ES2933979T3

ES2933979T3 - Inmunoensayo para un sistema automatizado

Info

Publication number: ES2933979T3
Application number: ES19719530T
Authority: ES
Inventors: Benita-Andrea Johannsen; Vanessa Klein; Konstantinos Mitsakakis
Original assignee: Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Current assignee: Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2023-02-15
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: US20210055289A1; EP3788372A1; CN112074739A; WO2019211218A1; AU2019264344A1; EP3788372B1

Abstract

La invención se refiere a un método para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende los pasos secuenciales de (a.) incubar al mismo tiempo en una solución tampón en un pocillo de reacción (i.) la muestra que se sospecha que contiene uno o más objetivos moléculas de captura, (ii.) moléculas de captura acopladas en fase sólida adecuadas para unirse a las moléculas objetivo, donde las moléculas de captura están acopladas a perlas (perlas de captura), (iii.) una cantidad definida de moléculas de detección adecuadas para unirse al objetivo moléculas de captura y/o las moléculas de captura, donde las moléculas de detección están acopladas a perlas (perlas de detección), donde las perlas de captura son separables de las perlas de detección, (b.) separar en el pozo de reacción las perlas de captura de las solución tampón que comprende perlas de detección no unidas, y (c.) detectar las perlas de detección no unidas restantes en la solución tampón, que se ha separado de las perlas de captura, en el que el método no comprende una etapa de lavado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoensayo para un sistema automatizado

La invención se refiere a un método para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende las etapas secuenciales de (a.) incubar al mismo tiempo en una solución tampón en un pocillo de reacción (i.) la muestra que se sospecha que contiene uno o más objetivos moléculas de captura, (ii.) moléculas de captura acopladas en fase sólida adecuadas para unirse a las moléculas objetivo, en donde las moléculas de captura están acopladas a perlas (perlas de captura), (iii.) una cantidad definida de moléculas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura, en donde las moléculas de detección están acopladas a perlas (perlas de detección), en donde las perlas de captura pueden separarse de las perlas de detección, (b.) separar en el pocillo de reacción las perlas de captura de las solución tampón que comprende las perlas de detección no unidas, y (c.) detección de las perlas de detección no unidas restantes en la solución tampón, que se ha separado de las perlas de captura, en donde la detección de las perlas de detección no unidas restantes se produce en el mismo pocillo de reacción que la incubación y separación, en donde el método no comprende una etapa de lavado.

Antecedentes de la invención

Existe una creciente necesidad de pruebas diagnósticas rápidas, específicas y sensibles en el sitio donde se realiza el manejo del paciente, especialmente en casos de emergencias o toma de decisiones en las que el tiempo es crítico. Por ejemplo, uno de los grandes desafíos de la atención médica surge con el aumento de bacterias resistentes a los antimicrobianos (AMR), donde se supone que una de las principales causas es el uso excesivo de antibióticos para enfermedades febriles agudas [1]. Un gran paso para disminuir el problema de AMR es el uso de una prueba de diagnóstico rápido que también puede distinguir entre infecciones bacterianas y virales [1].

Para esto puede usarse la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), sin embargo, es un procedimiento que incluye una tediosa preparación de muestras en su configuración manual. Además, solo un número muy limitado de plataformas ofrece paneles verdaderamente multipatógenos. Además, la NAAT tiene como objetivo diagnosticar específicamente el patógeno, mientras que para la primera decisión de prescripción si se necesitan antibióticos, solo es importante diferenciar entre infección viral o bacteriana.

Por otro lado, los marcadores proteicos como la proteína C reactiva (CRP) y la procalcitonina (PCT) se han usado a menudo como indicadores de sepsis y/o inflamación en general (CRP) [2], [3], [4]. Especialmente en el caso de sepsis, es de vital importancia que el resultado se obtenga lo más rápido posible, para evitar complicaciones graves y una prescripción inadecuada de antibióticos. Estudios recientes indican que la inclusión de más de un marcador proteico y la coevaluación de sus niveles en el procedimiento de diagnóstico puede tener un gran impacto en el diagnóstico diferencial entre infecciones bacterianas y virales y, en consecuencia, la disminución de la prescripción innecesaria de antibióticos [5]. En el diagnóstico del cáncer, el uso de biomarcadores de proteínas está aumentando gradualmente, ya sea en el laboratorio o en el punto de necesidad, donde la detección de biomarcadores permite una detección y un tratamiento más personalizados del paciente [6]. Algunos ejemplos indicativos de biomarcadores son: antígeno prostático específico (PSA) en el cáncer de próstata [7], y CA 15-3, CA 125 y sHER2 en el cáncer de mama [8].

En las enfermedades cardiovasculares, nuevamente, los síntomas tales como el dolor en el pecho o en la espalda a menudo son fáciles de malinterpretar, por lo que se pierde la oportunidad de visitar una clínica. La complejidad de las enfermedades cardiovasculares requiere la detección de marcadores multipanel [9].

Además, en el campo de las infecciones orales, la monitorización de la flora bacteriana de la cavidad oral se realiza típicamente mediante identificación de bacterias (NAAT). Sin embargo, se ha demostrado que la detección y caracterización (semi)cuantitativa de biomarcadores de proteínas del huésped es un factor importante a coevaluar con la flora bacteriana, contribuyendo de esta manera al seguimiento personalizado del paciente a largo plazo. Se han identificado varios biomarcadores para la periodontitis, que deben monitorearse como un panel de múltiples marcadores para un monitoreo personalizado confiable [10].

La implementación de la detección de marcadores de proteínas antes mencionadas a través de inmunoensayos se puede realizar típicamente en un laboratorio central. Sin embargo, por razones que tienen que ver con la reducción de costes y evitar el transporte de muestras desde el punto de recogida hasta el punto de análisis, es muy deseable que estas pruebas se integren en plataformas y se realicen de forma totalmente automatizada, preferentemente en una manera que el usuario solo agregue la muestra. Las pruebas completamente automatizadas también permiten la implementación fuera de un laboratorio central en entornos de punto de atención (PoC) donde el nivel de experiencia del usuario puede variar de bien a poco capacitado. Estas pruebas PoC totalmente automatizadas también incluyen biomarcadores de última generación para el campo de aplicación previsto, lo que aumenta de esta manera la calidad del diagnóstico del paciente.

Los inmunoensayos para un sistema automatizado deben tener las siguientes propiedades, que son elementos clave para crear sistemas automatizados que también puedan usarse en el punto de atención:

• Etapas mínimas del flujo de trabajo (para permitir posteriormente una complejidad mínima en el sistema automatizado)

• Número mínimo de reactivos

• Corto tiempo de incubación

• Potencial para resultados cuantitativos

• Potencial de adaptación a formato múltiple, incluso cuando los diferentes marcadores están presentes en intervalos de concentración clínica muy diferentes

• Flexibilidad y fácil adaptabilidad para detectar marcadores que requieren diferentes especificaciones de ensayo

El primer inmunoensayo se describió en 1959 [11]. Desde entonces, se puede encontrar una amplia variedad de publicaciones y patentes sobre el tema de los procesos y aplicaciones de inmunoensayos.

SK Vashist y otros [12] describen un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) rápido de una sola etapa para la detección de la CRP. El ensayo solo requiere una etapa de incubación, dos etapas de lavado y la adición del sustrato de tetrametilbencidina (TMB) para generar la señal colorimétrica a detectar. Aunque el ensayo descrito en esta publicación se presenta como rápido y con un alto potencial para el desarrollo de kits de diagnóstico rentables in vitro [12] todavía necesita dos etapas de lavado y, por lo tanto, también requiere el uso de tampones de lavado correspondientes. Además, se establece que el rendimiento óptimo del ensayo durante la incubación es de 30 min, que es demasiado tiempo para una prueba PoC rápida.

Sin embargo, tal método de inmunoensayo es difícil de implementar en un sistema completamente automatizado, tal como una plataforma microfluídica centrífuga, como es evidente a partir de Y. Zhao y otros [13]. Para automatizar el inmunoensayo de los biomarcadores de CRP e interleucina-6 (IL-6) en una plataforma microfluídica centrífuga, se necesita una variedad de operaciones unitarias como tres estructuras de bombeo neumático con una alícuota incluida. El ensayo que se automatizó en [13] es un inmunoensayo basado en perlas que usa un concepto de sándwich con un método de detección basado en la absorción. Para un sistema completamente automatizado, todos los reactivos que se necesitarán durante el ensayo, como el tampón de lavado, los anticuerpos, el tampón de sustrato o el tampón de parada, deben almacenarse previamente en el cartucho. Esto está directamente relacionado con las etapas de trabajo que se incluyen en el proceso de trabajo del inmunoensayo. Cuantas más etapas tiene un ensayo, más operaciones unitarias se necesitan, lo que conduce a una mayor huella y complejidad de las estructuras microfluídicas. Sin embargo, el método presentado en [13] no es adecuado para reducir la huella y el alto número de operaciones unitarias, lo que lo convierte en un proceso complejo para una automatización completa. El gran tamaño restringe el grado de rendimiento (número de muestras por análisis) y adaptación a formato múltiple (número de biomarcadores detectables) en un cartucho. La complejidad de la automatización se debió al hecho de que era necesario realizar secuencialmente varias etapas de ensayo, incluidos también varios reactivos de ensayo diferentes, y las etapas de lavado eran absolutamente necesarias. Para facilitar los ensayos automatizados, sería una gran ventaja desarrollar un ensayo de una sola etapa, que no requiera necesariamente una etapa de lavado después de la separación, sino una detección directa de la fase sin unión, todo en la misma cámara. En tal contexto, la automatización en una plataforma microfluídica (centrífuga) sería cada vez más fácil, robusta y rentable. Además, cuando se trata de la automatización de inmunoensayos en sistemas microfluídicos, la reducción de las etapas del ensayo corresponde a una reducción de cámaras y canales que conduce a un menor riesgo de pérdida de proteínas debido a la adsorción u otras razones.

El documento US4,868,131A [14] describe un proceso de inmunoensayo en el que, en una sola etapa, un antígeno analito reacciona con anticuerpos inmovilizados en micropartículas insolubles en agua. Una vez completada la reacción competitiva antígeno-anticuerpo, la solución de reacción se coloca en un elemento de análisis multicapa integral con una capa porosa en la parte superior, una capa de detección y una capa inferior transparente e impermeable al agua. Las micropartículas son demasiado grandes para pasar la primera capa porosa y solo los antígenos sin unión excedentes marcados pueden pasar a la capa de detección y detenerse allí. Una vez finalizada la etapa de filtración, se lee la capa de detección. Este ensayo se usó para una detección colorimétrica de antiinmunoglobulina G (anti-IgG) en suero. El proceso de ensayo introducido en el documento US4,868,131A informa la detección de la fase sin unión (fase líquida/sobrenadante), sin embargo, se reporta en combinación con una membrana multicapa integral seca necesaria para separar la fase sólida de la fase sin unión y para detectar la fase libre ligada. Esto restringe las posibilidades de aplicación. La membrana clasifica los reactivos de acuerdo con su tamaño de poro solo por fuerzas capilares y de difusión. Esto podría ser propenso a ser inespecífico o inexacto. Las dos etapas de incubación, una en el tubo y otra en la superficie de la membrana, presentan nuevos desafíos para la automatización de ensayos en entornos estándar como placas de microtitulación o también plataformas automatizadas como la plataforma microfluídica centrífuga descrita anteriormente, o cualquier otra configuración no basada en membrana.

El documento US4,659,678A [15] describe un formato de inmunoensayo en el que al menos una parte es un anticuerpo monoclonal o fragmentado en el que se forma un complejo entre el antígeno de la muestra y dos o más anticuerpos. El complejo se une de forma no covalente a una fase sólida que puede ser superficies planas, como recubrimiento de paredes o partículas. Esta patente reivindica un ensayo en el que se usan anticuerpos monoclonales para reducir la unión inespecífica sobre la superficie sólida y con ello reducir el ruido de la señal. Además, solo se usan enlaces no covalentes para unir el complejo al soporte sólido. Se detecta el complejo sobre el soporte. El soporte puede ser perlas y, si se desea, partículas magnéticas para que la separación de fases pueda realizarse mediante fuerzas magnéticas. Sin embargo, el ensayo del documento US4,659,678A requiere al menos un anticuerpo monoclonal, y dichos anticuerpos no son la mejor opción para todas las aplicaciones. Además, este ensayo solo se puede usar como tipo sándwich. Esto restringe la cartera de aplicaciones, ya que es posible que se requiera un ensayo competitivo para algunas aplicaciones específicas. Los ensayos de ejemplo presentados en esta patente tienen largos tiempos de incubación de 2 horas a más de 4 horas y necesitan una etapa de lavado.

Además, en el documento US4,244,940A [16] se describe un ensayo tipo sándwich de una sola etapa en la que la muestra contiene el ligando a detectar, un receptor marcado y un receptor no marcado que se une covalentemente a una fase sólida. Todos estos componentes reaccionan en una sola etapa en una solución acuosa para formar el complejo. Después de la reacción, las fases sólida y líquida se separan y la señal se detecta en cualquiera de las fases. Sin embargo, este ensayo tiene un largo tiempo de incubación de 2 h. Esta patente también describe ensayos que necesitan papel de filtro o papel absorbente con respaldo de plástico, lo que restringe las aplicaciones para las que puede usarse este ensayo. También necesita una gran cantidad de reactivos, lo que hace que este ensayo sea difícil de automatizar.

El documento US5,840,501 [17] describe un inmunoensayo para la detección de formas complejas de antígeno prostático específico (PSA) en sangre y, al mismo tiempo, elimina el PSA no complejado. El método se describe como un inmunoensayo convencional conocido por los usuarios expertos, en donde se usa una separación por conjugación de anticuerpos. Sin embargo, se necesita un tercer anticuerpo adicional para eliminar el PSA no complejado. El ensayo descrito requiere una etapa de lavado. El lavado en general es un procedimiento propenso a errores, requiere reactivos adicionales y aumenta la duración del ensayo debido a las etapas adicionales realizadas. El ensayo del documento US5,840,501 se describe de manera que se pueda medir la cantidad del marcador en la fase unida o sin unir y que el marcador se pueda medir en cada una de las fracciones separadas. Sin embargo, debido a la presencia de una etapa de lavado, el método descrito en el documento US5,840,501 es, por definición, no aplicable en la fase sin consolidar porque la etapa de lavado eliminaría la propia fase sin consolidar. También, el documento US5,840,501 parece referirse/citar exclusivamente a ensayos que contienen etapas de lavado y, en consecuencia, tampoco son compatibles por definición con la detección de fase no ligada propuesta por el método de la presente invención, porque con una etapa de lavado se pierde la fase no ligada. Por lo tanto, parece existir una contradicción entre el supuestoafirmación de los autores del documento US5,840,501 y los procedimientos experimentales documentados. Esto muestra que no es obvio aplicar la detección en la fase no ligada. Además de la necesidad de una etapa de lavado, el documento US5,840,501 muestra el largo tiempo de incubación de este ensayo (el tiempo de incubación solo, incluso en el sistema automatizado, fue de 38 minutos y 78 minutos), así como también las etapas secuenciales del ensayo. Así, aunque el documento US5,840,501 reporta aplicabilidad en sistema automatizado, apenas es implementable en aplicaciones de punto de atención.

El documento US5,447,870 [18] describe un ensayo inmunocromatográfico que usa un soporte sólido cromatográfico con un agente floculante inmovilizado y separación por bioafinidad para capturar un analito de una matriz de muestra compleja. Este método es, por definición, diferente de los métodos en los que todos los componentes involucrados reaccionan en líquido.

El método del documento US 5,447,870 se refiere a la medición de un marcador libre en una mezcla de reacción o ligado a un soporte. El documento US5,447,870 describe un ensayo inmunocromatográfico que usa un soporte sólido cromatográfico con un agente floculante inmovilizado sobre él y separación por bioafinidad para capturar un analito de una matriz de muestra compleja. La eliminación/separación del medio sólido del medio líquido y la posterior detección del marcador es una práctica habitual. Sin embargo, existe la necesidad en la técnica de un ensayo que no requiera material adicional para la separación y ningún lavado después de la separación y antes de la detección, mientras que estos dos procesos tienen lugar en el mismo entorno líquido. En otras palabras, sería una gran ventaja sobre el estado de la técnica desarrollar un ensayo que permita la detección de las moléculas marcadas de la fase sin unión en un entorno líquido después de la separación de la fase sólida sin una etapa de lavado, mientras que la fase sólida y la líquida están presentes en el mismo pocillo o recipiente.

Es más, el documento US5,447,870 informa que el marcador libre se eluye a través de la columna, y que los contaminantes se eliminan por lavado y el analito se detecta mediante el uso de varios protocolos de ensayo bien conocidos. Esto indica claramente que después de la captura, el método descrito requiere que se realice una etapa de lavado antes de la detección.

También, el documento US5,447,870 se centra únicamente en el método de separación e incluye, el ensayo/incubación ex situ (antes de la inyección en la columna) y la colección de componentes a detectar (después del lavado/elución) ex situ. Sin embargo, sería ventajoso desarrollar un método que involucre una incubación, la separación in situ de fase sólida y líquida sin lavado intermedio y la detección in situ, todo se hace en el mismo pocillo de reacción.

Además de estos hechos, está la etapa de trabajo adicional de transferir el líquido a una membrana, lo que presenta un desafío adicional para automatizar una transferencia robusta y reproducible del ensayo líquido a una membrana. Tales ejemplos del documento EE. UU. 5,447,870 necesitan varias incubaciones, antes de la inyección en la membrana, que suman hasta 50 minutos. La automatización de tales ensayos que requieren más de un tiempo de incubación con diferentes reactivos es más compleja y desventajosa.

O. Strohmeier y otros (Chem. Soc. Rev. 2015, vol.44, núm. 17, páginas 6187-6229) [19] resumen soluciones para la automatización de inmunoensayos en plataformas microfluídicas centrífugas, que requieren marcos de tiempo relativamente largos para proporcionar un resultado. Sería ventajoso desarrollar un ensayo con una menor complejidad para permitir un mayor grado de automatización y una generación más rápida de resultados en comparación con los ensayos descritos en el mismo. Un ensayo deseado reduciría la cantidad de reactivos necesarios para la automatización para permitir una huella reducida en los sistemas centrífugos y menos desafíos para el almacenamiento de los reactivos en el desechable. Además, sería ventajoso simplificar la complejidad del protocolo. Dichas ventajas se logran mediante el método de la invención descrito en la presente descripción, ya que el ensayo/incubación, la separación y la detección sin lavado de la fase sin unión se pueden lograr en un único pocillo de reacción. Además, las ventajas del método de la presente invención permiten un número mínimo de estructuras microfluídicas necesarias para la automatización, reduciendo de esta manera el riesgo de pérdida de proteínas debido a la adsorción en microcanales y cámaras, conservando las propiedades de los inmunoensayos heterogéneos. Una ventaja importante del método descrito en la presente descripción es la reducción de la dependencia del proceso de separación, que siempre es necesario en sistemas heterogéneos. El ensayo descrito en esta invención no se basa en la cantidad total de marcador de detección, sino que mide la concentración en la fase líquida. Esto simplifica la automatización y hace que el sistema sea más robusto.

El documento WO 2008/056165 A1 [20] describe un ensayo de saturación, que puede ser un ensayo de aglutinación que separa la fracción unida y no unida con un medio poroso, por ejemplo, una membrana comparable al ensayo de flujo lateral.

El formato de ensayo de flujo lateral es diferente en estructura y función del método de la presente invención, que se refiere a ensayos ELISA de base líquida. El método del documento WO 2008/056165 A1 se basa en la medición de la fracción de reactivo marcado libre o no unido, pero el método requiere la concentración del material marcado no unido para no perder sensibilidad, ya que los ensayos de flujo lateral por naturaleza tienen la desventaja de no ser lo suficientemente sensibles. Por lo tanto, la fracción no unida debe inmovilizarse adicionalmente en una zona de captura designada, lo que significa que, estructuralmente, la fracción de reactivo marcada no se detecta en la fase líquida no unida, sino que se detecta solo después de realizar una etapa de inmovilización adicional y la detección tiene lugar en un apoyo sólido. Esta etapa adicional requerida para poder lograr la sensibilidad necesaria conduce a la desventaja obvia de la unión superficial no específica en esta zona de atrapamiento. Por el contrario, el método descrito en la presente descripción es estructural y funcionalmente claramente diferente y ventajoso porque la detección ocurre en la fase líquida no unida, en la misma fracción líquida donde tuvo lugar el ensayo/reacción de unión y donde se separó la fase sólida. De esta manera, se minimiza el riesgo de interacciones no específicas de las moléculas marcadas no unidas "útiles" con cualquier superficie de soporte sólido, ya que no se requieren medidas de concentración/condensación para lograr la sensibilidad necesaria.

Adicionalmente, el hecho de que la separación en el método del documento WO 2008/056165 A1 tiene lugar mediante el uso de una membrana, es una desventaja porque las membranas son un factor adicional que puede provocar una unión inespecífica de la proteína al material de la membrana y las proteínas pueden perderse en la membrana debido a la variación del tamaño de los poros que se encuentra normalmente en el material de la membrana. El formato de ensayo del documento WO 2008/056165 A1 también se limita a la prueba de moléculas con tamaños más grandes, porque las moléculas demasiado pequeñas no se capturan en la membrana o, si el tamaño de los poros es demasiado pequeño, el fondo no se retiene. Esto conduce a una restricción en los tamaños de proteína que son detectables por el ensayo.

Otra desventaja del ensayo del documento WO 2008/056165 A1 es la mayor probabilidad de errores, porque, además de una primera etapa típica donde se forman los agregados, se agrega una segunda etapa bioquímica para la inmovilización en la zona de captura. Este ensayo tampoco ofrece la posibilidad de usar la adaptación a formato múltiple por color, pero necesita una adaptación a formato múltiple espacial mediante el uso de diferentes zonas de captura. Esto es desventajoso porque la zona de atrapamiento tiene un espacio limitado.

M.A. Fernández-Baldo y otros (Analyst, 2011,136, páginas 2756-2762) [21] presenta una solución microfluídica con un inmunoensayo competitivo para probar la ocratoxina A en manzanas para determinar si la fruta está contaminada con Aspergillus ochraceus. Se usan nanopartículas magnéticas para ejecutar el ensayo de forma automática en 16 minutos. Desde la perspectiva de la automatización, el sistema microfluídico usa bombas para mover el líquido en el chip. Debido al uso de una bomba, se requiere una interfaz con el chip y, por esta razón, el sistema en sí no es un sistema cerrado. Esto aumenta el riesgo de contaminación. El sistema también requiere varios desechables (porque la limpieza de la interfaz entre la bomba y el chip es difícil para el usuario) y múltiples reactivos (lo cual es una desventaja porque todos los reactivos deben almacenarse en el desechable).

En comparación, el formato estructural del método descrito en la presente descripción es intrínsecamente ventajoso y simple (sobre la publicación nombrada) en caso de automatización porque se puede realizar como una sola etapa que comprende ensayo/incubación, seguido de separación, sin lavado pero detección directa en la fase sin unión, todos tienen lugar en el mismo pocilio de reacción, lo que minimiza el riesgo de pérdida de proteínas debido a la adsorción inespecífica en microcanales y cámaras. Por el contrario, el ensayo de Fernandez-Baldo y otros, cuando se automatiza en este sistema microfluídico, requiere etapas de lavado.

Debido a que la automatización y el cumplimiento de los requisitos del inmunoensayo, como se describe en la sección "antecedentes de la invención", dependen en gran medida de la forma y la complejidad del ensayo que debe integrarse - tal como la cantidad de moléculas objetivo diferentes que deben detectarse simultáneamente, el número de etapas del proceso, componentes y reacciones, y el tiempo de las etapas de reacción - es necesario no solo desarrollar un dispositivo que se ajuste a estos requisitos, sino también dar un paso atrás y repensar la cadena de procesos bioquímicos para hacer la automatización sea lo más fácil y robusta posible. En consecuencia, a la luz de la técnica anterior, sigue existiendo una necesidad significativa en la técnica de proporcionar un método mejorado que se lleve a cabo en un sistema automatizado para detectar una molécula objetivo en una muestra.

Resumen de la invención

A la luz de los desafíos técnicos y de rendimiento del estado de la técnica, y en relación con los requisitos de inmunoensayo descritos en la sección "antecedentes de la invención", el problema técnico a resolver por la presente invención es la provisión de medios alternativos y/o mejorados para detectar una o más moléculas objetivo en una muestra en un sistema microfluídico automatizado o automatizado. El problema se resuelve mediante las características de las reivindicaciones independientes. Las modalidades preferidas de la presente invención se proporcionan en las reivindicaciones dependientes.

En la presente descripción se describe un método para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende

a. incubar en una solución tampón

i. la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo,

ii. moléculas de captura acopladas en fase sólida adecuadas para unirse a las moléculas objetivo, iii. una cantidad definida de moléculas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura,

b. separar las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón,

c. detectar las moléculas de detección restantes en la solución tampón separada.

Esta solicitud también se relaciona con un método realizado en un sistema automatizado para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende

a. incubar en una solución tampón

i. la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo,

La solicitud se refiere además a un método para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende

a. incubar en una solución tampón

i. la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo,

ii. moléculas de captura acopladas en fase sólida adecuadas para unirse a las moléculas objetivo, en donde la fase sólida es una perla,

iii. una cantidad definida de moléculas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura, en donde las moléculas de detección se acoplan a perlas que son diferenciables de las perlas acopladas a las moléculas de captura, por ejemplo, por tamaño, densidad, propiedades magnéticas,

b. separar las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón y potencialmente las perlas acopladas a las moléculas de detección,

c. detectar las moléculas de detección acopladas a las perlas restantes en la solución tampón separada.

En modalidades de la invención, la separación de las moléculas de captura acopladas a perlas se puede lograr mediante sedimentación, en donde las perlas acopladas a las moléculas de captura tienen un peso y/o densidad definidos que es mayor que el peso y/o la densidad de las perlas acopladas a las moléculas de detección. Además, las moléculas de captura acopladas a las perlas pueden separarse ya que estas perlas son más pesadas y/o muestran una mayor densidad y/o un tamaño mayor que las perlas acopladas a las moléculas de detección. En modalidades adicionales, las perlas de las moléculas de captura acopladas a las perlas pueden ser magnéticas, lo que permite la separación magnética.

El método de la presente invención es ventajoso en comparación con los métodos basados en ELISA heterogéneos conocidos para la detección de una molécula objetivo en una muestra líquida porque permite la detección y, opcionalmente, la cuantificación de una o más moléculas objetivo específicas en una muestra potencialmente compleja, mediante el análisis del sobrenadante separado después de realizar la reacción de unión entre las moléculas de captura, las moléculas objetivo y las moléculas de detección.

Para el análisis del sobrenadante para detectar las moléculas de detección restantes en la solución tampón separada después de la etapa de separación b., la solución tampón separada y las moléculas de captura acopladas en fase sólida aún pueden estar en el mismo pocillo de reacción donde tuvo lugar la incubación y la separación. En este contexto, la separación se refiere a la ubicación separada de las moléculas de detección que son solubles en la fase líquida en contraste con las moléculas de detección que se unen a la fase sólida de las moléculas de captura después de la etapa de incubación. Sin embargo, esta ubicación separada puede estar en el mismo recipiente o pocillo de reacción.

En consecuencia, el término "separar las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón" también se refiere a concentrar o localizar las moléculas de captura acopladas en fase sólida en una ubicación específica del pocillo de reacción, de modo que las moléculas de captura acopladas en fase sólida no se disuelvan en la fase líquida. Dado que la incubación de los componentes de la reacción ocurre en un pocillo de reacción, "separar las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón" puede indicar más claramente que la separación ocurre mientras las moléculas de captura acopladas en fase sólida y la solución tampón que comprende moléculas de detección no unidas todavía están en la misma reacción también puede denominarse "separación en el pocillo de reacción de las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón". En consecuencia, como se describe en la presente descripción, la separación de las moléculas de captura y la solución tampón después de la etapa de incubación es independiente de la transferencia de la solución tampón separada a una reacción diferente mucho antes de la detección. La detección de las moléculas de detección no unidas en la solución tampón separada puede ocurrir en el mismo pocillo de reacción o después de la transferencia de una fracción de la solución tampón separada que comprende la molécula de detección no unida a otro pocillo de reacción.

En otras palabras, la separación no se refiere necesariamente a la eliminación de la fase líquida/solución tampón, que se ha separado de las moléculas de captura acopladas en fase sólida, de la reacción mucho después de la incubación.

Por ejemplo, en caso de que la fase sólida que se acopla a las moléculas de captura sea el fondo de una placa de pocillos, la separación se produce automáticamente, ya que las moléculas de detección unidas ya no se localizan en la fase líquida. En otro caso, cuando la fase sólida es una perla acoplada a las moléculas de captura, las perlas pueden separarse de la solución tampón/fase líquida al concentrar las perlas en una ubicación específica del pocillo de reacción, por ejemplo, mediante separación magnética o centrífuga, electroforesis o sedimentación. Después de la etapa de separación, la solución tampón/fase líquida puede o no eliminarse del pocillo de reacción.

La detección de las moléculas de detección restantes en la solución tampón separada se produce en el mismo pocillo que la etapa de incubación. En modalidades, el método de la invención es un método de detección heterogéneo. Fue totalmente sorprendente que el método proporcione resultados fiables, ya que los ensayos de detección heterogéneos suelen requerir el análisis de la fase sólida y la detección y cuantificación de la unión de las moléculas de detección en la fase sólida para obtener un resultado fiable, sólido y reproducible. Igualmente, sorprendente es el hecho de que el método de la presente invención no requiere una etapa de lavado y, aunque las moléculas de detección no unidas pueden estar en el mismo pocillo que las moléculas de captura acopladas en fase sólida separadas, todavía ofrece resultados cuantitativos, que fue inesperado en vista del estado del arte. En modalidades, la invención también se refiere a un método realizado en un sistema automatizado para detectar cuantitativamente una molécula objetivo en una muestra.

El método de la presente invención es ventajoso en comparación con los métodos basados en ELISA heterogéneos conocidos para la detección de una molécula objetivo en una muestra líquida porque al analizar el sobrenadante separado en un formato competitivo, la señal aumentará con el aumento de la concentración objetivo, mientras que en un formato tipo sándwich la señal disminuirá con el aumento de la concentración del objetivo. Esto es ventajoso porque, especialmente, los ensayos tipo sándwich a menudo requieren que sean muy sensibles y una de las restricciones es la limitación de detección del hardware óptico que proporciona señales bajas para concentraciones bajas en enfoques ELISA estándar. Sin embargo, con el método de la presente invención, la sensibilidad se puede mejorar de dos maneras: (i) al usar una detección basada en partículas, la señal de fluorescencia se mejora debido a la gran cantidad de fluoróforos en el núcleo de la partícula de detección (perla de detección) y (ii) al detectar en el sobrenadante la concentración más baja de la molécula objetivo conduce a una señal alta y, por lo tanto, hace que el ensayo sea más sensible.

Sin embargo, los métodos conocidos dirigidos al análisis de la fase sólida requieren el lavado de la fase sólida, preferentemente con un tampón de lavado específico, para proporcionar resultados fiables y evitar la falsificación de los resultados por moléculas de detección unidas inespecíficamente. Estas etapas de lavado adicionales de la fase sólida requieren mucho tiempo adicional y requieren reactivos adicionales, tales como tampones de lavado. Dichas etapas de lavado, ya sea que se realicen de forma manual o automática, presentan el riesgo adicional de que se pierdan proteínas debido al pipeteo (en caso de que sea manual) o a la unión no específica en cámaras y paredes de desafío (en caso de plataformas microfluídicas o no automatizadas). Por lo tanto, los métodos conocidos son desventajosos para aplicaciones que requieren resultados rápidos, que preferentemente deben llevarse a cabo en un sistema automatizado adecuado para el punto de atención (por ejemplo, compacto y portátil) y/o por una persona con entrenamiento de laboratorio limitado.

El método de la presente invención permite la detección y cuantificación fiables de la presencia de al menos una molécula objetivo específica en una muestra mediante el análisis de la fase no unida separada (solución tampón separada) después de la coincubación de las moléculas de captura, objetivo y detección. Esta característica es particularmente ventajosa, ya que conduce a una reducción drástica de las etapas necesarias del método para determinar la presencia y cuantificar una molécula objetivo. En el contexto del método de la invención, la separación de las moléculas de captura acopladas en fase sólida y la solución tampón se refiere a separar la solución tampón con las moléculas de detección no unidas (ya sea en su totalidad o en un volumen específico) de las moléculas de captura acopladas en fase sólida. En el contexto de la etapa de separación del método de la presente invención, el término solución tampón se refiere a la fase líquida presente durante la incubación de los componentes del método de la invención, que comprende la solución tampón y potencialmente líquidos de los componentes adicionales del método de la invención. En el contexto de la presente invención, la separación de las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón (etapa b) no

requieren la eliminación de la fase líquida o partes de la misma del pocillo de reacción que comprende las moléculas de captura acopladas en fase sólida y las moléculas de detección potencialmente unidas. En su lugar, estos componentes permanecen en el mismo recipiente o pocillo de reacción, pero en ubicaciones separadas para que las moléculas de captura acopladas en fase sólida no se disuelvan en la fase líquida.

Por ejemplo, después de la etapa de incubación, la fase sólida se separa de las moléculas de captura acopladas a la fase sólida pero aún permanece en el mismo pocillo de reacción, y se detectan las moléculas de detección no unidas disueltas en la fase líquida.

Aquí se describe un método para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende las etapas secuenciales de

a. una. incubar al mismo tiempo en una solución tampón en el mismo pocillo de reacción

i. la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo,

ii. moléculas de captura adecuadas para unirse a las moléculas objetivo, en donde las moléculas de captura están acopladas a perlas (perlas de captura),

iii. una cantidad definida de moléculas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura, en donde las moléculas de detección están acopladas a perlas (perlas de detección), en donde las perlas de captura pueden separarse de las perlas de detección,

b. separar en el pocillo de reacción las perlas de captura de la solución tampón que comprende las perlas de detección no unidas,

c. detectar las perlas de detección no unidas restantes en la solución tampón, que se ha separado de las perlas de captura.

El método de la presente invención usa un enfoque de dos perlas. Al usar no solo una, sino dos perlas, se puede lograr lo siguiente: (i) una mayor relación superficie/volumen, lo que permite unir más proteínas en la superficie. Por lo tanto, durante la etapa de incubación, que puede implicar la mezcla o agitación de la solución tampón, se mejora la probabilidad de interacción de las proteínas y se acorta el tiempo de incubación requerido. (ii) La separación fácil y rápida de las moléculas de captura unidas a uno de los dos tipos de partículas puede lograrse explotando principios físicos tales como separación magnética, centrifugación, electroforesis u otros métodos conocidos por el experto en la técnica.

En los casos en los que la fase sólida a la que se unen las moléculas de captura es una perla, el término perlas de captura puede usarse para referirse a las moléculas de captura acopladas a perlas. Análogamente, en los casos en los que las moléculas de detección están acopladas a perlas, el término perlas de detección puede usarse para referirse a las moléculas de captura acopladas a perlas. Unas modalidades de la invención que comprende perlas de captura y perlas de detección puede denominarse enfoque de dos perlas, variante de dos perlas o ensayo de dos perlas del método de la invención. En el contexto de un enfoque de dos perlas de la invención, las perlas que se acoplan a las moléculas de captura y las perlas que se acoplan a las moléculas de detección son distinguibles o diferenciales. Esto significa que se deben usar dos tipos de perlas para acoplarse a las moléculas de captura o a las moléculas de detección, en donde los tipos de perlas tienen propiedades distinguibles, tales como, sin limitación, tamaño, forma, diámetro, peso, densidad, material, propiedades magnéticas, propiedades electroforéticas, marcaje y/o color.

Es importante destacar que, en el contexto de un enfoque de dos perlas, las perlas de captura se pueden separar de las perlas de detección después de que ambos tipos de perlas se hayan incubado en la solución tampón, lo que significa que las perlas de captura se pueden separar de las perlas de detección. La separabilidad se puede lograr debido a las propiedades distinguibles de las perlas. Además, las perlas de captura pueden separarse/pueden separarse de la solución tampón. La separación de las perlas de captura de la solución tampón y también de las perlas de detección no unidas presentes en la solución tampón después de la etapa de incubación se produce en el pocillo de reacción de la etapa de incubación.

El término "incubar al mismo tiempo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las modalidades de la invención en las que los componentes de reacción de la etapa a. (incubación) del método no se agregan secuencialmente a la solución tampón, sino aproximadamente al mismo tiempo, de modo que las reacciones de unión ocurren mientras todos los componentes están presentes en la solución tampón. Esto significa que el método de la invención se lleva a cabo como un ensayo/reacción de una sola etapa.

El término "etapas secuenciales" se refiere a las etapas a. (incubación), b. (separación), y c. (detección) del método de la invención, en donde secuencial significa que las etapas se realizan secuencialmente en el orden enumerado del primero a., segundo b. y tercero c.

En modalidades de la invención, la detección de las moléculas de detección o perlas de detección no unidas restantes se produce en el mismo pocillo de reacción que la incubación y separación. Esto representa una gran ventaja del método de la invención, ya que no se requiere un segundo pocillo de reacción para detectar las moléculas de detección no unidas, lo que es particularmente ventajoso para diseñar sistemas automatizados para realizar el método de la invención y para evitar el riesgo de pérdida de proteína y/o perlas durante la transferencia a un segundo pocillo de reacción para detectar las moléculas de detección no unidas.

Además, debido a la incubación de una cantidad definida/conocida de moléculas de detección, se conoce la concentración inicial de moléculas de detección en la fase líquida de la etapa de incubación y se puede medir una disminución potencial de la concentración de moléculas de detección después de la etapa de incubación en una fracción separada de la fase líquida y no requiere la separación de toda la fase líquida de la fase sólida. Otra ventaja es que la presente invención no necesita una membrana ni ninguna otra matriz fibrilar para funcionar y todavía proporciona resultados cuantitativos sobre la cantidad de analito analizado.

En modalidades de la invención que implican un tipo de perlas como fase sólida acoplada a las moléculas de captura y un tipo diferente de perlas diferenciables acopladas a las moléculas de detección, se demostró que es posible detectar una concentración muy alta de un objetivo (15 mg/l - 120 mg/l) sin la etapa de dilución para la preparación de la muestra. Debido a la alta relación superficie/volumen de las perlas de captura y la gran cantidad de moléculas de captura en su superficie, aumenta la cantidad de objetivo que se puede unir en una reacción. El enfoque de dos perlas y la detección del sobrenadante conduce sorprendentemente a un ensayo muy robusto que puede resistir cualquier reacción inespecífica de la matriz de muestra compleja que está presente en una mayor proporción si la muestra no se diluye. La reducción de la reacción inespecífica se mejora de manera única por el hecho de que la incubación, la separación y la detección de perlas de detección no unidas en la fase no unida se realizan todas en el mismo pocillo de reacción. Es sorprendente que el ensayo no muestre ningún efecto de matriz, aunque no se requiere una etapa de lavado para realizar el inmunoensayo. Esta es una gran ventaja del método de ensayo de dos perlas que se logra acoplando las moléculas de captura y detección a dos tipos de perlas. La alta relación superficie/volumen conduce a una mayor cantidad disponible de proteínas en la superficie de las perlas. La masa de las perlas también conduce a un mejor comportamiento de reacción debido a la menor dependencia del factor de difusión durante la incubación.

En una modalidad preferida de la invención, las perlas de captura y/o las perlas de detección son perlas compactas individuales. Las perlas compactas individuales son diferentes del grupo de perlas. Dichos grupos de perlas consisten en varias perlas más pequeñas, que se ensamblan para formar una perla más grande formando un grupo o aglomerado de perlas más pequeñas. El uso de tales agrupaciones de perlas es desventajoso en el contexto del método de la invención, ya que las agrupaciones pueden desestabilizarse en determinados tampones y por lo tanto restringir la selección de la solución tampón. La desestabilización y desintegración de las agrupaciones conduce a un cambio de las propiedades físicas de las agrupaciones de perlas, cambiando las condiciones de separación para las perlas de captura y las perlas de detección y, por lo tanto, puede perturbar en gran medida el rendimiento del método de la invención. Dichas perturbaciones no pueden ocurrir cuando las perlas usadas en el contexto de la invención son perlas sólidas individuales que no están ensambladas a partir de estructuras de perlas más pequeñas. En consecuencia, en modalidades preferidas, las perlas usadas en el contexto del método de la invención no están formadas por grupos de perlas.

En modalidades preferidas de la presente invención, las perlas de captura tienen una densidad mayor que las perlas

de detección. En modalidades, las perlas de captura y las perlas de detección pueden tener la misma o aproximadamente la misma densidad. En modalidades de la invención, la combinación de perlas de captura y perlas

de detección usadas es tal que la densidad de las perlas de detección es menor o igual a la densidad de las perlas de captura.

Las densidades preferidas de las perlas de captura y/o perlas de detección a usar están en el intervalo de aproximadamente 1 g/ml a 2 g/ml. Las posibles densidades son 1,000, 1,005, 1,01, 1,015, 1,02, 1,025, 1,03, 1,035,

1,04, 1,045, 1,05, 1,055, 1,06, 1,065, 1,07, 1,075, 1,08, 1,085, 1,09, 1,095, 1,10, 1,11, 1,12, 1,13, 1,14, 1,15, 1,16,

1,17, 1,18, 1,19, 1,20, 1,21, 1,22, 1,23, 1,24, 1,25, 1,26, 1,27, 1,28, 1,29, 1,30, 1,31, 1,32, 1,33, 1,38, 1,39, 1,40, 1,41, 1,42, 1,43, 1,44, 1,45, 1,46, 1,47, 1,48, 1,49, 1,50, 1,51, 1,52, 1,53, 1,54, 1,59, 1,60, 1,61, 1,62, 1,63, 1,64, 1,65, 1,66, 1,67, 1,68, 1,69, 1,70, 1,71, 1,72, 1,73, 1,74, 1,75, 1,80, 1,81, 1,82, 1,83, 1,84, 1,85, 1,86, 1,87, 1,88, 1,89, 1,90, 1,91, 1,92, 1,93, 1,94, 1,95, 1,96, 1,97, 1,98, 1,99,

2,00 g/ml.

En modalidades adicionales, el diámetro de las perlas de captura a usar en el contexto de la invención es de al menos

0,5 |jm. Otros diámetros posibles de perlas de captura comprenden el intervalo de 0,5 jm a 5 jm , por ejemplo aproximadamente de 0,51, 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,60, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67,

0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88,

0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3,

2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9,

5,0 jm .

En un ejemplo, el diámetro de las perlas de detección es de al menos 0,1 jm . Otros diámetros posibles están en el intervalo de 0,1 jm a 4 jm , por ejemplo aproximadamente 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20,

0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,40, 0,41,

0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49, 0,50, 0,51, 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,60, 0,61, 0,62,

0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83,

0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88, 0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6,

1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0 jm .

Es posible usar perlas de captura y perlas de detección de aproximadamente el mismo tamaño, perlas de captura con

un diámetro mayor o con un diámetro menor en comparación con las perlas de detección.

La combinación de densidad y dimensiones de las perlas de captura y detección se elige de manera que permita una

clara separación de los dos tipos de perlas. Por ejemplo, pero sin limitarse a ello, se podrían seleccionar densidades similares pero diferentes dimensiones de las perlas de captura y detección; o de dimensiones similares y densidades diferentes. Los intervalos anteriores se eligen de tal manera que retengan las ventajas del ensayo basado en dos

perlas indicado en la presente descripción.

a. incubar al mismo tiempo en una solución tampón en un pocillo de reacción

i. la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo,

ii. moléculas de captura adecuadas para unirse a las moléculas objetivo, en donde las moléculas de captura

están acopladas a perlas (perlas de captura),

iii. una cantidad definida de moléculas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura, en donde las moléculas de detección están acopladas a perlas (perlas de detección),

en donde las perlas de captura pueden separarse de las perlas de detección,

b. separar en el pocillo de reacción las perlas de captura en la solución tampón que comprende perlas de detección no unidas, y

c. detectar las perlas de detección no unidas restantes en la solución tampón, que se ha separado de las

perlas de captura

en donde el método no comprende una etapa de lavado.

En modalidades, el método de la invención no comprende una etapa de lavado. En particular, el método de la presente invención no comprende el lavado de la fase sólida después de la incubación con la muestra y los otros componentes

de la reacción y, sorprendentemente, el método proporciona resultados cuantitativos, lo que lo hace ventajoso en comparación con los ensayos conocidos, tales como el ensayo de flujo lateral. No es necesario lavar la fase sólida después de la separación de la fase sólida y el sobrenadante líquido, ya que se analiza el sobrenadante. En particular,

ni siquiera se requiere que el sobrenadante/solución tampón se transfiera a un pocillo/recipiente de reacción diferente después de la separación. Esto no solo es ventajoso con respecto al número de etapas del método, sino que también reduce el número de reactivos y tampones necesarios para llevar a cabo el método y también el número de pocillos de reacción/recipientes de reacción. Esto simplifica la realización del método de la invención por parte de una persona con formación limitada y también reduce las fuentes de errores. Además, esto también simplifica el desarrollo de sistemas automatizados diseñados para llevar a cabo el método de la invención de forma automática, ya que dicho sistema tiene que integrar menos etapas del método y menos reactivos en comparación con un sistema diseñado para llevar a cabo un ensayo heterogéneo del estado de la técnica que requiere el análisis de la fase sólida. Una ventaja adicional en el caso de la integración en un sistema microfluídico es que, cuando la incubación, la separación y la detección del sobrenadante tienen lugar en la misma cámara, se usan menos microcanales y microcámaras, por lo tanto, hay menos riesgo de pérdida de proteína por unión inespecífica en las paredes microfluídicas.

En otra modalidad del método de la invención, la intensidad detectada de la señal derivada de las moléculas de detección restantes en la solución tampón separada depende de la concentración de las moléculas de detección y no de la cantidad total de marcador fluorescente unido a la fase sólida, como en el estado de la técnica. Además, en el contexto de las modalidades de la invención, la naturaleza del método de separación y detección no permite que las perlas de captura interfieran con la fase líquida y, por lo tanto, con la detección que tiene lugar en la fase líquida/sobrenadante. En consecuencia, el proceso de separación no tiene influencia en los resultados de la prueba y, debido a las razones anteriores, se puede lograr una alta reproducibilidad (bajos CV) en las mediciones del método de la invención. Debido a la separación de las perlas de captura de la fase líquida antes de detectar las moléculas de detección restantes en la fase líquida separada, el proceso de separación no influye en los resultados de la prueba y, debido a las razones anteriores, puede lograrse una alta reproducibilidad (bajo CV) en las mediciones del método de la invención. Esto simplifica el proceso de separación y permite al usuario separar la fase sólida y detectar la fase no unida incluso en el mismo pocillo de reacción sin transferir la solución tampón separada a un recipiente o pocillo de reacción diferente. En los métodos conocidos en la técnica, donde la señal se detecta en la fase sólida, todas las perlas deben estar presentes para lograr el resultado correcto. Esto significa que durante la separación y todas las etapas de lavado en tales métodos se debe asegurar que no se eliminen por accidente moléculas de captura/perlas de captura. De hecho, el porcentaje de pérdida de perlas se considera un criterio de calidad importante de los métodos del estado de la técnica, especialmente para ensayos automatizados. Dado que el método de la presente invención no se basa en la detección de la señal de la fase sólida, esto representa una gran ventaja sobre los métodos del estado de la técnica y permite obtener resultados exactos y altamente reproducibles al tiempo que reduce la complejidad del método.

El método de la presente invención también brinda la posibilidad de no eliminar ninguna solución tampón del pocillo de reacción de la incubación sino detectar la señal en la fase líquida (sobrenadante), por ejemplo, después de la sedimentación de las perlas acopladas a las moléculas de captura en tal de manera que las moléculas de detección en su superficie no afecten la detección de moléculas de detección en el sobrenadante. Los resultados generados por tales modalidades muestran esencialmente el mismo resultado que los resultados generados por modalidades que implican una separación y transferencia del sobrenadante. En conclusión, el inmunoensayo presentado en esta invención combina las ventajas del enfoque clásico de un ELISA heterogéneo y las ventajas de los inmunoensayos homogéneos.

El desarrollo del método de la presente invención, que se lleva a cabo preferentemente como un inmunoensayo, ha sido impulsado por el objetivo de facilitar la ejecución o realización automatizada de un inmunoensayo, por ejemplo, en una plataforma microfluídica, preferentemente una plataforma microfluídica centrífuga automatizada. Una plataforma automatizada y en particular una plataforma centrífuga completamente automatizada, así como también cualquier otra plataforma automatizada y miniaturizada, no solo tiene como objetivo la automatización de las etapas o un método a realizar, sino también la integración del almacenamiento de reactivos en las piezas desechables del sistema. Las exigentes demandas de dicho ensayo, que se cumplen con el método de la presente invención, pero no con los métodos conocidos de la técnica de la técnica, comprenden la reducción del tiempo de manipulación (etapas del método manual); reducción del número de etapas de método requerido; reducción del número de reactivos necesarios (que pueden tener que almacenarse en un sistema microfluídico); simplificación de las operaciones de la cadena de procesos para una fácil automatización; prevención de la pérdida de proteínas relacionada con el proceso debido, por ejemplo, a una unión no específica; reducción del tiempo de realización de un inmunoensayo; habilitación de adaptación a formato múltiple; habilitación de la realización de inmunoensayos tipo sándwich, así como también inmunoensayos competitivos (incluso en paralelo y en el mismo pocillo de reacción), para garantizar la cobertura de una amplia variedad de aplicaciones en términos de (i) niveles de concentración (los ensayos competitivos son preferibles para detectar y determinar los analitos presentes en concentraciones altas) y (ii) el tamaño molecular del analito (los ensayos tipo sándwich requieren que los analitos con dos epítopos sean reconocidos por dos anticuerpos diferentes, por lo que los analitos de tamaño pequeño pueden requerir el uso de un ensayo competitivo); una amplia implementación en múltiples plataformas.

Mediante el uso de dos tipos de partículas/perlas diferenciables, una para la fase sólida acoplada a las moléculas de captura y otra acoplada a las moléculas de detección, se mejora la estabilidad de los reactivos. Tomando el inmunoensayo como ejemplo, la estabilidad de la proteína es un gran desafío para los sistemas automatizados. Las proteínas unidas a la superficie de una perla muestran una larga estabilidad reactiva en líquido almacenado en el refrigerador (2-8 °C). La unión de la proteína a la superficie conduce a una estabilización de la proteína debido a la reducción de la movilidad, que es una de las principales causas de los procesos de desnaturalización. La unión de los reactivos a la superficie de las partículas también permite el almacenamiento de las proteínas a temperatura ambiente (15-25 °C) en desechables para sistemas automatizados mediante el secado de las partículas.

La configuración o diseño del método de la invención permite que se realice como un ensayo tipo sándwich o como un ensayo competitivo. Es una gran ventaja que el método se pueda realizar en un tipo sándwich y una configuración competitiva (incluso en paralelo y en el mismo pocillo de reacción), cubriendo de esta manera un intervalo de detección muy amplio de concentraciones, así como también tamaños moleculares y estructuras de analitos a ser detectado. Teniendo en cuenta que un ensayo tipo sándwich requiere dos anticuerpos que se unan a diferentes epítopos de una molécula de analito, esta configuración de ensayo solo se puede realizar para moléculas objetivo adecuadas. Además, es posible aplicar el método de la invención en la configuración competitiva. Esto puede ser ventajoso en el caso de analitos pequeños que no contengan dos epítopos para los que estén disponibles anticuerpos adecuados.

El método de la invención se puede realizar en una configuración de laboratorio estándar, ya sea de forma manual o automatizada, o en una plataforma miniaturizada, que puede emplear diferentes plataformas de fase sólida y/o diferentes métodos de detección. En modalidades preferidas, el método de la presente invención es un inmunoensayo. El método es ventajoso porque es muy flexible, en un sentido técnico, así como también operativo.

El método se puede implementar tanto en equipos de laboratorio estándar como en plataformas miniaturizadas (microfluídicas), por ejemplo, pero sin limitarse a, placas de microtitulación y lectores de placas correspondientes, citómetros de flujo, centrífuga microfluídica/controlada por presión, microfluidos automatizados basados en perlas magnéticas, sistemas de pipeteo y, generalmente, con cualquier sistema o plataforma estándar o miniaturizado que pueda hacer uso de un principio físico para separar la fase sin unión/sobrenadante líquido de la fase sólida después de la incubación conjunta de los reactivos. Esta flexibilidad no es posible con los ensayos conocidos en la técnica, que pueden requerir configuraciones complejas que implican, por ejemplo, una membrana para la separación de fases y la detección posterior, lo que restringe sustancialmente la aplicabilidad del ensayo.

Es importante destacar que el método descrito en la presente descripción no requiere una etapa de lavado. En particular, no se requiere ninguna etapa de lavado después de la separación y antes de la detección de la fase libre, incluso cuando esta última tiene lugar en el mismo pocillo de reacción en el que se realizó la separación, lo cual no es trivial para el estado de la técnica, pero sí único y sorprendente. Eso reduce el número total de etapas y, por lo tanto, el tiempo de respuesta, y hace que el ensayo sea más adecuado para una fácil automatización en comparación con los métodos conocidos del estado de la técnica. Especialmente en el caso de la implementación del método de la invención en sistemas miniaturizados, el hecho de que solo se requiere un tampón de reacción para realizar el método, mientras que no hay necesidad de más tampones, como tampón de lavado o similares, representa una ventaja importante. Sorprendentemente, la falta de una etapa de lavado en el método de la invención no tuvo una influencia negativa en el rendimiento del ensayo y la reproducibilidad de los resultados, presumiblemente también debido a la reducción de la pérdida de proteínas y la reducción de la unión inespecífica como todas las etapas involucradas (incubación, separación, detección de sobrenadante) se realizan en el mismo pocillo de reacción.

El proceso de trabajo propuesto comprende la detección de las moléculas de detección en fase líquida tras la coincubación y separación de la fase sólida. La molécula de detección a la que se hace referencia en el contexto del método de la invención representa una molécula de detección primaria. La detección puede ocurrir a través de detección directa o indirecta mediante el uso de un marcador.

En modalidades preferidas, la molécula de detección comprende un marcador. El marcador se une preferentemente directamente a la molécula de detección primaria, lo que permite la detección directa. Sin embargo, también puede estar unido a una molécula de detección secundaria o terciaria, que se une específicamente a la molécula de detección primaria o secundaria, respectivamente, lo que puede ser útil para la amplificación de la señal en la detección de analitos presentes en baja concentración. En consecuencia, el método aquí descrito es compatible con múltiples principios de detección, tales como, sin limitación, fluorescencia, quimioluminiscencia, absorción y reacciones enzimáticas. Uno de los ejemplos descritos en la presente descripción usa perlas fluorescentes como marcador adherido a la molécula de detección. En modalidades de la invención, el método se lleva a cabo como un ensayo multiplex. El término multiplexado se refiere a la detección paralela de dos o más moléculas objetivo diferentes dentro de la misma cámara/pocillo de reacción, en donde se usan diferentes moléculas de detección que comprenden diferentes marcadores o métodos de detección para cada molécula objetivo. Esto es particularmente ventajoso para la detección simultánea de múltiples marcadores.

Al usar un tipo de perla como fase sólida acoplada a las moléculas de captura y un segundo tipo diferenciable de perla acoplada a la molécula de detección, se necesita un tiempo de reacción más corto para unir la molécula objetivo, los efectos de la matriz de la muestra se reducen y se puede lograr una alta relación señal-ruido y una mayor sensibilidad. Esto es muy ventajoso para la adaptación a formato múltiple y simplifica el proceso. Por lo tanto, en el contexto de un ensayo multiplex mediante el uso de moléculas de detección acopladas a perlas y moléculas de captura acopladas a perlas, para que cada molécula objetivo se detecte, se debe usar una perla de detección específica que se distinga de las perlas de captura y las perlas de detección de las otras moléculas objetivo. Además, todas las perlas de detección tienen que ser separables de las perlas de captura.

De acuerdo con modalidades de la invención, se detectan en paralelo dos o más moléculas objetivo diferentes comprendidas en la muestra. En modalidades, el método de la invención puede usarse para detectar dos o más moléculas objetivo en una muestra. En tal variante múltiplex del método, es posible detectar en paralelo diferentes moléculas objetivo. En él, es posible detectar al menos una molécula objetivo de una concentración alta en paralelo y en una reacción bien con al menos otra molécula objetivo, que está presente en una concentración baja.

En particular, debido a las ventajas descritas anteriormente del método de inmunoensayo presentado en esta invención que usa dos tipos de perlas, en donde un primer tipo de perlas se acopla como una fase sólida a las moléculas de captura (perlas de captura) y un segundo tipo diferenciable de perlas se acopla a las moléculas de detección (perlas de detección), también es posible realizar la adaptación a formato múltiple de intervalos dinámicos donde un objetivo está presente en un intervalo de concentraciones más altas (por ejemplo, 1000 - 200000 ng/ml) y normalmente se detectaría con un formato competitivo, mientras que el segundo objetivo está presente en la misma matriz de muestra en el intervalo de concentraciones más bajas (por ejemplo, 0,001 - 100 ng/ml) y normalmente se detectaría con un formato tipo sándwich. Por lo tanto, la adaptación a formato múltiple de estos dos objetivos a partir de una muestra y en un líquido es muy desafiante para los formatos de inmunoensayo estándar. Pero con el método de inmunoensayo presentado en esta invención es posible debido a las propiedades de mezclado mejoradas y debido al hecho de que el flujo de trabajo de un tipo sándwich y un formato competitivo se lleva a cabo con las mismas etapas. Los experimentos incluso demostraron que es posible la adaptación a formato múltiple de dos objetivos con diferentes matrices de muestra presentes en intervalos de detección que difieren en 4 a 5 órdenes de magnitud. Esto prueba que el método de inmunoensayo presentado en esta invención es sorprendentemente capaz de satisfacer las demandas incluso para la adaptación a formato múltiple desafiante y compleja, aunque no se realice ninguna etapa de lavado y aunque todas las incubaciones, separaciones y detecciones de todos los objetivos en formato múltiple se realicen (potencialmente) en el mismo pocillo de reacción o recipiente.

En un aspecto, se detectan en paralelo dos o más moléculas objetivo diferentes comprendidas en la muestra, en donde

a. una primera molécula objetivo se detecta mediante un ensayo tipo sándwich y una segunda molécula objetivo se detecta mediante un ensayo competitivo, o

b. ambas moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo tipo sándwich, o

c. ambas moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo competitivo, y

d. una de las moléculas objetivo está presente en una concentración alta y la otra molécula objetivo está presente en una concentración baja, o

e. ambas moléculas objetivo están presentes en una concentración alta, o

f. ambas moléculas objetivo están presentes en una concentración baja.

En modalidades de la invención, se detectan en paralelo dos o más moléculas objetivo diferentes comprendidas en la muestra, en donde

a. una o más moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo tipo sándwich y una o más moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo competitivo, o

b. todas las moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo tipo sándwich, o

c. todas las moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo competitivo, o y

d. una o más de las moléculas objetivo están presentes en una concentración alta y una o más moléculas objetivo están presentes en una concentración baja, o

e. todas las moléculas objetivo están presentes en una concentración alta, o

f. todas las moléculas objetivo están presentes en una concentración baja.

a. una o más moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo tipo sándwich y las otras moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo competitivo, o

c. todas las moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo competitivo, o

d. una o más moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo competitivo y las otras moléculas objetivo se detectan mediante un ensayo tipo sándwich

y

e. una o más de las moléculas objetivo están presentes en una concentración alta y las otras moléculas objetivo están presentes en una concentración baja, o

f. todas las moléculas objetivo están presentes en una concentración alta, o

g. todas las moléculas objetivo están presentes en una concentración baja, o

h. una o más de las moléculas objetivo están presentes en una concentración baja y la otra

a. moléculas objetivo están presentes en una concentración alta.

Dichos ensayos en formato múltiple se realizan preferentemente en un formato de ensayo de dos perlas, mediante el uso de moléculas de captura y detección acopladas a perlas para cada molécula objetivo.

Es una ventaja importante del método de la presente invención que pueden usarse muestras que comprenden una concentración alta o baja de una molécula objetivo a detectar. El intervalo de detección del ensayo varía de concentraciones bajas a medias y altas. Además, cuando se usa como ensayo multiplex, es posible detectar al menos un analito con una concentración alta y al menos un analito con una concentración baja en la misma muestra en paralelo y en el mismo pocillo de reacción. Por ejemplo, es posible analizar una muestra sin diluir, por ejemplo, una muestra de suero o plasma, que puede comprender una concentración alta de un biomarcador determinado y una concentración baja de un segundo biomarcador, y ambos biomarcadores podrían determinarse en la misma muestra sin diluir mediante el uso del método de la presente invención.

En las modalidades de la invención no se usa etapa de lavado. Se demostró que el inmunoensayo de la invención es sorprendentemente capaz de detectar de manera robusta tanto objetivos de concentración baja, como en el intervalo de 1 - 2000 ng/ml, como objetivos de concentración muy alta, tal como en el intervalo de 15 - 120 mg/l. Por tanto, en un aspecto, la concentración de la molécula objetivo en la muestra es de 1 - 2000 ng/ml. En otros ejemplos, la concentración de la molécula objetivo es de 15 - 120 mg/l.

El ensayo descrito aquí proporciona resultados cuantitativos para la detección de una o más moléculas objetivo, preferentemente en un intervalo de concentración de 1 ng/ml a 120 mg/l. En un aspecto, el ensayo proporciona resultados cuantitativos para la detección de una o más moléculas objetivo presentes en una alta concentración. Como se describe aquí, el ensayo proporciona resultados cuantitativos para la detección de una o más moléculas objetivo presentes en una concentración baja. El término resultados cuantitativos para la detección de una o más moléculas objetivo se refiere a la detección de una molécula objetivo que no solo detecta la presencia de la molécula objetivo, sino también la cantidad de concentración de la molécula en una muestra, por ejemplo, en comparación con una o más muestras de referencia.

Una alta concentración puede estar relacionada con una concentración de un analito, preferentemente una proteína o un péptido, de más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280 o 300 mg/l. Un intervalo de detección alto puede referirse a un intervalo de 10-300, 15-250, 20-200, 24 180, 28-160, 30-140, 32-120, 35-100, 40-95, 45-90, 50-85, 55-80, 60-75, 65-70 mg/l.

Una concentración baja puede estar relacionada con una concentración de un analito, preferentemente una proteína o un péptido, más abajo de 2000, 1500, 1000, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1 o 0,05 ng/ml. Un intervalo de detección bajo puede referirse a un intervalo de 0,05-10, 0,1-10, 1-2000, 2-1500, 3-1000, 4-800, 5-600, 6-500, 8-400, 10-300, 12-200, 14-150, 16 140, 18-120, 20-100, 25-95, 30-90, 35-85, 40-80, 45-75, 50-70, 55-65 ng/ml.

La posibilidad de lograr resultados cuantitativos para la concentración de una molécula objetivo en una muestra en intervalo de concentración tan amplios e incluso sin etapa de lavado en el flujo de trabajo de la presente invención es particularmente posible para modalidades de la invención que usan un enfoque de dos perlas. En este caso, es particularmente ventajoso usar perlas de captura con una alta densidad y grandes dimensiones porque desempeña un papel clave en el comportamiento de mezcla durante la incubación con las moléculas objetivo y las perlas/moléculas de detección, y debido a la clara separación posterior a la incubación de las perlas de captura, que subsecuentemente conduce a complejos reproducibles de partícula de detección de analito en fase sólida. Las características preferibles (pero no restrictivas) de las perlas que permiten estas características funcionales son el diámetro de las perlas de captura entre 0,5 pm y 5,0 pm, densidades > 1 g/ml y, si es necesario, propiedades adicionales como magnéticas, electroforéticas u otras; para las características de las perlas de detección son el diámetro de las perlas entre 0,1 pm y 4 pm, densidades inferiores o iguales a las de las perlas de captura y marcadores o propiedades que permiten la detección de las perlas de detección libres unidas después de la separación. La combinación de densidad y las dimensiones de las perlas de captura y detección debe elegirse de manera que permita una clara separación de las dos.

De acuerdo con modalidades de la invención, el método no requiere más de una solución tampón. Preferentemente, la única solución tampón que se requiere en el contexto de la presente invención es el tampón usado para la incubación de las moléculas de captura acopladas en fase sólida, la muestra y las moléculas de detección. Allí, los tres componentes de la etapa a. del método de la invención se pueden añadir e incubar en la solución tampón simultáneamente.

Alternativamente, la muestra y las moléculas de captura pueden incubarse primero sin las moléculas de detección y las moléculas de detección pueden agregarse subsecuentemente. Sin embargo, también en caso de incubación secuencial, solo se necesita una solución tampón.

La detección de las moléculas de detección en el tampón líquido separado después de la incubación conjunta de los componentes del método de la invención puede requerir soluciones tampón adicionales, en dependencia del método de detección. Por ejemplo, la detección de enzimas puede requerir soluciones tampón adicionales. Sin embargo, en las modalidades de la invención, para las etapas de incubación de los componentes de reacción y separación del líquido de la fase sólida, solo se requiere una solución tampón.

En modalidades, la solución tampón se puede proporcionar primero. Luego, la muestra, las moléculas de captura acopladas en fase sólida y las moléculas de detección pueden agregarse a la solución tampón. Cada uno de estos tres componentes se puede proporcionar en forma sólida o en forma líquida. Uno o más de los tres componentes también se pueden suspender en la solución tampón individualmente antes de la incubación conjunta con uno o ambos de los otros componentes. Preferentemente, la muestra que se sospecha que contiene una o más moléculas objetivo y las moléculas de detección se añaden a las moléculas de captura acopladas en fase sólida al mismo tiempo. El método puede llevarse a cabo como un ensayo de una sola etapa. En un ensayo de una sola etapa, la muestra, que comprende las moléculas objetivo, y las moléculas de detección se agregan a las moléculas de captura en la solución tampón al mismo tiempo. Dichos ensayos de una sola etapa no implican la incubación secuencial de reactivos, por ejemplo, un primer período de incubación, en donde las moléculas de captura y las moléculas objetivo se incuban primero en una solución tampón antes de agregar las moléculas de detección.

Debe entenderse que el término "al mismo tiempo" significa aproximadamente al mismo tiempo, lo que se refiere a la adición de los reactivos en un breve intervalo de tiempo. Dicho intervalo puede estar en el intervalo de milisegundos a unos pocos segundos hasta uno o dos minutos, en dependencia de las propiedades de los reactivos y la configuración del ensayo. Un experto en la materia puede juzgar el significado de "al mismo tiempo" o "aproximadamente al mismo tiempo" en el contexto de la presente invención y una reacción de detección específica a realizar.

En modalidades de la presente invención, el sistema automatizado es un sistema microfluídico. En modalidades preferidas, el sistema microfluídico es un sistema microfluídico centrífugo. El uso de un sistema centrífugo es particularmente ventajoso para el método de la presente invención ya que las fuerzas centrífugas son adecuadas para separar la fase sin unión/sobrenadante de las moléculas de captura acopladas a la fase sólida que comprenden las moléculas objetivo unidas y/o las moléculas de captura. La configuración y los principios de la microfluídica centrífuga permiten el manejo de líquidos sin necesidad de bombas o válvulas externas, lo que simplifica el equipo de procesamiento de cartuchos. Además, todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo se pueden almacenar en el desechable y el ensayo se puede realizar de forma totalmente automatizada, siendo la única etapa práctica la adición de la muestra al sistema. Adicionalmente, es posible realizar la preparación de la muestra de forma automatizada.

En modalidades de la invención, la incubación de la muestra, las moléculas de captura acopladas en fase sólida y las moléculas de detección duran no más de 20 minutos. En un ejemplo, el método permite un tiempo de incubación de solo 15 minutos e incluso menos.

Sin embargo, el tiempo de incubación está influenciado por diferentes parámetros. Por ejemplo, el tiempo requerido para la incubación de las moléculas de captura acopladas en fase sólida con las moléculas objetivo y/o las moléculas de detección depende de las propiedades de unión específicas y las características de las moléculas respectivas que se van a usar. Sin embargo, el método se lleva a cabo preferentemente con reactivos que permiten una unión eficaz y rápida de los reactivos entre sí si están presentes en el mismo tampón líquido en solución. En un ejemplo, la incubación no dura más de 30, 28, 26, 24, 22, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 minutos. Además, la temperatura de reacción puede influir en el tiempo de incubación. Se probaron diferentes tiempos de incubación a 37 °C y el ensayo pareció funcionar bien también con duraciones de alrededor de 2 minutos, pero 15 minutos aumenta la robustez. En un ejemplo, la solución tampón se mezcla o agita durante la etapa de incubación.

El hecho de que el método de la invención pueda realizarse con tiempos de incubación tan cortos, que son mucho más cortos que los tiempos de incubación de los ensayos conocidos, se debe en particular a la característica estructural del método que emplea un principio de ensayo de dos perlas. Esto ofrece una ventaja importante y tiene un gran impacto en el tiempo total hasta el resultado y, subsecuentemente, en el tiempo hasta el diagnóstico y el tratamiento. En modalidades de la invención, la fase sólida usada para acoplar las moléculas de captura es una perla y/o el marcador de la molécula de detección es una perla. Sorprendentemente, se ha demostrado que el acoplamiento de perlas de la molécula de captura y/o la molécula de detección acelera la reacción de unión durante la etapa de incubación. Por lo tanto, se ha demostrado que son ventajosas las configuraciones del método de la invención en donde una, o preferentemente ambas, la molécula de captura y la molécula de detección están acopladas con perlas, ya que el tiempo de incubación puede reducirse significativamente.

Además, en modalidades del método de la invención, la fase sólida es una perla, tal como por ejemplo una microperla, una nanoperla, una perla cargada o una perla magnética. En el contexto de la invención, una perla que se acopla a la molécula de captura también se denomina perla de captura. El tipo de perla que se usa como fase sólida acoplada a las moléculas de captura debe tener preferentemente un diámetro de más de 0,5 pm para lograr las propiedades ventajosas para el ensayo como se describió en la presente descripción.

El uso de perlas de captura como fase sólida para acoplar las moléculas de captura es ventajoso en el contexto de la presente invención, ya que las perlas permiten varias formas eficientes de separar las moléculas de captura acopladas en fase sólida con el objetivo unido y/o las moléculas de detección después incubación desde la fase sin unión. Por ejemplo, es posible la separación por centrifugación. Por ejemplo, en caso de separación centrífuga, las perlas no tienen que ser magnéticas, sino que solo deben tener la densidad suficiente para interactuar con las fuerzas centrífugas generadas por la centrifugación. En el caso de perlas magnéticas, también es posible la eliminación magnética de las perlas de la solución líquida. En modalidades preferidas, la separación de las perlas de captura de la solución tampón se produce mediante sedimentación. La sedimentación se refiere a la separación a través de fuerzas gravitatorias sin necesidad de aplicar externamente más estímulos o fuerzas.

En el contexto de un enfoque de dos perlas, las ventajas de usar perlas de captura se mantienen ya que las perlas de captura pueden separarse de las perlas de detección y tienen diferentes propiedades que pueden permitir, por ejemplo, la separación de las perlas de captura de la solución tampón mientras que la perla de detección no unida permanece disuelta en la solución tampón.

En un aspecto, la separación se produce en no más de 1 minuto. Mediante el uso de perlas de captura que son más grandes, más pesadas y/o tienen una densidad más alta, preferentemente perlas que tienen un diámetro de más de 0,5 |jm, en contraste con las perlas de detección que son más pequeñas, más livianas y/o tienen una densidad más baja que las perlas de captura, la separación basada en la sedimentación es posible. Esto es muy ventajoso porque una separación magnética como la conoce el usuario experto en la técnica necesita un tiempo de separación de al menos 2 minutos o más y adicionalmente requiere componentes magnéticos específicos para la separación. Por el contrario, la separación basada en la sedimentación se puede lograr en marcos de tiempo de menos de 1 minuto, tal como por ejemplo aproximadamente de 55, 50, 45, 40,35, 30, 25, 20,15, 10 o incluso 5 segundos. El tiempo para responder/tiempo para obtener un resultado del método de la invención es muy importante para las aplicaciones de diagnóstico en entornos cercanos al paciente o en el punto de atención. Debido al enfoque de dos perlas de esta invención, no solo se puede reducir considerablemente el tiempo de incubación, sino que también se simplifica y acelera la separación. En modalidades de la invención, la separación de las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón se produce mediante fuerzas magnéticas, gravitatorias, centrífugas o electroforéticas.

Otras ventajas de usar perlas como fase sólida en el contexto de la presente invención incluyen tiempos de incubación más cortos, almacenamiento de reactivos más sencillo e integración simplificada del método en un sistema microfluídico. Las perlas se pueden dispensar y almacenar fácilmente en desechables con dispositivos de alto rendimiento de última generación (por ejemplo, robot de pipeteo). Además, es posible preparar un solo lote de perlas de gran volumen e implementar diferentes ensayos en un solo desechable sin la automatización de la preparación de reactivos, lo que es particularmente ventajoso para el bajo rendimiento del ensayo y cuando el ensayo es autopreparado, por ejemplo, en instalaciones de investigación.

En un aspecto, se usa una gran cantidad de moléculas de captura acopladas en fase sólida para asegurar que se capturen prácticamente todas las moléculas objetivo presentes en la muestra, incluso si la concentración de las moléculas objetivo en la muestra es muy alta. En tales aspectos, es ventajoso utilizar perlas como fase sólida, ya que esto permite proporcionar una relación superficie/volumen de fase sólida muy alta para acoplar moléculas de captura, lo que aumenta el número de sitios de unión en la fase sólida. Esto también permite la detección de intervalos de medición altos sin una dilución del material de la muestra, lo cual es una gran ventaja para los sistemas automatizados, ya que se simplifica la preparación de la muestra (y, además, es una ventaja para los sistemas microfluídicos y/o centrífugos, ya que la huella del cartucho es más pequeña y más simple).

En modalidades que no forman parte de la invención, la fase sólida es una placa de microtitulación. Esta modalidad es particularmente ventajosa para realizar el método de la invención manualmente o mediante un robot de pipeteo automatizado en una placa multipocillo. En modalidades adicionales, la fase sólida puede ser una superficie de un sistema microfluídico, tal como la superficie de una cámara de reacción de un disco centrífugo.

En determinadas modalidades de la invención, la molécula de captura reconoce un primer epítopo comprendido por la molécula objetivo. Este puede ser el caso tanto para un ensayo competitivo, así como también para uno de tipo sándwich.

En modalidades adicionales, la molécula de detección reconoce un segundo epítopo comprendido por la molécula objetivo. Esta característica se refiere a los ensayos tipo sándwich, en donde tanto la molécula de detección como la molécula de captura se unen a la molécula objetivo, pero a diferentes epítopos. De acuerdo con modalidades de la invención, la molécula de captura reconoce un primer epítopo comprendido por la molécula objetivo y la molécula de detección reconoce un segundo epítopo comprendido por la molécula objetivo.

En modalidades de la invención,

a. la molécula de captura reconoce un primer epítopo comprendido por la molécula objetivo, y

b. la molécula de detección reconoce un segundo epítopo comprendido por la molécula objetivo (ensayo tipo sándwich) o

c. la molécula de detección comprende el primer epítopo reconocido por la molécula de captura (ensayo competitivo).

En un aspecto, la molécula de detección comprende el primer epítopo reconocido por la molécula de captura. En una variante del método, la molécula de captura reconoce un primer epítopo comprendido por la molécula objetivo y la molécula de detección también comprende el primer epítopo reconocido por la molécula de captura. De acuerdo con este aspecto, el primer epítopo de la molécula de detección y el primer epítopo de la molécula objetivo pueden unirse ambos a la molécula de captura y, por lo tanto, compiten por unirse a la molécula de captura. Es posible que la molécula de captura no pueda unirse a dos epítopos, pero solo puede unirse a un epítopo.

Esto se refiere a ensayos competitivos, en donde la molécula de detección y la molécula objetivo compiten por unirse a la molécula de captura. En determinados ejemplos, la molécula objetivo y la molécula de detección son la misma molécula, que puede diferir en determinados aspectos requeridos para la detección de la molécula de detección. Por ejemplo, la molécula de detección puede estar marcada y/o comprender una etiqueta que es reconocida por una molécula de detección secundaria. Alternativamente, la molécula de detección y la molécula objetivo pueden tener solo un determinado dominio o estructura en común, que comprende el epítopo reconocido por la molécula de captura.

Por lo tanto, en dependencia de la abundancia o concentración de las moléculas objetivo en el tampón de incubación, una cantidad mayor o menor de moléculas de detección se unirá a las moléculas de captura tras la incubación simultánea de las moléculas de captura, las moléculas de detección y las moléculas objetivo y no estarán presentes en la solución tampón después de la separación de la fase sólida que comprende las moléculas de captura acopladas con las moléculas objetivo y de detección unidas. En el caso de una alta concentración de moléculas objetivo, el número de moléculas de detección detectables en la solución tampón después de la separación se reducirá con menos fuerza en comparación con una situación con pocas moléculas objetivo. Si hay una alta concentración de moléculas objetivo que comprenden el primer epítopo, muchas moléculas de captura se unirán a moléculas objetivo y no estarán disponibles para unirse a moléculas de detección. En consecuencia, el número de moléculas de detección después de la separación de la fase sólida no se reducirá tan fuertemente, en comparación con una situación en la que hay pocas moléculas objetivo, y todas o la mayoría de las moléculas de captura se unirán a las moléculas de detección que comprenden el primer epítopo, que, en consecuencia, ya no estará presente en la solución tampón después de la separación de las moléculas de captura acopladas en fase sólida.

En otra modalidad de la invención, la molécula de captura comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo o un antígeno, y/o la molécula de detección comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo o un antígeno. De acuerdo con una modalidad adicional, la molécula de captura comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo y/o la molécula de detección comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo. Preferentemente, el método de la invención es un inmunoensayo que comprende al menos un anticuerpo y al menos un antígeno como molécula de captura, molécula objetivo y molécula de detección.

En modalidades preferidas de la invención, las moléculas de detección se acoplan a perlas (perlas de detección). Allí, las perlas pueden servir como marcador. Esto es ventajoso ya que las perlas tienen una alta relación superficievolumen, lo que facilita de esta manera un alto número de moléculas de detección en su superficie, lo que disminuye el tiempo de interacción entre las moléculas de captura y las moléculas de detección. Además, si las perlas son perlas fluorescentes, pueden usarse para amplificar la señal, ya que contienen una gran cantidad de fluoróforos, lo que aumenta de esta manera la intensidad de la señal y, por lo tanto, la sensibilidad del sistema. En modalidades de la invención, las moléculas de captura y las moléculas de detección se acoplan ambas a las perlas, en donde las perlas acopladas a las moléculas de captura se distinguen de las perlas acopladas a las moléculas de detección. Por ejemplo, las perlas de las moléculas de captura y las perlas de las moléculas de detección pueden tener diferente masa, diámetro, tamaño, material, forma, propiedades eléctricas y/o propiedades magnéticas, y/o pueden estar marcadas de manera diferente, por ejemplo, por diferentes marcadores o etiquetas fluorescentes. Preferentemente, el peso y/o el tamaño y/o la densidad del tipo de perla de detección es menor que el peso y/o el tamaño y/o la densidad de las perlas de captura.

Aquí se describe un kit para detectar una molécula objetivo en una muestra de acuerdo con el método de cualquiera de la presente invención, en donde el kit comprende

a. moléculas de captura acopladas en fase sólida adecuadas para unirse a las moléculas objetivo,

b. moléculas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura,

c. y opcionalmente medios para detectar las moléculas de detección en una solución tampón después de

i. incubar en la solución tampón las moléculas de captura acopladas en fase sólida, la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo y una cantidad definida de moléculas de detección, y

ii. separar las moléculas de captura acopladas en fase sólida de la solución tampón.

Preferentemente, el kit comprende adicionalmente un sistema microfluídico, tal como un sistema microfluídico centrífugo. Además, el kit puede comprender una cantidad definida de moléculas de detección. Los componentes del kit se han descrito en el contexto del método de la invención. Además, el experto en la técnica conoce medios adicionales para detectar las moléculas de detección en una solución tampón.

Preferentemente, el kit comprende

a. perlas de captura adecuadas para unirse a las moléculas objetivo,

b. perlas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las moléculas de captura, en donde las perlas de captura y las perlas de detección son perlas compactas individuales, las perlas de captura pueden separarse de las perlas de detección, las perlas de captura tienen una densidad mayor que o densidad igual a las perlas de detección y las perlas de captura tienen un diámetro de al menos 0,5 pm, c. opcionalmente un sistema microfluídico, preferentemente un sistema microfluídico centrífugo,

d. y opcionalmente una solución tampón y/o medios para detectar las perlas de detección en una solución tampón después de

ii. separar en el pocillo de reacción las perlas de captura de la solución tampón que comprende perlas de detección no unidas.

Descripción detallada de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En el contexto de la presente invención, el término "sistema automatizado" se refiere a un sistema que es capaz de llevar a cabo todas (o algunas de las) etapas necesarias para detectar una o más moléculas objetivo en una muestra sin la participación de etapas manuales por personal capacitada después de agregar la muestra al sistema. En el contexto de la invención, el término "sistema automatizado" se refiere tanto a sistemas completamente automatizados como a sistemas (semi)automatizados.

En algunos casos (semi)automatizados, puede ser que el sistema requiera la adición manual de líquidos que son necesarios para llevar a cabo las etapas para detectar la molécula objetivo.

Un sistema automatizado no requiere la supervisión de personal capacitado, por lo que de esta manera se reducen los costos generales de mano de obra. Además, se pueden evitar los errores manuales (incluso por parte de personal capacitado) y se puede mejorar la reproducibilidad de los resultados. Además, un sistema automatizado reduce el tiempo de manipulación desde la adición de la muestra hasta el resultado en comparación con el flujo de trabajo manual.

Es importante destacar que puede usarse un sistema automatizado para transferir un flujo de trabajo de un usuario capacitado a una persona no capacitada o con capacitación limitada. Por lo tanto, los procesos biológicos completos, tales como la preparación de muestras, la extracción y purificación de ácidos nucleicos, la extracción y purificación de proteínas, la amplificación y la detección, pueden integrarse en sistemas automatizados y simplificarse para los usuarios finales, ofreciendo ventajas como alto rendimiento, adaptación a formato múltiple y alta paralelización de ensayos, portabilidad de dispositivos para aplicaciones de punto de atención y medición precisa.

Algunas etapas de procesamiento que típicamente se realizan en sistemas automatizados son, por ejemplo, pero que no se limitan a, la dilución del material de la muestra, la mezcla de la muestra con varios reactivos como moléculas de captura, moléculas de detección y solución tampón, etapas de lavado y detección (o preparación para la detección).

Se puede elaborar un sistema automatizado de modo que la automatización incorporada permita al usuario generar reacciones de múltiples etapas que requieran un bajo nivel de experiencia y aun así lograr varias funcionalidades. Los sistemas automatizados, especialmente cuando se combinan con cartuchos microfluídicos, pueden ocupar poco espacio y pueden proporcionar análisis en el punto de atención/punto de necesidad.

En general, los sistemas automatizados pueden dirigir, mezclar, separar o manipular fluidos para lograr, por ejemplo, multiplexado, resultados rápidos y sistemas de alto rendimiento. Se conocen en la técnica varios sistemas automatizados para inmunoensayos y podrían usarse para realizar el método de la presente invención, potencialmente en una forma modificada. El experto en la materia sabe cómo usar y ajustar dichos sistemas para llevar a cabo el método de la invención.

Los dispositivos microfluídicos aprovechan las propiedades físicas y químicas de los líquidos y gases a microescala. Un sistema microfluídico automatizado en el sentido de la presente invención se refiere a un sistema que permite el control y la manipulación precisos de fluidos que están restringidos geométricamente a una escala pequeña, a menudo submilimétrica. Los sistemas microfluídicos automatizados pueden usarse para mover, mezclar, separar o procesar líquidos para lograr reacciones rápidas, adaptación a formato múltiple, automatización y análisis de alto rendimiento de líquidos y, preferentemente, moléculas objetivo presentes en los líquidos. Los sistemas microfluídicos suelen cumplir al menos una de las características de pequeños volúmenes (ml, pl, nl, pl, fl), tamaño pequeño, bajo consumo de energía y efectos del microdominio. Numerosas aplicaciones emplean técnicas de control pasivo de fluidos como fuerzas capilares. En algunas aplicaciones, los medios de accionamiento externos se usan adicionalmente para un transporte dirigido de los medios y líquidos. Por ejemplo, los sistemas microfluídicos centrífugos/accionadores giratorios aplican fuerzas centrífugas para el transporte de fluidos en chips pasivos. La microfluídica activa se refiere a la manipulación definida del fluido de trabajo por (micro) componentes activos tales como microbombas o microválvulas. Las microbombas suministran fluidos de forma continua o se usan para dosificación. Las microválvulas determinan la dirección del flujo o el modo de movimiento de los líquidos bombeados. Los procesos que normalmente se llevan a cabo en un laboratorio se miniaturizan en un solo cartucho para mejorar la eficiencia y la movilidad, así como también para reducir los volúmenes de muestras y reactivos. La automatización en el contexto de los sistemas microfluídicos se refiere al hecho de que, tras la carga inicial del sistema con los componentes necesarios, tales como tampones de ensayo, reactivos y una o más muestras, las etapas del ensayo pueden llevarse a cabo automáticamente sin necesidad de interferencias manuales adicionales del usuario.

Los sistemas microfluídicos automatizados de la presente invención comprenden chips o cartuchos microfluídicos, que están formados por un patrón de microcanales y cámaras y eventualmente otros componentes, que pueden moldearse, termoformarse, grabarse o producirse por otros métodos adecuados. Algunos sistemas necesitan un vínculo con el macroentorno mediante varios orificios de diferentes dimensiones excavados en el chip. Es a través de estas vías que los fluidos pueden inyectarse y evacuarse de un chip o sistema microfluídico. En general, los dispositivos microfluídicos pueden dirigir, mezclar, separar o manipular fluidos para lograr, por ejemplo, adaptación a formato múltiple, automatización y análisis de alto rendimiento. El diseño de la red de microcanales debe elaborarse con precisión para lograr las características deseadas (laboratorio en un chip, in situ de tratamiento/preparación de muestras, detección de microorganismos, ácidos nucleicos, proteínas u otras (bio)moléculas, etc.). Para gestionar con precisión los fluidos dentro de los microcanales, se requieren sistemas específicos. Estos elementos se pueden encontrar incrustados dentro del chip, disco o cartucho microfluídico.

Los sistemas microfluídicos ofrecen varios beneficios sobre los sistemas de tamaño convencional. Permiten el análisis y el uso de un menor volumen de muestras, productos químicos y reactivos, lo que reduce los costos generales de fabricación y aplicación y abre nuevas áreas posibles de aplicación. Se pueden ejecutar muchas operaciones al mismo tiempo gracias al tamaño compacto de los cartuchos microfluídicos, aumentando así el rendimiento analítico. Las dimensiones de micro/nanoescala permiten tiempos de reacción más rápidos, lo que acorta de esta manera el tiempo de obtención de resultados. Los sistemas microfluídicos tienen la capacidad de procesar y analizar muestras con un manejo menor de muestras. Se puede elaborar un cartucho microfluídico para que la automatización incorporada permita al usuario generar reacciones de múltiples etapas que requieren un bajo nivel de experiencia y aun así logran muchas funcionalidades. Dichos sistemas microfluídicos ejecutan funciones que van desde la detección de moléculas objetivo, tales como proteínas o toxinas, hasta el análisis de secuencias de ADN o la creación de dispositivos de impresión por inyección de tinta. Los sistemas microfluídicos tienen diversos activos: tiempo de reacción rápido, sensibilidad analítica mejorada, control de temperatura mejorado, portabilidad, automatización y paralelización más sencillas, integración de rutinas de laboratorio en un solo dispositivo (laboratorio en un chip). Los sistemas microfluídicos son baratos ya que no implican el uso de varios equipos o dispositivos costosos y reducen el tiempo de manipulación, lo que reduce de esta manera los costos de mano de obra. Todo el proceso biológico, tal como la preparación de muestras, la extracción y purificación de ácidos nucleicos, la extracción y purificación de proteínas, la amplificación y la detección, puede integrarse en la microfluídica y simplificarse para los usuarios finales. Estos ofrecen ventajas tal como ensayos de alto rendimiento, multiplexados y altamente paralelos, análisis más rápidos debido a los tiempos de reacción y/o separación más cortos, realización en dispositivos portátiles para aplicaciones de punto de atención, bajo consumo de reactivos y medición precisa. En general, la microfluídica permite aumentar la resolución de la medición en determinadas aplicaciones.

Los sistemas microfluídicos comprenden los llamados dispositivos laboratorio en un chip (LOAC). Un LOAC es un dispositivo que realiza a escala miniaturizada uno o varios análisis que se realizan habitualmente en un laboratorio. Integra y automatiza múltiples técnicas de laboratorio de alta resolución, tal como síntesis y análisis de productos químicos o pruebas de fluidos, en un sistema que cabe en un chip. Hay muchas ventajas de operar a esta escala. El análisis de muestras puede ocurrir en el sitio (punto de atención / punto de necesidad), donde se generan las muestras, en lugar de llevarlas a un laboratorio. A microescala es más fácil controlar el comportamiento de los fluidos, el movimiento y la interacción de las muestras, haciendo que las reacciones sean mucho más potentes y minimizando el desecho químico. También permite una exposición reducida a productos químicos peligrosos.

Otros ejemplos de sistemas microfluídicos automatizados conocidos por el experto en la técnica que pueden usarse en el contexto de la presente invención comprenden sistemas microfluídicos de flujo continuo, microfluídicos digitales y optofluídicos.

Preferentemente, el método de la presente invención se lleva a cabo en el contexto de un sistema microfluídico centrífugo. Un sistema microfluídico centrífugo o un cartucho microfluídico centrífugo es un tipo de tecnología de laboratorio en un chip que puede usarse para integrar procesos como la separación, la mezcla, las reacciones biomoleculares y la detección de moléculas en una sola pieza de plataforma, incluida una plataforma con forma de disco. Este cartucho es una integración de múltiples tecnologías en diferentes áreas. Algunos componentes de elementos básicos, tales como válvulas, unidades de mezcla y unidades de separación, deben usarse para completar el proceso de prueba completo. Hay muchos métodos propuestos por científicos que se han propuesto para ser realizados en sistemas microfluídicos centrífugos, incluidos los inmunoensayos. La etapa final puede ser recibir datos del cartucho por medio de un dispositivo de procesamiento dedicado. Se conocen en la técnica varios sistemas microfluídicos centrífugos y podrían usarse para realizar el método de la presente invención, potencialmente en una forma modificada. El experto en la materia sabe cómo usar y ajustar dichos sistemas para llevar a cabo el método de la invención. Los desarrollos recientes en el campo de la microfluídica centrífuga también se describen en [19], [22].

En el contexto de la presente invención, el término "molécula objetivo" se refiere a una molécula de interés para ser detectada en una muestra. Preferentemente, la molécula objetivo es una biomolécula, tal como, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, enzimas, péptidos, anticuerpos, moléculas de azúcar, lípidos y sus combinaciones, tal como, por ejemplo, proteínas glicosiladas u otras biomoléculas glicosiladas.

El término "muestra" en el sentido de la presente invención se refiere a cualquier tipo de líquido o material licuable que se sospeche que comprende una molécula objetivo. El material de muestra usado en la presente invención puede ser, por ejemplo, una muestra biológica, tal como un fluido corporal o tejido obtenido de un organismo, tal como un mamífero o preferentemente un ser humano, en donde un fluido corporal o tejido puede ser sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, esputo, derrames pleurales, una muestra de tejido, una biopsia de tejido, una muestra de heces, células, un extracto celular, células de cultivo celular, extractos de cultivo celular o sobrenadantes de cultivo celular, y similares. Las muestras pueden ser también de naturaleza no humana, por ejemplo: del sector ambiental: agua de balsas, agua de lastre, agua de mar, y similares; del sector de alimentos y bebidas: leche, jugos, vino y similares. Dichas muestras pueden analizarse sin diluir o diluidas y/o después de la licuefacción.

En el contexto de la presente invención, una muestra puede analizarse mediante el método descrito en la presente descripción para determinar si una molécula objetivo específica está presente en dicha muestra o no. En general, se analizará una muestra que se sospeche que contiene la molécula objetivo de interés y se podrá usar el método de la presente invención para determinar la cantidad y/o concentración de la molécula objetivo en dicha muestra de forma cuantitativa o semicuantitativa, por ejemplo, en comparación con una o más muestras de referencia, que se sabe que no contienen la molécula objetivo o que contienen la molécula objetivo. Preferentemente, en dicha muestra de referencia se conoce la concentración exacta de la molécula objetivo.

Como se usa en la presente descripción, una "molécula de captura" puede ser cualquier molécula que se sabe que interacciona o que se sabe que se une a la molécula objetivo respectiva. Por ejemplo, si la molécula objetivo es un antígeno específico, tal como una biomolécula o proteína específica (citocina, toxina, biomarcador proteico, enzima, hormona o fragmento del mismo), la molécula de captura puede ser un anticuerpo. Alternativamente, si la molécula objetivo es un anticuerpo específico, la molécula de captura puede ser un antígeno conocido por unirse al anticuerpo específico de interés. La molécula objetivo puede ser un ligando de un receptor y la molécula de captura puede ser el receptor correspondiente, o viceversa. La molécula objetivo puede ser una molécula de ácido nucleico de una secuencia específica y la molécula de captura puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de la molécula objetivo, permitiendo la unión de la molécula objetivo a la molécula de captura.

Un anticuerpo, también conocido como inmunoglobulina (Ig), es una proteína grande en forma de Y producida principalmente por las células plasmáticas que el sistema inmunitario usa para unirse a moléculas específicas que el organismo reconoce como extrañas, por ejemplo, moléculas de un patógeno invasor. El anticuerpo reconoce un objetivo, llamado antígeno, a través de la región variable de Fab. Cada punta de la "Y" de un anticuerpo contiene un parátopo que es específico para un epítopo particular en un antígeno, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión. Mediante el uso de este mecanismo de unión, un anticuerpo puede unirse al antígeno correspondiente. Los anticuerpos pueden venir en diferentes variedades conocidas como isotipos o clases, tal como en los mamíferos placentarios los cinco isotipos de anticuerpos conocidos como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que pueden usarse en el contexto de la presente invención. También pueden usarse fragmentos de anticuerpos o partes específicas en el contexto de la presente invención. Los brazos de la estructura Y de un anticuerpo contienen los sitios que pueden unirse a los antígenos y esta región del anticuerpo se denomina región Fab (fragmento, unión a antígeno). Se compone de un dominio constante y uno variable de cada cadena pesada y ligera del anticuerpo. El parátopo está formado en el extremo amino terminal del monómero del anticuerpo por los dominios variables de las cadenas pesada y ligera. El dominio variable también se denomina región FV y es importante para la unión a antígenos. Para ser específicos, los bucles variables de las cadenas p, cada una de las cadenas (variable) ligera (VL) y (variable) pesada (VH) son responsables de la unión al antígeno. Estos bucles se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La base de la Y se llama la región Fc (fragmento cristalizable), y está compuesta por dos cadenas pesadas que contribuyen con dos o tres dominios constantes en dependencia de la clase del anticuerpo. La región Fc se une a una clase específica de receptores Fc, y otras moléculas inmunitarias, tales como las proteínas del complemento. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos idénticos que tienen parátopos idénticos y reaccionan o se unen al mismo epítopo específico de un antígeno. Por el contrario, el término "anticuerpo policlonal" se refiere a un grupo de diferentes anticuerpos que reaccionan con diferentes epítopos del mismo antígeno. Como se usa en la presente descripción, el término anticuerpo se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos o moléculas de anticuerpo modificadas que comprenden la función de reconocimiento de antígeno de los anticuerpos como se describió anteriormente.

Un epítopo es un determinante antigénico, que es la parte de un antígeno que es reconocido por el sistema inmunitario, específicamente por anticuerpos u otros receptores del sistema inmunitario. En el contexto de la presente invención el término "epítopo" se usa en un sentido más amplio para denominar la estructura de una molécula objetivo que es reconocida y unida por la molécula de captura y/o la molécula de detección usada en el método de la presente invención. En consecuencia, el término "epítopo" en el sentido de la presente invención no se limita a una estructura o parte de un antígeno que es reconocido por un anticuerpo, sino que también se relaciona con una estructura, parte o área superficial específica de cualquier molécula objetivo en el sentido de la presente invención, que se une o interactúa con la correspondiente molécula de captura y/o molécula de detección usada en el método de la invención.

La detección de una molécula objetivo por el método de la presente invención se refiere a la determinación directa o indirecta de la presencia de la molécula objetivo por medio de una molécula de detección. Una molécula de detección es una molécula que es una molécula marcada, que puede detectarse directamente por medio del marcador, o puede detectarse indirectamente, por ejemplo, por medio de una molécula de detección secundaria marcada que se une a la molécula de detección (primaria). Una molécula de detección en el sentido de la presente invención puede unirse a la molécula de captura y/o a la molécula objetivo. En caso de unión de la molécula de captura a la molécula de detección, el método de la presente invención se lleva a cabo como un ensayo competitivo, en donde la molécula de detección y la molécula objetivo compiten por unirse a la molécula de captura. En caso de unión de la molécula de detección a la molécula objetivo en el contexto de la presente invención, el método se lleva a cabo preferentemente como un ensayo tipo sándwich, en donde la molécula objetivo se une tanto a la molécula de captura, así como también a la molécula de detección a través de dos epítopos diferentes.

Como se explica en la presente descripción, el método de la presente invención puede llevarse a cabo como un inmunoensayo, que implica la unión entre anticuerpos y antígenos para la detección de un antígeno específico o de anticuerpos específicos en una muestra de interés. Sin embargo, los principios para detectar la presencia de una molécula objetivo capturada con la ayuda de una molécula de detección empleada por inmunoensayos, que se explican a continuación, también se aplican correspondientemente a las modalidades alternativas del método de la invención que no involucran la interacción anticuerpo-antígeno, pero implican otras moléculas objetivo y de captura, tales como moléculas de ácido nucleico, receptores y agonistas de receptores y otros ejemplos descritos en la presente descripción y conocidos por los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente descripción, un inmunoensayo es un método que se usa, por ejemplo, en medicina de laboratorio, en el que se usa una reacción específica de anticuerpo-antígeno para detectar un analito o una molécula objetivo en una muestra. Un inmunoensayo es una prueba bioquímica que mide la presencia o concentración de una macromolécula o una molécula pequeña en una solución mediante el uso de un anticuerpo o un antígeno. La molécula detectada por el inmunoensayo suele denominarse "analito" y en muchos casos es una proteína, aunque pueden ser otro tipo de moléculas, de diferente tamaño y tipo, siempre que sean anticuerpos u otras moléculas de captura que tengan las propiedades adecuadas para unirse al analito que está disponible. El uso de un calibrador se emplea a menudo en inmunoensayos. Los calibradores son soluciones que se sabe que contienen el analito en cuestión, y la concentración de ese analito generalmente se conoce. La comparación de la respuesta de un ensayo a una muestra real con la respuesta del ensayo producida por los calibradores hace posible interpretar la intensidad de la señal en términos de presencia o concentración de analito en la muestra. No es necesario incluir calibradores en cada ejecución, pero se pueden medir por lotes. En una modalidad preferida, el método de la presente invención es un inmunoensayo que emplea anticuerpos y antígenos como moléculas de captura y moléculas objetivo, o viceversa.

Los inmunoensayos se basan en la capacidad de un anticuerpo para reconocer y unirse a un antígeno específico, tal como una macromolécula específica, en lo que podría ser una mezcla compleja de moléculas o macromoléculas, tal como una muestra biológica. En algunos casos, un inmunoensayo puede usar un antígeno para detectar la presencia de anticuerpos, que reconocen ese antígeno, en una solución. En consecuencia, el analito puede ser un antígeno o un anticuerpo. Además de la unión de un anticuerpo a su antígeno, la otra característica clave de todos los inmunoensayos es un medio para producir una señal medible en respuesta a la unión del antígeno al anticuerpo, que en el contexto de la presente invención en general corresponde a la unión de la molécula de captura a la molécula objetivo. La mayoría de los inmunoensayos, aunque no todos, implican la unión química de anticuerpos o antígenos con algún tipo de marcador detectable, en donde estos anticuerpos o antígenos marcados sirven como una molécula de detección.

Existe una gran cantidad de marcadores en los inmunoensayos modernos y permiten la detección a través de diferentes medios. Muchos marcadores son detectables porque emiten radiación, producen un cambio de color en una solución, emiten fluorescencia bajo la luz o pueden ser inducidos a emitir luz. Los marcadores adecuados son conocidos por el experto en la técnica. Una lista no exhaustiva de posibles marcadores comprende, sin limitación, enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa; isótopos radioactivos; indicadores de ADN que pueden usarse en una PCR inmunocuantitativa en tiempo real (iqPCR), en donde el marcador se usa como una sonda de ADN; reporteros fluorogénicos; etiquetas o marcadores electroquímicos, que emiten luz detectable en respuesta a la corriente eléctrica; perlas o partículas, que pueden tener un tamaño y/o peso específico, y/o que pueden comprender otros marcadores como se describió en la presente descripción (marcador fluorescente, marcaje enzimático, etc.). Los puntos cuánticos o partículas inorgánicas similares representan otro posible tipo de marcador a usar en el contexto de la invención.

Los marcadores directos incluyen etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales, colorantes, radionucleótidos y similares, unidos a la molécula de detección. Una molécula de detección, tal como un anticuerpo marcado con yodo-125 (125I) puede usarse para determinar los niveles de uno o más marcadores en una muestra. Un ensayo de quimioluminiscencia mediante el uso de un anticuerpo quimioluminiscente específico para el marcador es adecuado para la detección sensible y no radiactiva de los niveles del marcador. Una molécula de detección marcada con fluorocromo también es adecuada para determinar los niveles de uno o más marcadores en una muestra. Los ejemplos de fluorocromos (o fluoróforos), que pueden usarse en el contexto de la presente invención comprenden, sin limitación, rodamina y derivados, tales como Texas Red, fluoresceína y derivados, tales como 5-bromometil fluoresceína, Lucifer amarillo, ⁱA ^eDANS, 7-Me2N-cumarina-4-acetato, 7-OH-4-CH3-cumarina-3-acetato, 7-NH2-4CH3-cumarina-3-acetato (AMCA), monobromobimano, trisulfonatos de pireno, tales como Cascade Blue y monobromotrimetil-amoniobimano, FAM, TET, CAL Fluor Gold 540, HEX, JOE, VIC, CAL Fluor naranja 560, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TMR, CAL Fluor rojo 590, ROX, LC rojo 610, CAL Fluor rojo 610, rojo Texas, LC rojo 610, CAL Fluor rojo 610, LC rojo 640, CAL Fluor rojo 635, Cy5, LC rojo 670, Quasar 670, Oyster 645, LC rojo 705, Cy5.5, BODIPY FL, verde Oregón 488, verde rodamina, verde Oregón 514, Cal Gold, BODIPY R6Gj, amarillo Yakima, Cal naranja, BODIPY TMR-X, Quasar-570 /Cy3, TAMRA, rojo rodamina-X, rodamina B, rodamina 6g , rojo Redmond, BODIPY 581/591, Cy3.5, rojo Cal/rojo Texas, BODIPY TR-X, BODIPY 630/665-X, Pulsar-650, Quasar-670/Cy5. El marcaje fluorescente también puede ocurrir a través de proteínas fluorescentes, tales como, por ejemplo, fotoproteínas, tal como la aecuorina; obelín; proteínas fluorescentes de aequorea, tales como, por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes (GFP, EGFP, AcGFP1), proteínas fluorescentes cian (CFP, ECFP), proteínas fluorescentes azules (BFP, EBFP), proteínas fluorescentes rojas (RFP), proteínas fluorescentes amarillas (YFP, EYFP), proteína fluorescente ultravioleta (GFPuv), sus variantes de mejora de la fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptidos y similares; proteínas fluorescentes de arrecifes de coral, tales como, por ejemplo, proteínas fluorescentes rojas Discosoma (DsRed, DsRed1, DsRed2 y DsRed-Express), proteínas fluorescentes rojas Anemonia (AsRed y AsRed2), proteínas fluorescentes rojas lejanas Heteractis (HcRed, HcRed1), cian Anemonia proteínas fluorescentes (AmCyan, AmCyan1), proteínas fluorescentes verdes de Zoanthus (ZsGreen, ZsGreen1), proteínas fluorescentes amarillas de Zoanthus (ZsYellow, ZsYellow1), sus variantes de mejora de la fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptidos y similares; proteína verde fluorescente de renilla reniformis (Vitality hrGFP), sus variantes de mejora de la fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptidos y similares; y proteínas fluorescentes de Great Star Coral, tales como, por ejemplo, proteína fluorescente de Montastrea cavernosa (Monster Green® proteína fluorescente), sus variantes de mejora de la fluorescencia, sus variantes de desestabilización de péptidos y similares. Un experto en la técnica entiende que estas y una variedad de otras proteínas fluorescentes pueden ser útiles como proteína fluorescente en aspectos de la invención, véase, por ejemplo, [23]. Un experto en la técnica entiende que estas y muchas otras proteínas fluorescentes, incluidas las especies ortólogas y parálogas de las proteínas fluorescentes naturales descritas anteriormente, así como también las proteínas fluorescentes diseñadas, pueden ser útiles como una proteína fluorescente descrita en aspectos de la presente memoria descriptiva. Sin embargo, los expertos conocen otros ejemplos de marcadores fluorescentes y otros marcadores que pueden usarse en el contexto de los inmunoensayos, así como también el método de la presente invención. Las moléculas de detección secundarias tales como anticuerpos secundarios o ligadas a fluorocromos pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, IgG-FITC antihumano F(ab')2 de cabra está disponible en Tago Immunologicals (Burlingame, CA).

Los marcadores indirectos incluyen varias enzimas bien conocidas en la técnica, tal como la peroxidasa de rábano picante (HRP), la fosfatasa alcalina (AP), la p-galactosidasa, la ureasa y similares. Puede usarse un sistema de detección de peroxidasa de rábano picante, por ejemplo, con el sustrato cromogénico tetrametilbencidina (TMB), que produce un producto soluble en presencia de peróxido de hidrógeno que es detectable a 450 nm. Puede usarse un sistema de detección de fosfatasa alcalina con el sustrato cromogénico fosfato de p-nitrofenilo, por ejemplo, que produce un producto soluble fácilmente detectable a 405 nm. De manera similar, puede usarse un sistema de detección de p-galactosidasa con el sustrato cromogénico o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG), que produce un producto soluble detectable a 410 nm.

Se puede analizar una señal del marcador directo o indirecto, por ejemplo, mediante el uso de un espectrofotómetro para detectar el color de un sustrato cromogénico; un contador de radiación para detectar radiación, tal como un contador gamma para la detección de 125I; o un fluorómetro, fotomultiplicador o fotodiodo para detectar fluorescencia en presencia de luz de una determinada longitud de onda. Para la detección de anticuerpos ligados a enzimas, se puede realizar un análisis cuantitativo de la cantidad de niveles de marcador mediante el uso de un espectrofotómetro tal como un lector de microplacas EMAX (Molecular Devices; Menlo Park, Calif.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos de la presente invención se pueden automatizar o realizar de forma robótica, y la señal de múltiples muestras se puede detectar simultáneamente.

Como ejemplos de medios para detectar el marcador en el método de la presente invención, pueden usarse una variedad de técnicas de inmunoensayo, que incluyen inmunoensayos competitivos y no competitivos, para determinar la presencia o el nivel de uno o más marcadores en una muestra (ver, por ejemplo, [24]). El término "inmunoensayo" abarca técnicas que incluyen, sin limitación, inmunoensayos enzimáticos (EIA) tal como la técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ELISA de captura de antígeno, ELISA tipo sándwich, ELISA de captura de anticuerpos IgM (MAC ELISA), e inmunoensayo enzimático de micropartículas (MEIA); inmunoensayos de electroforesis capilar (CEIA); radioinmunoensayos (RIA); ensayos inmunorradiométricos (IRMA); inmunoensayos de polarización de fluorescencia (FPIA); y ensayos de quimioluminiscencia (CL). Si se desea, dichos inmunoensayos pueden automatizarse. Los inmunoensayos también se pueden usar junto con la fluorescencia inducida por láser (ver, por ejemplo, [25], [26]). Los inmunoensayos de liposomas, tales como los inmunoensayos de liposomas por inyección de flujo y los inmunosensores de liposomas, también son adecuados para su uso en la presente invención (ver, por ejemplo, [27]).

Los inmunoensayos vienen en muchos formatos y variaciones diferentes. Los inmunoensayos se pueden ejecutar en múltiples etapas con los reactivos que se agregan y se lavan o se separan en diferentes puntos del ensayo, y dichos ensayos de múltiples etapas a menudo se denominan inmunoensayos de separación o inmunoensayos heterogéneos. Debido a la etapa de separar la fase líquida y las moléculas de captura acopladas a la fase sólida después de la etapa de incubación, el método de la presente invención corresponde a tal ensayo heterogéneo. Dichos ensayos heterogéneos se pueden subdividir en ensayos competitivos y no competitivos.

Un inmunoensayo competitivo es un ensayo en donde, a diferencia de un ensayo tipo sándwich, se añaden moléculas de detección competidoras, tales como antígenos o anticuerpos, que pueden marcarse, a la incubación de las moléculas de captura y la muestra que comprende las moléculas objetivo. Esta molécula de detección (marcada) compite con la molécula objetivo para unirse a la molécula de captura, por ejemplo, para formar los complejos antígeno-anticuerpo, en la fase sólida. La cantidad de moléculas de detección marcadas unidas depende de la cantidad de moléculas objetivo presentes en la mezcla de incubación. En otras palabras, en un ensayo competitivo, el analito no marcado (molécula objetivo) en una muestra compite con el analito marcado (molécula de detección) para unirse a un anticuerpo u otra molécula de captura. Después de la incubación, las moléculas de analito no unidas (marcadas y sin marcar) se separan de la fase sólida y de las moléculas de captura. En los ensayos heterogéneos competitivos del estado de la técnica, se miden los analitos marcados que se han unido a las moléculas de captura en la fase sólida, y esto requiere etapas adicionales de lavado de la fase sólida. Por el contrario, el método de la presente invención está detectando la molécula de detección de analito marcada y no unida en la fase líquida después de la separación, mientras que la fase líquida puede estar todavía en el mismo pocillo de reacción donde tuvo lugar la separación. En consecuencia, es posible realizar el ensayo de la invención sin requerir ninguna etapa de lavado. Mediante la detección de la molécula de detección competitiva no unida (por ejemplo, antígeno o anticuerpo), se puede determinar la cantidad o concentración de la molécula objetivo en la muestra después de que la fase libre unida se separe de la fase sin unión.

Un ensayo tipo sándwich se diferencia de un ensayo competitivo porque una molécula objetivo se detecta mediante la unión de una molécula de captura, así como también de una molécula de detección a la molécula objetivo. Preferentemente, el ensayo tipo sándwich es un inmunoensayo, en donde se usan dos anticuerpos (o antígenos). El anticuerpo 1 (antígeno 1) puede inmovilizarse en la fase sólida como una molécula de captura, que se une a un epítopo de la molécula objetivo (analito). Se puede marcar un segundo anticuerpo 2 (antígeno 2) para la detección (o lleva un receptor o sitio de unión para otra molécula/entidad marcada) y se une a un epítopo diferente de la molécula objetivo en comparación con el anticuerpo 1 (antígeno 1). La cantidad de moléculas de detección unidas depende de la cantidad de antígenos de muestra (anticuerpos). Después de que el complejo de la molécula de captura, la molécula objetivo y la molécula de detección se forma (por ejemplo, como un complejo de dos anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de un antígeno) la fase sin unión (que comprende el segundo anticuerpo 2 marcado no unido (antígeno 2)) se separa de la fase unida (que comprende el complejo de la molécula de captura, la molécula objetivo y la molécula de detección). En los ensayos heterogéneos tipo sándwich del estado de la técnica, se miden las moléculas de detección marcadas que se han unido a la molécula objetivo y las moléculas de captura en la fase sólida, y esto requiere etapas adicionales de lavado de la fase sólida. Por el contrario, el método de la presente invención está detectando las moléculas de detección marcadas no unidas en la fase líquida después de la separación, en modalidades mientras todavía están en el mismo pocillo de reacción donde tuvo lugar la separación, y aún sin requerir ninguna etapa de lavado. Mediante la detección de moléculas de detección marcadas no unidas (por ejemplo, antígeno o anticuerpo), la cantidad o concentración de la molécula objetivo en la muestra puede detectarse después de que la fase sin unión se separe de la fase unida.

En el contexto de la presente invención, los grupos de perlas consisten en varias perlas más pequeñas, que se ensamblan para formar una perla más grande formando un grupo o aglomerado de perlas más pequeñas y también pueden denominarse perlas coloidales.

Una etapa de lavado en el sentido de la presente invención se refiere al lavado de la fase sólida después de la separación de las moléculas de captura acopladas a la fase sólida que comprenden las moléculas objetivo unidas y/o las moléculas de detección de la solución tampón. Estas etapas de lavado son necesarias en los inmunoensayos heterogéneos de última generación conocidos, ya que estos ensayos se basan en la detección de la presencia de moléculas de detección unidas en la superficie sólida después de la incubación. Sin tales etapas de lavado mediante el uso de tampones de lavado adecuados, que en su mayoría difieren de las soluciones tampón empleadas durante la etapa de coincubación para apoyar la reacción de unión, la unión inespecífica de las moléculas de detección a la superficie sólida a menudo conduce a resultados defectuosos. Incluso en el caso de ensayos basados en membrana o inmunocromatográficos, se necesita al menos algo de tampón para la propulsión del fluido a lo largo de la franja de flujo lateral. Sin embargo, el método de la presente invención tiene la ventaja de que tales etapas de lavado no son necesarias ya que sorprendentemente es posible determinar la presencia y/o concentración de la molécula objetivo detectando las moléculas de detección que quedan en la fase líquida después de la etapa de coincubación y separación de la fase líquida de la fase sólida, siendo sorprendentemente reproducible el procedimiento en sí mismo aunque todas etapas antes mencionadas se pueden realizar bien en la misma reacción.

Como se usa en la presente descripción, un (inmuno)ensayo de una etapa se refiere a un ensayo en el que los reactivos formadores de complejos, que comprenden en el contexto de la presente invención las moléculas de captura, las moléculas objetivo y las moléculas de detección, se añaden a la solución tampón en una sola etapa. Esto significa que los reactivos se añaden simultáneamente o en un período de tiempo corto, preferentemente en segundos. En consecuencia, la incubación de los reactivos que toman parte en la reacción de detección ocurre casi simultáneamente para todos los reactivos involucrados, y no se realizan etapas o períodos de incubación secuenciales en un ensayo de una etapa. Por ejemplo, si la fase sólida que comprende las moléculas de captura acopladas ya está presente en la solución tampón, las moléculas objetivo y las moléculas de detección se añaden en una etapa aproximadamente al mismo tiempo. El complejo se forma mientras todos los reactivos necesarios para la detección están en la solución tampón.

Una incubación, como se usa en la presente descripción, se refiere a un período de tiempo en donde determinados reactivos o moléculas están presentes en la solución tampón al mismo tiempo para realizar la reacción de unión requerida para detectar la presencia o ausencia de las moléculas objetivo. En consecuencia, el tiempo de incubación es la duración del tiempo durante el cual tiene lugar la reacción específica entre la molécula de captura y la molécula objetivo y/o la molécula de detección y puede tener lugar la unión de la molécula de captura a la molécula objetivo y/o la molécula de detección puede tener lugar. Por ejemplo, durante la incubación se puede formar un complejo antígenoanticuerpo.

Como se usa en la presente descripción, el término "solución tampón" se refiere a un líquido que es adecuado para soportar la reacción de unión entre las moléculas de captura y las moléculas objetivo y/o las moléculas de detección. Durante la incubación, la muestra que se sospecha que contiene una o más moléculas objetivo, la solución tampón y potencialmente los líquidos de los componentes de la etapa de incubación forman una fase líquida. La solución tampón se puede seleccionar y determinar sobre la base de la reacción específica que se va a respaldar y las condiciones del ensayo. Es posible que la composición exacta de la solución tampón deba ajustarse específicamente para la reacción de incubación y detección que se llevará a cabo y puede estar influenciada por factores como el tipo de muestra que se analizará, las características de unión de la molécula de captura específica a la molécula objetivo y las características de unión de las moléculas de detección específicas al objetivo y/o las moléculas de captura. Un experto en la técnica puede seleccionar una solución tampón adecuada para usar en el contexto de un método específico de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, la solución tampón separada también puede denominarse sobrenadante separado o fase sin unión. Después de que se forma el complejo de la molécula de captura y la molécula objetivo y/o la molécula de detección, por ejemplo, en forma de un complejo antígeno-anticuerpo, y se une a la fase sólida debido al acoplamiento de las moléculas de captura, las moléculas sobrantes y cualquier otro material que no se unió a las moléculas de captura se dejan en la fase líquida. Las moléculas excedentes suspendidas en el tampón que pueden separarse del complejo que consiste en la fase sólida y las moléculas unidas a la fase sólida forman la fase sin unión. El término "fase unida" se refiere a la fase sólida y los complejos de las moléculas de captura acopladas a la fase sólida con las moléculas objetivo o de detección, tal como por ejemplo los complejos antígeno-anticuerpo que se forman en la superficie de la fase sólida.

Una molécula de captura que está acoplada, unida o conectada a una fase sólida puede denominarse molécula de captura acoplada a una fase sólida. Una fase sólida se refiere a una superficie sólida sobre la que se pueden inmovilizar moléculas de captura, tal como anticuerpos o antígenos. Después de la incubación de las moléculas de captura acopladas a la fase sólida, las moléculas objetivo y las moléculas de detección, la fase sólida se puede separar de la fase sin unión/fase líquida/sobrenadante.

Las fases sólidas adecuadas para acoplar moléculas de captura comprenden, sin limitación, perlas o partículas sólidas o una superficie sólida, tal como la superficie de una placa de microtitulación o una placa o cualquier tipo de pared, usada en el contexto de un sistema microfluídico. Una placa de microtitulación puede ser una placa hecha de plástico que tiene pocillos en su superficie que pueden usarse para realizar una reacción de inmunoensayo. Una partícula o perla sólida puede ser, por ejemplo, una perla magnética, una microperla, una nanoperla o una nanopartícula, tal como una nanopartícula metálica que comprende, por ejemplo, oro, plata, oro, cerámica o vidrio.

La naturaleza de la etapa de separar la fase sólida de la solución tampón depende del tipo de fase sólida usada. Por ejemplo, en el caso de una superficie sólida fija, tal como una placa de microtitulación o la superficie de un dispositivo microfluídico, la separación se produce de forma prácticamente automática, ya que las moléculas de captura se fijan en la superficie de la placa y la solución tampón forma un sobrenadante. La eliminación de la fase líquida separada (o una parte de la misma) de las moléculas de captura puede realizarse de forma manual o automática (por ejemplo, con una pipeta robótica) o por flujo a través de un canal microfluídico si la fase sólida es una superficie microfluídica. En el caso de perlas que sirven como fase sólida en el sentido del método de la invención, la separación puede ocurrir con la ayuda de fuerzas magnéticas, gravitatorias, centrífugas o electroforéticas o sedimentación, por ejemplo. Si las perlas magnéticas sirven como fase sólida para acoplar las moléculas de captura, puede usarse un campo electromagnético o permanente/un electroimán o permanente para separar las perlas del tampón, en donde las perlas se fijarán en la ubicación de un imán, por ejemplo. Después de la separación, es posible, por ejemplo, retirar la fase líquida del pocillo de reacción con las perlas fijas, que pueden estar fijadas en la pared de una cámara de reacción o pocillo debido a la fuerza magnética. En el caso de microperlas o nanoperlas, pero con una densidad suficientemente mayor que la fase líquida (por ejemplo, vidrio o cerámica, o similares) que sirven como fase sólida para acoplar las moléculas de captura, la separación puede ocurrir mediante centrifugación, en donde las perlas pueden estar, por ejemplo, sedimentando al fondo de la cámara de reacción. Opcionalmente, la fase líquida se puede eliminar como sobrenadante después de la separación, por ejemplo, mediante centrifugación. La separación electroforética también puede ser una posibilidad, por ejemplo, en el caso de usar partículas cargadas como fase sólida. Debido a las diferentes propiedades de las perlas, también es posible usar un tipo de perlas como fase sólida para acoplar las moléculas de captura y usar un tipo diferente de perlas como marcador en una molécula de detección.

Figuras

La invención se describe además mediante las siguientes figuras. Estas no pretenden limitar el alcance de la invención, sino que representan modalidades preferidas de aspectos de la invención proporcionados para una mayor ilustración de la invención descrita en la presente descripción.

Breve descripción de las figuras:

Figura 1: Ilustración de un flujo de trabajo de inmunoensayo de acuerdo con el método de la presente invención (como ejemplo se muestra un inmunoensayo competitivo).

Figura 2: Cadena de proceso con etapas de inmunoensayo de un ejemplo del método de la presente invención.

Figura 3: Intensidad de las perlas fluorescentes restantes en el sobrenadante (en formato tipo sándwich).

Figura 4: Intensidad de las perlas fluorescentes restantes en el sobrenadante (curva estándar en formato competitivo).

Figura 5: Intervalo de CV de concentración del ensayo de fase sin unión.

Figura 6: Resultado de la medición de un material de referencia certificado (CRM) de suero humano con un valor certificado de 41,2 mg/l y un intervalo de incertidumbre de ± 2,5 mg/l con el método de inmunoensayo presentado en esta invención.

Descripción detallada de las figuras:

Figura 1: (1) Se añaden perlas magnéticas (MB) a las perlas fluorescentes (FB) y a la muestra. (2) Los antígenos en las FB y en la muestra reaccionan con los anticuerpos en la superficie de las Mb . (3) Después de que se forma el complejo antígeno-anticuerpo, las fases se separan y se detecta la fase sin unión (sobrenadante) con el exceso de las FB. El número de FB excedentes y, en consecuencia, la señal detectada depende de la cantidad de antígeno en la muestra debido a la competencia por los sitios de unión de los anticuerpos.

Figura 2: Este ejemplo de inmunoensayo de acuerdo con la presente invención contiene siete etapas. La preparación de las perlas fluorescentes y magnéticas no se incluye en este esquema, ya que no forman parte del flujo de trabajo del inmunoensayo en sí.

Figura 3: Ejemplo de aplicación del método de esta invención en inmunoensayo de CRP tipo sándwich (intervalos de concentración bajos). Para este experimento se usaron perlas fluorescentes con un diámetro de 0,5 pm (Merck formalmente Sigma Aldrich, Alemania). El principio del protocolo para el ensayo tipo sándwich (no descrito en este documento) es el mismo que se describe para el ensayo competitivo, pero se usan dos anticuerpos (R&D Systems a Biotechne Brand, EE. UU.) para poder formar un sándwich. El anticuerpo de captura se inmoviliza en las perlas magnéticas (Thermo Fisher, EE. UU.). El anticuerpo de detección se inmoviliza en la perla fluorescente. Este ensayo es un ensayo tipo sándwich de una sola etapa.

Figura 4: Ejemplo de aplicación del método de esta invención en inmunoensayo de CRP competitivo (intervalos de concentración altos). Esta figura muestra una curva estándar del ensayo de c Rp realizado con el protocolo descrito en la sección "EJEMPLOS". La curva estándar se creó con una repetición de tres ensayos para cada valor.

Figura 5: Una descripción general del CV de concentración en % en el intervalo de concentración de CRP entre 30 mg/l y 100 mg/l. Los valores de concentración se calcularon a partir de la intensidad medida mediante la creación de una curva estándar con 5 mediciones repetidas para muestras de suero humano con CRP enriquecida con valores de 20 mg/l, 40 mg/l, 60 mg/l, 80 mg/l y 100 mg/l. Los datos de medición con sus valores medios y desviaciones estándar se ajustaron con una función sigmoidal. Esta función se usó para calcular la concentración medida de 16 repeticiones para muestras de suero humano con CRP enriquecida con valores de 40 mg/l, 60 mg/l, 80 mg/l y 100 mg/l.

Figura 6: Un material de referencia certificado (CRM) (ERM-DA474/IFCC, Centro Común de Investigación (JRC) Comisión Europea), suero humano con un valor certificado de 41,2 mg/l y un intervalo de incertidumbre de ± 2,5 mg/l de CRP con el ensayo de CRP realizado con el protocolo descrito en la sección "EJEMPLOS". El ensayo se realizó en 5 días diferentes, cada uno con 5 repeticiones. Para calcular la concentración a partir de la intensidad medida, se usó una curva estándar creada con el mismo lote de material (perlas magnéticas, perlas fluorescentes, tampón de ensayo), que se creó con el mismo método como se describió en la descripción de la figura 5, pero aquí con 3 mediciones repetidas para cada valor. La figura 6 muestra el valor medio de las 5 medidas repetidas del material de referencia certificado con su desviación estándar para cada día. La línea en el valor de 41,2 mg/l representa el valor certificado de la muestra y las líneas discontinuas en 38,7 mg/l y 43,7 mg/l muestran el intervalo cubierto por el material certificado considerando su incertidumbre.

Ejemplos

La invención se describe además mediante los siguientes ejemplos. Estos no pretenden limitar el alcance de la invención, sino que representan modalidades preferidas de aspectos de la invención proporcionados para una mayor ilustración de la invención descrita en la presente descripción. Los ejemplos se refieren a un método para un inmunoensayo, que proporciona información sobre un antígeno (o anticuerpo) que se supone que está presente en una muestra líquida, al detectarlo en la fase sin unión (sobrenadante) del inmunoensayo. Con este enfoque es posible evitar las etapas de lavado que se necesitan en otros enfoques de inmunoensayo conocidos en la técnica. Combinado con un enfoque de ensayo basado en perlas, este inmunoensayo requiere solo un tiempo de incubación corto y proporciona la posibilidad de medir intervalos de concentración altos y bajos. Además, se requieren menos etapas de manipulación en comparación con otros enfoques de inmunoensayo. En consecuencia, el método de la invención es ideal para realizarse en un sistema automatizado o semiautomatizado y/o en un sistema microfluídico automatizado o semiautomatizado. El número total de etapas para realizar el método de la invención depende, por ejemplo, de la plataforma que se use. Las etapas de preparación descritas en este ejemplo son para un enfoque de ensayo competitivo basado en perlas en el que se usa un pocillo de la placa de microtitulación solo como una cámara de reacción sin anticuerpos inmovilizados u otros reactivos en la superficie del lugar de microtitulación.

El ejemplo proporcionado en la presente descripción es un inmunoensayo basado en perlas, competitivo y de una sola etapa para la detección de CRP en suero humano. El concepto también es aplicable a diferentes tipos de inmunoensayos, por ejemplo, ensayos tipo sándwich de una o dos etapas con diferentes métodos de detección, tales como, pero que no se limitan a, fluorescencia, quimioluminiscencia, absorción o colorimetría.

En este ejemplo, el volumen de reacción consta de una muestra que contiene el antígeno analito, un antígeno competitivo conjugado con una entidad marcadora, el tampón de ensayo (todos los mencionados anteriormente forman la fase líquida), perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos (forman la fase sólida). Para este ensayo, se usaron como fase sólida las perlas magnéticas (MB) M280 Dynabeads Tosylactivated (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), donde se forma el complejo. Este ensayo usa anticuerpos policlonales, pero los anticuerpos monoclonales también se probaron y funcionaron bien. El antígeno competitivo se acopla a las perlas fluorescentes (FB) que actúan como entidad marcadora. Para este ensayo, se usaron microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres con un diámetro de 0,2 pm y longitudes de onda de excitación/emisión de 580 nm/605 nm (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y se acoplaron con el antígeno de CRP nativa (United State Biological, EE. UU.). Se probaron perlas fluorescentes de otro proveedor con diferentes diámetros y también funcionaron.

Estas perlas FluoSphere acopladas se agregan al tampón de ensayo junto con la muestra. En la siguiente etapa las perlas magnéticas con los anticuerpos en su superficie se agregan a la mezcla de tampón, FB y muestra (Figura 1 (1)). Si el antígeno a detectar está presente en la muestra, competirá con el antígeno competitivo que está acoplado en la superficie de las FB y se forma un complejo antígeno-anticuerpo con el antígeno de la muestra o el antígeno de detección acoplado a las F^b(Figura 1 (2)) durante la incubación a 37 °C durante 15 minutos. La cantidad de antígeno de detección acoplado a las FB sobrantes (fase sin unión) que no se ha unido a los anticuerpos de captura de las MB depende de la cantidad de antígeno presente en la muestra. Así, con la separación de la fase sin unión (en fase líquida) de la fase sólida (complejo que reaccionó sobre la superficie de la partícula magnética), se puede detectar la señal fluorescente del antígeno de detección acoplado a las FB restantes y la concentración de CRP se puede determinar en la muestra (Figura 1 (3)). Con eso, el ensayo también permite la adaptación a formato múltiple por color. No se necesita una etapa de lavado y la separación se puede realizar mediante fuerzas magnéticas, fuerzas centrífugas, fuerzas electroforéticas o adsorción bioquímica, pero no se limita a ellas.

La figura 2 resume todas las etapas necesarias para el ejemplo del método de la presente invención. El marco para eso puede ser un enfoque basado en perlas como el presentado anteriormente. El ensayo que se presenta en la presente descripción también permite enfoques no basados en perlas en los que la fase sólida puede ser la parte inferior de una placa de microtitulación u otras superficies adecuadas. La señal a detectar tampoco se limita a derivar de perlas de fluorescencia. Los colorantes fluorescentes, o los puntos cuánticos, o enfoques como la quimioluminiscencia, las reacciones enzimáticas también funcionan, aunque algunos enfoques aumentarían el número de etapas (en la fase de detección, no en la fase de incubación donde el método de la invención conserva sus ventajas independientemente del método de detección) debido a los reactivos adicionales que deben agregarse para la generación de la señal.

El método de la presente invención se creó para una fácil automatización, por ejemplo, pero sin limitarse a, una plataforma microfluídica centrífuga. El ensayo como se describe en el presente ejemplo no limitativo combina un tiempo de incubación corto, solo siete etapas en total, un reactivo líquido que debe almacenarse (sin etapas de lavado y, en consecuencia, sin almacenamiento de tampones de lavado), pequeños volúmenes y ningún material adicional como membranas para la detección.

El método se describe en un ejemplo de inmunoensayo de CRP. Puede haber cuatro parámetros principales que pueden influir en el rendimiento del inmunoensayo después de que los reactivos, como los anticuerpos, el antígeno y los tampones, se fijen y optimicen: (i) el tiempo de incubación, (ii) el volumen de la muestra, (iii) la relación entre la cantidad de perlas magnéticas y la cantidad de perlas fluorescentes y (iv) la temperatura de incubación. Estos parámetros pueden usarse para adaptar el intervalo de detección, el intervalo lineal y la pendiente de la curva estándar y, en consecuencia, la sensibilidad. Con la temperatura de incubación también es posible ajustar la duración de la incubación y también la pendiente del intervalo lineal.

Materiales y métodos de los ejemplos

Placa de microtitulación

Una placa de microtitulación negra que no se une (Greiner Bio-One GmbH, Austria) se bloquea con un tampón de bloqueo (PBS/BSA al 5 %) para evitar la adsorción no específica de los reactivos en la superficie de la placa de microtitulación. Las etapas son:

• Llenar bien completamente con PBS/BSA al 5 %

• Bloquear durante 30 min a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 8 °C

• Lavar 3 veces con el tampón de lavado (PBS) llenando los pocillos por completo, esperar 2 minutos y agitar cuidadosamente la placa mientras se espera

• Retirar el tampón de lavado y secar la placa con cuidado en una toalla de papel de laboratorio golpeando suavemente la placa.

Perlas magnéticas

Las perlas magnéticas M280 tosilactivadas Dynabeads (14203, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) se usaron como fase sólida. Los anticuerpos de CRP (A80-125A, Bethyl Laboratories Inc. USA) se acoplaron en su superficie. El protocolo lo proporciona el proveedor (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) [28].

Perlas de fluorescencia

Las perlas de fluorescencia (F8812, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) se usaron como marcador de la molécula de detección (antígeno competitivo). El proveedor proporciona el protocolo de acoplamiento para inmovilizar el antígeno de CRP nativo altamente purificado (C7907-26, United State Biological, EE. UU.) en la superficie de las FluoSpheres [29].

Resultados de los ejemplos

Para la prueba de concepto, se presentan ensayos basados en perlas de una sola etapa. Estos ensayos pueden cubrir intervalos de detección pequeños (3 ng/ml a 2000 ng/ml, en formato tipo sándwich, figura 3) así como también intervalos de detección grandes (28,6 mg/l a 140 mg/l en formato competitivo, figura 4) y tienen una duración de incubación rápida de 15 min o menos. Es importante destacar que la exclusión de cualquier lavado no tiene ninguna influencia negativa en la reproducibilidad, ya que pudimos mostrar un coeficiente de variación (CV) interensayo de 4,3 % y un CV interensayo de 4,1 % para el ejemplo del ensayo de CRP competitivo medido con un material de referencia certificado (ERM-DA474/IFCC, Comisión Europea, Unidad de Materiales de Referencia). Es importante optimizar los volúmenes de los reactivos usados en el protocolo de ensayo. El protocolo que se describe más abajo es el protocolo optimizado para un inmunoensayo de ^cR^pcon suero humano como material de muestra y un intervalo de medición de 28,6 mg/l a 140 mg/l en una placa de microtitulación negra que no une (Greiner Bio-One GmbH, Austria).

Protocolo para un ensayo competitivo con antígeno (molécula de detección) acoplado en FluoSpheres (marcador) y anticuerpo (molécula de captura) acoplado en Dynabeads (fase sólida)

Inmunoensayo (volumen total de 75 pl)

Llevar los reactivos a temperatura ambiente

Añadir 50 |jl de tampón de ensayo

Añadir 10 j l de perlas FluoSphere (2 mg/ml)

Añadir 5 j l de muestra (suero nativo humano libre de CRP)

Añadir 11,5 j l de Dynabeads (concentración madre de 20 mg/ml)

Incubar durante 15 min a 37 °C en un agitador

Separar las perlas magnéticas con un imán de la fase sin unión (sobrenadante)

Tomar 50 j l del sobrenadante

Medir la fluorescencia

Este ensayo muestra un CV interensayo del 4,1 % (considerado como muy buenos resultados en la placa de microtitulación) y un CV intraensayo del 4,35 % medido durante 5 días diferentes en un sistema no automatizado con el CRM. La figura 4 muestra una curva estándar para CRP. Cada concentración medida se repitió tres veces. El material de la muestra era suero libre de CRP humana nativa (HyTest Ltd, Finlandia) enriquecido con una concentración conocida de CRP humana nativa. La lectura se realizó en un lector de placas de microtitulación (Tecan Spark 10M, Tecan Trading GmbH, Suiza). La figura 5 muestra el CV de concentración calculado para 40 mg/l, 60 mg/l, 80 mg/l y 100 mg/l. Todos los valores medios de CV son inferiores al 10 %, siendo el valor más alto para 80 mg/l 5,6 % y el valor más bajo con 3,9 % para 60 mg/l. Estos valores se calcularon como se describió en la "descripción detallada de las figuras". Esto prueba que el ensayo puede considerarse cuantitativo entre 40 mg/l y 100 mg/l y, por lo tanto, la ausencia de la etapa de lavado no influye en la calidad del ensayo. La figura 6 muestra los resultados de medición del CRM (ERM-DA474/IFCC, Joint Research Center (JRC) European Comission) con un valor certificado de 41,2 mg/l y un intervalo de incertidumbre de ± 2,5 mg/l con el método descrito en la "descripción detallada de las figuras". La línea en el valor de 41,2 mg/l representa el valor certificado de la muestra y las líneas discontinuas en 38,7 mg/l y 43,7 mg/l muestran el intervalo cubierto por el material certificado considerando su incertidumbre. Todos los valores medios medidos en cada día están dentro del intervalo del CRM, lo que demuestra la funcionalidad del método. También demuestra que el método no está influenciado de ninguna manera por diferentes muestras. En conclusión, se evaluó el concepto de ensayo y se demostró que funciona. El ensayo competitivo de CRP es cuantitativo con CV claramente por debajo del 10 % y se demostró que se usa con material de muestra sin diluir.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprende las etapas secuenciales de a. incubar al mismo tiempo en una solución tampón en un pocillo de reacción

i. la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo,

b. separar en el pocillo de reacción las perlas de captura de la solución tampón que comprende las perlas de detección no unidas, y

c. detectar las perlas de detección no unidas restantes en la solución tampón, que se ha separado de las perlas de captura, en donde la detección de las perlas de detección no unidas restantes se produce en el mismo pocillo de reacción que la incubación y separación por medio de un marcador que no requiere reactivos adicionales para la generación de señales,

en donde el método no comprende una etapa de lavado.

2. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el marcador que no requiere reactivos adicionales para la generación de la señal es una etiqueta fluorescente.

3. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método no requiere más de una solución tampón.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método se realiza en un sistema automatizado, preferentemente un sistema microfluídico, con mayor preferencia un sistema microfluídico centrífugo.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las perlas de captura y/o las perlas de detección son perlas compactas individuales.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las perlas de captura tienen una densidad mayor que las perlas de detección y/o un diámetro de al menos 0,5 pm.

7. Método de acuerdo con la reivindicación anterior, en donde la separación de las perlas de captura de la solución tampón se produce mediante fuerzas magnéticas, gravitatorias, centrífugas o electroforéticas, preferentemente mediante sedimentación.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de captura comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo o un antígeno, y/o la molécula de detección comprende un anticuerpo o fragmentos del mismo o un antígeno.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de detección comprende un marcador.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la incubación no dura más de 20 minutos y/o la separación se produce en no más de 1 minuto.

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ensayo proporciona resultados cuantitativos para la detección de una molécula objetivo.

13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se detectan en paralelo dos o más moléculas objetivo diferentes comprendidas en la muestra, en donde

e. todas las moléculas objetivo están presentes en una concentración alta, o

f. todas las moléculas objetivo están presentes en una concentración baja.

14. Uso de un kit para detectar una molécula objetivo en una muestra de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el kit comprende

a. perlas de captura adecuadas para unirse a las moléculas objetivo,

b. perlas de detección adecuadas para unirse a las moléculas objetivo y/o las perlas de captura, en donde las perlas de captura y las perlas de detección son perlas compactas individuales, las perlas de captura pueden separarse de las perlas de detección, las perlas de captura tienen una densidad mayor que o densidad igual a las perlas de detección y las perlas de captura tienen un diámetro de al menos 0,5 pm, c. un sistema microfluídico, preferentemente un sistema microfluídico centrífugo, configurado para realizar en una cámara de reacción las etapas del método de

i. incubar al mismo tiempo en una solución tampón la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo, las perlas de captura y una cantidad definida de perlas de detección, ii. separar en el pocillo de reacción las perlas de captura de la solución tampón que comprende perlas de detección no unidas, y

iii. detectar las perlas de detección no unidas restantes en la solución tampón por medio de una etiqueta que no requiere reactivos adicionales para la generación de señales,

i. incubar en la solución tampón las perlas de captura, la muestra sospechosa de contener una o más moléculas objetivo y una cantidad definida de perlas de detección, y