ES2930428T3

ES2930428T3 - Métodos que utilizan la espectroscopia Raman de fibra óptica

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Publication number: ES2930428T3
Application number: ES13813251T
Authority: ES
Inventors: Zhiwei Huang; Khek Yu Ho; Mads Sylvest Bergholt; Wei Zheng; Khay Guan Yeoh; Shiyamala Duraipandian
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2022-12-12
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CA2917308A1; KR101947859B1; JP6230077B2; KR20150036345A; US20150335248A1; CN104541153B; EP2870462A1; EP2870462A4; CA2917308C; CN104541153A; SG11201408793XA; WO2014007759A1; GB2513343A; GB201307338D0; JP2015526135A; EP2870462B1; US9931039B2

Abstract

Un método para lograr mediciones independientes del instrumento para el análisis cuantitativo del sistema de espectroscopio Raman de fibra óptica, el sistema que comprende una fuente láser, un espectroscopio y una sonda de fibra óptica para transmitir luz desde la fuente láser a un objetivo y devolver la luz dispersada al espectroscopio. comprendiendo el método transmitir luz desde la fuente láser a un objetivo estándar que tiene un espectro conocido, registrar un espectro de calibración de la luz dispersada desde el objetivo estándar, comparar el espectro conocido y el sistema de calibración y generar una transferencia de sonda y/o sistema de sonda y almacenar la función de transferencia. Además se proporciona un método para realizar espectroscopía Raman de diagnóstico en tiempo real opcionalmente en combinación con los otros métodos descritos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos que utilizan la espectroscopia Raman de fibra óptica

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a una plataforma de software de espectroscopia biomédica en línea para diagnósticos de cáncer en tiempo real en endoscopia y métodos para mediciones independientes del instrumento para análisis cuantitativo en espectroscopia Raman de fibra óptica.

Antecedentes

La espectroscopia Raman es una técnica que utiliza dispersión inelástica o Raman de luz monocromática. Convencionalmente, la fuente de luz monocromática es un láser en el rango visible o infrarrojo cercano ("NIR" del inglés "nearinfrared"). La energía de los fotones dispersos se desplaza hacia arriba o hacia abajo en respuesta a la interacción con modos de vibración o excitaciones en el material iluminado, variando la longitud de onda de los fotones dispersos. En consecuencia, los espectros de la luz dispersada pueden proporcionar información sobre el material de dispersión.

La espectroscopia NIR Raman se conoce como una técnica potencial para la caracterización y el diagnóstico de células y tejidos precancerosos y cancerosos in vivo en varios órganos. La técnica es deseable ya que puede ser no invasiva o mínimamente invasiva, sin requerir biopsias u otra extracción de tejido. Es conocido el uso de espectroscopia NIR Raman en dos rangos de longitud de onda. El primero es el llamado rango de huellas dactilares ("FP" del inglés "fingerprint"), con números de onda de 800 a 1800 cm-1, debido a la gran cantidad de información bimolecular altamente específica, por ejemplo del contenido de proteínas, ADN y lípidos, contenida en esta región espectral para la caracterización y el diagnóstico de tejidos.

La desventaja de este rango de longitud de onda es que, cuando se usa con una fuente láser de 785 nm de uso común, se puede generar una fuerte señal de fondo de autofluorescencia tisular. Además, cuando la sonda usa fibra óptica, se dispersa una señal Raman desde la sílice fundida en las fibras ópticas. En particular, cuando se utiliza un dispositivo de carga acoplada ("CCD" del inglés "charge-coupled device") para medir los espectros dispersos, la señal de autofluorescencia puede saturar el CCD e interferir con la detección de señales Raman inherentemente muy débiles en este rango de longitud de onda.

Otro problema con la espectroscopia Raman de fibra óptica como técnica es el de la estandarización de los instrumentos. La técnica de espectroscopia Raman de fibra óptica se ha limitado principalmente a sistemas individuales y no se ha intentado transferirla a ensayos clínicos multicéntricos o diagnósticos médicos de rutina. Esto se debe principalmente a que los instrumentos del espectrómetro Raman generalmente son diferentes (es decir, la óptica, la función de respuesta, la alineación, el rendimiento, etc.) y, en general, producen espectros Raman muy diferentes. Además, las sondas Raman de fibra óptica tienen una vida útil limitada y deben reemplazarse o intercambiarse periódicamente. Desafortunadamente, los datos Raman adquiridos con diferentes sondas de fibra óptica no se pueden comparar, porque cada sonda de fibra óptica tiene su propio fondo único y está asociada con diferentes propiedades espectrales de transmisión. Las diferentes características de transmisión distorsionan significativamente las intensidades espectrales haciendo incomparables los espectros Raman tisulares obtenidos con diferentes sondas de fibra óptica. En consecuencia, los algoritmos de diagnóstico multivariante desarrollados en una plataforma clínica primaria no pueden aplicarse a plataformas clínicas secundarias. En particular, la medición cuantitativa de la intensidad de Raman tisular es uno de los problemas más desafiantes en las aplicaciones biomédicas de fibra óptica Raman. La calibración y estandarización de intensidad independiente del instrumento/sonda de fibra es esencial para la realización del uso global de la espectroscopia Raman de fibra óptica en biomedicina. Por esta razón, un modelo de diagnóstico estadístico multivariable construido con una sonda 'maestra' no se puede aplicar a los espectros medidos con una sonda 'esclava'. Para que la técnica Raman se convierta en una herramienta generalizada para la detección del cáncer a escala mundial, es necesario estandarizar tanto los espectrómetros Raman como las sondas de fibra óptica, especialmente para aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, el documento US 5850623 A (Carman et al.) describe un método para calibrar un espectrómetro Raman en el que el método divulgado no utiliza ningún espectrómetro de referencia en el proceso, sino que calibra el espectrómetro utilizando dos materiales: un material de referencia y un material de muestra. La mayoría de los estudios informados se han centrado en la estandarización de espectrómetros inter-Raman para mediciones de mezclas químicas simples sin sondas de fibra óptica. En general, la espectroscopia Raman de mezclas químicas simples no se puede comparar con la espectroscopia Raman de fibra óptica de muestras de tejidos biológicos heterogéneos.

Otro problema con la estandarización de los resultados entre instrumentos es el de la variación espectral asociada con la potencia de excitación del láser. Convencionalmente, los espectros Raman se normalizan, lo que conserva la forma general del espectro, pero elimina las características espectrales cuantitativas absolutas. Se sabe que se intenta controlar la potencia del láser suministrada en sondas Raman de fibra óptica, por ejemplo, incrustando un diamante en la punta de la fibra o ubicando una tapa de polímero en la trayectoria de la luz del láser como referencia. Sin embargo, estas soluciones no son satisfactorias y pueden causar interferencias en las regiones espectrales requeridas.

Otro problema en el uso de técnicas espectroscópicas ópticas (incluyendo fluorescencia de reflectancia y Raman) para un diagnóstico in vivo del cáncer y condiciones precancerosas es que el análisis de datos se ha limitado principalmente al procesamiento posterior y al desarrollo de algoritmos fuera de línea. Esto es cierto para el análisis endoscópico porque una gran cantidad de espectros recopilados durante la endoscopia son valores atípicos. Sería útil contar con un sistema que permita el diagnóstico en tiempo real para la endoscopia.

Sumario

De acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un método para calibrar un sistema de espectroscopio Raman de fibra óptica que tiene un espectrómetro primario y una pluralidad de espectrómetros secundarios, comprendiendo el espectrómetro primario una fuente láser y una sonda primaria de fibra óptica asociada con el espectrómetro primario, cada uno de los espectrómetros secundarios que comprenden una fuente láser y una pluralidad de sondas secundarias de fibra óptica asociadas con los espectrómetros secundarios, las sondas primaria y secundaria transmiten luz desde las fuentes láser a un objetivo y devuelven la luz dispersada al espectroscopio para generar un espectro Raman capturado, el método comprende:

calibrar cada uno de los espectrómetros secundarios de acuerdo con el espectrómetro primario usando la sonda primaria;

derivar una función de transferencia asociada a cada uno de los espectrómetros secundarios mediante la prueba de los espectrómetros secundarios frente a una fuente estándar fluorescente utilizando la sonda primaria;

registrar y almacenar la función de transferencia asociada a cada espectrómetro secundario;

calibrar cada una de las sondas secundarias contra la sonda primaria para calcular una función de calibración asociada a cada sonda secundaria calibrada;

registrar y almacenar la función de calibración calculada de cada sonda secundaria; y corregir el espectro Raman capturado por una de las sondas secundarias utilizadas con uno de los espectrómetros secundarios mediante la modificación de la función de transferencia registrada del espectrómetro secundario utilizado en función de la función de calibración de la sonda secundaria utilizada,

en el que la fuente estándar de fluorescencia tiene un espectro fluorescente conocido tras la excitación por la fuente láser; y

en donde derivar la función de transferencia comprende:

registrar un espectro de la fuente estándar de fluorescencia a través de la calibración del espectrómetro secundario utilizando una de las sondas secundarias y la fuente estándar de fluorescencia; y

calcular la función de transferencia del espectrómetro secundario alineando el espectro registrado con el espectro fluorescente conocido.

También se describe en el presente documento, un método para hacer funcionar un sistema de espectroscopio Raman, el sistema comprende una fuente láser, un espectroscopio y una sonda de fibra óptica para transmitir luz desde la fuente láser a un objetivo y devolver la luz dispersada al espectroscopio, el método comprende transmitir luz desde la fuente láser a un objetivo que tiene un espectro conocido, registrando un espectro de la luz dispersada desde el objetivo y modificando el espectro registrado de acuerdo con una función de transferencia almacenada. La función de transferencia almacenada puede estar asociada con el espectrómetro y la sonda de fibra óptica. La función de transferencia almacenada puede estar asociada con el espectrómetro y una sonda de fibra óptica primaria y el método puede comprender además modificar la función de transferencia almacenada de acuerdo con una función de calibración almacenada asociada con la sonda de fibra óptica.

También se describe aquí un sistema de espectroscopio Raman que comprende una fuente de láser, un espectroscopio y una sonda de fibra óptica para transmitir luz desde la fuente de láser a un objetivo y devolver la luz dispersada al espectroscopio, y una función de transferencia almacenada, siendo que el sistema funciona para transmitir luz de la fuente láser a un objetivo que tiene un espectro conocido, registra un espectro de la luz dispersada desde el objetivo y modifica el espectro registrado de acuerdo con la función de transferencia almacenada.

La función de transferencia almacenada puede estar asociada con el espectrómetro y la sonda de fibra óptica. La función de transferencia almacenada puede estar asociada con el espectrómetro y una sonda de fibra óptica primaria y el método puede comprender además modificar la función de transferencia almacenada de acuerdo con una función de calibración almacenada asociada con la sonda de fibra óptica.

También se describe en este documento un método para estimar la potencia láser transmitida en un sistema de espectrómetro Raman, el sistema que comprende una fuente láser, un espectroscopio y una sonda de fibra óptica para transmitir luz desde la fuente láser a un objetivo y devolver la luz dispersada al espectroscopio, el método comprende transmitir luz desde la fuente láser a una pluralidad de objetivos, para cada objetivo, medir la potencia transmitida de la luz desde la fuente láser y el espectro de la luz dispersada en el espectroscopio, realizar un análisis multivariado de los espectros capturados con la potencia transmitida medida como variable dependiente, y almacenar un modelo resultante.

El método puede comprender el paso de transmitir luz láser a un objetivo de prueba, suministrar un espectro capturado al modelo y calcular una estimación de la potencia transmitida.

También se describe aquí un método para sustraer una señal de fondo de un sistema de espectroscopio Raman de fibra óptica que tiene una sonda de fibra óptica, comprendiendo el método los pasos de:

a) almacenar un espectro de fondo,

b) recibir un espectro de prueba,

c) estimar una contribución de fondo usando uno o más picos de referencia,

d) multiplicar el espectro de fondo por un factor de corrección basado en la contribución de fondo estimada y restarlo del espectro de prueba,

e) verificar el espectro de prueba para una contribución de fondo restante, y

f) si la contribución de fondo es insignificante, generar el espectro de prueba; de lo contrario, repetir los pasos de (c) a (e).

El uno o más picos de referencia pueden comprender uno o más picos correspondientes a sílice o zafiro en la sonda de fibra óptica.

También se describe en el presente documento, pero sin formar parte del objeto reivindicado, un método implementado por ordenador para el diagnóstico en tiempo real usando espectroscopia Raman durante la endoscopia. El método comprende recibir al menos un espectro asociado a un tejido; analizar el al menos un espectro en un modelo que usa el espectro para determinar una puntuación en el que dicha puntuación indica una probabilidad de que el tejido sea canceroso; y dar salida a dicha puntuación.

En algunas formas, el modelo se genera usando una función de interpretación seleccionada del grupo que consiste en análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales, análisis de componentes principales, análisis discriminante lineal, análisis discriminante lineal de optimización de colonias de hormigas, árboles de clasificación y regresión, máquina de vectores de soporte y refuerzo adaptativo.

En algunas formas, el al menos un espectro se genera mediante espectroscopia Raman. Analizar el al menos un espectro en un modelo puede comprender analizar el al menos un espectro en un primer modelo y un segundo modelo. En algunas realizaciones, el modelo se selecciona en función del tejido analizado. En algunas realizaciones, la puntuación indica si el tejido es normal, metaplasia intestinal, displasia o neoplasia.

En algunas formas, analizar el al menos un espectro comprende: realizar un análisis de valores atípicos; y en respuesta al análisis de valores atípicos determinando que al menos un espectro es un valor atípico, rechazando el espectro. Realizar un análisis de valores atípicos puede comprender un análisis de componentes principales.

En algunas formas, un dispositivo emisor de audio emite una señal de audio en respuesta al análisis de valores atípicos que determina que al menos un espectro es un valor atípico. En respuesta a la determinación de que el espectro es un método atípico, le indica al espectrómetro que adquiera al menos un espectro adicional que recibe el sistema para su análisis.

En algunas formas, el dispositivo emisor de audio emite una señal de audio que identifica el tejido como normal, displásico o neoplásico. En algunas realizaciones, la señal de audio asociada con cada diagnóstico es diferente y también diferente de una señal de audio asociada con la determinación de un espectro atípico.

En algunas formas, el diagnóstico se realiza durante el procedimiento endoscópico.

También se describen sistemas para llevar a cabo los métodos implementados por ordenador, así como medios legibles por ordenador no transitorios con instrucciones para llevar a cabo los métodos implementados por ordenador.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones del sistema y los métodos descritos se describen a modo de ejemplo solo con referencia a los dibujos adjuntos.

La figura 1 es una ilustración esquemática de un sistema espectroscópico Raman según una realización. La figura 1a es una vista del extremo del endoscopio de la figura 1 a mayor escala.

La figura 1b es una vista de la sonda Raman del endoscopio de la figura 1a con más detalle.

La figura 2 es un gráfico que ilustra una comparación de los espectros de fluorescencia medidos con un patrón de referencia. También se muestran las funciones de calibración.

La figura 3 es una ilustración esquemática de un primer método de calibración.

La figura 4a es un diagrama de flujo que muestra un primer proceso para usar con el primer método de calibración.

La figura 4b es un diagrama de flujo que muestra una primera parte de un segundo proceso para usar con el primer método de calibración.

La figura 4c es un diagrama de flujo que muestra una segunda parte de un segundo proceso para usar con el primer método de calibración.

La figura 5 es un gráfico que muestra la alineación de la longitud de onda de una lámpara de argón/mercurio entre un espectrómetro primario y un espectrómetro secundario.

La figura 6 es un gráfico que muestra la calibración espectral de un espectrómetro primario y un espectrómetro secundario usando el segundo método de calibración.

La figura 7a es un diagrama de flujo que muestra un primer proceso para usar con el primer método de calibración.

La figura 7b es un diagrama de flujo que muestra una primera parte de un segundo proceso para usar con el segundo método de calibración.

La figura 7c es un diagrama de flujo que muestra una segunda parte de un segundo proceso para usar con el segundo método de calibración.

La figura 8 es un gráfico que muestra patrones fluorescentes medidos con sondas maestra y esclava y una función de transferencia de calibración de sonda.

La figura 9a es un gráfico de espectros Raman tisulares que compara espectrómetros primario y secundario no calibrados con sonda maestra y esclava respectivamente.

La figura 9b es un gráfico de espectros Raman de tejido de espectrómetros primario y secundario con sonda maestra y esclava respectivamente después de la recalibración usando un primer método de calibración.

La figura 9c es un gráfico que muestra espectros de espectrómetros primario y secundario con sonda maestra y esclava respectivamente después de la recalibración usando un segundo método de calibración. La figura 10 es un diagrama de dispersión de la puntuación del análisis de componentes principales en espectros Raman de tejido in vivo del gástrico antes y después de la calibración.

La figura 11 es un gráfico que muestra picos espectrales de fondo debidos a la sonda de fibra en un espectro Raman.

La figura 12 es un gráfico que muestra la variación de los espectros Raman con la potencia del láser de excitación.

La figura 13a es un diagrama de flujo que ilustra un método para generar un modelo para estimar la potencia del láser.

La figura 13b es un diagrama de flujo que ilustra un método para estimar la potencia del láser.

La figura 14a es un gráfico que muestra la raíz del error cuadrático medio para cualquier número de variables latentes incluidas.

La figura 14b muestra el factor de carga y regresión para las variables latentes del método de la figura 10. La figura 15 es un gráfico que muestra la potencia láser medida frente a la potencia láser prevista en sujetos in vivo de prueba.

La figura 16 es un diagrama de flujo que muestra un método para sustraer una señal de fondo de sonda. La figura 17 es un gráfico que muestra un espectro recibido de una palma y el fondo de fibra óptica de sílice y zafiro.

La figura 18 es un gráfico que compara el espectro Raman de la figura 16 y el espectro después de la eliminación del fondo.

La figura 19 es un diagrama de flujo que muestra una combinación de los métodos.

La figura 20 es un diagrama de arquitectura para el sistema de adquisición espectral y flujo de procesamiento para diagnóstico de cáncer en tiempo real según una realización.

La figura 21 es un diagrama de flujo que ilustra un esquema del flujo de procesamiento y adquisición espectral para el diagnóstico del cáncer en tiempo real según una realización.

Las figuras 22A y B son interfaces gráficas de usuario (GUI) para usar el sistema para diagnóstico de cáncer en tiempo real según dos realizaciones.

La figura 23 es un espectro Raman del medio in vivo de tejido gástrico normal (n=2465) y canceroso (n=283) adquirido de 305 pacientes gástricos.

La figura 24 ilustra las cargas de componentes principales (PC del inglés "principal component") calculadas a partir de una base de datos de entrenamiento espectral.

La figura 25 son diagramas de dispersión de dos puntuaciones de PC significativas para el diagnóstico (PC1 frente a PC2).

La figura 26 demuestra los residuos de T2 versus Q de Hotelling para 105 espectros Raman (45 normales, 30 cancerosos, 30 atípicos) adquiridos de 10 muestras gástricas prospectivas.

La figura 27 es un diagrama de dispersión de los valores de probabilidad posterior pertenecientes a tejido gástrico prospectivo normal (n=45) y canceroso (n=30) basado en el modelado PLS-DA junto con validación cruzada de exclusión de un espectro.

La figura 28 ilustra las curvas características operativas del receptor (ROC) calculadas a partir de la base de datos espectral para la predicción retrospectiva así como la curva ROC para la predicción prospectiva de tejido gástrico normal y canceroso.

La figura 29 ilustra los espectros Raman de tejido in vivo medios calibrados con intensidad y sustraídos por autofluorescencia ± 1 SD (del inglés "standard deviations") del labio interno mediante el uso de diferentes potencias de excitación láser de 785 nm (es decir, 10, 30 y 60 mW).

La figura 30a ilustra la relación entre las potencias de excitación del láser real y predicha utilizando el modelo de regresión PLS basado en la validación cruzada de un sujeto excluido, así como el ajuste lineal a los datos.

La figura 30b ilustra la relación entre la potencia de excitación del láser real y la predicha utilizando la regresión PLS basada en la validación independiente.

La figura 31 ilustra los espectros Raman de fantomas de tejido de gelatina preparados con diferentes concentraciones (es decir, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 % en peso) medidas a una potencia de excitación láser de 60 mW.

La figura 32 ilustra la correlación entre las concentraciones de gelatina, reales y predichas en fantomas de tejido después de la corrección con la potencia del láser predicha.

La figura 33 ilustra el espectro Raman sin procesar in vivo representativo adquirido de la fosa de Rosenmüller con 0,1 s durante el examen endoscópico clínico. El recuadro de la figura 33 es el espectro Raman del tejido procesado después de eliminar el intenso fondo de autofluorescencia.

La figura 34 ilustra el espectro Raman medio in vivo (entre sujetos) ± 1 desviación estándar (SD del inglés "standard deviations") de la nasofaringe posterior (PN) (n=521), la fosa de Rosenmüller (FOR del inglés "fossa of Rosenmüller") (n=157) y las cuerdas vocales laríngeas (LVC del inglés "laryngeal vocal chords") (n=196). Téngase en cuenta que los espectros Raman medios se desplazan verticalmente para una mejor visualización. También se muestran las adquisiciones endoscópicas Raman de fibra óptica in vivo de la fosa de la nasofaringe posterior (superior) de Rosenmüller (media) y las cuerdas vocales laríngeas (inferior) bajo la guía de imágenes de reflectancia de luz blanca (WLR) y de banda estrecha (NB del inglés "narrowband"). La figura 35 ilustra (intrasujeto) espectros Raman in vivo medios ± 1 SD de PN (n=18), FOR (n=18) y LVC (n=17). Téngase en cuenta que los espectros Raman medios se desplazan verticalmente para una mejor visualización.

La figura 36 ilustra la comparación de espectros de diferencia ± 1 SD de diferentes tipos de tejido anatómico (entre sujetos): [nasofaringe posterior (PN) - cuerdas vocales laríngeas (LVC)]; [nasofaringe posterior (PN) -fosa de Rosenmüller (FOR)] y [cuerdas vocales laríngeas (LVC) - fosa de Rosenmüller (FOR)].

La figura 37 ilustra Espectros Raman in vitro de posibles factores de confusión de fluidos corporales humanos (mucosidad nasal, saliva y sangre).

La figura 38 ilustra las cargas de PC que resuelven las variaciones biomoleculares entre diferentes tejidos en la cabeza y el cuello, lo que representa un total de 57,41 % (PC1: 22,86 %; PC2: 16,16 %; PC3: 8,13 %; PC46,22 % PC5: 4,05 %) de la varianza espectral.

La figura 39 proporciona cuadros con gráficos de las 5 puntuaciones de PCA para los diferentes tipos de tejido (es decir, PN, FOR y LVC). La línea entre cada cuadro de muesca [posición] representa la mediana, pero los límites inferior y superior del cuadro indican el primer (percentil 25,0%) y el tercer cuartil (percentil 75,0%), respectivamente. Las barras de error (triquitos o grafico de trazos) representan el rango intercuartílico de 1,5 veces. Los valores de p también se dan entre diferentes tipos de tejido.

La figura 40A ilustra los espectros Raman confocales medios in vivo de epitelio revestido escamoso (n=165), epitelio revestido cilíndrico (n=907), esófago de Barrett (n=318), displasia de alto grado (n=77) adquiridos durante el examen endoscópico clínico.

Las figuras 40B-E ilustran B) Portaobjetos seccionados histológicamente representativos (teñidos con hematoxilina y eosina (H&E)) correspondientes a los sitios de tejido medidos. Epitelio revestido escamoso (C) Esófago revestido columnar con ausencia de células caliciformes, *200; (D) Esófago de Barrett donde el epitelio escamoso estratificado normal es reemplazado por epitelio metaplásico intestinal que contiene células caliciformes, *200; (E) Displasia de alto grado que muestra atipia arquitectónica y citológica, así como criptas abarrotadas con ramificación y formación papilar, pleomofismo citológico y pérdida de polaridad; *100.

La figura 41A ilustra un gráfico ternario bidimensional de las probabilidades posteriores prospectivas que pertenecen al epitelio revestido columnar "normal" (CLE del inglés "columnar lined epithelium"), (ii) metaplasia intestinal "de bajo riesgo" (IM del inglés "intestinal metaplasia"), (iii) displasia de alto grado de "alto riesgo" (HGD del inglés "high-grade dysplasia") utilizando la técnica del endoscopio Raman confocal. Figura 41B Curvas de características operativas del receptor (ROC del inglés "receiver operating characteristics") de discriminaciones dicotómicas de CLE "normal", (ii) IM de "bajo riesgo", (iii) HGD de "alto riesgo". Las áreas bajo las curvas ROC (AUC del inglés "area under curve") son 0,88, 0,84 y 0,90, respectivamente.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En este documento se proporciona un sistema y un método en línea para espectroscopia biomédica (es decir, reflectancia, fluorescencia y espectroscopia Raman) para realizar la detección en tiempo real de lesiones neoplásicas en diferentes órganos (por ejemplo, tracto gastrointestinal (estómago, esófago, colon), vejiga, pulmón, cavidad oral, nasofaringe, laringe, cuello uterino, hígado, piel, etc.) en la endoscopia. El método de diagnóstico integra la sincronización de la fuente de excitación, el ajuste del tiempo de integración, la adquisición de datos, el preprocesamiento, el análisis de valores atípicos y el diagnóstico multivariante probabilístico (es decir, análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA por sus siglas en inglés de "partial least squares- discriminan analysis"), análisis discriminante lineal (LDA por sus siglas en inglés de "linear discriminan analysis") de análisis de componentes principales (PCA por sus siglas en inglés de "principal componen analysis"), análisis discriminante lineal de optimización de colonias de hormigas (ACO)-LDA [(ACO por sus siglas en inglés de "ant colony optimization")], árboles de clasificación y regresión (CART por sus siglas en inglés de "classification and regression trees"), máquina de vectores de soporte (SVM por sus siglas en inglés de "support vector machine"), refuerzo adaptativo (AdaBoost), etc.), incluidos diagnósticos multiclase basados en bases de datos espectrales integrales (es decir, Raman, fluorescencia, reflectancia) de diferentes órganos.

En una realización, el sistema y el método divulgados integran el marco de diagnóstico en línea con la plataforma espectroscópica Raman guiada por imagen multimodal (WLR/NBI/AFI) recientemente desarrollada para el diagnóstico temprano y la detección de precáncer y cáncer en el GI superior en la endoscopia. La acumulación de espectros Raman tisulares y la escala automática del tiempo de integración con un límite superior predefinido de 0,5 s permite la adquisición instantánea de in vivo espectros de tejido con SNR (del inglés "signal to noise ratio") mejorado al tiempo que previene la saturación de la señal c Cd . Esto es especialmente importante para los diagnósticos endoscópicos donde la intensidad de la autofluorescencia varía significativamente entre diferentes regiones anatómicas (por ejemplo, antro y cuerpo en el estómago, bronquios en el pulmón) probablemente causada por distintos fluoróforos endógenos en el tejido.

Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles que se muestran son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es lo más útil y fácilmente comprensible en la descripción de los principios y aspectos conceptuales del sistema y los métodos divulgados. En este sentido, no se intenta mostrar los detalles estructurales del sistema y los métodos divulgados con más detalle del necesario para una comprensión fundamental del sistema y los métodos divulgados, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la materia cómo las diversas formas del sistema y los métodos descritos se pueden realizar en la práctica.

Antes de explicar en detalle al menos una realización del sistema y los métodos descritos, debe entenderse que la invención está definida por las reivindicaciones adjuntas y que la descripción no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. El sistema y los métodos descritos son aplicables a otras realizaciones o se pueden poner en práctica o llevar a cabo de diversas formas. Además, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en el presente documento tienen fines descriptivos y no deben considerarse como limitantes.

Con referencia ahora a la figura 1, en 10 se muestra un instrumento de diagnóstico que comprende un sistema de endoscopio según una realización. El propio endoscopio se muestra en 11 y un cabezal de instrumento del endoscopio 11 se ilustra en general en la figura 1a. Para proporcionar orientación y visualización visual del área que se está probando, el endoscopio 11 está provisto de un sistema de video adecuado. La luz de una fuente de luz de xenón se transmite a las ventanas de iluminación 15 en el extremo del endoscopio 12. Los CCD 16 y 17, que responden a imágenes de reflexión de luz blanca, imágenes de banda estrecha o imágenes de autofluorescencia, reciben la luz reflejada y transmiten datos de video para permitir la inspección visual de los tejidos a prueba y para guiar el endoscopio a la posición deseada. El cabezal de la sonda Raman confocal se muestra en 18 y con más detalle en la figura 1b.

El sistema de espectroscopia Raman se muestra generalmente en 20. Una fuente de láser monocromática se muestra en 21, en el presente ejemplo, un láser de diodo con una longitud de onda de salida de aproximadamente 785 nm. La luz del diodo láser 21 pasa a través de un filtro de paso de banda proximal 22, que comprende un filtro de paso de banda estrecha que está centrado a 785 nm con una mitad máxima de ancho total de ± 2,5 nm. La luz pasa a través de un acoplamiento 23 a una fibra óptica de excitación 25 proporcionada como parte de un haz de fibras. La fibra de excitación 25 tiene un diámetro de 200 pm y una apertura numérica ('NA') de 0,22. La luz transmitida por la fibra de excitación 25 entra en una lente esférica 26 en el extremo del endoscopio 11, que en el presente ejemplo comprende una lente esférica de zafiro con un diámetro de aproximadamente 1,0 mm y un índice de refracción n = 1,77. Como se ilustra en la figura 1b, la luz transmitida desde la fibra óptica de excitación 25 se refleja internamente dentro de la lente esférica 26. Cuando la lente esférica está en contacto con el tejido a analizar, tal y como se muestra en el presente documento en 27, la luz transmitida desde la fibra óptica de excitación la fibra 25 sufre, al menos en parte, dispersión Raman dentro del tejido 27, a una profundidad de ~ 140 pm. La luz dispersada se refleja de nuevo internamente en la lente esférica 26 y se recibe en una pluralidad de fibras colectoras 28, también provistas como parte del haz de fibras. En el presente ejemplo se utilizan veintiséis fibras colectoras de 100 pm, con una AN de 0,22. Las fibras colectoras 28 pueden disponerse en cualquier configuración adecuada, por ejemplo, en una disposición circular que rodea la fibra de excitación 25.

La luz dispersa recogida devuelta por las fibras colectoras 28 pasa a través de un filtro colector en línea de paso largo 29 que, de manera similar, tiene un corte a ~ 800 nm. La configuración de la lente esférica de zafiro 26, las fibras de excitación y recolección 25, 28, los filtros de paso de banda 22 y el filtro de paso largo 29 proporciona un buen sistema para recolectar selectivamente fotones Raman retrodispersados del tejido 27.

A continuación, la luz devuelta dispersada se separa en el espectrógrafo 30 y el espectro resultante se refleja en una matriz de detección de luz 34, en el presente ejemplo, un dispositivo de par de carga ("CCD"). Un ordenador mostrado en 35 controla el funcionamiento del sistema, procesa y almacena los espectros y los datos de control, y proporciona resultados y datos a un usuario.

En una realización, el ordenador 35 comprende al menos un procesador acoplado a un conjunto de chips. También se acoplan al conjunto de chips una memoria, un dispositivo de almacenamiento, un teclado, un adaptador de gráficos, un dispositivo señalador, un dispositivo emisor de audio y un adaptador de red. Una pantalla está acoplada al adaptador de gráficos. En una realización, la funcionalidad del conjunto de chips la proporciona un concentrador de controlador de memoria y un concentrador de controlador de I/O. En otra realización, la memoria se acopla directamente al procesador en lugar del conjunto de chips.

El dispositivo de almacenamiento es cualquier dispositivo capaz de almacenar datos, como un disco duro, un disco compacto de memoria de solo lectura (CD-ROM), un DVD o un dispositivo de memoria de estado sólido. La memoria contiene instrucciones y datos utilizados por el procesador. El dispositivo señalador puede ser un ratón, bola de seguimiento u otro tipo de dispositivo señalador, y se utiliza en combinación con el teclado para introducir datos en el sistema informático. El adaptador de gráficos muestra imágenes y otra información en la pantalla. El adaptador de red acopla el sistema informático a una red de área local o amplia.

Como se conoce en la técnica, un ordenador 35 puede tener componentes diferentes y/u otros a los descritos anteriormente. Además, el ordenador puede carecer de ciertos componentes. Además, el dispositivo de almacenamiento puede ser local y/o remoto desde el ordenador (tal como incorporado dentro de una red de área de almacenamiento (SAN del inglés "storage area network")).

Como se conoce en la técnica, el ordenador está adaptado para ejecutar módulos de programas informáticos para proporcionar la funcionalidad descrita en este documento. Tal y como se usa en el presente, el término "módulo" se refiere a la lógica del programa informático utilizada para proporcionar la funcionalidad especificada. Por lo tanto, un módulo puede implementarse en hardware, firmware y/o software. En una realización, los módulos de programa se almacenan en el dispositivo de almacenamiento, se cargan en la memoria y el procesador los ejecuta.

Las realizaciones de las entidades descritas en el presente documento pueden incluir otros y/o módulos diferentes a los aquí descritos. Además, la funcionalidad atribuida a los módulos puede ser realizada por otros o diferentes módulos en otras realizaciones. Además, esta descripción omite ocasionalmente el término "módulo" con fines de claridad y conveniencia.

El ordenador 35 también realiza el preprocesamiento de los datos espectrales. Dado que los espectros Raman de tejido medidos están sustancialmente oscurecidos por el fondo de autofluorescencia del tejido, es necesario el preprocesamiento de los espectros Raman de tejido in vivo para extraer las señales Raman débiles. Los espectros Raman sin procesar medidos a partir de tejido in vivo representan una combinación de señal Raman débil, fondo de autofluorescencia intenso y ruido. Los espectros se normalizan primero al tiempo de integración y la potencia del láser. A continuación, los espectros se suavizan utilizando un filtro de suavizado Savitzky - Golay de primer orden (ancho de ventana de 3 píxeles) para reducir el ruido. Se encontró que un polinomio de quinto orden era óptimo para ajustar el fondo de autofluorescencia en el espectro suavizado por ruido, y este polinomio luego se resta del espectro sin procesar para producir solo el espectro Raman del tejido. El ordenador 35 también puede incluir algoritmos de diagnóstico para precáncer y detección de cáncer.

Calibración de espectrómetro y sonda de fibra óptica

Se sabe que diferentes espectrómetros tendrán diferentes funciones de transferencia, es decir, mostrarán diferentes variaciones de intensidad dentro de los espectros incluso cuando se ilumine usando la misma fuente. Como se ilustra en la figura 2, se muestra el espectro de una fuente estándar. La fuente estándar en este ejemplo es un objetivo estándar fluorescente que emite un espectro fluorescente conocido cuando es excitado por un láser como la fuente láser 21. El objetivo estándar fluorescente debe ser consistente y estable y emitir un amplio espectro de fluorescencia bajo una excitación láser (por ejemplo, 785nm). El espectro de fluorescencia debe ser estable en el tiempo y caracterizar de manera eficiente las propiedades de transmisión espectral en toda la región espectral de interés (por ejemplo, 400-1800 cirr1, 2000-3800 cirr1). Un ejemplo es el vidrio dopado con cromo. Se muestran los espectros resultantes de dos espectrómetros, que son claramente diferentes. Para compensar la respuesta del espectrómetro, o función de transferencia, se sabe aplicar una función de calibración que corregirá el espectro recibido del espectrómetro. En la figura 2 se muestran ejemplos y funciones de calibración que, cuando se aplican al espectro correspondiente del espectrómetro, alinearán el espectro con el espectro estándar conocido.

Usando una fuente estándar fluorescente, la función de transferencia, es decir, la respuesta del espectrómetro dependiente de la longitud de onda, se puede dar por

(ecuación 1) donde F(A) es el espectro estándar fluorescente correcto, S(A) es el espectro medido de la fuente estándar fluorescente y T(A) es la función de transferencia del espectrómetro. En consecuencia, como se conoce T(A), se puede calcular un espectro Raman correctamente calibrado de una nueva muestra R(A) mediante

(ecuación 2) donde S(A) es el espectro de muestra medido.

La función de transferencia T(A) es una función tanto de la función de transferencia del espectrómetro T^s(A) [TS del inglés "transfer function"] y una función de transferencia de sonda T^p(A) [PA del inglés "probe transfer']. Por lo tanto, la ecuación 2 se puede escribir como

(ecuación 3). Como las sondas de fibra óptica son reemplazables y pueden ser consumibles, será evidente que cuando una nueva sonda con una nueva función de transferencia de sonda Tp se inserta, la función de transferencia general del sistema cambiará.

Con referencia ahora a la figura 3, se muestra un espectrómetro principal o maestro en 50 y un espectrómetro secundario o esclavo en 51. Cada uno de los espectrómetros 50, 51 tiene una configuración similar a la que se muestra en la figura 1, pero pueden tener diferentes sondas de fibra y características de espectrógrafo. Idealmente, el ordenador personal 35 que controla cada espectrógrafo usa una biblioteca común de programas para proporcionar control del sistema y procesamiento de datos, y por lo tanto es deseable que las características de los espectrómetros primario y secundario 50, 51 sean consistentes. En este ejemplo, el espectrómetro principal 50 está asociado con la sonda principal o maestra 52, y el espectrómetro secundario 51 está asociado con una pluralidad de sondas secundarias o esclavas mostradas en 53a, 53a, 53b. En cada caso, la calibración se realiza con referencia a una fuente fluorescente estándar ilustrada esquemáticamente en 54.

En la figura 4a se muestra un primer método de calibración que no forma parte de la invención reivindicada. En el paso 60, se calibra la longitud de onda del espectrómetro secundario de acuerdo con el espectrómetro primario. En este caso, se realiza la calibración del eje de longitud de onda del espectrómetro secundario 51, por ejemplo, utilizando una lámpara espectral de argón-mercurio o una muestra química con líneas espectrales definidas, y luego se realiza la coincidencia de resolución de píxeles mediante interpolación lineal para garantizar que el tamaño del eje del segundo espectrómetro coincide con el del espectrómetro primario. Los resultados de esta calibración se muestran en la figura 5, donde los espectros de los espectrómetros primario y secundario 50, 51 muestran las líneas espectrales de la lámpara alineadas con precisión. En el paso 61, se realiza la calibración para el segundo espectrómetro y la sonda 53a usando una fuente fluorescente 54. De manera similar al gráfico de la figura 2, se registrará un espectro de la fuente fluorescente y luego se puede calcular una función de transferencia para alinear el espectro medido con el espectro conocido y almacenarlo, por ejemplo, mediante el un ordenador personal 35. En el paso 62, el espectrómetro 51 puede usarse para ensayo o pruebas Raman in vivo o de otro modo, y los espectros Raman medidos pueden ser corregidos utilizando la función de transferencia registrada en el paso 61.

Cuando se descarta la sonda 53a y se desea realizar pruebas en un nuevo sujeto, se puede sustituir una sonda 53b de reemplazo, en cuyo caso se repite el método de la figura 4a.

En una alternativa que tampoco forma parte de la invención reivindicada, como se ilustra en las figuras 4b y 4c, se pueden registrar primero una pluralidad de funciones de calibración para el espectrómetro secundario y una pluralidad de sondas secundarias. En el paso 60 de la figura 4b, como en la figura 4a, el espectrómetro secundario 51 se calibra para que sea coherente con el espectrómetro primario 60. En el paso 61, se mide una función de calibración para la sonda secundaria 53a, y en el paso 63 esta función de calibración se almacena y asociado con la sonda 53a de alguna manera, por ejemplo guardando la función de calibración como un archivo de ordenador 56a etiquetado con un número de referencia correspondiente a la sonda secundaria 53a. Como muestra la flecha 64, este proceso se repite luego para cualquier número de sondas 53b, ..., 53n para proporcionar un surtido o reserva de sondas. Como se muestra en la figura 4c, cuando se desea realizar pruebas utilizando el espectrómetro 51, en el paso 60 se calibra el espectrómetro de acuerdo con el espectrómetro principal 50 como se indicó anteriormente. En el paso 65, la sonda 53n se instala en el sistema y se recupera una correspondiente función de transferencia almacenada 56n. En el paso 66, las pruebas que usan el espectrómetro secundario 51 pueden realizarse y calibrarse usando la función de calibración recuperada 56n.

Un enfoque alternativo según la invención reivindicada se ilustra con referencia a la figura 6, en la que las sondas secundarias o secundarias 53a,...,53n se calibran en la primaria o principal 50. De acuerdo con la ecuación 2, donde el espectrómetro principal se prueba con una sonda primaria o maestra con función de transferencia T^pp(A) y una sonda secundaria o esclava con función de transferencia T^sp(A), el espectro de la fuente fluorescente F(A) dará como resultado un espectro SPP(A) para la sonda primaria, donde

(ecuación 4) y un espectro S^sp(A) utilizando la sonda secundaria, donde

(ecuación 5) las ecuaciones 4 y 5 se pueden dividir para relacionar los dos valores de transferencia de sonda a través de una función de calibración de sonda Tfc, dónde

(ecuación 6) en consecuencia, a partir de las ecuaciones 2 y 6, cuando se utiliza el espectrómetro secundario con la sonda secundaria, el espectro medido S(A) y el espectro Raman R(A) están relacionados por

(ecuación 7) donde T(Á) = T^s ( ^á)T^pp ( ^á) es la función de transferencia del sistema almacenada medida para el espectrómetro secundario usando la sonda maestra.

Como se ilustra en las figuras 6 a 7c, esto permite hacer coincidir cualquier número de sondas secundarias o esclavas 53a, 53b, 53n con cualquier número de espectrómetros secundarios 51a, 51b, 51n. Como se muestra en la figura 7a, en un primer paso 70, el espectrómetro secundario 51a se calibra de acuerdo con el espectrómetro primario 50 de manera similar al paso 60, usando la sonda maestra 52. La función de transferencia del sistema 71a se encuentra en el paso 72 probando el espectrómetro secundario contra una fuente estándar fluorescente 54 de manera similar al método de las figuras 3 a 4c. La función de transferencia del sistema 71a se asocia con el espectrómetro 51a correspondiente de cualquier manera apropiada, por ejemplo, en el software de control o de otro modo en el paso 73. Como se muestra con la flecha 74, esto puede repetirse para cualquier número de sistemas de espectrómetro secundarios 51b, ...51n, para generar funciones de transferencia del sistema apropiadas 71b,...71n. Como se muestra en la figura 7b, las sondas secundarias o esclavas 53a, 53b,..., 53n se calibran contra la sonda maestra 52. En el paso 75, el sistema de espectrómetro primario 50 se calibra adecuadamente con la sonda maestra contra una fuente fluorescente 54, aunque esto puede omitirse si este paso ya se ha realizado y la función de transferencia asociada a la sonda maestra ya está almacenada. En el paso 76, la sonda maestra se reemplaza por la sonda 53a, y la combinación del sistema de espectrómetro primario y la sonda esclava correspondiente luego se prueban con un estándar fluorescente 54. En el paso 77, una función de calibración T^fcse calcula a partir de la relación de los espectros de la sonda primaria y secundaria y en 78 esto se registra y almacena asociado con la sonda secundaria como se muestra en 79a. Como muestra la flecha 80, esto puede repetirse para cualquier número de sondas secundarias 53b,...53n y la correspondiente función de calibración T^fcalmacenado como se muestra en 79b,...79b.

Como se ilustra en la figura 7c, uno de los sistemas de espectrómetro secundario 51n se puede usar con cualquiera de las sondas secundarias 53n, ya que se conoce la función de transferencia del sistema 71a que usa la sonda maestra 52 y la función de calibración T^fcse conoce la relación de la sonda secundaria 53n con la sonda maestra 52. Como se muestra en el paso 81, el sistema de espectrómetro secundario 51n se calibra de acuerdo con el sistema de espectrómetro primario 50. En el paso 82, la función de calibración de sonda secundaria Tfc se recupera y la función de transferencia del sistema de almacenamiento 71n se modifica de acuerdo con la función de calibración almacenada T^fc. En el paso 83, se pueden realizar pruebas Raman in vivo o de otro modo y se pueden corregir los espectros Raman capturados.

Por lo tanto, en cualquiera de los métodos, haciendo coincidir las características secundarias del espectrómetro con las características primarias del espectrómetro y almacenando la función de transferencia para la combinación de espectrómetro y sonda o una función de transferencia para el sistema que incorpora una sonda maestra y una función de calibración para usar con una sonda secundaria, los espectros capturados usando diferentes combinaciones de espectrómetro y sonda serán consistentes y comparables.

Esto es evidente a partir de la figura 8 y las figuras 9a a 9c. La figura 8 muestra diferentes respuestas entre la sonda maestra 52 y una sonda secundaria o esclava 53n. La respuesta de intensidad varía a lo largo del espectro, y la función de calibración, como se muestra, asignaría el espectro de la sonda secundaria al de la sonda principal o maestra. Los espectros de tejido no calibrados de un espectrómetro primario 50 y un espectrómetro secundario 51 se muestran en la figura 9a y las diferencias entre ellos son evidentes. Las figuras 9b y 9c muestran los resultados de la calibración usando cada uno de los métodos mostrados anteriormente y los espectros del espectrómetro primario y secundario concuerdan sustancialmente.

Los espectros Raman se midieron desde el estómago con dos sondas diferentes (n=902 espectros). Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) antes y después de la calibración de la sonda secundaria. La figura 10 muestra el análisis PCA antes y después de la calibración de la sonda de fibra óptica, así como el intervalo de confianza del 95 % en diferentes puntuaciones. Es evidente que después de la calibración de la sonda de fibra, los espectros caen dentro del mismo intervalo de confianza, lo que indica una transferencia exitosa entre las sondas Raman de fibra óptica maestra y esclava.

Supervisión de la potencia del láser

La figura 11 es un gráfico que muestra un espectro de fondo de una sonda de fibra, es decir, en ausencia de una señal de tejido. Son evidentes los picos correspondientes a la dispersión Raman o fluorescencia dentro de la sílice de la fibra y los picos correspondientes al zafiro de la lente esférica distal. La figura 12 muestra un gráfico de espectros Raman recibidos de tejido in vivo con diferentes niveles de potencia transmitida. Los picos de la figura 11 son evidentes en las diferentes líneas de la figura 12, pero será evidente que las alturas relativas de los picos y el fondo continuo varían con la potencia transmitida.

Ventajosamente, se ha descubierto que las características espectrales de la sonda de fibra y la lente esférica de zafiro en los espectros Raman capturados pueden usarse como referencia interna para derivar la potencia del láser transmitida sin requerir la provisión de ningún componente adicional en el tren óptico. Como se muestra en el método de la figura 13A, en el paso 90, se recoge un número adecuadamente grande de espectros, en el presente ejemplo 352, y se mide la potencia láser transmitida. En el paso 91, se realiza un análisis estadístico de múltiples variables adecuado, en el presente ejemplo, regresión de mínimos cuadrados parciales ("PLS"). La regresión PLS reduce la dimensión de los datos espectrales a una serie de variables latentes ("LV"). En este caso, la varianza entre la variación espectral y la variable dependiente, la potencia del láser, se maximiza para que las variables latentes den mayor peso a los picos espectrales que se correlacionan bien con la potencia del láser. Seleccionando un número apropiado de variables latentes, se puede derivar un modelo de la potencia del láser en función de las características espectrales, y se almacena como se muestra en el paso 92. En consecuencia, en funcionamiento como se muestra en la figura 13b en el paso 93 se captura un espectro de prueba, por ejemplo de un sujeto in vivo o de otro modo, y en el paso 94 se proporcionan los valores espectrales al modelo almacenado. En el paso 95, la potencia del láser se deriva y se muestra al operario, por ejemplo, en el ordenador personal 35.

En el presente ejemplo, en la figura 14a se muestra un gráfico del número de variables latentes incluidas frente a la raíz del error cuadrático medio, y se seleccionan cuatro variables que dan el mejor equilibrio entre error y complejidad. La carga relativa de las cuatro variables latentes y el vector de regresión se muestran en la figura 14b. En la figura 15 se muestran datos de ejemplo de mediciones en tiempo real de 166 espectros en cinco sujetos, con la potencia del láser medida representada frente a la potencia estimada por el modelo. Será evidente que el ajuste sustancialmente lineal muestra que la potencia estimada es un buen indicador de la potencia entregada realmente. Sustracción de fondo iterativa

Con referencia a las figuras 16 a 18, se muestra un método para sustraer el espectro Raman de fondo resultante de la fluorescencia, la dispersión Raman en la sílice de la sonda y el zafiro de la lente. Esta señal de fondo es única para cada sonda de fibra específica. Es deseable eliminar el fondo de los espectros Raman tisulares sin substraer o subsustraer el fondo.

Como se muestra en el paso 110 de la figura 16, el espectro de fondo se captura y almacena, por ejemplo, transmitiendo luz desde la fuente láser a través de la sonda en ausencia de un objetivo. En el paso 111, se recibe el espectro Raman de un sujeto de prueba, por ejemplo, de un tejido. En el paso 112, la cantidad de señal de fondo de fibra en el espectro Raman del sujeto de prueba se estima usando la intensidad de uno o más picos de referencia distintos. En el presente ejemplo, los picos pueden deberse a sílice y/o zafiro (por ejemplo, 417 o 490 cm-1). Utilizando la cantidad estimada de señal de fondo, la señal de fondo almacenada puede multiplicarse por un factor de corrección adecuado, posiblemente dependiente de la longitud de onda, y restarse del espectro de prueba (etapa 113).

En el paso 114, se comprueba la presencia de fondo restante en el espectro. Si el fondo se eliminó por completo (es decir, cuando la señal de sílice y zafiro contribuye de manera insignificante al espectro Raman del tejido), el espectro se pasa para salida o análisis adicional como se muestra en el paso 115. Si una señal de fondo todavía está presente, entonces los pasos 112 a 114 se repiten como muestra la flecha 116.

No es necesario que el método se limite a picos individuales de sílice/zafiro. El análisis multivariante (por ejemplo, métodos de resolución de curvas y mínimos cuadrados parciales, etc.) también se pueden utilizar para este propósito.

A modo de ejemplo, la figura 17 es un gráfico que muestra un espectro Raman recibido del tejido de la palma y un espectro de fondo de la sonda. Los picos de fluorescencia, la dispersión Raman en la sílice de la sonda y el zafiro de la lente son evidentes, superpuestos al espectro Raman de la palma. Esta señal de fondo es única para cada sonda de fibra específica.

Como se muestra en la figura 18, después de que se haya realizado el proceso iterativo de la figura 16, los espectros Raman suaves se muestran sin los picos distintivos de la señal de fondo pero conservando la información espectroscópica Raman esencial requerida.

Sistema Combinado

Los diversos métodos descritos se pueden usar juntos. En la figura 19 se ilustra una realización de dicha combinación. En el paso 100, el método de calibración se puede realizar de modo que la función de transferencia del sistema se conozca de acuerdo con un sistema maestro o primario 50 y los espectros subsiguientes se puedan corregir apropiadamente. En el paso 101, se puede realizar el preprocesamiento de la señal, incluido el suavizado y la sustracción del fondo del tejido. En el paso 103, se puede realizar el control de potencia en el espectro como se discutió anteriormente y, en paralelo, en el paso 102, se puede realizar la sustracción de fondo de la sonda. Como se muestra en el paso 104, la información de los pasos 102 y 103 se proporciona a un programa adecuado en el ordenador personal 35 para realizar otros pasos de diagnóstico o salida.

Al combinar el método de calibración descrito con un método de diagnóstico, la espectroscopia Raman de fibra óptica independiente del instrumento es posible para el análisis y la caracterización cuantitativos de tejidos. Esto permite la comparación de espectros tomados por diferentes instrumentos y también espectros tomados con el mismo instrumento pero con diferentes sondas. Esto es importante para el diagnóstico porque permite el uso de espectros tomados en diferentes máquinas o con diferentes sondas para comparar. Esto es importante para aumentar la precisión del diagnóstico.

Diagnóstico de cáncer en tiempo real

Un sistema y método de espectroscopia biomédica en línea (es decir, espectroscopia de reflectancia, fluorescencia y Raman) realiza diagnósticos de cáncer en tiempo real en la endoscopia clínica y puede interactuar con los médicos utilizando retroalimentación auditiva, así como una visualización gráfica del resultado de los algoritmos de diagnóstico probabilístico con la patología pronosticada. Tomando como ejemplo la endoscopia Raman en el estómago (figura 22A); el método es capaz de predecir varias patologías: normal, metaplasia intestinal, displasia y neoplasia. Este método de diagnóstico en línea proporciona información al médico en tiempo real de la patología del tejido que se puede utilizar para la toma de decisiones, como la guía de biopsia o la erradicación de tumores. El sistema, que incluye una GUI [del Inglés "graphic userinterface" o interfaz gráfica del usuario], está optimizado para un procesamiento rápido de datos que permite diagnósticos en tiempo real (<0,1 s), por ejemplo, para endoscopia clínica.

Para abordar las variaciones espectrales interanatómicas e interorgánicas, el marco en línea implementa modelos de diagnóstico específicos de órganos y cambia entre las bases de datos espectrales de diferentes órganos (por ejemplo, esófago, estómago, colon, cuello uterino, vejiga, pulmón, nasofaringe, laringe y la cavidad oral (paladar duro, paladar blando, bucal, labio interno, ventral y lengua)). Por lo tanto, la plataforma Raman descrita es una herramienta de diagnóstico universal para el diagnóstico de cáncer en endos

La figura 20 es un diagrama de arquitectura para un sistema de diagnóstico 115 para adquisición espectral y flujo de procesamiento para diagnóstico de cáncer en tiempo real según una realización. El sistema de diagnóstico 115 puede implementarse en el ordenador personal 35. El sistema de diagnóstico 115 comprende un módulo de adquisición espectral 120, un módulo de preprocesamiento espectral 125, un módulo de análisis de valores atípicos 130, un módulo de análisis multivariante 135, un módulo de patología 140 y una base de datos 142. Para simplificar, solo se muestran un módulo de adquisición espectral 120, un módulo de preprocesamiento espectral 125, un módulo de análisis de valores atípicos 130, un módulo de análisis multivariado 135, un módulo de patología 140 y una base de datos 142, pero en la práctica muchos de cada uno pueden estar en funcionamiento.

Haciendo referencia a las figuras 20-22, en el paso 145, el módulo de adquisición espectral 120 sincroniza electrónicamente la fuente de excitación láser con el CCD y almacena la lectura agrupada del CCD en la base de datos 142 para su posterior procesamiento. El módulo de adquisición espectral ajusta aún más automáticamente el tiempo de exposición y la acumulación de espectros escalando hasta -85 % del recuento total de fotones en función de las mediciones de tejido anteriores, mientras que se establece un límite superior de 0,5 segundos para lograr condiciones clínicamente aceptables. La acumulación de múltiples espectros y el ajuste automático del tiempo de exposición proporciona una metodología rápida y sencilla para evitar la saturación de la señal y obtener una alta relación señal/ruido para aplicaciones endoscópicas. Si la señal espectral se satura, el método inicia una nueva adquisición de datos con un tiempo de integración reducido para evitar la saturación. Después de la adquisición espectral, el método identifica y elimina los rayos cósmicos (por ejemplo, utilizando la primera derivada de los espectros con un intervalo de confianza (CI del inglés "confidence interval") del 95% sobre todo el rango espectral establecido como umbral máximo). Los rayos cósmicos identificados se eliminan por interpolación lineal. El marco de tiempo de adquisición espectral corto es especialmente útil para aplicaciones endoscópicas. La GUI ilustrada en la figura 22A ilustra la adquisición del espectro en 180.

Para otras aplicaciones, el marco de adquisición espectral también podría usarse para intervenciones quirúrgicas externas o internas o para evaluar tipos de tejido durante la cirugía. La capacidad en tiempo real permite el diagnóstico sobre el terreno y, por lo tanto, podría usarse para guiar los márgenes de escisión para la resección del tumor. Es fundamental que la información de diagnóstico se pueda proporcionar en línea (es decir, <0,5 segundos) para ayudar en la toma de decisiones médicas. Para las mediciones de la piel, existen demandas menos estrictas para el tiempo de medición porque los espectros de la piel se adquieren en entornos experimentales más controlables con la posibilidad de tiempos de exposición más prolongados. La arquitectura de software en línea también se puede aplicar a otras áreas que requieren mediciones espectrales rápidas, incluida la fluorescencia, la espectroscopia de reflectancia o en diferentes campos, como la tecnología analítica de procesos, las ciencias de los alimentos, la medicina forense, etc., donde se necesita una detección ininterrumpida en tiempo real. En el paso 150, el módulo de adquisición espectral 120 determina si la señal está saturada. Si es así, inicia una nueva adquisición de datos con un tiempo de integración reducido para evitar la saturación. En el paso 155, el módulo de adquisición de espectros 120 identifica y elimina los rayos cósmicos (es decir, utilizando la primera derivada de los espectros con un intervalo de confianza (CI) del 95% sobre todo el rango espectral establecido como umbral máximo). En una realización, los rayos cósmicos identificados se eliminan mediante interpolación lineal. Los rayos cósmicos se pueden eliminar mediante otros métodos, incluido el análisis multivariante, el suavizado, el filtrado medio, el filtrado mediano, la transformada de Fourier, las ondículas, etc.

En el paso 160, el módulo de preprocesamiento espectral 125 escala los espectros adquiridos con el tiempo de integración y la potencia del láser. Se utiliza además un filtro de suavizado Savitzky-Golay de primer orden para eliminar el ruido en los espectros de intensidad corregida. A continuación, se resta un polinomio modificado de quinto orden restringido al límite inferior de los espectros suavizados para resolver solo el espectro Raman tisular. El espectro Raman finalmente se normaliza al área integrada bajo la curva de 800 a 1800 cirr1 para resolver las formas de las líneas espectrales y las intensidades relativas, reduciendo las variaciones en el manejo de la sonda en la endoscopia clínica. La GUI (figura 22A) ilustra el espectro normalizado en 185. En algunas realizaciones, el módulo de preprocesamiento espectral 125 utiliza métodos adicionales para el preprocesamiento que incluyen, entre otros, corrección de dispersión múltiple (MSC del inglés "múltiple scatter correction"), filtrado FIR, sustracción de línea base ponderada, ruido reducción, centrado de la media, diferenciación, etc.

En el paso 165, el módulo de análisis de valores atípicos 130 detecta los espectros de valores atípicos utilizando el componente principal (PCA) junto con las estadísticas residuales T2 y Q de Hotelling. La GUI (figura 22A) ilustra el análisis de valores atípicos en 190. La implementación de la detección de valores atípicos sirve como una herramienta de retroalimentación específica del modelo de alto nivel en el marco en línea utilizando el componente principal (PCA) junto con las estadísticas T2 y Q-residual de Hotelling. Los residuos T2 y Q de Hotelling son los dos parámetros independientes que proporcionan información dentro y fuera del ajuste del modelo. Usando estos parámetros como indicadores de la calidad del espectro (es decir, el modo de contacto de la sonda, los factores de confusión, la interferencia de la luz blanca, etc.), la retroalimentación auditiva se integra en el sistema de diagnóstico Raman en línea, lo que facilita la detección espectroscópica en tiempo real y los consejos sobre el manejo de la sonda para los médicos. El sistema de software proporciona diferentes comentarios de sonido para diferentes resultados de diagnóstico. Por ejemplo, si el espectro es un valor atípico, aparecerá un determinado sonido. Si el espectro se clasifica como "normal" en el diagnóstico, aparecerá un segundo sonido distinto. Si el espectro se clasifica como "precáncer" o "cáncer", aparecerá un tercer o cuarto sonido. La frecuencia del sonido podría ser proporcional a la "probabilidad posterior". Esto es muy útil porque proporciona al endoscopista una guía en tiempo real mientras recibe información de diagnóstico. Por lo tanto, el endoscopista no necesita prestar atención al monitor de la plataforma Raman, sino que se concentrará en los procedimientos de operación endoscópica con la guía de sonido. Si el módulo de análisis de valores atípicos determina que el espectro adquirido es un valor atípico, el sistema de diagnóstico 115 comienza de nuevo en el paso 145.

Si los espectros se verificaron para un análisis posterior, se alimentan a modelos probabilísticos para diagnósticos de cáncer in vivo. En el paso 170, el módulo de análisis multivariado 135 aplica modelos probabilísticos para in vivo diagnóstico de cáncer. El módulo de análisis multivariado 135 cambia entre diferentes modelos renderizados previamente, incluido el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), análisis discriminante lineal PCA (LDA), optimización de colonias de hormigas (ACO)-LDA, árboles de clasificación y regresión (CART), máquina de vectores de soporte (SVM), refuerzo adaptativo (AdaBoost), etc., basado en bases de datos espectrales de un gran número de pacientes.

En el paso 175, el módulo de patología 140 implementa modelos de diagnóstico específicos de órganos que pueden cambiar entre las bases de datos espectrales de diferentes órganos para diagnósticos probabilísticos de cáncer. Además de la retroalimentación de audio, la GUI (Fig. 22A) proporciona al médico la salida del módulo de patología 140 en 195.

La figura 22B proporciona la GUI según una segunda realización.

La base de datos 142 almacena los espectros adquiridos así como los espectros almacenados utilizados para el diagnóstico.

En algunas realizaciones, se toman y analizan múltiples espectros. Por ejemplo se toman entre 5 y 15. Cada uno se analiza y si más de un porcentaje umbral proporciona el mismo resultado (cáncer frente a normal), ese es el diagnóstico determinado. Por ejemplo, si se toman 10 espectros y 7 o más dan la misma respuesta, ese es el diagnóstico. Si solo 5 ó 6 dan la misma respuesta, se repite el proceso.

Ejemplo

Un sistema integrado de espectroscopia Raman y de imágenes de campo amplio trimodal utilizado para diagnósticos en tiempo real comprende un láser de diodo de espectro estabilizado de 785 nm (salida máxima: 300 mW, de B&W TEK Inc., en Newark, Delaware, EE. UU.) sincronizado electrónicamente con un USB 6501 digital I/O (de National Instruments, Austin, Texas, EE. UU.), un espectrógrafo de imágenes transmisivas.

(Holospec f/1.8, Kaiser Optical Systems, Ann Arbor, Míchigan, EE. UU.) equipado con una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD) refrigerada por nitrógeno líquido, optimizada para NIR, retroiluminada y de agotamiento profundo (1340400 píxeles a 20 x 20 pm por píxel; Spec-10: 400BR/LN, de Princeton Instruments, Trenton, Nueva Jersey, EE. UU.), y una sonda endoscópica Raman especialmente diseñada para el suministro de luz láser y la recolección de señales Raman de tejido in vivo. La sonda endoscópica Raman de 1,8 mm está compuesta por 32 fibras colectoras que rodean la fibra de suministro de luz central con dos etapas de filtrado óptico incorporadas en los extremos proximal y distal de la sonda para maximizar la recolección de señales Raman tisulares, al tiempo que reduce la interferencia de la luz dispersa de Rayleigh, la fluorescencia de fibra y las señales Raman de sílice. La sonda Raman puede pasar fácilmente al canal de instrumentos de los endoscopios médicos y dirigirse a sitios de tejidos sospechosos bajo la guía de modalidades de imágenes endoscópicas de campo amplio (WLR/AFI/NBI). El sistema adquiere espectros Raman en el rango de número de onda de 800-1800 cm-1 del tejido GI superior in vivo en 0,5 s utilizando la potencia de excitación de 785 nm de 1,5 W/cm2 (tamaño de punto de 200 pm) con una resolución espectral de ~9 cm-1.

Los componentes de hardware del sistema Raman (por ejemplo, control de potencia láser, espectrómetro, obturador CCD y sincronización de lectura de cámara) se interconectaron con el software Matlab a través de bibliotecas para diferentes espectrómetros/cámaras (por ejemplo, biblioteca PVCAM (de Princeton Instruments, Roper Scientific, Inc., Trenton, Nueva Jersey, EE. UU.) y Omni Driver (Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, EE. UU.), etc.). El láser se sincronizó electrónicamente con el obturador CCD. El ajuste automático de la potencia del láser, el tiempo de exposición y la acumulación de espectros se realizaron escalando dentro del 85 % del recuento total de fotones (por ejemplo, 55.250 de 65.000 fotones) en función de las mediciones Raman de tejido anteriores, mientras que se estableció un límite superior de 0,5 segundos para realizar condiciones clínicamente aceptables. La acumulación de espectros múltiples y el ajuste automático del tiempo de exposición proporciona una metodología rápida y sencilla para evitar la saturación del CCD y obtener una relación señal/ruido (SNR del inglés "signal to noise rntio") alta para aplicaciones endoscópicas. El eje de desplazamiento Raman (longitud de onda) se calibró utilizando una lámpara de calibración de mercurio/argón (Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, EE. UU.). La corrección de la respuesta espectral para la dependencia de la longitud de onda del sistema se realizó utilizando una lámpara estándar (RS-10, EG&G Gamma Scientific, San Diego, California, EE. UU.). La reproducibilidad de la plataforma se controla continuamente con la frecuencia del láser y los espectros Raman de ciclohexano y paracetamol como estándares de número de onda. Todas las medidas de rendimiento del sistema, incluida la temperatura del CCD, el tiempo de integración, la potencia del láser y la alineación del CCD, se registran en consecuencia en una base de datos central a través del servidor SQL.

El preprocesamiento en tiempo real de las señales Raman se realizó con la detección rápida de rayos cósmicos utilizando la primera derivada con un intervalo de confianza (CI) del 95 % en todo el rango espectral establecido como umbral máximo. Los puntos de datos que se encuentran fuera de un umbral se interpolaron a segundo orden. Los espectros se escalaron aún más con el tiempo de integración y la potencia del láser. Se usó un filtro suavizante Savitzky-Golay de 5 puntos de primer orden para eliminar el ruido en los espectros de intensidad corregida, mientras que se restó un polinomio modificado de quinto orden restringido al límite inferior de los espectros suavizados para resolver el espectro Raman de tejido separadamente. El espectro Raman se normalizó al área integrada bajo la curva de 800 a 1800 cm-1, lo que permite una mejor comparación de las formas espectrales y las intensidades de banda Raman relativas entre diferentes patologías tisulares. Luego, los espectros se centraron localmente en la media de acuerdo con la base de datos específica para eliminar las variaciones comunes en los datos. Después del preprocesamiento, los espectros Raman se alimentaron a un análisis de valores atípicos específico del modelo. Se incorporó un esquema de detección de valores atípicos en la espectroscopia biomédica como una herramienta de retroalimentación específica del modelo de alto nivel en el marco en línea mediante el uso de PCA junto con las estadísticas residuales T2 y Q de Hotelling. PCA reduce la dimensión de los espectros Raman al descomponerlos en combinaciones lineales de componentes ortogonales (componentes principales (PC)), de modo que se maximizan las variaciones espectrales en el conjunto de datos. El modelo PCA de la matriz de datos X está definido por:

donde T y P representan puntajes y cargas, y E contiene los residuos. Las cargas corresponden al nuevo eje rotado, mientras que las puntuaciones representan los valores de proyección de datos. En consecuencia, el estadístico T2 de Hotelling es una medida de varianza capturada por el modelo PCA (distancia de muestra a modelo) y se define por:

A - ' X - 1 donde t¡k es la puntuación de PC para el espectro de muestra primero, usando el componente k, y ' ‘' e s la matriz diagonal de valores propios normalizados de la matriz de covarianza para el componente k. Por lo tanto, el T2 de Hotelling da una indicación de los valores extremos dentro del modelo PCA. Por otro lado, Q-residual es una medida de varianza que no es capturada por el modelo PCA (falta de estadísticas de ajuste del modelo) y está definida por

donde x¡ es el espectro de la muestra, Q¡k es la suma del error de reconstrucción al cuadrado para el espectro de la primera muestra usando el componente k y Pk son las cargas de PC. Para los residuos T2 y Q de Hotelling, se utilizó el CI del 99 % normalizado como umbrales superiores para interceptar espectros Raman anómalos. En consecuencia, los residuos T2 y Q de Hotelling son dos parámetros independientes que brindan información cuantitativa sobre el ajuste del modelo. Al usar estos parámetros como indicadores de la calidad del espectro (es decir, el modo de contacto de la sonda, los factores de confusión, la interferencia de la luz blanca, etc.), la retroalimentación auditiva se integró en el sistema de diagnóstico Raman en línea, lo que facilita el asesoramiento en el manejo de la sonda en tiempo real y la detección espectroscópica para los médicos durante procedimientos endoscópicos clínicos.

Después de la verificación de la calidad de los espectros Raman tisulares, esos espectros Raman calificados se alimentaron inmediatamente a modelos probabilísticos para el diagnóstico in vivo en línea y la predicción de patologías. La GUI puede cambiar instantáneamente entre diferentes modelos, incluido el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), análisis discriminante lineal PCA (LDA), optimización de colonias de hormigas (ACO)-LDA, árboles de clasificación y regresión (CART), máquina de vectores de soporte (SVM), refuerzo adaptativo (AdaBoost), etc., para clasificación prospectiva en procedimientos endoscópicos clínicos. Como ejemplo, se empleó PLS-DA probabilístico para el diagnóstico de cáncer gástrico. El PLS-DA emplea el principio fundamental de PCA pero rota aún más los componentes maximizando la covarianza entre la variación espectral y la afinidad de grupo para obtener las variaciones relevantes para el diagnóstico en lugar de las variaciones más destacadas en el conjunto de datos espectrales. El sistema admite la clasificación binaria, el análisis discriminatorio probabilístico PLS-DA uno contra todos y uno contra uno multiclase (es decir, benigno, displasia y cáncer) para predecir las patologías específicas de los tejidos.

Ejemplo 1

Se adquirieron un total de 2748 espectros de tejido gástrico in vivo (2465 normales y 283 con cáncer) de los 305 pacientes reclutados para construir la base de datos espectral para desarrollar algoritmos de diagnóstico para el diagnóstico de cáncer gástrico. La histopatología de tejidos sirve como estándar de oro para la evaluación del rendimiento de la técnica Raman para el diagnóstico y la caracterización de tejidos in vivo.

El estómago representa uno de los órganos más desafiantes que presenta muchos factores de confusión (es decir, jugo gástrico, restos de alimentos, sangrado, exudados, etc.) para el diagnóstico espectroscópico. Los espectros Raman medios in vivo adquiridos de 305 pacientes gástricos (normales (n = 2465) y con cáncer (n = 283)) para el desarrollo de algoritmos se muestran en la figura 23. Los espectros Raman del tejido gástrico muestran los picos Raman prominentes a 875 cm-1 (u(C-C) de hidroxiprolina), 936 cm-1 (u(C-C) de proteínas), 1004 cm-1 (Us(C-C) anillo de respiración de fenilalanina), 1078 cm-1 (u(C-C) de lípidos), 1265 cm-1 (amida III u(C-N) y 8(N-H) de proteínas), 1302 y 1335 cm-1 (8(CH2) deformación de proteínas y lípidos), 1445 cm-1 (8(CH2) de proteínas y lípidos), 1618 cm-1 (u(C=C) de porfirinas), 1652 cirr1 (amida I u(C=O) de proteínas) y 1745 cirr1 (u(C=O) de lípidos). Los espectros Raman del tejido gástrico contienen una gran contribución de triglicéridos (es decir, picos principales a 1078, 1302, 1445, 1652 y 1745 cirr1) que probablemente refleja el interrogatorio de la grasa subcutánea en la pared gástrica. Los espectros Raman del cáncer gástrico revelan cambios notables en las propiedades espectrales Raman antes mencionadas (por ejemplo, intensidad, forma espectral, ancho de banda y posición máxima), reconfirmando nuestros estudios Raman in vivo anteriores.

La detección automática de valores atípicos se realizó para el análisis predictivo en línea utilizando PCA con estadísticas T2 y Q-residuals de Hotelling (CI del 99 %). Para que el diagnóstico en línea fuera eficiente, se procesó un modelo PCA de dos componentes que incluía las variaciones espectrales de tejido más grandes. Estas PC significativas seleccionadas (p<0,0001) representaron una variación máxima del 38,71 % (PC1: 30,33 %, PC2: 8,38 %) de la variabilidad total en el conjunto de datos (n = 2748 espectros Raman), y las cargas de PC correspondientes se muestran en figura 24.

La figura 25 muestra los diagramas de dispersión de puntuaciones (es decir, PC1 frente a PC2) para los espectros de tejido normal (n=2465) y canceroso (n=283) que ejemplifican la capacidad de las puntuaciones de PC para separar los espectros de cáncer de los normales. El CI del 99 % de los residuos T2 y Q de Hotelling se calculó en consecuencia a partir del conjunto de datos de entrenamiento y se fijó como un umbral para la validación espectral en línea prospectiva. Luego se presentaron modelos probabilísticos de PLS-DA para la predicción del cáncer gástrico. La base de datos de entrenamiento se volvió a muestrear aleatoriamente varias veces (n = 10) en conjuntos de aprendizaje (80 %) y de prueba (20 %). Los modelos PLS-DA generados proporcionaron una precisión predictiva del 85,6 % (95 % CI: 82,9 % - 88,2 %) (sensibilidad del 80,5 % (95 % CI: 71,4 % - 89,6 %) y especificidad del 86,2 % (95 % CI: 83,6% - 88,7%)) para el diagnóstico de cáncer gástrico, retrospectivamente. Luego se probó más la detección de valores atípicos, así como el PLS-DA probabilístico en 10 pacientes gástricos prospectivos. En la figura 25 también se muestran gráficos de dispersión de puntuación de PC (es decir, PC1 frente a PC2) para los espectros de tejido prospectivo normal (n=45) y canceroso (n=30).

La figura 26 muestra el diagrama de dispersión prospectivo de T2 de Hotelling (38,71 %) y Q-residuales (61,29 %) con los límites de CI del 99 % para 105 espectros (45 normales, 30 con cáncer, 30 atípicos) adquiridos de 10 muestras gástricas prospectivas. La línea punteada representa el intervalo de confianza (CI) del 99 % que verifica si los espectros Raman prospectivos se encuentran dentro de las variaciones tisulares comunes del modelo de análisis de componentes principales (PCA). Se observa que una gran cantidad de espectros sin contacto se encuentran fuera del CI del 99% y, por lo tanto, se descartan en tiempo real sin pasar por el diagnóstico del tejido. Los espectros Raman de tejido verificados caen en gran medida dentro del CI del 99% de T2 y residuos Q, lo que demuestra que este análisis de datos en línea proporciona un medio rápido y altamente eficiente de validación en tiempo real de espectros de tejidos biomédicos.

Los espectros adquiridos prospectivamente verificados por el análisis de valores atípicos en línea se alimentan además al PLS-D^aprobabilístico para la predicción instantánea de enfermedades, logrando una precisión diagnóstica del 80,0 % (60/75) para la detección de cáncer gástrico (figura 27), según lo confirmado por análisis histopatológico. La línea punteada separada da una sensibilidad diagnóstica del 90,0 % (27/30) y una especificidad del 73,3 % (33/45) para separar el cáncer del tejido gástrico normal in vivo.

Las curvas de características operativas del receptor (ROC del inglés "receiver operating characteristic") se generaron adicionalmente para evaluar las separaciones de grupos. La figura 28 muestra la media de las curvas ROC calculadas a partir de cada división aleatoria de la base de datos espectral para la predicción retrospectiva, así como la ROC calculada para la predicción prospectiva del conjunto de datos. Las áreas de integración bajo las curvas ROC generadas para los conjuntos de datos retrospectivos y prospectivos son 0,90 y 0,92, respectivamente, lo que ilustra la solidez del algoritmo PLS-DA para el diagnóstico de cáncer gástrico in vivo.

El tiempo total de procesamiento para toda la adquisición de datos en línea antes mencionada para la predicción patológica del tejido fue de 0,13 s. El tiempo de procesamiento para cada paso del diagrama de flujo en la figura 21 se presentan en la tabla 1. Se puede lograr un diagnóstico óptico de funcionamiento libre y un tiempo de procesamiento de < 0,5 segundos lo cual es fundamental para realizar diagnósticos de tejidos in vivo en tiempo real en la endoscopia.

Tabla 1

Tiempo promedio de procesamiento para el marco espectroscópico Raman biomédico en línea en una ordenador personal 35 con una memoria de 4 GB de 17 núcleos cuádruples de 64 bits.

al (milisegundos)

130

Ejemplo 2

El sistema de espectroscopia Raman consta de un láser de diodo de espectro estabilizado de 785 nm (salida máxima: 300 mW, B&W TEK Inc., Newark, Delaware), un espectrógrafo de imágenes transmisivas (Holospec f/1.8, Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor, Michigan) equipado con una cámara CCD de empobrecimiento profundo, retroiluminada y enfriada con nitrógeno líquido (1340 * 400 píxeles a 20 * 20 pm por píxel; Spec-10: 400BR/LN, de Princeton Instruments, Trenton, Nueva Jersey). El sistema también consta de una sonda endoscópica Raman de fibra óptica de sílice fundida especialmente diseñada (1,8 mm de diámetro exterior y 1,30 metros de longitud) que comprende fibras colectoras de 9 * 200 pm (N.A. = 0,22) que rodean la fibra de entrega de luz central (200 pm de diámetro, N.A. = 0,22). Se acopla una lente esférica de zafiro de 1,0 mm (índice de refracción 1,76) a la punta de fibra de la sonda Raman para mejorar las mediciones Raman del tejido epitelial. El sistema adquiere espectros Raman en el rango de 800-1800 cm-1 con resolución espectral de 9 cm-1. Cada espectro Raman en este estudio se midió con un tiempo de integración de 0,5 s bajo la excitación láser de 785 nm. La técnica de espectroscopia Raman rápida se calibró en longitud de onda utilizando una lámpara espectral de argón/mercurio (AR-1 y HG-1, de Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida). Todos los espectros calibrados por longitud de onda se corrigieron para la respuesta de intensidad del sistema usando una lámpara de calibración de tungsteno-halógeno (RS-10, de EG&G Gamma Scientific, San Diego, California).

Utilizando el sistema y el método descritos en las figuras 20-22 se utilizó para controlar el sistema de espectroscopia Raman para la adquisición y el análisis de datos en tiempo real. Los espectros Raman sin procesar medidos a partir de tejido in vivo representan una combinación de señal Raman débil, fondo de autofluorescencia intenso y ruido. Los espectros sin procesar son preprocesados por un filtro de suavizado Savitzky - Golay de primer orden (ancho de ventana de 3 píxeles seleccionados para que coincida con la resolución espectral) para reducir el ruido espectral. En la región de la huella dactilar (800-1800 cirr1), se encontró que un polinomio de quinto orden era óptimo para ajustar el fondo de autofluorescencia en el espectro suavizado por ruido, y este polinomio luego se resta del espectro sin procesar para producir solo el espectro Raman de tejido. Todo el preprocesamiento antes mencionado se completa en 100 ms y los resultados procesados se pueden mostrar en la pantalla del ordenador en tiempo real.

La regresión PLS se empleó como método multivariable para extraer señales de fondo de referencia internas características de la sonda Raman de fibra óptica. Brevemente, PLS utiliza el principio fundamental de PCA pero rota aún más los componentes LV maximizando la covarianza entre la variación espectral y la variable dependiente (por ejemplo, potencia de excitación láser), de modo que las cargas de LV expliquen las variaciones relevantes en lugar de las variaciones más destacadas en el conjunto de datos espectrales. Las señales de referencia espectral importantes relacionadas con la potencia de excitación del láser se mantuvieron en los primeros LV. En este estudio, el centrado en la media se realizó antes del modelado para reducir la complejidad del modelo de regresión PLS. La complejidad óptima del modelo de regresión PLS se determinó a través de la validación cruzada y la exclusión de un sujeto, y el rendimiento del modelo de regresión PLS se examinó calculando el coeficiente de determinación (R2), error cuadrático medio de calibración (RMSEC), error cuadrático medio de validación cruzada (RMSECV) y error cuadrático medio de predicción (RMSEP). Téngase en cuenta que un modelo PLS óptimo tiene un alto R2 pero con un RMSEC, RMSECV y RMSEP bajos. El modelo de regresión PLS desarrollado para resolver las señales de referencia en este estudio también se implemento como un predictor de potencia de excitación láser en línea en nuestro software Raman clínico en tiempo real y se probó prospectivamente de manera imparcial. El análisis estadístico multivariante se realizó en el entorno de programación Matlab (de Mathworks Inc., Natick, Massachusetts).

Se reclutó un total de 30 sujetos sanos normales (16 mujeres y 14 hombres) para las mediciones Raman de tejido in vivo en la cavidad bucal. Antes de las mediciones de espectroscopia Raman tisular in vivo, todos los sujetos se sometieron a un enjuague bucal extenso para reducir los factores de confusión (por ejemplo, restos de alimentos, recubrimientos microbianos, etc.). Se recogieron espectros Raman de tejido in vivo (n = 783) del labio interior de 25 sujetos. Para los 25 sujetos, se adquirieron espectros Raman de tejido oral in vivo (n=~5) a seis niveles de potencia en el rango de 5-65 mW (intervalos de -10 mW). Antes de cada medición Raman de tejido, se midió el nivel de potencia de excitación del láser en la punta distal de la sonda de fibra óptica utilizando un medidor de potencia con una linealidad de ±0,5 % y una precisión de ±3 % (rango de 0,1 a 100 mW). Otros factores de confusión (por ejemplo., la presión de la sonda en la superficie del tejido, el fotoblanqueo, las propiedades ópticas del tejido y la flexión de la sonda de fibra óptica) no se controlaron a propósito, sino que se incorporaron al modelo PLS para la extracción robusta de señales de referencia in situ. Después de la implementación del modelo PLS desarrollado en el marco de adquisición Raman en línea, se realizó la validación prospectiva e independiente de la señal de referencia interna para el monitoreo de la potencia de excitación del láser en los 5 nuevos sujetos (n = 166 espectros) en tiempo real.

Para validar aún más el valor cuantitativo del método de referencia interno desarrollado en este trabajo, también se realizó un experimento en fantomas de tejido. Se prepararon fantomas de tejido de varias concentraciones de gelatina a partir de piel bovina, gelatina tipo B (G9391, de Sigma, EE. UU.). La gelatina se disolvió en concentraciones predefinidas (20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 % en peso) en H2O destilada. La gelatina disuelta se calentó a 50°C durante 1 hora en un baño de agua con agitación continua. Posteriormente, la gelatina fundida se vertió en un molde previamente enfriado (4 °C) y se almacenó durante 2 a 3 horas para producir fantomas de gelatina sólida. Luego se realizó un análisis espectroscópico Raman de fibra óptica cuantitativo de los fantomas de tejido. Se midió un total de n = 133 espectros Raman de los diversos fantomas de tejido utilizando la sonda Raman de fibra óptica con diferentes potencias de láser. Las potencias de excitación del láser se cambiaron en el rango de 10 a 60 mW y los espectros medidos se normalizaron a las potencias de excitación del láser según lo predicho por el método de referencia interno.

La figura 11 muestra el espectro de fondo de una sonda Raman de fibra óptica con lente de bola utilizada cuando se excita con un láser de diodo de 785 nm. Los distintos picos Raman de zafiro (AhOs) que se originan en la lente esférica distal se pueden encontrar en 417 y 646 cirr1 (modo fonónico con simetría A-ig) y 380 y 751 cirr1 (modo fonónico Eg). Hay dos componentes Raman dominantes de la fibra de sílice fundida, así como un fondo de fluorescencia de fibra relativamente débil. Los marcados "picos defectuosos" de la sílice fundida, denominados D1 y D2 a 490 y 606 cirr1, se han asignado a vibraciones de respiración de átomos de oxígeno en anillos de cuatro y tres miembros, respectivamente. El hombro (~130 cirr1) de una banda Raman de bosón intensa relacionada con la característica general de las sustancias de sílice amorfa también se observa en el espectro de fondo de la sonda Raman de fibra óptica. La banda del bosón de sílice está alcanzando su punto máximo cerca de ~ 60 cirr1, pero solo el hombro era evidente debido a los filtros ópticos de nuestro diseño de sonda Raman. Estos picos Raman de fondo característicos (más cortos que la región de la huella dactilar (800-1800 cirr1)) de la propia sonda Raman de fibra óptica podrían servir como señales de referencia internas para mediciones Raman de tejidos in vivo.

Para desarrollar el modelo de regresión PLS y resolver las señales de referencia internas, medimos los espectros Raman in vivo de 25 sujetos en la cavidad bucal con la potencia de excitación del láser como parámetro independiente. Para cada sujeto, se adquirieron espectros Raman tisulares in vivo (n= -5) con diferentes niveles de potencia en el rango de 5-65 mW (intervalos de -10 mW). La figura 12 muestra un ejemplo del espectro Raman crudo medio in vivo ± 1 desviación estándar (SD) medido desde el labio interno usando diferentes potencias de excitación láser (por ejemplo, 10, 30 y 60 mW). Se pueden observar las señales débiles Raman del tejido superpuestas al amplio fondo variable de autofluorescencia. La figura 29 muestra los espectros Raman medios libres de fondo calibrados ± 1 DE. El espectro Raman in vivo del labio interior muestra picos Raman alrededor de 853 cirr1 (v(C-C)), 1004 cm-1 (vs(C-C)), 1245 cm-1 (amida III v(C-N) y 5(N-H) de proteínas), 1302 cm-1 (CH3CH2 torsión y movimiento), 1443 cm’1 (deformación 5(^cH2)), 1655 cm’1 (amida I v(C=o) de proteínas) y 1745 cm’1 v(C=O)). Por otro lado, los espectros Raman de tejido in vivo sin procesar (figura 12) también contenían los picos Raman prominentes de sílice fusionada y zafiro de la sonda Raman de fibra óptica, es decir: 380, 417, 490, 606, 646 y 751 cm -1.

Un modelo de regresión PLS para extraer una amplia gama de picos de referencia internos característicos de los espectros Raman del tejido bucal. La luz dispersa de Rayleigh se excluyó del análisis PLS. Los espectros Raman de tejido crudo medidos in vivo se organizaron en una matriz con espectros por filas y números de onda por columnas. Los niveles de potencia del láser de referencia se organizaron en un vector de columna que representaba las variables dependientes. Después de centrar la media, se desarrolló un modelo de regresión PLS utilizando la validación cruzada de exclusión de un sujeto para establecer el algoritmo óptimo para generar señales de referencia robustas para la predicción de potencia de excitación láser. La figura 14a muestra el RMSEC y el RMSECV de la predicción de potencia láser en función de los LV retenidos. El análisis de regresión PLS mostró que se podía obtener un modelo óptimo (RMSECV = 2,5 mW) utilizando 4 LV. La figura 14b muestra las primeras cuatro cargas de LV que representan la variación espectral Raman más grande (es decir, LV1: 94,8 %, LV2: 3,0 %, LV3: 0,9 % y LV4: 0,2 %) y la variación de la potencia de excitación del láser (LV1: 80,1 %, LV2: 16,8%, LV3: 0,8% LV4: 0,7%). También se muestra el vector de regresión PLS calculado. La figura 30a muestra los resultados del control de la potencia del láser in vivo (es decir, la potencia del láser medida frente a la potencia del láser predicha) usando una validación cruzada de exclusión de un sujeto. Los datos pueden ajustarse mediante la ecuación (y = 0,551 0,984x) que indica una relación lineal sustancial (R=0,98). La complejidad del modelo PLS de 4 LV ofreció una referencia interna precisa para el monitoreo de potencia de excitación láser con un RMSECV de 2,5 mW y R2 de 0,981. El mismo modelo de regresión PLS se implementó posteriormente en línea en el software Raman para la validación independiente de los 5 nuevos sujetos (n=166 espectros) en tiempo real. La figura 30b muestra la relación entre la potencia de excitación láser real medida y la potencia de excitación láser predicha utilizando el modelo de regresión PLS desarrollado. Se puede obtener el Rm SEP de 2,4 mW y una relación lineal (y = 0,342 1,011x; R2 = 0,985), reconfirmando la aplicación de la regresión PLS como método de referencia interna durante las mediciones Raman de tejidos in vivo.

El valor cuantitativo del método de referencia interna desarrollado para el análisis espectral cuantitativo de fantomas de tejido. Se construyeron y probaron siete fantomas de tejido compuestos de gelatina con diferentes concentraciones (es decir, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50% en peso). Los espectros Raman (n = 133 espectros) de los fantomas de gelatina se midieron y normalizaron a las potencias del láser predichas en tiempo real. La figura 31 muestra los espectros Raman medidos a partir de fantomas de tejido de gelatina con diferentes concentraciones a una potencia de láser de excitación de 60 mW. Como era de esperar, estos espectros Raman muestran una relación lineal (R=0,992) entre las intensidades de los picos Raman y las concentraciones de gelatina. La figura 32 muestra la correlación entre las concentraciones reales de gelatina y las concentraciones predichas con potencias de láser de excitación variables (que varían de 10 a 60 mW). Es evidente que al corregir la variación de la potencia del láser a través del monitoreo de la potencia de excitación del láser en tiempo real in situ, se puede realizar un análisis cuantitativo preciso de los fantomas de tejido de gelatina (RMSEP = 1.9% y R2 = 0,985). Los resultados anteriores indican que el método desarrollado de monitoreo de energía en tiempo real basado en señales de referencia internas multivariadas puede lograr un análisis de composición cuantitativo sólido en espectroscopia Raman de tejido de fibra óptica.

Ejemplo 3

Endoscopia Raman transnasal guiada por imágenes en tiempo real in vivo: definición de las propiedades espectrales en la nasofaringe y la laringe

Este estudio demuestra la viabilidad de la espectroscopia Raman en aplicaciones endoscópicas transnasales, proporcionando la base para estudios clínicos a gran escala en la cabeza y el cuello. La plataforma de endoscopia Raman guiada por imágenes integrada con una sonda Raman de fibra miniaturizada desarrollada proporciona una evaluación rápida y mínimamente invasiva de los constituyentes del tejido endógeno de la cabeza y el cuello a nivel molecular durante el examen endoscópico clínico. Esto facilita enormemente a los médicos la obtención de huellas dactilares biomoleculares detalladas del tejido de la cabeza y el cuello, reflejando las firmas morfológicas y de composición genuinas sin introducir los artefactos causados por la punción vascular o la deshidratación del tejido, los efectos morfológicos y anatómicos, etc.

El sistema de espectroscopia Raman consta de un láser de diodo de 785 nm de espectro estabilizado (salida máxima: 300 mW, de B&W TEK Inc., Newark, Delaware), un espectrógrafo de imágenes transmisivo (Holospec f/1.8, Kaiser Optical Systems) equipado con un criogénico refrigerado ( -120 °C), cámara con dispositivo acoplado por carga (CCD) de agotamiento profundo, retroiluminada y optimizada para NIR (1340 * 400 píxeles a 20 * 20 pm por píxel; Spec-10: 400BR/LN, de Princeton Instruments). El novedoso acoplamiento de entrada de fibra del espectrómetro consta de una matriz alineada parabólica de 58 fibras (100 pm) para corregir la aberración de la imagen del espectrómetro y mejorar tanto la resolución espectral como la relación señal/ruido de las señales Raman. Se utilizó una sonda Raman de fibra óptica de 1,8 mm para aplicaciones endoscópicas transnasales que maximiza tanto la excitación del tejido como las colecciones Raman de tejido in vivo. La sonda de fibra Raman encaja en el canal del instrumento de los endoscopios transnasales flexibles y se puede dirigir de manera segura a diferentes ubicaciones en la nasofaringe y la laringe bajo la guía de imágenes de campo amplio (es decir, reflectancia de luz blanca (WLR) e imágenes de banda estrecha (NBI)). La plataforma de endoscopia clínica Raman se ha integrado con nuestro software de procesamiento de datos en línea desarrollado recientemente para facilitar el manejo de la sonda, el asesoramiento y la retroalimentación sólida a los médicos en tiempo real (tiempo de procesamiento < 0,1 s). Brevemente, el marco de endoscopia Raman en línea sincroniza la adquisición espectral (es decir, la exposición al láser, el tiempo de integración, el obturador CCD y la lectura, etc.) y extrae automáticamente las señales Raman de los espectros de tejido sin procesar (que comprenden un fondo de autofluorescencia fuerte y señales Raman débiles) utilizando los métodos de preprocesamiento establecidos, incluidos el suavizado, la sustracción de la línea de base polinomial de quinto orden, etc. Los espectros Raman in vivo y el resultado de los algoritmos multivariados (por ejemplo, el análisis de componentes principales) se pueden mostrar en tiempo real en una interfaz gráfica de usuario (GUI) comprensible durante la endoscopia Raman transnasal clínica.

Un total de 23 sujetos masculinos sanos normales de diferentes razas (veintidós asiáticos y uno caucásico) fueron reclutados para mediciones Raman de tejido in vivo en endoscopia transnasal. En estos sujetos reclutados, no se identificaron lesiones sospechosas bajo el examen de imágenes WLR y NB. Se predefinieron un total de tres sitios de medición primarios de tejidos supuestamente normales (o benignos) para adquisiciones Raman in vivo, incluidas las cuerdas vocales laríngeas verdaderas (LVC), la nasofaringe posterior (PN) y también el receso faríngeo (es decir, fosa de Rosenmüller (FOR)) donde normalmente se inicia NPC. La sonda Raman de fibra óptica se puede colocar en contacto suave con tejidos internos interrogando con las composiciones biomoleculares endógenas de tejido en tiempo real. Los endoscopistas a cargo verificaron el posicionamiento preciso contra los sitios de tejido de la biopsia en el monitor WLR/NBI. La sonda permitió recolectar espectros Raman de un área (200 pm de diámetro) con un volumen de sondeo de aproximadamente 1 mm3 y profundidad de penetración de -800 pm. Cada espectro se adquirió en 0,5 s utilizando la luz láser de 785 nm con una potencia de -50 mW en la superficie del tejido.

Los espectros Raman se mostraron en línea y se almacenaron para la inspección posterior al procedimiento. Esta tecnología endoscópica Raman rápida no es destructiva y ahora se puede usar de forma rutinaria en exámenes transnasales endoscópicos para evaluación clínica. Para evaluar la variación del sitio dentro del tejido, también se adquirieron varios espectros Raman (-18) de cada sitio del tejido. Como resultado, se midió un total de 874 espectros Raman in vivo de 47 sitios en la endoscopia transnasal y se usaron para el análisis espectral [PN (n=521), fOr (n=157) y LVC (n=196)] de los 23 asignaturas.

Antes del análisis de datos, los espectros Raman sin procesar se suavizaron en primer lugar con un filtro Savitzky Golay lineal y, a continuación, se sustrajo el fondo de autofluorescencia tisular de los espectros suavizados con un filtro de quinto orden de ajuste polinomial. Los espectros Raman sustraídos de fondo se normalizaron a las áreas integradas bajo las curvas para minimizar el efecto de las variaciones de manejo de la sonda Raman en las mediciones clínicas Raman con respecto a diferentes sujetos y sitios de tejido. Todos los espectros Raman procesados se ensamblaron en una matriz y luego se realizó el centrado medio de todo el conjunto de datos Raman. Para reducir la dimensión de los datos espectrales, se empleó el análisis de componentes principales (PCA) para extraer un conjunto de componentes principales ortogonales (PC) que explican la varianza máxima en el conjunto de datos espectrales Raman para la caracterización de tejidos. En consecuencia, las cargas en las PC representan espectros de base ortogonal de la variación espectral más prominente en el conjunto de datos que explica la variación progresivamente decreciente, mientras que las puntuaciones en las PC representan el valor de proyección de los espectros Raman del tejido en la carga correspondiente. Por lo tanto, PCA se puede usar de manera eficiente para resolver variaciones espectrales mientras se reduce al mínimo la dimensión del conjunto de datos. El número de PC retenidas se eligió en función del análisis de varianza (ANOVA) y la prueba t de Student al nivel de 0,05. Empleamos la prueba de diferencias de mínimos cuadrados (LSD) de Fisher post-hoc para evaluar las diferencias en las medias. El análisis estadístico multivariante se realizó utilizando la caja de herramientas PLS (de Figenvector Research, Wenatchee, Washington) en el entorno de programación Matlab (de Mathworks Inc., Natick, Massachusetts).

Los espectros Raman in vivo de alta calidad se pueden adquirir de forma rutinaria en la nasofaringe y la laringe en tiempo real durante las inspecciones endoscópicas transnasales guiadas por imágenes (es decir, WLR y NBI). La figura 1 muestra un ejemplo de espectro Raman sin procesar in vivo (señal Raman débil superpuesta a un fondo de autofluorescencia de tejido grande) adquirido de la nasofaringe posterior con un tiempo de adquisición de 0,1 s en la endoscopia. El espectro Raman de tejido sustraído de fondo con una relación señal-ruido (SNR) de >10 (recuadro de la figura 33) se puede obtener y mostrar en línea durante las mediciones endoscópicas clínicas. La figura 34 muestra los espectros Raman medios in vivo entre sujetos ± 1 desviación estándar (DE) de tejidos nasofaríngeos normales [PN (n=521) y FOR (n=157)] y laríngeos [LVC (n=196)] cuando la sonda Raman se pone en contacto suavemente con el tejido bajo la guía de imágenes WLR/NB. Las comparaciones con los espectros Raman de tejido nasofaríngeo y laríngeo adquiridos (figura 34), demuestran que los bioquímicos en los fluidos corporales no contribuyen significativamente a los espectros Raman de tejido in vivo en la endoscopia transnasal. También se muestran imágenes WLR obtenidas de las ubicaciones anatómicas correspondientes. Las bandas Raman prominentes asociadas con proteínas y lípidos se identifican tal y como se muestran en la tabla 2 con asignaciones biomoleculares tentativas.

Tabla 2

Asignaciones tentativas de vibraciones de moléculas y bioquímicos involucrados en la dispersión Raman del tejido nasofaríngeo y laríngeo (donde v, modo de estiramiento; vs, modo de estiramiento simétrico; 8, modo de flexión).

Repique Raman (cm-1) Vibraciones Bioquimicos

853 v(C-C) proteinas

940

v(C-C)

proteinas

1004 vs(C-C) respiración proteinas

1078 v(C-C) lípidos

1265 Amida III v(C-N) 5(N-H) proteinas

1302 CH2 torsión y movimiento lípidos/proteínas

1450 5(CH2) lípidos/proteínas

1660 Amida I v(C=O) proteinas

La figura 35 muestra los espectros medios intrasujeto ± 1 DE de un sujeto elegido al azar. Se encontró que los espectros Raman de tejido in vivo eran reproducibles con diminutas variaciones entre sujetos e intrasujetos (<10 %) en la nasofaringe y la laringe. Otras pruebas endoscópicas Raman indican que la variabilidad entre diferentes sitios de tejido dentro de la nasofaringe posterior es sutil (< 5 %) (datos no mostrados). También se calculó espectros de diferencia ± 1 SD entre diferentes tipos de tejido (es decir, PN-LVC, LV-FOR y PN-FOR) como se muestra en la figura 36, resolviendo los perfiles morfológicos y de composición distintivos de diferentes sitios anatómicos de tejido a nivel biomolecular. ANOVA reveló doce subregiones espectrales Raman amplias y prominentes que mostraron una variabilidad significativa [p<0.0001] entre los tres sitios de tejido anatómico centrados en: 812, 875, 948, 986, 1026, 1112, 1254, 1340, 1450, 1558, 1655 y 1745 cirr1, reconfirmando la importancia de caracterizar las propiedades espectrales Raman de la nasofaringe y la laringe hacia diagnósticos precisos de tejidos in vivo.

Los espectros Raman in vitro de sangre, saliva y mucosidad nasal obtenidos de voluntarios sanos se midieron como se muestra en la figura 37. Las bandas Raman más prominentes en la saliva y la mucosidad nasal están a 1638 cirr1 (v2 modo de flexión del agua), mientras que la sangre exhibe bandas Raman de porfirina cerca de 1560 y 1620 cirr1 31. Para evaluar más a fondo las diferencias espectrales entre diferentes tejidos en la cabeza y el cuello, un modelo PCA de cinco componentes basado en ANOVa y la prueba t de Student (p<0,05) representa el 57,41 % de la varianza total (PC1: 22,86 %; PC2: 16,16 %; PC3: 8,13 %; PC46,22 % PC5: 4,05 %) fue desarrollado para resolver las variaciones máximas significativas de diferentes ubicaciones anatómicas. La figura 38 muestra las cargas de PC que revelan las bandas Raman de resolución asociadas con proteínas (es decir, 853, 940, 1004, 1265, 1450 y 1660 cm-1) y lípidos (es decir, 1078, 1302 1440, 1655 y 1745 cirr1). La figura 39 (A a E) muestra gráficos de cuadros de puntuaciones de PCA para los diferentes tipos de tejido (es decir, PN, FOR y LVC). La línea dentro de cada cuadro de muesca [posición] representa la mediana, y los límites inferior y superior del cuadro indican el primer (percentil 25,0%) y el tercer cuartil (percentil 75,0%), respectivamente. Las barras de error (triquitos o grafico de trazos) representan el rango intercuartílico de 1,5 veces. Los valores de p también se representan entre diferentes tipos de tejido. Los algoritmos PCA dicotómicos integrados con análisis discriminante lineal (LDA) proporcionaron sensibilidades del 77,0 % (401/521), 67,3 % (132/192) y especificidades del 89,2 % (140/157) y 76,0 % (396/521) para la diferenciación entre PN vs. FOR, y LVC vs PN, respectivamente usando validación cruzada de dejar un sujeto fuera. En general, estos resultados demuestran que los espectros Raman de la nasofaringe y la laringe en la cabeza y el cuello se pueden medir in vivo en la endoscopia transnasal, y el desarrollo de algoritmos de diagnóstico debe ser específico del sitio del tejido para garantizar una complejidad mínima del algoritmo.

Ejemplo 4

Espectroscopia Raman confocal de fibra óptica para el diagnóstico in vivo en tiempo real de la displasia en el esófago de Barrett

El diagnóstico Raman confocal de fibra óptica se puede lograr en tiempo real (<0,5 segundos) y descubre los cambios biomoleculares y funcionales progresivos de las células epiteliales y los tejidos en la carcinogénesis de Barrett in situ. La histopatología caracterizó 152 de los sitios de tejido medidos prospectivamente como epitelio columnar revestido (n=597 espectros), 48 como metaplasia intestinal (n=123 espectros), 9 displasia de alto grado (n=77 espectros). Usando el análisis de las características operativas del receptor (ROC), la identificación de la displasia de alto grado podría lograrse con éxito con una sensibilidad del 87,0 % y una especificidad del 84,7 % sobre la base del espectro. Se encontró que el área bajo la curva ROC era 0,90. Esta nueva modalidad endoscópica biomolecular específica con capacidad en tiempo real ofrece al gastroenterólogo una herramienta confiable para enfocarse objetivamente en áreas de tejido de alto riesgo en los pacientes de Barrett durante una endoscopia en curso.

El sistema espectroscópico Raman confocal se compone de un láser de diodo infrarrojo cercano (NIR) (Aex = 785 nm), un espectrógrafo de imágenes transmisivas de alto rendimiento equipado con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) optimizada para NIR, enfriada con nitrógeno líquido, y una sonda Raman confocal de fibra óptica de 1,8 mm especialmente diseñada. El sistema adquiere espectros Raman en el rango 800-1800 cirr1 con una resolución espectral de ~9 cirr1. La sonda endoscópica Raman confocal de fibra óptica desarrollada se utiliza tanto para el suministro de luz láser como para in vivo colección de señales Raman tisulares.

La sonda endoscópica Raman confocal de 1,8 mm (de diámetro exterior) consta de 9 fibras colectoras recubiertas de filtro de 200 |jm (NA = 0,22) que rodean la fibra de suministro de luz central (200 |jm de diámetro, NA = 0,22). Se acopla una lente esférica de zafiro en miniatura de 1,0 mm (NA = 1,78) a la punta de fibra de la sonda confocal para enfocar firmemente la luz de excitación en el tejido, lo que permite la recopilación eficaz del espectro Raman del revestimiento epitelial (< 200 jim). La sonda Raman confocal de fibra óptica puede insertarse en el canal del instrumento de los endoscopios convencionales y colocarse en contacto suave con el epitelio para la caracterización y el diagnóstico de tejidos in vivo. La selectividad de profundidad de esta sonda Raman confocal ofrece ventajas experimentales convincentes, que incluyen:

(i) la espectroscopia Raman confocal de fibra óptica se enfoca selectivamente en el revestimiento epitelial asociado con el inicio temprano de la carcinogénesis de Barrett, que es superior a las sondas Raman de fibra óptica de volumen convencional que interrogan un volumen de tejido más grande;

(ii) la capacidad de interrogación de tejido más superficial de la técnica Raman confocal proporciona una relación de fondo Raman de tejido a autofluorescencia más alta debido a una contribución de autofluorescencia tisular mucho menor de las capas de tejido más profundas (por ejemplo, estroma), y

(iii la combinación de esta nueva plataforma de espectroscopia Raman confocal de fibra óptica con un análisis multivariante bien documentado permite extraer y analizar información molecular epitelial en tiempo real in vivo.

Todo el sistema endoscópico Raman confocal se controla en un marco de software intuitivo que permite una inspección rápida en entornos de detección endoscópica con retroalimentación probabilística auditiva para el endoscopista, empujando la frontera de la espectroscopia Raman hacia el diagnóstico clínico de rutina.

Se inscribió a un total de 450 pacientes en los exámenes endoscópicos Raman para la vigilancia o detección de diversas indicaciones, incluida la dispepsia y la neoplasia GI superior. Durante un examen típico de lesiones sospechosas, cada medición Raman de tejido se puede adquirir en 0,5 segundos, lo que permite un examen rápido de grandes áreas de tejido. Los datos espectrales Raman in vivo adquiridos de 373 pacientes con diferentes subtipos histológicos en el GI superior se han utilizado para construir una biblioteca Raman completa (>12 000 espectros Raman). Para los pacientes reclutados para la detección y vigilancia de EB, los espectros Raman se clasifican en las siguientes tres clases de riesgo histopatológico: (i) "Normal": epitelio revestido de columna (CLE), (ii) EB de "bajo riesgo": definido como la presencia de células caliciformes, (iii) "Alto riesgo": displasia de bajo grado (LGD) y displasia de alto grado (HGD). Por ejemplo, la figura 40A muestra el espectro Raman confocal medio in vivo medido de pacientes en nuestra base de datos que presentan diferentes tipos de tejido (es decir, epitelio revestido escamoso (n=165), CLE (n=907), metaplasia intestinal (IM) (n =318) y DAG (n=77)) como lo confirma la caracterización histopatológica. Cada espectro Raman se adquirió en 0,5 segundos. Los espectros se han normalizado al pico Raman a 1445 cm-1 con fines de comparación. Los picos Raman de tejido prominente se pueden observar alrededor de: 936 cm-1 (v(C-C) proteínas), 1004 cm-1 (vs(C-C) anillo de respiración de fenilalanina), 1078 cm-1 (v(C-C) de lípidos), 1265 cm-1 (amida III v(C-N) y 5(N-H) de proteínas), 1302 cm-1 (CH2 torsión y movimiento de proteínas), 1445 cm'1 (8(CH2) deformación de proteínas y lípidos), 1618 cm'1 (v(C=C) de porfirinas), 1655 cm'1 (amida I v(C=O) de proteínas) y 1745 cm-1 (v(C=O) de lípidos). Se pueden distinguir notables diferencias espectrales Raman (por ejemplo, intensidad máxima, desplazamiento y ensanchamiento de banda) entre diferentes tipos de tejido. Estas ricas firmas espectrales representan los cambios biomoleculares y funcionales que ocurren en el epitelio que acompañan a la carcinogénesis de Barrett. Mientras que la histología identifica la presencia de células caliciformes y atipia arquitectónica y citológica progresiva (figura 40(B, C, D, E), la espectroscopia Raman confocal de fibra óptica revela que el epitelio sufre importantes cambios funcionales y biomoleculares a lo largo de la secuencia de carcinogénesis de Barrett. Es intrigante que la firma biomolecular Raman de BE se parezca en gran medida a la de la displasia, lo que confirma que la transformación al fenotipo metaplásico intestinal es un evento clave en la carcinogénesis de Barrett. Estas firmas moleculares epiteliales altamente específicas posiblemente reflejen una multitud de biomarcadores ópticos endógenos (es decir, oncoproteínas, ADN, expresión de mucina, mitosis, etc.).8 Por lo tanto, la correlación de las firmas espectrales Raman epiteliales con la histopatología o la histoquímica puede profundizar la comprensión del inicio y la progresión de Barrett in situ a nivel biomolecular. Actualmente, ninguna otra técnica espectroscópica óptica de la competencia (por ejemplo, fluorescencia, espectroscopia de dispersión elástica) puede proporcionar una caracterización molecular tan exhaustiva in vivo en la endoscopia.

La histopatología caracterizó 152 de los sitios de tejido medidos prospectivamente (es decir, de forma independiente) como CLE (n = 597 espectros), 48 como IM (n = 123 espectros) y 9 como HGD (n = 77 espectros). La figura 41A muestra un gráfico de dispersión ternario bidimensional de las puntuaciones de riesgo medidas prospectivas en 77 pacientes pertenecientes a espectros Raman confocales de lesiones normales, de bajo riesgo y de alto riesgo. Las correspondientes curvas características operativas del receptor (ROC) dicotómicas (figura 41B) también se generan a partir de la figura 3A con el área bajo la curva (AUC) que es 0,88, 0,84 y 0,90, respectivamente, para discriminaciones entre lesiones normales, de bajo riesgo y de alto riesgo. La técnica Raman confocal no solo diferenció las lesiones de bajo riesgo con EB (figura 41A), sino que también pudo localizar objetivamente las áreas de tejido específicas que contenían epitelio displásico. El análisis ROC anterior ilustra que la detección dirigida de tejidos de alto riesgo se puede lograr con éxito en tiempo real, lo que produce una sensibilidad diagnóstica del 87,0 % (67/77) y una especificidad del 84,7 % (610/720) sobre la base del espectro.

En la descripción anterior, una realización es un ejemplo o implementación del sistema y métodos divulgados. Las diversas apariencias de "una realización", "una realización" o "algunas realizaciones" no necesariamente se refieren todas a las mismas realizaciones.

Aunque se pueden describir varias características del sistema y los métodos descritos en el contexto de una sola realización, las características también se pueden proporcionar por separado o en cualquier combinación adecuada. Por el contrario, aunque el sistema y los métodos divulgados pueden describirse en el presente documento en el contexto de realizaciones separadas para mayor claridad, el sistema y los métodos divulgados también pueden implementarse en una sola realización.

Además, debe entenderse que el sistema y los métodos descritos pueden llevarse a cabo o practicarse de diversas formas y pueden implementarse en realizaciones distintas de las esbozadas en la descripción anterior.

Los significados de los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento deben entenderse comúnmente como pertenecientes a un experto en la materia, a menos que se defina de otro modo.

Ciertos aspectos de la presente descripción incluyen etapas o pasos de procesos e instrucciones descritas en este documento en forma de método. Cabe señalar que los pasos del proceso y las instrucciones de la presente divulgación podrían incorporarse en software, firmware o hardware, y cuando estén incorporados en el software, podrían descargarse para residir y funcionar desde diferentes plataformas utilizadas por los sistemas operativos de red en tiempo real.

La presente descripción también se refiere a un aparato para realizar las operaciones de este documento. Este aparato puede construirse especialmente para los propósitos requeridos, o puede comprender un ordenador de propósito general activado o reconfigurado selectivamente por un programa de ordenador almacenado en un medio legible por ordenador al que puede acceder el ordenador. Tal programa de ordenador se puede almacenar en un medio de almacenamiento tangible no transitorio legible por ordenador, como, entre otros, cualquier tipo de disco, incluidos disquetes, discos ópticos, CD-ROM, discos magnéticos-ópticos, memorias de solo lectura (ROM del inglés "read-only memories"), memorias de acceso aleatorio (RAM del inglés "random access memories"), EPROM, EEPROM, tarjetas magnéticas u ópticas, circuitos integrados de aplicación específica (ASIC del inglés "application specific integrated circuits"), o cualquier tipo de medio adecuado para almacenar instrucciones electrónicas, y cada uno acoplado a un bus de sistema informático. Además, los odernadores a los que se hace referencia en la especificación pueden incluir un solo procesador o pueden ser arquitecturas que empleen diseños de múltiples procesadores para aumentar la capacidad informática.

Los métodos y operaciones presentados en este documento no están inherentemente relacionados con ninguna ordenador u otro aparato en particular. También se pueden usar varios sistemas de propósito general con programas de acuerdo con las enseñanzas del presente documento, o puede resultar conveniente construir un aparato más especializado para realizar las etapas o pasos del método requeridos. La estructura requerida para una variedad de estos sistemas será evidente para los expertos en la materia, junto con variaciones equivalentes. Además, la presente descripción no se describe con referencia a ningún lenguaje de programación en particular. Se estima que se puede usar una variedad de lenguajes de programación para implementar las enseñanzas de la presente divulgación como se describe en este documento, y se proporcionan referencias a lenguajes específicos para la divulgación de la habilitación y el mejor modo de la presente divulgación.

La presente descripción se adapta bien a una amplia variedad de sistemas de redes informáticas en numerosas topologías. Dentro de este campo, la configuración y gestión de grandes redes comprende dispositivos de almacenamiento y odernadores que se acoplan comunicativamente a diferentes odernadores y dispositivos de almacenamiento a través de una red, como Internet, redes públicas, redes privadas u otras redes que permiten la comunicación entre sistemas informáticos. Finalmente, cabe señalar que el lenguaje utilizado en la memoria descriptiva se seleccionó principalmente con fines instructivos y de legibilidad, y es posible que no se haya seleccionado para delinear o circunscribir el objeto de la invención. En consecuencia, la presente descripción pretende ser ilustrativa, pero no limitativa, y el alcance de la invención reivindicada se establece en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para calibrar un sistema de espectroscopio Raman de fibra óptica que tiene un espectrómetro primario (50) y una pluralidad de espectrómetros secundarios (51a-51n), comprendiendo el espectrómetro primario (50) una fuente láser (21) y una sonda primaria de fibra óptica (52) asociada con el espectrómetro primario (50), cada uno de los espectrómetros secundarios (51a-51n) comprende una fuente láser (21) y una pluralidad de sondas secundarias de fibra óptica (53a-53n) asociadas con los espectrómetros secundarios (51a-51n), las sondas primaria (52) y secundaria (53a-53n) transmiten luz desde las fuentes láser (21) a un objetivo y devuelven la luz dispersada al espectroscopio para generar un espectro Raman capturado, comprendiendo el método:

calibrar cada uno de los espectrómetros secundarios (51a-51n) de acuerdo con el espectrómetro principal (50) utilizando la sonda principal (52);

derivar una función de transferencia asociada a cada uno de los espectrómetros secundarios (51a-51n) mediante la prueba de los espectrómetros secundarios (51a-51n) frente a una fuente estándar fluorescente (54) usando la sonda primaria (52);

registrar y almacenar la función de transferencia asociada a cada espectrómetro secundario (51a-51n); calibrar cada una de las sondas secundarias (53a-53n) contra la sonda primaria (52) para calcular una función de calibración asociada a cada sonda secundaria calibrada (53a-53n);

registrar y almacenar la función de calibración calculada de cada sonda secundaria (53a-53n); y corregir el espectro Raman capturado por una de las sondas secundarias (53a-53n) utilizadas con uno de los espectrómetros secundarios (51) mediante la modificación de la función de transferencia registrada del espectrómetro secundario (51) utilizado en función de la función de calibración de la sonda del espectrómetro secundario (53a-53n) utilizada,

en el que la fuente estándar de fluorescencia (54) tiene un espectro fluorescente conocido tras la excitación por la fuente láser (21); y

en donde derivar la función de transferencia comprende:

registrar un espectro de la fuente estándar de fluorescencia (54) a través de la calibración del espectrómetro secundario (51a-51n) usando una de las sondas secundarias (53a-53n) y la fuente estándar de fluorescencia (54); y

calcular la función de transferencia del espectrómetro secundario (51a-51n) alineando el espectro registrado con el espectro fluorescente conocido.

2. Método según la reivindicación 1, en el que calibrar cada una de las sondas secundarias (53a-53n) para calcular una función de calibración comprende:

calibrar el espectrómetro primario (50) con la sonda primaria (52) frente a la fuente estándar fluorescente (54);

calibrar el espectrómetro primario (50) con cada una de las sondas secundarias (53a-53n) frente a la fuente estándar fluorescente (54) reemplazando la sonda primaria (52); y

calcular una función de calibración de cada sonda secundaria (53a-53n) a partir de la relación de los espectros de la sonda primaria (52) y cada sonda secundaria (53a-53n).