrófobas. Se ha descubierto que las propiedades hidrófilas de una malla polimérica que comprende PLA como componente principal pueden mejorarse mediante procedimientos de postprocesamiento, tal como el tratamiento con plasma (es decir, tratamiento con un plasma de gas ionizado) y/o revistiendo la superficie de la estructura porosa del andamio con un polímero natural, tal como colágeno o gelatina.

El término "polímeros biocompatibles" se refiere a polímeros que son biológicamente tolerados y no causan rechazo cuando se introducen en un organismo vivo. Para la presente invención, los polímeros biocompatibles también abarcan los polímeros que son reconocidos por un huésped como extraños pero cuyo rechazo puede suprimirse mediante una inmunosupresión adecuada.

La expresión "biodegradable" se refiere a un material que puede convertirse en productos metabolizables en organismos vivos (o fluidos corporales o cultivos celulares derivados de organismos vivos). Los materiales biológicamente degradables incluyen, por ejemplo, polímeros que son biorreabsorbibles y/o biogradables. "Biogradable" denota la capacidad de ser soluble o suspendible en líquidos biológicos. Biorreabsorbible significa la capacidad de ser absorbido por células, tejidos o fluidos de un organismo vivo.

En una realización preferente, la malla de sostén polimérica tiene un ángulo de contacto con el agua inferior a 40°, preferentemente inferior a 25°, más preferentemente inferior a 15°. Lo más preferentemente, el ángulo de contacto con el agua de la superficie hidrófila de la malla de sostén está dentro del intervalo de 0° a 10° y es, por tanto, "superhidrófila".

El término "ángulo de contacto", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere al ángulo de contacto del agua sobre una superficie, es decir, al ángulo formado en la interfaz en la que el agua se encuentra con la superficie. De este modo, el "agua" utilizada para la medición del ángulo de contacto se refiere al agua pura, concretamente al agua ultrapura. En particular, la medición del ángulo de contacto se lleva a cabo por el procedimiento de la gota sésil (por ejemplo, mediante un dispositivo del tipo EasyDrop DSA20E, Krüss GmbH) utilizando un tamaño de gota de 0,3 o 0,1 pl. Los ángulos de contacto se calculan generalmente ajustando una función de segmento circular al contorno de la gota colocada sobre la superficie

Se ha descubierto que una malla de sostén con propiedades hidrófilas favorece el crecimiento tisular de, por ejemplo, células musculares lisas y fibroblastos del tejido adyacente al defecto hemiario, y permite una distribución celular uniforme sobre y a lo largo de la malla. Además, la naturaleza porosa de la capa superior proporciona un entorno estimulante de crecimiento para las células que ayudan a construir tejido de matriz extracelular y diversos tipos de fibras de colágeno, formando así una placa cicatrizante que cierra el defecto tisular. La formación de la placa cicatricial establecerá una conexión firme entre la malla de sostén polimérica degradable (y, por tanto, temporal) y los bordes del defecto herniario, así como la pared abdominal u otras estructuras circundantes. Mientras continúa la degradación de la malla de sostén, el tejido cicatrizante recién formado proporcionará la función de soporte necesaria creando una cicatrización adicional, evitando así la formación recurrente de hernias. Al final, tras la degradación completa de la malla de sostén, es decir, cuando se hayan absorbido los componentes poliméricos de la malla, no quedará ningún material extraño dentro del cuerpo del paciente.

En una realización preferente, la malla de sostén tiene una forma plana, similar a una lámina, y es elásticamente deformable para permitir su plegado o enrollado. En particular, es preferente que toda la malla de sostén sea deformable elásticamente, de modo que pueda doblarse o enrollarse y pueda volver a su forma original. Esto permite la inserción de la malla enrollada o plegada a través de un trocar en un procedimiento laparoscópico.

Si la malla de sostén se proporciona en forma de lámina, tiene preferentemente un espesor de al menos 0,1 mm, más preferentemente de al menos 0,3 mm, más preferentemente de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 4 mm, en algunos casos puede ser incluso más gruesa, por ejemplo hasta 10 mm.

Si se proporciona en forma de lámina, la sección transversal de la malla de sostén puede ser de cualquier tipo, por ejemplo rectangular, cuadrada, circular, ovalada, etc., y también puede cortarse para adaptarse a la forma del defecto hemiario. Por ejemplo, la forma general de la sección transversal puede ser circular u ovalada.

La malla de sostén puede adoptar la forma de una única estructura continua o también puede proporcionarse en forma de múltiples piezas de malla más pequeñas (es decir, "parches") separadas entre sí. Estos pequeños parches de malla pueden estar contenidos en una formulación similar a una pasta, líquida o semilíquida.

En una realización alternativa, la malla de sostén puede proporcionarse en forma de hidrogel, es decir, sin una forma externa o transversal tridimensional específica. Un hidrogel, debido a su naturaleza generalmente hidrófila, ayuda al crecimiento del tejido en los poros, con lo que se consigue un anclaje inmediato de la malla de sostén al tejido. El hidrogel también puede mezclarse con sustancias adicionales, tal como factores de crecimiento o sustancias farmacéuticamente activas.

En cuanto a la composición material de la malla de sostén, es preferente que la malla de sostén esté fabricada exclusivamente con el primer polímero -que comprende PLA como componente principal- o el primer polímero y además un polímero natural seleccionado del grupo que consiste en colágeno, gelatina, laminina, fibrinógeno, albúmina, quitina, quitosano, agarosa, ácido hialurónicoalginato y sus mezclas, siendo preferente el colágeno.

Preferentemente, la estructura esponjosa de la malla de sostén polimérica consiste en el primer polímero y está revestida por el menos un polímero natural. Preferentemente, el armazón poroso de la capa superior está revestido o recubierto con el polímero natural, de manera que la estructura porosa subyacente de la capa superior no se ve modificada por el revestimiento. En particular, es preferente no alterar sustancialmente el tamaño de los poros, por ejemplo formando redes adicionales dentro de los poros de la malla de sostén. Esto garantiza que el revestimiento no afecte negativamente la capacidad de las células para penetrar y extenderse dentro de la malla de sostén. Más adelante, en la sección de experimentos, se ofrecen más detalles al respecto.

Es preferente además que el polímero natural revista esencialmente todas las superficies accesibles (excepto las superficies dentro de los poros cerrados) de la malla de sostén. De este modo, las células no sólo se extenderán sobre la superficie superior, sino también dentro de la estructura porosa de la malla de sostén.

Preferentemente, el primer polímero consiste en al menos 70% de ácido poli(láctico), incluso más preferentemente en al menos 80% de ácido poli(láctico). Se comprobó que el PLA tiene una buena resistencia a la tracción y un módulo elevado. Además, se ha descubierto que el PLA es beneficioso para lograr y mantener las propiedades hidrófilas obtenidas mediante tratamiento con plasma y/o revestimiento de la estructura de PLA con un polímero natural, tal como el colágeno.

En esta solicitud, el término "ácido poli-láctico" (PLA) incluye, por ejemplo, ácido poli-L-láctico (PLLA) o ácido poli-D,L-láctico (mezcla racémica de L- y D-láctidos; PDLLA). Un ejemplo específico de un primer polímero preferente es Poli(L -lactida) que está disponible comercialmente a partir de Sigma Corporation (PLLA número de catálogo P1566) con un peso molecular de 85.000 - 160.000. Una alternativa adecuada es el PLLA de Durect Corporation (Lactel® número de catálogo B6002 - 2).

Más específicamente, se ha descubierto que para las estructuras porosas fabricadas con un material con un alto contenido de PLA, por ejemplo, si el primer polímero consiste en al menos 70% de PLA, la hidrofilicidad de la superficie no sólo se podría mejorar significativamente mediante un tratamiento con plasma como el que se describe en la presente memoria descriptiva, sino que la hidrofilicidad también podría mantenerse durante un tiempo prolongado. De hecho, la hidrofilicidad también podría mantenerse después de esterilizar la malla de sostén con peróxido de hidrógeno (como también se describirá más adelante). Este aumento de la hidrofilicidad no podría lograrse por el tratamiento con plasma de una malla que tuviera, por ejemplo, PGA como componente principal.

Aunque el primer polímero puede consistir esencialmente en PLA puro, también puede estar fabricado con una mezcla de PLA con otros materiales biodegradables, tal como PGA. Por ejemplo, el primer polímero puede consistir en 75% de PLA y 25% de PGA (con respecto al peso del primer polímero). Una de las razones para utilizar una mezcla de PLA y otros materiales biodegradables es que las mallas de PLA puro son menos resistentes a la deformación que las fabricadas con PLA mezclado con otros polímeros, tal como PGA. PGA es la abreviatura de ácido poliglicólico. Los copolímeros de PLA y PGA -denominados poli-lactida-co-ácido glicólico (PLGA o PLG)- son candidatos atractivos para la fabricación de mallas biodegradables debido a sus propiedades físicas flexibles y bien definidas, y a su relativa biocompatibilidad. Además, sus productos de degradación son compuestos de bajo peso molecular que entran en las vías metabólicas normales. Además, los copolímeros de PLGA ofrecen la ventaja de un amplio espectro de velocidades de degradación, de unos pocos días hasta años, simplemente variando la proporción de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico.

En particular, si el implante de malla está destinado a uso laparoscópico en una cirugía mínimamente invasiva, debe ser insertable a través de una herramienta laparoscópica, tal como un trocar. Para estas aplicaciones, la malla de sostén se presenta preferentemente en forma de pasta o hidrogel o, alternativamente, en una forma que pueda plegarse o enrollarse elásticamente para su inserción a través de una herramienta laparoscópica. Se pueden proporcionar propiedades elásticas utilizando PLGA, es decir, una mezcla de PLA y PGA, como el primer polímero.

Así, para una malla de soporte plegable, el primer polímero está preferentemente fabricado con PLGA, específicamente una mezcla de ácido poli(glicólico-ácido láctico) que tiene un contenido de ácido láctico de aproximadamente 75 mol% y un contenido de ácido glicólico de aproximadamente 25 mol%). Dicho material de poli(D,L-lactida-co-glicolida) 75:25 puede adquirirse, por ejemplo, comoRESOMER® RG 752 de Evonik Industries AG (Essen, Alemania) o de Sigma Corporation, PLGA número de catálogo P1941. Otras mezclas de polímeros preferentes son poli(D,L-lactida-co-glicolida) 65:35, por ejemploRESOMER® RG 653; poli(D,L-lactida-co-glicolida) 75:25, por ejemplo RESOMER® RG 502 o Durect Company (Cupertino, CA, EE. UU.); poli(D,L-lactida-co-glicolida) 85:15, por ejemplo RESOMER® RG 858 o Polímeros Absorbibles de LACTEL®.

Los procedimientos de preparación de mallas porosas a partir de los polímeros sintéticos mencionados con anterioridad son bien conocidos en la técnica. Una posibilidad es el uso de una técnica de lixiviación salina, como se describe, por ejemplo, en la Patente Europea EP 2256155.

Como se ha mencionado, en una realización preferente, la malla de sostén consiste esencialmente sólo en el primer polímero por sí solo o en el primer polímero y otro polímero natural seleccionado del grupo que consiste en colágeno, gelatina, laminina, fibrinógeno, albúmina, quitina, quitosano, agarosa, ácido hialurónicoalginato y sus mezclas. El polímero natural reviste preferentemente todas las superficies de la malla de sostén. De este modo, la malla de sostén proporcionará un entorno especialmente hidrófilo y favorable para las células, lo que aumenta la tasa de supervivencia y proliferación de las células sobre y dentro de la malla.

De los polímeros naturales mencionados con anterioridad, el colágeno es el más preferente. El colágeno es una biomolécula de la matriz extracelular (MEC) y el principal componente de la piel y los huesos. Gracias a su arquitectura nanofibrosa, el colágeno es especialmente eficaz para promover la adhesión celular, el crecimiento y la función diferenciada en cultivos de tejidos. Sin embargo, también se ha observado que si el polímero natural comprende colágeno, las propiedades hidrófilas de la malla de sostén de acuerdo con la presente invención resultan particularmente reforzadas. A este respecto, el término "colágeno", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, abarca colágenos derivados naturalmente y colágenos producidos sintéticamente, así como sustancias derivadas a partir de colágeno, tal como gelatina, que es una forma hidrolizada de colágeno.

En una realización preferente, el polímero natural consiste esencialmente en colágeno. A este respecto, el polímero natural puede consistir en sólo un tipo de colágeno, es decir, el tipo I, o puede consistir en una mezcla de tipos de colágeno, por ejemplo una mezcla de colágeno tipo I y colágeno tipo IV. En este último caso, se da preferencia a la mezcla que contiene las proteínas en porcentajes aproximadamente iguales en peso. El colágeno de tipo I es el más preferente, ya que se encuentra fácilmente disponible, tiene un alto grado de biocompatibilidad, y proporciona resistencia adicional a la tracción. Además, es uno de los principales componentes de los vasos sanguíneos naturales y proporciona un lugar de fijación natural para las células implicadas en el proceso de cicatrización de heridas. Por último, también se ha demostrado que los productos de degradación del colágeno de tipo I a III inducen una atracción quimiotáctica de los fibroblastos humanos, lo que resulta especialmente beneficioso para el uso previsto de la malla de sostén como un implante que comprende fibroblastos.

Otra ventaja del implante de la invención es la capacidad de incorporar agentes en la malla de sostén y posteriormente administrarlos al sitio de la herida que afecta el crecimiento celular, tal como colágeno de tipo IV y V, fibronectina, laminina, ácido hialurónico, y proteoglicanos. De manera similar, también pueden incorporarse a la malla de sostén agentes farmacológicamente activos tal como el factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante beta, factor de angiogénesis, antibióticos, antifúngicos, espermicidas, hormonas, enzimas y/o inhibidores enzimáticos.

En cuanto a la degradación de la malla de sostén dentro del organismo -que normalmente se produce por bioabsorción de sus componentes-, es preferente un tiempo total de degradación en un organismo vivo de 1 a 12 meses, preferentemente de 1 a 8 meses, más preferentemente de 1 a 6 meses, y lo más preferentemente de 2 a 4 meses.

Por lo tanto, para promover la formación de tejido cicatricial es preferente que la malla de sostén comprenda además factores de crecimiento, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en interleucinas, factor de crecimiento de fibroblastos ácido, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, VEGF, y HGF. Estos factores de crecimiento son importantes para regular la proliferación y diferenciación celular, la síntesis de proteínas y la remodelación de la MEC (matriz extracelular). En particular, se ha demostrado que el b - FGF, el PDGF, el VEGF y el HGF aumentan la granulación, la epitelización y la formación de capilares mediante la secreción de citocinas angiogénicas. También se ha demostrado que inhiben la migración de neutrófilos y macrófagos a la localización de la herida mediante la secreción de factores que inhiben la migración y la supresión tanto de IL - 1a como de IL - 1p, y que secretan factores antiinflamatorios que previenen la apoptosis y mejoran la cicatrización de la herida.

Preferentemente, los factores de crecimiento se añaden a la malla de sostén junto con un secretoma mesenquimal placentario. Un secretoma preferente disponible comercialmente es un secretoma que comprende células madre humanas de Wharton's Jelly Stem Cell (CM-hWJSC) que fueron cultivadas en condiciones de hipoxia. Este secretoma de células madre puede adquirirse, por ejemplo, del Stem Cell and Cancer Institute (PT Kalbe Farma Tbk.). El secretoma se utiliza para estimular el crecimiento de las células implantadas en la malla de sostén. En vista de su uso como dispositivo médico, la adición del secretoma puede emplearse extracorpóreamente en la incubadora para estimular el crecimiento de las células antes de la implantación. En cuanto se haya logrado un crecimiento celular suficiente, la malla puede lavarse con medio antes de la implantación.

El uso de secretoma que comprende células madre de Wharton's Jelly Stem Cell (CM-hWJSC) que fueron cultivadas en condiciones de hipoxia para estimular el crecimiento celular ha demostrado ser altamente eficaz no sólo para la estimulación de fibroblastos, sino también para otras células, en particular células que son más delicadas de manejar y cultivar, tal como las células hepáticas (hepatocitos). De hecho, los hepatocitos generalmente se cocultivan con células del páncreas, específicamente células de los islotes de Langerhans, ya que se ha demostrado que esto aumenta la tasa de supervivencia y proliferación de los hepatocitos. Al añadir el secretoma mencionado a los hepatocitos en medios de cultivo, se ha comprobado que el crecimiento y la proliferación de los hepatocitos son incluso mejores que en cocultivo con células de islotes de Langerhans.

Los fibroblastos proporcionados en la malla de sostén son preferentemente fibroblastos autólogos del paciente que está destinado a recibir el implante. De este modo, se reduce en gran medida el riesgo de que el paciente muestre una respuesta inmunitaria no deseada debido a la implantación de material celular extraño.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar un implante de malla como el descrito anteriormente mediante las siguientes etapas:

a) proporcionar una malla de sostén polimérica biodegradable como la descrita anteriormente;

b) tratamiento con plasma de la malla de sostén polimérica con un plasma de gas ionizado a una temperatura inferior a 50°C; y

c) inocular la malla de sostén polimérica con fibroblastos.

Se ha descubierto que el tratamiento con plasma aumenta las propiedades hidrófilas de la superficie de la superficie, sin efectos perjudiciales sobre la estabilidad o la integridad estructural de la malla. Las pruebas demostraron que el tratamiento con plasma es especialmente eficaz para mejorar y también mantener las propiedades hidrófilas si la malla de sostén polimérica tiene un alto contenido de PLA, es decir, comprende PLA como un componente principal. Por otra parte, el tratamiento con plasma de las estructuras de PGA no mejora significativamente la hidrofilia.

El plasma de gas ionizado utilizado para el tratamiento con plasma preferentemente se selecciona del grupo que consiste en helio, argón, nitrógeno, neón, silano, hidrógeno, oxígeno y sus mezclas. El gas de tratamiento preferente es oxígeno.

El tratamiento con plasma preferentemente implica un tratamiento con plasma a baja presión, en el que la malla de sostén está expuesta a un plasma de gas ionizado A22337WOEP/07.04.2022 a una temperatura inferior a 50°C, preferentemente inferior a 40°C.Preferentemente, la presión está en el intervalo de 1 Kpa a 1e-4 Kpa, preferentemente dentro del intervalo de 0,01 a 0,1 Kpa.

El tiempo de tratamiento preferente es de al menos un minuto, preferentemente entre 2 y 30 minutos, más preferentemente entre 5 y 20 minutos.

El término "plasma" por lo tanto se refiere generalmente a un gas excitado y radicalizado, es decir, un gas de proceso conductor de la electricidad en el que intervienen electrones e iones. El plasma suele generarse mediante electrodos en una cámara de vacío (la llamada "aproximación plasmática RF"), pero también puede generarse mediante procedimientos capacitivos o inductivos, o radiación de microondas.

Más preferentemente, el procedimiento para preparar un implante como el descrito anteriormente comprende las etapas de:

b) revestir al menos la superficie de la malla de sostén polimérica con un polímero natural, preferentemente colágeno;

c) tratamiento con plasma de la malla de sostén polimérica con un plasma de gas ionizado a una temperatura inferior a 50°C; y

d) inocular la malla de sostén polimérica con fibroblastos.

Se ha descubierto que el revestimiento de la malla de sostén polimérica con un polímero natural, en particular colágeno, también mejora las propiedades hidrófilas de la superficie de la malla y es altamente beneficioso con vistas al uso de la malla de sostén como un sostén para la proliferación de células.

Es particularmente preferente que antes de la inoculación con fibroblastos, la malla de sostén polimérica se esterilice por tratamiento con H²O²a una temperatura inferior a 50°C.

La etapa de esterilización del procedimiento de preparación de la invención es altamente preferente para la preparación del implante de la presente invención. Inesperadamente, se ha descubierto que la esterilización por el uso de peróxido de hidrógeno permite una esterilización perfecta de la malla de sostén, sin utilizar ninguna de las técnicas de esterilización convencionales que implican vapor caliente, rayos gamma, irradiación por haz de electrones o tratamientos químicos agresivos que, se ha demostrado, provocan la alteración o incluso la degradación de la estructura molecular de la malla de sostén polimérica y, por lo tanto, no sólo disminuyen su resistencia mecánica y enzimática, sino que también reducen sus propiedades hidrófilas. Además, el procedimiento de la invención de esterilización con peróxido de hidrógeno preserva cualquier capa de colágeno que pueda proporcionarse en la malla de sostén. A diferencia de las técnicas de esterilización convencionales que conducen a la desnaturalización de las capas de colágeno, en particular en el caso de capas de colágeno nanogruesas, el tratamiento con H²O²descrito anteriormente no tiene este efecto de deterioro.

El tiempo de tratamiento depende en gran medida de la temperatura y presión dentro de la cámara, y de la concentración de la solución de H²O². Preferiblemente, la solución de H²O²comprende H²O²en una cantidad de alrededor del 30% en volumen o menos. Los tiempos de tratamiento preferentes son de al menos uno minuto, preferentemente al menos 5 minutos, o al menos una hora. Si se aplica una presión "más alta" (por ejemplo, aproximadamente 1 Kpa) y temperaturas bajas (por ejemplo, inferiores a 40°C) o concentraciones de H²O²inferiores a 30 vol.-%, pueden ser convenientes tiempos de tratamiento de hasta 10 a 12 horas.

El entorno que contiene peróxido de hidrógeno puede proporcionarse mediante tratamiento con plasma de H²O²o colocando el sustrato a esterilizar en una cámara de vacío, junto con una fuente de peróxido de hidrógeno (generalmente líquido). Al aplicar vacío dentro de la cámara de vacío, el peróxido de hidrógeno se sublima y se crea una atmósfera que contiene peróxido de hidrógeno. Además, la presión negativa aplicada en la cámara de vacío se encuentra preferentemente en el intervalo de 0,001 Kpa a 10 Kpa, más preferentemente entre 0,01 y 2,0 Kpa, por ejemplo, aproximadamente 0,9 Kpa.

Para asistir en el proceso de cicatrización de la herida, el procedimiento descrito anteriormente incluye preferentemente una etapa adicional en la que un secretoma que comprende factores de crecimiento, en particular secretoma mesenquimal, se administra sobre o dentro de la malla de sostén.

La presente invención también se refiere al uso del implante de malla de la invención en el cierre primario de heridas, por ejemplo después de una incisión abdominal primaria, para ayudar a la cicatrización de heridas, en particular en el caso de heridas crónicas, y procesos de cicatrización. Además, también es muy adecuado para uso en el cierre de fístulas o hernias.

En otro aspecto, la presente invención también se refiere al procedimiento de cierre de una hernia utilizando el implante descrito anteriormente. En general, durante dicho procedimiento, la malla de sostén polimérica degradable con los fibroblastos sembrados se colocará sobre el defecto, por ejemplo, la pared abdominal (reparación de hernia inguinal de acuerdo con Lichtenstein), debajo de la capa muscular de la pared abdominal (técnica de subcolocación), como reparación de IPOM, o en cualquier técnica que un cirujano considere adecuada para la reparación.

Además de las hernias, el implante de malla de la presente invención también es particularmente adecuado para el cierre quirúrgico de fístulas. Una fístula es una conexión revestida con tejido epitelial que conecta patológicamente el espacio intraabdominal con la piel y presenta una abertura al nivel de la piel -que a menudo produce fugas de líquido a través de la piel- o una conexión patológica entre el intestino grueso o delgado y el área anal. Las fístulas son difíciles de tratar quirúrgicamente y son propensas a recidivas repetidas. A la fecha, la resección completa de la totalidad de la fístula es la terapia de elección. Se han desarrollado diversos materiales que se insertan en el canal resecado para mejorar el proceso de cicatrización. Ninguno ha demostrado garantizar el éxito a largo plazo. Sin embargo, se ha descubierto que la inserción o implantación de la malla de sostén que porta fibroblastos, tal como se ha descrito anteriormente, aumenta sustancialmente el proceso de cicatrización. Este efecto también se observó en heridas crónicas y fístulas. A este respecto, de acuerdo con la descripción anterior, la malla de sostén puede tener forma de lámina, o una sin geometría definida tener forma de pasta o hidrogel.

La presente invención se refiere además a un kit para uso en la reparación quirúrgica de tejidos blandos, en particular la reparación de fístulas o hernias, dentro del cuerpo de un paciente, en el que el kit comprende a) una malla de sostén polimérica como se ha definido anteriormente y b) una malla de soporte adicional, preferentemente biodegradable, que tiene una tasa de degradación más lenta que la malla de sostén polimérica.

Si la malla de soporte es biodegradable, tiene preferentemente una tasa de degradación dentro del intervalo de 4 a 12 meses.

La malla de soporte no degradable o degradable se pretende para colocación debajo de la malla de sostén polimérica, para puentear la hernia después de que la malla de sostén polimérica se haya degradado. Esto significa que, en general, la malla de soporte proporcionará una función de soporte adicional después de los tres primeros meses.

En una realización preferente, la malla de soporte es biodegradable y se habrá degradado al cabo de, como máximo, 12 meses. De manera similar a la malla de sostén, la malla de soporte es preferentemente hidrófila, al menos parcialmente, y favorece así la formación de la placa cicatricial que sirve de puente a la hernia.

Lo más preferente es que la malla de soporte sea una malla común disponible en el mercado.

En una realización preferente, la malla de sostén polimérica comprende uno o más de los polímeros seleccionados del grupo que consiste en ácido poli(glicólico), ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico - ácido láctico), y sus mezclas. Además, en esta realización, si tanto la malla de sostén polimérica como la malla de soporte son biodegradables, entonces la malla de sostén tiene preferentemente una tasa de degradación más rápida que la malla de soporte.

En otra realización preferente, el kit incluye como una malla de soporte una malla antiadherente adicional de dos capas, que comprende dos capas individuales o integrales consistentes en

i) una capa hidrófila orientada hacia el peritoneo o el tejido muscular o la fascia abdominales expuestos, y con un ángulo de contacto con el agua inferior a 75°, preferentemente inferior a 60°, y

ii) una capa hidrófoba con un ángulo de contacto con el agua superior a 90°.

Esta realización del kit de implante proporciona dos beneficios principales: por un lado, la malla de sostén polimérica proporciona un cierre temporal del defecto, en particular una hernia o fístula, mientras que los fibroblastos forman nuevo tejido cicatricial que asumirá la función de soporte de la malla de sostén tras su degradación. Por otra parte, la malla antiadherente de dos capas que funciona como malla de soporte tiene una capa superior con propiedades hidrófilas que promueven el crecimiento tisular en el lado orientado hacia el defecto de tejido blando, en particular la proliferación de los fibroblastos implantados que ayudan a formar la placa cicatricial que acaba cerrando el defecto, y una capa inferior con propiedades hidrófobas que impiden la adhesión de diversas células, entre otras, células inflamatorias, fibrina o residuos, a la malla antiadherente desde el lado intraperitoneal, es decir, el lado de la malla de soporte orientada al defecto, es decir, el lado de la malla de soporte orientada contra el defecto, de forma que se evite la aparición de inflamación y la formación de tejido adhesivo entre la malla antiadherente o la placa cicatricial recién formada y los tejidos abdominales subyacentes.

Aunque se afirma que la malla de soporte tiene generalmente una tasa de degradación más lenta que la malla de sostén, también puede ocurrir que porciones de la malla de soporte tengan una tasa de degradación similar a la de la malla de sostén. Por ejemplo, en la realización en la que la malla de soporte tiene una capa superior y una capa inferior como se define en los párrafos anteriores, la capa superior puede tener una tasa de degradación más rápida que la capa inferior, de manera que, por ejemplo, el tiempo de degradación de la capa superior en el organismo vivo es de entre 1 y 3 meses, preferentemente de aproximadamente 2 meses, y el tiempo de degradación de la capa inferior en el organismo vivo es de entre 4 y 8 meses, preferentemente aproximadamente 6 meses. Esto significa que en esta realización de dos capas, es sobre todo la capa inferior de la malla de soporte la que proporciona una función de soporte adicional durante los primeros cuatro a ocho meses. Transcurrido este tiempo, es preferente que la capa inferior también se haya degradado.

En vista de su uso en la reparación de hernias o fístulas, es preferente que al menos una, preferentemente ambas, de las mallas de sostén poliméricas y las mallas de soporte tengan una flexibilidad que permita su inserción en el cuerpo del paciente a través de una herramienta laparoscópica.

Tanto la malla de sostén polimérica como la malla de soporte pueden suministrarse en cualquier forma, por ejemplo rectangular, cuadrada, circular, ovalada, etc., y pueden cortarse para adaptarse a la forma del defecto de la hernia. Por ejemplo, la forma general de la malla puede ser circular u ovalada. Alternativamente, las mallas pueden tener una forma generalmente cuadrada o rectangular. En forma alternativamente adicional, la malla de soporte puede tener forma de lámina plana y la malla de sostén puede ser una pasta o un hidrogel comprendiendo los fibroblastos. De este modo, la malla de soporte mantendrá la malla de sostén en su lugar, mientras que la malla de sostén puede utilizarse para rellenar el defecto de tejido blando.

Cuando se utiliza para cerrar una hernia, el kit de implante de la presente invención puede utilizarse de la siguiente manera:

En primer lugar, se proporciona un kit de implante como el descrito anteriormente. Después, se practica una incisión a través de la piel y el tejido del paciente para acceder al defecto en el peritoneo. Después, la malla de sostén polimérica se coloca encima del defecto, por ejemplo, la pared abdominal (reparación de hernia inguinal de acuerdo con Lichtenstein) o alternativamente debajo de la capa muscular de la pared abdominal (técnica de subcolocación) o como una IPOM (malla de colocación intraperitoneal) debajo del peritoneo antes de colocar la malla de sostén polimérica sobre la malla de soporte. Si se proporciona en forma de lámina, la malla de sostén puede fijarse adicionalmente a los músculos abdominales. Después, se cierra la incisión.

El defecto hemiario se cerrará normalmente mediante una placa cicatricial en un plazo de 3 a 6 meses, tiempo en el que la malla de sostén biodegradable perderá gradualmente su resistencia y consistencia. Al final, no permanecerá ningún material extraño cuando los componentes de la malla se hayan bioabsorbido dentro del organismo.

Datos experimentales

Preparación de la malla de sostén

Partículas de cloruro sódico (NaCl) se molieron con mortero y pilón antes de su tamizado para obtener partículas de NaCl en un intervalo de 355 a 425 |jm. Se introdujeron 9 g de partículas de NaCl en un tubo de centrifugación y se secaron en un desecador. Después, las partículas de NaCl se introdujeron en una bandeja de aluminio.

Una solución de PLLA preparada con 1 g de gránulos de PLLA disuelta en 5 ml de cloroformo se mezcló con las partículas de NaCl, y la mezcla se extendió uniformemente en la bandeja de aluminio para formar una capa plana de PLLA. El disolvente se dejó evaporar por secado al aire a temperatura ambiente durante un tiempo de 20 a 48 horas, preferentemente de 24 a 36 horas, y lo más preferentemente de 28 a 32 horas. Alternativamente, la vaporización del disolvente se llevó a cabo en un horno de temperatura controlada, colocado en una campana extractora para extraer los gases tóxicos del cloroformo.

La capa de PLLA - NaCl previamente seca se separó de la bandeja de aluminio y se secó en una cámara de vacío a una presión negativa de 0,1 MPa durante 3 - 4 días.

Las capas de PLLA-NaCl secas resultantes se colocaron en un vaso de precipitados y las partículas de NaCl se lixiviaron lavando las matrices con agua desionizada. Para ello, las matrices se sumergieron en ddH²O (agua dos veces desionizada) y se mantuvieron en un baño de agitación lineal a 25°C (temperatura ambiente), a 60 rpm durante 48 horas. El agua del vaso de precipitados se cambiaba cada 1 - 2 horas. Las mallas de PLLA/PLGA así preparadas se retiraron del vaso de precipitados y se secaron en la campana extractora durante la noche.

Postprocesamiento con colágeno

Las mallas de PLLA se cortaron en forma redonda con un diámetro de 1 cm. Después, cada malla de PLLA se sumergió en una solución ácida de colágeno de tipo I (1,0 (p/v)%, pH 3,0, adquirida en Wako) al vacío, de modo que los poros de la malla se llenaran con la solución de colágeno. Para eliminar cualquier exceso de solución de colágeno en las mallas de PLLA, se introdujeron en un tubo de centrífuga y se centrifugó el tubo durante 10 min a aceleraciones centrífugas de 2000 g. Se ha descubierto que una aceleración superior a 600 g proporciona mallas de PLLA revestidas con colágeno en lugar de formar microesponjas de colágeno dentro de los poros.

Posteriormente, la malla de colágeno-PLLA se congeló a -80 °C durante 12 horas y se liofilizó bajo un vacío de < 5 Pa durante 24 horas adicionales para eliminar cualquier disolvente de la malla.

Si se utilizaba un agente reticulante (que resultó no ser esencial para la preparación de la malla), la malla de colágeno-PLLA se reticulaba de forma adicional mediante tratamiento con vapor de glutaraldehído saturado con solución acuosa de glutaraldehído al 25 % a 37 °C durante 4 horas. Tras su reticulación, la malla se trató con 0,1 M de solución acuosa de glicina para bloquear los grupos aldehído no reaccionados. En lugar de glicina, pueden utilizarse otros agentes bloqueantes, por ejemplo, caseína, albúmina, gelatina o metanol -acético anhídrido. Tras el lavado con agua desionizada y liofilización, se obtuvo la malla de sostén polimérica como producto final. Tras la liofilización (también conocida como secado por congelación), las mallas de colágeno-PLLA se almacenaron en un desecador hasta su uso.

Las mallas de sostén se prepararon con poros de un diámetro comprendido entre 50 y 900 micrómetros, preferentemente entre 280 y 560 micrómetros, y lo más preferentemente entre 355 y 425 micrómetros.

Notablemente, los poros en las mallas de PLLA tenían esencialmente la misma forma que las partículas de NaCl. De este modo, el revestimiento de colágeno de las mallas de PLLA sólo modificó la humectabilidad (hidrofilicidad) de la superficie, pero no modificó la estructura de los poros.

En comparación con las mallas de PLLA no revestidas, la malla de PLLA revestida de colágeno demostró tanto una mejor humectabilidad como una alta absorción de agua.

Tratamiento con plasma de O ²

Las mallas de sostén - con la capa superior revestida o no de colágeno - se sometieron además a un tratamiento con plasma utilizando un plasma de gas ionizado, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en helio, argón, nitrógeno, neón, silano, hidrógeno, oxígeno y sus mezclas. Preferentemente, se utilizó un tratamiento con plasma utilizando plasma de gas ionizado de oxígeno, hidrógeno, o nitrógeno.

El tratamiento con plasma se realizó utilizando una máquina de tratamiento con plasma de Diener (Diener electronics; Plasma - Surface - Technology; Ebhausen, Alemania), dentro de una cámara de vacío durante un tiempo de 5 a 20 minutos, preferentemente de 8 a 15 minutos. Los parámetros de tratamiento se fijaron de la siguiente manera: Presión dentro de la cámara de vacío: 0.40 mbar; potencia: 35 W; flujo de gas oxígeno: 5 sccm (min) - 60 sccm (max).

Esterilización

Por último, las mallas de sostén se esterilizaron posteriormente colocándolas en un entorno que conteníaH2O2H2O2, exponiendo la malla de sostén a una atmósfera que contenía H²O².

El entorno o atmósfera que contiene H²O²se creó dentro de una cámara de vacío, colocando la malla de sostén en la cámara junto con un matraz abierto que contenía una solución de H²O²y evacuando posteriormente la cámara para evaporar el H²O². La solución de H²O²contenía H²O²en una cantidad igual o inferior al 30% en volumen. El tiempo de tratamiento depende en gran medida de la presión dentro de la cámara y de la concentración de la solución de H²O². Preferentemente, el tiempo de esterilización fue de 10 a 12 horas, a una temperatura de 40°C y una presión de aproximadamente 0,9 Kpa. Sin embargo, a presiones más bajas o temperaturas más altas, los tiempos de tratamiento de sólo unos pocos minutos también demostraron ser eficaces.

Mediciones del ángulo de contacto estático, procedimiento de la gota sésil

Se realizaron mediciones del ángulo de contacto para determinar el grado de hidrofilicidad o hidrofobicidad. Normalmente, los ángulos de contacto de las mallas se determinaban mediante mediciones estáticas del ángulo de contacto. Los ángulos de contacto estáticos se determinaron mediante un ensayo de gota sésil con agua ultrapura (EasyDrop DSA20E, Krüss GmbH). Las gotas de agua con un tamaño de 0,3 pl se dosificaron utilizando una unidad automatizada. Los ángulos de contacto se calcularon ajustando una función de segmento circular al contorno de la gota colocada sobre la superficie.

Recolección, cultivo y siembra de fibroblastos

La recolección de fibroblastos se realizó mediante una escisión dermatológica o quirúrgica de una muestra de piel con espesor total en condiciones de estricta esterilidad de aproximadamente 2 cm x 1 cm. La muestra se colocó en un recipiente estéril y se recubrió con PBS precalentado que contenía antibiótico/antimicótico (AB/AM) 2%. La muestra se trasladó al laboratorio, en el que se lavó con una solución de lavado/EGTA precalentada que contenía AB/AM 2%. La muestra de piel lavada se recubrió con 200 unidades/ml de colagenasa recién preparada en un medio DMEM completo que contenía FBS 10-20%, AB/AM 2%, L-glutamina 2mM y de solución de Na-piruvato 1 mM y, a continuación, se incubó -con la dermis hacia abajo- en CO²5%, a 37°C, durante 3-5 horas. El lado de la dermis se raspó suavemente con un raspador celular hasta que toda la parte de la dermis se disolvió en la solución de colagenasa. La parte de la epidermis se desechó y la suspensión celular se tamizó a través de un tamiz celular de nylon de 100 pm y las células recogidas en el tamiz se enjuagaron exhaustivamente con PBS (AB/AM 2%) antes de recogerlas en un tubo de centrífuga. Las células se centrifugaron durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante, y las células se volvieron a suspender en medio DMEM completo que contenía FBS 10-20%, AB/AM 2%, L-glutamina 2 mM, Na-piruvato 1 mM y HEPES 10 mM. Las células resuspendidas se introdujeron en un matraz revestido con colágeno y se incubaron en CO²5%, a 37 °C, durante 30 minutos. Las células fibroblásticas adheridas a la superficie del matraz revestida con colágeno se separaron de las células no fibroblásticas que permanecían en el medio de cultivo. El recuento de células se realizó con tinción de azul de tripano.

De ser deseado, los fibroblastos se incubaron en medio DMEM. La malla de sostén se sembró con fibroblastos (500.000 células por 1 cm2).

Se ha descubierto que el revestimiento con colágeno aumenta la humectabilidad de la superficie porosa de la malla de sostén y facilita la penetración de la solución de suspensión celular, lo que permite a los fibroblastos penetrar fácilmente en los poros interiores de la malla de sostén.

Las realizaciones preferentes con respecto a la estructura del implante de la invención y su colocación dentro del cuerpo de un paciente en la reparación de tejido blando se describen de forma adicional en conexión con las figuras adjuntas, en las que

La Fig. 1 muestra un dibujo esquemático de una sección a través de un defecto de tejido blando reparado con la ayuda de un kit de acuerdo con la presente invención.

El dibujo esquemático de la Fig. 1 muestra un defecto (hueco) en el tejido muscular 12 que ha sido puenteado con un implante de malla 10 de la presente invención. Específicamente, se colocó una malla de soporte comercialmente disponible debajo del tejido muscular defectuoso 12 antes de insertar en el defecto una malla de sostén biodegradable polimérica 10 que comprende fibroblastos 16. Después, se reparó la piel superpuesta 17, es decir, se cerró mediante puntos 18. La malla de sostén proporciona una estructura de soporte temporal para la proliferación de los fibroblastos y el crecimiento de las células de los tejidos adyacentes. En general, la malla de sostén 10 con los fibroblastos 16 simplemente se insertará en el defecto o se colocará sobre este. Gracias a la malla de soporte 14, se evita el desplazamiento de la malla de sostén 10 del sitio del implante.

Durante los días y semanas posteriores a la inserción del implante de malla, los fibroblastos depositados con la malla de sostén dentro del defecto de tejido muscular continuaron proliferando y extendiéndose a los tejidos adyacentes. Esto es demostrado por los fibroblastos que se han extendido por el tejido muscular adyacente y la malla de soporte colocada bajo el defecto. Se ha demostrado que los fibroblastos extraños producen colágeno, que ayuda a formar tejido cicatricial que cierra firmemente el defecto dentro del tejido muscular en el momento en que la malla de sostén se ha degradado por completo.

El implante de malla de la invención también se ha probado in vivo en ratas, como se describirá en las secciones siguientes.

Histología

Se reparó una hernia experimental de la pared abdominal en una rata con un implante de malla biodegradable de acuerdo con la presente invención, es decir, mediante una malla de sostén que porta fibroblastos. En este experimento, la hernia dentro del tejido muscular de la pared abdominal se rellenó con la malla de soporte de la invención que porta numerosos fibroblastos y secretoma añadidos a la malla de sostén. Para mantener en su lugar la malla de sostén implantada, se implantaron dos mallas de soporte adicionales, una encima y otra debajo de la hernia dentro del tejido muscular, y una malla de soporte adicional como parte de un kit de la invención descrito anteriormente. El análisis histológico del área de la herida dérmica se muestra en las Figs. 2 a 6A:

La Fig. 2 muestra una vista desde arriba de una parte extirpada de una pared abdominal que incluye un área con una antigua hernia que se ha reparado con un kit de la presente invención que incluye una malla de sostén que porta fibroblastos y una malla de soporte adicional;

La Fig. 3A muestra una sección a través de la pared abdominal de la Fig. 2 a lo largo de la línea A, es decir, a través del área con una antigua hernia;

Las Figs. 3B, 3C muestran secciones detalladas ampliadas de la Fig. 3A con un aumento de 40x y 200x, respectivamente;

La Fig. 4A muestra una sección a través de la pared abdominal de la Fig. 2 a lo largo de la línea B, es decir, adyacente al área con una antigua hernia;

La Fig. 4B muestra una sección detallada ampliada de la Fig. 4A con un aumento de 40x;

La Fig. 5A muestra una sección a través de la pared abdominal de la Fig. 2 a lo largo de la línea C, es decir, a una distancia del área con una antigua hernia; y

La Fig. 6A muestra una sección de detalle ampliada con un aumento de 40x a través de una pared abdominal de un ejemplo comparativo, en el que se reparó una zona de hernia mediante una malla de soporte sin fibroblastos.

Como se muestra en la Fig. 2, la pared abdominal incluye capas de epidermis 20, dermis 22, tejido subcutáneo 24 con células adiposas, tejido muscular 26 y, dentro del área muscular 26, un área con una antigua hernia 28, en la que se habían implantado la malla de sostén y la malla de soporte. Así, un antiguo hueco en el tejido muscular 26 se rellenó con la malla de sostén (y fibroblastos).

Las Figs. 3A a 3C muestran una sección ampliada del área de la antigua hernia 28. Dentro de esta área 28, es visible una masa de tejido 29 que rellena la antigua hernia y está formada, al menos en parte, por la malla de sostén 10 parcialmente degradada. En esta masa 29 se puede observar una población de células similares a las mesenquimales (células alargadas y redondas) 32 dispuestas en haces entrelazados, así como también fibroblastos 16 de forma estrellada a fusiforme con borde relativamente claro, y núcleos ovalados-planos con cromatina granular fina. Se presume que las células mesenquimales 32 proceden del secretoma depositado en la malla de sostén junto con los fibroblastos 16. Mezcladas con las células mesenquimales 32, se observan fibras de colágeno 38. El tejido adiposo 30 es visible bajo la masa 29 de fibroblastos/colágeno/células de tipo mesenquimal. Por encima de la masa 29, es visible una región de reepitelización 40 que separa la masa 29 de varias capas de células epiteliales con hiperqueratosis ortoqueratósica y reepitelización pustular intracorneal. Se pueden observar restos de la malla de soporte 14, por debajo de la masa 29, en el límite del área muscular 26 con el tejido adiposo 30 (Fig. 3C).

Normalmente, los fibroblastos se encuentran en un número mucho menor y principalmente en el área subcutánea. El elevado número y la localización de las células identificadas implican claramente que estas células fibroblásticas 16, con forma estrellada a fusiforme, proceden de la malla de sostén 10 implantada.

La confirmación de los hallazgos anteriores se presenta en las Figs. 4A-6A: Las Figs. 4A y 4B muestran una sección a través de la pared abdominal reparada mostrada en la Fig. 3A-C, aunque el corte no se realiza a través de la antigua hernia 28 sino de forma adyacente a esta. En esta área adyacente, sólo está presente la malla de soporte 14, ya que se dimensionó para revestir no sólo el área de la hernia 28, sino también las áreas adyacentes a su alrededor. La malla de soporte 14 sigue siendo claramente visible por encima y por debajo del área muscular 26. A diferencia de las secciones mostradas en las Figs. 3A-3C, no se observa una malla de sostén.

La Fig. 5A, por otro lado, muestra una sección a través de tejido a una distancia del área de la hernia, es decir, a través del tejido normal de la pared abdominal. Como era de esperar, no se observa ninguna malla de soporte ni ninguna malla de sostén.

La Fig. 6A muestra los resultados de un experimento de control, en el que se implantó una malla de sostén 10 sin fibroblastos para cerrar un defecto de tejido blando en la pared abdominal de una rata. Este experimento de control confirmó que las células de forma estrellada a fusiforme identificadas en las secciones de tejido mostradas en las Figs.

3A-3C (y ausentes en la Fig. 6A) son fibroblastos que no tienen origen en el tejido. Por lo tanto, los resultados histológicos confirman que la presencia de fibroblastos no se debe a los procesos normales de cicatrización de heridas e inflamación, sino que los fibroblastos proceden de la implantación. Además, se ha observado que los fibroblastos introducidos en el defecto de tejido blando con el implante de malla inventiva no sólo permanecen en el lugar de la malla de sostén, sino que migran activamente al tejido huésped adyacente, favoreciendo la formación de colágeno, lo que se presume finalmente conduce a una formación mejorada de la cicatriz.

Por lo tanto, el análisis histológico no sólo ha demostrado la distribución de los fibroblastos implantados dentro del defecto de tejido blando y dentro de la malla de sostén, sino que también el crecimiento interno y la migración de los fibroblastos a los tejidos adyacentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Implante de malla biodegradable para uso en la reparación de tejidos blandos, en particular la reparación quirúrgica de hernias, la cicatrización de heridas crónicas o la reparación de fístulas, dentro del cuerpo de un paciente, comprendiendo el implante de malla

una malla de sostén polimérica porosa, hidrófila y biodegradable (10), y

fibroblastos (16) sobre o dentro de la malla de sostén polimérica,

en el que la malla de sostén (10) comprende una estructura similar a una esponja con poros interconectados de diferentes tamaños,

tiene un ángulo de contacto con el agua inferior a 75, y

está fabricada con al menos un primer polímero que comprende ácido poliláctico como componente principal.

2. Implante como se ha reivindicado en la Reivindicación 1, en el que la malla de sostén polimérica tiene un ángulo de contacto con el agua inferior a 40°, preferentemente inferior a 25°, aún más preferentemente inferior a 15°, lo más preferentemente dentro del intervalo de 0° a 10°.

3. Implante como se ha reivindicado en la Reivindicación 1 o 2, en el que la malla de sostén tiene una forma de lámina plana y es elásticamente deformable para permitir su plegado o enrollado.

4. Implante como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer material polimérico consiste en al menos 70% de ácido poli (láctico), más preferentemente al menos 80% de ácido poli(láctico), o consiste esencialmente en ácido poli(láctico).

5. Implante como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 1 a 4, en el que la malla de sostén polimérica consiste en el primer polímero por sí solo o en el primer polímero y al menos un polímero natural seleccionado del grupo que consiste en colágeno, gelatina, laminina, fibrinógeno, albúmina, quitina, quitosano, agarosa, ácido hialurónico alginato, y sus mezclas, siendo preferente el colágeno.

6. Implante como se ha reivindicado en la Reivindicación 5, en el que la estructura similar a una esponja de la malla de sostén polimérica está revestida con al menos un polímero natural, preferentemente colágeno.

7. Implante como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 1 a 6, en el que la malla de sostén tiene un tiempo de degradación total en el organismo vivo de 1 a 12 meses, preferentemente de 1 a 8 meses, más preferentemente de 1 a 6 meses, lo más preferentemente de aproximadamente 2 a 4 meses.

8. Implante como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 1 a 7, que comprende además factores de crecimiento, preferentemente factores de crecimiento del secretoma mesenquimal placentario.

9. Procedimiento para preparar un implante de malla de acuerdo con una de las Reivindicaciones 1 a 8, por

a) proporcionar una malla de sostén polimérica biodegradable que comprende una estructura similiar a una esponja con poros interconectados de diferentes tamaños, que tiene un ángulo de contacto con el agua inferior a 75° y fabricada con al menos un primer polímero que comprende ácido poliláctico como un componente principal;

b) tratamiento con plasma de la malla de sostén polimérica con un plasma de gas oxidizado a una temperatura inferior a 50°C; y

c) inocular la malla de sostén polimérica con fibroblastos.

10. Procedimiento como se ha reivindicado en la Reivindicación 9, que comprende las etapas de

a) proporcionar una malla de sostén polimérica biodegradable fabricada con un primer polímero que comprende una estructura similar a una esponja con poros interconectados de diferentes tamaños, que tiene un ángulo de contacto con el agua inferior a 75° y fabricada con al menos un primer polímero que comprende ácido poliláctico como un componente principal;

c) tratamiento con plasma de la malla de sostén polimérica tratando la malla de sostén polimérica con un plasma de gas ionizado a una temperatura inferior a 50°C; y

d) inocular la malla de sostén polimérica con fibroblastos.

11. Procedimiento como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 9 y 10, en el que antes de la inoculación con fibroblastos, la malla de sostén polimérica se esteriliza por tratamiento con H²O²a una temperatura inferior a 50°C.

12. Procedimiento como se ha reivindicado en la Reivindicación 14, en el que la etapa de esterilización se lleva a cabo por el tratamiento de la malla de sostén polimérica con un plasma de H²O², o por la exposición de la malla de sostén polimérica a una atmósfera que contiene H²O², a presión en el intervalo de 10 a 0,001 Kpa, más preferentemente en el intervalo de 0,01 a 2,0 Kpa, y durante al menos 1 minuto, preferentemente al menos 5 minutos.

13. Procedimiento como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 9 a 12, que comprende además la etapa de añadir un secretoma que comprende factores de crecimiento a la malla de sostén.

14. Kit de implante para uso en la reparación quirúrgica de heridas, en particular la reparación de fístulas o hernias, dentro del cuerpo de un paciente, el kit de implante incluye

un implante de malla que incluye una malla de sostén polimérica biodegradable que porta fibroblastos como se ha reivindicado en una de las Reivindicaciones 1 a 8, y

una malla de soporte polimérica que comprende uno o más de los polímeros seleccionados del grupo que consiste en ácido poli(glicólico), ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico - ácido láctico) y sus mezclas;

en el que

la malla de sostén polimérica tiene una tasa de degradación más rápida que la malla soporte.

15. Kit de implante como se ha reivindicado en la Reivindicación 14, que incluye además una malla antiadherente que comprende dos capas individuales o integrales consistentes en una capa hidrófila orientada hacia el tejido muscular abdominal, y que tiene un ángulo de contacto con el agua inferior a 75°, preferentemente inferior a 60°, y una capa hidrófoba que tiene un ángulo de contacto con el agua superior a 90°.

16. Kit de implante como se ha reivindicado en la Reivindicación 14 o 15, en el que la malla de soporte tiene una forma de lámina plana y la malla de sostén polimérica tiene una forma de pasta o hidrogel que comprende los fibroblastos.