ES2934850A1 - METODO in vitro PARA EL DIAGNOSTICO DE UNA INFECCION POR Borrelia spp. - Google Patents
METODO in vitro PARA EL DIAGNOSTICO DE UNA INFECCION POR Borrelia spp. Download PDFInfo
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Abstract
Método in vitro para el diagnóstico de una infección por Borrelia sp. La presente invención se refiere a un método in vitro para la detección de Borrelia spp y de Borrelia hispánica y al kit o dispositivo de diagnóstico para llevar a cabo dicho método.
Description
DESCRIPCIÓN
MÉTODO in vitro PARA EL DIAGNÓSTICO DE UNA INFECCIÓN POR Borrelia spp
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la microbiología, y se relaciona con un método in vitro para la detección de Borrelia spp y de Borrelia hispánica mediante una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos y empleando cebadores genéricos para detección simultánea de Borrelia spp e identificación de la especie B. hispánica.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La fiebre recurrente transmitida por garrapatas (FRTG) es una zoonosis causada por espiroquetas del genero Borrelia. El artrópodo vector es una garrapata blanda del genero Ornithodoros que está presente en toda América, África tropical, Asia y Europa. En Europa, el mayor riesgo endémico se encuentra en la Península Ibérica y en países del área mediterránea. En España se han notificado casos en zonas rurales de Andalucía, Castilla y León y Extremadura.
Dentro de su área de distribución, existe una relación especifica entre la especie de Ornithodoros transmisor y la especie de Borrelia infectante. Hay 23 especies validadas de Borrelia relacionadas con la FRTG y existen otras en vías de validación. En España, la especie de Borrelia relacionada con la FRTG ha sido identificada como B. hispanica.
La infección se transmite a los seres humanos cuando la garrapata infectada pica, eliminando borrelias con la saliva o el excremento que liberan mientras se alimenta, con frecuencia su presencia pasa inadvertida, debido a que se alimentan por la noche y su picadura es indolora.
Es una enfermedad de declaración obligatoria en España. En Andalucía, se notificaron un total de 85 casos en el periodo 2003-17, lo que representa el 11% de las enfermedades informadas transmitidas por garrapatas. Las zonas más afectadas fueron Sevilla (67%), seguida de Málaga (17,6%) y Córdoba (10,6%); no obstante, la incidencia de esta enfermedad podría estar subestimada por la baja sospecha y la dificultad en el diagnóstico.
El método más común para la detección de borrelias en sangre es la tinción de las extensiones de sangre finas y/o gruesas con Giemsa para visualizar las espiroquetas al microscopio óptico con el objetivo de inmersión. Dado que se necesita una densidad de al menos 104 espiroquetas/ml en extensiones gruesas y 105 espiroquetas/ml en extensiones finas para identificarlas, la visualización microscópica carece de sensibilidad suficiente para el diagnóstico adecuado de la FRTG. Con el objetivo de aumentar la sensibilidad, se puede realizar una doble centrifugación de la muestra de sangre inoculada en un tubo con heparina. También se han utilizado tubos de capa leucocitica cuantitativa (quantitative buffy coat) recubiertos con naranja de acridina, con posterior centrifugación y observación con microscopio de fluorescencia. Este método es muy sensible pero requiere experiencia técnica e infraestructura en el laboratorio y, además, no identifica la especie de Borrelia. Los procedimientos de diagnóstico prolongados, como el cultivo in vitro y la inoculación de animales, son solo de interés académico.
La serología es de poca utilidad debido a que es un diagnóstico tardío, con falsos negativos porque las espiroquetas de la fiebre recurrente tienen una amplia gama de proteínas de membrana externa que producen secuencialmente, y la respuesta de anticuerpos se puede dar solo frente a algunas de las proteínas incluidas en los ensayos serológicos. También se han detectados algunos casos falsos positivos por reacción cruzada con la sífilis y la enfermedad de Lyme.
La detección molecular ha sido descrita como útil para el diagnóstico de FRTG, incluso sobre muestras con muy baja carga bacteriana, y además ofrece la posibilidad de identificar la especie. Se ha demostrado que la amplificación por PCR y la secuenciación del dominio IGS era un método sensible para la detección de B. hispanica. Además, se han diseñado protocolos de PCR en tiempo real usando sondas taqman® dirigidas frente a un fragmento del gen que codifica para el ARNr 16S que detecta Borrelia spp, y frente a fragmentos específicos de los genes glpQ de B. crocidurae, recN de B. duttonii/recurrentis y recC de B. hispanica. En 2014, se ha publicado la secuencia completa de B. hispanica.
El Área de Gestion Sanitaria de Osuna (AGSO) da asistencia médica a la población situada en una zona geográfica conocida como "La Campilla", localizada al sureste de la provincia de Sevilla. Esta es un área endémica de FRTG. Desde 1994 hasta 2018 se han identificado, mediante visualización de las extensiones de sangre tenidas con Giemsa, 105 casos. Esta serie de casos, la más larga que nosotros conozcamos, presenta considerables variaciones interanuales, la mayor tasa de incidencia se
produjo en el año 2015 (8,7/100.000 hab.) y la más baja en 1995; 2001 y 2012, años en los que, siguiendo la misma metodología, no se observó ningún caso.
La extracción de la muestra se debe hacer en la fase febril que es cuando las borrelias se multiplican en el torrente circulatorio. La espiroquetemia mediante tinción de Giemsa se cuantificó de la siguiente manera: 3+ si se observaban > 5 espiroquetas/campo; 2+ si se observaban 1-5 espiroquetas/campo y 1+ si se observaban <1 espiroqueta/campo. En nuestra serie, la espiroquetemia fue de 1+ / 2+ y las muestras de sangre se negativizaban en uno o dos días, ya que, con el reconocimiento inmunitario, estas bacterias son eliminadas del torrente circulatorio y secuestradas en órganos internos, dando origen a los periodos afebriles intercurrentes. Después de 3 días, la fiebre y los síntomas acompañantes (en nuestra serie y en orden decreciente de frecuencia, cefalea, vómitos, artralgias, dolor abdominal, mialgias y escalofríos) remiten súbitamente, pudiendo reaparecer a la semana hasta 2 o 3 veces. Un exantema en el tronco de 1-2 días de duración ocurrió en el 4% de los enfermos al final del primer episodio febril y conllevo al diagnóstico diferencial con otros procesos exantemáticos. Como complicaciones de la FRTG se han comunicado las hemorragias (petequias, epistaxis, hemoptisis, hematuria y hematemesis), las alteraciones oculares (iritis e iridociclitis) que pueden conducir a disminución permanente de la visión, la traqueobronquitis y miocarditis. La afectación del sistema nervioso central (SNC) en forma de meningitis fue observada en nuestra serie en el 4% de los pacientes.
El diagnostico precoz de esta enfermedad evitaría ingresos hospitalarios prolongados y recaídas, además de prevenir las complicaciones clínicas. También es importante tenerla en cuenta en el diagnóstico diferencial de infecciones exantemáticas y del SNC.
Es necesario, por tanto, desarrollar nuevas técnicas diagnósticas basadas en herramientas moleculares, métodos alternativos que permita mejorar la sensibilidad para integrarlas en algoritmos diagnósticos eficaces de la FRTG.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención proponen un nuevo protocolo de PCR a tiempo real para detectar e identificar simultáneamente y en un mismo tubo de reacción, respectivamente, Borrelia spp. y B. hispánica (especie endémica en nuestro país), en muestras de sangre total.
Los inventores han diseñado una PCR múltiple en tiempo real con sondas Taqman® para la amplificación del fragmento del gen ARNr 16S para detección de Borrelia spp. y del fragmento del gen recC, para detección específica de B.hispanica. La PCR incluye cebadores y sonda para amplificación de un fragmento de la RNAsa P humana, que sirve de control interno de la reacción.
MÉTODOS DE LA INVENCIÓN
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para detectar Borrelia ssp. y, específicamente, identificar cuándo es B. hispanica, en una muestra, donde el método comprende:
i) realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9;
ii) detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i).
donde la detección del producto de amplificación generado en la etapa (i) es indicativo de
Los organismos del género Borrelia en la presente invención son aquellos organismos celulares pertenecientes al superreino Bacteria, Phylum Spirochaetes, Clase Spirochaetia, orden Spirochaetales, familia Borreliaceae.
Se han descrito numerosas especies dentro de este género. Por ejemplo, pero sin limitar, B.anserina, B. brasiliensis, B. caucasica, B. coriaceae, B. crocidurae, B. dugesii, B. duttonii, B. graingeri, B. harveyi, B. hermsii, B. hispanica, B. johnsonii, B. latyschewii, B. lonestari, B. marítima, B.mazzottii, B. merionesi, B. microti, B.
miyamotoi, B. parkeri, B. pérsica, B. recurrentis, B. theilerí, B. tillae, B. turcica, B. turícatae o B. venezuelensis
Alternativamente, Borrelia también se refiere al género de un organismo que tiene una secuencia de nucleótidos homologa de su región de ADN ribosómico con una identidad de al menos 70% con SEQ ID NO: 1, preferiblemente con una identidad de 85-100% con SEQ ID NO: 1, y más preferiblemente con una identidad de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con SEQ ID NO: 1. Incluso más preferiblemente, la secuencia homóloga de su región de ADN ribosómico tiene una identidad del 100% con SEQ ID NO: 1 (Genebank GQ202265 B.hispanica clone 5HOJ12 16S).
SEQ ID NO: 10:
TATGAGATGGGGATAACTATTAGAAATAGTAGCTAATACCGAATAAGGTCAGTTGAGCTGTCAATTGA TGAAAGGAAGCCTTTAAAGCTTCGCTTGTAGATGAGTCTGCGTCTTATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGA GCCTACCAAGGCTATGATAAGTAACCGGCCTGAGAGGGTGAACGGTCACACTGGAACTGAGATACGG TCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCGACA CTGCGT GAACGAAGAAGGT CGAAAGATT GT AAAGTT CTTTT AT AAAT GAGGAAT AAGCTTT GT AGGAA ATGACAAGGTGATGACGTTAATTTATGAATAAGCCCCGGCTAATTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAAGGGGCGAGCGTTGTTCGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTAGGCGGATATGCAAGTCTAT GCGTAAAATACCACAGCTCAACTGTGGAGCTATGCTAGAAACTGCATGACTAGAGTCTGATAGGGGAA GTTAGAATTCCTGGTGTAAGGGTGGAATCTGTTGATATCAGGAAGAATACCAGAGGCGAAGGCGAACT TCTAGGTCAAGACTGACGCTGAGTCACGAAAGCGTAGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC TACGCTGTAAACGATGCACACTTGGTGTTAATCGAGAGGTTAGTACCGAAGCTAACGTGTTAAGTGTGC CGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTGACATATACAGGATGTAGTTAG AGATAACTATTCCCCGTTTGGGGTCTGTATACAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCTGTGAGG TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTCTGTTACCAGCATGTAAAGATGGGGACTCA GACGAGACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAATCATCATGGCCCTTATGTCC TGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCTGTACAAAGCGATGCGAAACAGTGATGTGAAGCAAAACGCAT AAAGCAGGTCTCAGTCCAGATTGAAGTCTGAAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTA TATCAGAATGATACGGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACCCGAGTTGAG GATACCCGAAGCTAT
El término "identidad", como se usa en este documento, se refiere a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos secuencias de nucleótidos cuando se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica e incluyen, entre otros, BLASTP o BLASTN y FASTA (SF Altschul et al. "Basic Local Alignment Search Tool” , J. Mol Biol. 1990, 215,403-410.
El término "secuencia de nucleótidos homóloga", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que es equivalente al fragmento de ADN ribosómico de la
secuencia SEQ ID NO: 1 de Borrelia, preferiblemente B. hispánica. La expresión "una secuencia que es equivalente" significa una secuencia de nucleótidos que está dentro de la subunidad 16S (o subunidad equivalente en esa especie de Borrelia en particular) y realiza la misma función. El experto en la materia puede identificar estas regiones equivalentes con protocolos de rutina.
El término "% de identidad", como se entiende en esta invención, se refiere al% de identidad entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El% de identidad es un recuento del número de posiciones a lo largo de la alineación de dos secuencias donde todos los nucleótidos o aminoácidos en esa posición son idénticos. El% de identidad se calcula en base a secuencias homólogas de la misma longitud.
En la presente invención, se entiende por “ácido nucleico” a la repetición de monómeros llamados nucleótidos, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Existen dos tipos de ácidos nucleicos: ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico). Adicionalmente, de forma artificial, a partir de ARN se puede obtener ADN complementario (ADNc) que también se considera un ácido nucleico. Por tanto, en la presente invención, se entiende por “preparación de ácidos nucleicos” al conjunto de ácidos nucleicos, es decir, ADN y/o ADNc procedente de la retrotranscripción del ARN presentes en una preparación que va a ser sometida a una reacción de amplificación. En la presente invención se entiende por “ADN” al material genético de los organismos vivos que controla la herencia y se localiza en el núcleo o en las mitocondrias de las células. En la presente invención se entiende por “ARN” a la molécula resultado de la transcripción de una secuencia de ADN. En la presente invención, se entiende por “ADNc” al ADN obtenido a partir del ARNm por acción de la retrotranscriptasa inversa.
El ácido nucleico de la invención puede contener una o más modificaciones en las nucleobases, en los azúcares y/o en los enlaces entre nucleótidos. Las modificaciones a uno o más residuos del esqueleto de los ácidos nucleicos pueden comprender una o más de las siguientes: modificaciones del azúcar en 2’ tal como 2’-O-metil (2’-OMe), 2’-O-metoxietil (2’-MOE), 2’-O-metoxietoxi, 2’- fluoro (2’-F), 2’-allil, 2’-O-[2-(metilamino)-2-oxoetil], 2’-O-(N-metilcarbamato); modificaciones del azúcar en 4’ incluyendo 4’-tio, puente 4’-CH2-O-2’, puente 4-(CH2)2-O-2’; ácido nucleico cerrado (LNA, locked nucleic acid); ácido péptido nucleico (APN); ácido nucleico intercalante (INA); ácido nucleico intercalante enrollado (TINA); ácidos nucleicos de hexitol (HNA); ácido arabinonucleico (ANA); ácidos ciclohexano nucleicos (CNA); ácido ciclohexenilnucleico (CeNA); ácido treosil nucleico (TNA); oligonucleótidos morfolinos; Gap-meros; Mixmeros; incorporación de péptidos ricos en arginina; adición de 5’-fosfato a ARN sintéticos; o cualquier combinación de los mismos.
Las modificaciones a uno o más enlaces de nucleósidos de los ácidos nucleicos pueden comprender una o más de las siguientes: fosforotioato, fosforamidato, fosforodiamidato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato y fosforanilidato, o cualquier combinación de los mismos.
Un ácido nucleico cerrado (LNA), con frecuencia denominado ARN inaccesible, es un nucleótido de ARN modificado. El grupo ribosa de un nucleótido LNA se modifica con un puente extra que une los carbonos 2’ y 4’ (puente O2’,C4’-metileno). El puente "cierra” la ribosa en la conformación estructural 3’-endo, que con frecuencia se encuentra en la forma A del ADN o ARN. Los nucleótidos LNA se pueden mezclar con bases de ADN o ARN en el ácido nucleico cuando se desee. Tales oligómeros están comercialmente disponibles. La conformación cerrada de la ribosa aumenta el apilamiento de bases y pre-organización del esqueleto. Esto aumenta significativamente la estabilidad térmica (temperatura de fusión) y la afinidad de hibridación de ácidos nucleicos modificados con LNA, además de tener capacidades mejoradas en la discriminación a malos emparejamientos. Estas propiedades los hacen muy útiles para técnicas antisentido. Además, los oligonucleótidos LNA anti-miR se han probado en primates con resultados esperanzadores y baja toxicidad.
Un ácido péptido nucleico (APN) es un polímero artificialmente sintetizado similar a ADN o ARN y se usa en investigación biológica y tratamientos médicos. No se sabe que el APN se produzca de forma natural. EL ADN y ARN tienen un esqueleto de azúcar de desoxirribosa y ribosa, respectivamente, mientras que el esqueleto de APN está compuesto de unidades repetitivas de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos. Las diferentes bases de purina y pirimidina están unidas al esqueleto por enlaces metilen-carbonilo. Los APN se representan como péptidos, con el N-terminal en la primera posición (izquierda) y el C-terminal a la derecha. Puesto que el esqueleto del APN no contiene grupos fosfato cargados, la unión entre las hebras APN/ADN es más fuerte que entre las hebras ADN/ADN debido a la falta de repulsión electrostática. Las moléculas de bases mezcladas de APN son imitadores verdaderos de las moléculas de ADN en términos de reconocimiento de pares de bases. La unión APN/APN es más fuerte que la unión APN/ADN.
Un ácido nucleico intercalante (INA) es un análogo de ácido nucleico modificado que comprende desoxirribonucleótidos normales unidos covalentemente a inserciones hidrofóbicas. El INA tiene una gran afinidad por el ADN complementario con
estabilización de hasta 11 grados para cada modificación. El INA tiene mayor especificidad por una diana completamente apareada sobre dianas mal apareadas que el ADN normal. Utilizando que los INA tienen mayor afinidad por ADN hace posible usar sondas más cortas y aumentar así la especificidad incluso más. Además, un INA es un análogo oligonucleotídico selectivo de ADN, con una capacidad única para discriminar entre ADN y ARN. Incluso aunque los INA tienen altas afinidades para ADN complementario, tiene una menor afinidad por una secuencia complementaria de INA complementarios. Los ácidos nucleicos intercalantes enrollados se denominan TINA.
Los ácidos nucleicos de hexitol (HNA) son nucleótidos construidos de nucleobases naturales y un esqueleto 1,5-anhidrohexitol fosforilado. Las asociaciones moleculares entre HNA y ARN son más estables que entre HNA y ADN y entre ácidos nucleicos naturales (ADNbc, ARNbc, ADN/ARN). Otros oligonucleótidos sintéticamente modificados comprenden ANA (ácido 5 arabinonucleico), CNA (ácidos ciclohexano nucleicos), CeNA (ácido ciclohenexilnucleico) y TNA (ácido treosilnucleico).
Los morfolinos son moléculas sintéticas que son el producto de un rediseño de la estructura natural del ácido nucleico. Estructuralmente, la diferencia entre morfolinos y ADN o ARN es que mientras los morfolinos tienen nucleobases estándar, esas bases están unidas a anillos de 6 miembros de morfolina en lugar de a anillos de desoxirribosa/ribosa y los enlaces fosforodiamidato no iónicos entre las subunidades reemplazan los enlaces fosfodiéster aniónicos. Los morfolinos se denominan algunas veces PMO (oligonucleótido fosforodiamidato de morfolino). El anillo de morfolina de 6 miembros tiene la fórmula química O-(CH2-CH2)2-NH.
Los gapmeros son sondas oligonucleotídicas quiméricas de ARN-ADN-ARN, donde se
insertan ventanas o ‘huecos’ (‘gaps’) de ADN en un oligonucleótido de ARN de otra manera normal o modificado. Esta modificación aumenta la estabilidad del oligonucleótido in vivo y la avidez de la interacción de la sonda con la diana, de modo que se pueden usar sondas más cortas de forma eficaz.
Como entiende el experto en la materia, la detección de Borrelia a partir del ARN implica la existencia de células viables de Borrelia en la muestra analizada. Por tanto, la puesta en práctica del método de la invención permitiría no sólo detectar Borrelia (si la muestra de partida es una preparación de ADN genómico), sino también detectar exclusivamente células viables de Borrelia presentes en la muestra analizada (si la muestra de partida es una preparación de ADNc obtenida a partir de una preparación
ARN de Borrelia. El método de la invención requiere la extracción del ácido nucleico de una muestra. Las distintas técnicas de la extracción de ácidos nucleicos son ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3). Adicionalmente, existen kits de extracción de ácidos nucleicos comercialmente disponibles para realizar dicha extracción.
El método de la invención comprende una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos. Como entiende el experto en la materia, una reacción de amplificación consiste, básicamente, en la multiplicación exponencial de una molécula de ADN diana (o de una región diana de una molécula de ADN) mediante el empleo de oligonucleótidos que hibridan con las regiones que flanquean la región diana que se quiere amplificar. Las diferentes técnicas o procedimientos de llevar a cabo reacciones de amplificación están ampliamente descritas en el estado de la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001. (supra.). Ejemplos de reacciones de amplificación son, sin limitarse a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y variaciones de la misma [amplificación regional de la reacción en cadena de la polimerasa (RA-PCR, del inglés Regional Amplification PCR), la reacción en cadena de la polimerasa a Tiempo Real (RT-PCR del inglés Real Time PCR, etc.] El protocolo seguido para llevar a cabo una PCR es ampliamente conocido en el estado de la técnica y actualmente, existen kits comerciales que contienen los materiales necesarios para llevar a cabo dicha amplificación. Asimismo, las condiciones de temperatura, tiempo, concentraciones de reactivos y número de ciclos de la PCR dependerán de la ADN polimerasa utilizada en la reacción de amplificación, de la especificidad de los cebadores, etc. Si se emplea un kit comercial, las condiciones de la reacción serán las especificadas por el fabricante del kit. Así, en un modo de realización particular de la invención, la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a Tiempo Real. Una reacción de PCR a Tiempo Real es, básicamente, una PCR convencional en la que los equipos de amplificación (termocicladores) llevan incorporados un sistema de detección de fluorescencia, basándose dicha detección en la utilización de unas moléculas específicas.
Como entiende el experto en la materia, una reacción de amplificación requiere el empleo de una pareja de oligonucleótidos, denominados cebadores, que van a hibridar con la región/secuencia diana que se quiere amplificar. En el caso concreto del presente método, la región diana a amplificar es una región del gen ARNr 16S con los cebadores SEQ ID 1-3, una región del gen recC de B. hispanica con los cebadores
SEQ ID 4-6 y una región del gen de la RNasa P humana con los cebadores SEQ ID 7 9. La base indicada con el símbolo A se refiere a adenina. La base indicada con el símbolo G se refiere a guanina. La base indicada con el símbolo C se refiere a citosina. La base indicada con el símbolo T se refiere a timina. La base indicada con el símbolo U se refiere a uracilo. La base indicada con el símbolo R se refiere a guanina (G) o a adenina (A), es decir, se refiere a una purina. La base indicada con el símbolo Y se refiere a timina (T)/uracilo (U) o a citosina (C), es decir, se refiere a una pirimidina. La base indicada con el símbolo W se refiere a adenina (A) o a timina (T)/ uracilo (U), es decir, se refiere a bases que establecen interacciones débiles por 2 puentes de hidrógeno. La base indicada con el símbolo S se refiere a guanina (G) o a citosina (C), es decir, se refiere a bases que establecen interacciones fuertes por 3 puentes de hidrógeno.
En el contexto de la presente invención, los parámetros de ciclado comprenden una incubación a 90-100°C por 5-10 minutos; 20-50 ciclos de 90-100°C por 5-20 segundos, 50-60°C por 5-40 segundos y 70-75°C por 5 -40 segundos y por último una extensión final de 70-75°C por 3-10 minutos. En un modo de realización particular de la invención, los parámetros de ciclado para la reacción de amplificación comprenden una incubación a 95°C por 10 minutos; 45 ciclos de 95°C por 15 segundos, 52°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos y por último una extensión final de 72°C por 5 minutos.
Una vez llevada a cabo la reacción de amplificación es necesario detectar los productos de amplificación o amplicones. Nuevamente, las técnicas para detectar los productos de amplificación están ampliamente descritos en el estado de la técnica, como por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 (citado at supra). En dicha detección puede emplearse cualquiera de los procedimientos de identificación de fragmentos de amplificación conocidos del estado de la técnica, tales como hibridación con sondas marcadas (por ejemplo con un fluoróforo), o tinción con moléculas de tinción de ácidos nucleicos, como por ejemplo, tinción de plata, tinción con agentes intercalantes (i.e., bromuro de etidio, SYBR Green®, etc.). Como es conocido del estado de la técnica, si el método de amplificación elegido es una PCR a tiempo real, la detección del producto de amplificación se realiza simultáneamente a la reacción de amplificación. Para ello, pueden emplearse tanto mecanismos de detección no específicos como específicos. Los mecanismos de detección no específicos detectan todos los ADN de doble cadena producidos durante la reacción de amplificación (ya sea un producto específico, un producto inespecífico o dímeros de cebadores). Este mecanismo es el
método estándar y básicamente consiste en añadir un agente intercalante de la doble cadena o un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a esta.
Así, en una realización particular, la detección del producto de amplificación se lleva a cabo mediante una molécula de tinción de ácidos nucleicos, preferiblemente un agente fluorescente. En un modo de realización particular, la detección del producto de amplificación se lleva a cabo mediante un fluoróforo. En un modo de realización todavía más particular, la molécula de tinción de ácidos nucleicos es (FAM: verde cuando es positivo; HEX: naranja cuando es positivo; y Cy5: azul cuando es positivo).
En el contexto de la presente invención, se considera que se detecta el producto de amplificación en PCT a tiempo real cuando el valor de intensidad de la señal (por ejemplo, el valor de intensidad de fluorescencia) supera el valor umbral de intensidad de la señal (por ejemplo, el valor umbral de fluorescencia). El punto donde el valor de intensidad de la señal correspondiente a la muestra cruza el valor umbral se llama ciclo umbral (Ct por su nombre en inglés, “threshold cycle”). Es decir, el ciclo umbral, también conocido como Cp ("Crossing point') o Ct ("Threshold point') es el punto en el cual la fluorescencia de la reacción sobrepasa la fluorescencia basal (umbral o "threshold"), y se considera como el punto en el cual la reacción de amplificación da comienzo. El ciclo umbral es inversamente proporcional al número de copias de la diana a detectar, es decir, a mayor concentración de la diana a detectar, menor será el valor del ciclo umbral. En el caso de utilizar una misma muestra de partida que tenga la misma concentración de la diana a detectar, el valor de Ct se puede usar como medida para discriminar la sensibilidad de distintos métodos (o de distintas parejas de cebadores cuando el método es el mismo). En este caso, el método o la pareja de cebadores que proporcione los valores de Ct más bajos en PCR a tiempo real es más sensible.
En el contexto de la presente invención, la preparación de ácidos nucleicos se deriva de una muestra de un paciente. El término “muestra” o “muestra biológica” significa material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para determinar la presencia de Borrelia ssp. La muestra se puede aislar de cualquier tejido o líquido biológico adecuado. En un modo de realización, la muestra es una muestra clínica de sangre.
En el contexto de la presente invención, el término “paciente” o “sujeto” se refiere a un ser humano de cualquier edad o raza.
Un segundo aspecto de la invención un método in vitro para el diagnóstico de una infección por Borrelia ssp en un paciente y, específicamente, identificar cuándo es B. hispánica, donde el método comprende:
i) realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de una muestra del paciente empleando los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9;
ii) detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i),
donde la detección del producto de amplificación generado en la etapa (i) es indicativo de
Como se usa en el presente documento, "método de diagnóstico" se refiere a evaluar la probabilidad según la cual un sujeto padece una infección por Borrelia ssp. Como seguramente entenderá un experto en la materia, dicha evaluación puede no ser correcta para el 100% de los sujetos a diagnosticar, aunque preferiblemente lo sea. En un modo de realización particular, la evaluación es correcta para al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% de los sujetos a diagnosticar. En cualquier caso, el término requiere poder identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos que padecen dicha infección. El experto en la materia puede determinar si una parte es estadísticamente significativa utilizando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, mediante la determinación de intervalos de confianza, la determinación del valor p, la prueba t de
Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Información y detalles sobre dichas herramientas se pueden encontrar en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% al menos 95%. Los valores de p son preferiblemente 0,05, 0,025, 0,001 o menos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la muestra es una muestra de sangre.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real (qPCR).
Todos los términos y modos de realización descritos en esta parte o en cualquier otra parte del presente documento son igualmente aplicables a cualquiera de los métodos de la invención.
KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN Y USOS DEL KIT
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo para el diagnóstico de una infección por Borrelia ssp en un paciente, y la identificación específica de B. hispánica, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9.
En el contexto de la presente invención, el término "kit” se entiende como un producto o dispositivo que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención embalados para permitir su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para embalar los componentes del kit incluyen cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares. Además, los kits de la invención pueden contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que están en el kit. Dichas instrucciones pueden estar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones de modo que puedan ser leídas por un sujeto, tal como medios de almacenamiento electrónico (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CDROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de Internet que proporcionan dichas instrucciones. Los reactivos para uso en los métodos de la invención se pueden formular como un "kit” y, por tanto, se pueden combinar con uno o más de otros tipos de elementos o componentes (por ejemplo, otros tipos de
reactivos bioquímicos, envases, paquetes tal como embalaje pretendido para venta comercial, sustratos a los que están unidos los reactivos, componentes de hardware electrónicos, etc.).
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, para la detección de Borrelia ssp. y la identificación específica de B. hispánica.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, para el diagnóstico de una infección por Borrelia ssp. en un paciente, que permite identificar específicamente B. hispanica.
AUTOMATIZACIÓN DEL MÉTODO DE LA INVENCIÓN IMPLEMENTÁNDOLO EN UN PROGRAMA DE ORDENADOR
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con el método de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en
práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.
El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Material y Métodos
Se disponía de 46 muestras de sangre total congeladas desde enero de 2014 hasta marzo de 2019 en el Hospital de la Merced de Osuna (HLM) con Giemsa positivo y de 22 muestras congeladas con Giemsa negativo pertenecientes a enfermos diagnosticados o sospechosos de padecer una FRTG. Nueve muestras con espiroquetemias habían sido enviadas en 2014 al Centro Nacional de Microbiología (CNM) siendo identificadas como B. hispánica.
Desde el 21/05/2019 hasta el 30/11/2019 y desde el 01/05/2020 hasta el 10/09/2020 se incorporaron al estudio 157 muestras de sangre total de pacientes de AGSO (Área de Gestión Sanitaria de Osuna), con exclusión de los ingresados en UCI, que presentaban fiebre y los criterios analíticos prefijados de neutrofilia (>65%) plaquetopenia (< 200.000/mm3) Proteína C Reactiva (>70 mg/L).
Se utilizó la tinción con Giemsa al 10% de las extensiones de sangre para identificar las muestras en las que se observaban las espiroquetas.
Se realizó la extracción de ácidos nucleicos de las 225 muestras recopiladas con el sistema automatizado MagNAPure Compact (Roche Diagnostics).
Se puso a punto una técnica de PCR múltiple con diferentes protocolos de amplificación, mezclas maestras y combinaciones de concentraciones de cebadores y
sondas, usando alícuotas de ADN de una muestra positiva. Se diseñó una PCR múltiple en tiempo real con sondas Taqman® para incluir en el mismo tubo la amplificación del fragmento del gen ARNr 16S para detección de Borrelia spp. y del fragmento del gen recC, para detección específica de B. hispánica, así como los cebadores y sonda para amplificación de un fragmento de la RNAsa P humana, (https://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/CDCrealtimeRTPCRprotocol_ 20090428.pdf), que sirve de control interno de la reacción.
Las sondas Taqman® de las 3 dianas de la PCR múltiple están marcadas en 5’ con los fluoróforos HEX, 6- FAM y Cy5, y en 3’ con los quenchers BHQ1 para las sondas HEX y 6-FAM y BHQ3 para la sonda Cy5. Se valida como positiva una curva con amplificación aceptada y Ct <39.
Tabla 1. Cebadores y sondas para PCR multiplex de Borrelia productora de FRTG
Para realizar ensayos de validación de la técnica, se procedió a la extracción de los ácidos nucleicos de las muestras congeladas de sangre-EDTA positivas por microscopia con el sistema automatizado MagNAPure Compact y el kit MagNAPure Compact Total Nucleic Acid Isolation I (Roche). Los parámetros que se programan en el equipo para la extracción son:
• Protocoí: “Total NA Plasma external lysis V3-2”
• Sampíe voíume: 600 (250 pL muestra 350 pL buffer de lisis)
• Eíution voíume: 50 pL
• Seleccionar en Sampíe materiaí: Blood
• Internal Control Volume: None
Se puso a punto la técnica con diferentes protocolos de amplificación, mezclas maestras y combinaciones de concentraciones de cebadores y sondas de la PCR múltiple, usando alícuotas de ADN de una muestra positiva. Finalmente optamos por el siguiente protocolo:
1. Se preparó una mezcla de cebadores y sondas (tabla 2).
Tabla 2. Preparación de la mezcla de cebadores y sondas
2. Se preparó la mezcla maestra de PCR con el reactivo genérico LightCycler® FastStart DNA Master plus Hybprobe y la mezcla de cebadores y sondas para cada muestra o control en tubos de PCR de 0,2 ml, según la tabla 3.
Tabla 3. Preparación de la mezcla maestra de reacción
Como control negativo se utilizó agua grado PCR y como control positivo ADN de Borrelia hispánica (previamente extraído de una muestra positiva).
3. El protocolo de amplificación fue el siguiente: 95°C durante / 10 minutos, 45 ciclos de 95°C/15 segundos 52°C/30 segundos, 72°C/30 segundos.
4. Interpretación de resultados. Para la interpretación de los resultados, se deben analizar las curvas de amplificación y los Ct (cycle threshold, ciclo umbral de fluorescencia), y validar como positiva los resultados con curva típica y Ct<39 (Tabla 4).
Tabla 4. Interpretación de resultados
Se creó una base de datos con la identificación de las muestras, los resultados de la microscopía óptica y de la PCR y los valores analíticos (porcentaje de neutrófilos, número de plaquetas y Proteína C reactiva) de las muestras procesadas.
Se recogieron las características epidemiológicas y analíticas de los casos clínicos detectados:
-Sexo (H/M)
-Edad (Años)
-Residencia (Rural/Urbana)
-Ocupación (Actividades agrícolas/ Otras)
-Antecedente de picadura de garrapata (Si/No)
-Lugar de exposición (si antecedente de picadura de garrapata)
-Variables clínicas: fiebre (>38,5°C), escalofríos, cefalea, dolor abdominal, vómitos, artralgias, mialgias.
-Criterios analíticos: porcentaje de neutrófilos en el hemograma; número de plaquetas/mm3 en el hemograma, proteína C Reactiva (mg/L) en la bioquímica -Giemsa: presencia de Borrelia/o no presencia, recuento de espiroquetas/campo -PCR: presencia de Borrelia/o no presencia, B. hispanica/no hispánica
Los equipos utilizados para la realización de la PCR múltiple a tiempo real fueron el CFX96 (Bio-Rad) en el Hospital Virgen de las Nieves (HVN) y el cobas z 480 (Roche) en el HLM.
Resultados
Sensibilidad
La técnica de PCR diseñada mostró una sensibilidad del 100% en la identificación de B. hispanica cuando se comparó con los resultados obtenidos por el Centro Nacional de Microbiología en las 9 muestras enviadas por el HLM en 2014 y conservadas congeladas y en otras 53 muestras positivas por Giemsa.
Especificidad
Se observó una especificidad del 100% cuando se realizaron estudios con ADN y ARN de cepas bacterianas, de levaduras y virales de la colección del laboratorio (tabla 5).
Tabla 5. Resultado de la PCR en ADN y ARN de otros microorganismos
Validación analítica
Elegimos una muestra con un Ct bajo para ambas dianas (Borrelia spp y B.hispanica) e hicimos diluciones para obtener volumen suficiente para hacer alícuotas de ADN suficientes para realizar 20 determinaciones en una sola ejecución y otras 20 determinaciones en 20 ejecuciones en diferentes días, para el cálculo del error intraensayo e inter-ensayo, respectivamente. El error intraensayo calculado fue < 1% y el inter-ensayo < 1,5%
Se realizó la comparación de la técnica en dos equipos de PCR en tiempo real: CFX96 (Bio-Rad) y cobas z 480 (Roche), no obteniéndose diferencias entre ambos.
Los resultados obtenidos tras el análisis de las muestras positivas conservadas desde el año 2014 hasta marzo de 2019 y las obtenidas desde mayo de 2019 hasta septiembre de 2020, a través de la regla informática que captaba todas las muestras que cumplían los requisitos de laboratorio y clínicos establecidos, aparecen en la Tabla 6.
Tabla 6. Resultados obtenidos en el ensayo de las 225 muestras
aTodas las muestras con PCR positivas para Borrelia spp. fueron identificadas por PCR como B. hispánica
*18 PCR positivas de 12 pacientes, de los cuales, 8 fueron diagnosticados por PCR y 4 eran pacientes con Giemsa anteriormente positivo que, con los días de evolución, se habían negativizado.
La PCR permite detectar B.hispanica en pacientes con espiroquetemias más bajas, y hasta 12 días después del inicio de los síntomas (hasta 3 días con microscopia).
Características demográficas, epidemiológicas, clínicas y analíticas de los 57 pacientes confirmados
Las características demográficas, epidemiológicas, clínicas y analíticas de los 57 pacientes diagnosticados con esta PCR múltiple en tiempo real se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7. Variables clínicas, demográficas, epidemiológicas y analíticas de los casos diagnosticados por PCR
V a r ia b le s N = 57
S ín to m a s n (%)
Fiebre (>38.5°C) 57 (100)
Cefalea 27 (47,4)
Vómitos 24 (42,1)
D olor abdominal 19 (33,3)
Artralgias 16 (28,1)
M ialgias 15 (26,3)
Escalofríos 10 (17,5)
D e m o g r á f ic a s y E p id e m io ló g ic a s n (%)
Sexo Hombre, n (%) 34 (59,6)
Edad (años)* 37 (25-52)
Residencia rural, n (%) 44 (77,2)
A ctividad agrícola/ganadera, n (%) 11 (19,3)
A ntecedente picadura garrapata, n (%) 12 (21,0)
H a lla z g o s a n a lít ic o s
Plaquetas, m il/mm3* 67,5 (37-110)
Throm bocitopenia (<130,000/m m 3), n (%) 47 (82,4)
Neutrofilos (%)* 77,2 (73,7-81,9)
Neutrofilia (>65% ), n (%) 55 (96,5)
Proteína C Reactiva (mg/L) * 284,4 (221,7-341,5)
E levación Proteína C Reactiva (>5 mg/L), n (%) 57 (100)
*mediana (rango interquartilico).
Claims (7)
1. Un método para detectar Borrelia ssp. y, específicamente, identificar cuándo es B. hispánica, en una muestra, donde el método comprende:
iii) realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de dicha muestra empleando los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9;
iv) detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i).
donde la detección del producto de amplificación generado en la etapa (i) es indicativo de
2. Un método in vitro para el diagnóstico de una infección por Borrelia ssp en un paciente, específicamente, identificar cuándo es B. hispánica, donde el método comprende:
iii) realizar una reacción de amplificación a partir de una preparación de ácidos nucleicos derivada de una muestra del paciente empleando los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9;
iv) detectar el producto de amplificación generado en la etapa (i),
donde la detección del producto de amplificación generado en la etapa (i) es indicativo de
3. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la muestra es una muestra de sangre.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente qPCR.
5. Un kit o dispositivo para el diagnóstico de una infección por Borrelia ssp en un paciente, y la identificación específica de B. hispánica, que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9
6. - El uso del kit o dispositivo según la reivindicación 5, para la detección de Borrelia ssp. y la identificación específica de B. hispánica.
7. - El uso del kit o dispositivo según la reivindicación 5, para el diagnóstico de una infección por de Borrelia ssp. en un paciente, que permite identificar específicamente B. hispanica.
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|---|---|---|---|
| ES202130807A ES2934850A1 (es) | 2021-08-24 | 2021-08-24 | METODO in vitro PARA EL DIAGNOSTICO DE UNA INFECCION POR Borrelia spp. |
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| EP3305917A1 (en) * | 2014-10-01 | 2018-04-11 | Arcis Biotechnology Holdings Limited | Methods and kits |
-
2021
- 2021-08-24 ES ES202130807A patent/ES2934850A1/es not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|
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| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2934850 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20230227 |
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