ES2930285T3 - Membrana o matriz de colágeno con propiedades antimicrobianas - Google Patents

Abstract

El objetivo principal de la tecnología es el desarrollo de una matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas que comprende colágeno proveniente de membranas fetales amnióticas y nanopartículas metálicas. Además, se describe su procedimiento de elaboración.

Description

DESCRIPCIÓN

Membrana o matriz de colágeno con propiedades antimicrobianas

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la obtención de una matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas que comprende colágeno proveniente de membranas fetales amnióticas y nanometales también conocidos como nanopartículas metálicas según la reivindicación 1.

La presente invención permite obtener un producto que mantiene las propiedades biomecánicas como la flexibilidad, la capacidad de ser suturable, baja inmunogenicidad, al ser derivado de la placenta humana con el valor agregado de tener propiedades antimicrobianas, lo que amplia aún más su espectro de uso.

Antecedentes de la invención

En las últimas décadas, se ha avanzado mucho en la lucha de enfermedades como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer. A pesar de este avance en estas enfermedades parece no ser el caso de la obesidad y de la diabetes, las cuales parecen estar empeorando en vez de mejorar con el tiempo. En el caso de esta última, este aumento es especialmente preocupante debido a su asociación con otras patologías dentro de las cuales podemos mencionar, neuropatía diabética, úlcera venosa o diabética y pie diabético; todas ellas representan un enorme gasto para la salud pública, más aun teniendo presente que aún no existe cura para las úlceras diabéticas difíciles de curar.

Hoy en día, las úlceras diabéticas son un problema de salud grave. Aunque el tratamiento de las úlceras diabéticas se ha desarrollado mucho en los últimos años, el tratamiento de las úlceras diabéticas crónicas sigue siendo un problema significativo en el que las opciones de tratamiento son muy limitadas. Hay varios tratamientos de heridas que son innovadores, que no siempre proporcionan resultados concluyentes. Esto demuestra que es necesario realizar más investigación para proporcionar evidencia que cambiará los protocolos para la atención de rutina que se utilizan en los hospitales hoy día. Esto es crucial considerando que los pacientes con úlceras diabéticas crónicas tienen que lidiar con dolor, infección, hospitalización y amputaciones. Esto significa, por un lado, una mala calidad de vida para el paciente y otros gastos de salud grandes para la comunidad. Estos gastos podrían reducirse si existiera un tratamiento adecuado para estas úlceras crónicas.

En la búsqueda de soluciones para estas complicaciones, varias estrategias han sido exploradas. Particularmente los preparados biológicos, en especial los productos derivados de tejido placentario han sido foco de interés en los últimos 10 años en diversas publicaciones científicas. Es así como se ha demostrado que el uso de preparados biológicos de origen humano es una poderosa herramienta segura y eficaz para el tratamiento de enfermedades o condiciones asociadas a enfermedades crónicas. Este interés se debe principalmente a que favorecen el proceso de cicatrización y regeneración tisular.

Las heridas se definen como lesiones que producen pérdida de la integridad de los tejidos blandos. La cicatrización de una herida por otra parte, es un proceso biológico y bioquímicamente complejo, que involucra la activación de muchas vías de señalización celular comandadas por los denominados factores de crecimiento cuyo propósito final es la regeneración del tejido. Para ayudar al proceso de cicatrización, nace el concepto de curación. La curación es definida como una técnica que favorece la cicatrización en cualquier herida hasta conseguir su remisión. Pese a la existencia de técnicas de curación, aún persisten heridas para las cuales las técnicas de curación existentes no consiguen el resultado esperado.

Actualmente existen dos grandes formas de realizar una curación de heridas: la tradicional y la avanzada. La primera se caracteriza por que se realiza en ambiente seco, usa apósitos pasivos, usa tópicos como los antisépticos y antimicrobianos y su frecuencia es diaria. Además, es un proceso que no es regenerativo y que no funciona para heridas complejas e infectadas. En este grupo se incluyen los parches multicapa, los sistemas de compresión y la terapia de vacío.

La curación avanzada por su parte se realiza en ambiente húmedo fisiológico, utiliza apósitos activos, en lo posible evita el uso de tópicos y la frecuencia va a depender de las condiciones locales de la herida. Además, en estos procesos se incluyen los diferentes tratamientos innovadores conocidos como el uso de biomateriales, membranas amnióticas (Epifix/Amniograft) y biotejidos como Dermagraph y la matriz de gel con factores de crecimiento como Regranex®.

Diversa evidencia científica ha demostrado que es el ambiente húmedo el más adecuado para el proceso de cicatrización. Entre los muchos efectos que tendría el ambiente húmedo, podemos destacar que previene la desecación celular, favorece la migración celular, promueve la síntesis de colágeno y la angiogénesis. Estos efectos biológicos se traducirían a su vez en efectos clínicos como menor dolor, mayor velocidad y calidad de la cicatrización.

En los últimos años un nuevo concepto en el área de las curaciones ha aparecido, el cual corresponde a los productos regenerativos, incluyendo los biotejidos, desarrollados mediante bioingeniería tisular en la que sobre una capa de gelatina se agregan colágeno I y factores de crecimiento de fibroblastos sobre una placa plástica. Estos productos presentan las desventajas de que se deben usar en el momento y no pueden ser almacenados a largo plazo y no sirven para heridas infectadas (Yildirimer and Seifalian 2014) y las membranas amnióticas (Fijan, Hashemi et al. 2014), todos ellos utilizados en las curaciones avanzadas.

Para los biotejidos a partir de membranas amnióticas, se ha visto que su eficacia radica fundamentalmente en la presencia de células epiteliales y la alta concentración de factores de crecimiento (es decir, EGF, KGF, HGF y FGF), sin embargo, esto supone una desventaja en el momento de escalar el producto, debido a la necesidad de criopreservar el producto para mantener intactos dichos componentes.

El producto REGRANEX® es un cicatrizante cuya presentación es del tipo gel tópico que deriva a partir de plaquetas. Se utiliza para tratar úlceras y heridas del pie, tobillo o pierna en personas con diabetes. Su función es ayudar a curar la úlcera, lo cual se logra porque es un producto natural que reemplaza la piel muerta y otros tejidos, atrayendo células que reparan heridas. Este producto es capaz de estimular la curación de tejidos y modula la inflamación, pero no puede ser usado en heridas infectadas. Su desventaja principal radica en que se ha observado un aumento de la tasa de mortalidad secundaria a malignidad en pacientes tratados con 3 o más tubos de REGRANEX® Gel en un estudio de cohorte retrospectivo postcomercialización. REGRANEX® Gel sólo debe utilizarse cuando se espera que los beneficios superen los riesgos. REGRANEX® Gel debe ser usado con precaución en pacientes con malignidad conocida.

Amniograft/EpiFix® es un apósito de membrana amniótica/coriónica deshidratada, compuesta de múltiples capas incluyendo una capa simple de células epiteliales y una capa de tejido conectivo avascular. EpiFix® esta mínimamente manipulada y deshidratada por lo que mantiene la mayoría de los factores de crecimiento, citoquinas, y proteínas de la matriz extracelular presentes en el tejido amniótico que permiten la regeneración de tejidos blandos. Puede ser almacenada a temperatura ambiente, estimula la curación de tejidos y modula la inflamación, pero no puede ser usada en heridas infectadas.

El estado de la técnica incluye diferentes formas de curar heridas ulcerosas, incluyendo tanto curaciones tradicionales como curaciones avanzadas. Sin embargo, no se encontraron procedimientos que sean totalmente efectivos y fáciles de aplicar y que logren una recuperación completa del sector ulcerado. Por tanto, existe la necesidad de disponer de un producto que sea de fácil aplicación y que permita una rápida recuperación del sector ulcerado, aun cuando las heridas se encuentren infectadas.

El documento WO 2008/057162 A2 divulga composiciones que comprenden colágeno de telopéptido placentario humano, métodos de preparación de las composiciones, métodos de su utilización y kits que comprenden las composiciones.

El documento WO 2006/135843 A2 divulga composiciones que comprenden colágeno placentario humano, métodos de preparación de las composiciones, métodos de su utilización y kits que comprenden las composiciones.

El documento US 2004/048796 A1 divulga membranas colagenosas producidas a partir de amnios, a las que se hace referencia en la misma como un biotejido de colágeno. El biotejido de colágeno presenta la integridad estructural de la membrana amniótica no tratada natural, es decir, la estructura terciaria y cuaternaria natural. El documento US 2004/048796 A1 proporciona asimismo un método para preparar un biotejido de colágeno a partir de una membrana placentaria, preferentemente una membrana placentaria humana que presenta una membrana coriónica y amniótica, descelularizando la membrana amniótica.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un procedimiento de elaboración para una matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas según la reivindicación 1.

La presente invención corresponde a un producto según la reivindicación 4 que mantiene las propiedades biomecánicas como la flexibilidad, la capacidad de ser suturable, baja inmunogenicidad, al ser derivado de la placenta humana con el valor agregado de tener propiedades antimicrobianas, lo que amplia aún más su espectro de uso.

La presente invención corresponde a una matriz de colágeno de origen placentario según la reivindicación 4 que está libre de células y de factores proteicos, lo que facilitaría el escalamiento del producto y sin perder la capacidad regenerativa de los derivados placentarios, debido a la presencia de colágeno, principal componente de la matriz extracelular y responsable de permitir la migración celular, fundamental para el proceso de migración celular y cierre de heridas.

Específicamente, la invención corresponde a una matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas según la reivindicación 4 y al procedimiento de obtención de dicha matriz o membrana de colágeno la cual comprende colágeno procedente de membranas fetales amnióticas y nanometales también conocidos como nanopartículas metálicas, según la reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos

La invención será descrita a continuación haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:

La figura 1 muestra el gráfico que resume los resultados para un paciente promedio tratado con la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas de la presente invención.

La figura 2 muestra los resultados de un ensayo de sensibilidad a antibióticos realizado a la matriz o membrana de la presente invención.

Las figuras 3 y 4 muestran los resultados de ensayos de sensibilidad a antibióticos realizados en una matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas de la presente invención.

La figura 5 muestra la secuencia de las bacterias Gram negativas del género Proteus.

La figura 6 muestra la secuencia de las bacterias Gram positivas del género Staphylococcus.

Descripción detallada de la invención

La presente invención corresponde a una matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas, que comprende colágeno proveniente de membranas fetales amnióticas y nanopartículas metálicas.

La presente invención además, corresponde al procedimiento de obtención de dicha matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas.

Considerando que la materia prima base para obtener la matriz o membrana de colágeno de la presente invención es el colágeno derivado a partir de las membranas fetales amnióticas, primeramente se describirá el procedimiento jurídico que se establece para la obtención de este tipo de materias primas.

En este contexto, el estatuto jurídico aplicable a la donación de la placenta, que también contiene la membrana amniótica, en el artículo 153 del Libro IX del Código Sanitario y en el artículo 16 de su Reglamento, señala que no es necesario el consentimiento de la madre en la donación de la placenta. Sin embargo, siguiendo las buenas prácticas internacionales, se obtendrán las membranas fetales amnióticas, a través de un consentimiento informado de parte de la madre donante como condición necesaria para elaborar una matriz o membrana de colágeno. Para poder utilizar las membranas fetales amnióticas se requerirá de la autorización del Director del establecimiento donde se obtendrá la placenta. Esto se resuelve mediante convenio con la clínica. En relación con el uso comercial, ni el artículo 153 del Libro IX del Código Sanitario ni el artículo 16 de su Reglamento prohíben expresamente que el producto obtenido a partir de los órganos y tejidos sea comercializado. Sobre el particular, si bien podría ser discutible que se vendiera directamente, por ejemplo la placenta (pues ésta fue adquirida gratuitamente y su aprovechamiento debería realizarse de la misma manera), no ocurre lo mismo con el procedimiento de elaboración, en virtud del cual la placenta es convertida en un producto terapéutico (como es el caso de la matriz o membrana de colágeno). Por otra parte, en EE.UU. que corresponde a uno de los mercados en que se pretende comercializar la matriz o membrana de colágeno de la presente invención, el procedimiento jurídico se encontraría regulado bajo la norma 361 (Human Cells and Tissue-BasedProducts) de la FDA. Dentro de las características más importantes de esta norma se encuentran las pruebas clínicas del producto, según las condiciones establecidas por la FDA.

Procedimiento de obtención de las membranas fetales amnióticas:

1. - Mediante un consentimiento informado se solicita la donación de la placenta, que también contiene la membrana fetal amniótica, si la paciente está de acuerdo, se solicita su firma.

2. - Paralelamente, se realiza una toma de muestra de sangre para realizar los siguientes exámenes serológicos: VIH, reagina plasmática rápida (RPR), antígeno de superficie de virus de hepatitis B; serología de virus de hepatitis C, enfermedad de Chagas (endémica en Chile), V.D.R.L. y se envía a un laboratorio clínico. Estos resultados tardan 7 días hábiles en estar disponibles. Esto es realizado para cumplir la norma 361 (Human Cells and Tissue-BasedProducts) de la FDA.

3. - La placenta, es transportada entonces en el interior de una nevera portátil, previamente desinfectada con etanol, 70% v/v y dentro de un contenedor hermético previamente esterilizado hasta las dependencias de la sala de laboratorio donde se asegura el tejido. Es importante mencionar en esta etapa que solo se utilizarán membranas fetales amnióticas que provengan de un parto por medio de cesárea. Esto con la finalidad de evitar la contaminación de la placenta y de la membrana fetal amniótica con microorganismos del tracto urogenital de la madre al pasar por el canal de parto durante el proceso de parto normal.

4.- Se separa el corion del resto de la placenta con la ayuda de tijeras quirúrgicas y pinzas, para obtener la membrana fetal amniótica. Esta membrana fetal amniótica se lava cuantas veces sea necesario con la finalidad de eliminar los restos de sangre y coágulos. En caso de ser necesario se aplica etanol 70% v/v para eliminar los restos de coágulos.

El procedimiento de elaboración de la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas comprende las siguientes etapas:

i) obtención de colágeno a partir de membranas fetales amnióticas;

ii) adición e incorporación de nanopartículas metálicas al colágeno así obtenido, para obtener la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas; y

iii) deshidratado e irradiación de la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas, para obtener un producto listo para su embalaje.

i) Obtención de colágeno a partir de membranas fetales amnióticas:

La obtención del colágeno comienza a partir de las membranas fetales amnióticas. Para ello, el tejido correspondiente a la membrana fetal amniótica es tratado químicamente para eliminar restos proteicos que pudiesen quedar en él. Este primer tratamiento comprende sumergir el tejido en una solución con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,01% durante una hora a temperatura ambiente. Este proceso se realiza en agitación usando un agitador orbital y dentro de un contenedor cerrado herméticamente para evitar la contaminación con microorganismos oportunistas presentes en el medio ambiente.

Una vez finalizado este proceso, se procede con un segundo tratamiento químico para eliminar las células que pudiesen quedar adheridas al tejido. Para ello se sumerge el tejido en una solución de tripsina-EDTA libre de marcador de pH (incolora) durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, se realizan tres lavados con suero fisiológico durante 15 minutos cada uno para eliminar las células que se hayan desprendido del tejido durante el proceso de lavado con tripsina. Este también se realiza en agitación usando un agitador orbital y dentro de un contenedor cerrado.

Luego, se realiza un segundo tratamiento con SDS al 0,01% durante una hora a temperatura ambiente. Este proceso se realiza en agitación usando un agitador orbital y dentro de un contenedor cerrado. Este proceso se realiza con la finalidad de eliminar componentes proteicos y restos celulares que hayan quedado tras el tratamiento con tripsina-EDTA. Luego se procede a realizar cinco lavados con suero fisiológico estéril y de esta manera se obtiene el colágeno, correspondiente a la materia prima base de la presente invención.

El colágeno obtenido a partir de este procedimiento mantiene su integridad estructural. Para ello, se realiza un proceso de descelularización de la membrana fetal amniótica. Esto permite obtener un producto con numerosas utilidades en el campo de la medicina como la reparación de tendones, vasos sanguíneos, cirugías oculares y apósito para heridas (Wilshaw SP, Kearney JN, Fisher J, Ingham E. 2006, “Production of an acellular amniotic membrane matrix for use in tissue engineering”. Tissue Eng. 2006 Aug;12(8):2117-29) y (Letendre S, LaPorta G, O'Donnell E, Dempsey J, Leonard K. 2009. “Pilot trial of biovance collagen-based wound covering for diabetic ulcers”. Adv Skin Wound Care. 2009 Apr; 22(4):161-6).

El colágeno así obtenido luego es montado en un soporte inerte, por ejemplo una mica transparente plástica previamente esterilizada, sobre la cual es deshidratado e irradiado y almacenado en mangas cerradas al vacío a una temperatura de -80°C, a la espera de los resultados de los análisis serológicos.

Si los exámenes serológicos son negativos se procede con la segunda parte del proceso de producción de la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas. Si alguno de los exámenes resulta positivo, dichas matrices son eliminadas y se comienza nuevamente el procedimiento desde la etapa i).

ii) Adición e incorporación de nanopartículas metálicas al colágeno así obtenido:

En una forma de realización de la presente invención se prepara una solución acuosa, en agua estéril y filtrada, que comprende nanopartículas metálicas de:

a) cobre o

b) cobre/plata

En otra forma de realización de la presente invención se prepara una solución acuosa que comprenda una mezcla de cobre/plata/oro. En este caso el disolvente que se debe utilizar es el citrato.

En la preparación de la solución acuosa de nanopartículas de cobre (Cu), se utilizan nanopartículas de cobre de un tamaño comprendido entre 25 y 60 nm y la solución se deja a una concentración final de cobre de 1mg/mL.

En el caso de la preparación de la solución acuosa de cobre/plata, se utiliza el mismo tamaño de las partículas de cobre, que el mencionado anteriormente y el tamaño de las nanopartículas de plata (Ag), es de un tamaño de 100nm o menos. Por su parte, la concentración de las nanopartículas de cobre se mantiene en 1 mg/mL en la solución final, mientras que para las nanopartículas de plata la concentración es de 2,5 a 5 ng/mL. Para ambas nanopartículas la pureza es > 99,5%.

En el caso de adicionar puntos cuánticos (qdts), se utiliza una solución de puntos cuánticos de (cadmio) en una concentración de 0,1-10 nM.

En el caso de usar una solución de cobre/plata/oro, la disolución de las nanopartículas se realiza en una solución de citrato. La pureza, tamaño y concentración de las nanopartículas de cobre y plata se mantiene exactamente igual a anteriormente. El tamaño de las nanopartículas de oro es de 5 nm y la concentración de nanopartículas de oro en la solución final es de 5,5E+13 partículas por mL.

La adición de las nanopartículas se realiza embebiendo el colágeno obtenido en la solución acuosa que contiene las nanopartículas metálicas y se coloca en una cámara de electroforesis y se somete a campo eléctrico de 50 voltios durante 30 min para la incorporación de las nanopartículas en el colágeno obtenido y su distribución homogénea. De esta manera se obtiene la matriz o membrana de colágeno.

iii) Deshidratación e irradiación de la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas, para obtener un producto listo para su embalaje:

La matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas se deshidrata y es irradiada durante 30 min con luz UV, para obtener el producto que se encuentra listo para su embalaje final. La deshidratación se realiza lentamente en cabina de bioseguridad y en condiciones de aire circulante estéril (filtro HEPA 99,95%).

El producto obtenido, que presente nanopartículas de cobre, cobre/plata o qdts añadidas, es la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas, la cual puede ser liofilizada y posteriormente disuelta en un solvente orgánico o puesta en un contenedor con atomizador para generar un producto en forma de espray de fácil aplicación y de posible venta en locales farmacéuticos.

La matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas presenta propiedades regenerativas y actividad antimicrobiana de amplio espectro cuando se adicionan nanopartículas de cobre, cobre/plata o cobre/plata/oro. En el caso de adicionar una mezcla de qdts, es formado un producto con propiedades regenerativas y con actividad antimicrobiana de espectro reducido diseñado para algunos S. Aureus Gram (+) y Gram (-).

Resultados obtenidos con la matriz o membrana de colágeno con actividad antimicrobiana

1.- Regeneración del tejido.

Una vez obtenida la matriz o membrana de colágeno con actividad antimicrobiana, ésta se almacena en condiciones de sellado hermético y a temperatura ambiente. En el momento de ser utilizada en el paciente, es reconstituida con suero fisiológico (NaCl 0,9%).

Una vez reconstituida, se coloca sobre la herida que se debe tratar y se controla al paciente cada 7 días. Cada 7 días un nuevo parche con la matriz o membrana de colágeno con actividad antimicrobiana se coloca en la zona tratada. Luego la zona es aislada del medio ambiente mediante la incorporación de un apósito tradicional (gasa).

Luego de 5-6 aplicaciones, se logra una reducción del área y de la profundidad de la herida en un promedio de 80%. Estos resultados se observan en la figura 1.

La figura 1 muestra el gráfico que resume los resultados obtenidos para un paciente promedio tratado con una matriz o membrana de colágeno con actividad antimicrobiana, luego de 6 aplicaciones del producto. Las barras en color negro, muestran los datos para el área de la herida y las barras en color blanco son los datos para la profundidad de la herida en milímetros (mm). Como se puede observar en la figura 1, el área de la herida disminuye considerablemente al aumentar las semanas de tratamiento con el producto de la presente invención, logrando así una disminución del 80% del área de la herida. Lo mismo ocurre con la profundidad de la herida, donde también se logra una disminución del 80% de la profundidad de la herida.

2.- Poder microbicida de la matriz o membrana de colágeno con actividad antimicrobiana.

Para poder determinar la capacidad antimicrobiana de la matriz o membrana de colágeno, se realizaron pruebas de laboratorio. Unas biopsias de pacientes fueron recolectadas a partir de diferentes tipos de heridas infectadas (pie diabético neuropático y biopelículas). Estas muestras fueron homogenizadas y se pusieron a cultivar durante 24 horas para observar si hay o no crecimiento bacteriano. Una vez observado el crecimiento bacteriano, se aislaron colonias de estos cultivos y con ella se realizó la prueba de sensibilidad microbiana a la acción de los nanometales. Es importante destacar que fueron recogidas a partir de las biopsias de bacterias Gram negativas y positivas y ambas fueron examinadas para este ensayo de sensibilidad.

Para realizar este ensayo, como controles, se utilizaron antibióticos comúnmente utilizados para eliminar estas bacterias y a concentraciones establecidas. En este caso en particular los antibióticos usados como control fueron los siguientes: eritromicina (15mg), claritromicina (CLR) (15mg), penicilina (10mg) ampicilina (AM) (10mg), ciprofloxacino (CIP) (5mg), vancomicina (30mg).

Para analizar la efectividad de los nanometales de cobre y su efectividad como agentes antimicrobianos, se utilizaron tres concentraciones 1, 5 y 10 mg/ml. Para poder demostrar que efectivamente las partículas de nanometales presentes en la matriz o membrana de colágeno poseen la actividad antimicrobiana, como control de este ensayo se utilizó una matriz o membrana de colágeno sin partículas de nanometales de cobre.

El ensayo fue llevado a cabo de la siguiente manera: sobre la superficie de una placa de agar Müller-Hinton se inocularon 100 ul de una solución bacteriana (OD600: 0,4) y sembraron de forma uniforme para el crecimiento de las colonias bacterianas. A continuación se colocan discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibióticos. El antibiótico difundirá desde el papel de filtro al agar de forma radial. Se incuba la placa durante 18-24 horas a 37°C y luego se miden los halos de inhibición de desarrollo, interpretándose de acuerdo con los datos disponibles en las bases de datos. Los resultados se expresan como: sensible (S), intermedio o moderadamente sensible (I) y resistente (R). La tabla 1 muestra los mismos.

Tanto para las bacterias Gram negativas como las bacterias Gram positivas una concentración de cobre de 1mg/mL fue suficiente para inhibir el crecimiento bacteriano. La matriz o membrana de colágeno que no poseía cobre, por su parte, no es capaz de inhibir este crecimiento. Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 2. La figura 2 muestra los resultados del ensayo de sensibilidad a antibióticos. Los halos alrededor de los discos indican inhibición del crecimiento bacteriano. La imagen de la izquierda muestra un ensayo para bacterias Gram negativas. La imagen de la derecha muestra un resultado para bacterias Gram positivas. F: matriz o membrana de colágeno sin nanometales (ausencia de nanopartículas de cobre) SF: matriz o membrana de colágeno con nanometales a una concentración de 1 mg/mL. CIP: ciprofloxacino, AM: ampicilina. CLR: claritromicina.

Tabla 1: sensibilidad a antibióticos

Tabla 1: cuantificación de los halos de inhibición obtenidos en ensayos de sensibilidad a antibióticos.

Para determinar el halo de inhibición, en la placa sembrada con bacterias en presencia de los distintos antibióticos, fue medido el diámetro alrededor del sensidisco en el cual no se observó crecimiento bacteriano. El halo de inhibición en este caso está expresado en mm. Según el tamaño del halo las bacterias son clasificadas como sensibles a la acción del antibiótico, resistentes a la acción del antibiótico o de resistencia intermedia a la acción del antibiótico (datos que se encuentran publicados en bases de datos). Los datos de la tabla nombrados como placa 1, son los datos obtenidos para un ensayo típico como el mostrado en la figura 2 izquierda (bacterias Gram negativas). Los datos correspondientes a la placa 2 de la tabla, son los datos obtenidos para un ensayo típico como el mostrado en la figura 2 derecha (bacterias Gram positivas). Los siguientes antibióticos fueron estudiados en este ensayo: CIP: ciprofloxacino, AM: ampicilina. CLR: claritromicina. Los valores mostrados representan el promedio obtenido para tres experimentos. La finalidad de este ensayo es además descartar que la matriz sola presente algún grado de acción antimicrobiana, por lo que como control se utilizó una matriz sin cobre. En ese caso el grado de sensibilidad se clasificó como n /a (no aplica).

Las bacterias Gram negativas pertenecen al género Proteus y las bacterias Gram positivas pertenecen al género Staphylococcus

3.- Usos de la matriz o membrana de colágeno y sus derivados:

El uso de la matriz o membrana de colágeno y sus productos derivados está recomendado para heridas de pie diabético, ulceras venosas, escaras, quemaduras, epidermólisis ampollosa (piel de cristal) y en heridas producidas por el roce con aparatos ortopédicos, según la reivindicación 11.

Además debido a que es un producto que es reabsorbido por la piel y extremadamente delgado, su uso se puede complementar con terapias y tratamientos ya existentes tales como hidrocoloides para permitir la hidratación de la piel tratada, alginatos que permitan absorber secreciones y/o carbón activado para neutralizar los olores producidos por estas heridas.

Resultados con Cu/Ag y Cu/Ag/Au

Para poder determinar la capacidad antimicrobiana de la matriz o membrana de colágeno, se realizaron pruebas de laboratorio. Unas biopsias de pacientes fueron recolectadas desde diferentes tipos de heridas infectadas (pie diabético neuropático y biopelículas). Estas muestras fueron homogenizadas y se pusieron a cultivar durante 24 horas para observar si hay o no crecimiento bacteriano. Una vez observado el crecimiento bacteriano, se aislaron colonias de estos cultivos y con ellas se realizó la prueba de sensibilidad microbiana a la acción de los nanometales. En este caso se probaron soluciones de Cu/Ag y soluciones de Cu/Ag/Au. Es importante destacar que fueron recogidas a partir de las biopsias de bacterias Gram negativas y positivas y ambas fueron examinadas para este ensayo de sensibilidad. El ensayo fue llevado a cabo de la siguiente manera: sobre la superficie de una placa de agar Müller-Hinton se inocularon 100 ul de una solución bacteriana (OD600: 0,4) y se sembraron de forma uniforme para el crecimiento de las colonias bacterianas. A continuación se colocan discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibióticos. En este caso en particular se usó ciprofloxacino (5mg) y eritromicina (15mg) como controles. Además para cada caso, también se usó una matriz de colágeno sin tratar con nanopartículas metálicas.

En la figura 3 se muestran los resultados del ensayo de sensibilidad a antibióticos para una bacteria Gram positiva (izquierda) y una bacteria Gram negativa (derecha) aisladas desde la herida infectada, en pacientes con pie diabético. La figura 3 representa los resultados obtenidos para una matriz o membrana de colágeno con nanopartículas de Cu/Ag y sin nanopartículas metálicas.

Como muestra la figura 3, los halos alrededor de los discos indican inhibición del crecimiento bacteriano. La imagen de la izquierda muestra un resultado para unas bacterias Gram positivas. La imagen de la derecha muestra un ensayo para bacteria Gram negativa. En este caso, ambas bacterias fueron aisladas desde heridas infectadas de pacientes con pie diabético. La simbología de la figura 3 es la siguiente: ST: malla filtrada sin nanometales (ausencia de nanopartículas de cobre y plata). NP: membrana filtrada con nanometales de cobre a una concentración de 1 mg/ml y plata 5ng/mL. C: ciprofloxacino, E: eritromicina.

El mismo experimento mencionado anteriormente de sensibilidad a nanopartículas metálicas se realizó en presencia de una mezcla de nanopartículas de cobre, plata y oro. Nuevamente las bacterias fueron sembradas de forma uniforme para el crecimiento de colonias bacterianas. A continuación se colocan discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibióticos. Tal como en el caso anterior, se utilizaron ciprofloxacino (5mg) y eritromicina (15mg) como controles y se usó asimismo una matriz o membrana de colágeno sin tratar con nanopartículas metálicas.

En la figura 4 se muestran los resultados del ensayo de sensibilidad a antibióticos para una bacteria Gram positiva (izquierda) y una bacteria Gram negativa (derecha) aisladas desde la herida infectada en pacientes con pie diabético. La figura 4 representa los resultados obtenidos para una matriz o membrana de colágeno con nanopartículas de Cu/Ag/Au y sin nanopartículas metálicas.

Como muestra la figura 4 los halos alrededor de los discos indican una inhibición del crecimiento bacteriano. La imagen de la izquierda muestra un resultado para algunas bacterias Gram positivas. La imagen de la derecha muestra un ensayo para bacterias Gram negativas. En este caso, ambas bacterias fueron aisladas desde heridas infectadas de pacientes con pie diabético. La simbología de la figura 4 es la siguiente: ST: malla filtrada sin nanometales (ausencia de nanopartículas de cobre y plata). NP: membrana filtrada con nanometales de cobre a una concentración de 1 mg/ml, de plata a 5ng/ml, y de oro a 5,5E+13 partículas por mL. C: ciprofloxacino, E: eritromicina.

Adicionalmente, de estas bacterias se extrajo ADN y se realizó una secuenciación para identificar las bacterias tratadas. Una vez obtenida la secuencia, ésta es subida a una base de datos de NIH de Estados Unidos y se compara con secuencias ya existentes en la base de datos.

Como resultado de la comparación, la secuencia de las bacterias Gram negativas pertenecía al género Proteus y la secuencia de las bacterias Gram positivas al género Staphylococcus.

Los resultados obtenidos para las bacterias Gram negativas y Gram positivas, después de la comparación de las secuencias, se muestran en las figuras 5 y 6, respectivamente. La figura 5 muestra la secuencia de las bacterias Gram negativas que pertenece a un aislado de paciente del género Proteus y la figura 6 muestra la secuencia de las bacterias Gram positivas que pertenece a un aislado de paciente del género Staphylococcus.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de elaboración para una matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas, caracterizado por que consiste en las etapas siguientes:

i) formar colágeno a partir de membranas amnióticas fetales;

ii) añadir e incorporar nanopartículas metálicas al colágeno así formado para formar la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas; y

iii) deshidratar e irradiar la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas para formar un producto listo para su embalaje;

y por que, para que el colágeno se forme a partir de la membrana amniótica fetal, ésta es tratada químicamente para eliminar cualquier resto proteico que pueda permanecer en la misma en un primer tratamiento que comprende sumergir la membrana amniótica fetal en una solución de dodecil sulfato de sodio al 0,01% (SDS) durante una hora a temperatura ambiente, en agitación utilizando un agitador orbital y dentro de un contenedor cerrado herméticamente, y

cuando finaliza el primer tratamiento, se realiza un segundo tratamiento químico para eliminar cualquier célula que pueda permanecer adherida a la membrana amniótica fetal, para lo cual se sumerge la membrana amniótica fetal en una solución de tripsina-EDTA libre de marcador de pH (incolora) durante 1 hora a 37°C; a continuación, se realizan a continuación tres lavados con suero fisiológico durante 15 minutos, cada uno para eliminar cualquier célula que pueda haberse desprendido del tejido durante el proceso de lavado con tripsina, y

cuando finaliza el segundo tratamiento, se realiza un nuevo tratamiento químico con SDS al 0,01% durante una hora a temperatura ambiente, en agitación utilizando un agitador orbital y dentro de un contenedor cerrado, para que el colágeno se forme finalmente a partir de la membrana amniótica, y

por que para que se añadan las nanopartículas metálicas e incorporen al colágeno formado, el colágeno formado es embebido en una solución acuosa que contiene las nanopartículas metálicas, y se coloca en una cámara de electroforesis y se somete a un campo eléctrico de 50 voltios durante 30 minutos para que las nanopartículas se incorporen en el colágeno formado y se distribuyan de manera homogénea.

2. Procedimiento de elaboración para una matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas según la reivindicación 1, caracterizado por que, para deshidratar la matriz o membrana de colágeno, la deshidratación se realiza lentamente en una cabina de bioseguridad y en condiciones de aire circulante estéril (filtro HEPA 99,95%).

3. Procedimiento de elaboración para una matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas según la reivindicación 2, caracterizado por que la matriz o membrana de colágeno con propiedades antimicrobianas es irradiada durante 30 min con luz UV.

4. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas, obtenida mediante el procedimiento de elaboración según las reivindicaciones 1 a 3.

5. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos según la reivindicación 4, caracterizada por que las nanopartículas metálicas son nanopartículas de cobre contenidas en una solución acuosa, en la que las nanopartículas de cobre presentan un tamaño de partícula de 25-60 nm, y en la que la solución presenta una concentración de cobre final de 1 mg/mL.

6. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos según la reivindicación 4, caracterizada por que las nanopartículas metálicas son una mezcla de cobre y plata contenida en una solución acuosa, en la que las nanopartículas de cobre presentan un tamaño de partícula de 25-60 nm y las nanopartículas de plata presentan un tamaño de partícula de 100 nm o menos.

7. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos según la reivindicación 6, caracterizada por que la solución presenta una concentración de cobre final de 1 mg/mL y una concentración de nanopartículas de plata de 2,5-5 ng/mL.

8. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos según la reivindicación 4, caracterizada por que las nanopartículas metálicas son una mezcla de puntos cuánticos de cadmio contenida en una solución acuosa a una concentración de 0,1-10 nM.

9. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos según la reivindicación 4, caracterizada por que las nanopartículas metálicas son una mezcla de cobre, plata y oro contenida en una solución acuosa, en la que las nanopartículas de cobre presentan un tamaño de partícula de 25-60 nm, las nanopartículas de plata presentan un tamaño de partícula de 100 nm o menos, y las nanopartículas de oro presentan un tamaño de partícula de 5 nm.

10. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos según la reivindicación 9, caracterizada por que la solución presenta una concentración de cobre final de 1 mg/mL y una concentración de nanopartículas de plata de 2,5-5 ng/mL, y una concentración de las nanopartículas de oro en la solución final de 5,5E+13 partículas por mL.

11. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas según las reivindicaciones 4 a 10, para la utilización en el tratamiento de neuropatías diabéticas, úlceras venosas o diabéticas y pie diabético.

12. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas según las reivindicaciones 4 a 10, para la utilización en el tratamiento de escaras, quemaduras, epidermólisis ampollosa (piel de cristal) y heridas producidas por el roce con aparatos ortopédicos.

13. Matriz o membrana de colágeno libre de células y de factores proteicos con propiedades antimicrobianas según las reivindicaciones 4 a 10, para la utilización en el tratamiento de infecciones de heridas bacterianas Gramnegativas y Gram-positivas.