ES2928973T3 - Caracterización de partículas subvisibles usando un analizador de partículas - Google Patents
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Abstract
La presente especificación describe métodos para caracterizar una población de partículas utilizando un analizador de partículas. Las partículas se pueden caracterizar por tamaño, número absoluto, si la partícula es proteinácea o no proteinácea, si una partícula proteinácea tiene o carece de una determinada propiedad física, o cualquier combinación de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Caracterización de partículas subvisibles usando un analizador de partículas
Introducción
Los productos proteicos terapéuticos proporcionan tratamientos únicos y eficaces para numerosas enfermedades y afecciones médicas humanas. En muchos casos, estos tratamientos se usan crónicamente para ralentizar la progresión de la enfermedad, reducir la morbilidad y/o reemplazar proteínas esenciales que no se producen endógenamente en un individuo. Los factores que reducen o eliminan la eficacia de un tratamiento a base de proteínas pueden conducir al padecimiento e incluso la muerte del paciente. Un medio mediante el cual puede verse comprometida la eficacia de proteínas terapéuticas es mediante una respuesta inmunitaria, lo que da como resultado la neutralización mediada por anticuerpos de la actividad de la proteína o alteraciones en la biodisponibilidad. Por ejemplo, en el caso del tratamiento de hemofilia A, los anticuerpos neutralizantes contra el factor VIII pueden provocar episodios de hemorragia potencialmente mortales, lo que da como resultado una morbilidad significativa y la necesidad de tratamiento con un transcurso prolongado de una terapia de inducción de tolerancia para revertir la inmunidad. En otros casos, los anticuerpos inducidos por un tratamiento a base de proteínas exógenas pueden reaccionar de manera cruzada con, y neutralizar, la proteína endógena del paciente. Si la proteína endógena cumple una función biológica no redundante, una respuesta inmunitaria como tal puede tener resultados devastadores. Por ejemplo, la aplasia pura de la serie roja puede ser el resultado de anticuerpos neutralizantes contra la epoetina alfa. Se ha presupuesto que los agregados de proteína presentes en un producto proteico terapéutico pueden potenciar la inmunogenicidad provocando una respuesta inmunitaria. Como tal, los agregados de proteína tienen el potencial de afectar negativamente al rendimiento clínico. Por tanto, los agregados de proteína deben caracterizarse como parte de los programas de caracterización y garantía de calidad del producto.
La solicitud de patente US 2009/0311715 describe un método para determinar el número de microvesículas por |il de plasma obtenido de un mamífero para determinar si el mamífero tiene o no calcificación coronaria o de tejidos blandos.
La patente US 5.540.494 describe un método para el dimensionamiento de partículas biológicas individuales (tales como liposomas) en un citómetro de flujo. El método permite el cálculo de un tamaño de partícula individual a partir de la intensidad de dispersión de luz para calcular el área de superficie y la fluorescencia normalizada con respecto al volumen.
La solicitud de patente WO 99/57566 describe un método para detectar fibrillas amiloides utilizando citometría de flujo. La presencia de fibrillas amiloides se detecta mediante un procedimiento de múltiples etapas en el que cada colorante amiloidofílico se añade y analiza por separado.
Mach et al. (“The use of flow cytometry for the detection of subvisible particles in therapeutic protein formulations”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, vol. 100, 1671-1678) describen el uso de un citómetro de flujo equipado con detectores de dispersión frontal y lateral, así como de fluorescencia, para determinar el número de partículas subvisibles en formulaciones de anticuerpos monoclonales.
Las proteínas habitualmente se agregan a partir de moléculas parcialmente desplegadas, que pueden formar parte del conjunto de moléculas en estado nativo. Aunque las formulaciones de producto se desarrollan para maximizar y mantener la fracción de moléculas de proteína presentes en el estado nativo, pueden formarse cantidades significativas de agregados, especialmente en escalas de tiempo farmacéuticamente relevantes y en condiciones de estrés. Por ejemplo, la exposición a interfases (por ejemplo, aire-líquido y sólido-líquido), luz, fluctuaciones de temperatura o impurezas minoritarias puede inducir la agregación. Tal exposición puede producirse durante las etapas de procesamiento, así como en el envase de producto final durante el almacenamiento, el envío y la manipulación. Además, pueden generarse agregados de proteína a partir de la proteína sola o a partir de la nucleación heterogénea en micropartículas y/o nanopartículas extrañas que se desprenden, por ejemplo, a partir de bombas de llenado o envase/cierres de producto. Además, los niveles y tamaños de agregados de proteína pueden cambiarse por muchos factores relevantes para la producción comercial de las proteínas terapéuticas. Tales factores incluyen un cambio en el tipo de bomba de llenado durante el aumento de escala para la fabricación comercial, cambios en la formulación o en el envase/cierre, e incluso cambios no intencionales en el procedimiento de fabricación tales como alteraciones en los parámetros mecánicos de la bomba de llenado u otros factores imprevistos.
Los agregados de proteína grandes pueden cuantificarse basándose en el porcentaje en masa para cada tamaño de agregado y se clasifican habitualmente como solubles o insolubles. Existe un equilibrio de masas entre la cantidad de proteína en agregados y la pérdida de proteína monomérica. Sin embargo, los agregados de proteína más pequeños no constituyen habitualmente una fracción de masa suficiente de la población de proteínas como para cuantificarse basándose en la masa de agregados o la pérdida de proteína monomérica. Normalmente, estos agregados más pequeños se cuantifican contando el número de partículas en intervalos de tamaño dados. Como primera aproximación, las partículas se dividen en partículas visibles y partículas subvisibles. Aunque no puede
asignarse un límite de tamaño estricto para cuando las partículas se vuelven visibles para el ojo humano, se reconoce generalmente que las partículas de más de 100-200 |im de tamaño se detectan con una probabilidad relativamente alta en condiciones de prueba apropiadas. Las partículas subvisibles se definen habitualmente como partículas que son demasiados grandes para su análisis por cromatografía de exclusión molecular (SEC), pero demasiado pequeñas como para ser visibles a simple vista.
Aunque los agregados de proteína son potencialmente inmunogénicos, las pruebas de particulados de la actual Farmacopea de Estados Unidos (USP) no están diseñadas para monitorizar o evaluar la presencia de agregados de proteína en un producto proteico terapéutico. Por ejemplo, métodos tales como el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), la microscopia de flujo, la dispersión de luz electroforética (ELS), el oscurecimiento de luz y el análisis diferencial de movilidad por electropulverización (ES-DMA), también conocido como análisis molecular de la movilidad electroforética en fase gaseosa (GEMMA), no pueden caracterizar las partículas subvisibles detectadas en cuanto a su naturaleza (por ejemplo, proteica frente a no proteica), composición, propiedades estructurales, propiedades químicas, cantidad y/o tamaño. Por tanto, existe la necesidad de métodos analíticos que puedan evaluar características de agregados de proteína. Tales métodos son importantes para establecer controles de calidad apropiados y/o para evaluar y mitigar el riesgo para la calidad del producto potencialmente provocado por los agregados de proteína.
Sumario
La presente memoria descriptiva proporciona métodos para la detección, el recuento y la caracterización simultáneos de partículas subvisibles. A diferencia de otros métodos, los métodos divulgados en el presente documento proporcionan información sobre la naturaleza (por ejemplo, proteica frente a no proteica), composición, propiedad (por ejemplo, una propiedad estructural, funcional o química), cantidad y tamaño de las partículas subvisibles detectadas. Esto se logra, en parte, mediante el uso de un colorante fluorescente que detecta partículas subvisibles por debajo de 1 |im. Esta detección puede permitir la identificación de tales partículas subvisibles a partir del ruido de fondo, así como la distinción de partículas subvisibles proteicas de las partículas subvisibles no proteicas y la identificación de una composición particular o la presencia (o ausencia) de una propiedad en las partículas subvisibles proteicas. Además, los métodos divulgados permiten la caracterización de partículas individuales mientras se analiza una muestra a granel.
Por tanto, la presente memoria descriptiva divulga un método para caracterizar una población de partículas subvisibles en una preparación farmacéutica usando un analizador de partículas. En unos aspectos, el método comprende las etapas de: a) calibrar un analizador de partículas usando un patrón de tamaño; b) explorar la muestra a medida que la muestra pasa a través de una zona de detección del analizador de partículas, comprendiendo la muestra un patrón de recuento fluorescente y una pluralidad de colorantes fluorescentes que comprende un primer colorante fluorescente y un segundo colorante fluorescente, en el que la preparación farmacéutica comprende un material proteico que es un principio activo farmacéutico, un adyuvante o un excipiente y en el que la exploración incluye luz de una o más longitudes de onda que pueden dispersarse por el patrón de tamaño, dispersarse por o excitar el patrón de recuento fluorescente y dispersarse por o excitar la pluralidad de colorantes fluorescentes, y en el que el primer colorante fluorescente tiñe un material proteico de una manera que distingue el material proteico de un material no proteico y el segundo colorante fluorescente tiñe un subconjunto del material proteico que tiene una propiedad física del material proteico de una manera que distingue el material proteico que tiene la propiedad física del material proteico que no tiene la propiedad física, y la exploración incluye una o más longitudes de onda que pueden excitar el segundo colorante fluorescente; c) recopilar datos de al menos un parámetro de dispersión de luz y al menos un parámetro de fluorescencia, en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz representan un tamaño de partícula basándose en la calibración de patrón de tamaño, y en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de fluorescencia incluyen un primer parámetro de fluorescencia que representa la presencia del material proteico basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del primer colorante fluorescente, un segundo parámetro de fluorescencia que representa el número de partículas basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del patrón de recuento fluorescente y un tercer parámetro de fluorescencia que representa la presencia del material proteico que tiene la propiedad física basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del segundo colorante fluorescente; y d) analizar los datos para definir el tamaño de partícula, el número de partículas, la presencia del material proteico y la presencia de la propiedad física para determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas con y sin la propiedad física, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra, en el que la detección, el recuento y la caracterización de la población de partículas subvisibles son simultáneos. En otros aspectos no cubiertos por las reivindicaciones, se analizan el número absoluto, el tamaño y la presencia de un material no proteico y el número absoluto, el tamaño y la presencia de un material subvisible no proteico con y sin la propiedad física con el fin de caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra.
Otros aspectos de la presente memoria descriptiva no cubiertos por la invención reivindicada divulgan métodos para caracterizar una población de partículas subvisibles en una muestra usando un analizador de partículas, comprendiendo el método las etapas de: a) calibrar un analizador de partículas usando un patrón de tamaño; b) explorar la muestra a medida que la muestra pasa a través de una zona de detección del analizador de partículas, comprendiendo la muestra un patrón de recuento fluorescente y al menos un colorante fluorescente, en el que la
exploración incluye luz de una o más longitudes de onda que pueden dispersarse por el patrón de tamaño, dispersarse por o excitar el patrón de recuento fluorescente y dispersarse por o excitar el al menos un colorante fluorescente, y en el que el al menos un colorante fluorescente incluye un primer colorante fluorescente que tiñe el material proteico de una manera que distingue una partícula proteica de una partícula no proteica; c) recopilar datos de al menos un parámetro de dispersión de luz y al menos un parámetro de fluorescencia, en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz representan un tamaño de partícula basándose en la calibración de patrón de tamaño, y en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de fluorescencia incluyen un primer parámetro de fluorescencia que representa la presencia de un material proteico basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del primer colorante fluorescente y un segundo parámetro de fluorescencia que representa el número de partículas basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del patrón de recuento fluorescente; y d) analizar los datos para definir el tamaño de partícula, el número de partículas y la presencia del material proteico para determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. La etapa de análisis de datos puede comprender además determinar el número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas restando el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas. En otros aspectos, se analizan el número absoluto, el tamaño y la presencia de un material no proteico con el fin de caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra.
Además, los métodos no cubiertos por la invención reivindicada pueden incluir 1) en la etapa de exploración de la muestra, que el al menos un colorante fluorescente incluya un segundo colorante fluorescente que tiñe una propiedad física del material proteico de una manera que distingue una partícula proteica que tiene la propiedad física de una partícula proteica que no tiene la propiedad física y la exploración incluya una o más longitudes de onda que pueden excitar el segundo colorante fluorescente; 2) en la etapa de recopilación de datos, que la recopilación de datos incluya además recopilar datos de un tercer parámetro de fluorescencia, representando el tercer parámetro de fluorescencia la presencia de un material proteico que tiene la propiedad física basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del segundo colorante fluorescente; y 3) en la etapa de análisis de datos, que los datos se analicen para definir la presencia de la propiedad física para determinar la fracción de partículas subvisibles proteicas dimensionadas contadas con o sin la propiedad física, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En otros aspectos, se analizan el número absoluto, el tamaño y la presencia de material subvisible no proteico con y sin la propiedad física con el fin de caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra.
Aún otros aspectos de la presente memoria descriptiva no cubiertos por la invención reivindicada divulgan métodos para caracterizar una población de partículas subvisibles en una muestra usando un analizador de partículas, comprendiendo el método las etapas de: a) calibrar un analizador de partículas usando un patrón de tamaño; b) explorar la muestra a medida que la muestra pasa a través de una zona de detección del analizador de partículas, comprendiendo la muestra al menos un colorante fluorescente, en el que la exploración incluye luz de una o más longitudes de onda que pueden dispersarse por el patrón de tamaño y excitar el al menos un colorante fluorescente, y en el que el al menos un colorante fluorescente incluye un primer colorante fluorescente que tiñe el material proteico de una manera que distingue una partícula proteica de una partícula no proteica; c) recopilar datos de al menos un parámetro de dispersión de luz y al menos un parámetro de fluorescencia, en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz representan un tamaño de partícula basándose en la calibración de patrón de tamaño, y en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de fluorescencia incluyen un primer parámetro de fluorescencia que representa la presencia de un material proteico basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del primer colorante fluorescente; y d) analizar los datos para definir el tamaño de partícula y la presencia del material proteico para determinar el tamaño y la presencia de partículas subvisibles proteicas, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En otros aspectos, se analizan el tamaño y la presencia de un material no proteico con el fin de caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra.
Además, los métodos no cubiertos por la invención reivindicada pueden incluir 1) en la etapa de exploración de la muestra, que la muestra comprenda además un patrón de recuento fluorescente y la exploración incluya una o más longitudes de onda que pueden explorar o excitar el patrón de recuento fluorescente; 2) en la etapa de recopilación de datos, que el al menos un parámetro de fluorescencia incluya un segundo parámetro de fluorescencia que representa el número de partículas basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del patrón de recuento fluorescente; y 3) en la etapa de análisis de datos, que los datos se analicen para definir el número de partículas para determinar el número absoluto de las partículas subvisibles proteicas dimensionadas, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En otros aspectos, se analiza el número absoluto de un material no proteico con el fin de caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra.
Además, los métodos no cubiertos por la invención reivindicada pueden incluir además 1) en la etapa de exploración de la muestra, que el al menos un colorante fluorescente incluya un segundo colorante fluorescente que tiñe una propiedad física del material proteico de una manera que distingue un material proteico que tiene la propiedad física de un material proteico que no tiene la propiedad física y la exploración incluya una o más longitudes de onda que pueden excitar el segundo colorante fluorescente; 2) en la etapa de recopilación de datos, que la recopilación de datos incluya además recopilar datos a partir de un tercer parámetro de fluorescencia, representando el tercer
parámetro de fluorescencia la presencia de un material proteico que tiene la propiedad física basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del segundo colorante fluorescente; y 3) en la etapa de análisis de datos, que los datos se analicen para definir la presencia de la propiedad física para determinar la fracción de partículas subvisibles proteicas dimensionadas contadas con o sin la propiedad física, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En otros aspectos, se analizan el número absoluto, el tamaño y la presencia de material subvisible no proteico con y sin la propiedad física con el fin de caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1, que no es según la invención reivindicada, muestra datos que representan el tamaño de partícula (A) y el intervalo de distribución de tamaño (B) generados a partir de parámetros de dispersión de luz frontal y de dispersión de luz lateral. Para la figura 1B, las áreas representadas por los diferentes tipos de sombreado representan tamaños de partícula de menos de aproximadamente 0,75 |im, desde aproximadamente 0,75 |im hasta aproximadamente 1,0 |im, desde aproximadamente 1,0 |im hasta aproximadamente 2,0 |im, desde aproximadamente 2,0 |im hasta aproximadamente 4,5 |im, desde aproximadamente 4,5 |im hasta aproximadamente 6,0 |im, desde aproximadamente 6,0 |im hasta aproximadamente 10 |im y más de aproximadamente 10 |im.
La figura 2, que no es según la invención reivindicada, muestra datos que representan el tamaño de partícula (A) y el intervalo de distribución de tamaño (B) generados estableciendo selecciones entre los máximos de pico de cada perla de patrón de tamaño y el extremo de los ejes. Para la figura 2B, las marcas representan tamaños de partícula de desde aproximadamente 0,75 |im hasta menos de aproximadamente 10 |im, desde aproximadamente 1,0 |im hasta menos de aproximadamente 10 |im, desde aproximadamente 2,0 |im hasta menos de aproximadamente 10 |im, desde aproximadamente 4,5 |im hasta menos de aproximadamente 10 |im, desde aproximadamente 6,0 |im hasta menos de aproximadamente 10 |im y más de aproximadamente 10 |im.
La figura 3, que no es según la invención reivindicada, muestra datos que representan el intervalo de distribución de tamaño de partículas subvisibles proteicas (A) y el recuento de partículas dentro de cada intervalo de distribución (B) generados a partir de parámetros de dispersión de luz frontal y de dispersión de luz lateral. La figura 3 también muestra un gráfico de barras (C) del número de partículas subvisibles proteicas frente al intervalo de distribución de tamaño tanto de una muestra de control (D-PBS) como de una muestra de prueba (fibrillas de Abeta 1-42).
La figura 4, que no es según la invención reivindicada, muestra datos que representan el intervalo de distribución de tamaño de partículas subvisibles no proteicas (A) y el intervalo de distribución de tamaño de partículas subvisibles proteicas (B) generados a partir de parámetros de dispersión de luz frontal y de dispersión de luz lateral. La figura 4 también muestra datos que indican que las partículas subvisibles proteicas (SO+) y no proteicas (SO-) pueden diferenciarse entre sí (C) o compararse cualitativamente entre sí (D) basándose en la intensidad de fluorescencia debida a la tinción con SYPRO™ Orange (SO). La figura 4 muestra además que los datos que indican que las partículas subvisibles proteicas (SO+) y no proteicas (SO-) pueden diferenciarse y compararse cuantitativamente entre sí (E).
La figura 5 muestra datos que indican que las partículas subvisibles proteicas (SO+) y las partículas subvisibles no proteicas (SO-) pueden diferenciarse entre sí basándose en la intensidad de fluorescencia debida a la tinción con SYPRO™ Orange (SO) (A). La figura 5 también muestra datos que indican que las partículas subvisibles proteicas que tienen una estructura de lámina p (ThT+) y las partículas subvisibles proteicas que carecen de una estructura de este tipo (ThT-) pueden diferenciarse entre sí basándose en la intensidad de fluorescencia debida a la tinción con tioflavina T (ThT) (B). La figura 5 también muestra que los datos recopilados pueden identificar partículas subvisibles proteicas que tienen una estructura de lámina p a partir de la población total de partículas en la muestra (C). La figura 5 muestra además un gráfico de barras que indica el número absoluto de partículas subvisibles totales (acontecimientos totales), partículas subvisibles proteicas (SO+), partículas subvisibles no proteicas (SO-) y partículas subvisibles proteicas con una estructura de lámina p (SO+ ThT+), clasificadas basándose en el intervalo de distribución de tamaño para cada partícula (D).
La figura 6 muestra la estrategia de selección usada para diferenciar al mismo tiempo en una muestra entre partículas subvisibles proteicas (proteína) y no proteicas (no proteína) así como entre la presencia (propiedad ) o ausencia (propiedad -) de una propiedad de partículas subvisibles proteicas (A). La figura 6 también muestra que en primer lugar se usa un gráfico de dispersión lateral frente a dispersión frontal para generar datos que detectan partículas subvisibles dentro de una muestra (B) y que la detección con bis-ANS (un colorante específico de proteína) se representa gráficamente frente a la dispersión frontal para diferenciar entre partículas subvisibles proteicas y no proteicas (C). La figura 6 también muestra que las partículas subvisibles proteicas se caracterizaron adicionalmente usando 9-(2,2-dicianovinil)julolidina (DCVJ) representadas gráficamente frente a la dispersión frontal (D); DCVJ se une específicamente a estructuras p cruzadas y permite la identificación de partículas subvisibles proteicas similares a amiloides. La figura 6 también muestra los análisis de retroselección de partículas subvisibles proteicas y no proteicas (E).
Descripción detallada
Aspectos de la presente memoria descriptiva divulgan, en parte, una muestra. La muestra comprende una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica incluye un material proteico. El material proteico puede sintetizarse químicamente, producirse de manera recombinante o purificarse a partir de una fuente natural. El material proteico es un principio farmacéutico activo de la preparación farmacéutica, un adyuvante o un excipiente usado en la preparación farmacéutica.
Un principio farmacéutico activo puede referirse a cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinada a su uso en la fabricación de un producto farmacológico y que, cuando se usa en la producción de un fármaco, se convierte en un principio activo en el producto farmacológico. Tales sustancias están destinadas a proporcionar actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afectar a la estructura y la función del cuerpo. Un principio farmacéutico activo puede incluir, sin limitación, un anticuerpo, una enzima, una toxina o cualquier otro polipéptido o peptidomimético diseñado para tener un efecto beneficioso cuando se administra a un individuo. Un excipiente puede incluir, sin limitación, una albúmina. Un anticuerpo se refiere a una molécula generada por un sistema inmunitario que se produjo en respuesta a un antígeno particular, que se une específicamente a ese antígeno, e incluye tanto anticuerpos que se producen de manera natural como anticuerpos que no se producen de manera natural. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un dímero, un multímero, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo bifuncional, un anticuerpo asociado a células como un receptor de Ig, un anticuerpo lineal, un diacuerpo o un minicuerpo, siempre que el fragmento presente la actividad biológica deseada, y derivados de cadena sencilla de los mismos. Un anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa que comprende los dominios Vh y Vl, así como un dominio constante de cadena ligera (Cl) y dominios constantes de cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3, o un fragmento inmunológicamente activo de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fc, un fragmento Fd, un fragmento Fv. Un anticuerpo puede derivarse de cualquier especie de vertebrado (por ejemplo, humano, cabra, caballo, burro, ratón, rata, conejo o pollo), y puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) o subclase (lgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2). En la actualidad existen más de 30 terapias basadas en anticuerpos aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos. Estas incluyen abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, brentuximab vedotina, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetán, infliximab, ipilimumab, motavizumab, muronomab, natalizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, raxibacumab, rituximab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab y ustekinumab.
En una realización, un principio farmacéutico activo incluye una toxina, como una citotoxina o una no citotoxina. Una citotoxina es una sustancia que tiene un efecto tóxico (o destructor) sobre las células, tal como, por ejemplo, necrosis o apoptosis, mientras que una no citotoxina es una sustancia que tiene un efecto no tóxico (no destructor) sobre las células, tal como, por ejemplo, inhibición de la endocitosis, exocitosis, citocinesis, cariocinesis. Los ejemplos no limitativos de una citotoxina incluyen un veneno tal como, por ejemplo, un veneno de serpiente y un veneno de caracola, una toxina de planta tal como, por ejemplo, ricina y abrina, una toxina bacteriana tal como, por ejemplo, toxina diftérica y exotoxina de Pseudomonas, y una toxina viral tal como, por ejemplo, una toxina de Shiga. Los ejemplos no limitativos de una no citotoxina incluyen una toxina de Clostridium como una toxina de C. botulinum, una toxina de C. baratii, una toxina de C. butyricum y una toxina de C. tetani.
En una realización, un principio farmacéutico activo incluye una proteína de la sangre como una proteína de coagulación de la sangre, incluyendo sus formas tanto inactiva como activa. Los ejemplos no limitativos de proteínas de la sangre incluyen ADAMTS-13, antiplasmina a l, antiplasmina a2, antitrombina, antitrombina III, procoagulante del cáncer, eritropoyetina, factor II, factor IIa, factor V, factor Va, factor VI, factor VIa, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor Xla, factor XII, factor Xlla, factor XIII, factor XIIIa, fibronectina, fibrinógeno (factor I), cofactor de heparina II, quininógeno de alto peso molecular (HMWK), inmunoglobulina intramuscular, inmunoglobulina intravenosa, plasmina, plasminógeno, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI1), inhibidor del activador de plasminógeno 2 (PAI2), precalicreína, prostaciclina, proteína C, proteína activa C (APC), proteína S, proteína Z, inhibidor de proteasas relacionado con la proteína Z, trombomodulina, factor tisular (factor III), inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI), activador tisular del plasminógeno (t-PA), urocinasa y factor de von Willebrand.
En una realización, un principio farmacéutico activo incluye una insulina.
La muestra comprende un patrón de recuento fluorescente tal como se divulga en el presente documento, y una pluralidad de colorantes fluorescentes divulgados en el presente documento que comprende un primer colorante fluorescente y un segundo colorante fluorescente.
Una muestra puede comprender una muestra de control. Puede usarse una muestra de control para evaluar la presencia de partículas subvisibles extrañas tales como, por ejemplo, partículas de polvo, partículas de vidrio,
partículas lixiviables y/o partículas de aceite. Luego pueden restarse los datos recopilados a partir de esta muestra de control de los datos de la muestra de prueba.
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, una población de partículas subvisibles. Una partícula subvisible es materia particulada no disuelta, distinta de burbujas de gas, que no puede observarse mediante inspección visual. Aunque no puede asignarse un límite de tamaño estricto para cuando las partículas se vuelven visibles para el ojo humano, se reconoce generalmente que las partículas de más de 100-200 |im de tamaño se detectan con una probabilidad relativamente alta en condiciones de prueba apropiadas. Como tal, el tamaño de una partícula subvisible puede ser menor de o igual a 200 |im. Las partículas subvisibles tienen diferentes orígenes. Pueden ser agregados de proteína pura; partículas de vidrio; una partícula lixiviable como tungsteno, aceite de silicio, metales; y también complejos de estas partículas lixiviables con proteínas y agregados de proteína. Como tal, las partículas subvisibles pueden ser proteicas, no proteicas, o ambas.
En unos aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede caracterizar una partícula subvisible que tiene un tamaño que es, por ejemplo, menor de o igual a 200 |im, menor de o igual a 150 |im, menor de o igual a 100 |im, menor de o igual a 75 |im, menor de o igual a 50 |im, menor de o igual a 25 |im, menor de o igual a 10 |im, menor de o igual a 7,5 |im, menor de o igual a 5 |im, menor de o igual a 2,5 |im, menor de o igual a 1 |im, menor de o igual a 0,75 |im, menor de o igual a 0,5 |im, o menor de o igual a 0,1 |im. En otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede caracterizar una partícula subvisible que tiene un tamaño de entre, por ejemplo, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 50 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 20 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 50 |im, o aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 20 |im.
Las partículas subvisibles proteicas pueden ser conjuntos relativamente grandes que contienen de miles a millones de moléculas de proteína. En unos aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede caracterizar una partícula subvisible proteica que tiene un tamaño que es, por ejemplo, menor de o igual a 200 |im, menor de o igual a 150 |im, menor de o igual a 100 |im, menor de o igual a 75 |im, menor de o igual a 50 |im, menor de o igual a 25 |im, menor de o igual a 10 |im, menor de o igual a 7,5 |im, menor de o igual a 5 |im, menor de o igual a 2,5 |im, menor de o igual a 1 |im, menor de o igual a 0,75 |im, menor de o igual a 0,5 |im, o menor de o igual a 0,1 |im. En otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede caracterizar una partícula subvisible proteica que tiene un tamaño de entre, por ejemplo, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 50 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 20 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 50 |im, o aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 20 |im.
Las partículas subvisibles no proteicas pueden ser materia inorgánica u orgánica e incluyen, sin limitación, partículas de vidrio, partículas metálicas y un aceite. En unos aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede caracterizar una partícula subvisible no proteica que tiene un tamaño que es, por ejemplo, menor de o igual a 200 |im, menor de o igual a 150 |im, menor de o igual a 100 |im, menor de o igual a 75 |im, menor de o igual a 50 |im, menor de o igual a 25 |im, menor de o igual a 10 |im, menor de o igual a 7,5 |im, menor de o igual a 5 |im, menor de o igual a 2,5 |im, menor de o igual a 1 |im, menor de o igual a 0,75 |im, menor de o igual a 0,5 |im, o menor de o igual a 0,1 |im. En otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede caracterizar una partícula subvisible no proteica que tiene un tamaño de entre, por ejemplo, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 50 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 20 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 50 |im, o aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 20 |im.
La presente memoria descriptiva divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, en parte, un analizador de partículas. Un analizador de partículas incluye un citómetro de flujo. La citometría de flujo puede combinar dispersión de luz a partir de partículas y emisión de luz a partir de moléculas fluorocrómicas para generar conjuntos de datos multiparamétricos específicos para partículas en el intervalo de aproximadamente 0,02 |im a aproximadamente 100 |im. Una característica única de la citometría de flujo es que puede medir propiedades de dispersión de luz y de emisión de fluorescencia de miles de partículas individuales por segundo. La muestra puede
inyectarse en una cámara de flujo donde las partículas se enfocan hidrodinámicamente en un fluido envolvente que fuerza a las partículas a alinearse en una sola fila en la parte central de la corriente de fluido. Luego, cada partícula pasa a través de una zona de detección en la que una fuente de luz óptimamente enfocada explora la partícula. La mayoría de las veces se usan láseres como la fuente de luz en citometría de flujo. A medida que la fuente de luz explora la partícula que pasa, la partícula dispersa luz y, si tiene propiedades de fluorescencia, la partícula también puede excitarse hasta un estado de mayor energía en el que libera energía como fotón de luz con propiedades espectrales específicas.
El análisis por citometría de flujo de una partícula da lugar a datos multiparamétricos correspondientes a dispersión de luz, absorción de luz e intensidad de fluorescencia. Normalmente, un citómetro de flujo convencional puede diferenciar la dispersión de luz (LS) como dispersión de luz frontal (FLS), dispersión de luz lateral (SLS) y dispersión de luz inversa (RLS) y detectar hasta cuatro emisiones de intensidad de fluorescencia diferentes (FL1-FL4). Los parámetros de luz dispersada y emitida de cada partícula se convierten en pulsos eléctricos mediante detectores ópticos. La luz colimada (formas de onda de luz paralelas) se recoge por lentes confocales enfocadas en el punto de intersección de las partículas y la fuente de luz. La luz se envía a diferentes detectores usando filtros ópticos. El tipo de detector más habitual usado en citometría de flujo es el tubo fotomultiplicador (PMT). Luego se procesan los pulsos eléctricos procedentes de la luz detectada por los PMT mediante una serie de amplificadores lineales y logarítmicos. La amplificación logarítmica se usa con mayor frecuencia para medir la intensidad de fluorescencia. Este tipo de amplificación expande la escala para señales débiles y comprime la escala para señales de fluorescencia “fuertes” o específicas. Después de amplificar las diferentes señales o pulsos, se procesan mediante un convertidor analógico-digital (ADC) que a su vez permite representar los acontecimientos en una escala grafica. Las escalas típicas incluyen un histograma de un solo parámetro y un histograma de dos parámetros.
Las salidas de datos de citometría de flujo se almacenan en forma de archivos informáticos. Los datos correspondientes a una muestra pueden almacenarse como archivo en modo de lista y/o archivo en histograma. Los archivos en modo de lista contienen un listado completo de todos los acontecimientos correspondientes a todos los parámetros recopilados, tal como se especifica mediante un protocolo de adquisición definido por el usuario. El protocolo de adquisición sirve como plantilla que define qué parámetros específicos (por ejemplo, dispersión de luz y/o fluorescencia) se recopilan y cómo se presentan estos parámetros recopilados. Además, un protocolo de adquisición sirve para determinar cómo se seleccionan los datos, y contiene todas las regiones a partir de las cuales pueden generarse parámetros estadísticos. Además, los protocolos contienen otra información específica que sirve como interfaz directa entre la estación de trabajo informática y el citómetro, incluyendo las relacionadas con configuraciones de alta tensión para los detectores de PMT, ganancias para la amplificación de parámetros lineales, velocidades de flujo de muestras, compensación de fluorescencia y configuraciones de diferenciación.
Los archivos en histograma pueden estar en forma de archivos de un solo parámetro o de dos parámetros. Los archivos en histograma consisten en una lista de los acontecimientos correspondientes a la visualización gráfica especificada en el protocolo de adquisición. Un histograma de un solo parámetro es un gráfico de recuento de células en el eje de ordenadas y el parámetro de medición en el eje de abscisas. Un histograma de dos parámetros es un gráfico que representa dos parámetros de medición, en los ejes de abscisas y de ordenadas, y la altura de recuento de células en un gradiente de densidad. Esto es similar a un mapa topográfico. Los recuentos de partículas se muestran mediante densidad de puntos o mediante gráfico de contorno.
El procedimiento de separar células usando datos multiparámetros de citometría de flujo se denomina clasificación. Un citómetro de flujo capaz de clasificar células incluirá un transductor sintonizable que permite romper el fluido envolvente para dar gotitas individuales que encapsulan una sola partícula, retardos de carga eléctrica para cargar gotitas individuales, placas deflectoras para desviar gotitas individualmente cargadas al interior de tubos de recogida y configuraciones de software para definir los criterios de clasificación, estos incluyen regiones que definen poblaciones que van a clasificarse.
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, calibrar un analizador de partículas usando un patrón de tamaño. Un patrón de tamaño comprende una suspensión calibrada de partículas de uno o más tamaños conocidos, teniendo cada tamaño un diámetro medio. Un patrón de tamaño se usa para definir intervalos de distribución de tamaño que permitirán el dimensionamiento de las partículas subvisibles presentes en una muestra. Las partículas que representan un tamaño particular pueden tener cualquier forma regular (geométrica) o irregular, pueden prepararse de cualquier material y pueden ser fluorescentes o no fluorescentes. Los diámetros medios de partícula presentes en un patrón de tamaño incluyen, sin limitación, 0,5 |im, 1,0 |im, 2,0 |im, 4,0 |im, 6 |im, 10 |im, 15 |im, 20 |im, 30 |im, 40 |im, 50 |im, 60 |im, 70 |im, 80 |im, 90 |im, 100 |im, 125 |im, 150 |im, 175 |im, 200 |im, o cualquier combinación de los mismos y en cualquier intervalo hallado entre cualquiera de estos valores. Los ejemplos no limitativos de un patrón de tamaño incluyen el kit de calibración de tamaño Fluoresbright I y II (Polysciences, Inc., Warrington, PA), el kit de calibración de tamaños para citometría de flujo (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA), los patrones de tamaño certificados ChromoSphere-T (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), nanoesfera de la serie 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), patrones de tamaño de partículas de sílice de la serie 8000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) y el kit de patrones de calibración de tamaño (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN).
Un analizador de partículas puede calibrarse procesando una muestra que comprende un patrón de tamaño
divulgado en el presente documento y recopilando parámetros de dispersión de luz. La tensión del tubo fotomultiplicador (PMT) puede ajustarse con el fin de recopilar información de tamaño. Por ejemplo, aumentar la tensión del PMT permite la detección de tamaños más pequeños. El límite superior del tamaño depende normalmente del diámetro de los tubos usados en el analizador de partículas y, por tanto, puede variar. En unos aspectos de esta realización, el límite superior del tamaño puede ser, por ejemplo, 150 |im, 175 |im, 200 |im, 225 |im, 250 |im, 275 |im o 300 |im. Los datos de dispersión de luz se recopilan basándose en el tamaño de partícula, y estos datos se usan para crear una base de datos de selección con el fin de establecer selecciones de intervalos de distribución de tamaño definidos. En un aspecto de esta realización, el intervalo de distribución de tamaño es para partículas que son, por ejemplo, menores de o iguales a 150 |im, menores de o iguales a 175 |im, menores de o iguales a 200 |im, menores de o iguales a 225 |im, menores de o iguales a 250 |im, menores de o iguales a 275 |im, o menores de o iguales a 300 |im.
En otro aspecto, los intervalos de distribución de tamaño son, por ejemplo, menores de 0,75 |im, 0,75-1 |im, 1-2 |im, 2-4 |im, 4-6 |im, 6-8 |im, 8-10 |im, 10-20 |im, 20-30 |im, 30-40 |im, 40-50 |im, 50-60 |im, 60-70 |im, 70-80 |im, 80 90 |im, 90-100 |im, 100-150 |im, o cualquier combinación de los mismos. En aún otro aspecto, los intervalos de distribución de tamaño son de, por ejemplo, 0,10-0,25 |im, 0,25-0,50 |im, 0,50-0,75 |im, 0,75-1 |im, 1-2 |im, 2-4 |im, 4-6 |im, 6-8 |im, 8-10 |im, 10-20 |im, 20-30 |im, 30-40 |im, 40-50 |im, 50-60 |im, 60-70 |im, 70-80 |im, 80-90 |im, 90 100 |im, 100-150 |im, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, los intervalos de distribución de tamaño son, por ejemplo, menores de 0,75 |im, 0,75-1 |im, 1-2 |im, 2-4,5 |im, 4,5-6 |im, 6-10 |im, mayores de 10 |im, o cualquier combinación de los mismos. En aún otro aspecto, los intervalos de distribución de tamaño son, por ejemplo, menores de 0,10-0,25 |im, 0,25-0,50 |im, 0,50-0,75 |im, 0,75-1 |im, 1-2 |im, 2-4,5 |im, 4,5-6 |im, 6-10 |im, mayores de 10 |im, o cualquier combinación de los mismos. El analizador de partículas puede almacenar esta base de datos de selección para el posterior análisis de una muestra de prueba.
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, explorar una muestra a medida que la muestra pasa a través de una zona de detección de un analizador de partículas. La exploración se produce cuando una partícula pasa a través de una fuente de luz óptimamente enfocada provocando que la partícula disperse luz y/o emita un fotón o fotones de luz que tienen propiedades espectrales específicas. La exploración incluye luz de una o más longitudes de onda que pueden dispersarse por una partícula o usarse para excitar una partícula que tiene propiedades de fluorescencia. Las longitudes de onda de la luz particulares que se usan para explorar una partícula pueden ser definidas por el usuario y estar basadas, en parte, en el tamaño particular que se desea detectar, el espectro de excitación particular de una partícula, la longitud de onda de excitación de pico de la partícula, el espectro de emisión particular de una partícula, la longitud de onda de emisión de pico de la partícula, el grado de superposición entre dos o más espectros de excitación particulares y el grado de superposición entre dos o más espectros de emisión particulares.
En un aspecto de esta realización, la exploración incluye una o más longitudes de onda que pueden dispersarse por un patrón de tamaño, dispersarse por o excitar un patrón de recuento fluorescente y dispersarse por o excitar una pluralidad de colorantes fluorescentes.
Aspectos de la presente memoria descriptiva divulgan una pluralidad de colorantes fluorescentes. Un colorante fluorescente se refiere a un compuesto que, tras la excitación, absorbe energía lumínica de una determinada longitud de onda y emite energía lumínica de una longitud de onda diferente. El método divulgado en el presente documento usa un primer colorante fluorescente y un segundo colorante fluorescente. En todavía otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento usa un primer colorante fluorescente, un segundo colorante fluorescente y un tercer colorante fluorescente. En otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento usa un primer colorante fluorescente, un segundo colorante fluorescente, un tercer colorante fluorescente y un cuarto colorante fluorescente. En aún otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento usa un primer colorante fluorescente y opcionalmente un segundo colorante fluorescente, un tercer colorante fluorescente, un cuarto colorante fluorescente, un quinto colorante fluorescente, un sexto colorante fluorescente, un séptimo colorante fluorescente, un octavo colorante fluorescente, un noveno colorante fluorescente y/o un décimo colorante fluorescente. En todavía otros aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento usa un primer colorante fluorescente y un segundo colorante fluorescente, y opcionalmente un tercer colorante fluorescente, un cuarto colorante fluorescente, un quinto colorante fluorescente, un sexto colorante fluorescente, un séptimo colorante fluorescente, un octavo colorante fluorescente, un noveno colorante fluorescente y/o un décimo colorante fluorescente.
Un colorante fluorescente divulgado en el presente documento abarca colorantes que pueden emitir en una variedad de espectros, incluyendo ultravioleta, visible (incluyendo violeta, azul, cian, verde, amarillo, naranja y rojo), infrarrojo cercano, infrarrojo medio e infrarrojo lejano. Un colorante fluorescente incluye, sin limitación, un colorante de acridina y sus derivados, un colorante arilmetina y sus derivados, un colorante cumarina y sus derivados, un colorante cianina y sus derivados, un colorante naftaleno y sus derivados, un colorante o-ftaldehído y sus derivados, un colorante oxadiazol y sus derivados, un colorante oxazina y sus derivados, un colorante ficoeritrina y sus derivados, un colorante ficocianina y sus derivados, un colorante pireno y sus derivados, un colorante piridiloxazol y sus derivados, un colorante escuarilio y sus derivados, un colorante tetrapirrol y sus derivados y un colorante xanteno y sus derivados. Estos y otros colorantes son conocidos por experto en la técnica.
Un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de excitación en los espectros ultravioleta, visible, infrarrojo cercano, infrarrojo medio o infrarrojo lejano. En un aspecto de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de excitación dentro del intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 800 nm. En un aspecto de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de excitación dentro del intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 635 nm. En unos aspectos de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de excitación en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En aún otros aspectos de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar una longitud de onda de excitación de pico en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En todavía otros aspectos de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar una longitud de onda de excitación de pico de aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 310 nm, de aproximadamente 320 nm, de aproximadamente 330 nm, de aproximadamente 340 nm, de aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 360 nm, de aproximadamente 370 nm, de aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 390 nm, de aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 410 nm, de aproximadamente 420 nm, de aproximadamente 430 nm, de aproximadamente 440 nm, de aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 470 nm, de aproximadamente 480 nm, de aproximadamente 490 nm, de aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 510 nm, de aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 530 nm, de aproximadamente 540 nm, de aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 560 nm, de aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 580 nm, de aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 610 nm, de aproximadamente 620 nm o de aproximadamente 630 nm.
Un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de emisión en los espectros ultravioleta, visible, infrarrojo cercano, infrarrojo medio o infrarrojo lejano. En otro aspecto de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de emisión dentro del intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 800 nm. En aún otro aspecto de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de emisión dentro del intervalo de aproximadamente 385 nm a aproximadamente 800 nm. En unos aspectos de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar un espectro de emisión en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En aún otros aspectos de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar una longitud de onda de emisión de pico en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En todavía otros
aspectos de esta realización, un colorante fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento puede presentar una longitud de onda de emisión de pico de aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 360 nm, de aproximadamente 370 nm, de aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 390 nm, de aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 410 nm, de aproximadamente 420 nm, de aproximadamente 430 nm, de aproximadamente 440 nm, de aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 470 nm, de aproximadamente 480 nm, de aproximadamente 490 nm, de aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 510 nm, de aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 530 nm, de aproximadamente 540 nm, de aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 560 nm, de aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 580 nm, de aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 610 nm, de aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 630 nm, de aproximadamente 640 nm, de aproximadamente 650 nm, de aproximadamente 660 nm, de aproximadamente 670 nm, de aproximadamente 680 nm, de aproximadamente 690 nm, de aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 710 nm, de aproximadamente 720 nm, de aproximadamente 730 nm, de aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 750 nm, de aproximadamente 760 nm, de aproximadamente 770 nm, de aproximadamente 780 nm, de aproximadamente 790 nm o de aproximadamente 800 nm.
Un colorante fluorescente divulgado en el presente documento se selecciona basándose en su capacidad para teñir partículas subvisibles proteicas, o una composición o propiedad presente en partículas subvisibles proteicas. Tal como se usa en el presente documento, el término “tiñe” cuando se usa en referencia a un colorante fluorescente se refiere a un colorante fluorescente que absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con el material que el usuario desea detectar, emitirá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con el material que el usuario desea detectar, o absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda y emitirá energía lumínica de una longitud de onda diferente sólo cuando esté asociado con el material que el usuario desea detectar. Si un colorante fluorescente se asocia con material que el usuario no desea detectar, entonces el colorante o bien no absorbe energía lumínica y/o bien no emite energía lumínica, o emite energía lumínica de una manera que un analizador de partículas puede distinguir entre la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente asociado con el material que el usuario desea detectar y la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente asociado con el material que el usuario no desea detectar.
En un aspecto de esta realización, la pluralidad de colorantes fluorescentes incluye un primer colorante fluorescente que tiñe el material proteico de una manera que distingue la partícula proteica de la partícula no proteica. Tal como se usa en el presente documento, el término “tiñe” cuando se usa en referencia a un primer colorante fluorescente para el material proteico se refiere a un primer colorante fluorescente que absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material proteico, emitirá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material proteico, o absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda y emitirá energía lumínica de una longitud de onda diferente sólo cuando esté asociado con material proteico. Si un primer colorante fluorescente se asocia con un material no proteico, entonces el colorante o bien no absorbe energía lumínica y/o bien no emite energía lumínica, o emite energía lumínica de una manera que un analizador de partículas puede distinguir entre la fluorescencia emitida por el primer colorante fluorescente asociado con material proteico y la fluorescencia emitida por el primer colorante fluorescente asociado con material no proteico.
En una realización no cubierta por la invención reivindicada, el al menos un colorante fluorescente puede incluir un primer colorante fluorescente que tiñe material no proteico de una manera que distingue una partícula no proteica de una partícula proteica. Tal como se usa en el presente documento, el término “tiñe” cuando se usa en referencia a un primer colorante fluorescente para material no proteico se refiere a un primer colorante fluorescente que absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material no proteico, emitirá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material no proteico, o absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda y emitirá energía lumínica de una longitud de onda diferente sólo cuando esté asociado con material no proteico. Si un primer colorante fluorescente se asocia con un material proteico, entonces el colorante o bien no absorbe energía lumínica y/o bien no emite energía lumínica, o emite energía lumínica de una manera que un analizador de partículas puede distinguir entre la fluorescencia emitida por el primer colorante fluorescente asociado con material no proteico y la fluorescencia emitida por el primer colorante fluorescente asociado con material proteico.
La detección y la distinción de un colorante fluorescente asociado con el material que el usuario desea detectar pueden estar basadas en, por ejemplo, cambios en la intensidad de fluorescencia, cambios en el espectro de excitación como longitud de onda de excitación de pico o cambios en el espectro de emisión como longitud de onda de emisión de pico. En un aspecto de esta realización, la detección y la distinción de material proteico basándose en la tinción con el primer colorante fluorescente pueden estar basadas en, por ejemplo, cambios en la intensidad de fluorescencia, cambios en el espectro de excitación como longitud de onda de excitación de pico o cambios en el espectro de emisión como longitud de onda de emisión de pico. En una realización no cubierta por la invención reivindicada, la detección y la distinción de material no proteico basándose en la tinción con el primer colorante fluorescente pueden estar basadas en, por ejemplo, cambios en la intensidad de fluorescencia, cambios en el espectro de excitación como longitud de onda de excitación de pico o cambios en el espectro de emisión como longitud de onda de emisión de pico.
Los ejemplos no limitativos de un primer colorante fluorescente que tiñe el material proteico y que puede usarse para distinguir material proteico de material no proteico incluyen colorante de estirilo o colorante de merocianina como SYPRO® Ruby, SYPRO® Tangerine, SYPRO® Orange (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y SYPRO® Red (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); derivados de cumarina como 3-(2-benzotiazolil-7-(dietilamino)-cumarina (BTDEC), 3-(2-bencimidazolil)-7-(dietilamino)-cumarina (BIDEC), 3-(2-bencimidazolil)-7-cumarina (BIC), 3-(2-bencimidazolil)-7-(dipropilamino)-cumarina (BIDPC), 3-(2-benzoxazolil)-7-(dietilamino)-cumarina (BODEC), 3-(6-metil-2-benzoxazolil)-7-(dietilamino)-cumarina (MBODEC), 3-(dietilamino)-7-imino-7H-(1)benzopirano(3',2':3,4) pirido(1,2-a)bencimidazol-6-carbonitrilo (DIBPBC), 3-(dietilamino)-7-oxo-7H-(1)benzopirano(3',2':3,4) (DOBPBC); difluoruro de dipirrometenoboro y sus derivados, descritos en, por ejemplo, el documento US 4.774.339; complejos metálicos fotoluminiscentes, descritos en, por ejemplo, el documento US 2009/0131640; e hidroxiquinolona y sus derivados, descritos en, por ejemplo, el documento Us 2007/0281360. Las longitudes de onda de excitación y emisión de pico para colorantes fluorescentes útiles como primer colorante fluorescente divulgado en el presente documento se enumeran en la tabla 1. Otros colorantes fluorescentes útiles como primer colorante fluorescente divulgado en el presente documento son conocidos por un experto en la técnica.
Los ejemplos no limitativos, no cubiertos por la invención reivindicada, de un primer colorante fluorescente que tiñe material no proteico y que puede usarse para distinguir material no proteico de material proteico incluyen colorantes lipófilos. Los colorantes lipófilos útiles en los métodos divulgados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, colorantes lipófilos de carbocianina, colorantes lipófilos de aminoestirilo, colorantes anfífilos de estirilo, colorantes dialquilaminoestirilo, sondas anfífilas, sondas apolares, sondas de membrana y sondas catiónicas lipófilas. Los colorantes lipófilos de carbocianina incluyen, sin limitación, una octadecil(C18)indocarbocianina como Dil y DiD, una tiacarbocianina como (DiS) y una oxacarbocianina como DiO. Los colorantes lipófilos de aminoestirilo incluyen, sin limitación, 4-DÍ-10-a Sp (d291); DiA, D3883 y FAST DiA (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Las sondas anfífilas incluyen, sin limitación, sondas que comprenden derivados de una rodamina, una fluoresceína, una cumarina, 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH) o derivados de DPH con una “cola” lipófila. Los ejemplos no limitativos de tales sondas anfífilas incluyen octadecilrrodamina B; fluoresceínas tales como, por ejemplo, 5-dodecanoilaminofluoresceína, 5-hexadecanoil-aminofluoresceína, 5-octadecanoil-aminofluoresceína y el éster octadecílico de fluoresceína; 4-heptadecil-7-hidroxicumarina; 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), p-toluenosulfonato de 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno (TMA-DPH), p-toluenosulfonato de N-((4-(6-fenil-1,3,5-hexatrienil)fenil)propil)trimetilamonio (TMAP-DPH), ácido sulfónico de Dapoxil y ácido 3-(4-(6-fenil)-1,3,5-hexatrienil)fenilpropiónico (ácido DPH-propiónico). Las sondas apolares incluyen, sin limitación, sondas que comprenden una molécula de BODIPY con una “cola” lipófila. Los ejemplos no limitativos de tales sondas apolares incluyen BODIPY 493/503, BODIPY 505/515, BODIPY 665/676, BODIPY FL C5-ceramide y CellTrace BODIPY TR methyl ester, un colorante de fenoxazina como rojo Nilo, una molécula de 1,3-bis-(1-pireno)propano o azida bimánica con una “cola” lipófila. Las sondas de membrana incluyen, sin limitación, derivados de Dapoxil tales como, por ejemplo, ácido sulfónico de Dapoxil; 6-propionil-2-dimetilaminonaftaleno (prodan), 6-dodecanoil-2-dimetilaminonaftaleno (laurdan), 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrylodan), 6-bromoacetil-2-dimetilaminonaftaleno (badan); anilinonaftalenosulfonato (ANS) y derivados del mismo, tales como, por ejemplo, ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (1,8-ANS), ácido 2-anilinonaftaleno-6-sulfónico (2,6-ANS), ácido 2-(ptoluidinil)naftaleno-6-sulfónico (2,6-TNS), ácido 4,4'-dianilino-1,1'-binaftil-5,5'-disulfónico (bis-ANS); 4-(dicianovinil)julolidina (DCVJ); y ácido 4-amino-4'-benzamidoestilbeno-2,2'-disulfónico (MBDS o BADS). Las sondas catiónicas lipófilas incluyen, sin limitación, octadecilrrodamina y colorantes de FM tales como dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(dibutilamino)estiril)piridinio (FM® 1-43), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(dipentilamino)estiril)piridinio (FM® 1-84), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(dietilamino)estiril)piridinio (FM® 2-10), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(6-(4-(dietilamino)fenil)hexatrienil)piridinio (FM® 4-64), dibromuro de N-(3-trimetilamoniopropil)-4-(6-(4-(dietilamino)fenil)hexatrienil)piridinio (FM® 5-95), dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(4-(4-(dietilamino)fenil)butadienil)piridinio (RH 414) y derivados de los mismos (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); conjugados fosfolipídicos fluorescentes tales como NBD-PE (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); sondas de balsa lipídica, que son insolubles en detergentes. Las longitudes de onda de excitación y emisión de pico para colorantes lipófilos útiles como primer colorante fluorescente divulgado en el presente documento, pero no cubiertas por la invención reivindicada, se enumeran en la tabla 2. Otros colorantes lipófilos útiles como primer colorante fluorescente divulgado en el presente documento son conocidos por un experto en la técnica.
El uso de un colorante fluorescente que distingue partículas proteicas de partículas no proteicas permite la detección de partículas subvisibles por debajo de 1 |im del ruido de fondo. En unos aspectos de esta realización, un colorante fluorescente que tiñe partículas proteicas tal como se divulga en el presente documento permite la detección de partículas subvisibles que tienen un tamaño de, por ejemplo, menor de o igual a 1 |im, menor de o igual a 900 nm, menor de o igual a 800 nm, menor de o igual a 750 nm, menor de o igual a 700 nm, menor de o igual a 600 nm, menor de o igual a 500 nm, menor de o igual a 400 nm, menor de o igual a 300 nm, menor de o igual a 250 nm, menor de o igual a 200 nm, o menor de o igual a 100 nm. En otros aspectos, un colorante fluorescente que tiñe partículas proteicas tal como se divulga en el presente documento permite la detección de partículas subvisibles de entre, por ejemplo, aproximadamente 100 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 250 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 500 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 750 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 100 nm y aproximadamente 750 nm, aproximadamente 250 nm y aproximadamente 750 nm, o aproximadamente 500 nm y aproximadamente 750 nm.
En otros aspectos de una realización no cubiertos por la invención reivindicada, un colorante fluorescente que tiñe partículas no proteicas tal como se divulga en el presente documento permite la detección de partículas subvisibles que tienen un tamaño de, por ejemplo, menor de o igual a 1 |im, menor de o igual a 900 nm, menor de o igual a
800 nm, menor de o igual a 750 nm, menor de o igual a 700 nm, menor de o igual a 600 nm, menor de o igual a 500 nm, menor de o igual a 400 nm, menor de o igual a 300 nm, menor de o igual a 250 nm, menor de o igual a 200 nm, o menor de o igual a 100 nm. En otros aspectos, un colorante fluorescente que tiñe partículas no proteicas tal como se divulga en el presente documento permite la detección de partículas subvisibles de entre, por ejemplo, aproximadamente 100 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 250 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 500 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 750 nm y aproximadamente 1 |im, aproximadamente 100 nm y aproximadamente 750 nm, aproximadamente 250 nm y aproximadamente 750 nm, o aproximadamente 500 nm y aproximadamente 750 nm.
La pluralidad de colorantes fluorescentes incluye un segundo colorante fluorescente que tiñe un subconjunto del material proteico que tiene una propiedad física del material proteico de una manera que distingue un material proteico que tiene la propiedad física de un material proteico que no tiene la propiedad física. Tal como se usa en el presente documento, el término “tiñe” cuando se usa en referencia a un segundo colorante fluorescente para una propiedad física del material proteico se refiere a un segundo colorante fluorescente que absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material proteico que tiene una determinada propiedad física, emitirá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material proteico que tiene una determinada propiedad física, o absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda y emitirá energía lumínica de una longitud de onda diferente sólo cuando esté asociado con material proteico que tiene una determinada propiedad física. Si un segundo colorante fluorescente se asocia con un material no proteico o material proteico que no tiene la propiedad física, entonces el colorante o bien no absorbe energía lumínica y/o bien no emite energía lumínica, o emite energía lumínica de una manera que un analizador de partículas puede distinguir entre la fluorescencia emitida por el segundo colorante fluorescente asociado con material proteico que tiene una determinada propiedad física y la fluorescencia emitida por el segundo colorante fluorescente asociado con material no proteico o material proteico que no tiene la propiedad física. Alternativamente, el uso de un primer colorante fluorescente junto con un segundo colorante fluorescente permitirá la detección y la distinción de material proteico que tiene una determinada propiedad física en relación con material no proteico en situaciones en las que el colorante fluorescente o bien primero o bien segundo se asocia con un material no proteico de una manera que no permite que un analizador de partículas distinga estas dos categorías de material.
Una propiedad física de un material proteico es una característica que está presente sólo en un subconjunto de partículas proteicas presentes en una muestra e incluye, sin limitación, una característica estructural o modificación química como una modificación posterior a la traducción. Como tal, un segundo colorante fluorescente es uno que puede teñir sólo un subconjunto de partículas proteicas presentes en una muestra. Los ejemplos no limitativos de una característica estructural de un material proteico incluyen una estructura de hélice a, una estructura de lámina p, hidrofobia y una escisión peptídica. Los ejemplos no limitativos de una modificación química a un material proteico incluyen una acilación, una adenililación, una alquilación, una amidación, una glicación, una glicosilación, una glipiación, una isoprenilación, una miristoilación, una palimoilación, una pegilación, una fosforilación, una polisialilación, una prenilación, una sulfatación y una ubiquitinación.
La detección y la distinción de material proteico que tiene una determinada propiedad física basándose en la tinción con el segundo colorante fluorescente pueden estar basadas en, por ejemplo, cambios en la intensidad de fluorescencia, cambios en el espectro de excitación como longitud de onda de excitación de pico o cambios en el espectro de emisión como longitud de onda de emisión de pico.
En una realización no cubierta por la invención reivindicada, el al menos un colorante fluorescente puede incluir un segundo colorante fluorescente que tiñe una propiedad física del material no proteico de una manera que distingue un material no proteico que tiene la propiedad física de un material no proteico que no tiene la propiedad física. Tal como se usa en el presente documento, el término “tiñe” cuando se usa en referencia a un segundo colorante fluorescente una propiedad física del material no proteico se refiere a un segundo colorante fluorescente que absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material no proteico que tiene una determinada propiedad física, emitirá energía lumínica de una determinada longitud de onda sólo cuando esté asociado con material no proteico que tiene una determinada propiedad física, o absorberá energía lumínica de una determinada longitud de onda y emitirá energía lumínica de una longitud de onda diferente sólo cuando esté asociado con material no proteico que tiene una determinada propiedad física. Si un segundo colorante fluorescente se asocia con un material proteico o material no proteico que no tiene la propiedad física, entonces el colorante o bien no absorbe energía lumínica y/o bien no emite energía lumínica, o emite energía lumínica de una manera que un analizador de partículas puede distinguir entre la fluorescencia emitida por el segundo colorante fluorescente asociado con material no proteico que tiene una determinada propiedad física y la fluorescencia emitida por el segundo colorante fluorescente asociado con material proteico o material no proteico que no tiene la propiedad física. Alternativamente, el uso de un primer colorante fluorescente junto con un segundo colorante fluorescente permitirá la detección y distinción de material no proteico que tiene una determinada propiedad física en relación con material proteico en situaciones en las que el colorante fluorescente o bien primero o bien segundo se asocia con un material proteico de una manera que no permite que un analizador de partículas distinga estas dos categorías de material.
En una realización no cubierta por la invención reivindicada, la detección y la distinción de material no proteico que
tiene una determinada propiedad física basándose en la tinción con el segundo colorante fluorescente pueden estar basadas en, por ejemplo, cambios en la intensidad de fluorescencia, cambios en el espectro de excitación como longitud de onda de excitación de pico o cambios en el espectro de emisión como longitud de onda de emisión de pico.
Los ejemplos no limitativos de un segundo colorante fluorescente que tiñe el material proteico que tiene una determinada propiedad física y que puede usarse para distinguir partículas proteicas que tienen una determinada propiedad física de partículas proteicas que no tienen esta determinada propiedad física incluyen cloruro de 4-(3,6-dimetil-1,3-benzotiazol-3-io-2-il)-N,N-dimetilanilina (tioflavina T) y sus derivados incluyendo, por ejemplo, primulina de sodio (tioflavina S) y 4-(1,3-benzotiazol-2-il)-N-metilanilina (BTA-1); un tiofeno y sus derivados basados en oligómeros y polímeros fluorescentes, descritos en, por ejemplo, Peter, et al., Am. J. Pathol. 176: 563 (2010) que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad; cumarina y sus derivados incluyendo, por ejemplo, 3,3'-metanodiilbis(4-hidroxi-2H-cromen-2-ona) (hidroxicumarina), ácido 11-oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H,11H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-carboxílico (cumarina 343) y 9-metil-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H,11H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-11-ona (cumarina 102); 2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-benzo[ij]quinolizina y sus derivados tales como, por ejemplo, (2E)-2-(2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-ilmetiliden)hidrazinacarbotioamida, 9-[(E)-fenildiazenil]-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolina, (2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-ilmetiliden)propanodinitrilo, 9-(2,2-dicianovinil)julolidina (DCVJ) y ácido (2E)-2-ciano-3-(2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)prop-2-enoico (CCVJ), 9-(dietilamino)-5H-benzo[a]fenoxazin-5-ona (rojo Nilo), ácido 3,3'-([1,1'-bifenil]-4,4'-diil)bis(4-aminonaftaleno-1-sulfónico) (rojo Congo) y sus derivados tales como, por ejemplo, [(trans,trans)-1-bromo-2,5-bis-(3-hidroxicarbonil-4-hidroxi)estirilbenceno] (BSB), 4-[(E)-2-[2-bromo-4-[(E)-2-(4-hidroxifenil)vinil]fenil]vinil]fenol (K114), ácido 8-(fenilamino)naftaleno-1-sulfónico (ANS) y sus derivados tales como, por ejemplo, 4,4'-bis(fenilamino)-1,1'-binaftaleno-5,5'-disulfonato de dipotasio (bis-ANS); sal de sodio del ácido bencenosulfónico y sus derivados incluyendo, por ejemplo, sal de sodio del ácido 3-(4-anilinofenilazo)bencenosulfónico (Orange IV), 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH) y sus derivados como ptoluenosulfonato de 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno (TMA-DPH); y diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las longitudes de onda de excitación y emisión de pico para colorantes fluorescentes útiles como segundo colorante fluorescente divulgado en el presente documento se enumeran en la tabla 3. Otros colorantes fluorescentes útiles como segundo colorante fluorescente divulgado en el presente documento son conocidos por un experto en la técnica.
La muestra comprende un patrón de recuento fluorescente. Un patrón de recuento comprende una suspensión calibrada de partículas de cantidad o concentración conocida. Un patrón de recuento se usa para definir el número de partículas en una muestra y permitirá la determinación del número de partículas subvisibles presentes en una muestra. Las partículas pueden tener cualquier forma regular (geométrica) o irregular, pueden prepararse de cualquier material. Para los recuentos absolutos, se añade un volumen específico del patrón de recuento a un volumen específico de muestra, de modo que se conoce la razón de volumen de muestra con respecto a volumen de patrón de recuento. El volumen de muestra analizado puede calcularse a partir del número de acontecimientos de partícula de patrón de recuento, y puede usarse con acontecimientos de partícula de muestra para determinar la concentración. En general, deben adquirirse al menos 1.000 acontecimientos de partícula de patrón de recuento para garantizar una determinación estadísticamente significativa del volumen de muestra. En unos aspectos de esta realización, un método divulgado en el presente documento puede contar, por ejemplo, al menos 1.000, al menos 2.000, al menos 3.000, al menos 4.000, al menos 5.000, al menos 6.000, al menos 7.000, al menos 8.000, al menos 9.000 o al menos 10.000 acontecimientos de partícula de patrón de recuento.
Un patrón de recuento fluorescente incluye partículas que pueden ser fluorescentes a lo largo de un amplio intervalo de longitudes de onda de excitación y emisión. Por ejemplo, un patrón de recuento fluorescente divulgado en el presente documento abarca partículas que pueden emitir en una variedad de espectros, incluyendo ultravioleta, visible (incluyendo violeta, azul, cian, verde, amarillo, naranja y rojo), infrarrojo cercano, infrarrojo medio e infrarrojo lejano.
Las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de excitación en los espectros ultravioleta, visible, infrarrojo cercano, infrarrojo medio o infrarrojo lejano. En un aspecto de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de excitación dentro del intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 800 nm. En un aspecto de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de excitación dentro del intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 635 nm. En unos aspectos de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de excitación en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En aún otros aspectos de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar una longitud de onda de excitación de pico en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En todavía otros aspectos de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar una longitud de onda de excitación de pico de aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 310 nm, de aproximadamente 320 nm, de aproximadamente 330 nm, de aproximadamente 340 nm, de aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 360 nm, de aproximadamente 370 nm, de aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 390 nm, de aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 410 nm, de aproximadamente 420 nm, de aproximadamente 430 nm, de aproximadamente 440 nm, de aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 460 nm, de
aproximadamente 470 nm, de aproximadamente 480 nm, de aproximadamente 490 nm, de aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 5l0 nm, de aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 530 nm, de aproximadamente 540 nm, de aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 560 nm, de aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 580 nm, de aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 610 nm, de aproximadamente 620 nm o de aproximadamente 630 nm.
Las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de emisión en los espectros ultravioleta, visible, infrarrojo cercano, infrarrojo medio o infrarrojo lejano. En un aspecto de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de emisión dentro del intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 800 nm. En un aspecto de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de emisión dentro del intervalo de aproximadamente 385 nm a aproximadamente 800 nm. En unos aspectos de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar un espectro de emisión en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En aún otros aspectos de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar una longitud de onda de emisión de pico en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 420 nm a aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 495 nm, de aproximadamente 460 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 495 nm a aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 520 nm a aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 570 nm a aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 590 nm a aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 620 nm a aproximadamente 750 nm, o de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 800 nm. En todavía otros aspectos de esta realización, las partículas de un patrón de recuento fluorescente útil para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento pueden presentar una longitud de onda de emisión de pico de aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 360 nm, de aproximadamente 370 nm, de aproximadamente 380 nm, de aproximadamente 390 nm, de aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 410 nm, de aproximadamente 420 nm, de aproximadamente 430 nm, de aproximadamente 440 nm, de aproximadamente 450 nm, de aproximadamente 460 nm, de aproximadamente 470 nm, de aproximadamente 480 nm, de aproximadamente 490 nm, de aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 510 nm, de aproximadamente 520 nm, de aproximadamente 530 nm, de aproximadamente 540 nm, de aproximadamente 550 nm, de aproximadamente 560 nm, de aproximadamente 570 nm, de aproximadamente 580 nm, de aproximadamente 590 nm, de aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 610 nm, de aproximadamente 620 nm, de aproximadamente 630 nm, de aproximadamente 640 nm, de aproximadamente 650 nm, de aproximadamente 660 nm, de aproximadamente 670 nm, de aproximadamente 680 nm, de aproximadamente 690 nm, de aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 710 nm, de aproximadamente 720 nm, de aproximadamente 730 nm, de aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 750 nm, de aproximadamente 760 nm, de aproximadamente 770 nm, de aproximadamente 780 nm, de aproximadamente 790 nm o de aproximadamente 800 nm.
Los ejemplos no limitativos de un patrón de recuento incluyen perlas de recuento absoluto COUNTBRIGHT™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), control de recuento CYTO-CAL™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), FLOW CYTOMETRY ABSOLUTE COUNT STANDARD™ (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN), microesferas PERFECT-COUNT™ (Cytognos, S.L., Salamanca) y partículas SPHERO™ AccuCount (Spherotech, Inc., Lake Forest, IL).
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, recopilar datos de al menos un parámetro de dispersión de luz. Un “parámetro” es sinónimo de “variable independiente” y se refiere a cualquiera de las mediciones independientes y simultáneas obtenidas a partir de partículas o células que están analizándose en un analizador de partículas. La combinación de dos o más parámetros, mediante alguna función matemática, se define como generación de otro parámetro. Un parámetro de LS se refiere a una señal de dispersión de luz medida sin especificar ningún ángulo o intervalo de ángulos particular. Los parámetros de dispersión de luz incluyen FLS, dispersión de luz de ángulo lateral (SALS) y dispersión de luz de ángulo inverso (RALS). FLS se refiere a una señal de dispersión de luz medida en un intervalo de ángulos de entre mayor de 0° y menor de 90° con respecto al eje de la luz incidente en la dirección frontal. SALS, también conocida como dispersión de luz ortogonal (OLS) o dispersión de luz de ángulo alto (HALS), se refiere a una señal de dispersión de luz medida a o aproximadamente a 90° con respecto al eje de la luz
incidente, en la dirección frontal. RALS se refiere a una señal de dispersión de luz medida en un intervalo de ángulos de aproximadamente 160°-176° con respecto al eje de la luz incidente, es decir, en una dirección inversa en relación con la dirección frontal de la luz incidente.
La FLS puede subdividirse en dispersión de luz de ángulo bajo (LALS), dispersión de luz de ángulo mediano (MALS), que incluye dispersión de luz de ángulo mediano inferior (LMALS) y dispersión de luz de ángulo mediano superior (UMALS). Dispersión de luz de ángulo bajo (LALS) se refiere a una señal de dispersión de luz medida en un intervalo de ángulos de más de 0° y menos de 9° con respecto al eje de la luz incidente. En aspectos de esta realización, la LALS se mide en un intervalo de ángulos de aproximadamente 3° a aproximadamente 7° con respecto al eje de la luz incidente, en la dirección frontal, o a aproximadamente 5,1° con respecto al eje de la luz incidente, en la dirección frontal.
Dispersión de luz de ángulo mediano (MALS) se refiere a una señal de dispersión de luz medida en un intervalo de ángulos de entre 9° y 70° con respecto al eje de la luz incidente. La dispersión de luz de ángulo mediano inferior (LMALS) se refiere a un subconjunto de MALs , en el que una señal de dispersión de luz se mide en un intervalo de ángulos de aproximadamente 9° a aproximadamente 20° con respecto al eje de la luz incidente. Dispersión de luz de ángulo mediano superior (UMALS) se refiere a un subconjunto de MALS, en el que una señal de dispersión de luz se mide en un intervalo de ángulos de aproximadamente 20° a aproximadamente 70° con respecto al eje de la luz incidente, en la dirección frontal. En unos aspectos de esta realización, la UMALS se mide en un intervalo de ángulos de aproximadamente 20° a aproximadamente 65° con respecto al eje de la luz incidente, en la dirección frontal, o en un intervalo de ángulos de aproximadamente 20° a aproximadamente 42° con respecto al eje de la luz incidente, en la dirección frontal.
Los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz definen el tamaño de una partícula. En un aspecto de esta realización, los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz pueden representar el tamaño de partícula basándose en las partículas presentes en el patrón de tamaño tal como se divulga en el presente documento. En otro aspecto de esta realización, los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz pueden representar el tamaño de partícula basándose en las partículas presentes en una muestra de prueba. En otros aspectos de esta realización, los datos recopilados pueden representar partículas que tienen un tamaño de, por ejemplo, menor de o igual a 0,1 |im, menor de o igual a 0,5 |im, menor de o igual a 0,75 |im, menor de o igual a 1 |im, menor de o igual a 2,5 |im, menor de o igual a 5 |im, menor de o igual a 7,5 |im, menor de o igual a 10 |im, menor de o igual a 25 |im, menor de o igual a 50 |im, menor de o igual a 75 |im, menor de o igual a 100 |im, menor de o igual a 150 |im, menor de o igual a 175 |im, menor de o igual a 200 |im, menor de o igual a 225 |im, menor de o igual a 250 |im, menor de o igual a 275 |im, o menor de o igual a 300 |im. En otros aspectos de esta realización, los datos recopilados pueden representar partículas que tienen un tamaño de entre, por ejemplo, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 50 |im, aproximadamente 0,05 |im y aproximadamente 20 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 200 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 150 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 100 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 75 |im, aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 50 |im, o aproximadamente 0,1 |im y aproximadamente 20 |im.
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, recopilar datos de al menos un parámetro de pérdida de luz. Cuando el haz de luz incidente incide en una partícula, la luz o bien se dispersa o bien se absorbe, ambas de las cuales retiran energía de la luz incidente y el haz incidente se atenúa. Esta atenuación se denomina extinción. Un parámetro de pérdida de luz (LL) se refiere a la cantidad de energía lumínica absorbida (pérdida). La pérdida de luz axial (ALL), también conocida como extinción directa o AL2, se refiere a la disminución en la energía lumínica debida al paso de una partícula a través de un haz de luz incidente y su detección por un fotodetector.
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, recopilar datos de al menos un parámetro de fluorescencia. Los datos de al menos un parámetro de fluorescencia se recopilan como intensidad de fluorescencia, o la cantidad de fotones emitidos a partir de la partícula fluorófora después de la excitación. Los datos recopilados de un parámetro de fluorescencia representan la presencia de un material proteico basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del primer colorante fluorescente divulgado en el presente documento, representan la presencia de un material proteico que tiene la propiedad física basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del segundo colorante fluorescente divulgado en el presente documento y representan el número de partículas basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del patrón de recuento fluorescente divulgado en el presente documento.
En una realización no cubierta por la invención reivindicada, los datos recopilados del al menos un parámetro de fluorescencia pueden incluir un primer parámetro de fluorescencia que representa la presencia de un material no proteico basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del primer colorante fluorescente, un segundo parámetro de fluorescencia que representa el número de partículas basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del patrón de recuento fluorescente y un tercer parámetro de fluorescencia que representa la
presencia de un material no proteico que tiene una determinada propiedad física basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del segundo colorante fluorescente.
Aspectos de la presente memoria descriptiva divulgan, en parte, recopilar datos que no son un parámetro de detección eléctrico. Ejemplos de un parámetro eléctrico pueden ser impedancia de corriente continua (CC), conductividad de radiofrecuencia (RF) y opacidad (OP). La impedancia de CC y la conductividad de RF son parámetros de detección electrónicos que se refieren al principio de Coulter de detección de células por impedancia de apertura. La impedancia de CC se refiere a la información de pico de pulso obtenida a partir de la aplicación de una corriente continua o de baja frecuencia. La amplitud de pico del pulso de CC es una función del volumen de partícula y se produce cuando no fluye ninguna corriente a través de la partícula. La conductividad de RF se refiere a la información de pico de pulso derivada de la medición obtenida a partir de la aplicación de una corriente de alta frecuencia. La RF es una función del volumen de célula y de la conductividad interna y se produce cuando fluye una corriente a través de la partícula. La OP se refiere al dato o valor de señal obtenido mediante la división de una señal de conductividad de RF entre una señal de impedancia de CC. La opacidad es un parámetro de detección eléctrico que no depende del tamaño, pero es una función de la conductividad interna. En una realización, los datos recopilados de una partícula no son un parámetro de detección eléctrico. En un aspecto de esta realización, los datos recopilados de una partícula no son una señal de impedancia de CC. En otro aspecto de esta realización, los datos recopilados de una partícula no son una señal de conductividad de RF. En aún otro aspecto de esta realización, los datos recopilados de una partícula no son una señal de OP.
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, analizar los datos para caracterizar la población de partículas subvisibles en la muestra. Los datos recopilados se almacenan como archivos informáticos. Por ejemplo, los datos correspondientes a una muestra pueden almacenarse como un archivo en modo de lista y/o archivo en histograma. Un archivo en modo de lista contiene un listado completo de todos los acontecimientos correspondientes a todos los parámetros recopilados, tal como especifica un protocolo de adquisición definido por el usuario. Una vez que los datos se han recopilado y escrito en un archivo en modo de lista, los datos pueden reproducirse usando el mismo protocolo de adquisición, o uno diferente, u otro programa diseñado para el análisis de datos de citometría de flujo. Por ejemplo, un protocolo de adquisición puede ajustarse con el fin de definir qué región, selección o parámetro debe analizarse y visualizarse.
Por ejemplo, los datos recopilados pueden analizarse para definir el tamaño de partícula y la presencia de material proteico con el fin de determinar el tamaño y la presencia de partículas subvisibles proteicas. Esto se realiza normalmente empleando la base de datos de selección establecida por un patrón de tamaño para establecer selecciones de intervalos de tamaño definidos que se usan para estimar el tamaño de cada partícula en la muestra de prueba y recopilar datos sobre la distribución de tamaño de todas las partículas en la muestra de prueba. Una vez determinada la distribución de tamaño de las partículas, pueden seleccionarse estos datos basándose en el tamaño y puede analizarse el subconjunto resultante de partículas dimensionadas para determinar la presencia de material proteico. De esta manera, pueden determinarse los datos sobre el tamaño y la presencia de partículas subvisibles proteicas en una muestra. Tales datos pueden visualizarse gráficamente como histograma de un solo parámetro. Una vez determinados, estos datos pueden compararse con el número total de partículas con el fin de definir otras caracterizaciones útiles, incluyendo, por ejemplo, el tamaño y la presencia de partículas subvisibles no proteicas y/o la presencia de partículas visibles. Por ejemplo, para determinar cualitativamente la presencia de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas, se resta el valor de presencia de todas las partículas subvisibles dimensionadas del valor de presencia de partículas subvisibles proteicas dimensionadas. De manera similar, pueden determinarse los datos sobre el tamaño y la presencia de partículas subvisibles no proteicas en una muestra tal como se describió anteriormente, excepto que el subconjunto resultante de partículas dimensionadas se analiza para determinar la presencia de material no proteico.
Los datos que representan el tamaño y la presencia de partículas subvisibles proteicas en una muestra pueden analizarse adicionalmente para definir el número de partículas con el fin de determinar el número absoluto de las partículas subvisibles proteicas dimensionadas. Esto puede lograrse seleccionando los datos que representan el tamaño de partícula y el subconjunto resultante de partículas dimensionadas analizadas para determinar el número de partículas y la presencia de material proteico. De esta manera, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas en una muestra. Tales datos pueden visualizarse gráficamente como histograma de dos parámetros. Una vez determinados, estos datos pueden compararse con el número total de partículas con el fin de definir otras caracterizaciones útiles, incluyendo, por ejemplo, el número, el tamaño y la presencia de partículas subvisibles no proteicas y/o el número y la presencia de partículas visibles. Por ejemplo, para determinar el número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas, se resta el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas. En una realización no cubierta por la invención reivindicada, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto de las partículas subvisibles no proteicas dimensionadas en una muestra tal como se describió anteriormente, excepto que el subconjunto resultante de partículas dimensionadas se analiza para determinar el número de partículas y la presencia de material no proteico.
Los datos que representan el número absoluto, el tamaño y la presencia de partículas subvisibles proteicas en una muestra se analizan adicionalmente para determinar si las partículas subvisibles proteicas, o un subconjunto de las
mismas, tienen una determinada propiedad física con el fin de determinar la fracción de partículas subvisibles proteicas dimensionadas contadas con y sin la propiedad física. Esto puede lograrse seleccionando los datos que representan el tamaño de partícula y el subconjunto resultante de partículas dimensionadas analizadas para determinar el número de partículas y la presencia de material proteico con o sin la propiedad física. De esta manera, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas con y sin una determinada propiedad física en una muestra. Tales datos pueden visualizarse gráficamente como histograma de dos parámetros. En una realización no cubierta por la invención reivindicada, pueden determinarse los datos sobre si las partículas subvisibles no proteicas, o un subconjunto de las mismas, tienen una determinada propiedad física con el fin de determinar la fracción de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas contadas con y sin la propiedad física tal como se describió anteriormente, excepto que el subconjunto resultante de partículas dimensionadas se analiza para determinar el número de partículas y la presencia de material no proteico con o sin la propiedad física.
Como otro ejemplo, los datos recopilados pueden analizarse para definir el tamaño de partícula, el número de partículas y la presencia de material proteico con el fin de determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas. Esto se realiza normalmente empleando la base de datos de selección establecida por un patrón de tamaño para establecer selecciones de intervalos de tamaño definidos que se usan para estimar el tamaño de cada partícula en la muestra de prueba y recopilar datos sobre la distribución de tamaño de todas las partículas en la muestra de prueba. Una vez determinada la distribución de tamaño de las partículas, estos datos pueden seleccionarse basándose en el tamaño y puede analizarse el subconjunto resultante de partículas dimensionadas para determinar el número de partículas y la presencia de material proteico. De esta manera, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas en una muestra. Tales datos pueden visualizarse gráficamente como histograma de dos parámetros. Una vez determinados, estos datos pueden compararse con el número total de partículas con el fin de definir otras caracterizaciones útiles, incluyendo, por ejemplo, el número, el tamaño y la presencia de partículas subvisibles no proteicas y/o el número y la presencia de partículas visibles. Por ejemplo, para determinar el número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas, se resta el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas. Tal como se comentó anteriormente, los datos que representan el número absoluto, el tamaño y la presencia de partículas subvisibles proteicas en una muestra pueden analizarse adicionalmente para determinar si las partículas subvisibles proteicas, o un subconjunto de las mismas, tienen una determinada propiedad física con el fin de determinar la fracción de partículas subvisibles proteicas dimensionadas contadas con y sin la propiedad física. En una realización no cubierta por la invención reivindicada, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles no proteicas en una muestra tal como se describió anteriormente, excepto que el subconjunto resultante de partículas dimensionadas se analiza para determinar el número de partículas y la presencia de material no proteico.
Como otro ejemplo, los datos recopilados pueden analizarse para definir el tamaño de partícula, el número de partículas, la presencia de material proteico y la presencia de una determinada propiedad física con el fin de determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas con y sin la propiedad física. Esto se realiza normalmente empleando la base de datos de selección establecida por un patrón de tamaño para establecer selecciones de intervalos de tamaño definidos que se usan para estimar el tamaño de cada partícula en la muestra de prueba y recopilar datos sobre la distribución de tamaño de todas las partículas en la muestra de prueba. Una vez determinada la distribución de tamaño de las partículas, estos datos pueden seleccionarse basándose en el tamaño y puede analizarse el subconjunto resultante de partículas dimensionadas para determinar el número de partículas y la presencia de material proteico con o sin la propiedad física. De esta manera, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas con y sin una determinada propiedad física en una muestra. Tales datos pueden visualizarse gráficamente como histograma de dos parámetros. En una realización no cubierta por la invención reivindicada, pueden determinarse los datos sobre el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles no proteicas con y sin una determinada propiedad física en una muestra tal como se describió anteriormente, excepto que el subconjunto resultante de partículas dimensionadas se analiza para determinar el número de partículas y la presencia de material no proteico con o sin la propiedad física.
Por tanto, en un aspecto de esta realización, los datos pueden analizarse para definir el tamaño de partícula, el número de partículas, la presencia del material proteico y la presencia de la propiedad física para determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas con y sin la propiedad física, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En todavía otro aspecto de esta realización, los datos pueden analizarse para determinar el número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas restando el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas.
En una realización no cubierta por la invención reivindicada, los datos pueden analizarse para definir el tamaño de partícula y la presencia del material no proteico para determinar el tamaño y la presencia de partículas subvisibles no proteicas, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En otro aspecto de esta realización, los datos pueden analizarse para definir el tamaño de partícula, el número de partículas y la presencia del material no proteico para determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles no proteicas, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En aún otro aspecto de
esta realización, los datos pueden analizarse para definir el tamaño de partícula, el número de partículas, la presencia del material no proteico y la presencia de la propiedad física para determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles no proteicas con y sin la propiedad física, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra. En todavía otro aspecto de esta realización, los datos pueden analizarse para determinar el número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas restando el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos con el fin de facilitar una comprensión más completa de las realizaciones representativas ahora contempladas. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitativos de ninguna de las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva, incluyendo aquellas referentes a los métodos para caracterizar partículas subvisibles.
Ejemplo de preparación 1
Establecimiento de límites de detección del tamaño e intervalos de distribución de tamaño
Para poder establecer intervalos de distribución de tamaño, se preparó una disolución madre de patrón de tamaño a partir del kit de calibración de tamaño Fluoresbright I y II (Polysciences, Inc., Warrington, PA). Esta disolución madre incluía microesferas que tenían diámetros medios de 0,75 |im, 1,0 |im, 2,0 |im, 4,5 |im, 6,0 |im y 10 |im y se preparó según las instrucciones del fabricante.
Se analizó la muestra de prueba preparada usando un analizador de partículas BD LSRFORTESSA™ (Becton Dickinson, San José, CA) equipado con un láser de luz violeta de 405 nm, un láser de luz azul de 488 nm, un láser de luz amarilla/verde de 561 nm y un láser de luz roja de 635 nm; y que tenía dos detectores de dispersión de luz de 488 nm (dispersión frontal de ángulo bajo [FSC] y dispersión lateral a 90° [SSC]) y 16 detectores de fluorescencia. Se ilustraron logarítmicamente la dispersión frontal y la lateral. Se estableció un umbral en la dispersión frontal y la lateral de una manera que incluiría partículas en el gráfico de dispersión frontal frente a dispersión lateral pero aun así excluiría el ruido electrónico. Se analizaron todos los acontecimientos y se registraron durante 120 segundos en la opción del instrumento de flujo de muestra “alto”, o a aproximadamente 60 |il/min. Todos los análisis de datos de citometría de flujo se realizaron usando FACS Diva Software 6.0 (Becton Dickinson, San José, CA) o FlowJo 8.8.6 (Tree Star, Ashland, OR). Para definir diferentes intervalos de tamaño, se establecieron selecciones entre los máximos de pico de cada población de perlas de calibración de tamaño en un histograma de FSC. Los ajustes y las selecciones se almacenaron como plantilla y reutilizaron en diferentes días de análisis después de volverse a verificar con perlas de calibración.
El análisis de los datos indicó que se detectaron partículas de aproximadamente 0,75 |im, aproximadamente 1,0 |im, aproximadamente 2,0 |im, aproximadamente 4,5 |im, aproximadamente 6,0 |im y aproximadamente 10 |im (figura 1A). Los resultados muestran que pueden detectarse y dimensionarse partículas de menos de 200 |im con respecto a un patrón de recuento. El análisis de los datos también permitió la generación de intervalos de distribución de tamaño de partícula de menos de aproximadamente 0,75 |im, de aproximadamente 0,75 |im a aproximadamente 1,0 |im, de aproximadamente 1,0 |im a aproximadamente 2,0 |im, de aproximadamente 2,0 |im a aproximadamente 4,5 |im, de aproximadamente 4,5 |im a aproximadamente 6,0 |im, de aproximadamente 6,0 |im a aproximadamente 10 |im, y de aproximadamente 10 |im a aproximadamente 200 |im (figura 1B) y la colocación de cada partícula detectada en uno de estos intervalos de distribución de tamaño. Estos resultados mostraron que las partículas pueden clasificarse en un intervalo de distribución de tamaño que comprende categorías menores de o iguales a 200 |im.
Ejemplo de preparación 2
Establecimiento de límites de detección del tamaño e intervalos de distribución de tamaño
Para poder establecer intervalos de distribución de tamaño, se preparó una disolución madre de patrón de tamaño a partir del kit de calibración de tamaño Fluoresbright I y II (Polysciences, Inc., Warrington, PA). Esta disolución madre incluía microesferas que tenían diámetros medios de 0,75 |im, 1,0 |im, 2,0 |im, 4,5 |im, 6,0 |im y 10 |im y se preparó según las instrucciones del fabricante.
Se analizó la muestra de prueba preparada usando un analizador de partículas BD FACSARIAIII™ (Becton Dickinson, San José, CA) equipado con un láser de luz violeta de 405 nm, un láser de luz azul de 488 nm y un láser de luz roja de 633 nm; y que tenía dos detectores de dispersión de luz de 488 nm (dispersión frontal de ángulo bajo [FSC] y dispersión lateral a 90° [SSC]) y 11 detectores de fluorescencia. Se ilustraron logarítmicamente la dispersión frontal y la lateral. Se estableció un umbral en la dispersión frontal y la lateral de una manera que incluiría partículas en el gráfico de dispersión frontal frente a dispersión lateral pero aun así excluiría el ruido electrónico. Se analizaron
todos los acontecimientos y se registraron durante 300 segundos de ejecución siempre a la misma baja velocidad de flujo de muestra (usando una velocidad de flujo de Diva Software de 2). Todos los análisis de datos de citometría de flujo se realizaron usando FACS Diva Software 6.0 (Becton Dickinson, San José, CA) o FlowJo 8.8.6 (Tree Star, Ashland, OR). Para definir diferentes intervalos de tamaño, se establecieron selecciones entre los máximos de pico de cada población de perlas de calibración de tamaño y el extremo de los ejes en un histograma de FSC. Los ajustes y las selecciones se almacenaron como plantilla y reutilizaron en diferentes días de análisis después de volverse a verificar con perlas de calibración.
El análisis de los datos indicó que se detectaron partículas de aproximadamente 0,75 |im, aproximadamente 1,0 |im, aproximadamente 2,0 |im, aproximadamente 4,5 |im, aproximadamente 6,0 |im y aproximadamente 10 |im (figura 2A). Los resultados muestran que pueden detectarse y dimensionarse partículas de menos del diámetro de los tubos de muestra (es decir, menos de 200 |im) usados en el citómetro de flujo. Los resultados muestran que pueden detectarse y dimensionarse partículas de menos de 200 |im con respecto a un patrón de recuento. El análisis de los datos también permitió la generación de intervalos de distribución de tamaño de partícula de menos de aproximadamente 0,75 |im, de aproximadamente 0,75 |im a aproximadamente 1,0 |im, de aproximadamente 1,0 |im a aproximadamente 2,0 |im, de aproximadamente 2,0 |im a aproximadamente 4,5 |im, de aproximadamente 4,5 |im a aproximadamente 6,0 |im, de aproximadamente 6,0 |im a aproximadamente 10 |im, y de desde 10 |im hasta aproximadamente el límite superior de detección, que lo determina el diámetro de los tubos de muestra (alrededor de 200 |im) (figura 2B) y la colocación de cada partícula detectada en uno de estos intervalos de distribución de tamaño. Estos resultados mostraron que las partículas pueden clasificarse en un intervalo de distribución de tamaño que comprende categorías menores de o iguales a 200 |im.
Ejemplo de preparación 3
Detección, recuento y determinación de la distribución de tamaño de partículas
Para preparar una muestra de prueba, se añadieron 50 |il (aproximadamente 49.500 microesferas) de perlas de recuento absoluto COUNTBRIGHT™ (Invitrogen, Life Technologies Ltd., Paisley, Gran Bretaña) a 450 |il de una muestra de partículas que incluía 50 |ig/ml de agregados del péptido amiloide p 1-42.
Se analizó la muestra de prueba preparada usando un analizador de partículas BD LSRFORTESSA™ (Becton Dickinson, San José, CA) tal como se describió en el ejemplo de preparación 1. Se usaron los ajustes, los umbrales y las selecciones almacenados determinados por el patrón de tamaño en el ejemplo de preparación 1 como plantilla para los intervalos de distribución de tamaño. Todos los acontecimientos se analizaron, registraron y evaluaron tal como se describió en el ejemplo de preparación 1. Cada muestra se evaluó tres veces y se calcularon un valor medio y desviaciones estándar de los tres resultados. Se analizó en paralelo una muestra de control que comprendía tampones de formulación para registrar la señal de fondo para la muestra de prueba correspondiente. Se restaron las señales de fondo de la señal de muestra en los análisis finales.
El análisis de los datos determinó el número de partículas en la muestra y la colocación de cada partícula en un intervalo de distribución de tamaño especificado (figuras 3A, 3B y 3C). Estos resultados muestran que las partículas proteicas pueden detectarse, contarse y clasificarse en un intervalo de distribución de tamaño que comprende categorías menores de o iguales a 200 |im.
Ejemplo 1 (no es según la invención reivindicada)
Diferenciación y recuento de partículas proteicas y no proteicas
En este experimento se prepararon tres muestras de prueba de 450 |il. La primera muestra de prueba incluía 25 |ig/ml de agregados de péptido amiloide p 1-42 (partículas proteicas), la segunda muestra de prueba incluía microesferas de látex polidispersas (partículas no proteicas) y la tercera muestra de prueba incluía una mezcla de tanto agregados de péptido amiloide p 1-42 como microesferas de látex polidispersas (micropartículas Polybead transparentes de PMMA de 1-10 |im; Polysciences, Inc., Warrington, PA). A las tres muestras se les añadieron 50 |il (aproximadamente 49.500 microesferas) de perlas de recuento absoluto COUNTBRIGHT™ (Invitrogen, Life Technologies Ltd., Paisley, Gran Bretaña) según las instrucciones del fabricante. A esta mezcla, se le añadió 1x SYPRO™ Orange (SO) (Invitrogen, Life Technologies Ltd., Paisley, Gran Bretaña).
Se analizaron las muestras de prueba preparadas usando un analizador de partículas BD LSRFORTESSA™ (Becton Dickinson, San José, CA) tal como se describió en el ejemplo de preparación 1. Se usaron los ajustes, los umbrales y las selecciones almacenados determinados por el patrón de tamaño en el ejemplo de preparación 1 como plantilla para los intervalos de distribución de tamaño. Se detectó la intensidad de fluorescencia de partículas teñidas con 1x SYPRO™ Orange (SO) usando un láser de luz azul con filtro de paso de banda de 530/30. Todos los acontecimientos se analizaron, registraron y evaluaron tal como se describió en el ejemplo de preparación 3. Se analizó en paralelo una muestra de control que comprendía tampones de formulación para registrar la señal de fondo para la muestra de prueba correspondiente. Se restaron las señales de fondo de la señal de muestra en los
análisis finales.
El análisis de los datos determinó tanto el número de partículas no proteicas en la muestra y la colocación de cada partícula en un intervalo de distribución de tamaño especificado (figura 4A), así como el número de partículas proteicas en la muestra y la colocación de cada partícula en un intervalo de distribución de tamaño especificado (figura 4B). Estos resultados muestran que tanto las partículas no proteicas como las proteicas pueden detectarse, contarse y clasificarse en un intervalo de distribución de tamaño que comprende categorías menores de o iguales a 200 |im. El análisis de los datos también detectó y diferenció partículas proteicas en relación con partículas no proteicas basándose en la tinción con SYPRO™ Orange (figura 4C) y permitió la comparación de partículas proteicas frente a partículas no proteicas (figura 4D). Estos resultados también permitieron la determinación de los números absolutos de partículas proteicas y no proteicas en la muestra (figura 4E). Estos resultados muestran que puede determinarse la evaluación tanto cualitativa como cuantitativa de partículas proteicas y no proteicas en una muestra.
Ejemplo 2
Caracterización de partículas subvisibles proteicas
Se preparó una muestra de prueba de partículas proteicas y no proteicas tal como se describió en el ejemplo de preparación 3, excepto que se añadió tioflavina T (ThT) a una concentración de 4 |iM a estas muestras.
Se analizó la muestra de prueba preparada usando un analizador de partículas BD LSRFORTESSA™ (Becton Dickinson, San José, CA) tal como se describió en el ejemplo de preparación 1. Se usaron los ajustes, los umbrales y las selecciones almacenados determinados por el patrón de tamaño en el ejemplo de preparación 1 como plantilla para los intervalos de distribución de tamaño. Se detectó la intensidad de fluorescencia usando un láser de luz violeta con un filtro de paso de banda de 525/50 y un láser de luz azul con un filtro de paso de banda de 530/30. Todos los acontecimientos se analizaron, registraron y evaluaron tal como se describió en el ejemplo de preparación 2. Se analizó en paralelo una muestra de control que comprendía tampones de formulación para registrar la señal de fondo para la muestra de prueba correspondiente. Se restaron las señales de fondo de la señal de muestra en los análisis finales.
El análisis de los datos detectó y diferenció las partículas proteicas de las partículas no proteicas basándose en la tinción con SYPRO™ Orange (figura 5A) y detectó y diferenció partículas proteicas que tenían una estructura de lámina p de las partículas proteicas que carecían de esta estructura (figura 5B). Estos resultados también permitieron la identificación de partículas proteicas que tenían una estructura de lámina p en la muestra (figura 5C). Estos resultados también permitieron la determinación de los números absolutos de partículas no proteicas, partículas proteicas que carecían de una estructura de lámina p y partículas proteicas que tenían una estructura de lámina p (figura 5D). Estos resultados muestran que puede determinarse la evaluación tanto cualitativa como cuantitativa de partículas no proteicas y proteicas con y sin una determinada propiedad física en una muestra.
Ejemplo 3
Detección y caracterización de partículas subvisibles usando un panel de flujo multicolor
En este experimento se prepararon dos muestras de prueba de 200 pl. La primera muestra de prueba incluía 195 |il de una mezcla de partículas no proteicas; la segunda muestra de prueba incluía 30 |il de 0,1 mg/ml de perlas de vidrio de 3-10 |im como partículas no proteicas (perlas de vidrio de 3-10 micrómetros, Polysciences, Inc., Warrington, PA) y 165 |il de una mezcla de partículas subvisibles de péptido Ap 1-42 y partículas subvisibles proteicas que contenían bajas cantidades de estructuras p cruzadas. A todas las muestras se les añadieron bis-ANS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a una concentración final de 20 |iM y DCVJ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a una concentración final de 5 |iM.
Se analizaron las muestras de prueba preparadas usando un analizador de partículas BD FACSARIAIII™ (Becton Dickinson, San José, CA) tal como se describió en el ejemplo de preparación 2. Se usaron los ajustes, los umbrales y las selecciones almacenados determinados por el patrón de tamaño en el ejemplo de preparación 2 como plantilla para los intervalos de distribución de tamaño. Todos los acontecimientos se analizaron, registraron y evaluaron tal como se describió en el ejemplo de preparación 2. Cada muestra se evaluó tres veces y se calcularon un valor medio y desviaciones estándar de los tres resultados. Se analizó en paralelo una muestra de control que comprendía tampones de formulación para registrar la señal de fondo para la muestra de prueba correspondiente. Se restaron las señales de fondo de la señal de muestra en los análisis finales.
El análisis de la muestra 1 que sólo contenía partículas no proteicas permitió el establecimiento de selecciones para determinar partículas que no contienen proteína. Esta selección se almacenó y usó para el análisis de la muestra 2 que contenía una mezcla de partículas no proteicas, partículas que contienen proteína y partículas similares a amiloide. El análisis de los datos de la muestra 2 detectó y diferenció las partículas proteicas de las partículas no proteicas basándose en la tinción con bis-ANS y detectó y diferenció partículas proteicas que tenían una estructura
de lámina p de las partículas proteicas que carecían de esta estructura usando DCVJ. Esta estrategia de selección se muestra en la figura 6A adjunta. Los resultados obtenidos a partir de la muestra 2 muestran que las partículas subvisibles proteicas pueden detectarse y diferenciarse de las partículas proteicas y no proteicas usando bis-ANS, y pueden caracterizarse adicionalmente por contener estructuras p cruzadas usando DCVJ (figuras 6B-6E). En primer lugar se representaron gráficamente los datos de muestra en dispersión frontal frente a dispersión lateral para detectar partículas subvisibles dentro de la muestra (figura 6B adjunta). Luego se usó bis-ANS como colorante específico de proteína para diferenciar entre partículas que contienen proteína y que no contienen proteína (figura 6C adjunta). Las partículas que contienen proteína se caracterizaron adicionalmente usando DCVJ que se une específicamente a estructuras p cruzadas y permite la identificación de partículas proteicas similares a amiloide (figura 6D adjunta). También se realizó un análisis de retroselección de partículas que contienen proteína y que no contienen proteína tal como se muestra en la figura 6E.
En conclusión, debe entenderse que aunque se destacan aspectos de la presente memoria descriptiva haciendo referencia a realizaciones específicas, un experto en la técnica apreciará fácilmente que estas realizaciones divulgadas son sólo ilustrativas de los principios del objeto divulgado en el presente documento. Por tanto, debe entenderse que el objeto divulgado no está limitado en modo alguno a la metodología, al protocolo y/o al reactivo, etc., particulares descritos en el presente documento. Por último, la terminología usada en el presente documento tiene el único propósito de describir realizaciones particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención no se limita precisamente a lo que se muestra y describe.
En el presente documento se describen determinadas realizaciones de la presente invención, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, variaciones en estas realizaciones descritas resultarán evidentes para los expertos habituales en la técnica tras la lectura de la descripción anterior. El inventor espera que los expertos en la técnica empleen tales variaciones según sea apropiado, y los inventores pretenden que la presente invención se ponga en práctica de otro modo distinto al descrito específicamente en el presente documento. Además, cualquier combinación de las realizaciones anteriormente descritas en todas las posibles variaciones de las mismas queda abarcada por la invención a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente de otro modo por el contexto.
Las agrupaciones de realizaciones, elementos o etapas alternativos de la presente invención no deben interpretarse como limitaciones. Puede hacerse referencia a cada miembro de grupo y reivindicarse individualmente o en cualquier combinación con otros miembros de grupo divulgados en el presente documento. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo pueden incluirse en, o eliminarse de, un grupo por motivos de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce tal inclusión o eliminación, se considera que la memoria descriptiva contiene el grupo tal como se modifica, cumpliendo así la descripción escrita de todos los grupos de Markush usados en las reivindicaciones adjuntas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa que la característica, el elemento, la cantidad, el parámetro, la propiedad o el término así calificado abarca un intervalo de más o menos el diez por ciento por encima y por debajo del valor de la característica, el elemento, la cantidad, el parámetro, la propiedad o el término indicado. Cada indicación numérica debe interpretarse al menos a la luz del número de cifras significativas notificadas y aplicando técnicas habituales de redondeo. A pesar de que los intervalos y valores numéricos que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los intervalos y valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se notifican con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier intervalo o valor numérico contiene inherentemente determinados errores que resultan necesariamente de la desviación estándar hallada en sus respectivas mediciones de prueba. Se pretende que la recitación de intervalos numéricos de valores en el presente documento sirva simplemente como método abreviado para referirse individualmente a cada valor numérico por separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual de un intervalo numérico se incorpora a la presente memoria descriptiva como si se recitara individualmente en el presente documento.
Debe interpretarse que los términos “un”, “uno/a”, “el/la” y referentes similares usados en el contexto de describir la presente invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos, o el lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”), proporcionado en el presente documento simplemente aclare mejor la presente invención y no suponga ninguna limitación en el alcance de la invención reivindicada de otro modo. Ningún lenguaje en la presente memoria descriptiva debe interpretarse como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la puesta en práctica de la invención.
Las realizaciones específicas divulgadas en el presente documento pueden limitarse adicionalmente en las reivindicaciones que usan el lenguaje que consiste en o que consiste esencialmente en. Cuando se usa en las reivindicaciones, ya sea tal como se presentó o añadió por enmienda, el término de transición “que consiste en”
excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en las reivindicaciones. El término de transición “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o a las etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y nueva(s). Las realizaciones de la presente invención así reivindicada se describen y facultan de manera inherente o expresa en el presente documento.
Claims (14)
- REIVINDICACIONESi. Método para caracterizar una población de partículas subvisibles en una preparación farmacéutica, comprendiendo el método las etapas de:a) calibrar un analizador de partículas usando un patrón de tamaño;b) explorar la muestra a medida que la muestra pasa a través de una zona de detección del analizador de partículas, comprendiendo la muestra un patrón de recuento fluorescente y una pluralidad de colorantes fluorescentes que comprende un primer colorante fluorescente y un segundo colorante fluorescente, en el que la preparación farmacéutica comprende un material proteico que es un principio activo farmacéutico, un adyuvante o un excipiente,en el que la exploración incluye una o más longitudes de onda que pueden explorar el patrón de tamaño, explorar o excitar el patrón de recuento fluorescente y explorar o excitar la pluralidad de colorantes fluorescentes, yen el que el primer colorante fluorescente tiñe el material proteico de una manera que distingue el material proteico de un material no proteico y el segundo colorante fluorescente tiñe un subconjunto del material proteico que tiene una propiedad física del material proteico de una manera que distingue el material proteico que tiene la propiedad física del material proteico que no tiene la propiedad física, y la exploración incluye una o más longitudes de onda que pueden excitar el segundo colorante fluorescente;c) recopilar datos de al menos un parámetro de dispersión de luz y al menos un parámetro de fluorescencia, en el que los datos recopilados del al menos un parámetro de dispersión de luz representan un tamaño de partícula basándose en la calibración de patrón de tamaño, yen el que los datos recopilados del al menos un parámetro de fluorescencia incluyen un primer parámetro de fluorescencia que representa la presencia del material proteico basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del primer colorante fluorescente, un segundo parámetro de fluorescencia que representa el número de partículas basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del patrón de recuento fluorescente y un tercer parámetro de fluorescencia que representa la presencia del material proteico que tiene la propiedad física basándose en la intensidad de fluorescencia emitida a partir del segundo colorante fluorescente; yd) analizar los datos para definir el tamaño de partícula, el número de partículas, la presencia del material proteico con el fin de determinar el número absoluto y el tamaño de partículas subvisibles proteicas y la presencia de la propiedad física con el fin de determinar una fracción de partículas subvisibles proteicas dimensionadas contadas con o sin la propiedad física, caracterizando de ese modo la población de partículas subvisibles en la muestra,en el que la detección, el recuento y la caracterización de la población de partículas subvisibles son simultáneos.
- 2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de análisis de datos comprende además determinar el número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas restando el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas.
- 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el primer colorante fluorescente es un colorante de estirilo, un colorante de merocianina, 3-(2-benzotiazolil-7-(dietilamino)-cumarina (BTDEC), 3-(2-bencimidazolil)-7-(dietilamino)-cumarina (BIDEC), 3-(2-bencimidazolil)-7-cumarina (BIC), 3-(2-bencimidazolil)-7-(dipropilamino)-cumarina (BIDPC), 3-(2-benzoxazolil)-7-(dietilamino)-cumarina (BODEC), 3-(6-metil-2-benzoxazolil)-7-(dietilamino)-cumarina (MBODEC), 3-(dietilamino)-7-imino-7H-(1)benzopirano(3',2':3,4)pirido(1,2-a)bencimidazol-6-carbonitrilo (DIBPBC), 3-(dietilamino)-7-oxo-7H-(1)benzopirano(3',2':3,4) (DOBPBC), difluoruro de dipirrometenoboro, un complejo metálico fotoluminiscente o una hidroxiquinolona.
- 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de análisis de datos comprende además determinar el número absoluto de partículas subvisibles no proteicas dimensionadas restando el número absoluto de todas las partículas subvisibles dimensionadas del número absoluto de partículas subvisibles proteicas dimensionadas.
- 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer colorante fluorescente o el patrón de recuento fluorescente tiene una longitud de onda de excitación de fluorescencia de pico de entre aproximadamente 300 nm y aproximadamente 635 nm y una longitud de onda de emisión de fluorescencia de pico de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 800 nm.
- 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la propiedad física es una característica estructural tal como una estructura de hélice a , una estructura de lámina p o una escisión peptídica o modificación química tal como una acilación, una adenililación, una alquilación, una amidación, una glicación, una glicosilación, una glipiación, una isoprenilación, una miristoilación, una palimoilación, una pegilación, una fosforilación, una prenilación, una sulfatación o una ubiquitinación.
- 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el segundo colorante fluorescente tiene una longitud de onda de excitación de fluorescencia de pico de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 635 nm y una longitud de onda de emisión de fluorescencia de pico de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 800 nm.
- 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el principio activo farmacéutico es ADAMTS-13, antiplasmina a 1, antiplasmina a2, antitrombina, antitrombina III, procoagulante del cáncer, eritropoyetina, factor II, factor IIa, factor V, factor Va, factor VI, factor VIa, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor Xla, factor XII, factor Xlla, factor XIII, factor XIIIa, fibronectina, fibrinógeno (factor I), cofactor de heparina II, quininógeno de alto peso molecular (HMWK), inmunoglobulina intramuscular, inmunoglobulina intravenosa, plasmina, plasminógeno, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI1), inhibidor del activador de plasminógeno 2 (PAI2), precalicreína, prostaciclina, proteína C, proteína activa C (APC), proteína S, proteína Z, inhibidor de proteasas relacionado con la proteína Z, trombomodulina, factor tisular (factor III), inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI), activador tisular del plasminógeno (t-PA), urocinasa, factor de von Willebrand, abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, brentuximab vedotina, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicina, golimumab, ibritumomab tiuxetán, infliximab, ipilimumab, motavizumab, muronomab, natalizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, raxibacumab, rituximab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab o ustekinumab.
- 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los datos de un parámetro de detección eléctrico no se recopilan mediante el analizador de partículas.
- 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el parámetro de detección eléctrico es impedancia de CC, conductividad de RF, opacidad o una combinación de las mismas.
- 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el segundo colorante fluorescente es cloruro de 4-(3,6-dimetil-1,3-benzotiazol-3-io-2-il)-N,N-dimetilanilina (tioflavina T), primulina de sodio (tioflavina S), 4-(1,3-benzotiazol-2-il)-N-metilanilina (BTA-1), un colorante oligomérico y polimérico a base de tiofeno, cumarina, 3,3'-metanodiilbis(4-hidroxi-2H-cromen-2-ona) (hidroxicumarina), ácido 11-oxo-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H,11H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-10-carboxílico (cumarina 343), 9-metil-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H,11H-pirano[2,3-f]pirido[3,2,1-ij]quinolin-11-ona (cumarina 102), 2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-benzo[ij]quinolizina, (2E)-2-(2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-ilmetiliden)hidrazinacarbotioamida, 9-[(E)-fenildiazenil]-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolina, (2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-ilmetiliden)propanodinitrilo, 9-(2,2-dicianovinil)julolidina (DCVJ), ácido (2E)-2-ciano-3-(2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)prop-2-enoico ( C c V J ) , 9-(dietilamino)-5H-benzo[a]fenoxazin-5-ona (rojo Nilo), ácido 3,3'-([1,1'-bifenil]-4,4'-diil)bis(4-aminonaftaleno-1-sulfónico) (rojo Congo), [(trans,trans)-1-bromo-2,5-bis-(3-hidroxicarbonil-4-hidroxi)estirilbenceno] (BSB), 4 [(E)-2-[2-bromo-4-[(E)-2-(4-hidroxifenil)vinil]fenil]vinil]fenol (K114), ácido 8-(fenilamino)naftaleno-1-sulfónico (ANS), 4,4'-bis(fenilamino)-1,1'-binaftaleno-5,5'-disulfonato de dipotasio (bis-ANS), sal de sodio del ácido bencenosulfónico, sal de sodio del ácido 3-(4-anilinofenilazo)bencenosulfónico (Orange IV), 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), p-toluenosulfonato de 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno (TMA-DPH) o diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
- 12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el tamaño de partícula basándose en la calibración de patrón de tamaño comprende tamaños menores de o iguales a 10 |i m, menores de o iguales a 20 |i m, menores de o iguales a 50 |i m, menores de o iguales a 75 |i m, menores de o iguales a 100 |i m, menores de o iguales a 200 |i m o menores de o iguales a 300 |i m.
- 13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la propiedad física es una característica estructural o una modificación química.
- 14. Método según la reivindicación 13, en el que la característica estructural es una estructura de hélice a , una estructura de lámina p o una escisión peptídica.
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