ES2924039T3 - Acidos nucleicos, péptidos y métodos - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico novedosas que codifican polipéptidos novedosos para su uso en el tratamiento de enfermedades de poliglutamina tales como la enfermedad de Huntington. Los polipéptidos de la invención exhiben una inmunotoxicidad reducida in vivo y pueden tener utilidad en la expresión sostenida (mediana o larga duración) in vivo. También se describen métodos para el tratamiento de enfermedades de poliglutamina, como la enfermedad de Huntington y el uso de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en terapia médica. También se describen métodos y composiciones de terapia génica, tales como vectores AAV para uso en métodos de terapia génica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos, péptidos y métodos
Campo técnico
La presente invención se refiere a nuevas construcciones de péptidos de dedo de cinc y de ácidos nucleicos que tienen propiedades deseables, y a métodos para fabricar y utilizar dichas construcciones, en particular, para la represión de la expresión de un gen diana. La invención también se refiere a nuevas secuencias promotoras/potenciadoras para la expresión prolongada de transgenes. Más particularmente, la invención se refiere a proteínas represoras transcripcionales de dedos de cinc y a sus secuencias de ácido nucleico codificantes que tienen secuencias compatibles con el hospedador para la expresión prolongada de transgenes en aplicaciones terapéuticas, como en el tratamiento de trastornos neurológicos.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de vectores de terapia génica cada vez más seguros, con inmunogenia reducida (Basner-Tschakarjan et al. (2014) Frontiers in Immunology), baja capacidad de inserción (Papayannakos y Daniel (2012) Gene Ther. 20: 581­ 8), y nuevas y más eficaces estrategias de administración (Sillay et al. (2013) Stereotact Fund Neurosurg. 91: 153­ 161; Yin et al. (2013) Cancer Gene Ther. 20: 336-41), ha dado lugar a varios ensayos clínicos exitosos. Algunos ejemplos incluyen una terapia contra la leucodistrofia metacromática (insertando la enzima funcional arilsulfatasa A en células hematopoyéticas) (Biffi et al. (2013) Science. 341: 1233158), y un avance en el tratamiento del SIDA que promete una "cura funcional" del VIH (Tebas et al. (2014) N. Engl. J. Med. 370: 901-910). En este último estudio se empleó la tecnología de las nucleasas de dedos de cinc sintéticas (Isalan M. (2011) Nat. Methods. 9: 32-34), con el objetivo a suprimir génicamente el receptor CCR5 en los linfocitos T CD4, ex vivo. Las células modificadas con nucleasas se trasplantaron de forma autóloga a los pacientes, logrando una reducción de la viremia sin medicamentos. La tecnología de nucleasas de sitio específico es altamente escalable y, con la llegada de nucleasas programables de ARN vectorizables como los lentivirus CRISPR/Cas9 (Shalem et al. (2014) Science. 343: 84-87), se está produciendo una revolución en la edición del genoma.
A pesar de este progreso, cada vez está más claro que el sistema inmunitario del hospedador es una barrera importante para el éxito de las terapias a largo plazo. En algunos casos, incluidos algunos de los ejemplos anteriores, las células pueden tratarse ex vivo, o con una única y breve intervención. Sin embargo, en muchas enfermedades esto no es posible; en cambio, es necesario modificar la expresión de los genes de la enfermedad in vivo. En este sentido, los sistemas CRISPR/Cas son de origen bacteriano, por lo que los problemas de inmunogenia pueden limitar significativamente su eficacia en las terapias para mamíferos, especialmente las que requieren pautas posológicas repetitivas o sostenidas. Incluso las nucleasas de dedos de cinc utilizan dominios de nucleasas bacterianos (Fokl (Bibikova et al. (2001) Mol. Cell Biol. 21: 289-297)), por lo que no está claro cómo se tolerarían in vivo.
Los efectos inmunológicos son especialmente relevantes cuando se consideran las terapias génicas para las enfermedades neurológicas, es decir, las que afectan al sistema nervioso central (cerebro y médula espinal), el sistema nervioso periférico (nervios periféricos y nervios craneales), y el sistema nervioso autónomo (cuyas partes se encuentran tanto en el sistema nervioso central como en el periférico).
Se han identificado más de 600 enfermedades neurológicas en seres humanos, que en conjunto afectan a todas las funciones del organismo, incluida la coordinación, la comunicación, la memoria, el aprendizaje, la alimentación y en algunos casos la mortalidad. Aunque muchos tejidos y órganos de los animales son capaces de autorrepararse, generalmente el sistema neurológico no lo es. Por lo tanto, los trastornos neurológicos suelen ser neurodegenerativos, caracterizados por un empeoramiento progresivo de los síntomas, que comienzan con problemas menores que permiten su detección y diagnóstico, pero que progresivamente son más graves hasta, en algunos casos, la muerte del paciente.
Se dispone de tratamientos para algunas de estas enfermedades, que pueden aliviar los síntomas y/o prolongar la supervivencia. Sin embargo, a pesar de los intensos esfuerzos de investigación, para la mayoría de los trastornos neurológicos, y en particular para las enfermedades más graves, todavía no hay cura.
En este sentido, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas requieren la corrección de una o más mutaciones in vivo, directamente en el tejido afectado, o la expresión sostenida de factores terapéuticos (Agustín-Pavón e Isalan (2014) BioEssays 36: 979-990), p. ej., para alterar los niveles de expresión génica. Dado que el cerebro tiene una capacidad de regeneración limitada y una conectividad compleja, el tejido no puede ser simplemente retirado, reparado y reimplantado.
Además, una colección de artículos recientes ha demostrado respuestas inmunitarias retardadas cuando se inyectan proteínas extrañas de vectores AAV en el parénquima cerebral (Ciesielska et al. (2013) Mol. Ther 21: 158-166; Hadaczek et al. (2009) Hum. Gene Ther 20: 225-237; Samaranch et al. (2014) Mol. Ther. 22: 329-337). Sorprendentemente, a pesar del entorno inmunitario privilegiado del cerebro, se ha demostrado que incluso la GFP induce una fuerte respuesta inflamatoria e inmunitaria tanto en ratas como en monos (Ciesielska et al. (2013) Mol. Ther. 21: 158-166; Hadaczek et al. (2009) Hum. Gene Ther. 20: 225-237). De forma similar, una enzima humana con posible uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson tiene efectos no deseados en ratas (Ciesielska et al.
(2013) Mol. Ther. 21: 158-166). En este caso, utilizando el vector AAV9, que es capaz de infectar tanto a las neuronas como a células gliales, la muerte neuronal comenzó tan pronto como 3 semanas después de la inyección. Por lo tanto, aunque se están desarrollando una serie de herramientas de biología sintética de nueva generación para las enfermedades (neuro)degenerativas (Agustín-Pavón e Isalan (2014) BioEssays 36: 979-990), el cerebro sigue siendo una diana difícil para la terapia génica. Por lo tanto, existe una clara necesidad de mejorar los agentes terapéuticos y los métodos para tratar las enfermedades neurológicas.
Los conocimientos actuales sobre los trastornos neurológicos muestran que pueden estar causados por muchos factores diferentes, entre los que se incluyen (pero sin limitación): anomalías genéticas hereditarias, problemas en el sistema inmunitario, lesión en el cerebro o en el sistema nervioso, o diabetes. Una de las causas conocidas del trastorno neurológico es una anomalía genética que da lugar a la expansión patológica de las repeticiones de CAG en determinados genes, que dan lugar a tractos de poliglutamina (poliQ) extendidos en los productos génicos mutados expresados (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228). Se cree que las proteínas resultantes se agregan y causan enfermedades tóxicas de ganancia de función, entre las que se incluyen ataxias espinocerebelosas, atrofia muscular espinobulbar y enfermedad de Huntington (Orr y Zoghbi (2007) Annu. Rev. Neurosci. 30: 575-621; Cha (2007) Prog. Neurobiol. 83(4): 228-248).
La neuropatología de la enfermedad de Huntington (EH) está asociada a la muerte selectiva de células neuronales, principalmente de las neuronas medianas espinosas del caudado y del putamen y, en menor medida, neuronas corticales, que da lugar a la disfunción cognitiva y a la corea (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228; y Kumar et al. Pharmacol. Rep. 62(1): 1-14). Desde el descubrimiento en 1993 de que el gen h ttprovoca la EH (The-Huntington's-Disease-Collaborative-Research-Group (1993) Cell 72(6): 971-983), se ha prestado mucha atención a cómo el número de repeticiones de CAG asociado al gen htt puede afectar a la patología y la progresión de esta enfermedad. Normalmente, el número de repeticiones de CAG en el gen htt de tipo silvestre oscila entre 10 y 29 (con una mediana de 18), mientras que en los pacientes con EH suele estar en el intervalo de 36 a 121 (con una mediana de 44). Además, también se ha demostrado que la edad de inicio de la enfermedad de la EH está correlacionada con el número de repeticiones de CAG (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228; y Kumar et al. Pharmacol. Rep. 62(1): 1-14).
Aunque se ha investigado mucho sobre la cura de la EH, los tratamientos disponibles actualmente solo tratan los síntomas de la enfermedad, por lo que todavía no hay forma de detener o retrasar la aparición o la progresión de la EH (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228; y Kumar et al. Pharmacol. Rep. 62(1): 1-14). Por esta razón, sería muy deseable contar con un tratamiento para la EH que abordara la causa y no los síntomas de la enfermedad.
Se ha demostrado que la interferencia de ARN (iARN) reduce la expresión de htt mutante (van Bilsen et al. (2008) Hum. Gene Ther. 19(7): 710-719; Zhang et al. (2009) J. Neurochem. 108(1): 82-90; Pfister et al. (2009) Curr. Biol.
19(9): 774-778). Sin embargo, aunque se ha demostrado que la iARN es una herramienta muy potente, el éxito de esta técnica depende de la búsqueda de polimorfismos de un solo nucleótido o de deleción que diferencien entre los alelos mutantes y de ts, y éstos a menudo difieren de un paciente a otro. La aparente necesidad de diseños de ARNpi personalizados plantea actualmente retos para los ensayos clínicos y la autorización de su uso en seres humanos.
En un planteamiento más general, Hu et al. utilizaron oligómeros antisentido de ácido peptidonucleico (APN) y de ácido nucleico bloqueado (ANB), para dirigirse a las repeticiones de CAG expandidas de los genes ataxina-3 y htt (Hu et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27(5): 478-484; Hu et al. (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1175: 24-31). Informaron de la inhibición selectiva del alelo mutante con ácidos peptidonucleicos (APN) durante un máximo de 22 días. Aunque estos resultados eran prometedores, los ANP no se pueden administrar al sistema nervioso central. Por lo tanto, los autores también probaron los ácidos nucleicos bloqueados (ANB), que quizá sean más adecuados para su uso in vivo. Aunque se observó una inhibición selectiva del alelo mutante, solo se observó una inhibición de hasta el 30 % de htt de ts en la concentración más alta y eficaz de ANB utilizada.
Los presentes autores han informado anteriormente del diseño y la síntesis de péptidos inhibidores de la transcripción con dedos de cinc personalizados (WO 2012/049332), que se unen selectivamente a los motivos de repetición de CAG expandidos e inhiben eficazmente la expresión de la proteína htt in vitro e in vivo. Sin embargo, la inhibición prolongada de la expresión de htt in vivo ha demostrado ser problemática. Además, parece que hay muchos tipos de células además de las neuronales, en el cerebro y en otros órganos/tejidos, que pueden desempeñar un papel en el desarrollo y/o la progresión de la EH. Agustín-Pavón et al. (2016) Molecular Neurodegeneration, vol. 11, n.° 1, 6 de septiembre de 2016, que se publicó después de la fecha de prioridad de la presente solicitud, se refiere a proteínas sintéticas de dedos de cinc para dirigirse a secuencias expandidas de repeticiones de CAG en el gen htt en la EH. En este estudio, los autores trataron de desarrollar un planteamiento de terapia génica de inyección única a largo plazo en el cerebro. Las construcciones de AAV con dedos de cinc adaptadas al hospedador mostraron una toxicidad reducida y un promotor pNSE no vírico mejoró la expresión de la proteína de dedo de cinc a largo plazo y la represión del gen diana.
Sería deseable disponer de moléculas y tratamientos terapéuticos alternativos y/o más eficaces para la EH y los trastornos relacionados, como las causadas por las repeticiones de CAG expandidas. También sería deseable tener la capacidad de dirigirse terapéuticamente a otros tipos de células distintas de las neuronales. Sería especialmente deseable poder dirigirse a estos tipos de células alternativas de forma ubicua.
Por consiguiente, la presente invención pretende superar o al menos aliviar uno o varios de los problemas encontrados en la técnica anterior.
Compendio de la invención
En términos generales, la presente invención proporciona nuevos péptidos de dedo de cinc y moléculas de ácido nucleico codificantes que pueden utilizarse para la modulación de la expresión génica in vitro y/o in vivo. Los nuevos péptidos de dedo de cinc de la invención pueden ser particularmente útiles en la modulación de genes diana asociados con repeticiones de trinucleótidos de CAG expandidas, y más específicamente la represión de dichos genes. Como consecuencia, se prevé la posibilidad de una mayor selectividad por genes específicos, que puede ser particularmente útil para la modulación de la expresión génica en el genoma y/o para distinguir entre secuencias de ácido nucleico similares de diferente longitud. Los nuevos péptidos de dedo de cinc de la invención se unen de forma beneficiosa a las repeticiones de trinucleótidos de CAG expandidas asociadas a genes patógenos mutados con mayor especificidad y afinidad que a las secuencias de repetición de trinucleótidos de tipo silvestre asociadas a los genes normales no patógenos.
Además, la invención se refiere a moléculas y composiciones terapéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a la poliglutamina, tales como enfermedades neurológicas, y en particular la enfermedad de Huntington (EH). La descripción también se refiere a métodos y pautas posológicas terapéuticas para tratar a los pacientes afectados o diagnosticados de EH y otras enfermedades poliglutamínicas. Por ejemplo, las moléculas terapéuticas de la invención pueden utilizarse en tratamientos médicos, como la terapia génica, para retrasar la aparición de los síntomas y/o para tratar o aliviar los síntomas de la enfermedad y/o para reducir la gravedad o prevenir la progresión de la enfermedad.
Concretamente, la invención se dirige a nuevos péptidos de dedo de cinc (ZFP) que pueden mostrar una expresión prolongada, a medio y largo plazo, en organismos diana in vivo, para que sean útiles en tratamientos médicos que puedan requerir una actividad a largo plazo del agente terapéutico. Las secuencias de péptidos de dedo de cinc de la invención están adaptadas/optimizadas para que coincidan estrechamente con las secuencias de péptidos endógenos/de tipo silvestre expresados en el organismo diana, de modo que tengan una toxicidad e inmunogenia reducidas. Las células que expresan los péptidos de dedo de cinc de la invención pueden, por tanto, estar protegidas de la respuesta inmunitaria del organismo diana para prolongar la expresión del péptido heterólogo en estas células.
El alcance de la protección se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona una molécula de polinucleótidos que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido un péptido de dedo de cinc que tiene de 8 a 32 dominios de dedo de cinc y que se une a secuencias de ácido nucleico con repetición de trinucleótidos de CAG y/o CTG; en donde el péptido de dedo de cinc comprende la secuencia:
N’- [(Fórmula 4) - L3]n0 - {[(Fórmula 6) - L2 -(Fórmula 6) - L3]n1 -[(Fórmula 6) - L2 -(Fórmula 6) -Xi_]}n2 -[(Fórmula 4) -L2 -(Fórmula 6) - L3]n3 -[(Fórmula 6) - L2 -(Fórmula 6)] -[L3 -(Fórmula 6) -]n4 -C’,
en donde n0 es 0 o 1, ni es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, L2 es la secuencia enlazadora -TGe/qk/rp-(SEQ ID NO: 7), L3 es la secuencia enlazadora -TGg/se/qk/rP-(SEQ ID NO: 8), y Xl es una secuencia enlazadora de entre 8 y 50 aminoácidos;
la fórmula 4 es un dominio de dedo de cinc con la secuencia X2 C X2,4 C X5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3,4,5 h/c y la fórmula 6 es un dominio de dedo de cinc con la secuencia X2 C X2 C X5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3 H, en donde X es cualquier aminoácido, los números en subíndice indican los posibles números de restos representados por X en esa posición, y el número en superíndice indica la posición del aminoácido en la secuencia de reconocimiento del dominio del dedo de cinc;
y en donde al menos 8 dominios de dedo de cinc adyacentes tienen una secuencia de reconocimiento X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se selecciona entre una combinación de las SEQ ID NO: 2 y 5; de una combinación de las SEQ ID NO: 3 y 4; de una combinación de las SEQ ID NO: 2, 3 o 4, o entre una combinación de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5. En algunas realizaciones, todos los dominios de dedo de cinc del péptido de dedo de cinc tienen la secuencia de reconocimiento definida de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. Las secuencias de reconocimiento ventajosas de SEQ ID NO: 1 son las SEQ ID NO: 2 a 5. Se prevé que cualquier combinación de las secuencias de reconocimiento de las SEQ ID NO: 2 a 5 puedan utilizarse dentro de un péptido de dedo de cinc de la invención para unir la secuencia repetida de trinucleótidos diana con una afinidad y/o especificidad adecuadas. Sin embargo, en algunas realizaciones los péptidos de dedo de cinc de la invención tienen secuencias de reconocimiento que se seleccionan únicamente del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2 y 5; o solo del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3 y 4.
En cualquiera de las realizaciones de la invención, L2 puede seleccionarse del grupo que consiste en -TGEKP-(SEQ ID NO: 6) y -TGQKP-(SEQ ID NO: 65). De forma similar, en cualquiera de las realizaciones de la invención, L3 puede seleccionarse del grupo que consiste en -TGSERP-(SEQ ID NO: 10) y -TGSQKP-(SEQ ID NO: 16).
En algunas realizaciones de la invención, todos los dominios de dedo de cinc del péptido se definen de acuerdo con la fórmula 6. Sin embargo, en otras realizaciones, pueden utilizarse estructuras de dominio de dedos de cinc seleccionadas entre cualquiera de las fórmulas 1 a 6.
De manera beneficiosa, el péptido de dedo de cinc tiene de 8 a 32, 8 a 24 u 8 a 18 dominios de dedo de cinc; tal como de 10 a 18 o de 11 a 18 dominios de dedo de cinc; por ejemplo, 10, 11, 12 o 18 dominios de dedo de cinc. Los péptidos de dedo de cinc preferidos de la invención tienen 11 o 12 dominios de dedo de cinc y un péptido más preferido tiene 11 dominios de dedo de cinc.
En una realización, el péptido de dedo de cinc de la invención tiene 10, 11 o 12 dominios de dedo de cinc, L2 es-TGEKP- (SEQ ID NO: 6), L3 es -TGSERP- (SEQ ID NO: 10) o -TGSQKP- (SEQ ID NO: 16), Xl tiene entre 20 y 30 aminoácidos y la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2 y 5. En otra realización, el péptido de dedo de cinc de la invención tiene 10, 11 o 12 dominios de dedo de cinc, L2 es -TGEKP-(SEQ ID NO: 6), L3 es -TGSERP-(SEQ ID NO: 10) o -TGSQKP-(SEQ ID NO: 16), Xl tiene entre 20 y 30 aminoácidos y la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3 y 4. Los péptidos de dedo de cinc preferidos de estas realizaciones tienen 11 dominios de dedo de cinc.
En cualquiera de las realizaciones de la invención, Xl puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 21,22, 23 y 24.
Convenientemente, los polipéptidos de la invención comprenden el dominio represor KRAB humano de Kox-1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 39 para su expresión en seres humanos o el dominio represor KRAB de ratón de ZF87 de acuerdo con la SEQ ID NO: 40 para su expresión en ratón. Estas secuencias represoras suelen estar unidas al péptido de dedo de cinc en su extremo C.
Convenientemente, la secuencia enlazadora se selecciona entre las secuencias peptídicas de SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43.
También puede incorporarse una secuencia de señal de localización nuclear a los polipéptidos de la invención para permitir dirigirlos al núcleo de las células en las que se expresan. Una secuencia de localización nuclear preferida para su uso en seres humanos es la SEQ ID NO: 37. Una secuencia de localización nuclear preferida para su uso en ratones es la SEQ ID NO: 38. La secuencia de SEQ ID NO: 36 puede utilizarse como alternativa para la localización nuclear. Las secuencias de péptidos de dedo de cinc preferidas de la invención se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 31,33 y 35. Los moduladores polipeptídicos preferidos de la invención comprenden una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 61 y 63. Los polipéptidos de la invención pueden comprender secuencias que tienen al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con cualquiera de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 29, 31,33, 35, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 59, 61 y 63.
Como se ha indicado anteriormente, la invención se refiere a moléculas de polinucleótidos (o ácidos nucleicos) que codifican los péptidos y polipéptidos de dedo de cinc de la invención. Particularmente, se incluyen polinucleótidos aislados. Además, los polinucleótidos (o moléculas de ácido nucleico) de la invención pueden ser construcciones de expresión para la expresión del péptido o polipéptido de la invención in vitro y/o in vivo. Los ácidos nucleicos de la invención pueden adaptarse para su expresión en cualquier sistema u organismo deseado, pero los organismos preferidos son ratones, en los que se pueden probar los efectos terapéuticos para las enfermedades a las que se dirigen los polipéptidos terapéuticos de la invención, y seres humanos, que probablemente serán los destinatarios finales de cualquier posible tratamiento.
Para la expresión de polipéptidos, las moléculas de ácido nucleico se insertan convenientemente en un vector o plásmido. Los vectores y plásmidos pueden estar adaptados para la replicación (p. ej., para producir grandes cantidades de su propia secuencia de ácido nucleico en las células hospedadoras), o pueden estar adaptados para la expresión de proteínas (p. ej., para producir cantidades grandes o adecuadas de proteínas que contienen dedos de cinc en las células hospedadoras). Se puede utilizar cualquier vector, pero se prefieren los vectores de expresión de polipéptidos para que el polipéptido codificado se exprese en las células hospedadoras (p. ej., con fines de tratamiento terapéutico).
Los vectores víricos son particularmente útiles para su posible uso en aplicaciones terapéuticas debido a su capacidad para dirigirse y/o infectar tipos de células específicas. Los vectores víricos adecuados pueden incluir los derivados de retrovirus (como el de la gripe, VIS, VIH, lentivirus y leucemia murina de Moloney); adenovirus; virus adenoasociados (AAV); virus del herpes simple (VHS); y virus quiméricos. Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se consideran particularmente útiles para dirigir los péptidos terapéuticos al sistema nervioso central y periférico y al cerebro. Un sistema preferido de suministro de vectores víricos se basa en el subtipo vírico AAV2/1.
Por tanto, la invención se refiere en concreto a un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una construcción de expresión de ácido nucleico capaz de expresar un polipéptido que comprende un péptido de dedo de cinc, en donde el polipéptido y el péptido de dedo de cinc se definen en las reivindicaciones.
También se describe un método de terapia génica que comprende la administración a una persona, individuo o paciente que lo necesite, una construcción de expresión de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Una construcción de expresión de ácido nucleico preferida es un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico como se describe en el presente documento.
También se describe un método para tratar una enfermedad poliglutamínica en un paciente o individuo que lo necesite. El método comprende adecuadamente administrar al paciente o individuo una construcción de expresión de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones, tal como un vector de virus adenoasociado (AAV). Un vector AAV preferido es AAV2/1 como se describe en la presente memoria.
Las enfermedades poliglutamínicas adecuadas se seleccionan del grupo que consiste en enfermedad de Huntington (EH), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA), ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1), ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), ataxia espinocerebelosa tipo 3 o enfermedad de Machado-Joseph (SCA3), ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7), ataxia espinocerebelosa tipo 6 (SCA6) y ataxia espinocerebelosa tipo 17 (SCA17). Una enfermedad preferida es la EH.
La invención también se refiere a polipéptidos que comprenden péptidos de dedo de cinc como se definen en las reivindicaciones. Habitualmente, los polipéptidos de la invención incluyen una porción de dedo de cinc que comprende diversos de dominios de dedo de cinc y una o más secuencias auxiliares beneficiosas, como los dominios efectores. Los dominios efectores incluyen secuencias de localización nuclear y dominios represores transcripcionales como se describe en otra parte en la presente memoria. Se apreciará que la invención abarca cualquier polipéptido que pueda codificarse por las moléculas de ácido nucleico definidas en las reivindicaciones; y cualquier molécula de ácido nucleico capaz de expresar un polipéptido como se define en las reivindicaciones.
El al menos un dominio efector puede seleccionarse entre dominios represores transcripcionales, dominios de activación transcripcional, dominios aislantes transcripcionales, remodelación de la cromatina, dominios de condensación o descondensación, dominios de escisión de ácidos nucleicos o proteínas, dominios de dimerización, dominios enzimáticos, secuencias o dominios de señalización/dirección.
Convenientemente, los polipéptidos de acuerdo con la invención se unen a secuencias de ácido nucleico de repetición de trinucleótidos bicatenarias que comprenden las secuencias de repetición de CAG, de repetición de CTG y/o de repetición de CAGCTG que contienen al menos 22 repeticiones de tripletes. Dichas secuencias de ácido nucleico se unen de forma beneficiosa con una afinidad de unión que es de al menos 1 nM; al menos 100 pM o al menos 10 pM.
Los polipéptidos de la invención también pueden administrarse a un individuo o paciente que los necesite. Convenientemente, los polipéptidos reivindicados son para tratar enfermedades poliglutamínicas.
Un método de terapia génica puede comprender la administración a una persona que lo necesite o a células de la persona, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, y que hace que el polipéptido se exprese en las células de la persona. De este modo, el método de terapia génica puede ser útil para tratar una enfermedad o afección poliglutamínica seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Huntington (EH), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA), ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1), ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), ataxia espinocerebelosa tipo 3 o enfermedad de Machado-Joseph (SCA3), ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7), ataxia espinocerebelosa tipo 6 (SCA6) y ataxia espinocerebelosa tipo 17 (SCA17).
La composición farmacéutica de la invención puede comprender moléculas de ácido nucleico (tales como vectores) y/o polipéptidos, cada uno de los cuales se definen según se reivindican.
Se prevé que las composiciones farmacéuticas de la invención puedan utilizarse en un método de terapia combinada con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
La invención también se refiere a proteínas quiméricas o de fusión que comprenden los péptidos de dedo de cinc de la invención conjugados con un dominio no de dedo de cinc.
También se describen formulaciones, medicamentos y composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos de dedo de cinc. En una parte de la descripción, la invención se refiere a un péptido de dedo de cinc para su uso en medicina. De manera más específica, los péptidos de dedo de cinc y la terapéutica de la invención pueden utilizarse para modular la expresión de un gen diana en una célula: por ejemplo, enfermedad de Huntington y otras enfermedades causadas o diagnosticadas por la expansión genética de las secuencias de repetición de trinucleótidos de CAG. La invención se refiere al tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con el gen de repetición de CAG mutado y/o la expresión de productos génicos que contienen tractos de poliglutamina (poliQ) extendidos. El tratamiento también puede incluir tratamientos preventivos y terapéuticos y el alivio de una enfermedad o afección.
La presente descripción también proporciona secuencias promotoras para la expresión prolongada de construcciones exógenas, tales como transgenes. Dichas secuencias promotoras pueden ser particularmente adecuadas para la expresión in vivo prolongada de construcciones que comprenden secuencias que codifican péptidos de dedo de cinc de acuerdo con aspectos de la invención. La descripción proporciona una nueva construcción sintética de ácido nucleico promotor-potenciador para la expresión sostenida específica en las neuronas, que comprende una porción de la secuencia cadena arriba y cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen de enolasa. Por ejemplo, una construcción de promotor de transcripción de ácido nucleico aislada puede comprender la secuencia de ácido nucleico que se extiende desde aproximadamente 1,6 a aproximadamente 1,7 kb cadena arriba hasta aproximadamente 100 pb a aproximadamente 200 pb cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen de enolasa. Convenientemente, la construcción promotora puede comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 148 o SEQ ID NO: 151; o SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 153. La descripción también proporciona una nueva construcción sintética de promotor-potenciador para la expresión sostenida en más de un tipo de célula, que comprende una porción de la secuencia cadena arriba y cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen Hsp90ab1. Por ejemplo, una construcción promotora de transcripción de ácido nucleico aislada puede comprender la secuencia de ácido nucleico que se extiende desde aproximadamente 1,6 a aproximadamente 1,7 kb cadena arriba hasta aproximadamente 100 pb a aproximadamente 200 pb cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen Hsp90ab1. Convenientemente, la construcción promotora puede comprender una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 150. Las construcciones promotoras preferidas tienen una longitud de aproximadamente 1.750 a 1.820 pb, tal como entre 1.800 y 1.810 pb. Sin embargo, la descripción también abarca construcciones de ácido nucleico para su uso como secuencias promotoras y/o potenciadoras que comprenden fragmentos de las secuencias promotoras/potenciadoras de la descripción. Los fragmentos adecuados pueden incluir hasta 200, hasta 400, hasta 600, hasta 800, hasta 1.000, hasta 1.200, hasta 1.400 o hasta 1.600 bases contiguas de las secuencias descritas en la presente memoria. Dichas construcciones de ácido nucleico pueden estar aisladas o pueden estar comprendidas en un vector, especialmente un vector de expresión; p. ej., un vector vírico, tal como AAV, como se describe en la presente memoria.
De manera beneficiosa, las secuencias promotoras de acuerdo con la descripción son adecuadas para la expresión constitutiva sostenida de los genes operablemente unidos/asociados durante un período de al menos 3 semanas, al menos 6 semanas, al menos 12 semanas o al menos 24 semanas. En el contexto de la presente descripción, las secuencias "promotoras" pueden abarcar tanto elementos promotores como potenciadores de la transcripción dentro de una secuencia de ácido nucleico que tienen el efecto de posibilitar, provocar y/o potenciar la transcripción de una construcción génica/de ácido nucleico asociada. En otras palabras, el uso del término "promotor" no excluye la posibilidad de que la secuencia de ácido nucleico en cuestión pueda abarcar también otros elementos asociados a la transcripción, tales como elementos potenciadores.
También se describen métodos de terapia génica, que comprenden la administración a un sujeto que lo necesite o a células del sujeto, un ácido nucleico que codifica un polipéptido bajo el control de los promotores sintéticos de la invención, y que hace que el polipéptido se exprese en las células del sujeto.
Por tanto, se describe un método de terapia génica que comprende la administración a un sujeto que lo necesita, o a células del sujeto, un vector que comprende una construcción de promotor-potenciador pNSE o pHsp90 de la descripción. Los métodos pueden comprender la administración al sujeto a tratar de un vector de acuerdo con la invención con especificidad de orientación neuronal en combinación con un vector promiscuo de acuerdo con la invención. El método puede comprender administrar al sujeto a tratar de un vector de virus adenoasociado (AAV) del subtipo AAV2/1 de acuerdo con las reivindicaciones en combinación con un vector de virus adenoasociado (AAV) del subtipo AAV2/9 de acuerdo con las reivindicaciones. La administración "en combinación" puede ser simultánea, separada o secuencial, según sea adecuado. También se incluyen usos terapéuticos de las construcciones y vectores víricos reivindicados. Las construcciones y usos de las reivindicaciones pueden ser para tratar una enfermedad o afección poliglutamínica seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Huntington (EH), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA), ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1), ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), ataxia espinocerebelosa tipo 3 o enfermedad de Machado-Joseph (SCA3), ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7), ataxia espinocerebelosa tipo 6 (SCA6) y ataxia espinocerebelosa tipo 17 (SCA17).
Breve descripción de los dibujos
La invención se ilustra además por los dibujos adjuntos en los que:
Figura 1 Los conjuntos de dedos de cinc de acuerdo con la descripción se unen a las repeticiones de CAG. (A) Una ilustración esquemática de un conjunto de 12 dedos, que muestra las hélices de reconocimiento que entran en contacto con las bases 5'-GCT- 3' de la cadena inferior de ADN. Se construyeron conjuntos similares de 4, 6, 8, 11, 12 y 18 dedos de cinc (ZF4xHunt, ZF6xHunt, ZF8xHunt, ZFHxHunt, ZF12xHunt y ZF18xHunt; véase el documento WO 2012/049332). Se añadieron señales de localización nuclear (NLS) y efectores (p. ej., el dominio de represión de la transcripción Kox-1) a los extremos N y C, respectivamente. (B) Los ensayos de desplazamiento de gel muestran que los conjuntos de 4, 6 o 12 dedos se unen al ADNbc de poli-CAG y forman complejos distintos; control negativo, mezcla de transcripción-traducción (TNT). (C) Columna de la izquierda: ilustración esquemática de un diseño de dedo de cinc híbrido que reconoce la secuencia de ácido nucleico 5'- GC(A/T)-3', que permite la unión a las hebras complementarias (GCA)n o (GCT)n de la secuencia de ADNbc con repeticiones de c Ag . Columna de la derecha: un ensayo de desplazamiento de gel que demuestra que el dedo de cinc híbrido se une por igual a los tripletes de GCA o de GCT en secuencias mixtas. (D) Ensayo de desplazamiento de gel de especificidad que ilustra que un péptido de dedo de cinc de acuerdo con la descripción (ZF6xHunt), se une preferiblemente a las repeticiones de CAG en comparación con las secuencias mutantes (D=A,G,T; S=C,G; H=A,C,T).
Figura 2 Represión episómica de poli-CAG-indicador mediante péptidos de dedo de cinc. Los resultados se ilustran para ZFP sin dominios efectores (paneles B a D), o fusionados al dominio represor Kox-1 (paneles E a G). (A) El plásmido indicador pEH contiene EGFP, fusionado con secuencias codificantes de poli-Q de diferente longitud, bajo un promotor de SV40. Un gen HcRed de control, bajo un promotor de CMV, mide la represión fuera de la diana o de largo alcance; clave: construcciones de expresión de ZFP que contienen 0, 4, 6, 11 o 18 dedos. (B) Ensayo de FACS que mide el factor de reducción en las células fluorescentes de EGFP y HcRed, en respuesta a la exposición a diferentes dedos de cinc. Una represión de factor 10 equivale a una reducción del 90 % en la fluorescencia de la proteína. (C) Ilustra una transferencia de Western de EGFP para la represión de ZFP de las dianas de pEH-Qx. (D) Muestra los resultados de un ensayo de qRT-PCR para medir el factor de represión del ARNm de EGFP o HcRED por ZFP. (E a G) Los mismos tres ensayos (FACS, Western, qRT-PCR) repetidos para los ZFP fusionados con Kox-1. En los paneles E a G las escalas verticales son mayores, lo que refleja la mayor represión causada por el dominio Kox-1 (represión >100 veces mayor; >99 % de reducción de la fluorescencia de la proteína), y la represión de largo alcance del gen HcRed por Kox-1.
Figura 3 Represión del indicador episómico por ZFP para dirigir las secuencias de repetición de CAG. Las células se cotransfectaron con plásmidos indicadores y de dedos de cinc: el plásmido indicador pEH contiene EGFP, fusionado con secuencias codificantes de poli-Q de diferente longitud, bajo un promotor de SV40. Un gen HcRed de control, bajo un promotor de CMV, mide la represión fuera de la diana o de largo alcance. Las construcciones de expresión pPGK-ZF (PGK-promotor) contienen cadenas de ZFxHunt (0, 4, 6, 12 o 18 dedos, según se indique). Las ZFP no están fusionadas a ningún dominio efector. El vector pTarget no contiene ZFP y se utiliza como control. (A) Ensayo de FACS que mide el factor de reducción en las células fluorescentes EGFP o HcRED, en respuesta a diferentes dedos de cinc. Una represión de factor 5 equivale a una reducción del 80 %. (B) Ensayo de qRT-PCR para medir el factor de represión del ARNm de EGFP o HcRED mediante ZFP. (C) Transferencia de Western de la represión mediante ZFP de las dianas de pEH-Qx. Como control de carga se utiliza tinción con p-actina.
Figura 4 Ensayo de competición de ZFP frente a partes de secuencias de repetición de CAG de diferente longitud. Cada cuadrado pequeño representa un experimento de transfección, donde las células reciben simultáneamente dos plásmidos indicadores: poli-Q-EGFP y poli-Q-mCherry de diferentes longitudes de repeticiones de CAG (Q0 = sin repeticiones; Q10 = 10 repeticiones; Q22 = 22 repeticiones; Q35 = 35 repeticiones; Q63 = 63 repeticiones; y Q104 = 104 repeticiones). Se probaron péptidos de dedo de cinc de la descripción con 4, 6, 11 o 18 dedos para evaluar su capacidad de reducir el número de células verdes y rojas detectables en ensayos de FACS (%). Fila superior: los recuadros de color gris claro representan niveles elevados de expresión de la proteína GFP, los recuadros de color gris oscuro representan niveles bajos de expresión de la proteína GFP; fila intermedia: los recuadros de color gris claro representan niveles elevados de expresión de la proteína mCherry, los recuadros de color gris oscuro representan niveles bajos de expresión de la proteína mCherry; fila inferior: los recuadros de color (gris) claro representan niveles más altos de expresión de la proteína GFP en comparación con mCherry, los recuadros de color gris oscuro representan niveles más altos de expresión de la proteína mCherry en comparación con GFP. Se obtuvieron resultados similares utilizando ZFP fusionados con el dominio de nucleasa Fokl (no mostrado).
Figura 5 Expresión de los genes cromosómicos de repetición de CAG, 20 días después del suministro retrovírico de ZFP. Los ensayos se llevaron a cabo en células STHdh de ratón de tipo silvestre (ts) con 7 repeticiones de CAG asociadas a cada copia del gen Hdh (Q7/Q7); en ratones mutantes STHdh poli-Q con 111 repeticiones de CAG asociadas a cada copia del gen Hdh (Q111/Q111); y en HEK293T de ser humano, como se indica. (A) Ilustración de la represión de la htt endógena por los péptidos de 6 y 11 dedos de la descripción (ZF6xHunt y ZFHxHunt, respectivamente), con o sin el dominio represor de Kox-1. Las transferencias de Western de Htt (fila superior) se controlaron con la tinción de p-actina y se cuantificaron utilizando ImageJ (factor de represión de la proteína; fila central). Se utilizó la qRT-PCR para comparar los niveles de ARNm de htt (factor de represión del ARN; fila inferior).
(B) Muestra que los niveles de ARNm de otros genes de repetición de CAG ts no se ven afectados en general. Los niveles de expresión de siete genes ts asociados a las repeticiones de CAG se analizaron mediante qRT-PCR (atrofina1: ATN1; ataxina-1, -2, -3 y -7: ATXN1, ATXN2, ATXN3 y ATXN7; subunidad del canal de calcio alfa 1A: CACNA1A; y la proteína de unión a TATA: TBP). Los números de repeticiones de CAG se ilustran en la tabla 1. Dos vecinos genómicos de htt (cinasa receptora 4 acoplada a proteína G: GRK4; y señalización de la proteína G 12: Rgs12) tampoco se vieron afectadas en las células STHdh. (C) Los niveles de ARNm de los siete genes de CAG ts y de HTT ts (huntingtina; 21 repeticiones de CAG) tampoco se vieron afectadas en general en las células HEK293T (N.B. CACNA1A no se expresa en las células HEK293T).
Figura 6 Ensayo de toxicidad de ZFP. Las células HEK-293T se transfectaron con las construcciones de vectores indicadas. Como control se utilizaron células solo con Lipofectamine2000 o no transfectadas (negativo). La citotoxicidad se analizó mediante el ensayo Guava Cell Toxicity (PCA) y las barras muestran el porcentaje de células muertas, medio apoptóticas y viables. Los resultados son una media de al menos 3 experimentos independientes.
Figura 7 Ilustra los datos de la qRT-PCR que cuantifican los niveles de ARNm en muestras de estriado de ratón a las que se inyecta ZF11xHunt-Kox-1. (A) La medición de los niveles de Kox-1 revela un pico de expresión del dedo de cinc a las 6 semanas con un descenso constante a partir de entonces. (B) La represión de la huntingtina mutante (htt mut) fue la más reprimida en la semana 6 y deja de estar significativamente reprimida en la semana 10. (C) El tratamiento con dedos de cinc no tiene un efecto significativo en los niveles de huntingtina de tipo silvestre (htt ts).
Figura 8 Pruebas de comportamiento sobre el rendimiento y el estado general de los ratones macho R6/2 y ts tratados con ZFP o GFP. (A) Gráfica que muestra los resultados de la prueba de comportamiento de agarre. El tratamiento con ZFP provocó un retraso en el inicio del comportamiento de agarre en comparación con los ratones R6/2 tratados con GFP y no operados. (B) Gráfica que muestra los resultados de la prueba de campo abierto. El aumento del tiempo de permanencia en el centro del campo abierto también se retrasó con el tratamiento con ZFP en la semana 7. Se observó una diferencia significativa en los ratones R6/2- GFP en la semana 7 con respecto a todos los demás grupos, pero el efecto había desaparecido en gran medida en la semana 9. (C) Gráfica que muestra los resultados de la prueba de la barra rotatoria. El descenso en el rendimiento en la barra rotatoria con respecto a los niveles anteriores a la cirugía se atenuó mediante ZFP. Una ANOVA con mediciones repetidas reveló que el grupo de R6/2-GFP difería de TS-GFP, mientras que R6/2-ZFP no se diferenció de su control TS-ZFP. (D) Gráfica que muestra el aumento de peso corporal a lo largo del experimento. El aumento de peso corporal fue similar entre los ratones tratados con ZFP y GFP, y comenzó a disminuir después de 7 semanas de edad, con ningún efecto del tratamiento. (E) Gráfica de barras que muestra el tiempo de supervivencia. La supervivencia no fue significativamente diferente entre los grupos de ratones R6/2. Todos los datos se presentan como media ± E.E.M. **, p<0,01. ***, p<0,001.
Figura 9 Represión de las construcciones de poli-CAG por ZF10xHunt que contienen secuencias variantes conservadoras en la hélice de reconocimiento de ácido nucleico. Se utilizó un ensayo episómico que incluye transfección transitoria seguida de FACS para células fluorescentes. Las construcciones indicadoras de poli-CAG-GFP codifican 0 (pEH), 10 (Q10), 35 (Q35) y 104 (Q104) repeticiones de CAG, respectivamente, (a) los dedos de cinc ZF10xHunt-Kox-1 reprimen el gen indicador de GFP fusionado. A modo de comparación, el control pTarget no contiene dedos de cinc, (b) Las fusiones de Kox-1-ZFP también reprimen ligeramente un gen HcRed de control en el mismo plásmido.
Figura 10 Diseños de optimización de los dedos de cinc (ZF): comparación de los diseños de los represores de dedos de cinc ZF11 -Kox-1, hZF11 -Kox-1 y mZF11-ZF87, que muestra las construcciones de 11 dedos de cinc alineadas con su secuencia de ADN de poli(CAG) diana (HTT mut). Los dominios de proteína que contenían secuencias de péptido no del hospedador (que contenían posibles epítopos exógenos) se sombrean en color gris. A título ilustrativo, las secuencias de hélices de reconocimiento de ADN representativas de los dedos 2 y 3 (F2, F3) se muestran debajo de las matrices de ZF, con las secuencias exógenas en fuente en color gris y las secuencias naturales del hospedador en fuente en color negro. Los porcentajes totales de restos no del hospedador en el péptido de longitud completa (que incluye secuencias de dedo de cinc y efectoras) se proporcionan para demostrar que los diseños optimizados para el hospedador reducen el total de secuencias exógenas.
Figura 11 Valores relativos de D.O. de las muestras estriatales con inmunotinción para marcadores gliales: los valores relativos de D.O., que representan las respuestas inflamatorias a diversos tratamientos, se calcularon para el marcador microglial Iba1 y el marcador astroglial reactivo GFAP, a las 4 y 6 semanas después de la inyección. El tratamiento con ZF11-Kox-1 no optimizado se comparó con la expresión de un mZF11-ZF87 optimizado para el hospedador, GFP o una inyección de PBS de control. La D.O. relativa se calcula como la D.O. media de cuatro cortes coronales, separados por 240 pm en el hemisferio inyectado, menos la media de la D.O. en el hemisferio de control contralateral. Los datos se muestran como D.O. relativa ± E.E.M., *** P<0,001, **P<0,01, *P<0,05.
Figura 12 Activación de la microglía (células Iba1+) en el estriado tras varios tratamientos: micrografías representativas de cortes coronales estriatales con inmunotinción de Iba1, en los hemisferios de control y los inyectados, para cada tratamiento a las 4 o 6 semanas. Muestras de ZF11-Kox-1 a las 4 y 6 semanas después del tratamiento (A, B) en comparación con los hemisferios contralaterales correspondientes (A', B’). Hemisferios tratados con mZF-ZF87 a las 4 y 6 semanas después de la inyección en comparación con los hemisferios contralaterales no inyectados (C, C’; D, D’). Muestras tratadas con GFP 4 semanas después de la inyección (E) y 6 semanas después de la inyección de GFP (F), en comparación con los hemisferios contralaterales (E', F’). Inyectados con PBS en ambos puntos temporales (G, G’; H, H’). Barra de escala: 100 pm.
Figura 13 Activación de la astroglía (células GFAP+) en el estriado y la corteza tras varios tratamientos: micrografías representativas de secciones coronales del estriado con inmunotinción de GFAP para los hemisferios de control e inyectados, para cada tratamiento en cada punto temporal. Muestras de ZF11 -Kox-1 a las 4 y 6 semanas después del tratamiento (A, B) en comparación con los hemisferios contralaterales no inyectados, respectivamente (A', B’).
Tratamiento con mZF11-ZF87 a las 4 y 6 semanas después de la inyección en comparación con sus hemisferios contralaterales no inyectados (C, C'; D, D’). Muestras tratadas con GFP 4 semanas después de la inyección (E) y 6 semanas después de la inyección de GFP (F), en comparación con los hemisferios contralaterales (E', F’). Inyectados con PBS en ambos puntos temporales (G, G’; H, H’). Barra de escala: 100 pm. Experimentos realizados con mfZF11 -ZF87 de SEQ ID n O: 49, 50, 51 y 52. Resultados mostrados para el polipéptido modulador de SEQ ID NO: 49.
Figura 14 Gráfica de barras que ilustra la densidad neuronal estriatal después de varios tratamientos. Se ilustra la densidad neuronal estimada en el estriado de los ratones tras los diferentes tratamientos. Los datos se expresan como media ± E.E.M. *P<0,05; **P<0,01; §P<0,01 (§ compara los recuentos celulares en los hemisferios contralaterales de las muestras de GFP y PBS a las 6 semanas.
Figura 15 Visualización de la densidad neuronal estriatal tras varios tratamientos: micrografías representativas de secciones coronales del estriado con inmunotinción de Neu-N del hemisferio de control e inyectado de cada tratamiento en cada punto temporal. La toxicidad de ZF-Kox-1 se observa en zonas del estriado inyectado que carecen de neuronas marcadas, 4 y 6 semanas después del tratamiento (A, B), mientras que los hemisferios contralaterales (A', B') muestran densidades neuronales similares a los hemisferios inyectados con PBS (G, H) y no tratados (G', H’). Por el contrario, el tratamiento con mZF-ZF87 no afectó significativamente a la densidad neuronal (C, C', D, D') en cualquier punto temporal. Sorprendentemente, Las inyecciones de GFP no afectaron a la densidad neuronal a las 4 semanas del tratamiento (E, E'), pero provocó una fuerte respuesta tóxica retardada que redujo la densidad neuronal tanto en el hemisferio inyectado (F) como en el contralateral (F'), 6 semanas después de la inyección. Barra de escala: 100 pm.
Figura 16 Análisis de la expresión del gen de huntingtina mutante tras el tratamiento con péptidos de dedo de cinc: A.
Regresión lineal que muestra las correlaciones negativas de los niveles de ARN de HTT mut y la expresión de ZF11-Kox-1 2, 4 y 6 semanas después del tratamiento. Los rombos negros muestran los valores medios de expresión de HTT mut (± 1 E.E.M.) en los hemisferios de control de cada grupo. Los niveles de expresión de ZF11-Kox-1 están en unidades arbitrarias (u.a), normalizados a la señal máxima de qRT-PCR de ZF11-Kox-1 en todas las muestras; B.
Porcentaje de HTT mut con respecto al valor medio en los hemisferios de control, durante el mismo periodo; C. Análisis de regresión lineal para comprobar las correlaciones negativas entre los niveles de ARN de HTT mut y la expresión de mZF11-ZF87, a las 2, 4 y 6 semanas después del tratamiento. Los niveles de expresión de mZF11-ZF87 están en unidades arbitrarias (u.a), normalizados a la señal máxima de qRT-PCR de mZF11-ZF87 en todas las muestras; D.
Porcentaje de HTT mut con respecto al valor medio en los hemisferios de control durante el mismo periodo. Las columnas muestran los niveles medios de expresión del ARN; barras de error: ±1 E.E.M. *P<0,05; § P<=0,06.
Figura 17 Efectos a largo plazo de la inyección intraventricular bilateral de AAV (10A10 viriones) que expresan dedos de cinc mZF-KRAB (Mol. Neurodegeneration 11 (1):64, 2016) bajo los promotores pCAG, pNSE o pHSP. A. Represión con dedos de cinc de la Huntingtina mutante en ratones R6/1. Los niveles de expresión de HTT mut (exón 1) en las muestras de cerebro entero de los distintos tratamientos se compararon con los niveles de transcripción en los controles de PBS mediante qRT-PCR. B. Expresión del dedo de cinc a lo largo del tiempo medida por Ct de qRT-PCR (valor de ciclo umbral; escala logarítmica). Los niveles de transcripción de mZF-KRAB de cerebros enteros se analizaron mediante qRT-PCR a las 3, 6, 12 y 24 semanas después de las inyecciones de virus (o del control de PBS) en neonatos R6/1. pCAG pierde la expresión detectable a las 6 semanas, mientras que pNSE y pHSP90 mantienen una expresión detectable hasta al menos 24 semanas. C. Los mismos datos para la expresión del dedo de cinc a lo largo del tiempo, normalizados a los niveles de CAG de control en R6/1. D. Expresión del dedo de cinc a lo largo del tiempo, normalizado a los niveles de CAG de control en los neonatos TS. E. Verificación de la falta de reactividad cruzada de mZF-KRAB con alelos cortos de Htt TSW en ratones TS. Los niveles de expresión de la Htt TS (exón 1) se cuantificaron en las mismas muestras de tratamiento anteriores. F. Verificación de la falta de reactividad cruzada de mZF-KRAB en ratones R6/1. Las barras de error son el E.E.M (n = 3). ** p < 0,01, *** p < 0,001, n.s.=no significativo.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la técnica (p. ej., en cultivos celulares, genética molecular, química de los ácidos nucleicos y bioquímica).
A menos que se indique otra cosa, la práctica de la presente invención emplea técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante, métodos químicos, formulaciones farmacéuticas y administración y tratamiento de animales, que se encuentran dentro de las capacidades de una persona normalmente versada en la técnica. Dichas técnicas también se explican en la bibliografía, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, cáps. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; y D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: Dn A Structure Parte A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.
Para ayudar a comprender la invención, en la presente memoria se describen varios términos.
El término "aminoácido" en el contexto de la presente invención se utiliza en su sentido más amplio y se entiende que incluye los L a-aminoácidos o restos naturales. En la presente memoria se utilizan las abreviaturas de una letra y tres letras comúnmente utilizadas de los aminoácidos de origen natural: A=Ala; C=Cys; D=Asp; E=Glu; F=Phe; G=Gly; H=His; I=Ile; K=Lys; L=Leu; M=Met; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; R=Arg; S=Ser; T=Thr; V=Val; W=Trp; e Y=Tyr (Lehninger, A. L., (1975) Biochemistry, 2.a ed., págs. 71-92, Worth Publishers, Nueva York). El término general "aminoácido" incluye además los D-aminoácidos, aminoácidos retroinversos, así como aminoácidos modificados químicamente, tales como análogos de aminoácidos, aminoácidos naturales que no suelen incorporarse a las proteínas, tales como norleucina, y compuestos de síntesis química con propiedades conocidas en la técnica como características de un aminoácido, tales como p-aminoácidos. Por ejemplo, dentro de la definición de aminoácidos se incluyen análogos o miméticos de la fenilalanina o la prolina, que permiten la misma restricción conformacional de los compuestos peptídicos que la Phe o la Pro naturales. Dichos análogos y miméticos se denominan en la presente memoria "equivalentes funcionales" del aminoácido respectivo. Se enumeran otros ejemplos de aminoácidos en Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross y Meiehofer, eds., Vol. 5 p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983.
El término péptido, como se emplea en esta memoria (p. ej., en el contexto de un péptido o armazón de dedo de cinc (ZFP)), se refiere a diversos aminoácidos unidos entre sí en una cadena lineal o circular. El término oligopéptido se utiliza normalmente para describir péptidos que tienen entre 2 y aproximadamente 50 o más aminoácidos. Los péptidos de más de aproximadamente 50 aminoácidos normalmente se denominan polipéptidos o proteínas. A efectos de la presente invención, sin embargo, el término "péptido" no se limita a ningún número concreto de aminoácidos, y se utiliza indistintamente con los términos "polipéptido" y "proteína".
Como se emplea en esta memoria, el término "dominio del dedo de cinc" se refiere a un "dedo" individual, que comprende un pliegue ppa estabilizado por un ion de cinc (como se describe en otra parte de la presente memoria). Cada dominio de dedo de cinc suele incluir aproximadamente 30 aminoácidos. El término "dominio" (o "módulo"), de acuerdo con su uso habitual en la técnica, se refiere a una parte individual y continua de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que puede equipararse a una función concreta. Los dominios de los dedos de cinc son en gran medida independientes desde el punto de vista estructural y pueden conservar su estructura y función en diferentes entornos. Normalmente, un dominio de dedo de cinc se une a una secuencia de nucleótidos triple o cuádruple (superpuesta). Los dominios de dedo de cinc adyacentes dispuestos en tándem están unidos por secuencias enlazadoras. Un péptido de dedo de cinc de la invención está compuesto por una pluralidad de "dominios de dedo de cinc", que en combinación no existen en la naturaleza. Por lo tanto, pueden considerarse péptidos de dedo de cinc artificiales o sintéticos.
Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos (ADN) o de ribonucleótidos (ARN), en una conformación lineal o circular, y en forma monocatenaria o bicatenaria. A efectos de la presente invención, dichos polímeros de ADN o ARN pueden incluir nucleótidos naturales, nucleótidos no naturales o sintéticos, y mezclas de los mismos. Los nucleótidos no naturales pueden incluir análogos de los nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en la base, los restos de azúcar y/o de fosfato (p. ej., cadenas principales de fosforotioato). Algunos ejemplos de ácidos nucleicos modificados son los APN y los ácidos nucleicos de morfolino. Por lo general, un análogo de un determinado nucleótido tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases, es decir, un análogo de G formará un emparejamiento de bases con C. A efectos de la invención, estos términos no deben considerarse limitantes con respecto a la longitud de un polímero.
Un "gen", como se emplea en esta memoria, es el segmento de ácido nucleico (normalmente ADN) que interviene en la producción de un producto génico polipeptídico o de ácido ribonucleico. Incluye las regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y tráiler), así como las secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones). Convenientemente, este término también incluye las secuencias de control necesarias para la expresión de los genes (p. ej., potenciadores, silenciadores, promotores, terminadores, etc.), que pueden ser adyacentes o distantes de la secuencia codificante correspondiente, así como las regiones codificantes y/o transcritas que codifican el producto génico. Los genes preferidos de acuerdo con la presente invención son los asociados a secuencias codificantes de repetición de poliglutamato.
Como se emplea en esta memoria, el término "modulación", en relación con la expresión de un gen, se refiere a un cambio en la actividad del gen. La modulación incluye tanto la activación (es decir, el aumento de la actividad o del nivel de expresión) como la represión o la inhibición de la actividad de los genes. En realizaciones preferidas de la invención, las moléculas terapéuticas (p. ej., los péptidos) de la invención son represores de la expresión o la actividad de los genes.
Una "diana", "sitio diana" o "secuencia diana" de ácido nucleico, como se emplea en esta memoria, es una secuencia de ácido nucleico a la que se unirá un péptido de dedo de cinc de la invención, siempre que las condiciones de la reacción de unión no sean prohibitivas. Un sitio diana puede ser una molécula de ácido nucleico o una porción de un polinucleótido más grande. Los sitios diana particularmente adecuados comprenden secuencias de ácido nucleico repetitivas; especialmente las secuencias de repetición de trinucleótidos. Las secuencias diana preferidas de acuerdo con la invención incluyen las definidas por secuencias de repetición de CAG (p. ej., CAGCAG...; AGCAGC...; and GCAGCA...), y sus secuencias complementarias, repeticiones de CTG (p. ej., CTGc Tg ...; TGCTGC...; y GCTGCT...). De acuerdo con la invención, una secuencia diana de un péptido de múltiples dedos de cinc de la invención puede comprender una única secuencia de ácido nucleico contigua o más de una secuencia de ácido nucleico no contigua (p. ej., dos secuencias contiguas separadas, cada una representativa de un sitio diana parcial), que están intercaladas por uno o más nucleótidos o secuencias de nucleótidos intermedias. Estos términos también pueden sustituirse o complementarse con los términos "sitio de unión", "secuencia de unión", "sitio de reconocimiento" o "secuencia de reconocimiento", que se utilizan indistintamente.
Como se emplea en esta memoria, "unión" se refiere a una interacción no covalente entre macromoléculas (p. ej., entre un péptido de dedo de cinc y una molécula de ácido nucleico que contiene un sitio diana adecuado). En algunos casos, la unión será específica de secuencia, tal como entre uno o más nucleótidos específicos (o pares de bases) y uno o más aminoácidos específicos. Se apreciará, sin embargo, que no es necesario que todos los componentes de una interacción de unión sean específicos de secuencia (p. ej., las interacciones no covalentes con los restos de fosfato en una cadena principal de ADN). Las interacciones de unión entre una secuencia de ácido nucleico y un péptido de dedo de cinc de la invención pueden caracterizarse por la afinidad de unión y/o la constante de disociación (Kd). Una constante de disociación adecuada para un péptido de dedo de cinc de la invención que se une a su sitio diana puede ser del orden de 1 pM o menor, 1 nM o menor o 1 pM o menor. "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión, de manera que una mayor afinidad de unión se correlaciona con un valor de Kd más bajo. Los péptidos de dedo de cinc pueden tener actividad de unión al ADN, actividad de unión al ARN y/o incluso actividad de unión a proteínas.
Preferiblemente, los péptidos de dedo de cinc de la invención se diseñan o seleccionan para tener una actividad de unión a ácidos nucleicos específica de secuencia, especialmente al ADNbc. Preferiblemente, el sitio diana de un péptido de dedo de cinc concreto es una secuencia a la que es capaz de unirse de manera específica de nucleótidos del péptido de dedo de cinc en cuestión. Se apreciará, sin embargo, que dependiendo de la secuencia de aminoácidos de un péptido de dedo de cinc, éste puede unirse o reconocer más de una secuencia diana, aunque normalmente se unirá a una secuencia con preferencia respecto de otras secuencias reconocidas, dependiendo de la especificidad relativa de las interacciones no covalentes individuales. En general, la unión específica se consigue preferiblemente con una constante de disociación (Kd) de 1 nM o inferior, 100 pM o inferior; o 10 pM o inferior. Preferiblemente, un péptido de dedo de cinc de la invención (o una proteína que comprende un péptido de dedo de cinc de la invención) se une a una secuencia diana específica con una constante de disociación de 1 pM o inferior; tal como 0,1 pM o inferior o incluso 10 fM o inferior.
Por "no diana" se entiende que la secuencia de ácido nucleico en cuestión no se une apreciablemente al péptido de dedo de cinc relevante. En algunas realizaciones, puede considerarse que, cuando un péptido de dedo de cinc de la invención tiene una secuencia diana específica de secuencia conocida, esencialmente todas las demás secuencias de ácidos nucleicos pueden considerarse como no diana.
Desde un punto de vista práctico, puede ser conveniente definir una interacción entre una secuencia no diana y un péptido de dedo de cinc concreto como subfisiológica (es decir, no capaz de crear una respuesta fisiológica en concentraciones fisiológicas de secuencia diana / péptido de dedo de cinc). Por ejemplo, si se puede medir alguna unión entre el péptido de dedo de cinc y la secuencia no diana, la constante de disociación (Kd) suele ser más débil que 1 pM, tal como 10 pM o menos, 100 pM o menos o al menos 1 mM.
Péptidos de dedo de cinc
La presente invención se refiere a péptidos con múltiples dedos de cinc de origen no natural para su unión a secuencias de ácido nucleico repetitivas, tales como secuencias de repetición de trinucleótidos y en concreto, a repeticiones de CAG expandidas (que codifican poliglutamina), que pueden encontrarse en las secuencias de ADN genómico de origen natural. La invención también se refiere al uso de dichos péptidos con múltiples dedos de cinc como moléculas terapéuticas y a métodos de tratamiento relacionados: por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades poliglutamínicas, tales como la EH. Preferiblemente, los péptidos con múltiples dedos de cinc de la invención se unen a repeticiones de CAG expandidas asociadas con secuencias génicas mutadas con preferencia y/o selectividad con respecto a las secuencias con repeticiones de CAG más cortas de los genes normales y no patógenos.
Un "dedo de cinc" es un dominio polipeptídico relativamente pequeño que comprende aproximadamente 30 aminoácidos, que se pliega para formar una estructura secundaria que incluye una hélice a adyacente a una lámina p antiparalela (conocida como pliegue ppa). El pliegue se estabiliza mediante la coordinación de un ion de cinc entre cuatro restos de Cys y/o His, en gran medida invariables (dependiendo del tipo de estructura del dedo de cinc), como se describe más adelante. Los dominios de dedo de cinc naturales se han estudiado ampliamente y se han descrito en la bibliografía, véase, por ejemplo, Miller et al., (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 99-102; y Lee et al., (1989) Science 245: 635-637. Un dominio de dedo de cinc reconoce y se une a un triplete de ácido nucleico, o a un cuadruplete superpuesto (como se explica más adelante), en una secuencia diana de ADN bicatenario. Sin embargo, también se sabe que los dedos de cinc se unen al ARN y a proteínas (Clemens, K. R. et al. (1993) Science 260: 530-533; Bogenhagen, D. F. (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 5149-5158; Searles, M. A. et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 47-60; Mackay, J. P. y Crossley, M. (1998) Trends Biochem. Sci. 23: 1-4).
Las proteínas de dedos de cinc suelen contener cadenas de dominios (o módulos) de dedos de cinc. Por tanto, una proteína de dedo de cinc natural puede incluir dos o más dominios dedo de cinc, que pueden estar directamente adyacentes entre sí, p. ej., separados por una secuencia enlazadora corta (canónica) o similar a la canónica o a secuencias de polipéptido más largas, flexibles o estructuradas. Se espera que los dominios de dedo de cinc adyacentes unidos por secuencias enlazadoras cortas canónicas o similares a las canónicas de 5, 6 a 7 aminoácidos se unan a secuencias de ácidos nucleicos contiguas, es decir, suelen unirse a trinucleótidos/tripletes adyacentes; o estructuras proteicas. En algunos casos, también puede producirse unión cruzada entre dedos de cinc adyacentes y sus respectivos tripletes más grandes, lo que ayuda a fortalecer o potenciar el reconocimiento de la secuencia diana y da lugar a la unión de secuencias de cuadrupletes superpuestas (Isalan et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 5617-5621). Por el contrario, los dominios de dedo de cinc distantes dentro de la misma proteína pueden reconocer (o unirse a) secuencias de ácido nucleico no contiguas o incluso a moléculas diferentes (p. ej., proteínas en lugar de ácido nucleico). De hecho, las proteínas que contienen dedos de cinc de forma natural pueden incluir tanto dominios de dedo de cinc para la unión a estructuras proteicas como dominios de dedo de cinc para la unión a secuencias de ácidos nucleicos. De acuerdo con la invención, algunos pares de dominios de dedo de cinc adyacentes pueden estar separados por secuencias enlazadoras relativamente largas y flexibles. Estos dedos de cinc adyacentes pueden unirse a secuencias de ácido nucleico no contiguas, aunque también es posible que se unan a secuencias contiguas. En dichas realizaciones, la ubicación de unión relativa de los pares de dominios de dedo de cinc separados por secuencias enlazadoras largas puede estar determinada por el contexto de la secuencia, es decir, por interacciones de unión dominantes de otros dominios de dedo de cinc dentro del péptido.
La mayoría de las cadenas laterales de aminoácidos en un dominio de dedo de cinc que son importantes para el reconocimiento de bases de ADNbc se encuentran en la a-hélice del dedo. Convenientemente, por lo tanto, las posiciones de los aminoácidos en un dominio de dedo de cinc se numeran a partir del primer resto de la a-hélice, que recibe el número (+)1; y generalmente se considera que la hélice termina en el resto final de Cys o His de coordinación con cinc, que suele ser la posición 11. Por tanto, "-1" se refiere al resto de la estructura marco inmediatamente anterior al primer resto de la a-hélice. Como se emplea en esta memoria, los restos denominados "++" se encuentran en el dominio de dedo de cinc inmediatamente adyacente (C-terminal). En general, el reconocimiento del ácido nucleico por parte de un módulo de dedo de cinc se consigue principalmente por las cadenas laterales de aminoácidos en las posiciones -1, 3, 6 y +2; aunque otras posiciones de aminoácidos (especialmente de la a-hélice) pueden contribuir a veces a la unión entre el dedo de cinc y la molécula diana. Dado que la gran mayoría de las interacciones específicas de base entre el ADNbc y un dominio de dedo de cinc provienen de este tramo relativamente corto de aminoácidos, es conveniente definir la secuencia del dominio del dedo de cinc de -1 a 6 (es decir, los restos -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6) como una "secuencia de reconocimiento" del dedo de cinc. Para facilitar la comprensión, cabe destacar que el primer resto invariable de histidina que se coordina con el ion cinc es la posición (+)7 del dominio del dedo de cinc.
Al unirse a una secuencia de ácido nucleico, la secuencia de reconocimiento del dedo de cinc interactúa principalmente con una hebra de una molécula de ácido nucleico bicatenario (la hebra o secuencia primaria). Sin embargo, puede haber interacciones subsidiarias entre los aminoácidos de un dominio de dedo de cinc y la cadena complementaria (o secundaria) de la molécula de ácido nucleico bicatenaria. Por ejemplo, el resto de aminoácido en la posición +2 típicamente puede interactuar con un resto de ácido nucleico en la cadena secundaria.
Durante la unión, la hélice a del dominio del dedo de cinc se encuentra casi siempre dentro del surco principal del ADNbc y se alinea de forma antiparalela a la cadena de ácido nucleico diana. Por consiguiente, la secuencia primaria de ácido nucleico está dispuesta de 3' a 5' para que se corresponda con la secuencia N-terminal a C-terminal del péptido de dedo de cinc. Dado que las secuencias de ácidos nucleicos se escriben convencionalmente de 5' a 3', y las de aminoácidos de N-terminal a C-terminal, cuando una secuencia de ácido nucleico diana y un péptido de dedo de cinc se alinean de acuerdo con la convención, la interacción primaria del péptido de dedo de cinc es con la cadena complementaria (o negativa) de la secuencia de ácido nucleico, ya que es esta hebra la que está alineada de 3' a 5'. Estas convenciones se siguen en la nomenclatura utilizada en la presente memoria.
Los péptidos de dedo de cinc de acuerdo con la invención no son naturales y contienen convenientemente de 8 a 32, por ejemplo, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 24 o más (p. ej., hasta aproximadamente 30 o 32) dominios de dedo de cinc dispuestos de forma adyacente en tándem. Dichos péptidos pueden denominarse "péptidos con múltiples dedos de cinc". Los péptidos de dedo de cinc particularmente beneficiosos de la invención incluyen al menos 8 dominios de dedo de cinc, aún más preferiblemente al menos 11 o al menos 12 o al menos 18 dominios de dedo de cinc; y en algunos casos al menos 24 dominios de dedo de cinc. Preferiblemente, los péptidos de dedo de cinc de la invención tienen de 8 a 18, de 10 a 18 o de 11 a 18 dominios de dedo de cinc dispuestos en tándem (p. ej., 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18).
Como ya se ha señalado, los péptidos de dedo de cinc de la invención pueden unirse a sitios de unión de ácidos nucleicos no contiguos o contiguos. Cuando se dirige a sitios de unión no contiguos, cada sub-sitio (o semi-sitio cuando hay dos secuencias no contiguas) tiene convenientemente una longitud de al menos aproximadamente 18 bases, pero, como alternativa, pueden tener una longitud de aproximadamente 12, 15 o 24 bases. Los péptidos de dedo de cinc 11 preferidos de la invención se unen a secuencias de ácido nucleico de longitud completa que tienen aproximadamente 33 nucleótidos, pero que pueden contener dos subsitios de 18 y 15 nucleótidos dispuestos directamente adyacentes para formar una secuencia contigua, o que están separados por nucleótidos intermedios para crear un sitio diana no contiguo. Los péptidos de dedo de cinc 12 preferidos de la invención se unen a secuencias de ácido nucleico de longitud completa que tienen aproximadamente 36 nucleótidos, pero que puede contener dos subsitios de (convenientemente) 18 nucleótidos dispuestos directamente adyacentes para formar una secuencia contigua, o separados por nucleótidos intermedios como en el caso de un sitio diana no contiguo.
En los péptidos de (múltiples) dedos de cinc de la presente invención, los dominios de dedo de cinc adyacentes están unidos entre sí por "secuencias enlazadoras" que pueden ser canónicas, similares a las canónicas, flexibles o estructuradas, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 01/53480 (Moore et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441). En general, una secuencia enlazadora de dedo de cinc natural carece de estructura secundaria en la forma libre del péptido. Sin embargo, cuando la proteína está unida a su sitio diana, un enlazador canónico suele estar en una conformación extendida y lineal, y las cadenas laterales de aminoácidos dentro del enlazador pueden formar interacciones locales con el ácido nucleico adyacente. En una disposición en tándem de dominios de dedo de cinc, la secuencia enlazadora es la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre el último resto de la a-hélice en un dedo de cinc N-terminal y el primer resto de la lámina p en el siguiente dedo de cinc (es decir, adyacente al C-terminal). A efectos de la presente invención, el último aminoácido de la a-hélice de un dedo de cinc se considera el último resto de histidina (o cisteína) que se coordina con el cinc, mientras que el primer aminoácido del siguiente dedo es generalmente una tirosina, fenilalanina u otro resto hidrófobo.
Es deseable que los péptidos de dedo de cinc de la invención se unan de forma relativamente específica a su secuencia diana. Se apreciará, sin embargo, que la "especificidad" con respecto a una secuencia altamente repetitiva no es un concepto sencillo en el sentido de que tanto las secuencias repetitivas relativamente más cortas como las relativamente más largas pueden ser la diana y unirse con buena afinidad. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención (y como se describe en otra parte de la presente memoria), los péptidos de dedo de cinc de la invención pueden presentar una unión preferente a secuencias repetidas relativamente más largas que a secuencias repetidas relativamente más cortas.
La afinidad de unión (p. ej., la constante de disociación, Kd) es una forma de evaluar la interacción de unión entre un péptido de dedo de cinc de la invención y una secuencia potencial de ácido nucleico diana. Es conveniente medir la afinidad de unión de los péptidos de dedo de cinc optimizados para el hospedador de la invención para garantizar que las modificaciones de las secuencias del péptido de dedo de cinc (especialmente las de la región de la secuencia de reconocimiento) no han afectado negativamente a la afinidad de unión del ácido nucleico. La afinidad de unión de un péptido de dedo de cinc a su secuencia diana seleccionada / potencial puede medirse mediante técnicas conocidas por el experto en la técnica, como resonancia de plasmones superficiales o interferometría de biocapas. Las estrategias de biosensores se han revisado por Rich et al. (2009), "A global benchmark study using affinity-based biosensors", Anal. Biochem., 386: 194-216. Como alternativa, pueden realizarse ensayos de unión en tiempo real entre un péptido de dedo de cinc y el sitio diana mediante interferometría de biocapas con un sistema Octet Red (Fortebio, Menlo Park, CA).
Los péptidos de dedo de cinc de la invención tienen una afinidad de unión de pM o superior por una secuencia de ácido nucleico diana. Convenientemente, un péptido de dedo de cinc de la invención tiene una afinidad de unión nM o sub-nM para su secuencia diana específica; por ejemplo, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M o 10-12 M o menor. En algunas realizaciones particularmente preferidas, la afinidad de un péptido de dedo de cinc de la invención por su secuencia diana está en el intervalo pM o inferior, por ejemplo, en el intervalo de 10-13 M, 10-14 M o 10-15 M o menor.
La afinidad de unión entre un péptido de dedo de cinc de la invención y una secuencia de ácido nucleico diana puede evaluarse convenientemente mediante un ensayo ELISA, como sabe el experto en la técnica.
Los péptidos de dedo de cinc para dirigirse específicamente a repeticiones de CAG expandidas tienen una constante de disociación por las secuencias de 35 o más repeticiones de CAG que es al menos 2 veces mayor, al menos 5 veces o al menos 10 veces mayor que por secuencias con menos de 22 repeticiones de CAG. Convenientemente, la afinidad de dichos péptidos de dedo de cinc de la invención por las secuencias de ADN que tienen al menos 63 repeticiones de CAG es de al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 20 veces mayor que por secuencias que tienen menos de 22 repeticiones de CAG. La afinidad de estos péptidos de dedo de cinc por las secuencias de ADN que tienen al menos 104 repeticiones de CAG es de al menos 2 veces, al menos 10 veces o al menos 50 veces mayor que por secuencias que tienen menos de 22 repeticiones de CAG.
Armazones peptídicos de dedos de cinc y derivados
Los péptidos de dedo de cinc han demostrado ser armazones extremadamente versátiles para la ingeniería de nuevos dominios de unión al ADN (p. ej., Rebar y Pabo (1994) Science 263: 671-673; Jamieson et al, (1994) Biochemistry 33: 5689-5695; Choo y Klug (1994) Proc. Nati Acad. Sci. USA. 91: 11163-11167; Choo et a l, (1994) Nature 372: 642­ 645; Isalan y Choo (2000) J. Mol. Biol. 295: 471-477; y muchos otros).
Para una funcionalidad biológica específica y el uso terapéutico, especialmente in vivo (p. ej., en la terapia génica y los animales transgénicos), en general, es deseable que un péptido de dedo de poli-cinc de la invención sea capaz de dirigirse a sitios únicos o prácticamente únicos dentro de cualquier genoma. Para genomas complejos, como en los seres humanos, generalmente se considera que se requiere abordar al menos 16 pb para especificar una secuencia de ADN potencialmente única. Las secuencias de ADN más cortas tienen una probabilidad significativa de aparecer varias veces en un genoma, lo que aumenta la posibilidad de obtener efectos de direccionamiento génico no específico y biológicos no deseados. Dado que los dedos de cinc individuales se unen generalmente a tres nucleótidos consecutivos, 6 dominios de dedo de cinc con un sitio de unión de 18 pb podrían, en teoría, utilizarse para el reconocimiento específico de una secuencia diana única dentro de cualquier genoma. Por consiguiente, se han llevado a cabo numerosas investigaciones sobre los llamados "factores de transcripción de diseño" para la regulación de genes específicos, que suelen incluir 4 o 6 dominios de dedo de cinc que pueden estar dispuestos en tándem o en grupos dimerizables (p. ej., de unidades de tres dedos). El trabajo anterior de los presentes inventores (p. ej., el documento WO 2012/049332) fue el primero en demostrar que pueden sintetizarse y expresarse conjuntos en tándem de más de 6 dominios de dedo de cinc, tal como 8, 9, 10, 11, 12 o más (p. ej., 15, 16 o 18) dedos de cinc; y, lo que es más importante, que dichos conjuntos largos de dominios de dedo de cinc no naturales pueden tener una actividad de unión a ácidos nucleicos in vitro o in vivo (específica). En este trabajo anterior, los presentes inventores también informaron de que dichos conjuntos extendidos de péptidos de dedo de cinc eran capaces de dirigirse a secuencias de ADN genómico y tener actividad de modulación de genes in vitro y/o in vivo.
Como continuación de este trabajo anterior, los presentes inventores proporcionan en la presente descripción nuevas estructuras peptídicas extendidas de dedos de cinc mejoradas que comprenden al menos 8, al menos 10, al menos 11, al menos 12 o al menos 18 dominios de dedo de cinc. Las estructuras peptídicas de dedos de cinc comprenden de 8 a 32 dominios de dedo de cinc, de 8 a 28 péptidos de dedo de cinc, de 8 a 24 péptidos de dedo de cinc, o de 8 a 18 péptidos de dedo de cinc. Los péptidos de dedo de cinc preferidos comprenden 8, 10, 11, 12 o 18 dominios de dedo de cinc; y los péptidos de dedo de cinc particularmente preferidos comprenden 10, 11 o 12 dominios de dedo de cinc.
Las estructuras peptídicas de dedos de cinc de la invención pueden comprender dominios de dedo de cinc directamente adyacentes que tengan secuencias de enlace canónicas (o similares a las canónicas) entre dominios de dedo de cinc adyacentes, de forma que se unan preferiblemente a secuencias de ácido nucleico contiguas. Por consiguiente, un péptido (armazón) de 6 dedos de cinc es particularmente adecuado para unirse a tramos contiguos de aproximadamente 18 bases de ácido nucleico o más, particularmente de la hebra de ácido nucleico negativa. Los péptidos de dedo de cinc particularmente preferidos comprenden más de 8 dominios de dedo de cinc, tal como 10, 11, 12, 18, 24 o 32 dominios de dedo de cinc. Por lo general, dichos péptidos con múltiples dedos de cinc, están diseñados para unirse a secuencias de ácido nucleico que pueden estar dispuestas como un tramo contiguo o como un tramo no contiguo que comprende dos o tres subsitios. Por ejemplo, un péptido con 8 dedos de cinc es particularmente adecuado para unirse a una secuencia diana de aproximadamente 24 nucleótidos; un péptido con 10 dedos de cinc es adecuado para unirse a aproximadamente 30 nucleótidos; un péptido con 11 dedos de cinc es adecuado para unirse a aproximadamente 33 nucleótidos; un péptido con 12 dedos de cinc es capaz de unirse a aproximadamente 36 nucleótidos; y un péptido de 18 dedos de cinc es particularmente adecuado para unirse a aproximadamente 54 bases de ácido nucleico o más. Como ya se ha descrito, dichas secuencias diana pueden estar dispuestas de forma contigua o en subsitios no contiguos, especialmente dispuestos en, p. ej., 12, 15 o 18 nucleótidos de longitud.
Los conjuntos extendidos de dominios de dedo de cinc en los péptidos y polipéptidos comprenden típicamente secuencias de enlace canónicas, secuencias enlazadoras flexibles cortas (similares a las canónicas) y secuencias enlazadoras flexibles largas. Por tanto, en algunas realizaciones, uno o más pares de dominios de dedo de cinc adyacentes de un péptido de dedo de cinc de acuerdo con la invención pueden estar separados por secuencias enlazadoras canónicas cortas (p. ej., TGERP, SEQ ID NO: 66; TGEKP, SEQ ID NO: 6; etc.). Uno o más pares de dominios de dedo de cinc adyacentes de un péptido de dedo de cinc de acuerdo con la invención pueden estar separados por secuencias enlazadoras cortas y flexibles (p. ej., de 6 o 7 aminoácidos), secuencias enlazadoras "canónicas", que comprenden preferiblemente los restos de aminoácidos de un enlazador canónico con uno o dos restos de aminoácidos adicionales en su interior, antes o después de la secuencia canónica (preferiblemente dentro). Los dominios de dedo de cinc adyacentes separados por secuencias enlazadoras flexibles canónicas y cortas (es decir, que tienen una longitud de entre 5 y 7 aminoácidos) suelen unirse a sitios diana de ADN contiguos. De acuerdo con la invención, sin embargo, uno o más pares de dominios de dedo de cinc adyacentes de un péptido de dedo de cinc de acuerdo con la invención pueden estar separados secuencias enlazadoras largas flexibles, por ejemplo, que comprenden 8 o más aminoácidos, tal como entre 8 y 50 aminoácidos. Los enlazadores largos y flexibles particularmente adecuados tienen entre aproximadamente 10 y 40 aminoácidos, entre 15 y 35 aminoácidos o entre 20 y 30 aminoácidos. Los enlazadores flexibles largos preferidos pueden tener 18, 23 o 29 aminoácidos. Los dominios de dedo de cinc adyacentes, separados por enlazadores largos y flexibles, tienen la capacidad de unirse a sitios de unión no contiguos, además de la capacidad de unirse a sitios de unión contiguos. La longitud del enlazador flexible puede influir en la longitud del ADN que puede estar entre esos subsitios de unión no contiguos. Esto puede ser una ventaja particular de acuerdo con la invención, ya que los péptidos de dedo de cinc que se dirigen a secuencias de repetición de tripletes extendidos pueden tener varias opciones para unirse a secuencias diana contiguas y discontinuas.
Convenientemente, los péptidos/estructuras de dedos de cinc de la invención pueden comprender dos o más (p. ej., 2, 3 o 4) conjuntos de 4, 5, 6 u 8 dominios de dedo de cinc directamente adyacentes (o cualquier combinación de ellos) separados por enlaces largos y flexibles (o estructurados). Preferiblemente, dichos péptidos de dedos extendidos (polilínea) están dispuestos en múltiples series de 5 y/o 6 unidades de dedos separadas por enlazadores largos y flexibles.
Los inventores han demostrado que dichos péptidos de dedo de cinc extendidos de más de 6 dedos de cinc en total pueden mostrar una unión específica y de alta afinidad a las secuencias diana deseadas, tanto in vitro como in vivo. Además, se ha demostrado que los péptidos de dedo de cinc extendidos de la invención pueden expresarse de forma estable dentro de una célula diana, pueden ser no tóxicos para la célula diana, y pueden tener una actividad de modulación génica específica y deseada. Concretamente, se ha demostrado que las proteínas represoras de dedos de cinc de la invención pueden tener una expresión prolongada en las células diana in vivo, sin causar los efectos secundarios tóxicos que suelen asociarse a la expresión de secuencias proteicas heterólogas/exógenas in vivo.
Como se ha indicado anteriormente, los péptidos de dedo de cinc extendidos de las reivindicaciones están adaptados para unirse a secuencias repetidas (es decir, repeticiones de trinucleótidos) en los genes diana. Las secuencias de repetición diana adecuadas comprenden al menos 10 repeticiones de trinucleótidos, al menos 12 repeticiones de trinucleótidos, o al menos 20 repeticiones de trinucleótidos. De manera beneficiosa, hay al menos 22 repeticiones de trinucleótidos, al menos 29 repeticiones de trinucleótidos, al menos 35 repeticiones de trinucleótidos o más. En algunas partes de la descripción puede haber 36, 40, 42 o más repeticiones de trinucleótidos, como se indica en los números de repetición de las posibles dianas genéticas patógenas en la tabla 1.
Los péptidos de dedo de cinc extendidos de la invención se unen a secuencias dentro de secuencias expandidas CAG y/o CTG-repetidas en ADN bicatenario, p. ej., moléculas de ADN, fragmentos, secuencias génicas o cromatina. Convenientemente, el sitio de unión comprende repeticiones de 5'- GCA -3' y/o 5'- GCT -3'. Por tanto, el sitio de unión comprende preferiblemente repeticiones de la secuencia 5’- GCT/a -3’. De manera deseable, las secuencias diana para los péptidos de dedo de cinc extendidos preferidos de la invención comprenden 22 o más repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, tal como al menos 35 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, al menos 63 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, al menos 104 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas o al menos 111 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas.
Una ventaja particular de los péptidos de dedo de cinc de las reivindicaciones es que se unen a conjuntos más largos de secuencias de repetición de CAG o CTG con preferencia por conjuntos más cortos. Por consiguiente, los péptidos de dedo de cinc dirigidos a CAG (o CTG) de las reivindicaciones se unen más eficazmente (p. ej., con mayor afinidad o mayor capacidad de modulación de genes) a secuencias expandidas de CAG o CTG que contienen al menos 22 repeticiones, en comparación con las secuencias que contienen, p. ej., 10 o menos repeticiones. De forma similar, las secuencias que contienen al menos 35 repeticiones de CAG o CTG pueden unirse preferiblemente con respecto a secuencias que contienen 22 o menos repeticiones (incluyendo 10 o menos); las secuencias que contienen al menos
63 repeticiones de CAG o CTG pueden unirse preferiblemente con respecto a secuencias que contienen 35 o menos repeticiones (incluyendo 22 o menos, o 10 o menos); y las secuencias que contienen al menos 104 repeticiones de
CAG o CTG pueden unirse preferiblemente con respecto a secuencias que contienen 63 o menos repeticiones (incluyendo 35 o menos, 22 o menos, o 10 o menos).
Hay una serie de armazones naturales de dedos de cinc conocidos en la técnica, y cualquiera de estos armazones puede ser adecuado para su uso en los armazones de péptidos de dedo de cinc extendidos de la invención. En general, un armazón natural de dedos de cinc tiene la secuencia, fórmula 1: X0-2 C X1-5 C X9-14 H X3-6 h/c ; o fórmula 2:
X0-2 C X1-5 C X2-7 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3-6 h/c donde X es cualquier aminoácido, los números en subíndice indican los posibles números de restos representados por X, y los números en superíndice indican la posición del aminoácido en la a-hélice. El armazón del péptido de dedo de cinc extendido puede estar basado en un conjunto de dominios de dedo de cinc de fórmula 1 o 2. Como alternativa, el motivo de dedo de cinc puede estar representado por la secuencia general, fórmula 3: X2 C X2,4 C X12 H X3,4,5 h/c ; o fórmula 4: X2 C X2,4 C X5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H
X3,4,5 h/c . Aún más preferiblemente, el motivo de dedo de cinc puede estar representado por la secuencia general, fórmula 5: X2 C X2 C X12 H X3 H; o fórmula 6: X2 C X2 C X5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 estructura peptídica de dedo de cinc extendida de la descripción puede basarse en dominios de dedo de cinc de las fórmulas 1 a 6, o en combinaciones de las fórmulas 1 a 6, unidas entre sí en un conjunto que utiliza las secuencias enlazadoras descritas en el presente documento.
En estas fórmulas, los restos C y H fijos se coordinan con el ion cinc para estabilizar la estructura del dedo de cinc: el primer resto de H es la posición 7 de la a-hélice. Las posiciones particularmente preferidas para la diversificación dentro de los armazones de dominio de dedo de cinc de la descripción, para dirigir la unión a una diana deseada, son los que están dentro o adyacentes a la a-hélice, por ejemplo, las posiciones -1, 2, 3 y 6.
Como se describe en la presente memoria, el armazón del péptido de dedo de cinc extendido puede comprender al menos 11 dominios de dedo de cinc de una de las fórmulas 1 a 6, unidos entre sí mediante secuencias enlazadoras, es decir, la fórmula 7: [(Fórmula 1 -6) - enlazador]n -(Fórmula 1 -6)], donde n es >10, tal como entre 10 y 31. Como se ha indicado, en la fórmula 7 puede utilizarse cualquier combinación de las fórmulas 1 a 6. En otra realización, el armazón peptídico de dedo de cinc extendido comprende entre 10 y 18 (p. ej., de 11 a 18) dominios de dedo de cinc de las fórmulas anteriores. Convenientemente, por lo tanto, n es de 9 a 17 (p. ej., de 10 a 17); más adecuadamente, n es 9, 10, 11, 13, 14, 15 o 17; y preferiblemente n es 10, 11 o 17.
De acuerdo con la descripción, la secuencia de reconocimiento de uno o más de los dominios de dedo de cinc (es decir, las posiciones X-1, X+1, X+2, X+3, X+4, X+5 y X+6 en las fórmulas 2, 4 y 6 anteriores está representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, es decir, QSa/gDl/rt/kR. La secuencia de reconocimiento de uno o más dominios de dedo de cinc se selecciona de SEQ ID NO: 2 (QSADLTR), SEQ ID NO: 3 (QSGDLTR), SEQ ID NO: 4 (QSGDRKR) y SEQ ID NO: 5 (QSADRKR) o cualquier combinación de dos o más de las mismas. De acuerdo con la invención, las secuencias de reconocimiento de al menos ocho dominios de dedo de cinc en un péptido de dedos de cinc de la invención para dirigirse a secuencias diana de poli-CAG se selecciona de una combinación de las SEQ ID
NO: 2 y 5; de una combinación de las SEQ ID NO: 3 y 4; de una combinación de las SEQ ID NO: 2, 3 o 4; o de una combinación de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5. Por tanto, en una realización, se proporciona un péptido de dedo de cinc (de unión a ADN) producido por ingeniería genética que comprende al menos 10, 11, 12 o 18 dominios de dedo de cinc que tienen las secuencias de reconocimiento de dedo de cinc de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5. En otra realización, se proporciona un péptido de dedo de cinc (de unión a ADN) producido por ingeniería genética que comprende al menos 10, 11, 12 o 18 dominios de dedo de cinc que tienen las secuencias de reconocimiento de SEQ ID NO: 3 y
SEQ ID NO: 4. De manera beneficiosa, por lo tanto, los péptidos de dedo de cinc producidos por ingeniería genética de la invención comprenden al menos 10, 11, 12 o 18 módulos de dedo de cinc. En algunas realizaciones, los péptidos de dedo de cinc de la invención comprenden más de 10, 11, 12 o 18 dominios de dedo de cinc, tal como cualquier número entre 11 y 32 dominios de dedo de cinc, a condición de que al menos 10, 11, 12 o 18 dominios adyacentes tengan la secuencia de reconocimiento especificada. En las realizaciones de la invención en donde cada dominio de dedo de cinc del péptido con múltiples dedos de cinc tiene las secuencias de reconocimientos anteriores, se entenderá que pueden sustituirse una o más secuencias de reconocimiento de SEQ ID NO: 2 por la secuencia de SEQ ID NO: 5 y viceversa y pueden sustituirse una o más secuencias de reconocimiento de SEQ ID NO: 3 por la secuencia de SEQ
ID NO: 4 y viceversa, sin alterar sustancialmente las características de reconocimiento y unión del péptido de dedo de cinc y dichos péptidos de dedo de cinc alternativo se encuentran abarcados dentro del alcance de las reivindicaciones.
Como ya se ha descrito, los dominios de dedo de cinc adyacentes están unidos entre sí por secuencias enlazadoras.
En una proteína de dedo de cinc natural, la treonina suele ser el primer resto del enlazador, y la prolina suele ser el último resto del enlazador. Basándose en la homología de secuencia, la secuencia enlazadora natural canónica se considera -TGEKP-(Enlazador 1 o L1; SEQ ID NO: 6). Sin embargo, los enlazadores naturales pueden variar mucho
en cuanto a la secuencia de aminoácidos y la longitud. Por lo tanto, una secuencia consenso común basada en secuencias enlazadoras naturales puede estar representada por -TGe/qk/rP-(Enlazador 2 o L2; SEQ ID NO: 7), y esta secuencia se prefiere para su uso como un enlazador "canónico" (o "similar a canónico") de acuerdo con la invención. Por tanto, otra secuencia canónica de enlace útil es -TGQKP-(SEQ ID NO: 65).
Sin embargo, en los conjuntos de dedos de cinc extendidos de, p. ej., 4 o más dominios de dedo de cinc, se ha demostrado que puede ser beneficioso interrumpir periódicamente la secuencia enlazadora canónica, cuando se utiliza entre dedos de cinc adyacentes en un conjunto, añadiendo uno o más restos de aminoácidos (p. ej., Gly y/o Ser), para crear subconjuntos de dominios de dedo de cinc (p. ej., grupos de 2 o 3 dominios de dedo de cinc) dentro conjunto (Moore et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441; y el documento WO 01/53480). Por lo tanto, las secuencias enlazadoras adecuadas para su uso de acuerdo con la invención incluyen las secuencias enlazadoras canónicas de 5 aminoácidos (p. ej., el enlazador 1 o el enlazador 2 anteriores), y las secuencias enlazadoras relacionadas similares a las canónicas de 6 o 7 aminoácidos.
Los enlazadores similares a los canónicos para su uso de acuerdo con la invención pueden basarse convenientemente en la secuencia, -TGg/se/qk/rP-(Enlazador 3 o L3; SEQ ID NO: 8). Por lo tanto, los enlazadores preferidos similares a los canónicos incluyen las secuencias específicas: TGGERP (SEQ ID NO: 9), Tg SERP (SEQ ID NO: 10), TGGQRP (SEQ ID NO: 11), TGSQRP (SEQ ID NO: 12), TGGEKP (SEQ ID NO: 13), TGSEKP (SEQ ID NO: 14), TGGQKP (SEQ ID NO: 15) o TGSQKP (SeQ ID NO: 16). Un enlazador similar a uno canónico particularmente preferido es TGSERP (enlazador 4 o L4; SEQ ID NO: 10). Otro enlazador similar a uno canónico particularmente preferido es TGSQKP (enlazador 5 o L5; SEQ ID NO: 16). Sin embargo, también pueden utilizarse otras secuencias enlazadoras entre uno o más pares de dominios de dedos de cinc, por ejemplo, enlazadores con la secuencia -TG(g/s)ü-2e/qk/rP-(SEQ ID NO: 17) o -T(g/s)o-2Ge/qk/rP-(Enlazador 6 o L6; SEQ ID NO: 18).
Pueden utilizarse enlazadores largos y flexibles de 8 o más aminoácidos, como se ha descrito anteriormente. Los enlazadores de 8 aminoácidos incluyen las secuencias -TG(g/s)3e/qk/rP-(SEQ ID NO: 19) y -T(g/s)3Ge/qk/rP-(L12; SEQ ID NO: 20). Los enlazadores largos y flexibles alternativos son: LRQKD(GGGGS)1-4QlVg Ta ERP (Enlazador 7 0 L7; SEQ ID n O: 21) y LRQKD(GGGGS)1-4QKP (Enlazador 8 o L8; SEQ ID n O: 22). Los enlazadores largos y flexibles preferidos para su uso en los péptidos de dedo de cinc de la invención son, LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQLVGTAERP (Enlazador 9 o L9; SEQ ID NO: 23), y LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQKP (Enlazador 10 o L10; SEQ ID NO: 24).
Los presentes inventores han demostrado que seleccionando secuencias enlazadoras adecuadas y combinaciones adecuadas de secuencias enlazadoras dentro de un conjunto de dedos de cinc, se pueden sintetizar conjuntos extendidos de péptidos de dedo de cinc de al menos 8 o 10 dedos de cinc (tal como 10, 11, 12 o 18), expresarse y puede tener una actividad selectiva de orientación genética. Los conjuntos extendidos de péptidos de dedo de cinc de la invención están convenientemente dispuestos en tándem. Dichos péptidos de 11 o 12 dedos de cinc pueden reconocer y unirse específicamente a 33 o 36 restos de ácido nucleico, respectivamente y los conjuntos más largos (tal como los péptidos de 18 dedos de cinc) reconocen secuencias de ácidos nucleicos aún más largas. De este modo, los péptidos de dedo de cinc extendidos de la invención pueden dirigirse a secuencias genómicas preferidas, es decir, secuencias de repetición de CAG expandidas, especialmente las asociados a genes de enfermedades poliglutamínicas.
Además, también cabría esperar un aumento significativo de la afinidad de unión, en comparación con los péptidos de dedo de cinc con menos dedos. Por ejemplo, mientras que un péptido de 3 dedos (con una secuencia de reconocimiento de 9 pb) puede unirse al ADN con afinidad nanomolar, puede esperarse que un péptido con 6 dedos se una a una secuencia de 18 pb con una afinidad de entre 10-9 y 10-l8 M, dependiendo de la disposición y la secuencia de los péptidos de dedo de cinc. Para optimizar tanto la afinidad como la especificidad de los péptidos de 6 dedos, se ha demostrado que una fusión de tres dominios de 2 dedos es ventajosa (Moore et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441; y el documento WO 01/53480). Por lo tanto, en algunas realizaciones de la invención, los péptidos de dedo de cinc de la invención comprenden subconjuntos de unidades de 2 dedos dispuestos en tándem. Los péptidos de dedo de cinc de la invención pueden incluir o comprender como alternativa subconjuntos de unidades de 3 dedos.
Por consiguiente, la estructura de dedos de cinc extendida de la descripción puede comprender una secuencia seleccionada entre:
SEQ ID NO: 25 N’-[(Fórmula 2) - X6]no - {[(Fórmula 2) - X5 -(Fórmula 2) - Xsjrn -[(Fórmula 2) - X5 -(Fórmula 2) - XL]}n2 - [(Fórmula 2) - X5 -(Fórmula 2) - X6]n3 -[(Fórmula 2) - X5 -(Fórmula 2)] -[X6 -(Fórmula 2) -]n4 -C’, en donde n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, X5 es una secuencia enlazadora de 5 aminoácidos, X6 es una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoácidos, y Xl es un enlazador de al menos 8 aminoácidos, y en donde la secuencia de fórmula 2 comprende la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 26 N’-[(Fórmula 1-6) - L3]no- {[(Fórmula 1-6) - L2 -(Fórmula 1-6) - L3]n1 -[(Fórmula 1-6) - L2 -(Fórmula 1 -6) - XL]}n2 -[(Fórmula 1 -6) - L2 -(Fórmula 1 -6) - L3]n3 -[(Fórmula 1 -6) - L2 -(Fórmula 1 -6)] -[L3 -(Fórmula 1 -6)]n4-C’ donde n0, n1, n2, n3, n4 and Xl son como se definió anteriormente y en donde las secuencias de cada una de las fórmulas 1-6 comprende la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 27 N’-[(Fórmula 1-6) - L4]no- {[(Fórmula 1-6) - L1 -(Fórmula 1-6) - L4]n1 -[(Fórmula 1-6) - L1 -(Fórmula 1-6) - Xi_]}n2 -[(Fórmula 1 -6) - L1 -(Fórmula 1 -6) - L4]n3 -[(Fórmula 1 -6) - L1 -(Fórmula 1 -6)] -[L4 -(Fórmula 1 -6)]n4-C’, donde n0, n1, n2, n3, n4 and Xl son como se definió anteriormente y en donde las secuencias de cada una de las fórmulas 1-6 comprende la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, Xl se selecciona de L7, L8, L9 o L10; y lo más preferiblemente, Xl es L9 (SEQ ID NO: 23). En un péptido de 11 dedos de cinc particularmente útil de la invención, n0 es 1, n1 es 1, n2 es 1, n3 es 2, n4 es 0 y Xl es L9. En un péptido de 12 dedos de cinc particularmente útil de la invención, n0 es 0, n1 es 2, n2 es 1, n3 es 2, n4 es 0 y XL es L9. En un péptido de 10 dedos de cinc particularmente útil de la invención, n0 es 0, n1 es 1, n2 es 1, n3 es 2, n4 es 0 y Xl es L9. Lo más preferiblemente, el armazón de dedo de cinc en cada uno de los dominios de SEQ ID NO: 27 corresponde a la fórmula 6.
SEQ ID NO: 28 N’-[(Fórmula 1-6) - L5]n0- {[(Fórmula 1-6) - L1 -(Fórmula 1-6) - L5]n1 -[(Fórmula 1-6) - L1 -(Fórmula 1-6) - XL]}n2 -[(Fórmula 1 -6) - L1 -(Fórmula 1 -6) - L5]n3 -[(Fórmula 1 -6) - L1 -(Fórmula 1 -6)] -[L5 -(Fórmula 1 -6)]n4-C’, donde n0, n1, n2, n3, n4 and Xl son como se definió anteriormente y en donde las secuencias de cada una de las fórmulas 1-6 comprende la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, Xl se selecciona de L7, L8, L9 o L10; y lo más preferiblemente, Xl es L10 (SEQ ID NO: 24). En un péptido de 11 dedos de cinc particularmente útil de la invención, n0 es 1, n1 es 1, n2 es 1, n3 es 2, n4 es 0 y Xl es L10. En un péptido de 12 dedos de cinc particularmente útil de la invención, n0 es 0, n1 es 2, n2 es 1, n3 es 2, n4 es 0 y Xl es L10. En un péptido de 10 dedos de cinc particularmente útil de la invención, n0 es 0, n1 es 1, n2 es 1, n3 es 2, n4 es 0 y Xl es L10. Lo más preferiblemente, el armazón de dedo de cinc en cada uno de los dominios de SEQ ID NO: 28 corresponde a la fórmula 6.
Para evitar dudas, los guiones en las fórmulas y las SEQ ID NO de la descripción tan solo representan enlaces y por tanto, estas fórmulas y SEQ ID también pueden representarse sin guiones.
En algunas realizaciones de la invención, en las SEQ ID NO: 25 a 28, n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 3, n2 es 1 o 2, n3 es 2 o 3, n4 es 0 y Xl es de aproximadamente 8 a 50. Como alternativa, n0 es 0, n1 es 2 o 3, n2 es 1 o 2, n3 es 2 y n4 es 0 y/o Xl es de aproximadamente 11 a 40 aminoácidos. En otras realizaciones adicionales, n0 es 0, n1 es 2, n2 es 1 o 2, n3 es 2 y n4 es 0; y/o Xl es de aproximadamente 15 a 35 aminoácidos. En realizaciones alternativas, Xl es de aproximadamente 18 a 29 aminoácidos. Lo más preferiblemente, Xl se selecciona de L7, L8, L9 y L10. De acuerdo con la descripción de "(Fórmula 1-6)", las SEQ ID NO: 25 a 28 representan una cualquiera de las fórmulas 1 a 6, y cada "(Fórmula 1-6)" puede ser igual o diferente; pero es convenientemente la misma.
En los armazones de dedos de cinc anteriores, el número total de dominios de dedo de cinc es preferiblemente de 10 a 18, especialmente 10, 11, 12 o 18, y la secuencia de reconocimiento del dedo de cinc se selecciona preferiblemente de una secuencia de SEQ ID NO: 1. Los péptidos de dedo de cinc particularmente preferidos tienen 11 o 12 dominios de dedo de cinc, cada uno de los cuales tiene una secuencia de reconocimiento seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2 o 5, o del grupo de SEQ ID NO: 3 o 4. Estas secuencias de reconocimiento se seleccionan de tal forma que el péptido con múltiples dedos de cinc se une eficazmente a secuencias de ácido nucleico de repetición de CAG y, asimismo, de tal forma que se minimizan las secuencias peptídicas no del hospedador en el hospedador de expresión preferido (p. ej., ratón o ser humano). Las secuencias ilustrativas del péptido de 11 dedos de cinc de la invención comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ iD No : 33 o SEQ ID NO: 35 (véase la tabla 9).
La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias peptídicas de la invención. En vista de la redundancia de codones, se apreciará que muchas secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes pueden codificar con precisión cada uno de los péptidos de dedo de cinc de la invención, y cada una de estas variantes se engloba dentro del alcance de la presente invención. Las secuencias codificantes de dedos de cinc ilustrativas comprenden las SEQ ID NO: 30, 32, 34 y 36 que codifican los péptidos de dedo de cinc de las SEQ ID NO: 29, 31,33 y 35, respectivamente (véase la tabla 9). La invención también abarca cualquier otra secuencia de ácido nucleico que codifique los péptidos de las SEQ ID n O: 29, 31,33 y 35.
Se apreciará que las secuencias de armazón peptídico de dedo de cinc de la invención pueden incluir secuencias líder (N-terminales) opcionales, tales como: aminoácidos para facilitar la expresión (p. ej., dipéptido de Met-Ala o Met-Gly N-terminal); marcadores de purificación (p. ej., marcadores FLAG); y secuencias de localización/direccionamiento (p. ej., secuencias de localización nuclear (NlS), tales como PKKKRKV; (NLS de SV40, SEQ ID NO: 37), PKKRRKVT; (proteína humana KIAA2022, SEQ ID NO: 46) o RIRKKLR; (primasa de ratón p58 NLS9, SEQ ID NO: 38). Asimismo, los péptidos pueden incluir opcionalmente secuencias C-terminales adicionales, tales como: secuencias enlazadoras para fusionar dominios de dedo de cinc a moléculas efectoras; y moléculas efectoras. Se pueden emplear otras secuencias con fines de clonación. Pueden variarse las secuencias de cualquier N o C-terminal, normalmente sin alterar la actividad de unión del armazón de péptido de dedo de cinc y dichas variantes están abarcadas dentro del alcance de las reivindicaciones. Las secuencias adicionales preferidas compatibles con el hospedador son el dipéptido Met-Gly para la expresión en seres humanos y ratones; secuencias de localización nuclear humanas (PKKRRKVT, SEQ iD NO: 46) o de ratón (RIRKKLR, SEQ ID NO: 38) para la expresión en seres humanos o en ratones, respectivamente; y secuencias de dominio efector procedentes del hospedador como se ha descrito anteriormente. De manera adecuada, un péptido de dedo de cinc de la invención para su expresión y uso en ratones o seres humanos, respectivamente, no incluye marcadores de purificación cuando no se pretende purificar el péptido que contiene dedos de cinc, p. ej., cuando se pretende realizar actividades reguladoras y/o terapéuticas de los genes. Por tanto, con el objetivo de mejorar el emparejamiento con el hospedador (toxicidad reducida e inmunogenia reducida), los péptidos y polipéptidos de las reivindicaciones están preferiblemente desprovistos de marcadores de purificación peptídicos y similares, que no se encuentran en las proteínas endógenas de tipo silvestre de un organismo hospedador.
Los polipéptidos particularmente preferidos comprenden una secuencia de localización nuclear adecuada dispuesta en N-terminal de un péptido con múltiples dedos de cinc, que a su vez está dispuesta en N-terminal con respecto a un dominio efector que puede reprimir la expresión de un gen diana. Los dominios efectores se unen convenientemente de manera covalente al péptido con múltiples dedos de cinc, tal como mediante una secuencia enlazadora peptídica como se describe en otras partes en la presente memoria.
Las reivindicaciones también abarcan los derivados de los péptidos de dedo de cinc. En este sentido, se apreciará que las modificaciones, como las sustituciones de aminoácidos, pueden realizarse en una o más posiciones del péptido sin afectar negativamente a sus propiedades físicas (como la especificidad o afinidad de unión). Por "derivado" de un péptido de dedo de cinc se entiende una secuencia peptídica que tiene la actividad deseada seleccionada (p. ej., afinidad de unión a una secuencia diana seleccionada, especialmente secuencias de poli CAG), pero que además incluye una o más mutaciones o modificaciones en la secuencia de aminoácidos primaria. Por tanto, un derivado de la invención puede tener una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más) cadenas laterales de aminoácidos químicamente modificadas, tales como las modificaciones de pegilación, sialilación y glicosilación. Además o como alternativa, un derivado puede contener una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más) mutaciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácidos o combinaciones de estos con respecto a la secuencia primaria de un péptido de dedo de cinc seleccionado. Por consiguiente, pueden realizarse experimentos de maduración en un péptido de dedo de cinc o un armazón de péptido de dedo de cinc seleccionado a fin de mejorar o cambiar una o más características del péptido inicialmente identificado. A modo de ejemplo, pueden mutarse (o sustituirse) de manera aleatoria o específica uno o más restos de aminoácidos de un dominio de dedo de cinc seleccionado utilizando métodos conocidos en la técnica (p. ej., modificando la secuencia de ADN o ARN codificante). La biblioteca o población de péptidos derivados resultante puede seleccionarse además, mediante cualquier método conocido en la técnica, de acuerdo con los requisitos predeterminados: tal como especificidad mejorada contra sitios diana particulares; o propiedades farmacológicas mejoradas (p. ej., solubilidad, biodisponibilidad, inmunogenia, etc.). Una ventaja particular de la invención es la mejora de la compatibilidad con el organismo hospedador/diana, evaluada por la similitud de la secuencia con las secuencias peptídicas conocidas del hospedador y/o la inmunogenia/respuesta inmunitaria adversa al péptido heterólogo cuando se expresa. Los péptidos seleccionados para exhibir dichas características adicionales o mejoradas y que muestran la actividad para la que el péptido fue inicialmente seleccionado son derivados de los péptidos de dedo de cinc de la invención y también pueden estar dentro del alcance de las reivindicaciones
Los marcos de dedos de cinc de la invención pueden diversificarse en una o más posiciones para mejorar su compatibilidad con el sistema hospedador en el que se pretende expresar las proteínas. Concretamente, se pueden realizar sustituciones específicas de aminoácidos dentro de las secuencias del péptido de dedo de cinc y en cualquier secuencia adicional del péptido (como los dominios efectores) para reducir o eliminar las posibles respuestas inmunológicas a la expresión de estos péptidos heterólogos in vivo. Los restos de aminoácidos diana para su modificación o diversificación son, en particular, los que crean secuencias de aminoácidos no del hospedador o epítopos que podrían no ser reconocidos por el organismo hospedador y, en consecuencia, podrían provocar una respuesta inmunitaria no deseada. En algunas partes de la descripción, el armazón se diversifica o modifica en una o más de las posiciones de aminoácidos -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de la secuencia de reconocimiento. Los cambios en la secuencia polipeptídica pueden lograrse convenientemente diversificando o mutando la secuencia de ácido nucleico que codifica los armazones del péptido de dedo de cinc en los codones de al menos una de esas posiciones, para codificar una o más variantes del polipéptido. Dichas variantes de ácidos nucleicos y polipéptidos pueden entrar dentro del alcance de las reivindicaciones.
Los restos de aminoácidos en cada una de las posiciones seleccionadas pueden aleatorizarse de manera no selectiva, es decir, permitiendo que el aminoácido en la posición en cuestión sea cualquiera de los 20 aminoácidos comunes que se encuentran en la naturaleza; o pueden aleatorizarse o modificarse de manera selectiva, es decir, permitiendo que el aminoácido específico sea uno cualquiera o más aminoácidos de un subgrupo definido de los 20 aminoácidos de origen natural. Se apreciará que una forma de crear una biblioteca de péptidos mutantes con aminoácidos modificados en cada ubicación seleccionada, es mutar específicamente o aleatorizar el codón de ácido nucleico de la correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica el aminoácido seleccionado. Por otro lado, dado el conocimiento que se ha acumulado en relación con la unión específica de la secuencia de los dominios de dedo de cinc a los ácidos nucleicos, puede ser conveniente seleccionar un aminoácido específico (o un pequeño subgrupo de aminoácidos) en una o más posiciones elegidas en el dominio del dedo de cinc, por ejemplo, en donde se sabe que un aminoácido específico proporciona una unión óptima a un resto de nucleótido concreto en una secuencia diana específica. Estos péptidos o estructuras son el resultado de un diseño "inteligente". Convenientemente, la totalidad de la secuencia de reconocimiento del dedo de cinc puede seleccionarse mediante diseño inteligente e insertarse/incorporarse en un armazón de dedo de cinc adecuado y en ambos casos, de manera ideal, proceden del organismo hospedador previsto, tal como un ratón o ser humano. El experto en la técnica conoce bien las secuencias de codones que pueden utilizarse para especificar uno o más restos de aminoácidos concretos dentro de una biblioteca. Preferiblemente, todas las posiciones de aminoácidos en cada dominio de dedo de cinc y en cualquier secuencia peptídica adicional (como los dominios efectores y las secuencias líder) se seleccionan de secuencias de tipo silvestre conocidas de ese organismo hospedador.
Moduladores y efectores de péptidos de dedo de cinc
Mientras que los péptidos de dedo de cinc de la invención pueden tener propiedades biológicas útiles en el aislamiento, también se les puede dar funciones biológicas útiles mediante la adición de dominios efectores. Por lo tanto, en algunos casos es deseable conjugar un péptido de dedo de cinc de la invención con uno o más dominios que no son dedos de cinc, creando así péptidos de dedo de cinc quiméricos o de fusión. También puede ser deseable, en algunos casos, para crear un multímero (p. ej., un dímero), de un péptido de dedo de cinc de la invención, por ejemplo, para unirse a más de una secuencia diana simultáneamente.
Por tanto, habiendo identificado un péptido de dedo de cinc deseable, un efector o grupo funcional apropiado puede entonces unirse, conjugarse o fusionarse con el péptido de dedo de cinc. La proteína resultante de la invención, que comprende al menos una porción de dedo de cinc (de más de un dominio de dedo de cinc) y un dominio, porción o resto de efector que no es de dedo de cinc puede denominarse péptido de dedo de cinc de "fusión", "quimérico" o "compuesto". De manera beneficiosa, el péptido de dedo de cinc se unirá al otro resto a través de sitios que no interfieren con la actividad de cualquiera de los restos.
Un "dominio no de dedo de cinc" (o resto), como se emplea en esta memoria, se refiere a una entidad que no contiene un pliegue de dedo de cinc (ppa-). Por tanto, las moléculas que no son dedos de cinc incluyen ácidos nucleicos y otros polímeros, péptidos, proteínas, ácidos peptidonucleicos (APN), anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas pequeñas, entre otros.
Los péptidos de dedo de cinc quiméricos o las proteínas de fusión de la invención se utilizan para regular hacia arriba o hacia abajo los genes diana deseados, in vitro o in vivo. Por tanto, los dominios efectores potenciales incluyen dominios represores transcripcionales, dominios de activación transcripcional, dominios aislantes transcripcionales, remodelación de la cromatina, dominios de condensación o descondensación, dominios de escisión de ácidos nucleicos o proteínas, dominios de dimerización, dominios enzimáticos, secuencias o dominios de señalización/dirección, o cualquier otro dominio biológicamente funcional adecuado. Otros dominios que también pueden añadirse a los péptidos de dedo de cinc de la invención (y que tienen funcionalidad biológica) incluyen secuencias peptídicas que participan en el transporte de proteínas, secuencias de localización (p. ej., secuencias de localización subcelular, localización nuclear, orientación de proteínas) o secuencias de señal. Los péptidos de dedo de cinc también pueden fusionarse con etiquetas epitópicas (p. ej., para señalar la presencia o la ubicación de una secuencia de nucleótidos diana reconocida por el péptido de dedo de cinc. También pueden utilizarse fragmentos funcionales de cualquiera de estos dominios.
De manera beneficiosa, los péptidos de dedo de cinc y las proteínas/polipéptidos de fusión de la descripción pueden tener actividad moduladora transcripcional y, por lo tanto, los dominios efectores biológicos preferidos incluyen dominios de modulación transcripcional, como activadores y represores transcripcionales, así como sus fragmentos funcionales. El dominio efector puede proceder directamente de un factor de transcripción basal o regulado, tal como, por ejemplo, transactivadores, represores y proteínas que se unen a secuencias aislantes o silenciadoras (véase Choo y Klug (1995) Curr. Opin. Biotech. 6: 431-436; Choo y Klug (1997) Curr. Opin. Str. Biol. 7:117-125; y Goodrich et al. (1996) Cell 84: 825-830); o de receptores, tales como receptores de hormonas nucleares (Kumar y Thompson (1999) Steroids 64: 310-319); o coactivadores y correpresores (Ugai et al. (1999) J. Mol. Med. 77: 481-494).
Otros dominios funcionales útiles para el control de la expresión génica son, por ejemplo, dominios modificadores de proteínas, tales como las histona acetiltransferasas, cinasas, metilasas y fosfatasas, que pueden silenciar o activar genes modificando la estructura del ADN o las proteínas que se asocian a los ácidos nucleicos (Wolffe (1996) Science 272: 371-372; y Hassig et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3519-3524). Otros dominios efectores útiles son los que modifican o reordenan las moléculas de ácido nucleico, tales como metiltransferasas, endonucleasas, ligasas, recombinasas y dominios de escisión de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res, 17: 3361-9; documento WO 2007/139982 y las referencias citadas en el mismo), tales como el dominio de la endonucleasa Fokl, que, junto con los péptidos de dedo de cinc de la invención, pueden utilizarse para truncar secuencias genómicas de repetición de poli-CAG.
Los dominios potenciales de activación transcripcional/genética para fusionar con los péptidos de dedo de cinc de la invención incluyen el dominio VP64 (véase Seipel et al., (1996) EMBO J. 11: 4961 -4968) y el dominio VP16 del virus del herpes simple (VHS) (Hagmann et al. (1997) J. Virol.71: 5952- 5962; Sadowski et al. (1988) Nature 335: 563-564); y el dominio de transactivación 1 y/o 2 de la subunidad p65 del factor nuclear-KB (NFkB; Schmitz et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 15576-15584).
En general, para un efecto terapéutico o diagnóstico útil, es deseable regular negativamente o reprimir la expresión de los genes asociados a la enfermedad poliglutamínica que son objeto de la presente invención. Por lo tanto, se prefieren los dominios efectores que efectúan la represión o el silenciamiento de la expresión del gen diana. Concretamente, los péptidos de la invención comprenden adecuadamente dominios efectores que causan la represión o el silenciamiento de los genes diana cuando el dominio de unión a ácidos nucleicos de dedo de cinc de la proteína se une directamente con secuencias de repetición de CAG asociadas al gen diana.
En una realización, el dominio de represión transcripcional es el dominio de la caja asociada a Kruppel (KRAB), que es un potente represor de la actividad génica. En algunas realizaciones preferidas, por lo tanto, los péptidos de dedo de cinc o las estructuras de la invención se fusionan con el dominio represor KRAB de la proteína humana Kox-1 para reprimir la actividad de un gen diana (p. ej., véase Thiesen et al. (1990) New Biologist 2: 363-374). Los fragmentos de la proteína Kox-1 que comprenden el dominio KRAB, hasta e incluyendo la proteína Kox completa, pueden utilizarse como dominios de represión transcripcional, como se describe en Abrink et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1422-1426. Una secuencia de dominio Kox-1 humana útil para la inhibición de genes diana en seres humanos se muestra en la tabla 6 (SEQ ID NO: 39). Una secuencia de dominio represor KRAB de ratón útil para la inhibición de genes diana en ratones es el análogo de ratón de Kox-1 humano, es decir, el dominio KRAB del ratón ZF87 (SEQ ID NO: 40). Otros dominios represores transcripcionales conocidos en la técnica pueden utilizarse como alternativa de acuerdo con el resultado deseado y el hospedador previsto, tal como el dominio engrailed, el dominio snagy el dominio de represión transcripcional de v-erbA.
Se incorporan todos los métodos conocidos para conjugar un dominio efector con una secuencia peptídica. El término "conjugado" se utiliza en su sentido más amplio para abarcar todos los métodos de unión o acoplamiento conocidos en la técnica, y se utiliza indistintamente con términos como "enlazado", "ligado", "asociado" o "adjunto". El o los dominios efectores pueden estar unidos de forma covalente o no covalente al dominio de unión: por ejemplo, cuando el dominio efector es un polipéptido, puede estar directamente ligado a un péptido de dedo de cinc (p. ej., en el extremo C) por medio de cualquier secuencia de aminoácidos enlazadora flexible o estructurada (codificada por la correspondiente molécula de ácido nucleico). En la tabla 6 se ilustran secuencias enlazadoras no limitantes para unir un dominio efecto al extremo C de un péptido de dedo de cinc (p. ej., LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQLVSS, SEQ ID NO: 41; LRQKDGGGGSGGGGSS, SEQ ID NO: 42; y LRQKDGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 43). Como alternativa, puede utilizarse un enlazador sintético no aminoacídico o químico, tal como polietilenglicol, un enlace de maleimidatiol (útil para unir ácidos nucleicos a aminoácidos) o un enlace de disulfuro. Los enlazadores sintéticos se encuentran disponibles comercialmente y son conocidos en la técnica métodos de conjugación química. Un enlazador preferido para conjugar el dominio kox-1 humano con un péptido de dedo de cinc de la invención es el péptido de SEQ ID NO: 42. Un enlazador preferido para conjugar el dominio ZF87 de ratón con un péptido de dedo de cinc de la invención es el péptido de SEQ ID NO: 43.
Los enlaces no covalentes entre un péptido de dedo de cinc y un dominio efector pueden formarse utilizando, por ejemplo, dominios de cremallera de leucina/superhélice, u otros dominios de dimerización naturales o sintéticos (Luscher y Larsson (1999) Oncogene 18: 2955-2966; y Gouldson et al. (2000) Neuropsychopharm. 23: S60-S77. Otros medios no covalentes de conjugación pueden incluir un enlace biotina-(estrept)avidina o similares. En algunos casos, también se pueden emplear adecuadamente las interacciones entre un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) y un antígeno, tal como la interacción fluoresceína-antifluoresceína.
Para provocar un efecto biológico deseado mediante la modulación de la expresión génica, los péptidos de dedo de cinc o sus correspondientes péptidos de fusión pueden interactuar con, y unirse a, una o más secuencias de nucleótidos asociadas al gen diana, ya sea in vivo o in vitro, dependiendo de la aplicación. De manera beneficiosa, por lo tanto, un dominio de localización nuclear se une al dominio de unión al ADN para dirigir la proteína al núcleo. Una secuencia de localización nuclear útil es la NLS de SV40 (PKKKRKV, SEQ ID NO: 37). De manera deseable, sin embargo, la secuencia de localización nuclear es una secuencia derivada del hospedador, tal como la NLS de la proteína humana KIAA2022 NLS (PKKRRKVT; NP_001008537.1, SEQ ID NO: 46) para su uso en seres humanos; o la NLS de la primasa de ratón p58 (RIRKKLR; GenBank: BAA04203.1, SEQ ID NO: 38).
Por tanto, los polipéptidos preferidos que contienen dedos de cinc de la descripción incluyen una secuencia de localización nuclear, una secuencia de péptido con múltiples dedos de cinc y un dominio represor transcripcional KRAB. Las secuencias polipeptídicas particularmente preferidas de la invención incluyen las SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 61 y 63 (tabla 9).
Como se describe en la presente memoria, las regiones de ADN a partir de las que se efectúa la regulación positiva o negativa de genes específicos incluyen promotores, potenciadores o regiones de control de locus (LCR). De acuerdo con las reivindicaciones, las secuencias diana adecuadas son las secuencias de repetición de trinucleótidos que comprenden al menos 10 de estas repeticiones. De acuerdo con las reivindicaciones, la secuencia diana de ADN genómico comprende una secuencia de repetición de CAG como la que se encuentra en las repeticiones de CAG expandidas de los genes mutantes y/o comprende una secuencia de repetición de CTG, que es el complemento de una secuencia de repetición de CAG expandida o cualquier otra secuencia repetida basada en la secuencia repetitiva -CAGCAGCAG-.
Ácidos nucleicos y expresión de péptidos
Los péptidos de dedo de cinc de acuerdo con la invención y, cuando sea adecuado, los moduladores de péptidos de dedo de cinc (moléculas conjugadas/efectoras) de la invención pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante y procedimientos estándar de expresión y purificación de proteínas. Por tanto, la invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de dedo de cinc de la invención, así como sus derivados; y construcciones de ácido nucleico, tales como vectores de expresión que comprenden ácidos nucleicos que codifican péptidos y derivados de acuerdo con las reivindicaciones.
Por ejemplo, el ADN que codifica el péptido correspondiente puede insertarse en un vector de expresión adecuado (p. ej., pGEM®, Promega Corp., EE. UU.), donde se une de forma operable a las secuencias de expresión adecuadas, y se transforma en una célula hospedadora adecuada para la expresión de la proteína de acuerdo con las técnicas convencionales (Sambrook J. et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Las células hospedadoras adecuadas son aquellas que pueden crecer en cultivo y son susceptibles de ser transformadas con ADN exógeno, incluyendo bacterias, células fúngicas y células de origen eucariota superior, preferiblemente células de mamífero.
Para ayudar a la purificación, los péptidos de dedo de cinc (y los correspondientes ácidos nucleicos) de la invención pueden incluir una secuencia de purificación, tal como un marcador de His. Además o como alternativa, los péptidos de dedo de cinc pueden, por ejemplo, cultivarse en fusión con otra proteína y purificarse como cuerpos de inclusión insolubles a partir de células bacterianas. Esto es particularmente conveniente cuando el péptido de dedo de cinc o el resto efector puede ser tóxico para la célula hospedadora en la que se va a expresar. Como alternativa, los péptidos de la invención pueden sintetizarse in vitro utilizando un sistema adecuado de (transcripción y) traducción in vitro (p. ej., el sistema de extracto de E. co liS30, Promega corp., EE. UU.). La presente invención se refiere particularmente a la expresión de péptidos que contienen dedos de cinc de las reivindicaciones en células hospedadoras in vivo o en células hospedadoras para aplicaciones ex vivo, para modular la expresión de los genes endógenos. Por lo tanto, los péptidos preferidos de la invención pueden estar desprovistos de dichas secuencias (p. ej., los marcadores de His) que están destinadas a la purificación u otras manipulaciones in vitro.
El término "unido operablemente", cuando se aplica a las secuencias de ADN, por ejemplo, en un vector de expresión o una construcción, indica que las secuencias están dispuestas de manera que funcionan de forma cooperativa para lograr los fines previstos, es decir, una secuencia promotora permite el inicio de la transcripción que procede a través de una secuencia codificadora ligada hasta la secuencia de terminación.
Se apreciará que, en función de la aplicación, el péptido de dedo de cinc o la proteína de fusión de la invención puede comprender una secuencia peptídica o secuencias peptídicas adicionales en el extremo N y/o C para facilitar la expresión de proteínas, la clonación y/o la estabilidad del péptido o el ARN, sin cambiar la secuencia de ningún dominio de dedo de cinc. Por ejemplo, las secuencias de péptido líder N-terminales adecuadas para su incorporación en los péptidos de la invención son MA o MG y ERP. Las secuencias de localización nuclear pueden incorporarse adecuadamente en el extremo N de los péptidos de la invención para crear una secuencia líder N-terminal. Una secuencia líder N-terminal útil para la expresión y direccionamiento nuclear en células humanas es MGPKKRRKVTGERP (SEQ ID NO: 44), y una secuencia líder N-terminal útil para la expresión y localización nuclear en células de ratón es MGRIRKKLRLAERP (SEQ ID NO: 45).
En algunas aplicaciones puede ser deseable controlar la expresión de los polipéptidos de dedo de cinc (de fusión) de la invención mediante secuencias promotoras específicas de tejido o promotores inducibles, que puede proporcionar los beneficios de la expresión específica y/o inducible en órganos o tejidos de los polipéptidos de la invención. Estos sistemas pueden ser especialmente ventajosos para las aplicaciones in vivo y la terapia génica in vivo o ex vivo. Algunos ejemplos de promotores específicos de tejido son el promotor humano CD2 (para linfocitos T y timocitos), Zhumabekov et al. (1995) J. Immunological Methods 185: 133-140); el promotor de cinasa II dependiente de alfacalcio-calmodulina (para células del hipocampo y el neocórtex, Tsien et al. (1996) Cell 87: 1327-1338); el promotor de la proteína ácida del suero (glándula mamaria, Wagner et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330); el promotor de la miogenina del ratón (músculo esquelético, Grieshammer et al. (1998) Dev. Biol. 197: 234-247); y muchos otros promotores específicos de tejidos que son conocidos en la técnica.
Es particularmente deseable expresar los péptidos de dedo de cinc y otras construcciones dedo de cinc de la invención, tales como proteínas represoras de dedos de cinc, a partir de vectores adecuados para su uso in vivo o ex vivo, p. ej., para aplicaciones terapéuticas (terapia génica). Cuando la terapia implica el uso de construcciones de ácido nucleico de dedo de cinc para la expresión de la proteína in vivo, el sistema de expresión seleccionado debe ser capaz de expresar la proteína en el tejido/las células adecuadas donde la terapia va a surtir efecto. De manera deseable, un sistema de expresión para su uso de acuerdo con las reivindicaciones también es capaz de dirigir las construcciones de ácido nucleico o los péptidos de la invención a la región, el tejido o las células del cuerpo adecuados en los que se prevé el tratamiento. Un sistema de expresión y direccionamiento particularmente adecuado se basa en virus adenoasociados (AAV) recombinantes, p. ej., el subtipo AAV2/1.
Para la terapia génica de la enfermedad de Huntington, es deseable infectar partes particulares del cerebro (el estriado). Por lo tanto, los vectores del subtipo AAV2/1 (véase, p. ej., Molecular Therapy (2004) 10: 302-317) son ideales para este fin y pueden utilizarse con un promotor de AAV fuerte incluido en los vectores.
En lugar o además de los vectores del subtipo AAV2/1, se pueden utilizar otros vectores de subtipo AAV, como los vectores del subtipo AAV2/9. El tropismo de AAV2/1 es más específico para infectar neuronas, mientras que AAV2/9 infecta más ampliamente (Expert Opin Biol Ther. junio de 2012; 12(6): 757-766.) y algunas variantes pueden aplicarse incluso por vía intravenosa (Nature Biotech 34(2): 204-209). Por lo tanto, el uso del subtipo AAV2/9 (solo o en combinación con el AAV2/1) permite ventajosamente dirigirse a una mayor variedad de tipos de células. En el contexto de la EH, esto permite dirigirse a otros tipos de células (no neuronales) del cerebro que también pueden desempeñar un papel en la EH, tal como la glía. Adicionalmente, esto puede permitir de manera ventajosa el direccionamiento a los tejidos periféricos, tales como el corazón, lo que puede ser ventajoso en algunas realizaciones y aplicaciones terapéuticas.
Un promotor que se puede utilizar en los vectores víricos AAV2/1 y que es adecuado para su uso en seres humanos y ratones es el promotor pCAG (elemento potenciador temprano del CMV y el promotor de la p-actina de pollo). Otra secuencia útil para incluir en los vectores AAV es el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck (WPRE); Garg et al, (2004) J. Immunol., 173: 550-558). Otro promotor que puede ser ventajoso para la expresión sostenida en seres humanos y ratones es el promotor pNSE (promotor específico de neuronas del gen de la enolasa).
En este sentido, los presentes inventores han diseñado potenciadores sintéticos del promotor de pNSE de ratón y humano (véase, p. ej., el ejemplo 17) que comprenden una porción de secuencia cadena arriba y cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen de la enolasa de ser humano y de rata (SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 153). Pueden añadirse sitios de restricción flanqueantes a la secuencia para su clonación en un vector adecuado. Dado que el promotor pNSE es específico para neuronas, se usa de manera particularmente ventajosa en combinación con AAV2/1 u otros vectores específicos para neuronas.
Un promotor que puede ser adecuado para su uso con vectores víricos AAV2/9 es el promotor pHSP (promotor del gen Hsp90ab1 de expresión ubicua). Este promotor también puede ser adecuado para su uso en seres humanos y ratones. Como se analiza en el ejemplo 17, a continuación, los presentes inventores han descubierto que un diseño de promotor-potenciador sintético que comprende una porción de la secuencia cadena arriba y cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción del gen Hsp90ab1 de ratón o humano podría utilizarse ventajosamente para obtener una expresión sostenida de un transgén, como los péptidos de dedo de cinc de la invención. Concretamente, los inventores han definido una región de 1,7 kb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen Hsp90ab1 que comprende múltiples potenciadores y puede utilizarse ventajosamente como promotor constitutivo mínimo de hsp90ab1, en combinación con una parte del exón 1 del gen. Las secuencias de los promotores mínimos de ratón y humanos con sitios de restricción flanqueantes para su clonación en un vector, se proporcionan como la SEQ ID NO: 146 y la SEQ ID NO: 147. También se proporcionan promotores mínimos de ratón y humanos sin sitios de restricción flanqueantes como la SEQ ID NO: 149 y la SEQ ID NO: 150. La presente invención abarca dichas secuencias promotoras novedosas, construcciones de expresión y vectores (p. ej., vectores víricos AAV2/1 o AAV2/9) que comprenden estas secuencias, así como el uso de dichas secuencias promotoras para la expresión de péptidos, tales como péptidos de dedo de cinc. Concretamente, se describen construcciones de expresión que comprenden las secuencias promotoras de SEQ ID NO: 149 y/o SEQ ID NO: 150; construcciones de expresión que comprenden las secuencias promotoras de SEQ ID NO: 149 y/o SEQ ID NO: 150 que están operablemente asociadas con/ligadas a secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos de dedo de cinc y los moduladores de la invención; y el uso/métodos de uso de dichas construcciones para la expresión sostenida de péptidos (dedos de cinc) in vivo. Los sistemas in vivo más adecuados son el ser humano y el ratón.
Los usos médicos y métodos terapéuticos adecuados pueden, de acuerdo con la invención, abarcan el uso combinado, ya sea por separado, secuencial o simultáneo, de los vectores víricos AAV2/1 y AAV2/9, en donde al menos el vector AAV2/9 comprende un promotor constitutivo de hsp90ab1, p. ej., de SEQ ID NO: 149 y/o SEQ ID NO: 150. Convenientemente, estos usos médicos y métodos de tratamiento comprenden además dichos vectores que codifican uno o más péptidos/moduladores de dedos de cinc de la invención. Los usos médicos y los métodos terapéuticos más adecuados están dirigidos al tratamiento de la EH en un sujeto, tal como un ser humano, o el estudio de la EH en un sujeto, tal como un ratón.
Como comprenderá el experto en la técnica, no es necesario seguir rigurosamente las secuencias proporcionadas para la función del promotor, siempre que los elementos funcionales, p. ej., potenciadores, y sus relaciones espaciales se mantengan esencialmente. Concretamente, las secuencias promotoras proporcionadas comprenden sitios de restricción flanqueantes para su clonación en un vector. El experto en la técnica sabrá adaptar estos sitios de restricción al sistema de clonación particular utilizado, así como realizar cualquier mutación puntual que pueda ser necesaria en la secuencia del promotor para eliminar, p. ej., un sitio de restricción críptico (véase, p. ej., la SEQ ID NO: 147).
Los sistemas inducibles adecuados pueden utilizar la inducción con moléculas pequeñas, tales como los sistemas controlados por tetraciclina (tet-on y tet-off), el promotor del gen de respuesta al crecimiento temprano inducible por radiación 1 (EGR1), y cualquier otro sistema inducible apropiado conocido en la técnica.
Composiciones terapéuticas
Un péptido de dedo de cinc o un modulador quimérico de la invención puede incorporarse a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un animal; preferiblemente un ser humano. Un péptido terapéutico de la invención (o un derivado del mismo) puede utilizarse para tratar una o más enfermedades o infecciones, dependiendo de para qué sitio de unión se haya diseñado el péptido de dedo de cinc. Como alternativa, un ácido nucleico que codifica el péptido terapéutico puede insertarse en una construcción/vector de expresión e incorporarse a formulaciones farmacéuticas/medicamentos con el mismo fin.
Como comprenderá el experto en la técnica, las posibles moléculas terapéuticas, tales como los péptidos de dedo de cinc y los moduladores de la invención pueden analizarse en un modelo animal, tal como un ratón, antes de que puedan aprobarse para su uso en sujetos humanos. Por consiguiente, el péptido de dedo de cinc o las proteínas moduladoras quiméricas de la invención pueden expresarse in vivo en ratones o ex vivo en células de ratón, así como en seres humanos y, de acuerdo con la invención, pueden diseñarse casetes de expresión y construcciones de expresión/vectores adecuados específicamente para cada sistema animal.
Los péptidos de dedo de cinc y los moduladores quiméricos de la invención contienen normalmente restos de aminoácido de origen natural, pero en algunos casos también pueden estar presentes restos de aminoácidos de origen no natural. Por lo tanto, los denominados "peptidomiméticos" y "análogos peptídicos'', que pueden incluir estructuras químicas no aminoacídicas que imitan la estructura de un aminoácido o péptido concreto, también pueden utilizarse en el contexto de la invención. Dichos miméticos o análogos se caracterizan generalmente por presentar características físicas similares, tales como el tamaño, carga o hidrofobia, y la orientación espacial adecuada que se encuentra en sus homólogos peptídicos naturales. Un ejemplo específico de compuesto peptidomimético es un compuesto en el que el enlace amida entre uno o más de los aminoácidos se sustituye por, por ejemplo, un enlace carbono-carbono u otro enlace distinto de amida, como es de sobra conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Sawyer, en Peptide Based Drug Design, págs. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995). Dichas modificaciones pueden ser particularmente ventajosas para aumentar la estabilidad de los agentes terapéuticos de péptidos de dedo de cinc y/o para mejorar las características de solubilidad, biodisponibilidad y administración (p. ej., para aplicaciones in vivo), cuando se va a administrar un péptido como molécula terapéutica.
Los péptidos terapéuticos y los ácidos nucleicos de la invención pueden ser particularmente adecuados para el tratamiento de enfermedades, afecciones y/o infecciones que puedan abordarse (y tratarse) intracelularmente, por ejemplo, dirigiéndose a secuencias genéticas dentro de una célula animal; y también para aplicaciones in vitro y ex vivo. Como se emplea en esta memoria, las expresiones "agente terapéutico" y "agente activo" abarcan tanto péptidos como los ácidos nucleicos que codifican un péptido de dedo de cinc terapéutico de la invención. Los ácidos nucleicos terapéuticos incluyen vectores, genomas víricos y virus modificados, tales como AAV, que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos de dedo de cinc y proteínas de fusión de la invención.
Los usos y aplicaciones terapéuticas de los péptidos de dedo de cinc y los ácidos nucleicos incluyen cualquier enfermedad, trastorno u otra afección médica que pueda tratarse mediante la modulación de la expresión de un gen o ácido nucleico diana.
Las enfermedades de expansión de repeticiones de trinucleótidos son particularmente útiles y susceptibles de terapias basadas en moléculas terapéuticas con múltiples dedos de cinc, por ejemplo: la enfermedad de Huntington (poli-CAG), ataxias espinocerebelosas (poli-CAG), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (poli-CAG), epilepsia mioclónica juvenil (repeticiones de dodecámero; poli-CCCCGCCCCGCG, SEQ ID NO: 67), ataxia de Friedreich (poli-GAA), síndrome de X frágil (poli-CGG), síndrome de X-E frágil (poli-CCG) y distrofia miotónica (poli-CTG).
Los péptidos de dedo de cinc de la invención están particularmente adaptados para dirigirse a y unirse a secuencias de repetición de CAG y/o a secuencias de repetición de CTG en los genomas humanos o animales. Los genes preferidos son los asociados a las enfermedades poliglutamínicas, y especialmente los nueve genes que ya se han identificado como asociados a las enfermedades poliglutamínicas en seres humanos, como se indica en la tabla 1 a continuación.
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Tabla 1: Genes de enfermedades poliglutamínicas.
Un gen preferido al que se dirigen los péptidos de dedo de cinc y las moléculas terapéuticas de la invención es el gen HTT humano expandido. Los genes anormales de la enfermedad de HTT comprenden 36 o más secuencias de repetición de CAG.
Pueden combinarse uno o más portadores farmacéuticamente aceptables (tales como diluyentes, adyuvantes, excipientes o vehículos) con los uno o más péptidos terapéuticos de la invención en una composición farmacéutica. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la invención se formulan para ajustarse a los estándares de registro farmacéutico y pueden administrarse por vía oral, intravenosa, tópica o por otras vías convencionales.
De acuerdo con la invención, el péptido o ácido nucleico terapéutico puede fabricarse en medicamentos o puede formularse en composiciones farmacéuticas. Cuando se administran a un sujeto, un agente terapéutico se administra adecuadamente como un componente de una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las moléculas, compuestos y composiciones de las reivindicaciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intravaginal, transdérmica, rectal, por inhalación, o por vía tópica en la piel. La administración puede ser sistémica o local. Los sistemas de suministro que se conocen también incluyen, por ejemplo, encapsulación en microgeles, liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y cualquiera de ellos puede utilizarse para administrar los compuestos de las reivindicaciones. Cualquier otro sistema de suministro adecuado conocido en la técnica también se contempla en el uso de la presente invención. Los vehículos farmacéuticos aceptables pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de procedentes del petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los vehículos farmacéuticos pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden utilizarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Cuando se administran a un sujeto, los vehículos farmacéuticamente aceptables son preferiblemente estériles. El agua es un vehículo adecuado, especialmente cuando el compuesto de la invención se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados también incluyen excipientes, tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores.
Los medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención pueden adoptar la forma de líquidos, soluciones, suspensiones, lociones, geles, comprimidos, píldoras, microgránulos, polvos, formulaciones de liberación modificada (tal como liberación lenta o sostenida), supositorios, emulsiones, aerosoles, pulverizaciones, cápsulas (por ejemplo, cápsulas que contienen líquidos o polvos), liposomas, micropartículas o cualquier otra formulación adecuada conocida en la técnica. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19.a ed., 1995, véanse, por ejemplo, las páginas 1447-1676.
Las composiciones terapéuticas o medicamentos de la invención se formulan de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración oral (más adecuadamente para seres humanos). Las composiciones para la administración oral pueden estar en forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Por tanto, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una cápsula, comprimido o píldora.
Las composiciones administradas por vía oral pueden contener uno o más agentes, por ejemplo, agentes edulcorantes, tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes aromatizantes, tales como menta, aceite de gaulteria, o de cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar un preparado farmacéuticamente apetecible. Cuando la composición se presenta en forma de comprimido o píldora, las composiciones pueden estar recubiertas para retrasar la disgregación y la absorción en el tubo digestivo, para proporcionar una liberación sostenida del principio activo durante un periodo de tiempo prolongado. Las membranas con permeabilidad selectiva que rodean a un compuesto osmóticamente activo también son adecuadas para las composiciones administradas por vía oral. En estas formas farmacéuticas, el compuesto conductor absorbe el líquido del ambiente que rodea a la cápsula, que se hincha para desplazar el agente o la composición del agente a través de una abertura. Estas formas farmacéuticas pueden proporcionar un perfil de administración esencialmente de orden cero, en contraposición con los perfiles con picos de las formulaciones de liberación inmediata. También puede utilizarse un material retardante, tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir vehículos convencionales, tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Estos vehículos son preferiblemente de grado farmacéutico. Para formulaciones orales, el lugar de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno, o el íleon) o el intestino grueso. Un experto en la técnica puede preparar formulaciones que no se disuelvan en el estómago, pero que liberarán el material en el duodeno o en otra parte del intestino. Convenientemente, la liberación evitará los efectos nocivos del ambiente estomacal, ya sea por protección del péptido (o derivado) o por liberación del péptido (o derivado) más allá del entorno estomacal, tal como en el intestino. Para garantizar una resistencia gástrica total, sería esencial un revestimiento impermeable a un pH de al menos 5,0. Algunos ejemplos de ingredientes inertes más comunes que se utilizan como recubrimientos entéricos son el acetato trimetilado de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y Shellac, que pueden utilizarse como películas mixtas.
Para facilitar la disolución del agente terapéutico o del ácido nucleico (o derivado) en el medio acuoso, puede añadirse un tensioactivo como agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos como el lauril sulfato de sodio, sulfosuccinato sódico de dioctilo y sulfonato sódico de dioctilo. Pueden utilizarse detergentes catiónicos, como el cloruro de benzalconio o el cloruro de bencetonio. Los posibles detergentes no iónicos que podrían incluirse en la formulación como tensioactivos son: lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos, cuando se utilizan, pueden estar presentes en la formulación del péptido o del ácido nucleico o del derivado, ya sea solo o como una mezcla en diferentes proporciones.
Normalmente, las composiciones para la administración intravenosa comprenden un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, las composiciones pueden incluir también un agente solubilizante.
Otra vía de administración adecuada para las composiciones terapéuticas de las reivindicaciones es la administración pulmonar o nasal.
Pueden incluirse aditivos para mejorar la captación celular del péptido terapéutico (o derivado) o del ácido nucleico de la invención, tales como ácidos grasos, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
En una composición farmacéutica, un péptido de dedo de cinc o un ácido nucleico de la invención (y, opcionalmente, cualquier resto de dedo de cinc asociado), p. ej., un modulador de la expresión génica y/o una resto de direccionamiento) puede mezclarse con una población de liposomas (es decir, una vesícula lipídica u otro compartimento artificial encapsulado en la membrana), para crear una población terapéutica de liposomas que contengan el agente terapéutico y, opcionalmente, el resto modulador o efector. La población terapéutica de liposomas puede entonces administrarse a un paciente por cualquier medio adecuado, como por ejemplo por inyección intravenosa. Cuando sea necesario que la composición liposomal terapéutica se dirija específicamente a un tipo de célula concreto, como una especie microbiana concreta o una célula infectada o anormal, la composición liposomal puede formularse adicionalmente con un dominio de anticuerpo adecuado o similar (p. ej., Fab, F(ab)2, scFv, etc.) o un resto de direccionamiento alternativo, que de forma natural o adaptada reconoce el tipo de célula diana. Dichos métodos son conocidos por un experto habitual en la técnica.
Los péptidos terapéuticos o los ácidos nucleicos de la invención también pueden formularse en composiciones para su aplicación tópica en la piel de un sujeto.
Los péptidos de dedo de cinc y los ácidos nucleicos de la invención también pueden ser útiles en aplicaciones no farmacéuticas, tal como en pruebas de diagnóstico, de imagen, como reactivos de afinidad para la purificación y como vehículos suministro.
Terapia génica
La terapia génica se refiere al uso de genes heterólogos en un sujeto, tal como la inserción de genes en una célula de un individuo (p. ej., animal o ser humano) y tejidos biológicos para tratar enfermedades, por ejemplo: sustituyendo los alelos mutantes perjudiciales por versiones funcionales/corregidas, por alelos mutantes inactivados mediante la eliminación total o parcial del alelo mutante o mediante la inserción de un casete de expresión para la expresión sostenida de una construcción de dedo de cinc terapéutica. Las enfermedades diana más prometedoras hasta la fecha son las causadas por defectos de un solo gen, tales como fibrosis quística, hemofilia, distrofia muscular, anemia falciforme y EH. Otras dianas habituales de la terapia génica son el cáncer y enfermedades hereditarias ligadas a un defecto genético, como las repeticiones de nucleótidos expandidas. La presente descripción se refiere en particular al tratamiento de las enfermedades poliglutamínicas, tales como la EH (véase la tabla 1).
La terapia génica se clasifica en dos tipos: terapia génica de la línea germinal, en la que se modifican las células germinales (es decir, los espermatozoides o los óvulos) mediante la introducción de genes terapéuticos, que normalmente se integran en el genoma y pueden ser hereditarias (es decir, transmitirse a generaciones posteriores); y la terapia génica somática, en la que los genes terapéuticos se transfieren a las células somáticas de un paciente, lo que significa que pueden estar localizados y no son heredados por las generaciones futuras.
Los tratamientos de terapia génica requieren la administración del gen terapéutico (o molécula de ADN o ARN) en las células diana. Hay dos categorías de sistemas de suministro, tanto los mecanismos de entrega basados en virus como los no víricos, y pueden utilizarse ambos mecanismos.
Los sistemas víricos pueden basarse en cualquier virus adecuado, tales como: retrovirus, que portan ARN (p. ej., gripe, VIS, VIH, lentivirus y leucemia murina de Moloney); adenovirus, que portan ADNbc; virus adenoasociados (AAV), que portan ADNmc; virus del herpes simple (VHS), que porta ADNbc; y virus quiméricos (p. ej., donde la envoltura del virus se ha modificado utilizando proteínas de envoltura de otro virus).
Un sistema de administración vírico particularmente preferido es el AAV. El AAV es un pequeño virus de la familia de los parvovirus con un genoma de ADN monocatenario. Una característica clave del AAV de tipo silvestre es que casi siempre inserta su material genético en un sitio específico del cromosoma 19 humano. Sin embargo, el AAV recombinante, que contiene un gen terapéutico en lugar de sus genes víricos normales, pueden no integrarse en el genoma animal y, en cambio, pueden formar ADN circular episomal, que probablemente sea la causa principal de la expresión génica a largo plazo. Las ventajas de los vectores de terapia génica basados en AAV incluyen: que el virus no sea patógeno para el ser humano (y ya sea portado por la mayoría de las personas); la mayoría de las personas tratadas con AAV no crearán una respuesta inmunitaria para eliminar el virus o las células que han sido infectadas con él (en ausencia de expresión génica heteróloga); infectará tanto a las células que se dividen como a las que no se dividen (quiescentes); y resulta especialmente prometedor para los tratamientos de terapia génica del músculo, ojo y cerebro. Los vectores AAV se han utilizado en ensayos clínicos en fase I y II para el tratamiento de la fibrosis quística; y se han realizado ensayos clínicos de fase I para el tratamiento de la hemofilia. También se han obtenido resultados alentadores en ensayos clínicos de fase I para la enfermedad de Parkinson, lo que da esperanzas a los tratamientos que requieren la administración en el sistema nervioso central. También se ha informado de ensayos de terapia génica con AAV para el tratamiento de la enfermedad de Canavan, la distrofia muscular y la lipofuscinosis ceroidea neuronal infantil tardía. El VHS, que infecta de forma natural las células nerviosas de los seres humanos, también puede ofrecer ventajas para la terapia génica de las enfermedades que afectan al sistema nervioso.
Convenientemente, las construcciones de ácido nucleico que codifican dedos de cinc (como se describe en la presente memoria) se insertan en un vector de virus adenoasociado (AAV), especialmente el subtipo AAV2/1 (véase, p. ej., Molecular Therapy (2004) 10: 302-317). Este vector es especialmente adecuado para la inyección e infección del estriado, en el cerebro, donde los efectos perjudiciales de la agregación de la Htt mutante son más frecuentes en la EH. De este modo, las construcciones de ácido nucleico que codifican el dedo de cinc pueden suministrarse a las células diana deseadas, y los péptidos de dedo de cinc expresados para reprimir la expresión de genes patógenos asociados con las secuencias de repetición de CAG, tales como los genes de htt mutantes.
Se utilizan vectores víricos con un tropismo más amplio en lugar de, o además de, vectores con un tropismo más específico. Por ejemplo, el subtipo AAV2/1, específico para las neuronas, puede utilizarse en combinación con el subtipo AAV2/9. Esto puede permitir ventajosamente el direccionamiento tanto a neuronas como a otros tipos de células presentes en el cerebro, tales como células gliales. Los vectores víricos ubicuos/promiscuos, como el AAV2/9, también pueden utilizarse solos, por ejemplo, cuando la terapia se dirige a los tejidos periféricos.
Aunque la EH se considera principalmente una enfermedad neurológica, en realidad es una enfermedad compleja que puede tener un componente periférico en su fisiopatología, incluidos posibles efectos en el corazón, músculo esquelético, riñón e hígado. Por ejemplo, la insuficiencia cardíaca es la segunda causa más común de muerte en los pacientes con EH. Por lo tanto, el direccionamiento a tejidos, tales como el corazón, con los péptidos de dedo de cinc/moduladores de la invención puede resultar beneficioso. En estas aplicaciones, el uso de un vector promiscuo o de un vector específico de órgano/tejido puede ser particularmente útil.
El tropismo del vector vírico y la especificidad del promotor utilizado para la expresión de la construcción terapéutica pueden adaptarse para dirigirse a poblaciones específicas de células. Por ejemplo, los vectores víricos específicos de las neuronas pueden utilizarse en combinación con promotores específicos de las neuronas. Por el contrario, los vectores promiscuos pueden utilizarse en combinación con promotores ubicuos (o promotores específicos de tejido, según se desee).
Los virus AAV2/1 pueden utilizarse en combinación con un promotor sintético pNSE, como se ha descrito anteriormente y en el ejemplo 17, que debe considerarse un ejemplo no limitativo de la presente solicitud. Los virus AAV2/9 pueden utilizarse en combinación con un vector sintético pHSP, como se ha descrito anteriormente y en el ejemplo 17, que debe considerarse un ejemplo no limitativo de la presente solicitud. Pueden utilizarse combinaciones de estos dos tipos de construcciones para dirigirse simultáneamente a múltiples tipos de células, p. ej., para el tratamiento de la EH.
Para algunas aplicaciones, los planteamientos no víricos para la terapia génica pueden aportar ventajas con respecto a los métodos víricos, por ejemplo, en vista de la sencillez de la producción a gran escala y la baja inmunogenia en el hospedador. Los tipos de mecanismos no víricos incluyen: ADN desnudo (p. ej., plásmidos); oligonucleótidos (p. ej., antisentido, ARNpi, oligodesoxinucleótidos bc señuelo y oligonucleótidos de ADNmc); lipoplejos (complejos de ácidos nucleicos y liposomas); poliplejos (complejos de ácidos nucleicos y polímeros); y dendrímeros (macromoléculas muy ramificadas y aproximadamente esféricas).
Por consiguiente, los ácidos nucleicos codificantes de dedos de cinc de la invención pueden utilizarse en métodos de tratamiento de enfermedades mediante terapia génica. Como ya se ha explicado, las enfermedades especialmente adecuadas son las del sistema nervioso (periférico y/o central); y preferiblemente las asociadas a las secuencias de repetición de CAG, tales como la EH.
Por consiguiente, los agentes terapéuticos y las pautas posológicas para la terapia génica de la descripción pueden posibilitar la expresión de dedos de cinc terapéuticos en células diana en aplicaciones in vivo o ex vivo para reprimir la expresión de genes diana, tales como aquellos que tienen secuencias de repetición de CAG expandidas no de tipo silvestre y especialmente, el gen de htt mutante.
Las nucleasas de dedo de cinc de la invención (p. ej., como proteínas de fusión con el dominio de nucleasa Fok-1) también pueden ser útiles en tratamientos de terapia génica para el corte de genes o para dirigir el sitio de integración de los genes terapéuticos a sitios cromosómicos específicos, como informaron previamente Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33, 18: 5978-5990.
La enfermedad de Huntington (EH) y las terapias
A diferencia de otros trastornos neurológicos, como las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, la EH es monogénica (The Huntington's Disease Collaborative Research Group (1993) Cell, 72(6): 971-983). Por lo tanto, una estrategia terapéutica útil contra la EH puede necesitar únicamente abordar la expresión del único gen causal para revertirla y tratar los efectos de la proteína mutante. Sin embargo, ya que la proteína Htt ts se expresa ampliamente (Sharp et al. (1995) Neuron 14(5): 1065-1074); es esencial para el desarrollo embrionario temprano (Duyao et al. (1995) Science 269(5222): 407-410); y es necesaria para la función neuronal y la supervivencia en el cerebro (Dragatsis et al. (2000) Nat. Genet. 26(3): 300-306); es importante reducir la expresión de la proteína mutante específicamente, y dejar la expresión de la proteína ts no afectada.
Se ha demostrado que la interferencia de ARN (iARN) reduce la expresión de htt mutante (van Bilsen et al. (2008) Hum. Gene Ther. 19(7): 710-719; Zhang et al. (2009) J. Neurochem. 108(1): 82-90; Pfister et al. (2009) Curr. Biol.
19(9): 774-778). Aunque esta técnica puede tener el potencial de ser bastante poderosa, el éxito de la iARN depende de la búsqueda de polimorfismos de un solo nucleótido o de deleción que diferencien entre los alelos mutantes y de ts, y éstos a menudo difieren de un paciente a otro. La necesidad de diseños de ARNpi personalizados plantea actualmente retos para los ensayos clínicos y la autorización de su uso en seres humanos.
En un planteamiento más general, Hu et al. utilizaron oligómeros antisentido de ácido peptidonucleico (APN) y de ácido nucleico bloqueado (ANB), para dirigirse a las repeticiones de CAG expandidas de los genes ataxina-3 y htt (Hu et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27(5): 478-484; Hu et al. (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1175: 24-31). Observaron la inhibición selectiva del alelo mutante con ácidos peptidonucleicos (APN) durante un máximo de 22 días (3 semanas). Aunque estos resultados también parecen prometedores, los ANP no se pueden administrar al sistema nervioso central. Por lo tanto, los autores también intentaron usar ácidos nucleicos bloqueados (ANB), que son más adecuados para las aplicaciones in vivo. En este experimento se observó la inhibición del alelo mutante, pero también se observó hasta un 30 % de inhibición de la htt ts en la concentración más efectiva de ANB utilizada, lo que, por supuesto, no es deseable.
Por lo tanto, sigue habiendo una clara necesidad en la técnica de tratamientos eficaces para inhibir la expresión de la proteína Htt mutante, a la vez que la expresión del alelo de tipo silvestre se vea en gran medida no afectada.
En este sentido, los presentes inventores han descrito previamente (documento WO 2012/049332) el diseño racional de péptidos de dedo de cinc para reconocer y unirse a secuencias de poli- 5'-GC(A/T)-3', de manera que reconozcan tanto poli-CAG como su hebra de ADN complementaria, poli-CTG. Los péptidos de dedo de cinc descritos en dicha memoria fueron capaces de reprimir un gen diana con secuencias de repetición de CAG expandidas preferiblemente sobre secuencias de repetición más cortas en ensayos de transcripción de indicadores. Usando una línea celular modelo para la EH, los inventores lograron una expresión estable de péptidos de dedo de cinc, que también redujo la expresión del gen htt mutante cromosómico (que tiene 111 repeticiones de CAG). La represión de la expresión génica se demostró tanto a nivel de proteínas como de ARN. Se demostró que la represión de los genes mutantes a los que se dirigía persiste durante largos periodos de tiempo (p. ej., al menos 20 días), y se comprobó que la expresión de los genes con secuencias genómicas de repetición de CAG más cortas no se ve afectada en general. Por tanto, los péptidos de dedo de cinc fueron capaces de dirigirse a las repeticiones de CAG expandidas asociadas al gen Htt mutante con preferencia con respecto a las repeticiones de CAG normales asociadas al gen Htt de tipo silvestre. Por lo tanto, los péptidos de dedo de cinc eran represores eficientes y selectivos de los genes con tramos de CAG largos.
Sin embargo, la expresión a medio y largo plazo (p. ej., durante 4 o más semanas) de los péptidos represores de dedos de cinc descritos en el documento WO 2012/049332 en las células diana no era sostenible, lo que resulta en la pérdida de la represión de genes diana específicos y la muerte celular in vivo.
Los efectos de la toxicidad de las moléculas terapéuticas, especialmente para su uso en terapia génica y otras estrategias similares que requieren la expresión a medio o largo plazo de una proteína heteróloga, es un problema importante. De hecho, los estudios han demostrado previamente que las proteínas no propias pueden provocar respuestas inmunitarias in vivo lo suficientemente graves como para causar una muerte celular generalizada.
Para mejorar los efectos a medio y largo plazo de la expresión del péptido de dedo de cinc en los organismos diana, especialmente en el cerebro, la presente invención pretende reducir la toxicidad e inmunogenia de los péptidos de dedo de cinc potencialmente terapéuticos y de las proteínas represoras de la descripción.
La descripción proporciona así péptidos de dedo de cinc y secuencias de ácidos nucleicos que son adecuados para la represión de la proteína Htt mutante in vivo y ex vivo en células de ratón y humanas. Del mismo modo, los péptidos de dedo de cinc de la descripción son adecuados para el direccionamiento y la modulación de otros genes, especialmente aquellos que contienen largas secuencias de repetición de trinucleótidos de CAG (es decir, asociadas con enfermedades distintas de la EH), como se ha indicado anteriormente.
Toxicidad e inmunogenia en el organismo hospedador
Se propuso que la toxicidad y la inmunogenia (inmunotoxicidad) de los péptidos heterólogos cuando se expresan en organismos hospedadores podría reducirse optimizando la secuencia del péptido primario para que coincida con la secuencia del péptido primario de los péptidos naturales del hospedador.
Como se ha descrito anteriormente (Garriga et al, 2012 y aquí), los péptidos de dedo de cinc de la presente invención se basan en un armazón de péptido de dedo de cinc genérico/universal, y en particular en el marco de péptido de Zif268, que es una proteína natural de dedo de cinc que tiene homólogos tanto en ratones como en humanos. Sin embargo, como se describe en el documento WO 2012/049332, las secuencias de reconocimiento de los dominios de dedo de cinc se basaron en la mejor coincidencia percibida para las secuencias de ácido nucleico diana (es decir, el código de reconocimiento para las interacciones entre el dedo de cinc y el ADNbc) y en estudios de optimización de la unión. Este diseño no tenía en cuenta el organismo hospedador diana en el que se expresarían finalmente los péptidos de dedo de cinc (p. ej., ratón o ser humano).
Además, las proteínas represoras de dedos de cinc descritas en el documento WO 2012/049332 incorporaron un dominio represor de la transcripción KRAB de Kox-1 humana: incluso en estudios con ratones o con células de ratón; y de forma similar, otras funciones efectoras, como la localización nuclear y los marcadores de purificación se seleccionaron sin tener en cuenta el organismo hospedador.
Como consecuencia de lo anterior, y a modo de ejemplo, uno de los péptidos represores de dedo de cinc preferidos descritos en el documento WO 2012/049332, ZF11xHunt-Kox-1 (SEQ ID NO: 68; véase también Garriga et al., 2012); denominado en lo sucesivo ZF11-Kox-1), contenía 260 de 509 (51 %) restos de aminoácidos que no eran de ratón, en comparación con las secuencias de proteínas de ratón de tipo silvestre. La presente descripción se refiere a la reducción del número de restos de aminoácidos no del hospedador para su expresión en células de ratón y humanas.
Los péptidos de dedo de cinc y los péptidos moduladores preferidos tienen más del 50 %, más del 60 %, más del 70 % o incluso más del 75 % de identidad con respecto a las proteínas endógenas/naturales en el organismo hospedador diana en el que se pretende expresar para su uso terapéutico. Más preferiblemente, los péptidos de dedo de cinc tienen aproximadamente un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 % o aproximadamente 85 % de identidad con respecto las proteínas endógenas/naturales del organismo diana. En algunos casos es deseable tener una identidad aún mayor con las secuencias peptídicas del organismo diana/hospedador, tal como, por ejemplo, entre aproximadamente un 75 % y un 95 % de identidad, o entre un 78 % y un 92 % de identidad, o entre un 80 % y un 90 % de identidad. Al mismo tiempo, se apreciará que los péptidos reivindicados son diferentes a las secuencias peptídicas conocidas. Por tanto, los péptidos pueden ser hasta un 50 %, hasta un 40 %, hasta un 30 % o hasta un 25 % no idénticos a las secuencias peptídicas endógenas/naturales halladas en el organismo hospedador. Se apreciará que por "hasta un x %", en este contexto, significa mayor que 0 % y menor que x %. Preferiblemente, los péptidos de la invención son aproximadamente un 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 % o 10 % no idénticos a las secuencias peptídicas endógenas/naturales encontradas en el organismo hospedador.
La identidad de secuencia puede evaluarse de cualquier forma conocida por el experto en la técnica, tal como usando el algoritmo descrito por Lipman y Pearson (1985), Science 227, pp1435; o por alineamiento de secuencias.
Como se emplea en esta memoria, "porcentaje de identidad" significa que, cuando se alinea, ese porcentaje de restos de aminoácidos (o bases en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos) es el mismo al comparar las dos secuencias. Las secuencias de aminoácidos no son idénticas cuando se sustituye, elimina o añade un aminoácido en comparación con la secuencia de referencia. En el contexto de la presente invención, ya que las proteínas en cuestión pueden considerarse modulares, es decir, que comprenden varios dominios o efectores diferentes y secuencias auxiliares (tales como secuencias de NLS, péptidos de expresión, módulos/dominios de dedo de cinc, y dominios efectores (p. ej., péptidos represores)), la identidad de secuencia se evalúa por separado para cada dominio/módulo del péptido en relación con cualquier dominio/módulo peptídico endógeno o natural conocido en el organismo hospedador. Esto se considera un planteamiento aceptable, ya que los fragmentos peptídicos relativamente cortos (epítopos) de cualquier péptido expresado por el hospedador pueden ser responsables de determinar la inmunogenia a través del reconocimiento o no de péptidos propios/no propios cuando se expresan en un organismo hospedador in vivo. A modo de ejemplo, una secuencia peptídica de 100 aminoácidos que comprende un dominio de dedo de cinc del hospedador directamente fusionado con un dominio represor del hospedador en donde ninguna de las dos secuencias ha sido modificada por mutación se consideraría 100 % idéntica a las secuencias peptídicas del hospedador. Para esta evaluación, resulta irrelevante que dichos dominios de dedo de cinc o dominios no de dedo de cinc, p. ej., el dominio represor, sea tan solo un fragmento de una proteína natural de mayor tamaño expresada en el hospedador. Si uno de los 100 aminoácidos ha sido modificado con respecto a la secuencia natural, sin embargo, la secuencia modificada se consideraría idéntica en un 99 % a las secuencias de proteínas naturales del hospedador; mientras que si el mismo dominio de dedo de cinc estuviera unido al mismo dominio represor por una secuencia enlazadora de 10 aminoácidos y esa secuencia enlazadora no se encuentra naturalmente en ese contexto en el organismo hospedador, la secuencia resultante sería (10/110) x100 % no idéntica a las secuencias del hospedador.
Por tanto, el grado de identidad de secuencia entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia puede determinarse: (1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación por defecto y la penalización por hueco por defecto; (2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es cuando el programa de alineación ha identificado un aminoácido o nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición determinada de la alineación; y (3) dividiendo el número de coincidencias exactas entre la longitud de la secuencia de referencia. En otras técnicas, el paso (3) puede consistir en dividir el número de coincidencias exactas con la longitud de la más larga de las dos secuencias; y en otras técnicas, el paso (3) puede consistir en dividir el número de coincidencias exactas entre la "longitud de la alineación", donde la longitud de la alineación es la longitud de toda la alineación, incluidos los huecos y las partes salientes de las secuencias. Como se ha explicado anteriormente, en este contexto, la longitud de la alineación es la longitud acumulada de aminoácidos de todos los dominios peptídicos, módulos o fragmentos que se han utilizado como secuencias de referencia para cada dominio o módulo respectivo del péptido de consulta.
Las comparaciones de identidades de secuencias pueden realizarse visualmente, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Los programas informáticos disponibles comercialmente pueden utilizar complejos algoritmos de comparación para alinear dos o más secuencias que reflejen de la mejor manera posible los acontecimientos evolutivos que podrían haber dado lugar a las una o más diferencias entre las dos o más secuencias. Por lo tanto, estos algoritmos funcionan con un sistema de puntuación que premia la alineación de aminoácidos idénticos o similares y penaliza la inserción de huecos, extensiones de huecos y el alineamiento de aminoácidos no similares. El sistema de puntuación de los algoritmos de comparación puede incluir uno o más y típicamente todos de: (i) asignación de una puntuación de penalización cada vez que se inserta un hueco (puntuación de penalización por hueco); (ii) asignación de una puntuación de penalización cada vez que un hueco existente se amplía con una posición adicional (puntuación de penalización por extensión); (iii) asignación de puntuaciones altas al alinear aminoácidos idénticos; y (iv) asignación de puntuaciones variables al alinear aminoácidos no idénticos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, es preferible utilizar los valores por defecto cuando se utiliza este tipo de programa informático para la comparación de secuencias.
En algunos algoritmos, las puntuaciones dadas para la alineación de aminoácidos no idénticos se asignan de acuerdo con una matriz de puntuación, que también puede denominarse matriz de sustitución. Las puntuaciones proporcionadas en dichas matrices de sustitución pueden reflejar el hecho de que la probabilidad de que un aminoácido sea sustituido por otro durante la evolución varía y depende de la naturaleza física/química del aminoácido a sustituir. Por ejemplo, la probabilidad de que un aminoácido polar sea sustituido por otro aminoácido polar es mayor en comparación con la probabilidad de que el mismo aminoácido sea sustituido por un aminoácido hidrófobo. Por lo tanto, la matriz de puntuación asignará la mayor puntuación a los aminoácidos idénticos, una puntuación más baja para aminoácidos no idénticos pero similares y una puntuación aún más baja para aminoácidos no idénticos no similares. Las matrices de puntuación más utilizadas son probablemente las matrices PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), las matrices BLOSUM (Henikoff y Henikoff (1992)) y la matriz Gonnet (Gonnet et al. (1992)).
Entre los programas informáticos adecuados para llevar a cabo dicha alineación se encuentran, pero sin limitación, Vector NTI (Invitrogen Corp.) y los programas ClustalV, ClustalW y ClustalW2 (Higgins DG y Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Una selección de diferentes herramientas de alineación está disponible en el servidor ExPASy Proteomics en www.expasy.org. Otro ejemplo de software que puede realizar la alineación de secuencias es BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que está disponible en la página web del National Center for Biotechnology Information que actualmente se encuentra en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y que fue descrito por primera vez en Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215; págs. 403-410). Algunos ejemplos de programas que realizan alineamientos globales son aquellos basados en el algoritmo de Needleman-Wunsch, p. ej., los programas EMBOSS Needle y EMBOSS Stretcher. En una técnica, se prefiere utilizar el programa informático ClustalW para realizar los alineamientos de secuencias. ClustalW2 está disponible en Internet, por ejemplo, en la página web del Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI) www.ebi.ac.uk la ruta tools - sequence analysis - ClustalW2.
Una vez que un programa informático adecuado ha producido una alineación o un grupo de alineaciones, es posible calcular el % de similitud y el % de identidad de secuencia. El software suele hacerlo como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico. Preferiblemente, el alineamiento se realiza sobre tramos de dominio en lugar de realizar un alineamiento global para intentar optimizar el alineamiento sobre toda la longitud de una secuencia. Por lo tanto, mientras que se puede utilizar un programa de alineación para facilitar la referencia y la coherencia, dado que las longitudes de las secuencias son relativamente cortas y los péptidos de la invención pueden contener dominios derivados de varias proteínas diferentes, la identidad de las secuencias se realiza de forma más sencilla mediante la inspección visual de las secuencias completas o parciales alineadas y el cálculo manual de la identidad.
Los presentes inventores han diseñado una serie de péptidos derivados de dedos de cinc mutados, basado en los péptidos/represores de dedos de cinc descritos en el documento WO 2012/049332, que han sido adaptados para aumentar su compatibilidad con el organismo hospedador en el que se van a expresar, p. ej., ratón o ser humano. Se ha comprobado que estos péptidos llamados "ratonizados" y "humanizados" de dedos de cinc reducen sustancialmente los posibles efectos de inmunogenia y toxicidad in vivo.
Las principales limitaciones de diseño al modificar los péptidos de la técnica anterior para mejorar la actividad terapéutica in vivo eran que los nuevos péptidos tenían que coincidir con las secuencias de proteínas del hospedador lo más estrechamente posible, manteniendo al mismo tiempo una actividad de unión específica contra las secuencias de ácidos nucleicos diana; en particular, actividad de unión de poli(CAG). Preferiblemente, los péptidos de dedo de cinc resultantes están adaptados para ser tolerados tanto en ratones como en humanos, de modo que, esencialmente, el mismo péptido de dedo de cinc puede utilizarse en modelos animales de efecto, así como en estudios y tratamientos terapéuticos posteriores. Este planteamiento puede simplificar el desarrollo de agentes terapéuticos útiles, especialmente en el caso de que una proteína diseñada pueda coincidir con las secuencias de péptidos humanos y de ratones hospedadores engendrados con una identidad de secuencia suficientemente alta.
El objetivo de la "humanización" o "ratonización" de acuerdo con la invención es minimizar las diferencias de secuencia de aminoácidos entre un diseño de dedo de cinc artificial, seleccionado para unirse al ADN de poli(CAG), y una repetición de dedo de cinc de origen natural, Zif268 (que tiene homólogos humanos y de ratón, y que se une naturalmente a GCG-TGG-GCG; Pavletich, 1991). En la práctica, la humanización o "ratonización", tenía la intención de reducir el potencial de epítopos extraños en las secuencias de péptidos de dedo de cinc de la invención. Estos cambios se llevaron a cabo dentro de la restricción de mantener la actividad de unión a CAG, según lo determinado por los experimentos ELISA con dedos de cinc (Isalan, 2001).
De manera significativa, dado que Zif268 tiene homólogos en células de ratón y humanas, y el marco del armazón de dedo de cinc de Zif268 es casi idéntico en ratones y seres humanos (véase la SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48), se consideró posible que una única secuencia de péptido de dedo de cinc de la invención, adecuadamente modificada y optimizada para el hospedador, pudiera ser adecuada para su uso tanto en células de ratón como en células humanas, sin dar lugar a efectos inmunogénicos adversos: por consiguiente, un diseño de dedo de cinc optimizado para la unión de poli(CAG) puede ser útil en ambas especies. De manera deseable, la identidad de secuencia de un péptido de la invención con cada una de las secuencias nativas de ratón y de humano es de al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 % o al menos aproximadamente un 85 %; tal como entre aproximadamente un 75 % y un 95 % o entre aproximadamente un 80 % y un 90 %.
Con el fin de mejorar la identidad de la secuencia, para estudios con ratones, el dominio represor KRAB, Kox- 1, que era adecuado y "compatible con el hospedador" para su uso en seres humanos, se sustituyó por el dominio KRAB análogo de ratón de ZF87, también denominado MZF22 (Abrink et al., 2001).
Además, las modificaciones de diseño para la adaptación al hospedador/la mejora de la optimización del hospedador incluyeron la eliminación de los marcadores epitópicos FLAG (no necesarios para la expresión in vivo a medio y largo plazo). Para mejorar aún más la optimización del hospedador, las señales de localización nuclear se seleccionaron a partir de secuencias humanas (KIAA2022) y de ratón (proteína p58) para su expresión en humanos o ratones, respectivamente.
Además, teniendo en cuenta la intención primordial de la invención de proporcionar péptidos de dedo de cinc para la unión de alta afinidad y específica a secuencias de ácido nucleico de poliCAG, los presentes inventores también modificaron las secuencias de dedos de cinc diseñadas originalmente para que coincidieran mejor con las secuencias del hospedador. Dado que Zif268 se encuentra tanto en humanos como en ratones, el "armazón" del péptido era esencialmente invariable. Sin embargo, la optimización del hospedador se logró modificando las hélices de reconocimiento y los enlazadores de los dedos de cinc diseñados originalmente para que coincidieran lo más posible con la secuencia del factor de transcripción humano Zif268 (SEQ ID NO: 48); Pavletich, 1991).
Un péptido de dedo de cinc "humanizado" de la invención (que tiene 11 dedos de cinc) se denomina en la presente memoria hZF-Kox-1, mientras que una versión ratonizada del péptido de dedo de cinc se denomina mZF-ZF87.
Se desarrolló una serie de diseños optimizados para el hospedador basados en ZF11xHunt-Kox-1 para equilibrar el resultado en términos de reducción de la inmunogenia y la toxicidad in vivo y la capacidad para unirse a las secuencias diana de poli-CAG.
La SEQ ID NO: 49 ilustra un modulador de dedo de cinc ventajoso que se une a la secuencia de ácido nucleico diana con alta afinidad (según se evalúa mediante ELISA), al tiempo que se reduce sustancialmente la toxicidad in vivo durante la expresión a medio y largo plazo en células de ratón. Esta secuencia modificada (que comprende la secuencia del péptido de dedo de cinc de SEQ ID NO: 31) contiene 33 diferencias con respecto a la secuencia inicial de ZF11xHunt-Kox-1. Estas diferencias se eligieron para que la secuencia fuera más parecida a Zif268 humana, conservando la unión al ADN de poli(CAG) (véase la tabla 9).
La secuencia de la SEQ ID NO: 49 se modificó posteriormente para aumentar la coincidencia con el hospedador (SEQ ID NO: 50; modulador de 11 dedos de cinc ratonizado 1 mZF-ZF87), que comprende la secuencia del péptido de dedo de cinc de SEQ ID NO: 29. Las hélices alfa y los enlazadores del péptido de dedo de cinc se rediseñaron para que fueran lo más parecidos a Zif268 humana, mientras que se seguía uniendo a poli(CAG) a través de las alfa hélices (p. ej., QSGDLTR y QSGDRKR). Estas secuencias peptídicas optimizadas para el hospedador se desarrollaron para su expresión en ratones con el fin de realizar estudios iniciales in vivo sobre su potencial valor terapéutico y toxicidad, y se denominan mZF-ZF87 en la presente memoria; y las variantes humanas equivalentes (véase las SEQ ID NO: 53, modulador de 11 dedos de cinc humanizado 2 hZF-ZF-kox1; y 54, modulador de 11 dedos de cinc humanizado 2 hZF-ZF-kox1) se denominan hZF-ZF-kox1. Las diferencias entre las variantes de ratón y las humanas radican en el dominio represor, que es el dominio KRAB ZF87 para el ratón y el dominio KRAB Kox-1 para el ser humano; y la señal de localización nuclear (NLS), que procede de una variante del péptido humano para su uso en humanos (proteína humana KIAA2022 NLS), y un péptido de ratón para su uso en ratones, como se describe en otra parte de la presente memoria.
Otros moduladores de péptidos de dedo de cinc emparejados con el hospedador de la invención particularmente adecuados para su uso en el ratón incluyen las SEQ ID NO: 51 y 52, que incorporan las secuencias de péptidos de dedo de cinc 33 y 35, respectivamente. Los moduladores de péptidos de dedo de cinc equivalentes humanizados son las SEQ ID NO: 55 y 56, que incorporan las secuencias de péptidos de dedo de cinc 33 y 35, respectivamente. Se considera que estas secuencias son lo suficientemente idénticas a las secuencias de péptidos de dedo de cinc humanas, sin dejar de unirse a las secuencias diana de poli(CAG).
De este modo, se ha comprobado que pueden sintetizarse diversas variantes de diseño de las secuencias de péptidos de dedo de cinc para conservar las características de unión a poli(CAG) deseadas, al tiempo que se mejoran/maximizan las propiedades de adaptación del hospedador y se minimiza la toxicidad in vivo. Sorprendentemente, dichas variantes de diseño pueden incluir un número relativamente alto de modificaciones dentro de las secuencias de reconocimiento alfa-helicoidal de los dedos de cinc y dentro de las secuencias de enlace de los dedos de cinc, que en ambos casos podría esperarse que afecten (p. ej., reduzcan) la afinidad y especificidad de unión al ácido nucleico diana, sin afectar negativamente a la eficacia del potencial terapéutico para su uso in vivo. Además, al reducir beneficiosamente los efectos de inmunogenia y toxicidad in vivo, la actividad a medio y largo plazo de los péptidos terapéuticos de la invención se incrementa significativamente.
Basándose en estos estudios para desarrollar derivados beneficiosos de ZF11xHunt-kox-1, se pueden realizar modificaciones similares para mejorar la optimización del hospedador, especialmente en la porción del péptido de dedo de cinc, en otras moléculas terapéuticas de péptidos de dedo de cinc basadas en dominios de 10 dedos de cinc (ZF10xHunt-kox-1), dominios de 12 dedos de cinc (ZF12xHunt-kox-1) y dominios de 18 dedos de cinc (ZF18xHuntkox-1), véanse las SEQ ID NO: 59 a 64 (tabla 9).
A continuación, la invención se ilustrará por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
A menos que se indique otra cosa, se utilizaron reactivos disponibles en el mercado y técnicas estándar de biología molecular y bioquímica.
Materiales y Métodos
Los siguientes métodos utilizados por los presentes solicitantes se describen en Sambrook, J. et al., 1989 anteriormente mencionado: análisis de los productos de digestión con enzimas de restricción en geles de agarosa y preparación de la solución salina tamponada con fosfato. Los reactivos de uso general, los oligonucleótidos, los productos químicos y los disolventes se adquirieron de Sigma-Aldrich Química SA (Madrid, España). Las enzimas y polimerasas se obtuvieron de New England Biolabs (NEB Inc.; c/o IZASA, S.A. Barcelona, España).
Construcción del vector y del péptido de dedo de cinc (ZFP)
Para construir un armazón de péptido de dedo de cinc (ZFP) que reconozca las secuencias de ADN tanto de CGA como de GCT (que se encuentran dentro de las repeticiones de CAG ampliadas), se seleccionó un armazón de dedo de cinc basado en la secuencia del armazón de tipo silvestre de la región de dedo de cinc de Zif268 humana de tipo silvestre. Los restos de aminoácidos responsables del reconocimiento de la diana de ADN (es decir, la "secuencia de reconocimiento", que corresponde esencialmente a la región a-helicoidal del armazón) se diseñaron en primer lugar teniendo en cuenta dos estudios publicados con anterioridad: (1) Choo et al. (1994) Nature 372(6507): 642-645, para la unión al triplete de GCT; y (2) Isalan et al. (1998) Biochemistry 37(35): 12026-12033, para la unión a los tripletes de GN(T/A), como se ha descrito anteriormente (documento WO 2012/049332). Estas secuencias de aminoácidos ahelicoidales se combinaron inicialmente para generar una nueva secuencia híbrida de a-hélice, QRATLQR (SEQ ID NO: 69), que comprende las posiciones -1, 1 y 2 de Isalan et al. y los restos 3, 4, 5 y 6 de Choo et al. Se esperaba, y así se demostró, que el dominio de dedo de cinc resultante se une a la secuencia GC(T/A) y se denominó ZFxHunt (véase la figura 1). Un vector pUC57 que contiene 6 de estos dominios de dedo de cinc, denominado ZF6xHunt, se sintetizó (Genscript Corporation (Piscataway, NJ). Este vector también incluía un promotor T7, una NLS N-terminal (PKKKRKV; (SEQ ID n O: 37) y sitios de restricción para obtener 4 (ZF4), 11 (ZF11), 12 (ZF12) y 18 (ZF18) péptidos de dedo de cinc en matrices en tándem por subclonación como se describe en el documento WO 2012/049332.
A continuación, los péptidos de dedo de cinc se subclonaron en el vector de expresión de mamíferos pTarget (Promega). Se introdujo mediante PCR una secuencia de marcador de 3xFLAG en el extremo N, y en el extremo C se introdujeron las secuencias codificantes del dominio de endonucleasa Foklo de Kox-1 (dominio de represión de KRAB), con una secuencia de enlace peptídico basada en aminoácidos G y S se colocó entre el péptido de dedo de cinc y el dominio efector, nuevamente, como se describe en el documento WO 2012/049332.
La serie de vectores pEH se clonó en dos etapas. En primer lugar, se extrajo la región codificante de EGFP de pEGFP-N1 (Clontech), usando HindIII / XbaI, y se clonó en pGL4.13 (Promega) obteniéndose pSV40-EGFP. Después, se clonó un producto de PCR que contenía CMV-HcRed-poliA y enlazadores C/al en pSV40-EGFP (parcialmente digerido con C/al). El codón de inicio de EGFP se mutó a alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio y fragmentos de PCR que contenían el exón I de Htt humana de diferentes moldes genómicos humanos (para obtener diferentes números de repeticiones de CAG), se clonaron en el sitio de EcoRI de pEH, cadena arriba y en marco con EGFP (serie pEH-Q). La serie de vectores pSV40-mCherry se generó sustituyendo la EGFP de la serie de vectores pSV40-EGFP por mCherry utilizando los sitios XmaI/ XbaI.
Diseño de péptidos de dedo de cinc "ratonizados"
ZF11-kox-1 descrito en el documento WO 2012/049332 (ZF-kox-1 en este documento) se convirtió en una serie de péptidos más compatibles con el ratón, mZF-ZF87 (SEQ ID NO: 49 a 52), como sigue:
(1) Se eliminó el triple indicador de marcador de FLAG de ZF-Kox-1.
(2) La señal de localización nuclear (NLS) vírica del SV40 se sustituyó por una NLS de la primasa p58 de ratón (RIRKKLR; GenBank: BAA04203.1; SEQ iD NO: 38) utilizando restos nativos adyacentes como enlazadores.
(3) Un marco de dedo de cinc lo más parecido posible a la secuencia Zif268 del ratón (Pavletich y Pabo (1991), Science 252: 809-817) conservando los restos funcionales de unión a CAG en las hélices de reconocimiento del ADN. Por tanto, la secuencia QRATLQR (SEQ ID NO: 69) utilizada en ZF11 -kox-1 del documento WO 2012/049332 se cambió por una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, tal como una o las SEQ ID NO: 2 a 5, o una combinación de las SEQ ID NO: 2 y 5 o 3 y 4, como se describe en la presente memoria, basándose en la variación natural de la secuencia de reconocimiento entre los dominios de dedo de cinc adyacentes dentro del armazón de Zif268; véase la figura 10).
Se realizaron experimentos ELISA con fagos como se han descrito anteriormente (Isalan etal. (2001), Nat. Biotechnol.
19: 656-660) para guiar el diseño de la secuencia de reconocimiento de la alfa-hélice a fin de garantizar que las secuencias modificadas conservaban la unión adecuada a los tripletes de CAG.
(4) Los péptidos enlazadores de dedos de cinc se modificaron para hacerlos lo más parecidos posible a los enlazadores de dedos de cinc canónicos (p. ej., TGEKP, TGQKP, SEQ ID NO: 6 y 65), mientras que se conservaron los enlazadores similares a los canónicos no de tipo silvestre (p. ej., TGSQKP, SEQ ID NO: 16) después de cada 2 dedos, que se consideran importantes para la función de los conjuntos de dedos de cinc largos (Moore et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1437-1441); y la conservación de los enlazadores largos a distancias adecuadas, es decir, después del dedo 5 (para la construcción de 11 dedos) y después del último dedo (dedo 11 de la construcción de 11 dedos) entre el dominio del dedo de cinc y el dominio represor. Sin embargo, estos enlazadores se redujeron en longitud respecto a los de ZF-kox-1 para reducir aún más la cantidad de secuencia no del hospedador.
(5) Para las construcciones de ratón, Kox-1 humana se sustituyó por el dominio de represión KRAB de ratón de ZF87 (SEQ ID NO: 40; también conocido como MZF22 (Abrink et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1422-1426.); refSeq_NM_133228.3). El fragmento del dominio KRAB de 1-76 aminoácidos de ZF87, cuando se fusiona con el dominio de unión al ADN Gal4, se ha informado previamente de que tiene niveles similares de represión en comparación con Gal4-Kox-1 (Abrink et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1422-1426.) en ratones.
Ensayos de desplazamiento de gel in vitro
Basándose en las construcciones de dedos de cinc del vector pUC57, se utilizaron los cebadores directos e inversos adecuados para generar productos de PCR para la expresión in vitro de ZFP, utilizando el kit TNT T7 Quick PCR DNA (Promega). Las sondas de ADN bicatenario con diferentes números de repeticiones de CAG se produjeron mediante el relleno de Klenow como se describe en el documento WO 2012/049332. Se utilizaron 100 ng de ADN bicatenario en una reacción de etiquetado DIG utilizando el kit Gel Shift, de 2.a generación (Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de desplazamiento de gel, se incubaron 0,005 pmol de sonda marcada con DIG con cantidades crecientes de proteína expresada con TNT en una reacción de 20 pl que contenía 0,1 mg/ml de BSA, 0,1 pg/ml de polidl:dC, glicerol al 5 %, Bis-Tris propano 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 50 mg/ml de ZnCl2, NonidetP40 al 0,1 % y DTT 5 mM durante 1 hora a 25 °C. Las reacciones de unión se separaron en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 7 % durante 1 hora a 100 V, se transfirieron a una membrana de nylon durante 30 minutos a 400 mA, y la visualización se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cultivo celular y administración de genes
La línea celular HEK-293T (ATCC) se cultivó en un 5 % de CO2 a 37 °C en DMEM (Gibco) suplementado con un 10 % de FBS (Gibco). El ADN purificado por Qiagen se transfectó a las células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se emplacaron las células en pocillos de 10 mm hasta una densidad del 50 % y se mezclaron y añadieron a las células 70 ng de plásmido indicador, 330 g de plásmido de expresión de ZFP y 2 pl de Lipofectamine 2000. Las células se cosecharon para su análisis 48 horas después.
Las células STHdh+ / Hdh+ y STHdhQ111/ Hdh111 (obsequiadas por M.E. MacDonald) se cultivaron en un 5 % de CO2 a 33 °C en DMEM suplementado con un 10 % de FBS (Gibco) y 400 pg/ml de G418 (PAA). Las células se infectaron con partículas retrovíricas utilizando el sistema pRetroX (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de citometría de flujo
Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto utilizando el software BD FACSDiva.
Transferencia de Western
Las células 293T se cosecharon 48 horas después de la transfección en 100 pl de colorante de carga 2xSDS con inhibidor de proteasa completo (Roche). Se separaron 20 pl de muestra en geles preparados Criterion Tris-HCI al 4­ 15 % (BioRad) durante 2 horas a 100V, se transfirieron a la membrana Hybond-C (GE Healthcare) durante 1 hora a 100V. Las proteínas se detectaron con el anticuerpo primario anti p-actina (Sigma A1978) a una dilución de 1:3000 o con el anticuerpo anti-EGFP (Roche) a una dilución de 1:1500 y con un anticuerpo secundario de burro anti ratón conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch) a una dilución de 1:10000. La visualización se realizó con el sistema ECL (GE Healthcare) utilizando un sistema de formación de imágenes LAS-3000 (Fujifilm). Se tripsinizaron las células STHdh y se recolectaron en PBS que contenía un inhibidor de proteasa completo (Roche). Las células se resuspendieron en tampón RIPA (TritonX-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, Tris-HCl 40 mM, NaCl 150 mM, SDS al 0,2 %, completo), se incubaron en hielo durante 15 minutos, y se centrifugaron a 13000 rpm durante 15 minutos. Se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas mediante el ensayo de proteínas Dc de BioRad. Se separaron 60 gg de proteína en un gel preparado Criterion Tris-HCI al 5 % (BioRad) durante 2 horas a 100V, se transfirieron utilizando el sistema iBIot Dry Blotting (Invitrogen) durante 8 minutos y la proteína Htt endógena se detectó con el anticuerpo primario anti-Huntingtina (Millipore MAB2166) a una dilución de 1:1000.
Producción del vector vírico adeno-asociado
Se produjeron rAAV2/1-GFP, rAAV2/1-ZF11-Koxl y rAAV2/1-mZF-ZF87 que contienen un promotor pCAG (elemento potenciador temprano del CMV y el promotor de la beta-actina de pollo) y WPRE (elemento regulador postraduccional de Woodchuck), en el Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica de la Universitat Autónoma de Barcelona (CBATEG- UAB) como se describió previamente (Salvetti et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9: 695-706). El virus recombinante se purificó por precipitación con PEG8000 seguida de ultracentrifugación en gradiente de yodixanol con un título final de aproximadamente 1012 copias del genoma/ml.
Animales - Ratones transgénicos R6/2
Para este estudio, los presentes inventores utilizaron ratones R6/1, R6/2 y de tipo silvestre.
Los ratones transgénicos R6/2 se adquirieron de Jackson Laboratories (B6CBA- Tg(HDexon1)62Gpb/3J). Las hembras hemicigotas trasplantadas de ovario y los machos B6CBAF1/J ts se criaron en el propio laboratorio, y se genotipó la descendencia como se describió previamente (Benn, et al. (2009), PLoS One 4, e5747).
Los ratones transgénicos R6/1 (B6.Cg-Tg(HDexon1)61 Gpb/J) y los controles ts (C57BL/6J) también se adquirieron de Jackson Laboratories. Para las pruebas de mZF-ZF87, se prefirió a los ratones R6/1 en lugar de los R6/2 para evitar la aparición temprana de síntomas y para cumplir con las condiciones de bienestar animal en el Reino Unido, ya que el objetivo de este estudio no era comprobar la reversión del fenotipo.
Se realizaron inyecciones estereotácticas en ratones R6/2 de 4 semanas de edad, ratones R6/1 de 8 semanas y ratones ts de 4 a 8 semanas. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Directiva 86/609/UE de la Comisión Europea, la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 del Reino Unido, y siguiendo protocolos aprobados por el Comité de Ética del Parque de Investigación Biomédica de Barcelona y el Órgano de Revisión Ética y de Bienestar Animal del Imperial College de Londres. El número de ratones para cada experimento se indica en la tabla 2.
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Tabla 2: Resumen del número de ratones a los que se inyecta ZF-Kox-1, mZF-ZF87, GFP o PBS.
Cirugía estereotáctica
En resumen, se anestesió a los ratones con una mezcla de ketamina (75 mg/kg) y medetomidina (1 mg/kg, i.p.) o isofluorano (preferido) y se fijaron en un marco estereotáctico. Se inyectó buprenorfina a 8 gg/kg para proporcionar analgesia.
Los AAV se inyectaron bilateral o unilateralmente (según el estudio) en el estriado (A/P 0,7 mm, M/L± 1,8 mm, D/V -3,0 y/o -2,5 mm con respecto al bregma) utilizando una jeringa Hamilton de 10 gl a una velocidad de 0,25 gl/min controlada por una Ultramicropump (World Precision Instruments). Para cada hemisferio, se inyectó un volumen total de 1,5 a 3 gl (aproximadamente 2x109 partículas genómicas) o 1,5 gl de PBS. Por ejemplo, se puede realizar una administración en dos pasos como se indica a continuación: se inyectaron 1,5 gl a -3,0 mm de DV, se dejó reposar la aguja durante 3 minutos en su posición, y luego se inyectó la otra mitad a -2,5 mm de DV.
En algunos estudios, se inyectó aleatoriamente a las hembras con AAV que expresaban péptidos represores de dedos de cinc (es decir, ZF-kox-1 o mZF-ZF87) en un hemisferio y con AAV de control que expresaban GFP (AAV2/1-GFP) en el otro hemisferio.
En algunos estudios, las hembras fueron inyectadas solo en un hemisferio con AAV que expresaba la proteína de prueba (ya sea dedo de cinc o proteína de control GFP), rAAV2/1 -ZF-kox-1, rAAV2/1 -hZF- kox-1, AAV2/1 -mZF-ZF87 o AAV2/1-GFP; o con PBS como control negativo.
Los ratones fueron sacrificados a diferentes edades para el análisis posterior por RT-PCR, inmunohistoquímica o transferencia de Western; normalmente a las 2, 4 o 6 semanas después de la administración del agente. A los machos se les inyectó bilateralmente 3 gl del mismo virus en ambos hemisferios para los ensayos de comportamiento.
Pruebas de comportamiento en animales
El seguimiento del comportamiento comenzó a las 3 semanas de edad y las pruebas se realizaron bimensualmente hasta las 11 semanas de edad. Todos los experimentos se realizaron con doble enmascaramiento con respecto al genotipo y al tratamiento de los ratones.
El comportamiento de agarre se comprobó suspendiendo al animal por la cola durante 20 segundos. Los ratones que abrazan sus extremidades traseras recibieron una puntuación de 1, y los que no las abrazan recibieron una puntuación de 0.
La fuerza de agarre se midió permitiendo que los ratones se fijaran a un medidor de fuerza de agarre y tirando suavemente de la cola. La prueba se repitió tres veces y se registraron la media y la fuerza máxima.
Para la prueba de la barra rotatoria acelerada, los ratones fueron entrenados a las 3 semanas de edad para permanecer en la barra a una velocidad constante de 4 rpm hasta que alcanzaron un criterio de 3 minutos consecutivos en la barra. En la fase de pruebas, los ratones fueron introducidos en la barra rotatoria a 4 rpm y la velocidad se incrementó constantemente durante 2 minutos hasta 40 rpm. El ensayo se repitió dos veces y se registró la latencia máxima y media de caída de la barra.
Para la prueba de campo abierto, los ratones fueron colocados en el centro de un campo abierto cuadriculado de metacrilato blanco (70x70 cm) iluminado con una luz tenue (70 lux) para evitar la aversión, y la distancia recorrida, la velocidad y la posición se midieron automáticamente con un software de seguimiento por vídeo (sistema SMART, Panlab, España). Otras actividades, como la cría, inclinación, el aseo y el número de heces se controlaron visualmente.
Para la prueba de la huella de la pata, se pintaron las patas traseras de los ratones con un tinte no tóxico y se les permitió atravesar un pequeño túnel (10x10x70 cm) con una hoja limpia de papel blanco en el suelo. Se analizaron las pisadas durante tres ciclos de paso y se midieron tres parámetros: (1) Longitud de la zancada: la distancia media entre un paso y el siguiente; (2) Anchura de la base trasera: la distancia media entre las huellas traseras izquierda y derecha; y (3) la longitud de la separación: la distancia diagonal entre las patas traseras contralaterales cuando el animal camina.
qRT-PCR
Los ratones fueron sacrificados humanitariamente por dislocación cervical. Lo más rápido posible, se decapitaron y los estriados se diseccionaron en hielo y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, para la posterior extracción de ARN.
El ARN se preparó con el kit RNeasy (Qiagen) y se transcribió de forma inversa con Superscript II (Invitrogen). La PCR en tiempo real se llevó a cabo en un instrumento LightCycler® 480 (Roche) utilizando LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche). Se utilizó SYBR Advantage GC qPCR Premix (Clontech) para amplificar el transgén humano HTT en las plantillas de R6/2 y R6/1. Para las réplicas técnicas, cada PCR se realizó al menos por triplicado, y los resultados se normalizaron con respecto a tres genes constitutivos (mHPRT, mActb y mAtp5m, como en el estudio anterior de los presentes inventores (Garriga-Canut etal. (2012), Proc. Nati. Acad. Sci.;109, E3136-3145)). Se realizaron al menos tres réplicas biológicas independientes para cada experimento. Los conjuntos de cebadores se indican en su totalidad en la tabla 3.
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Tabla 3: Cebadores utilizados en los análisis de qRT-PCR.
Número de repeticiones de CAG por gen y conjuntos de cebadores correspondientes para la qRT-PCR. Prefijos de nombres: mut=mutante; m=ratón. El número aproximado de repeticiones de CAG para los genes de tipo silvestre se obtuvo a partir de los datos de ARNm de Genbank. Longitud de la repetición de CAG: el primer número corresponde a las repeticiones de CAG puras, el segundo número a las repeticiones de CAG rotas (que contienen CAA o CAT).
Inmunohistoquímica
Se perfundió a los ratones transcardialmente con PBS seguido de formol al 4 % (v/v). Se extrajeron los cerebros y se posfijaron durante una noche a 4 °C en formol al 4 % (v/v). A continuación, los cerebros se crioprotegieron en una solución de sacarosa al 30 % (p/v), a 4 °C, hasta que se hundieron. Los cerebros se congelaron y se cortaron con un micrótomo de congelación en seis series coronales paralelas de 40 pm (distancia entre cortes en cada serie paralela: 240 pm). Se empleó el procedimiento ABC indirecto para la detección del marcador neuronal Neu-N (1:100, MAB377 Millipore) en la primera serie; el marcador astroglial reactivo GFAP (1:500, Dako) en la segunda serie; y el marcador microglial Iba1 (1:1000, Wako) en la tercera serie. En resumen, las secciones se bloquearon con suero normal de cabra (NGS, Vector Laboratories) al 2 % (v/v) en PBS-Triton100 al 0,3 % (v/v) y se bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno (H2O2) al 1 % (v/v) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, las secciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en: (i) anticuerpo primario (a la concentración indicada anteriormente) en PBS con 0,3 % (v/v) de Tritón X100 y 2 % (v/v) de NGS; (ii) el anticuerpo secundario biotinilado en el mismo tampón; y iii) complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit ABC Elite de Vector Laboratories) en PBS-Triton X-100 al 0,3 % (v/v). Las secciones se lavaron 3x10 min en PBS y la actividad de la peroxidasa se reveló con SIGMAFAST-DAB (tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina, Sigma-Aldrich) en PBS durante 5 minutos. Las secciones se enjuagaron y se montaron en portaobjetos, se limpiaron con Histoclear (Fisher Scientific) y se cubrieron con Eukitt (Fluka).
La cuarta serie inyectada con GFP se montó en portaobjetos y se cubrió con Mowiol (Sigma- Aldrich) para el análisis de fluorescencia.
Análisis por la imagen
Determinación del volumen de inyección:
Se fotografiaron cinco cortes coronales por hemisferio inyectado con GFP desde niveles de bregma de 1,5 mm, separados por 240 pm, con una cámara digital acoplada a un microscopio macrozoom (Leica). Se definieron manualmente los contornos alrededor del área de expresión de GFP y del estriado dorsal y se midió el área con el software ImageJ (National Institute of Health, EE.UU.). El volumen se calculó como área por distancia entre cortes, de acuerdo con el principio de Cavalieri (Oorschot (1996), J. Comp. Neurol.; 366: 580-599).
Determinación de la D.O. para las tinciones de GFAP e Iba1:
Se seleccionaron cuatro cortes coronales por ratón y hemisferio que cubrían el estriado desde niveles de bregma de 1,5 mm, y se capturó una región de interés de 670 x 897 pm2 en el centro del estriado dorsal con un objetivo de 10x utilizando una cámara digital acoplada a un microscopio (Leica DMIRBE). La D.O. de las áreas se midió con ImageJ, se calculó la densidad media por hemisferio y se restó la D.O. para GFAP e Iba1 de los hemisferios de control del hemisferio inyectado.
Determinación de la densidad neuronal del estriado:
La densidad celular se calculó mediante una adaptación del método del fraccionador no sesgado (Oorschot (1996), J.
Comp. Neurol .; 366: 580-599). Se seleccionaron cuatro cortes coronales por ratón y hemisferio que cubrían el estriado desde niveles de bregma de 1,5 mm, y se capturó una región de interés de 447 x 598 pm2 en el centro del estriado dorsal con un objetivo de 15x utilizando una cámara digital acoplada a un microscopio (Leica DMIRBE). Se superpuso a las imágenes una cuadrícula que dejaba 16 cuadrados de 35 x 35 pm2 y una persona con enmascaramiento respecto del tratamiento de la muestra contó el número de núcleos teñidos.
Análisis Estadístico
Los datos se analizaron con el paquete StatPlus para Excel (Microsoft) y con IBM SPSS Statistics 22. Para comprobar la respuesta inflamatoria se calculó la diferencia de D.O. del hemisferio inyectado frente al hemisferio de control y se realizó una prueba de la t de Student frente al valor de no diferencia (0).
Para la densidad neuronal, se realizó una prueba de la t de Student emparejada de la densidad neuronal en el hemisferio inyectado frente al hemisferio de control. La densidad neuronal se analizó en los hemisferios contralaterales mediante ANOVA, seguido de comparaciones post-hoc con los hemisferios contralaterales de las muestras de PBS. Para probar la represión, se calculó el porcentaje de HTT mutante (mutHTT) o del gen de interés (HTT, ATN1, ATXN2, TBP) en el cerebro inyectado con respecto al hemisferio de control, y se realizó una prueba de la t de Student de una muestra contra el valor de no represión (100 %). Para garantizar una comparación justa entre los hemisferios inyectados y los contralaterales, solo se utilizaron para los análisis estadísticos los ratones con una expresión de ZF <1 % en el hemisferio contralateral, en relación con el hemisferio inyectado (tabla 4). Para comprobar la correlación entre los niveles de ARN de los diferentes genes y la expresión de ZF se aplicó una prueba de regresión lineal. Para comprobar los niveles de expresión a través de diferentes tiempos después de la inyección se realizó un ANOVA unifactorial. Todos los valores de significación se fijan en p=0,05.
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Tabla 4: Datos en bruto de la expresión de ZF-Kox-1 y mZF-ZF87.
Conjunto de datos completo que muestra los valores de expresión de ZF en cada uno de los hemisferios (inyectados frente al control) y el porcentaje de expresión de ARN de HTT mut con respecto al control. Los ratones que muestran una expresión de fuga de ZF en el hemisferio de control contralateral (>1 % del hemisferio inyectado, negrita y cursiva) no se tienen en cuenta en el análisis estadístico de la represión de mut HTT que se muestra en la figura 16.
Ejemplo de referencia 1
Diseño de conjuntos de péptidos de dedo de cinc (ZFP) para que se unan a repeticiones de CAG
Se sabe que los dominios de dedo de cinc pueden concatenarse para formar cadenas de varios dedos (p. ej., 6 dedos) (Moore et al. (2001) Proc. Acad. Sci. USA 98(4): 1437-1441; y Kim y Pabo (1998) Proc. Acad. Sci. USA 95(6): 2812­ 2817). El estudio anterior de los presentes inventores, véase el documento WO 2012/049332, fue el primero en informar sobre la exploración sistemática de los modos de unión de ZFP de diferente longitud a largos tramos de ADN repetitivo.
En este estudio anterior, el diseño racional se utilizó para construir un dominio de dedo de cinc (ZFxHunt) que se uniría a la secuencia 5'- GC(A/T) -3' en el ADN bicatenario. Por lo tanto, se esperaba que las proteínas de dedos de cinc que comprenden conjuntos de ZfxHunt se unieran a las secuencias de poli-GCA y poli-GCT (véanse la sección de Materiales y métodos anterior y la figura 1). Las dos cadenas de ADN de la repetición de doble cadena de CAG fueron diana porque: (i) se pensó que esto aumentaría la avidez de los péptidos de dedo de cinc por las dianas cromosómicas de baja copia; y (ii) permitió probar los diseños de fusión de nucleasas Fok\ (como se describe a continuación). Para tratar de evitar que los péptidos de dedo de cinc de la invención pierdan su registro con el ADN afín (después de 3 o más dedos adyacentes y 9 pares de bases contiguas de ADN de doble hélice), se diseñaron cuidadosamente las secuencias enlazadoras. Concretamente, se moduló la longitud de los enlaces entre los dedos de cinc adyacentes en los conjuntos. De este modo, el registro entre los conjuntos más largos de péptidos de dedo de cinc, especialmente en la unión a ADNbc, se pudo optimizar. Utilizando consideraciones estructurales, se decidió modificar periódicamente las secuencias canónicas estándar de los enlaces en los conjuntos. Por lo tanto, se incluyeron secuencias enlazadoras similares a las canónicas que contenían un resto adicional de Gly (o Ser) o secuencias enlazadoras flexibles (de hasta 29 restos) en el conjunto de dedos de cinc largos después de cada 2 y 6 dedos, respectivamente (véanse la tabla 5 y las SEQ ID NO: 90 a 94). De este modo, podrían probarse diferentes números de dedos de cinc para una discriminación óptima en función de la longitud.
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Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de los armazones de péptido de dedo de cinc de péptidos de unión a repeticiones de CAG no humanizadas o ratonizadas. En las secuencias de aminoácidos, las secuencias de reconocimiento están subrayadas y las secuencias de enlace se muestran en negrita.
Ejemplo de referencia 2
Unión de péptidos de dedo de cinc a secuencias diana de ADN in vitro
Para demostrar que los péptidos de dedo de cinc del ejemplo 1 son capaces de unirse a las secuencias repetidas de CAG, los ensayos de desplazamiento de gel in vitro se llevaron a cabo de la siguiente manera.
Se construyeron conjuntos de péptidos de dedo de cinc que contenían 4, 6 o 12 dominios ZFxHunt y se probaron en ensayos de desplazamiento de gel, para la unión a las sondas de CAG bicatenarias (figura 1B). Los resultados mostraron que los ZFP más largos dieron una unión más completa de la sonda. De manera interesante, se observaron distintos complejos unidos en el desplazamiento del gel, indicando que los ZFP encontraron equilibrios termodinámicos únicos y no fueron atrapados por intermediarios cinéticos. Se podría haber esperado que los dedos de cinc y las secuencias de ADN altamente repetitivas formaran eventos de unión parcial contiguos, lo que se habría esperado que diera lugar a amplias manchas en los cambios de gel; pero este no fue el caso. En particular, el ZFP de 12 dedos dio un desplazamiento secundario más bajo, que probablemente se debe a un subproducto de la degradación de los 6 dedos (los dedos de cinc pueden ser inestables en las regiones de enlace; Miller et al. (1985) EMBO J.4(6): 1609-1614).
Para comprobar si los dominios de dedo de cinc ZFxHunt eran capaces de unirse a ambas cadenas de una sonda de ADN con repetición de CAG, se ensayó ZF6xHunt (es decir, el péptido de 6 dedos) por desplazamiento de gel, y se demostró que se une por igual a una sonda repetitiva de CAG que contiene seis repeticiones contiguas de GCA, y a una sonda alternativa de CAG-CTG con tres repeticiones contiguas, como se muestra en la figura 1C. Además, en comparación con las secuencias mutadas, ZF6xHunt mostró especificidad por una secuencia diana que tenía siete repeticiones trinucleotídicas de CAG contiguas (véase la figura 1D).
En resumen, se sintetizaron ZFP de 4, 6 y 12 dedos y se demostró su capacidad para unirse a sondas de ADN de poli 5'- GC(A/T) -3' in vitro. Además, se demostró que los ZFP más largos se unían de forma más específica y eficiente a sus secuencias diana.
Ejemplo de referencia 3
Represión de los genes indicadores de poliQ in vivo
La actividad intracelular del dominio de dedo de cinc ZFxHunt se probó in vivo utilizando vectores indicadores con diferentes números de repeticiones de CAG 5' en marco con EGFp (Q0, Q10, Q35 y Q104; donde Q = CAG y el número indica el número de repeticiones). Para evaluar si había efectos no específicos causados por las proteínas de dedo de cinc, se clonó un indicador de HcRed en una región diferente del mismo vector, bajo un promotor independiente (figura 2A).
Las células HEK293T se cotransfectaron transitoriamente con los vectores indicadores y ZFxHunt indicados, en los que la expresión de los dedos de cinc estaba dirigida por promotores de CMV. Se realizaron tres series de ensayos: cuantificación de las células con fluorescencia de EGFP y HcRed utilizando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS); niveles de proteína EGFP en transferencias de Western; y niveles de ARNm de EGFP y HcRed en la qRT-PCR (figuras 2B a 2D). Mientras que las repeticiones de CAG más cortas (Q0, Q10) no se vieron afectadas por ninguno de los péptidos ZF4, ZF6, ZF11 o ZF18xHunt, las dianas de repetición de CAG más largas (Q35, Q104) fueron fuertemente reprimidas en los tres ensayos, p. ej., hasta 10 veces la represión de EGFP según se determina mediante FACS, lo que equivale a una reducción del 90 % (figura 2B).
También se comprobó que las cadenas de dedos de cinc más largas daban una mayor represión de la expresión del gen diana, tal y como se determinó en la qRT-PCR (figura 2D). La proteína de 6 dedos, ZF6xHunt, se observó que era eficaz en la FACS (figura 2B) y en transferencias de Western (figura 2C).
Para probar el potencial de una represión aún más fuerte, el dominio de represión KRAB Kox-1 (Groner et al. PLoS Genet 6(3): e1000869) se fusionó con el C-terminal de las proteínas ZFxHunt (figuras 2E a 2G; tabla 6). Como cabía esperar, la represión de Kox-1 fue efectivamente mucho más fuerte. Por ejemplo, hubo hasta un 98 % de reducción de células verdes según se determinó mediante FACS para Q35- y Q104- EGFP, con niveles indetectables de la proteína EGFP mediante análisis de transferencia de Western (figura 2F). Aunque la represión fue generalmente más fuerte, seguía siendo proporcional al ZFP y a la longitud de CAG: por ejemplo, la construcción de EGFP que carece de repeticiones de CAG no fue reprimida, y las construcciones que tienen repeticiones de CAG más largas (p. ej., Q35) fueron reprimidas más fuertemente que las construcciones de repeticiones más cortas (p. ej., Q10-EGFP). En este ensayo, se observó que la proteína ZF11xHunt-Kox-1 proporcionaba el mayor nivel de represión, como se muestra en las figuras 2E y 2G. Esto demuestra que, con diseños de enlazadores adecuados, las cadenas largas que contienen números impares de dedos de cinc también pueden funcionar eficazmente. Además, se demuestra que el mecanismo de represión de HcRed mediado por Kox-1 depende de la presencia de repeticiones de CAG largas en el plásmido. El nivel de represión involuntaria del gen vecino (HcRed) con las proteínas Kox-1 puede deberse a los efectos de largo alcance de Kox-1 sobre la estructura de la cromatina.
Para comprobar que estos resultados no eran puramente específicos de los ZFP bajo el control del promotor de CMV, también se realizaron pruebas equivalentes con los ZFP expresadas bajo el control del promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK). Como se ilustra en la figura 3, se obtuvieron esencialmente los mismos resultados para las construcciones de péptidos de dedo de cinc desnudos.
De manera significativa, no se observó ninguna represión no específica de HcRed con ZFP desnudo, lo que sugiere que la unión específica de las proteínas ZFxHunt a las repeticiones de CAG largas es necesaria para la represión.
Por tanto, en ensayos de transfección transitoria, las proteínas ZFxHunt desnudas reprimen específicamente la expresión de un gen indicador que contiene 35 o más repeticiones de CAG. Las proteínas ZFxHunt fusionadas al dominio Kox-1 tuvieron un efecto represor más fuerte y redujeron la expresión de todos los genes indicadores que contenían CAG, y las construcciones más largas también afectan ligeramente a un gen indicador de control cercano.
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Tabla 6: Péptido de dominio Kox-1 y secuencias de ácido nucleico codificantes, y péptido enlazador de dominio de dedo de cinc y secuencias de ácido nucleico codificantes.
Ejemplo de referencia 4
Ensayos de unión competitiva para la represión de repeticiones de CAG largas
Para uso terapéutico en seres humanos, los ZFP deberían reprimir preferiblemente los alelos CAG mutantes largos y tener menos efecto sobre los alelos ts cortos (p. ej., de 10 a 29 repeticiones; la longitud de htt ts varía en la población humana, pero suele estar en este intervalo; mediana = 18). Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de competición para medir directamente la preferencia de longitud. Las células HEK293T se cotransfectaron con tres plásmidos: los vectores indicadores poliQ-EGFP y poliQ-mCherry indicados, junto con varios vectores de ZFxHunt.
La expresión relativa de los dos indicadores se midió mediante FACS (células positivas para EGFP o mCherry), y los resultados se muestran en la figura 4. En la fila superior, los recuadros de color gris claro representan niveles elevados de expresión de la proteína GFP, mientras que los recuadros de color gris oscuro representan niveles bajos de expresión de la proteína GFP; en la fila intermedia, los recuadros de color gris claro representan niveles elevados de expresión de la proteína mCherry, mientras que los recuadros de color gris oscuro representan niveles bajos de expresión de la proteína mCherry; y en la fila inferior, los recuadros de color (gris) claro representan niveles más altos de expresión de la proteína GFP en comparación con mCherry, los recuadros de color gris oscuro representan niveles más altos de expresión de la proteína mCherry en comparación con GFP. Los resultados demuestran que todos los péptidos de ZFxHunt se dirigen con preferencia y reprimen las repeticiones de CAG más largas, de tal forma que las células están dominadas por la expresión de las construcciones verdes o rojas más cortas cuando el número de secuencias de repetición de CAG en su homólogo opuesto es más largo. Esto se ve directamente al observar la relación entre la expresión verde y la roja en la fila inferior, en la que la esquina superior derecha de cada cuadrícula es un tono más claro, lo que indica mayores niveles de expresión de GFP; y la esquina inferior izquierda de cada cuadrícula es un tono más oscuro, lo que indica mayores niveles de expresión de mCherry. Todas las construcciones, con hasta 18 cadenas de dedos, demuestran una represión activa de los indicadores de repetición de CAG más largos.
Es posible que la inhibición selectiva de las secuencias diana más largas se deba, al menos en parte, a un efecto de acción masiva (es decir, las repeticiones de CAG más largas contienen más sitios potenciales de unión para los péptidos de dedo de cinc). Sin embargo, también es posible que en el caso de matrices más largas de dedos de cinc y secuencias más cortas de repeticiones de CAG, los péptidos pueden competir entre sí por el sitio de unión, y como consecuencia, los conjuntos más largos de dedos de cinc pueden unirse de forma más transitoria o más débil (p. ej., a secuencias de reconocimiento parciales o subóptimas).
Ejemplo de referencia 5
Represión cromosómica de htt mutante
Se probaron los efectos de los péptidos represores de dedos de cinc, ZF6xHunt y ZFHxHunt, sobre los genes htt cromosómicos. Las células STHdh (Trettel et al. (2000) Hum. Mol. Genet. 9(19): 2799-2809) son una línea de células progenitoras neuronales establecida a partir de primordios estriatales E14, procedentes de ratones ts (STHdhQ7/HdhQ7), o con inserciones génicas, donde el primer exón del gen htt de ratón con 7 repeticiones de CAG se ha sustituido por un exón humano con 111 repeticiones de CAG (STHdhQ111/HdhQ111). Las células STHdh que expresan de forma estable los péptidos ZF6xHunt y ZFHxHunt desnudos o fusionados con Kox-1 se cosecharon 20 días después de la infección retrovírica, y los niveles de htt se analizaron mediante transferencia de Western y qRT-PCR. El experimento se repitió dos veces de forma independiente y se obtuvieron resultados similares en ambas ocasiones. Los resultados de un experimento se muestran en la figura 5.
Como se ilustra en la figura 5A, ni los niveles de proteína ni de ARN de htt ts (Q7) se redujeron con ZF6xHunt y ZF1 IxHunt desnudos o fusionados con Kox-1. Por el contrario, los niveles de ARN y proteína de htt mutante Q111 se reprimieron con ZF6xHunt-Kox-1 hasta 2,5 veces (60 % de reducción) y 2 veces (50 % de reducción), respectivamente. ZF11xHunt-Kox-1 mostró una represión aún más fuerte, con una reducción de casi el 80 % en la expresión del ARNm y del 95 % en los niveles de proteína. ZF6xHunt y ZF11xHunt desnudos tuvieron menos efecto en la represión del gen htt mutante cromosómico, lo que sugiere que el mayor efecto de represión de Kox-1 puede ser beneficioso para la represión cromosómica de htt.
Ejemplo de referencia 6
Especificidad de la represión en los genomas de tipo silvestre
Los genomas normales contienen varios genes endógenos que se sabe que tienen secuencias de repetición de CAG. Por lo tanto, los posibles efectos secundarios de las proteínas ZFxHunt expresadas de forma estable en las células se ensayaron mediante qRT-PCR para los genes ts de atrofina1, ataxina-1, ataxina-2, ataxina-3, ataxina-7, subunidad alfa 1A del canal de calcio, y la proteína de unión TATA, que contienen secuencias de repetición de CAG. El número de secuencias de repeticiones de CAG en cada gen de tipo silvestre se muestra en la tabla 7.
Los resultados de estos ensayos se muestran en las figuras 5B y 5C. Como se ilustra, no se midieron efectos adversos ni en las células de ratón STHdh (figura 5B), ni en las células humanas HEK293T (figura 5C). En este último, incluso la htt humana, que tiene el mayor número de repeticiones de CAG ts en esta línea celular concreta (21 repeticiones), tampoco se reprimió.
Dado que la represión de Kox-1 se extiende mediante el establecimiento de heterocromatina (Groner et al. PLoS Genet 6 (3): e1000869), los efectos de ZF6xHunt-Kox-1 y ZF11xHunt-Kox-1 sobre los genes vecinos de htt, en células STHdh transducidas de forma estable, también se analizaron mediante qRT-PCR (figura 5B). Los dos genes adyacentes, receptor cinasa 4 acoplado a proteína G, que está a aproximadamente 7 kb cadena arriba; y la señalización de la proteína G 12, que se encuentra aproximadamente a 188 kb cadena abajo, y se comprobó que no se veían afectadas por la presencia de las proteínas represoras de dedos de cinc. Esto sugiere que estos dos genes vecinos están fuera del alcance de los efectos de Kox-1.
Los resultados indican que tanto la represión de ZF6xHunt-Kox-1 como la de ZF11xHunt-Kox-1 es específica para la htt mutante en los locus cromosómicos.
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Tabla 7: Número de repeticiones de CAG por gen y conjuntos de cebadores correspondientes para la qRT-PCR. Prefijos de nombres: h = humano; m = ratón. El número aproximado de repeticiones de CAG para los genes de tipo silvestre se obtuvo a partir de los datos de ARNm de Genbank.
Ejemplo de referencia 7
Ensayo de toxicidad celular
Ya que sería ventajoso que una terapia con ZFP tuviera una baja toxicidad, se realizaron ensayos de viabilidad celular con marcado de colorantes para comprobar la toxicidad (no específica) de los ZFP.
Se transfectaron células HEK-293T con 400 ng de las construcciones de vectores indicadas utilizando Lipofectamine2000 y se cosecharon 48 horas después de la transfección. Como control se utilizaron células solo con Lipofectamine2000 o no transfectadas (negativo). La citotoxicidad se analizó utilizando el ensayo Guava Cell Toxicity (PCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan como el porcentaje de células muertas, medio-apoptóticas y viables (véase la figura 6), en la que las barras expresan los resultados de al menos 3 experimentos independientes.
Estos datos muestran que no se produjeron efectos de toxicidad estadísticamente significativos en las células que expresan péptidos de dedo de cinc, en comparación con los experimentos de control. Además, ZF6xHunt- Kox-1 y ZF11xHunt-Kox-1 se toleraron durante más de 20 días (aproximadamente 3 semanas) tras la transfección retrovírica estable, sin ningún efecto celular adverso aparente. En general, las propiedades represoras de estos péptidos con dedos de cinc y su potencial de expresión estable, particularmente de las proteínas ZF6xHunt-Kox-1 y ZF11xHunt-Kox-1, sugieren que los péptidos de la invención tienen un potencial significativo para las aplicaciones terapéuticas de los genes.
Ejemplo de referencia 8
Represión del gen Htt mutante en un modelo de ratón para la enfermedad de Huntington
Tal como se ha descrito anteriormente, se diseñaron largas cadenas peptídicas de dedos de cinc con 6 o más dominios de dedo de cinc adyacentes con el objetivo de dirigirse específicamente a las secuencias de repetición de trinucleótidos de CAG. De manera beneficiosa, también se encontró que dichos péptidos largos de dedos de cinc, especialmente los que tienen 11 o más (p. ej., 11, 12 o 18) dominios de dedo de cinc adyacentes reprimen preferiblemente los genes diana con aproximadamente 35 o más repeticiones de CAG sobre las secuencias diana que tienen un número menor de repeticiones. También se demostró que la expresión estable de estas proteínas de dedo de cinc en una línea celular modelo de la EH reducía la expresión cromosómica del gen htt mutante (con 111 repeticiones de CAG), tanto a nivel de proteínas como de ARNm. Al mismo tiempo, el gen htt más corto de tipo silvestre (con 7 repeticiones de CAG en esta línea celular de ratón en particular) no se vio afectado, al igual que otros genes genómicos de repetición de CAG de tipo silvestre.
Los ratones R6/2 son un modelo animal bien establecido para el estudio de la EH y de potenciales terapias. Estos ratones expresan el exón 1 del gen humano de la EH con aproximadamente 150 repeticiones de CAG. Los ratones R6/2 tienen un inicio temprano de los síntomas de la EH y una rápida progresión de la enfermedad, mostrando una esperanza de vida de 12 a 17 semanas (Gil y Rego (2009) Brain Res. Rev. 59: 410-431).
Utilizando este modelo, las proteínas dedo de cinc se ensayaron para comprobar su capacidad de reducir la expresión de la htt mutante en un modelo de ratón transgénico de la EH, de acuerdo con el cronograma que se muestra a continuación.
En primer lugar, las proteínas represoras ZF6xHunt-Kox-1, ZF11xHunt-Kox-1 y ZF12xHunt-Kox-1 se insertaron en vectores del virus adenoasociado (AAV) (subtipo AAV2/1; Molecular Therapy (2004) 10: 302-317). En experimentos paralelos, los vectores de dedos de cinc-AAV se inyectaron en el estriado de ratones R6/2 para mediar la expresión de las proteínas de fusión ZFP-Kox-1 en las células del estriado. Se evaluó la capacidad de las proteínas de fusión ZFP-Kox-1 expresadas en las células del estriado para reducir los síntomas de la EH en los ratones R6/2 durante un periodo de hasta 12 semanas, evaluando periódicamente el comportamiento y los síntomas de los ratones R6/2 infectados con dedo de cinc-AAV, así como los niveles de expresión de la proteína htt mutante, en comparación con los ratones R6/2 de control infectados con un vector de control AAV-GFP.
Cronograma:
S e m a n a 0 : - R a to n e s R 6 /2 n e o n a to s .
S e m a n a 4 : - In y e c c ió n e s te re o tá c tic a e n e l e s tr ia d o d e ra to n e s R 6 /2 c o n A A V -p. e j., Z F 6 x H u n t-K o x -1 - ire s -G F P y A A V -G F P d e c o n tro l.
S e m a n a 4 a 12 : - P ru e b a d e c o m p o rta m ie n to s e m a n a l: p ru e b a d e b a r ra ro ta to r ia a c e le ra d a , a n á lis is d e la s u je c ió n d e la s e x tre m id a d e s p o s te r io re s y d e la lo n g itu d d e la z a n c a d a .
- C a d a d o s s e m a n a s : s a c r if ic io d e lo s ra to n e s p a ra la q R T -P C R p a ra c o m p ro b a r la re d u c c ió n d e la e x p re s ió n d e lo s fra g m e n to s m u ta n te s d e la E H y la in m u n o h is to q u ím ic a p a ra m o s tra r u n a re d u c c ió n d e lo s a g re g a d o s d e p o liQ y la e x p re s ió n d e o tro s m a rc a d o re s n e u ro n a le s c o m o D A R P P -32 y N e u N . Se demostró que las proteínas de fusión ZFP-Kox1 reducen la expresión de la proteína htt mutante y mejoran las anomalías motoras y neuropatológicas de los ratones R6/2 en comparación con los controles negativos.
Ejemplo de referencia 9
La administración en el estriado de dedos de cinc en ratones R6/2 provoca una represión dependiente de la dosis de la huntingtina mutante y atenúa los fenotipos de la enfermedad
El péptido ZF11xHunt-Kox-1 demostró ser eficaz para inhibir la expresión de htt mutante en la línea celular modelo STHdh (ejemplo 5). Por lo tanto, para probar la capacidad de estos péptidos de dedo de cinc para tratar / aliviar la EH in vivo en un modelo de ratón con EH se utilizó el virus AAV para entregar ZF11xHunt-Kox-1 a la zona cerebral afectada en ratones R6/2.
ZFxHunt fusionado a Kox-1 reduce la expresión de htt mutante in vivo
Los ratones hembra R6/2 fueron inyectados estereotácticamente a las 4 semanas de edad con un virus AAV2/1 que expresaba ZF11xHunt-Kox-1, bajo un promotor CAG con elementos WPRE (Garg et al. (2004) J. Immunol, 173: 550­ 558). Las inyecciones se realizaron en el estriado de un hemisferio cerebral, con inyecciones de control de AAV2/1-GFP en el otro.
El análisis mediante qRT-PCR mostró los mayores niveles de expresión de ZF11xHunt-Kox-1 en el estriado inyectado de ratones de 6 semanas de edad (véase la figura 7A). Al mismo tiempo, los niveles del ARNm del transgén de htt mutante en estas porciones del cerebro se redujeron en más de un 45 % (en promedio), en comparación con los niveles medidos en el hemisferio de control (véase la figura 7B).
Además, en el análisis de regresión lineal, se observó que los niveles de ARNm de ZF11xHunt-Kox-1 se correlacionaban negativa y estrechamente con los niveles de ARNm de htt mutante (r-cuadrado = 0,79; p = 0,0072), lo que es coherente con una represión in vivo dependiente de la dosis de htt mutante por la construcción del dedo de cinc.
Los niveles de represión del ARNm de htt mutante alcanzaron hasta el 60 % en algunos de los ratones analizados en la semana 6. En particular, esta represión era específica para la htímutante, ya que htt ts no se alteró en todos los puntos temporales analizados (véase la figura 7C). Sin embargo, la expresión de ZFP se redujo significativamente en la semana 8, y de forma concomitante, los niveles de represión del gen htt, aunque sigue siendo estadísticamente significativa, se redujeron al 20 % en comparación con el hemisferio de control. A las 10 semanas después de la inyección, los niveles de expresión de ZFP se redujeron en gran medida, y los niveles de htt mutante no se redujeron en comparación con el hemisferio de control.
Se obtuvieron resultados similares en ratones inyectados en un solo hemisferio con AAV-ZF11xHunt- Kox-1, en comparación con los hemisferios de control no inyectados (datos no mostrados).
Se cree que las reacciones inmunológicas a los péptidos de dedo de cinc expresados de forma heteróloga fueron las responsables de la notable reducción de la expresión del dedo de cinc en el cerebro de los ratones, así como la consiguiente reducción de la represión de la proteína htt mutante. En este sentido, se pudo observar una muerte celular significativa en las secciones cerebrales inyectadas, normalmente de 4 a 6 semanas después de la inyección.
ZFxHunt-Kox-1 retrasa la expresión de síntomas conductuales en ratones R6/2
En un experimento con doble enmascaramiento, los ratones R6/2 macho y sus compañeros de camada de tipo silvestre fueron tratados en ambos hemisferios, a las 4 semanas de edad, con AAV2/1-ZF11xHunt-Kox-1 o AAV2/1-GFP (es decir, que carecen de una proteína de represión de dedos de cinc). Se analizó el estado general de los ratones (peso corporal, fuerza de agarre, comportamiento de agarre) y su rendimiento en diferentes pruebas motoras de comportamiento (barra rotatoria acelerada, actividad en campo abierto, huella de la pata) dos veces al mes, a partir de la semana 3 de edad (antes de la cirugía).
En consonancia con el pico de represión observado a las 6 semanas de edad (figura 8B), las mayores mejoras en los síntomas de la EH se encontraron entre las semanas 5 y 7. Por ejemplo, ZF11xHunt-Kox-1 retrasó claramente el inicio del comportamiento de agarre en comparación con los ratones tratados con AAV2/1 - GFP o con los ratones de control R6/2 no operados, como se muestra en la figura 8A. Por tanto, mientras que tanto los ratones R6/2 tratados con GFP como los no tratados empezaron a agarrarse en la semana 5, este comportamiento patológico no se detectó en este momento en ninguno de los ratones tratados con ZF11xHunt-Kox-1 a las 5 semanas de edad. Además, en la semana 7, cuando el 67 % de los ratones de los grupos de control mostraron el agarre, solo el 25 % de los ratones tratados mostraron este comportamiento.
En la prueba de campo abierto, la distancia recorrida y la velocidad media no variaron entre los ratones R6/2 tratados y los no tratados. Sin embargo, el tiempo de permanencia en el centro del campo abierto en la semana 7 aumentó en los ratones tratados con GFP, con respecto a ambos grupos de ratones de tipo silvestre, pero no en los ratones tratados con ZF11xHunt-Kox-1 (ANOVA de medidas repetidas: Interacción significativa grupo x semana, p<0,01; comparaciones post-hoc por pares en la semana 7: TS-GFP frente a R6/2-GFP, p<0,001; TS-ZF frente a R6/2-ZF, n.s.), como se indica en la figura 8B. Este efecto podría deberse a la dificultad de los ratones R6/2 no tratados para iniciar el movimiento de huida hacia la periferia del campo abierto, o simplemente a una menor reactividad.
En la prueba de barra rotatoria acelerada, también se comprobó que el tratamiento con ZF11xHunt-Kox-1 atenúa la disminución del rendimiento con la edad, con respecto a los niveles preoperatorios (ANOVA de medidas repetidas: efecto principal significativo del grupo, p<0,05; comparaciones post-hoc entre grupos: TS-GFP frente a R6/GFP, p<0,05; TS-ZF frente a R6/2-ZF, n.s.), y los resultados se muestran en la figura 8C.
Sin embargo, la fuerza de agarre y los parámetros de marcha medidos en la prueba de impresión de la pata no revelaron ninguna diferencia notable entre los grupos, y tampoco la pérdida de peso o el tiempo de supervivencia (véase la figura 8D).
Por tanto, los datos in vivo en modelos de la enfermedad de Huntington son coherentes con una mejora parcial de los síntomas debido a la expresión de la proteína represora del dedo de cinc, que coincidió con un pico de represión del dedo de cinc a las 6 semanas aproximadamente. Sin embargo, la pérdida de expresión de la ZFP a lo largo del tiempo (que se cree que se debe a la toxicidad adversa y a los efectos inmunológicos que comienzan aproximadamente en la cuarta semana después del tratamiento), permitió que los síntomas de la EH volvieran a aparecer en los ratones tratados, e indicó que el control y el tratamiento de los síntomas en este modelo utilizando estas construcciones de dedos de cinc es transitorio: es decir, dependiente de la expresión del represor de ZFP en estos ensayos. Por tanto, los datos proporcionados en la presente memoria demuestran tanto la represión del gen htt mediada por los dedos de cinc in vivo, como la mejora parcial del fenotipo de la enfermedad.
Aunque el sistema CAG-WPRE ya está diseñado para ser una mejora de las construcciones de expresión anteriores (Garg et al. (2004) J. Immunol, 173: 550-558), es posible que se consigan más mejoras si se aumenta el nivel y la duración de la expresión del dedo de cinc.
Ejemplo de referencia 10
Variantes de secuencias de ZFxHunt para mejorar el empaquetamiento vírico
La hélice de dedo de cinc QRATLQR (SEQ ID NO: 69) fue diseñada de forma racional, como se describe en otras partes de la presente memoria y se demostró que se une específicamente al ADN de htt con alta afinidad, cuando se concatenan en largas cadenas de ZFP. Sin embargo, esto requiere la fabricación de construcciones de expresión de ADN y proteínas altamente repetitivas, que en algunos casos puede ser subóptima para el empaquetamiento vírico en aplicaciones de terapia génica con AAV2.
Por lo tanto, para idear una solución a este problema potencial, los presentes inventores decidieron hacer una serie de variantes de la ZFP que conservan la funcionalidad deseada de reconocimiento de ácido nucleico / unión al ADN de los ZFP descritos en la presente memoria. Por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de las hélices de reconocimiento del ácido nucleico se variaron teniendo en cuenta las reglas conocidas de reconocimiento del dedo de cinc-ácido nucleico (p. ej., como se revisa en Pabo et al. (2001), Annu. Rev. Biochem. 70: 313-340).
Los presentes inventores también descubrieron que era posible variar las secuencias del armazón de ZFP de forma conservadora sin afectar a la funcionalidad del dedo de cinc. Por lo tanto, en uno o más dominios de dedo de cinc, los restos del armazón que forman el pliegue beta-beta-alfa se variaron para evitar la repetición indeseable de secuencias.
Además, como ya se ha comentado anteriormente, en otras realizaciones, las secuencias enlazadoras de ZFP entre los dominios de dedo de cinc adyacentes también pueden variar de secuencia, si se desea.
En este ejemplo, con el fin de optimizar el empaquetamiento vírico, se produjeron varias variantes de 10 ZFxHunt, incluyendo la secuencia ilustrada a continuación (SEQ ID NO: 141), que tiene armazones de dedos de cinc y a-hélices alteradas en comparación con los péptidos ZFxHunt que tienen 6, 11, 12 y 18 dominios de dedo de cinc, como se ha descrito anteriormente, y se probó su unión a las secuencias diana de repetición de CAG adecuadas. Los armazones alterados se diseñaron teniendo en cuanta las diferentes secuencias de dedo de cinc de unión a ADN, incluyendo los dedos de Zif268 de tipo silvestre y sp1. Además, para reducir el tamaño de la construcción de AAV2 en aproximadamente 240 pb, también se eliminó el marcador FLAG-epítopo y un dominio ZFxHunt, dando como resultado un paquete vírico con un tamaño óptimo que codifica un péptido con 10 dedos de cinc.
El péptido resultante de 10 dedos de cinc (ZF10xHunt) se dirige a las secuencias CAG repetitivas y se une a ellas con gran afinidad y especificidad, al igual que los ZFP descritos anteriormente. Además, el ZFP ZF10xHunt ha demostrado que mantiene una fuerte actividad de supresión de HTTen ensayos episomales, como se muestra en la figura 9. Se utilizó un ensayo episomal, que implicó la transfección transitoria seguida de FACS para las células fluorescentes. Las construcciones indicadoras poli-CAG-GFP codifican 0 (pEH), 10 (Q10), 35 (Q35) y 104 (Q104) repeticiones de CAG, respectivamente. Como se muestra en la figura 9a, los dedos de cinc ZF10xHunt-Kox-1 reprimen el gen indicador de GFP fusionado. A modo de comparación, el control pTarget no contiene dedos de cinc. Sin embargo, como se muestra en la figura 9b, las fusiones de Kox-1-ZFP también reprimieron ligeramente un gen HcRed de control en el mismo plásmido, cuyo efecto se debe probablemente al reclutamiento de factores de represión de la cromatina.
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Tabla 8: Secuencias de aminoácidos de ZF10xHunt. En las secuencias de aminoácidos, las secuencias de reconocimiento están subrayadas y las secuencias de enlace se muestran en negrita. Los aminoácidos mutados en las secuencias de reconocimiento se muestran en minúsculas. La proteína represora completa incluye el enlazador y la secuencia Kox-1 en el extremo C del péptido de dedo de cinc.
Ejemplo 11
Diseños de dedos de cinc para reducir la inmunotoxicidad
Mientras que las mutaciones/modificaciones de los dedos de cinc descritas en el ejemplo 10 anterior pueden mejorar el empaquetamiento vírico, por ejemplo, en parte proporcionando una secuencia de ácido nucleico menos repetitiva para el empaquetamiento dentro de un virus; el péptido de dedo de cinc resultante, cuando se expresa, está necesariamente más diversificado que anteriormente.
Basándonos en investigaciones posteriores sobre la expresión heteróloga de los dedos de cinc in vivo, los presentes inventores han descubierto ahora que esta variabilidad en la secuencia del péptido puede ser desventajosa para su uso a largo plazo in vivo debido a la toxicidad e inmunogenia de los dedos de cinc (p. ej., inmunotoxicidad). En este sentido, los presentes inventores creen que el mayor número de secuencias peptídicas de no de tipo silvestre que resulta de la incorporación de la variabilidad de la secuencia aumenta el número de epítopos "exógenos" que pueden detectarse por el organismo animal tras la administración de las construcciones de expresión, como los vectores AAV.
Por lo tanto, se decidió rediseñar los péptidos de dedo de cinc y las construcciones represoras descritas en los ejemplos anteriores con el objetivo de reducir las reacciones inmunológicas a los péptidos heterólogos cuando se expresan en ratones y seres humanos.
En las primeras realizaciones, el péptido con 11 dedos de cinc ZF11xHunt-Kox-1 (véase también Garriga et al, 2012), en adelante denominado ZF-Kox-1, se rediseñó para crear una serie de péptidos de dedo de cinc "ratonizados" y "humanizados" para reducir la posible inmunogenia y toxicidad in vivo. De acuerdo con esta realización, las principales restricciones del nuevo diseño eran que las secuencias de péptidos de dedo de cinc modificados debían coincidir lo más posible con las secuencias de proteína del hospedador, manteniendo la actividad de unión del poli(CAG).
El objetivo de la "humanización" o "ratonización" era minimizar las diferencias de secuencia de aminoácidos entre las secuencias artificiales del péptido de dedo de cinc diseñadas para unirse al ADN de poli(CAG) y la secuencia natural del péptido de dedo de cinc Zif268, que se une naturalmente a GCG-TGG-GCG (Pavletich, 1991). Como se ha descrito anteriormente, ventajosamente, las proteínas precursoras del armazón de dedo de cinc de Zif268 son prácticamente idénticas en ratones y seres humanos (SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48, respectivamente) y por lo tanto un diseño de dedo de cinc optimizado para el hospedador podría tener el potencial de utilizarse para ambas especies. En la presente memoria, la notación mZF se utiliza para indicar péptidos de dedo de cinc ratonizados y la notación hZF se utiliza para indicar péptidos de dedo de cinc humanizados.
En este ejemplo, con el fin de reducir el potencial de los péptidos de dedo de cinc para crear epítopos "exógenos", se modificó el dominio represor Kox-1 del péptido hZF (véase la figura 10) mediante la eliminación de los marcadores epitópicos FLAG y la sustitución de otros dominios efectores, como la señal de localización nuclear y los represores KRAB (anteriormente del SV40), a análogos humanos. Además, las hélices de reconocimiento de los dedos de cinc y los enlazadores de los dedos de cinc se modificaron para que fueran lo más parecidos posible a la secuencia del factor de transcripción humano Zif268 (SEQ ID NO: 48; Pavletich, 1991). Como se ha descrito anteriormente, estas modificaciones se llevaron a cabo dentro de la restricción de conservar la actividad de unión a CAG; y los experimentos de ELISA con dedos de cinc se utilizaron para controlar y guiar este proceso (Isalan, 2001).
En primer lugar, se diseñó una secuencia peptídica optimizada para seres humanos o ratones que conservara la estructura ventajosa del péptido de 11 dedos de cinc descrito en los ejemplos 1 a 10 lo más estrechamente posible para mantener la máxima afinidad de unión al ADN.
En una realización, en lugar de la secuencia de reconocimiento de dedos de cinc QRATLQR (SEQ ID NO: 69), se utilizó la secuencia de reconocimiento QSADLTR (SEQ ID NO: 2) para los 11 dominios de dedo de cinc de la proteína. El péptido de dedo de cinc resultante (péptido de 11 dedos de cinc 2) tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y la proteína represora de dedo de cinc completa tiene la secuencia de SEQ ID NO: 49. La SEQ ID NO: 31 tiene 33 de 331 diferencias con el péptido inicial no humanizado, que se indican en negrita y subrayados en la tabla 9. Como se ha indicado, todas las diferencias resaltadas se eligieron para que la secuencia del péptido de dedo de cinc fuera más parecida a la de Zif268 humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 48) o de ratón (SEQ ID NO: 47), al tiempo que se mantenía la unión al ADN de poli(CAG).
En otra realización (péptido de 11 dedos de cinc 3; SEQ ID NO: 33), se realizaron más cambios de diseño para permitir una coincidencia aún más estrecha con el hospedador. En esta realización, las secuencias de reconocimiento de la hélice alfa se modificaron aún más junto con las secuencias enlazadoras para aproximarse más a la secuencia humana natural de Zif268, conservando la unión efectiva a la secuencia de ácido nucleico diana de poli(CAG) a través de las hélices alfa de reconocimiento. En esta realización, los dedos 1,2, 4, 6, 8 y 10 tenían la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 2, mientras que los dedos 3, 5, 7, 9 y 11 tenían la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NO: 5 (QSADRKR). Además, las secuencias enlazadoras entre los dedos 1 y 2, entre los dedos 3 y 4, entre los dedos 7 y 8 y entre los dedos 9 y 10 se modifican a la secuencia TGSQKP (SEQ ID NO: 16), que se ajusta mejor a la secuencia de tipo silvestre entre los dedos 1 y 2 de Zif268 natural. Por último, la secuencia de enlace larga entre los dedos 5 y 6 se redujo en longitud y se modificó a la secuencia LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQKP (SEQ ID NO: 24), para reducir la longitud de la secuencia no de tipo silvestre.
En una tercera realización (péptido de 11 dedos de cinc 1; SEQ ID NO: 29), se realizaron modificaciones en la secuencia de reconocimiento del dedo de cinc de manera que cada resto de alanina en la secuencia fue sustituido por glicina para dar lugar a las secuencias de reconocimiento QSGDLTR (SEQ ID NO: 3) y QSGDRKR (SEQ ID NO: 4). El péptido de dedo de cinc resultante tiene la secuencia de SEQ ID NO: 31. Las secuencias enlazadoras utilizadas en este péptido son las mismas que en la SEQ ID NO: 33 anterior.
Con el fin de demostrar que cierta variabilidad en la secuencia, dentro de los límites de la coincidencia óptima de la secuencia con el Zif268 de tipo silvestre era posible, se construyó otra secuencia de péptidos de dedo de cinc modificados (péptido de 11 dedos de cinc 4; SEQ ID NO: 35). Este péptido incorporaba la secuencia de reconocimiento QSADLTR (SEQ ID NO: 2) en el dedo 1, QSGDLTR (SEQ ID NO: 3) en los dedos 2, 4, 6, 8 y 10 y QSGDRKR (SEQ ID NO: 4) en los dedos 3, 5, 7, 9 y 11; mientras que las secuencias enlazadoras siguieron siendo las mismas que en las SEQ ID NO: 29 y 31.
Por lo tanto, los péptidos de dedo de cinc humanizados y ratonizados emplearon las mismas secuencias de aminoácidos. Sin embargo, las secuencias de la construcción de la proteína represora completa variaron entre las versiones de ratón y de humano, como se describió anteriormente. Por tanto, resumiendo, en la versión humana (hZF), se emplearon señales de localización nuclear humana y Kox-1 humana; mientras que en la versión de ratón se utilizó una secuencia de señal de localización nuclear derivada de ratón y un dominio represor KRAB de una proteína de ratón (ZF87) como dominio represor.
La figura 10 muestra los diseños de optimización de los dedos de cinc (ZF) para su uso en humanos y en ratones. Una comparación de la construcción original de 11 dedos (ZF-Kox-1) de los ejemplos 1 a 10, con diseños de represores de dedos de cinc hZF-Kox-1 (SEQ ID NO: 54) y mZF-ZF87 (SEQ ID NO: 50), que muestra las construcciones de 11 dedos de cinc alineadas con su secuencia de ADN de poli(CAG) diana (HTT mut). Los dominios proteicos que contienen secuencias peptídicas no del hospedador (que contienen posibles epítopos exógenos) están sombreados en gris, y con fines ilustrativos, las secuencias de hélices de reconocimiento de ADN representativas de los dedos 2 y 3 (F2, F3) se muestran debajo de las matrices de dedos de cinc, con las secuencias "exógenas'' en letra gris. Los porcentajes totales de restos no del hospedador dentro de las secuencias de construcción de proteína represora de longitud completa se proporcionan para mostrar que los diseños optimizados para el hospedador tienen una cantidad global de secuencias exógenas significativamente reducida.
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Tabla 9: Diseños de dedos de cinc para reducir la inmunotoxicidad.
Las diferencias con el péptido de partida no emparejado con el hospedador o con la secuencia humana nativa están en negrita y subrayadas, como se indica.
Ejemplo 12
El emparejamiento con el hospedador reduce la proliferación de la microglía
Las células microgliales tienen una importante participación en las respuestas inmunitarias innatas del cerebro, por lo que tratamos de comprobar si la administración de varias construcciones de dedos de cinc descritas en la presente memoria podría tener efectos indeseables en la regulación de la microglía.
Para comprobarlo, se administraron inyecciones unilaterales de construcciones de AAV recombinantes (rAAV2/1-ZF-Kox-1, rAAV2/1-mZF-ZF87 y rAAV2/1-GFP), o PBS en el estriado de ratones de tipo silvestre (TS). En estas investigaciones se utilizaron ratones TS para evitar cualquier efecto de confusión que pudiera producirse por el uso de los ratones previamente descritos que desarrollan el fenotipo de la EH.
Para comprobar la región de infección cubierta por el procedimiento de inyección, se midió el volumen cubierto por la fluorescencia de GFP en las muestras inyectadas con GFP. Esto reveló una media consistente de ~50 % de infección, tanto a las 4 como a las 6 semanas después de la inyección (datos no mostrados). De manera significativa, no se aprecia fluorescencia de la GFP fuera del estriado inyectado.
Dado que el número de copias del virus y la cantidad del vector utilizada fue la misma para GFP, ZF- Kox-1 y mZF-ZF87, se asumió que la eficiencia de la transducción sería similar en todos los grupos.
Para medir la regulación de la microglía, se utilizó inmunotinción con un marcador de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1). De forma similar, para medir la regulación astroglial, se utilizó la inmunotinción con un marcador para el marcador astroglial reactivo, GFAP (véase el ejemplo 13 a continuación). A continuación, los tejidos de la muestra se analizaron cuantificando la D.O. siguiendo un procedimiento similar al de (Ciesielska et al. (2013) Mol. Ther. 21: 158-166). Una prueba de la t de Student, comparó el valor de la D.O. de los hemisferios inyectados con la D.O. de fondo del hemisferio contralateral no inyectado (figura 11A). Esto reveló que ZF-Kox-1 y GFP provocaron un aumento significativo en la microglía, a las 4 y 6 semanas después de la inyección, respectivamente, como se demuestra en las figuras 12 A y 12F). Para ZF-Kox-1, los valores medios de D.O. a las 6 semanas eran similares a los de las 4 semanas posteriores a la inyección, pero la mayor variabilidad de las muestras impidió que el resultado alcanzara la significación estadística.
En la figura 12 se muestran micrografías representativas de cortes coronales estriatales teñidos con Iba1, en los hemisferios de control y los inyectados, para cada tratamiento a las 4 o 6 semanas. Las muestras de ZF- Kox-1 mostraron un aparente aumento de la inmunorreactividad de Iba1 en los hemisferios inyectados, a las 4 y 6 semanas después del tratamiento (A, B). Esto no se observó en los hemisferios contralaterales (A', B’). Por el contrario, los hemisferios tratados con mZF-ZF87 mostraron niveles similares de células Iba1 en comparación con sus hemisferios contralaterales no inyectados (C, C', D, D’).
Como puede observarse, algunas muestras tratadas con GFP mostraron un ligero aumento de la inmunorreactividad de Iba1 4 semanas después del tratamiento (E), mientras que la inmunorreactividad de Iba1 aumentó significativamente 6 semanas después de las inyecciones de GFP, en comparación con los hemisferios contralaterales (F, F').
Las muestras inyectadas con PBS muestran una inmunorreactividad de Iba1 similar entre los hemisferios en ambos puntos temporales (G, G', H, H’).
Como se puede ver en estos datos, las inyecciones de mZF-ZF87 y PBS no aumentaron significativamente la cantidad de tinción microglial (véanse las figuras 12C, 12D, 12G y 12H). Solo se pudieron detectar en el tejido células microgliales dispersas y agrandadas, principalmente alrededor del tracto de la aguja, tanto en los hemisferios inyectados con mZF-87 como con PBS.
Por tanto, la inyección de las proteínas exógenas, ZF-Kox-1 y GFP, indujo una fuerte proliferación de células microgliales en ratones TS, en diferentes momentos, que no estaba presente en el caso de la proteína represora de dedo de cinc mZF-ZF87 emparejada con el hospedador. Por consiguiente, se puede concluir que el tratamiento con ZF-Kox-1 es inflamatorio tanto a las 4 como a las 6 semanas después de la inyección (véanse las figuras 12 A y 12B), mientras que el tratamiento con una proteína equivalente ratonizada no lo es.
Ejemplo 13
El emparejamiento con el hospedador reduce la proliferación astroglial
Siguiendo con el ejemplo 12, anterior, a continuación, se comprobó si los distintos tratamientos provocaban un aumento de la astroglía reactiva mediante la inmunotinción de los cortes de cerebro de los ratones para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), y la medición de la D.O. resultante, como en el experimento anterior.
El valor de la D.O. de los hemisferios inyectados se comparó con la D.O. basal del hemisferio contralateral no inyectado mediante una prueba de la t de Student y los resultados se muestran en la figura 11B).
En la figura 13, que proporciona micrografías representativas de cortes coronales estriatales teñidos con GFAP, los resultados muestran claramente que GFAP se reguló positivamente de manera significativa en los hemisferios inyectados, en ambos momentos, en las muestras de ZF-Kox-1 (figuras 13A y 13B); mientras que, por el contrario, las muestras inyectadas con mZF-ZF87 mostraron un aumento menor y transitorio de GFAP, y esto se restringió principalmente a las áreas que rodean el tracto de la aguja. Además, esta leve activación solo fue notable alrededor de las 4 semanas posteriores a la inyección (figura 13C y 13D). Por el contrario, GFP provocó una reactividad retardada, alcanzando un aumento significativo (con respecto al hemisferio de control) a las 6 semanas después de la inyección (figura 13F). Como cabía esperar, la inyección de control de PBS no indujo un aumento significativo de la astroglía reactiva (figuras 13G y 13H). Se encontraron astrocitos aislados y no reactivos en todos los hemisferios contralaterales no inyectados (como se muestra en la figura 13).
En general, se puede ver en los datos que ZF-Kox-1 y GFP causaron una reacción persistente de las células astrogliales en los ratones TS, mientras que en el caso de mZF-ZF87 y PBS esta reacción fue más débil y ya estaba reducida en la semana 6 después de la inyección.
En general, por lo tanto, los patrones de tinción de GFAP a través de la regulación positiva de las células astrogiales reflejaron en gran medida la tinción de Iba1 en la regulación positiva de las células microgliales.
Ejemplo 14
Reducción de la toxicidad y de la muerte neuronal resultante
Para verificar si las respuestas inflamatorias observadas iban acompañadas de pérdida neuronal, se utilizó la detección inmunohistoquímica del marcador neuronal NeuN.
En primer lugar, se estimó la densidad neuronal en cada hemisferio de los distintos animales tratados (figura 14). Una prueba de la t de Student entre los hemisferios inyectados y los no inyectados reveló que el número de neuronas mostró una tendencia a la reducción por ZF-Kox-1 en la semana 4 después de la inyección (p=0,08). Esta reducción alcanzó significación a las 6 semanas después de la inyección (p=0,014).
Con referencia a la figura 15, que cuantifica la densidad neuronal tras los distintos tratamientos utilizados en el estudio, también se puede observar que la inyección de AAV que expresa ZF-Kox-1 provocó una extensa muerte neuronal en algunas muestras después de 6 semanas. Esto significó que no fue posible la detección efectiva de NeuN en el área que rodea el lugar de la inyección (véanse las figuras 15A y 15B). De hecho, no se pudo observar NeuN en algunos de los cortes, que solo mostraron una alta tinción de fondo.
En particular, El tratamiento con GFP en este estudio hizo que el número de células se redujera también en el hemisferio contralateral no inyectado.
En la figura 15, la densidad neuronal estriatal después de varios tratamientos también se visualizó mediante tinción, como se muestra en las micrografías representativas de secciones coronales del estriado con inmunotinción de NeuN del hemisferio de control e inyectado de cada tratamiento en cada punto temporal.
Como demuestran las micrografías de la figura 15, la toxicidad de ZF-Kox-1 se observó en zonas del estriado inyectado que carecen de neuronas marcadas, 4 y 6 semanas después del tratamiento (A, B), mientras que los hemisferios contralaterales (A', B') muestran densidades neuronales similares a los hemisferios inyectados con PBS (G, H) y no tratados (G', H’). Por el contrario, el tratamiento con mZF-ZF87 no afectó significativamente a la densidad neuronal (C, C', D, D') a las 4 o 6 semanas después de la inyección. Sorprendentemente, las inyecciones de GFP no afectaron a la densidad neuronal a las 4 semanas del tratamiento (E, E'), pero provocaron una fuerte respuesta tóxica retardada que redujo la densidad neuronal tanto en el hemisferio inyectado (F) como en el contralateral (F') a las 6 semanas después de la inyección.
En el caso de las muestras tratadas con mZF-ZF87, la densidad neuronal a las 4 o 6 semanas después del tratamiento (véanse las figuras 15C y 15D) no se vio afectada; aunque se observó una reducción limitada del número de neuronas cerca del tracto de la aguja en dos de los cuatro animales en la semana 6 después de la inyección, pero no alcanzó la significación (p=0,13). De hecho, en general, la mayoría de las muestras tratadas con mZF- ZF87 fueron similares a los hemisferios inyectados con PBS (véanse las figuras 15G y 15H).
Por último, de acuerdo con las observaciones anteriores en la inmunodetección de Iba1+ y GFAP, la densidad de neuronas no se vio afectada por GFP a las 4 semanas después del tratamiento (véanse la figura 14 y la figura 15E), y solo algunas zonas mostraban neuronas escasamente distribuidas cerca del tracto de la aguja. Sin embargo, GFP redujo significativamente la densidad neuronal en la semana 6 después de la inyección (p=0,018). De este modo, la citotoxicidad de la GFP se observó tras un retraso y fue el efecto tóxico más fuerte observado en este estudio. Ejemplo 15
Represión a largo plazo de la diana de HTT mut poliCAG in vivo
Como se indica en los ejemplos 1 a 10, se había demostrado previamente que la proteína represora ZF-Kox-1 era capaz de reprimir funcionalmente su gen diana de HTT mutante, in vivo, en ratones del modelo de EH R6/2 hasta 3 semanas después de la inyección bilateral. Durante el tiempo que duró esta represión, los síntomas patológicos de agarre en ratones fueron prácticamente suprimidos (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci.; 109, E3136-3145).
Tras este estudio, los presentes inventores investigaron además si la represión del gen mutante HTT diana podía mantenerse durante un período más largo, p. ej., hasta 6 semanas, cuando los ratones fueron tratados con la construcción de dedo de cinc ZF-Kox-1 o con la construcción represora de dedo de cinc mZF-ZF87 ratonizada. Para este fin, se inyectó rAAV2/1-ZF-Kox-1 en ratones R6/2. Las inyecciones de prueba se realizaron solo en un hemisferio, de modo que el hemisferio contralateral se dejó sin tratar con el fin de tener una comparación de referencia. Se tomaron muestras de cerebro de animales sacrificados a las 2, 4 y 6 semanas después de la inyección, y se analizaron los niveles de ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci., 109, E3136-3145).
La figura 16 muestra el análisis de la expresión del gen muíante HTT tras el tratamiento con construcciones de dedos de cinc. En (A) un análisis de regresión lineal muestra correlaciones negativas de los niveles de ARN de HTT mut y la expresión de ZF-Kox-1 a las 2, 4 y 6 semanas después del tratamiento, lo que sugiere una represión eficaz de HTT mut en virtud del tratamiento. Los rombos negros muestran los valores medios de expresión de HTT mut (± 1 E.E.M.) de los hemisferios de control de cada grupo.
Realizando una regresión lineal de los niveles de ARN de HTT mut frente a ZF-Kox-1, para cada punto de tiempo (figura 7A), es posible verificar si ZF-Kox-1 es capaz de reprimir su gen diana (HTT mut) de forma dependiente de la dosis. En este sentido, los datos muestran una correlación significativa y negativa entre estos niveles de ARN 2 semanas después del tratamiento (p=0,04). También hubo tendencias cercanas a la significación a las 4 y 6 semanas (p=0,05, p=0,09). Estos resultados indican que, aunque hay variabilidad en los ratones individuales inyectados, generalmente, una mayor expresión de ZF-Kox-1 da lugar a niveles más bajos de HTT mut, lo que coincide con resultados anteriores (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci.; 109, E3136-3145).
La figura 16B muestra el porcentaje de HTT mut con respecto al valor medio en los hemisferios de control, durante el mismo periodo. Los datos muestran una media de aproximadamente un 25 % de reducción de HTT mut, 2 semanas después del tratamiento (previamente informado en (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci.; 109, E3136-3145)), con un ratón individual que muestra una reducción de hasta un 40 % aproximadamente. Aunque los datos muestran que el porcentaje medio aumenta con el tiempo, los valores posteriores deben interpretarse con cierta cautela debido a la fuga de la expresión de ZF-Kox-1 al hemisferio contralateral y a la importante pérdida neuronal que pudo observarse.
Al comparar los niveles de HTT mut en el hemisferio inyectado con ZF-Kox-1 con el valor de referencia en el hemisferio no inyectado (figura 16B), los presentes inventores observaron que ZF-Kox-1 produjo una reducción media de HTT mut de aproximadamente el 35 % después de 2 semanas, que está en el intervalo terapéutico (Garriga-Canut et al.
(2012), Proc. Natl. Acad. Sci.; 109, E3136-3145). La represión se mantuvo en aproximadamente un 20 % a las 4 y 6 semanas después de la inyección. Sin embargo, la expresión de ZF-Kox-1 iba acompañada de una importante pérdida de células (como se ha demostrado anteriormente, véanse las figuras 14 y 15).
A continuación, los presentes inventores investigaron si mZF-ZF87 emparejado con el hospedador era un candidato más adecuado para la represión a largo plazo de HTT mutante. El fenotipo R6/2 de inicio temprano (como el utilizado en el ejemplo anterior) es útil para los ensayos de fenotipado pero, como resultado de la revisión por el Comité de ética (véase la sección de Materiales y métodos), los presentes inventores refinaron el procedimiento para recoger los datos de expresión y represión de los dedos de cinc a las 6 semanas, y cambiaron al modelo de ratón de EH de inicio tardío, R6/1. Desde el punto de vista ético, el uso de R6/1 es preferible a R6/2 porque los datos se pueden recoger antes de que se detecten los síntomas de la EH, maximizando el bienestar de los animales. De hecho, tanto R6/1 como R6/2 son portadores del mismo transgén, aunque las repeticiones de CAG son más largas en R6/2 (aproximadamente 250 repeticiones frente a aproximadamente 150 repeticiones en R6/1). No se pensó que esta diferencia en el número de repeticiones fuera importante para cuantificar la represión, ya que los presentes inventores han observado una represión comparable con dedos de cinc en células StHdh con 111 repeticiones (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci.; 109, E3136-3145).
Aunque R6/1 es, por tanto, un modelo válido para probar la represión del dedo de cinc, los datos no deben compararse formalmente con los resultados con ratones R6/2 descritos en este ejemplo, debido a las diferencias fenotípicas.
se inyectó el vector rAAV2/1-mZF-ZF87 en ratones R6/1 y se sacrificó a los ratones a las 2, 4 y 6 semanas después de la inyección para obtener muestras para el análisis del nivel de ARN mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
La figura 16C muestra un análisis de regresión lineal que demuestra una correlación negativa entre los niveles de ARN de HTT mut y la expresión de mZF-ZF87 a las 2, 4 y 6 semanas después del tratamiento. Nuevamente, los niveles de expresión de mZF-ZF87 están en unidades arbitrarias (u.a), normalizados a la señal máxima de qRT-PCR de mZF-ZF87 en todas las muestras. Los datos muestran que los niveles de ARN de mZF-ZF87 se correlacionaron negativamente con HTT mut a las 2 y 4 semanas después de la inyección (p<0,05). Esto indica que la represión de la diana mZF-ZF87 está funcionando. La correlación lineal se perdió en la semana 6 después de la inyección, aunque la mayoría de los ratones seguían teniendo niveles reducidos de HTT mut en el hemisferio inyectado, con respecto a los niveles de control. De manera interesante, los estudios en ratones han demostrado que la represión transitoria de HTT mut con oligonucleótidos modificados puede persistir durante 8 semanas después del tratamiento (Kordasiewicz et al.
(2012), Neuron, 74: 1031-1044). Por lo tanto, es probable que se esté observando una represión persistente de HTT mut a las 6 semanas, que ya no se correlaciona con la expresión de mZF-ZF87, debido a una tendencia a la reducción de la expresión del dedo de cinc con el tiempo. Además, en este sentido, hay que tener en cuenta que los dominios KRAB depositan heterocromatina en los locus genéticos y, por tanto, causan una fuerte represión a largo plazo que puede durar más que su expresión (Groner et al. (2010), PLoS Genet., 6.).
El gráfico de barras de la figura 16D muestra el porcentaje de HTT mut con respecto al valor medio en los hemisferios de control durante el mismo periodo. Al comparar los niveles de HTT mut en el hemisferio inyectado con mZF-ZF87 con el valor de referencia en el hemisferio no inyectado, los presentes inventores observaron que la represión fue de media de aproximadamente un 30 % a las 2 semanas (p=0,04) y se estabilizó en aproximadamente un 20 % a las 4 y 6 semanas (p=0,04), p=0,05, respectivamente). Aunque estos niveles de represión son muy similares a los observados para ZF-Kox-1 (y por lo tanto es probable que estén en el rango terapéutico establecido (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci., 109, E3136-3145)), la aparente y significativa reducción de la toxicidad respecto a ZF-Kox-1 hace preferible esta construcción ratonizada.
Ejemplo 16
Represión específica de HTT mut mediante mZF-ZF87
Dado que el genoma de ratón contiene siete posibles genes de expansión de poliQ (Garriga-Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci.; 109, E3136-3145), era importante entender si la represión transcripcional de HTT mut era específica o si las proteínas represoras de prueba también podrían afectar a uno o más de las otras posibles dianas de poliCAG.
Por tanto, se probaron los efectos de ZF-Kox-1 y mZF-ZF87 en la expresión de cuatro de estos genes (HTT ts de tipo silvestre, ATN1, ATXN2, TBP; tabla 10).
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1 S e m a n a s d e s p u é s d e la in y e c c ió n
2 LR = R e g re s ió n lin e a l
Tabla 10: Expresión de genes endógenos de ratón que contienen CAG tras el tratamiento con ZF-Kox1 y mZF-ZF87. El primer número (entre paréntesis después del nombre del gen) representa el número de repeticiones de CAG, y el segundo, el número de glutaminas en el tramo codificante (CAG CAA). Los valores se dan como el porcentaje de expresión del gen de interés, con respecto a los valores medios de los hemisferios de control. El resultado de ZF-Kox-1 a las 6 semanas después de la inyección debe leerse con precaución, ya que en este punto de tiempo había una pérdida neuronal significativa y una fuga del vector hacia el hemisferio contralateral. En negrita: §P<0,1; *P<0,05. ATN1: atrofia 1; ATXN2: ataxina 2; HTT: huntingtina (ratón); TBP: proteína de unión a TATA.
Los resultados de este estudio muestran que los niveles de ARN de los cuatro genes analizados no se correlacionaron negativamente con la expresión de ninguna de las construcciones de dedos de cinc; excepto, sorprendentemente, en el caso de HTTts con ZF-Kox-1, en todos los puntos temporales. Concretamente, ZF-Kox-1 reprimió significativamente aproximadamente el 10 % de la HTT de los ratones a las 2 y 4 semanas de tratamiento, de forma dependiente de la dosis.
Por el contrario, la expresión de ninguno de los genes se correlacionó negativamente con mZF-ZF87 en ningún momento. En general, los resultados demuestran de este modo que no solo mZF-ZF87 es menos tóxico que ZFKox-1 (o GFP), también parece ser más específico para reprimir la HTT mut in vivo.
Por lo tanto, son posibles varias variantes de diseño, como se ha comentado anteriormente, para conservar la unión de poli(CAG), al tiempo que se maximizan las propiedades de adaptación del hospedador y se minimiza la toxicidad in vivo.
Ejemplo 17
A. Diseño alternativo de promotores para la expresión (terapéutica) de transgenes a largo plazo: expresión específica de neuronas
Los presentes inventores han descrito con anterioridad (PNAS 109: E3136-E3145, 2012; documento WO 2012/049332) el uso del promotor vírico fuerte, pCAG (beta-actina de pollo potenciada por CMV) para expresar factores de transcripción de dedos de cinc y así reprimir la transcripción del gen mutante de la huntingtina ( HTT ) durante varias semanas. Sin embargo, se ha comprobado que el promotor pCAG puede perder (aparentemente) su actividad a las 6 semanas del inicio de la expresión; como se demuestra en la figura 17, (véanse los paneles a, b, c y d) para la expresión del gen HTT diana (panel a) y la expresión del transgén (paneles b, c y d) con pCAG a las 3 semanas en comparación con los niveles de expresión a las 6, 12 y 24 semanas. Esta reducción de la expresión del transgén/efecto transcripcional se debe probablemente a la metilación celular del ADN del CMV, como se ha informado en la bibliografía (p. ej., véase Gene Then, 2001,8: 1323-1332). Por lo tanto, los presentes inventores se propusieron lograr una terapia de tratamiento único a más largo plazo e investigaron promotores alternativos para tal fin.
Se consideró que las regiones promotoras de la NSE tenían una aplicación potencial en este sentido, pero no se ha caracterizado previamente ni en ratones ni en seres humanos. Dado que la mayoría de los modelos de EH se basan en ratones, los presentes inventores identificaron y sintetizaron químicamente una versión de rata del promotor pNSE para su uso en ratón y lo vectorizaron para expresar mZF- KRAB-WPRE a partir del vector vírico rAAV2/1.
En estudios in vivo, se descubrió que el promotor pNSE de rata era capaz de lograr la expresión del transgén en ratones durante un periodo de tiempo más largo que los correspondientes vectores víricos basados en pCAG: véase la figura 17, paneles b, c y d, para comparar los niveles de expresión de pCAG y pNSE durante el periodo entre 3 y 24 semanas tras la infección. Específicamente, se comprobó que, mientras que la actividad del promotor de pCAG se perdía a las 6 semanas, el promotor de pNSE mostró una expresión relativamente estable hasta aproximadamente 12 semanas (74-78 % del nivel máximo de expresión), y el péptido de dedo de cinc seguía siendo detectable después de 24 semanas (aunque a un nivel reducido del 4-5 % de los niveles máximos de pNSE y del 10-12 % de los niveles máximos de pCAG en TS y R6/1). La secuencia de pNSE sintética utilizada en estos experimentos se proporciona como SEQ ID NO: 152, cuya secuencia sin sitios de clonación de restricción es la SEQ ID NO: 153.
Cabe señalar que la detección del péptido de dedo de cinc se basa en una escala relativa y que incluso aproximadamente el 5-10 % de la expresión máxima puede seguir indicando una concentración absoluta de péptido de dedo de cinc que podría ser funcionalmente activa y (terapéuticamente) eficaz; esto solo puede determinarse examinando la represión de HTT mutante diana (véase la figura 17, panel a).
Al observar la represión de la HTT mutante, la represión impulsada por pCAG solo se detectó a las 3 semanas de la infección y aparentemente se perdió en el punto de tiempo del ensayo de 6 semanas, como se muestra en la figura 17, panel a para pCAG. Este hallazgo es coherente con la pérdida completa de la expresión detectable del transgén de dedo de cinc a partir de este promotor en todos los puntos de tiempo ensayados después de 3 semanas. Por el contrario, la represión del gen HTT impulsada por pNSE se mantuvo durante todo el periodo de 24 semanas, aunque con una tendencia a la reducción en el tiempo (de nuevo, véase la figura 17, panel a; pNSE). De manera significativa, a las 3, 6, 12 y 24 semanas, respectivamente, la expresión del péptido represor de dedos de cinc fue suficiente para dar lugar a un 77 %, 61 %, 48 % y 23 % de represión de HTT mutante en muestras de cerebro completo de ratones.
En particular, pNSE-ZF seguía reprimiendo los niveles de expresión de HTT mutante en casi una cuarta parte después de 24 semanas, que se acerca a los niveles de represión encontrados previamente en el intervalo terapéutico (véase PNAS 109: E3136-E3145, 2012).
Como cabía esperar, el alelo Htt corto de tipo silvestre no se vio afectado en todas las muestras, lo que indica una falta de actividad fuera de la diana (véase la figura 17, paneles e y f); demostrando la selectividad de los péptidos / moduladores de dedos de cinc de la invención.
En general, los resultados muestran que la combinación del péptido de dedo de cinc mZF-KRAB adaptado al hospedador de ratón (mZF11-ZF87) con el promotor pNSE de rata permite la represión de HTT mut en todo el cerebro, por un periodo prolongado de 6 meses. Se trata de una mejora considerable con respecto a la represión de 3 semanas demostrada anteriormente (PNAS 109: E3136-E3145, 2012).
La actividad del promotor de pNSE es relativamente específica para las neuronas (Gene Ther. (2001), 8: 1323-1332). Por tanto, cuando se utiliza en combinación con vectores víricos rAAV2/1 que muestran un fuerte tropismo hacia las neuronas, se espera que el direccionamiento de pNSE sea más específico para las neuronas y que proporcione beneficios terapéuticos a largo plazo para el tratamiento de los trastornos neurológicos, tales como Hd , en animales (p. ej., seres humanos).
B. Diseño alternativo de promotores para la expresión terapéutica de transgenes a largo plazo: expresión ubicua
El promotor pNSE descrito anteriormente (véanse también las SEQ ID NO: 148, 151, 152 y 153), especialmente cuando se combinan con vectores rAAV2/1, puede permitir el direccionamiento terapéutico de una gran proporción del cerebro durante un período de tiempo prolongado.
Sin embargo, hay muchos otros tipos de células en el cerebro que se cree que desempeñan un papel en la EH, tales como las células de la glía. Adicionalmente, puede ser ventajoso tener la capacidad de dirigirse a otros órganos o tejidos de un sujeto, tal como el corazón. Por lo tanto, los inventores trataron de identificar nuevas secuencias promotoras que pudieran dirigirse a otros tipos de células, tal como en el cerebro o en otros posibles órganos o tejidos diana. Concretamente, era deseable poder dirigirse a estos tipos de células alternativas de forma ubicua.
Por consiguiente, los inventores buscaron nuevos promotores/potenciadores endógenos que pudieran permitir el direccionamiento de diversos tipos celulares más allá de las neuronas. Por ejemplo, un reciente estudio de secuenciación de ARN exploró la expresión génica en el estriado y el córtex, en ratones TS y R6/2 y encontraron muchos genes consistentemente regulados positivamente en los cuatro tipos de muestras (Vashishtha et al.
10.1073/pnas.1311323110). Los promotores/regiones potenciadoras de algunos de estos genes podrían ser potencialmente buenos candidatos para impulsar la expresión de genes terapéuticos. Desgraciadamente, las regiones funcionales promotoras / potenciadoras de estos genes aún no se han caracterizado.
Por lo tanto, de acuerdo con este ejemplo, los inventores seleccionaron y examinaron los posibles promotores/potenciadores mediante simulación informática y, a continuación, diseñaron las nuevas secuencias de promotores/potenciadores mediante síntesis genética de novo para su ensayo in vitro e in vivo. Dado que se desconocía la ubicación de cualquier fragmento de ADN potencialmente funcional y la longitud de cualquier secuencia potencialmente eficaz, se estudiaron varias secuencias de construcción y longitudes de secuencia diferentes para identificar las secuencias promotoras-potenciadoras eficaces y/u óptimas.
Las secuencias seleccionadas se vectorizaron y se probaron, y se realizaron ediciones para determinar las longitudes adecuadas de las secuencias de ADN que debían incluirse en las posibles secuencias promotoras antes y después del sitio de inicio de la transcripción de los genes de tipo silvestre, con el fin de capturar la funcionalidad adecuada.
De este modo, los inventores identificaron sorprendentemente una nueva secuencia promotora-potenciadora que era capaz de alcanzar niveles de expresión de transgenes de dedos de cinc potencialmente terapéuticos de forma sostenida, es decir, durante períodos de más de 24 semanas, y potencialmente más largos (véase la figura 17, como se describe más adelante).
Se realizó un análisis preliminar in silico de los candidatos a promotores alternativos y se identificaron 8 que se encontraban entre los 20 genes más expresados en todas las afecciones de acuerdo con Vashishtha et al.
(10.1073/pnas.1311323110: afecciones: corteza y estriado, ratones de 8 y 12 semanas, R6/2 y TS; tabla S3). Por orden de nivel de expresión, estos genes altamente expresados fueron: Tmsb4x (NCBI Gene ID: 19241), Snap25 (20614), Fth1 (14319), Cst3 (13010), Cpe (12876), Hsp90ab1 (15516), Calm1 (12313) y Rtn1 (104001).
De estos 8 promotores se seleccionó el promotor del gen ubicuo Hsp90ab1 para realizar más pruebas porque se ha informado que su producto génico endógeno se expresa fuertemente en diversos tipos de células en varios organismos diferentes. El promotor de este gen está asociado de forma natural a la proteína de choque térmico HSP90. En particular, la isoforma Hsp90beta parece expresarse de forma constitutiva, mientras que la isoforma Hsp90alfa se expresa bajo estrés celular.
El promotor/potenciador de Hsp90 no ha sido caracterizado previamente, por lo que no fue posible identificar una construcción híbrida de promotor/potenciador, basada en la bibliografía, para su uso en la impulsión de la expresión del gen del péptido de dedo de cinc en el modelo de ratón con EH descrito en este documento. En este sentido, mientras que el promotor mínimo de Hsp90beta dependiente de estrés no homólogo había sido estudiado previamente (Gene, (1996), 172, 279-284), al igual que una secuencia de 2,0 kb en el gusano de seda Bombyx mori (doi: 10.1534/g3.114.011643), estas secuencias promotoras/potenciadoras de la técnica anterior no muestran ninguna homología evidente con la región promotora de Hsp90 de ratón por alineación de secuencias.
Por lo tanto, los presentes inventores se propusieron probar las posibles regiones del promotor de ratón (SEQ ID NO: 143) para comprobar su actividad en los modelos de expresión de ratón descritos en la presente memoria. El promotor de ratón de s Eq ID NO: 143 es ligeramente homólogo al promotor humano de SEQ ID NO:144.
En primer lugar, se identificaron sitios de unión de posibles factores de transcripción y cajas de TATA utilizando una región del genoma de 20 kpb (SEQ ID NO: 145) para buscar potenciadores distales, utilizando el algoritmo TSSW (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssw&group=programs&subgroup=promoter).
Se identificaron siete regiones promotoras/potenciadoras potenciales dentro de la región de la secuencia de 20 kpb, como se indica a continuación, con los sitios de unión identificados en cada uno de ellos descritos como "Posición(cadena)Especie$Factor de transcripción - Secuencia". Sitios de unión de factores de transcripción para humanos (HS), ratón y rata; las regiones potenciadoras y las cajas de TATA identificadas a continuación están en gris en las secciones pertinentes (SEQ ID NO: 154 a 160) de la secuencia de SEQ ID NO: 145 reproducida a continuación.
1. Promotor Pos: 820 LDF - 1,19 Caja de TATA en 786 19,41 (SEQ ID NO: 154)
Ggaggggagagtgcaggctcatggcaggcctcaggagacctgtgttccttacagggtctgtttgct
ctctcactctttctccctttttcccctctgctctgtctcctcccctttgcctgctctgtcactgtt
gtcactgtccctgaccccttttctcttttctgtcttctttgactgtctttccctgcctctcaatca
tccgtcctcctcctcctcctcgattgctccccacccttcggtttccaagcttataaactgcttctg
ctgctggataaaaatagcggtggcagcggccaggctggca
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 523 (-) HS$NPY_04 -CCCCTCC(ggagggg); 531 (-) RATÓN$MT1 -TGCAC (gtgca); 534 (-) HS$EGFR_19 - GCCTGC (gcaggc); 538 (+) HS$ALBU_03 - TGGCA; 545 (-) HS$EGFR_19 - GCCTGC (gcaggc); 558 (-) HS$APOB_04 - CAGGTC (gacctg); 561 (+) HS$CDC2_02 - TTCCTT; 566 (-) HS$CDC2_01 - AAGGAA (ttcctt); 612 (-) RATA$POMC_0 - CAGAG (ctctg); 615 (+) HS$GG_12 - CTGTC; 617 (-) RATA$POMC_0 - CAGAG (ctctg); 631 (+) HS$EGFR_19 - GCCTGC; 638 (+) HS$GG_12 - CTGTC; 640 (-) RATA$POMC_0 - CAGAG (ctctg); 640 (+) HS$CLASE_0 - GTCAC; 649 (+) HS$CLASE_0 - GTCAC; 650 (-) RATÓN$RAS1 - ACAACA (tgttgt); 653 (+) HS$GG_12 - CTGTC; 654 (+) RATA$A2UG_1 - TGTCCC; 659 (-) RATA$A2UG_1 - GGGACA (tgtccc); 663 (-) RATA$EAI_09 - GTCAG (ctgac); 678 (+) HS$GG_12 - CTGTC; 681 (+) RATÓN$RAS1 - TCTTCT; 691 (+) HS$GG_12 - CTGTC; 703 (+) RATÓN$AACRGCCTCTC; 708 (+) HS$EGFR_15 - TCAAT; 745 (+) HS$BG_18 - CCACC; 746 (+) HS$GG_13 -CACCC; 747 (-) RATÓN$M1H2 - TGGGGA (tcccca); 749 (-) HS$BG_17 - GGTGGGG (ccccacc); 749 (-) HS$BG_22 -GGTGG (ccacc); 756 (+) HS$IGKL_01 - TTTCCA; 786 (+) TATA - GATAAAAA; 796 (-) HS$GMCSF_0 - TATTT (aaata); 799 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 801 (+) HS$ALBU_03 - TGGCA; 803 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg); 816 (+) HS$ALBU_03 - TGGCA.
2. Promotor Pos: 9004 LDF - 12,67 (SEQ ID NO: 155)
tgccagacttcctggagaacaacgggcctatgtgtcctcatgttggcgttggacctccccgttctt
cagccatactgtggtctgaggaagggtgtgttggtatgggatgtgagactccctcggtggaggggg
cgctgatgctccagctcaggactgactggaactgagaggaacactctggtcctaagtgccccttgt
ccccagccctgggagacagaagcttttgccccgccccatctcccaagccccctcccccaaggctgc
atgttctctcatcctctaccagctgatggctacaggggtgg
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 8704 (-) HS$ALBU_03 - TGGCA (tgcca); 8732 (+) RATA$AFEP_0 - TGTCCT; 8735 (-) RATA$A2UG_1 - GACACA (tgtgtc); 8754 (-) HS$HH4_02 - GGTCC (ggacc); 8763 (+) RATA$INS2_0 - CTTCAGCC; 8793 (-) HS$GG_13 - CACCC (gggtg); 8795 (-) RATÓN$GATA - CACACCC (gggtgtg); 8801 (+) RATÓN$AAMY - ATGGGA; 8821 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 8825 (-) HS$BG_18 - CCACC; 8830 (-) HS$NPY_04 - CCCCTCC (ggagggg); 8857 (-) RATA$EAI_09 - GTCAG (ctgac); 8879 (+) HS$HH4_02 - GGTCC; 8879 (-) RATA$POMC_0 - CAGAG (ctctg); 8892 (-) RATA$NF1_01 - GGGCA (tgccc); 8902 (-) RATÓN$M1H2-TGGGGA (tcccca); 8913 (-) HS$A11 COL - TCTCCCA (tgggaga); 8913 (-) HS$LCK_01 -TCTCCCAGG (cctgggata); 8916 (-) HS$GG_12 - CTGTC (gacag); 8925 (+) HS$A11 COL - GCCCCGCCCC; 8927 (+) RATÓN$JUND - CCCGCCCC; 8928 (-) RATA$NF1_01 - GGGCA (tgccc); 8788 (-) RATÓN$FCGR - TTCCTC (gaggaa); 8872 (-) RATÓN$FCGR - TTCCTC (gaggaa); 8933 (-) HS$APOE_08 - GGGCGG (ccgccc); 8934 (-) RATÓN$DHFR - GGGGCGGGGC (gccccgcccc); 8934 (-) HS$MT2A_10 - GGGGCGGGG (ccccgcccc); 8936 (+) HS$A11COL - TCTCCCA; 8944 (+) HS$AAC_13 - GCCCCCTCCCC; 8946 (+) HS$NPY_04 - CCCCTCC; 8953 (-) RATÓN$CMYC -GGGAGGG (ccctccc); 8955 (-) HS$AAC_10 - GGGGGAGGGG (ccctccccc); 8895 (+) RATA$A2UG_1 - TGTCCC; 8900 (-) RATA$A2UG_1 - GGGACA; 9000 (+) HS$BG_22-GGTGG; 9003 (-) HS$GG_13-CACCC (gggtg); 9004 (-) RATÓN$THY1 - CCACCCCTG (caggggtgg); 9004 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg)
3. Promotor Pos: 9707 LDF - 3,70 (SEQ ID NO: 156)
Figure imgf000061_0001
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 9413 (+) RATÓN$TDT - CCACCTG; 9413 (+) HS$BG_18 - CCACC; 9417 (-) HS$BG_22 - GGTGG (ccacc); 9425 (-) RATA$POMC_0 -CAGAG (ctctg); 9443 (+) RATÓN$WAP - TTTAAA; 9446 (-) HS$GRH_03 - TAAAT (attta); 9448 (-) RATÓN$WAP -TTTAAA (tttaaa); 9478 (+) HS$EGFR_15 - TCAAT; 9481 (-) HS$CDC2_10 - TTGAA (ttcaa); 9482 (-) HS$CMYB_01 -ATTGAA (ttcaat); 9489 (+) RATÓN$RAS1 - TCTTCT9492 (+) RATÓN$RAS1 - TCTTCT; 9495 (+) RATÓN$RAS1 -TCTTCT; 9510 (+) RATÓN$WAP - TTTAAA; 9512 (+) RATA$PL_15 - TAAAAT; 9513 (-) RATÓN$ADA - TAAAAAA (tttttta); 9515 (-) RATÓN$WAP - TTTAAA (tttaaa); 9522 (-) HS$GMCSF_0 - CATTA (taatg); 9526 (+) RATÓN$A21C -ATTGG; 9526 (-) RATÓN$MT1 - TGCAC (gtgca); 9530 (-) HS$BAC_03 - CCAAT (attgg); 9545 (+) RATA$GLU_04 -TATAT; 9548 (-) RATA$GLU_04 - TATAT (atata); 9556 (+) RATA$EAI_09 - GTCAG; 9558 (+) RATA$POMC_0 -CAGAG; 9558 (-) RATA$A2UG_1 - GACACA (tgtgtc); 9563 (+) HS$IGKL_11 - CATCTG; 9570 (-) RATA$EAI_09 -GTCAG (ctgac); 9576 (-) RATA$POMC_0 - CAGAG (ctctg); 9593 (+) HS$NEU_01 - CAGTTG; 9595 (-) HS$GG_12 -CTGTC (gacag); 9608 (-) HS$ALBU_03 - TGGCA (tgcca); 9623 (+) HS$CMYB_01 - ATTGAA; 9624 (+) HS$CDC2_10TTGAA; 9627 (-) HS$EGFR_15-TCAAT (attga); 9640 (-) RATÓN$UPA - AGGAAA (tttcct); 9649 (+) HS$BG_02 -AGCCAAT; 9649 (+) RATÓN$NCAM - AGCCAA; 9650 (+) HS$CJUN_02 - GCCAATG; 9650 (+) RATÓN$JUND -GCCAAT; 9651 (+) HS$BAC_03 - CCAAT; 9655 (-) RATÓN$A21C - ATTGG (ccaat); 9682 (-) RATÓN$CMYC -GGGAGGG (ccctccc); 9692 (+) HS$NEU_01 - CAGTTG; 9693 (-) RATÓN$M1H2 - TGGGGA (tcccca); 9705 (+) HS$EGFR_15 - TCAAT; 9707 (-) HS$GP2B_02 - TGATAA (ttatca)
4. Promotor Pos: 14700 LDF - 1,71 Caja de TATA en 1467321,01 (SEQ ID NO: 157)
Figure imgf000062_0001
ctaagtgcatagaacctccagcccacttgggcccttaacaacccaaggatgaacctgggtggccta
aggaaacagacaggcttaggacccatggagtcagggtagtacacagctctgctctcagaagattaa
aaaagaaaaaaaaaaaaaagccaggtgactcccagtgacctagaaaggaagcccttcaggaaggga
ggagtgtgggcacagaaagcagccctgcaggctggggctgggttataaaaggctgcgggtgccatg
ctgagctctatcctgaagagtgggaaaggcccctagagacagccttaaaaccccctagg
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 14400 (-) HS$BG_22 -GGTGG (ccacc); 14403 (+) RATÓN$ACRD - TGCCTGG; 14413 (-) HS$GG_36 - GGGGCC (ggcccc); 14441 (-) RATÓN$MT1 - TGCAC (gtgca); 14490 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 14493 (-) HS$GG_13 - CACCC (gggtg); 14494 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg); 14498 (+) HS$CDC2_01 - AAGGAA; 14499 (+) RATÓN$UPA - AGGAAA; 14502 (+) HS$APOA2_1 - AAACAGAC; 14503 (-) HS$CDC2_02 - TTCCTT (aaggaa); 14511 (-) HS$GG_12 - CTGTC (gacag); 14521 (-) HS$HH4_02 - GGTCC (ggacc); 14523 (-) HS$GG_40 - TGGGTC (gaccca); 14528 (+) RATA$EAI_09 -GTCAG; 14537 (-) RATA$EAI_07 - CTACCC (gggtag); 14549 (-) RATA$POMC_0 - CAGAG (ctctg); 14560 (-) RATÓN$RAS1 - TCTTCT (agaaga); 14562 (+) RATÓN$ADA - TAAAAAA; 14593 (-) HS$APOA2_0 - GTCACCTG (caggtgac); 14593 (-) HS$CLASE_0 - GTCAC (gtgac); 14603 (-) HS$CLASE_0 - GTCAC (gtgac); 14609 (+) HS$CDC2_01 - AAGGAA; 14614 (-) HS$CDC2_02 - TTCCTT (aaggaa); 14638 (+) RATA$NF1_01 - GGGCA; 14644 (-) RATA$A2UG_0 - TGTGCC (ggcaca); 14662 (-) HS$EGFR_19 - GCCTGC (gcaggc); 14673 (+) TATA - TATAAAAG; 14691 (-) HS$GG_13 - CACCC (gggtg); 14694 (-) HS$ALBU_03 - TGGCA (tgcca); 14694 (-) RATA$OMP_07 -TGGCAC (gtgcca).
5. Promotor Pos: 17266 LDF - 0,75 Caja de TATA en 1723820,29 (SEQ ID NO: 158)
Ggatgagaagttcaaggtcaaaccaggcactggaggcacatgcctttaatcccagcatttgggaga
ctaaggcaggctgatttctgagttcaaggccagcctggtctataaagttccaggacacagagaaac
cctgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaagaaataccataaaaactaatat
tcattattaaacgttcgtgtgtgcgtatttcctggaggagctggagttacagtggctgtgagctgg
cagaggtgcccgggtggaacttcggccctcaagaccagttagtgctggaccttctctctaaccccc
aggccttttataaaaaggaatcttatcatcttatcacccgggtgtgaaggtgcgccttcaatccca
gcactctggaggtagtgacacacctactccaacaaggccatacttcctaatagtgccac
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 16966 (-) HS$A11COL - TCTCCCA (tgggaga); 16977 (-) HS$EGFR_19 - GCCTGC (gcaggc); 16979 (+) HS$HH4_01 -GATTTC; 16992 (-) RATA$POMC_0 - TGAACT (agttca); 16993 (-) HS$CDC2_10 - TTGAA (ttcaa); 17020 (+) RATA$A2UG_1 - GACACA; 17023 (-) RATA$AFEP_0 - TGTCCT (aggaca); 17024 (+) RATA$POMC_0 - CAGAG; 17082 (-) HS$GMCSF_0 - TATTT (aaata); 17092 (+) HS$GG_22 - CTAAT; 17096 (+) HS$PL_09 - TATTCAT; 17100 (+) HS$GMCSF_0 - CATTA; 17102 (-) HS$PL_05 - ATGAATA (tattcat); 17108 (-) HS$ALBU_04 - TTAATAAT (attattaa); 17124 (+) HS$GMCSF_0 - TATTT; 17130 (-) HS$INS_05 - GGAAAT (atttcc); 17131 (-) RATÓN$UPA - AGGAAA (tttcct); 17155 (-) RATA$GF_04 -AGCCACT (agtggct); 17162 (+) HS$ALBU_03 - TGGCA; 17165 (+) RATA$POMC_0- CAGAG; 17175 (-) RATA$NF1_01 - GGGCA (tgccc); 17177 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 17180 (-) HS$GG_13 - CACCC (gggtg); 17181 (-) HS$BG_18 - CCACC; 1721S (-) HS$HH4_02 - GGTCC (ggacc); 7238 (+) TATA - TATAAAAA; 17245 (+) HS$CDC2_01 - AAGGAA; 17250 (-) HS$CDC2_02 - TTCCTT (aaggaa); 17252 (+) HS$BG_06 - CTTATCAT; 17257 (-) RATÓN$AAG - GATAAG (cttatc); 17258 (-) HS$GP2B_02 - TGATAA (ttatca); 17265 (-) RATÓN$AAG - GATAAG (cttatc); 17265 (+) HS$GG_13 - CACCC; 17266 (-) HS$GP2B_02 - TGATAA (ttatca).
6. Potenciador Pos: 19922 LDF - 42,00: (SEQ ID NO: 159)
Ccacctccattctctttcagtcccctgagttctggactcttggggggtgggggggtggaagcgcct
accttgagttttctgaggcagtccgtagggtattcgcccgcagatacatccctaattgcatatgca
tgctccctgctcatcttgaggggggacatgtcctactcctgcagaaatgggggatgtgcaaaacga
tattgaattggccttgactcaggaaccaggcccggggtcccgctcctccccgccccctccacgatc
tgctaccatgacgtcaaggtgggcgggcg
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 19622 (+) RATA$A12COL - CACCTCC; 19625 (-) HS$BG_22 - GGTGG (ccacc); 19648 (+) RATÓN$RAS1 - AGTTCT; 19666 (+) HS$BG_17 - GGTGGGG; 19666 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 19669 (-) HS$GG_13 - CACCC (gggtg); 19670 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg); 19672 (-) RATÓN$PERI - CCCCACCCCC (gggggtgggg); 19674 (+) HS$BG_22 -GGTGG; 19677 (-) HS$GG_13 - CACCC (gggtg); 19678 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg); 19738 (+) HS$GG_22 -CTAAT; 19742 (+) HS$PL_01 - TTGCATA; 19775 (+) RATA$A2UG_1 - GGGACA; 19780 (-) RATA$A2UG_1 -TGTCCC (gggaca); 19781 (+) RATA$AFEP_0 - TGTCCT; 19789 (+) HS$EGFR_20 - TCCTGC; 19795 (+) HS$HH4_07 - AGAAATG; 19801 (-) HS$GMCSF_0 - CATTT (aaatg); 19812 (-) RATÓN$MT1 - TGCAC (gtgca); 19820 (+) HS$CMYB_01 - ATTGAA; 19821 (+) HS$CDC2_10 - TTGAA; 19824 (- ) HS$EGFR_15 TCAAT (attga); 19825 (+) RATÓN$A21C - ATTGG; 19830 (-) RATÓN$JUND - GCCAAT (attggc); 19833 (+) HS$MT2A_08 - TGACTCA; 19839 (-) RATÓN$NGF - TGAGTCA (tgactca); 19854 (+) HS$HH4_02 - GGTCC; 19867 (+) RATÓN$JUND - CCCGCCCC; 19868 (+) HS$TGFB1_0 - CCGCCCCC; 19872 (+) HS$NPY_04 - CCCCTCC; 19872 (-) HS$CDC25C - GGCGG (ccgcc); 19873 (-) HS$APOE_08 - GGGCGG (ccgccc); 19874 (-) HS$MT2A_10 - GGGGCGGGG (ccccgcccc); 19875 (-) RATA$MT1_01 - GGGGGCGG (ccgccccc); 19893 (+) HS$FN_03 - TGACGTCA; 19893 (+) HS$VIP_04 - TGACGT; 19893 (+) HS$INS_04 - TGACG; 19900 (- ) HS$INS_04 - TGACG (cgtca); 19900 (-) HS$VIP_04 - TGACGT (acgtca); 19900 (-) HS$FN_03 - TGACGTCA (tgacgtca); 19902 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 19905 (+) HS$APOE_08 - GGGCGG; 19906 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg); 19906 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 19909 (+) HS$APOE_08 - GGGCGG; 19910 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 19912 (-) HS$APOE_09 - GCCCGCCC (gggcgggc); 19913 (+) HS$CDC25C -GGCGG; 19914 (-) RATÓN$MT1 - CCGCCCG (cgggcgg).
7. Promotor Pos: 20018 LDF - 2,88 Caja de TATA en 1998918,87 (SEQ ID NO: 160)
ctaattgcatatgcatgctccctgctcatcttgaggggggacatgtcctactcctgcagaaatggg
ggatgtgcaaaacgatattgaattggccttgactcaggaaccaggcccggggtcccgctcctcccc
gccccctccacgatctgctaccatgacgtcaaggtgggcgggcggcggcaggtgcgtggcccgcag
ccactcctttaaggcggagggatccaagggcggggcccgggctgtgcttcgccttatatagggcgg
tcgggggcgt
Anotación:
Posición (hebra de ADN o -) Especie$Factor de transcripción - SECUENCIA (complemento): 19738 (+) HS$GG_22 - CTAAT; 19742 (+) HS$PL_01 - TTGCATA; 19775 (+) RATA$A2UG_1 - GGGACA; 19780 (-) RATA$A2UG_1 -TGTCCC (gggaca); 19781 (+) RATA$AFEP_0 - TGTCCT; 19789 (+) HS$EGFR_20 - CCTGC; 19795 (+) HS$HH4_07 - AGAAATG; 19801 (-) HS$GMCSF_0 - CATTT (aaatg); 19812 (-) RATÓN$MT1 -TGCAC (gtgca); 19914 (-) RATÓN$MT1 - CCGCCCG (cgggcgg); 19820 (+) HS$CMYB_01 - ATTGAA; 19821 (+) HS$CDC2_10 - TTGAA; 19824 (-) HS$EGFR_15 - TCAAT (attga); 19825 (+) RATÓN$A21C -ATTGG; 19829 (-) HS$BAC_03 - CCAAT (attgg); 19830 (-) RATÓN$JUND - GCCAAT (attggc); 19833 (+) HS$MT2A_08 - TGACTCA19839 (-) RATÓN$NGF - TGAGTCA (tgactca) 19854 (+) HS$HH4_02 - GGTCC; 19867 (+) RATÓN$JUND - CCCGCCCC; 19868 (+) HS$TGFB1_0 -CCGCCCCC; 19872 (+) HS$NPY_04 - CCCCTCC; 19872 (-) HS$CDC25C - GGCGG (ccgcc); 19873 (-) HS$APOE_08 - GGGCGG (ccgccc); 19874 (-) HS$MT2A_10 - GGGGCGGGG (ccccgcccc); 19875 (-) RATA$MT1_01 - GGGGGCGG (ccgccccc); 19893 (+) HS$FN_03- TGACGTCA; 19893 (+) HS$VIP_04 - TGACGT; 19893 (+) HS$INS_04 - TGACG; 19900 (-) HS$INS_04 - TGACG (cgtca); 19900 (-) HS$VIP_04 - TGACGT (acgtca); 19900 (-) HS$FN_03 - TGACGTCA (tgacgtca); 19990 (+) RATA$GLU_04 - TATAT; 19902 (+) HS$BG_22 - GGTGG; 19905 (+) HS$APOE_08 - GGGCGG; 19906 (-) HS$BG_18 - CCACC (ggtgg); 19906 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 19909 (+) HS$APOE_08 - GGGCGG; 19910 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 19912 (-) HS$APOE_09 - GCCCGCCC (gggcgggc); 19913 (+) HS$CDC25C -GGCGG; 19934 (+) RATA$GF_04 - AGCCACT; 19947 (+) HS$TPI_04 - AGGCGG; 19948 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 19962 (+) HS$WAF1_03 - AGGGCGG; 19963 (+) HS$APOE_08 - GGGCGG; 19964 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 19967 (+) HS$GG_36 - GGGGCC; 19989 (+) CAJA DE TATA - TTATATAG; 19995 (-) RATA$GLU_04 - TATAT (atata); 19995 (+) HS$WAF1_03 - AGGGCGG; 19996 (+) HS$APOE_08 - GGGCGG; 19997 (+) HS$CDC25C - GGCGG; 20005 (+) RATÓN$GLUT - GGGGCGT; 20006 (+) RATÓN$GLUT - GGGCGT; 20011 (-) HS$U2SN_04 - ACGCCC (gggcgt)
Posteriormente, ya que el vector AAV-ZF tiene un límite de empaquetamiento del inserto de aproximadamente 1810 pb, los presentes inventores diseñaron un promotor constitutivo de hsp90ab1 potencialmente mejorado y mínimo, utilizando regiones potenciadoras potenciales de una región de aproximadamente 1,7 k cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción (mayúsculas en la secuencia mostrada a continuación), más 95 pb del exón 1 (tapas grandes en la secuencia mostrada abajo), lo que resulta en un tamaño del inserto de 1810 pb que es ideal para un vector AAV óptimamente empaquetado en el presente sistema de expresión. El tamaño óptimo de empaquetamiento es esencial para obtener títulos elevados de AAV (>10A12 viriones/ml), que a su vez puede ser esencial para una terapia génica eficaz. El diseño sintético final de hsp90ab1 (SEQ ID NO: 146) se diseñó además para que también contuviera sitios de Nhel flanqueantes (véase la negrita), que se añadieron para la clonación en el vector AAV. Se mutó un sitio de Nhel críptico (subrayado en la secuencia de abajo) a partir de la secuencia original (c>a).
gctagcaacaccctagggccttctgagcaatcctacccagtgtctcctcatatattgatttcttta tgggcttcacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacagaattaaggag aggctaacagacagtgcaggatgggatgataacagacgaagtagacagaggcaaggagaaagcaac tactgtttaacaatgaatgcacattagacagactgcaggcaagcaccgggaacaaaggtgtgggcg gtggtgtggggacacaagccagcatgagctaagatagcagagcactgagtgcccatcctctactgg agggctcatcagtccaacaagcttccagatgcagccttggaaaaaggcaaggctagattgccagct gaaggacatggcaggccacctttagaacagaggcactggcacaacttggttttctggctcctggaa ctgggccaacctgtgaccagcaccttcatgcggatgcctagaactccagcttctctgaaaagactg
ggacctgctcctctctaggtccaaagagctgcatgcagtagggaagaggctagagaagcgaaacca gcttgagaaacagcttgtgctcacatagggagggcgcacgtacccgcgcgctgtgtacgtgggaga ccggggaggctgaggggtggggagtgttctacccagtagcgcaagctgatagctcggttctctgtt cactagaaggtgtccgcagtcactcacccccacagcccccgtgccctgtgaccgatccaggtcagc tatccctccctctgcgctccactcccccactgttatgtgggcctcttagggccacgcgtggagggt cgttcaaccctggcccacggtaggcagacttggggaaaatttcttcccagggtaagatcaaggtag gggaaaaaaaaaaaaaaaaaaagccacccagccaagcggcgacgaagacactgcccccgccgcagc aggggaggtggagcctaggggggaggggtggagaccgccgagacaggcctagaaactgctggaaga aatcgcagcaccaccgctgctgatccttccgccgcaggccgccaaagagtccctaccagcccaggc ccgtgcccctcccctcggggaaagcggctcccagcctgaagctgtgctgtacccgggagggtgggg atgggggaatcgggggcctccttaaagttggacaaggaatttatcatccttttctcttgatgtgcg atttgtagggaacattctagtaagatcgggtctggaaatggcagccgagttggccacctccattct ctttcagtcccctgagttctggactcttggggggtgggggggtggaagcgcctaccttgagttttc tgaggcagtccgtagggtattcgcccgcagatacatccctaattgcatatgcatgctccctgctca tcttgaggggggacatgtcctactcctgcagaaatgggggatgtgcaaaacgatattgaattggcc ttgactcaggaaccaggcccggggtcccgctcctccccgccccctccacgatctgctaccatgacg tcaaggtgggcgggcggcggcaggtgcgtggcccgcagccactcctttaaggcggagggatccaag ggcggggcccgggctgtgcttcgccttatatagggcggtcgggggcgttcgggagctCTCTTGAGT
CACCCCCGCGCAGCCTAGGCTTGCCGTGCGAGTCGGACTTGGTCCGGGCCCACCACCCTGCTCTGT
ACTACTACTCGGCTTTCCCGTCAAGgctagc
El promotor potencial pHSP diseñado anteriormente se sintetizó químicamente y se vectorizó para expresar mZF11-KRAB-WPRE.
En un ejemplo, la construcción de expresión se insertó en un vector vírico rAAV2/9, de forma similar a la descrita anteriormente para la construcción equivalente de pNSE en rAAV2/1, para un perfil de expresión más amplio que el del rAAV2/1, que es relativamente específico para la expresión neuronal (Expert Opin. Biol. Ther., (2012), Junio; 12(6): 757-766.). De este modo, fue posible evaluar tanto la expresión específica de las neuronas como la posible expresión ubicua de las construcciones que codifican péptidos. De forma similar, la construcción de expresión puede insertarse en un vector vírico rAAV2/1 para su expresión en tipos celulares preferiblemente diana de AAV2/1.
Para administrar construcciones de expresión vírica, se realizó una inyección intraventricular bilateral en ratones R6/1 neonatos, con el máximo volumen de AAV posible (4 |il, ~10A10 viriones).
En estos estudios, se descubrió que las construcciones de expresión controladas por pHSP (basadas en la SEQ ID NO: 146) se expresaban durante un periodo de tiempo significativamente más largo que pCAG (véase la figura 17, paneles b, c y d; datos de pHSP durante 3, 6, 12 y 24 semanas después de la administración).
Como se ha indicado anteriormente, los datos de la figura 17 lo demuestran claramente, al considerar la represión funcional de la HTT mutante, la represión impulsada por pCAG solo se detectó a las 3 semanas y se perdió a las 6 semanas (figura 17, panel a; pCAG), que coincidía con la pérdida completa de la expresión detectable del péptido de dedo de cinc a partir de este promotor vírico. Por el contrario, la represión impulsada por pHSP se mantuvo durante todo el periodo de 24 semanas, aunque con una represión ligeramente menor a las 3 semanas y una ligera tendencia a la reducción de la expresión con el tiempo (figura 17, panel a; pHSP).
De manera beneficiosa, el alelo Htt corto de tipo silvestre no se vio afectado en todas las muestras, indicando una falta de actividad fuera de la diana (véase la figura 17, paneles e y f) para el péptido de dedo de cinc de 11 dedos utilizado.
En resumen, estos resultados demuestran claramente que la combinación del diseño mZF11-KRAB con un promotor ubicuo (pHSP) da lugar a niveles de represión del gen diana similares a los basados en el promotor específico de neuronas (pNSE).
Además, hay que tener en cuenta que la expresión a largo plazo de los factores de transcripción (TF) es muy difícil y, hasta donde sabemos, nunca se ha intentado antes. De hecho, es mucho más difícil expresar niveles funcionales de un factor de transcripción sintético durante meses en comparación con un indicador enzimático secretado, como la luciferasa (Gene Ther. 2001 ;8:1323-32), que amplifica cualquier señal de expresión génica. Por tanto, la expresión del factor de transcripción de dedo de cinc observada a las 24 semanas después de la infección en los presentes ejemplos establece un nuevo punto de referencia.
En general, la construcción de pHSP descrita en la presente memoria logró una represión de HTT mut de aproximadamente el 25 % en todo el cerebro durante al menos 24 semanas. Además, se ha descubrió anteriormente que aproximadamente un 25 % de la represión de la HTT mutante está en el intervalo terapéutico (PNAS (2012), 109: E3136-E3145). Por tanto, los diseños de promotores de la presente descripción son muy prometedores para terapia.
Mientras que los presentes resultados beneficiosos en la expresión génica endógena a largo plazo se han demostrado en el contexto de la represión dependiente de dedos de cinc de HTT mutante, estos resultados indican que la secuencia promotora / potenciadora de pHSP identificada en la presente memoria también puede resultar útil para la expresión ubicua de cualquier secuencia (p. ej., un transgén) de interés: por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, tal como en terapias génicas, y en particular para la expresión de factores de transcripción.
C. Diseño de promotores alternativos para la expresión terapéutica de transgenes a largo plazo: uso humano
Las nuevas secuencias promotoras / potenciadoras de pNSE y pHSP descritas anteriormente para la expresión de genes en ratón se utilizaron para derivar las correspondientes secuencias promotoras / potenciadoras para la expresión de genes en células humanas de dos maneras.
En primer lugar, las versiones de ratón (p. ej., SEQ ID NO: 146 para pHSP) utilizadas y probadas como se describe en relación con la figura 17 se estudian en diferentes tipos de células humanas en cultivo de tejidos. En vista de la conservación de la secuencia de muchas secuencias promotoras y sitios de unión para factores de transcripción entre diferentes especies, las construcciones de promotores suelen ser funcionales en más de una especie. Por lo tanto, es posible identificar construcciones promotoras / potenciadoras de ratón que logren niveles de expresión transgénica adecuados para aplicaciones terapéuticas (terapia génica) en una variedad de tipos de células / tejidos humanos.
En segundo lugar, las versiones humanizadas de los fragmentos promotores humanos de hsp90ab1 y pNSE pueden diseñarse basándose en elecciones similares de los puntos de inicio y finales de la secuencia de ADN para conseguir un fragmento promotor de ADN óptimo de 1,8 kb adecuado para el empaquetamiento vírico del AAV. A cada una de estas secuencias puede añadirseNheI flanqueando los sitios de restricción, p. ej., dando lugar a las secuencias promotoras / potenciadoras humanas de las SEQ ID NO: 147 y 148. Por tanto, la SEQ ID NO: 147 corresponde a la secuencia que se extiende 1,6 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de hsp90ab1 humana y 179 pb del exón 1 del gen, con sitios adicionales flanqueantes de NheI. La SEQ ID NO: 148 corresponde a la secuencia que se extiende 1,6 kpb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de la enolasa 2 humana más 210 pb del exón 1 del gen, con la adición de sitios de restricción NheI flanqueantes.
Análisis
En estos ejemplos, se han diseñado péptidos de dedo de cinc capaces de reconocer y unirse a ambas cadenas de ADN de un tramo de repeticiones de CAG, reconociendo los tripletes de poli-GCA y poli-GCT; y se ha demostrado que dichas proteínas son capaces de inducir la represión de la transcripción de los genes diana tanto in vitro como in vivo.
Se ha demostrado que los péptidos de dedo de cinc desnudos (es decir, que carecen de dominios efectores adicionales) pueden ser inhibidores muy eficaces de la expresión del gen diana (la expresión de poliQ-EGFP se redujo hasta en un 90 %), especialmente cuando el número de repeticiones de CAG es igual o superior a 35. Este es un hallazgo significativo, ya que el número de repeticiones de CAG en los genes de tipo silvestre del genoma humano (incluido el gen htt), es inferior a 35. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, es probable que el mecanismo de represión en estos casos se deba al impedimento estérico de la progresión del complejo de ARN polimerasa, como informaron Choo et al. para un ZFP sintético contra el oncogén Bcr-Abl (Choo et al. (1994) Nature, 372(6507): 642- 645).
Se comprobó que la fusión del dominio de represión Kox-1 con los péptidos de dedo de cinc de la invención reducía aún más la expresión de los genes diana. En estos experimentos, se demostró que la represión requería la unión a las repeticiones de CAG, ya que los vectores de control que carecen de repeticiones de CAG no se vieron afectados.
Aunque se ha demostrado que la reducción parcial de la proteína htt de tipo silvestre más corta se tolera hasta 4 meses en modelos animales (Boudreau et al. (2009), Mol. Ther. 17(6): 1053-1063), se considera generalmente que una terapia segura y eficaz para la EH debe dirigirse preferiblemente al alelo htt mutante. Utilizando un ensayo de competición, se ha demostrado que los péptidos de dedo de cinc de la invención reprimen preferiblemente la expresión de genes indicadores que contienen más de 35 repeticiones de CAG, lo que sugiere que son muy prometedores como estrategia terapéutica para reducir los niveles de la proteína huntingtina mutante en pacientes heterocigotos.
Después de 20 días (aproximadamente 3 semanas) de expresión estable de los péptidos de dedo de cinc, la proteína de 11 dedos mostró la mayor represión del alelo mutante HTT diana. De hecho, cuando se fusiona con el dominio de represión Kox-I, los péptidos de dedo de cinc más activos de la invención fueron capaces de reducir drásticamente los niveles de la proteína mutante endógena en un 95 %, y los niveles del ARNm mutante en aproximadamente un 80 %, con un efecto insignificante en la expresión del alelo de tipo silvestre, o en cualquier otro gen que contenga un número de repeticiones de CAG de tipo silvestre. Sin embargo, es probable que se requiera una expresión sostenida, a medio o largo plazo, de las proteínas de dedo de cinc terapéuticas para que la terapia sea eficaz.
La terapia génica es una atractiva estrategia terapéutica para diversas enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, los vectores lentivíricos se han utilizado para mediar en la expresión generalizada y a largo plazo de transgenes en células que no se dividen, como las neuronas maduras (Dreyer, Methods Mol. Biol. 614: 3-35). También se utilizó un vector de rAAV por Rodriguez-Lebron et al. (2005) Mol. Ther. 12(4): 618-633, para administrar ARNhc anti-mutante de Htt en ratones modelo de EH; reduciendo así los niveles de mHtt en el estriado y frenando la progresión del fenotipo de la EH. Además, dado que se ha demostrado recientemente que la iARN (van Bilsen et al. (2008), Hum. Gene Then 19(7): 710-719; Zhang et al. (2009), J. Neurochem. 108(1): 82-90; Pfister et al. (2009), Curr Biol. 19(9): 774-778), y los ANB (Hu et al. (2009), Nat. Biotechnol. 27(5): 478-484; y Hu et al. (2009), Ann. NYAcad. Sci. 1175: 24-31) es prometedora para el tratamiento de la EH, es probable que en los próximos años se optimicen los vehículos de administración adecuados, y el planteamiento complementario del péptido de dedo de cinc descrito en la presente memoria probablemente se beneficiaría de dichos avances.
Por consiguiente, se ha desarrollado un modelo de línea celular de células del estriado de un modelo de ratón con EH con inserción génica (Trettel et al. (2000), Hum. Mol. Genet. 9(19): 2799-2809) y se ha utilizado para demostrar los efectos de los péptidos de dedo de cinc de la invención en condiciones probablemente terapéuticas (es decir, alelos de una sola copia en locus cromosómicos).
rAAV parecía ser un sistema de administración prometedor, por lo que los presentes inventores lo utilizaron para administrar los péptidos moduladores de dedos de cinc de la invención en el estriado de los modelos de ratón de EH de R6/2 y R6/1. Los presentes inventores observaron una represión significativa del transgén htt mutante en el estriado del cerebro de R6/2 y R6/1 en comparación con el estriado de control, mientras que la expresión del gen ts se mantuvo inalterada. Coincidiendo con la reducción de los niveles de expresión de htt mutante, mostraron un retraso en la aparición de muchos de los síntomas de la EH característicos de la línea del modelo R6/2. Específicamente, los presentes inventores observaron un retraso en el inicio del comportamiento de agarre, así como una atenuación de los déficits en la barra rotatoria de aceleración (Menalled et al. (2009), Neurobiol. Dis. 35: 319-336).
Sin embargo, incluso con la construcción de expresión de rAAV mejorada, en el caso de algunos moduladores de péptidos de dedo de cinc, los presentes inventores observaron una reducción significativa de la expresión de los péptidos de dedo de cinc a lo largo del tiempo (de 4 a 6 semanas después de la inyección), con una reducción concomitante de la represión de htt mutante. La disminución de la expresión del péptido de dedo de cinc a lo largo del tiempo podría deberse a varias razones (p. ej., el silenciamiento del promotor o la inestabilidad del ADN del péptido de dedo de cinc que permanece como ADN extracromosómico en las células estriatales quiescentes).
Otros estudios indicaron que la reducción de la expresión de los péptidos de dedo de cinc a partir de unas 4 semanas después de la inyección coincide con un aumento en el sistema inmunitario del hospedador (las células microgliales y astrogliales se activan significativamente in vivo), lo que sugiere que la expresión de estos péptidos heterólogos podría evitarse mediante una respuesta inmunitaria intensa y selectiva del hospedador a las células que expresan los péptidos de dedo de cinc. Por tanto, se decidió intentar mejorar la expresión a medio y largo plazo de los péptidos potencialmente terapéuticos in vivo reduciendo su inmunogenia en células de ratón y humanas. De este modo, se esperaba crear proteínas represoras de dedos de cinc capaces de ejercer una actividad terapéutica a largo plazo contra el gen HTT mutante y otros genes patógenos asociados a secuencias de repetición de trinucleótidos de CAG expandidas.
Ratonización frente a humanización en el desarrollo de terapias
La humanización de los productos biológicos, tales como anticuerpos diseñados por ingeniería genética, se ha establecido desde hace tiempo como una forma de reducir la inmunorreactividad en la terapia (Carter et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289; y Presta et al. (1997), Cáncer Res., 57: 4593-4599). La adaptación de las construcciones sintéticas para terapia génica para sus hospedadores es relativamente más compleja, dado que pueden tener más componentes y se deben valorar regiones funcionales más largas. Por ejemplo, las hélices de unión de múltiples dedos de cinc suelen requerir varios aminoácidos de tipo no silvestre para unirse a las secuencias diana deseadas (véase, p. ej., la figura 10). No obstante, en este trabajo se consideró que estas diferencias debían minimizarse para maximizar las posibilidades de desarrollar péptidos candidatos terapéuticos con éxito.
En este estudio, los presentes inventores han demostrado que la "ratonización" de una construcción represora de dedo de cinc para el tratamiento en cerebros de ratón redujo significativamente la toxicidad in vivo, manteniendo una eficacia de represión similar contra el gen diana en comparación con el péptido original (no ratonizado) en los estudios de expresión y represión. La reducción de las respuestas inflamatorias tras el emparejamiento con el hospedador de la construcción de dedos de cinc sugiere una respuesta inmunitaria contra las proteínas no propias como la explicación más probable de la toxicidad detectada a medio plazo. Una prueba indirecta que apoya esta hipótesis es la falta de toxicidad aparente de ZF-Kox-1, tanto en cultivo celular como en ensayos in vivo a corto plazo. De hecho, los presentes inventores pudieron generar líneas celulares estables que expresan ZF-Kox-1 in vitro, y un ensayo de viabilidad celular no mostró efectos tóxicos (Garriga- Canut et al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci:, 109, E3136-3145).
Uno de los objetivos de este estudio era sustituir todos los dominios efectores asociados expresados como parte de la proteína terapéutica por homólogos del hospedador, mientras que otra objeción fue rediseñar el dominio funcional de unión al ADN del péptido de dedo de cinc para conservar su actividad de unión prevista. Esto último requería utilizar el menor número posible de cambios de aminoácidos, en relación con el armazón proteico del organismo hospedador (en este caso, el dominio de dedo de cinc de ratón, Zif268). En principio, el escaneo de epítopos (Parker et al. (2010), BMC Bioinformatics, 11: 180) también puede ayudar a guiar la elección final de los cambios de diseño de aminoácidos, con el objetivo de reducir los epítopos potenciales.
En estudios posteriores, se demostró que los cambios en la secuencia de la proteína introducidos eran suficientes para reducir la pérdida de células neuronales in vivo, lo que hace que la posible construcción de terapia génica sea significativamente menos tóxica que incluso un vector de expresión de GFP. De hecho, la construcción "ratonizada" se comportó de manera más similar a una inyección de PBS de control que un tratamiento con proteínas heterólogas.
Represión funcional de HTT y expresión sostenida de los dedos de cinc
Este estudio ha demostrado que la reducción de los niveles de toxicidad de los moduladores de péptidos de dedo de cinc como se reivindican se correlaciona con la actividad de represión de HTT mut. Como las células individuales que expresan ZF de la invención alcanzan el 95 % de represión de HTT mut con los promotores fuertes utilizados en la presente memoria, las ligeras mejoras en la eficiencia de la transducción pueden ser un objetivo para futuras investigaciones con el fin de mejorar aún más el efecto terapéutico en la reversión del fenotipo de la EH. Un planteamiento podría ser aumentar la dosis eficaz de los moduladores de péptido de dedo de cinc reivindicados. Por ejemplo, la represión de HTT mut en todo el cerebro podría verse reforzada por el aumento de la dosis de virus, mientras se vigila la posible toxicidad.
Estudios anteriores con oligonucleótidos antisentido modificados han demostrado que la reducción transitoria de los niveles de HTT mut hasta aproximadamente el 50 % es suficiente para una reversión fenotípica sostenida durante un periodo de dos meses (Kordasiewicz et al. (2012), Neuron, 74: 1031-1044). Estos niveles de represión están dentro del intervalo alcanzado en el presente estudio.
También es posible alterar los niveles de expresión de los dedos de cinc y su persistencia modificando el diseño de los promotores. En este caso, se ha demostrado la eficacia de una construcción de expresión fuerte, que contiene el elemento potenciador temprano del CMV y el promotor de la p-actina del pollo, con el elemento regulador posttranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck (pCAG-WPRE). Sin embargo, el uso de una secuencia promotora de enolasa específica de rata (pNSE) de 1,8 kb, que ha demostrado dar una expresión persistente más de 100 veces superior a la del promotor del CMV en cerebros de roedores (Peel et al. (1997), Gene Ther., 4: 16-24; Forss-Petter et al. (1990), Neuron, 5: 187-197), ha mostrado proporcionar una expresión prolongada de transgenes de péptidos de dedo de cinc. En combinación con un WPRE, se ha demostrado que pNSE proporciona una fuerte expresión estable de luciferasa en el estriado de rata, incluso después de 15 meses (Xu et al. (2001), Gene Ther, 8: 1323-1332). De manera interesante, pNSE parece ser específico para las neuronas (que no presentan antígenos). En combinación con vectores rAAV2/1, que muestran un fuerte tropismo hacia las neuronas, el direccionamiento puede así evitar beneficiosamente la expresión en la glía y los astrocitos (que sí presentan antígenos). La presentación de antígenos reducida puede explicar por qué se mantiene la expresión génica de luciferasa durante al menos 15 meses. En la presente memoria se ha demostrado que las construcciones de dedos de cinc de la invención en combinación con WPRE y NSE (p. ej., rAAV2/1-pNSE-mZF-ZF87-WPRE) pueden producir una fuerte represión estable de HTT mut, principalmente en las neuronas, en lugar de también en la glía y los astrocitos. Es posible que como pNSE restringe la expresión a las neuronas, esta posible vía terapéutica podría reducir aún más la inflamación y la toxicidad, permitiendo la expresión a muy largo plazo de construcciones de dedos de cinc terapéuticas. En general, los resultados presentados en la presente memoria demuestran que la combinación de la construcción mZF-KRAB adaptada al hospedador de la invención con el promotor pNSE de ratón permite la represión de HTT mut en todo el cerebro, por un periodo prolongado de 6 meses, lo cual es claramente más largo que las 3 semanas notificadas anteriormente.
Pueden esperarse efectos similares en seres humanos, utilizando el promotor de ratón o el equivalente humano del promotor sintético pNSE utilizado en este estudio, como se describió anteriormente.
Adicionalmente, se han demostrado otros beneficios asociados al uso de un promotor ubicuo recientemente caracterizado, pHSP (basado en Hsp90). Concretamente, estos beneficios se ven reforzados cuando el nuevo promotor se utiliza en combinación con los vectores rAAV2/9, basados en un virus que infecta una gran variedad de tipos de células. Por tanto, se ha demostrado que la represión de HTT mutante impulsada por pHSP puede mantenerse durante largos periodos de tiempo (p. ej., durante al menos 24 semanas). En otras palabras, los resultados presentados en la presente memoria muestran que la combinación de la construcción mZF11 -KRAB con el promotor ubicuo (pHSP), puede permitir niveles similares de represión del gen diana (p. ej., de HTT mutante) en el cerebro en comparación con cuando se utiliza el promotor específico de neuronas (pNSE). Se pueden esperar efectos similares en sujetos humanos utilizando el promotor de ratón o el equivalente humano del promotor sintético de pHSP utilizado en este estudio. De forma similar, se esperan efectos beneficiosos con los otros péptidos moduladores de dedos de cinc descritos en la presente memoria, que puede contener 6, 8, 10, 11, 12, 18 o más dominios de dedo de cinc adyacentes.
Tal como se ha descrito anteriormente, los inventores han desarrollado una formulación para un promotor-potenciador (derivado de Hsp90ab1) que funciona de forma ubicua y a largo plazo in vivo. Sin embargo, el uso de promotores ubicuos va más allá de las aplicaciones de terapia génica en el cerebro, y tiene especial importancia en la enfermedad de Huntington y otras enfermedades poliglutamínicas, en las que la inyección y la expresión de los dedos de cinc terapéuticos en el tejido periférico pueden ser cada vez más importantes.
Aunque la EH se considera principalmente una enfermedad neurológica, en realidad, se trata de una enfermedad compleja que tiene un componente periférico en su fisiopatología, incluidos los efectos en el corazón, músculo esquelético, riñón e hígado. De hecho, la insuficiencia cardíaca es la segunda causa más común de muerte en los pacientes con EH (Zielonka, D et al., (2014), Exp. Clin. Cardiol. 20, 2547-2554).
Los presentes inventores han establecido previamente una serie de eventos moleculares y fisiológicos que conducen a la miocardiopatía relacionada con la EH en dos modelos de ratón de EH ampliamente utilizados, concretamente R6/2 y HdhQ150 (Mielcarek, M. et al., (2014), Dysfunction of the CNS-Heart Axis in Mouse Models of Huntington's Disease. PLoS Genetics, 10(8): e1004550). Siguiendo con esto, los presentes inventores han obtenido recientemente un nuevo y sorprendente efecto técnico en dos modelos de ratón de EH (así como en entornos clínicos de EH), lo que sugiere una remodelación metabólica típica de los corazones con insuficiencia cardíaca (Toczek, M. et al. (2016), An impaired metabolism of nucleotides underpins a novel mechanism of cardiac remodelling leading to Huntington’s disease related cardiomyopathy. BBA Molecular basis of disease, 1862, 2147-2157). De hecho, se descubrió que la disfunción cardíaca en la EH parece estar asociada a desequilibrios energéticos celulares, cambios en el catabolismo de los nucleótidos de adenina, trastornos redox internos en estado estacionario y una activación de la AMPK, lo que conlleva un cambio en la preferencia del sustrato cardíaco. Estos cambios iban acompañados de un aumento de las concentraciones de catabolitos de nucleótidos de adenina (inosina, hipoxantina, xantina y ácido úrico) y uridina, tanto en modelos de ratón con EH como en el plasma de los pacientes con EH. Estos metabolitos representan los primeros biomarcadores identificados relacionados con la disfunción cardíaca en la EH.
En este contexto, el nuevo promotor ubicuo (pHSP) para su uso en ratones y seres humanos, tal como se describe en el presente documento, y los tropismos alternativos de AAV dirigidos a varios tipos de células (p. ej., rAAV2/9) pueden utilizarse ventajosamente en los métodos y tratamientos como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, sería especialmente útil si la morbilidad y la mortalidad de la EH pudieran rescatarse mediante la represión con dedos de cinc de la HTT mutante en tejidos periféricos como el corazón. Adicionalmente, en el cerebro, utilizando rAAV2/9 (amplia infectividad), rAAV2/1 (más específico para las neuronas), o una mezcla de ambos podría utilizarse para afinar el intervalo de células diana, especialmente en combinación con promotores elegidos ventajosamente.
Conclusiones
Este estudio demuestra que las construcciones genéticas sintéticas que se adaptan al hospedador pueden reducir los daños por inmunotoxicidad en el cerebro. Esto podría aplicarse a muchas otras construcciones de terapia génica, incluidas las que son prometedoras pero muestran un grado de toxicidad. El desarrollo de construcciones que funcionen durante toda la vida de un organismo es un objetivo importante de la terapia génica y la optimización del hospedador nos acerca a este objetivo.
En general, los resultados presentados en este estudio establecen que los péptidos de dedo de cinc de la invención pueden reprimir específica y eficazmente la htt mutante in vivo (mediante inyección estriatal), de forma dependiente de la dosis; y que, como resultado, hay algunas mejoras conductuales claras y una reducción de los síntomas de la enfermedad de Huntington. Las construcciones de la presente invención demuestran una mejor compatibilidad con el hospedador y no inducen las fuertes respuestas inmunológicas cuando se expresan en el cerebro de los ratones que provocaron la supresión de la expresión de las construcciones anteriores. Las construcciones terapéuticas de dedo de cinc mejoradas descritas en la presente memoria han demostrado un gran potencial para el tratamiento de la enfermedad de Huntington debido a su capacidad para mantener la expresión de proteína heteróloga en el medio a largo plazo sin problemas de toxicidad evidentes. La mejora de los sistemas de administración y expresión aumentará aún más el potencial de estos péptidos terapéuticos.
Las construcciones proteicas descritas también tienen un gran potencial para el tratamiento de otras enfermedades que se sabe que están asociadas a secuencias de repetición de poliglutaminas expandidas patógenas.
Agradecimientos
El trabajo que ha dado lugar a la presente invención ha recibido financiación del Séptimo programa marco de la Unión Europea H2020 (ERC-2014-PoC 641232 - Fingers4Cure) con la subvención número 641232. El trabajo que ha dado lugar a la presente invención también ha recibido financiación del Conejo Europeo de Investigación en el ámbito la subvención número 201249 del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013)/ERC.
Secuencias
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Tabla 11: Secuencias de péptidos y ácidos nucleicos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido un péptido de dedo de cinc que tiene de 8 a 32 dominios de dedo de cinc y que se une a secuencias de ácido nucleico con repetición de trinucleótidos de CAG y/o CTG; en donde el péptido de dedo de cinc comprende la secuencia:
N’- [(Fórmula 4) - L3]n0 - {[(Fórmula 6) - L 2 - (Fórmula 6) - L3]n1 - [(Fórmula 6)
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(Fórmula 6) -Xi_]} L 2 -(Fórmula 6) - L3]n3 -[(Fórmula 6) - L 2 -(Fórmula 6)] -[L 3 -(Fórmula 6) -]n4 -C’,
en donde n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, L 2 es la secuencia enlazadora -TGe/qk/rP-(SEQ ID NO: 7), L 3 es la secuencia enlazadora -TGg/se/qk/rP-(SEQ ID NO: 8), y Xl es una secuencia enlazadora de entre 8 y 50 aminoácidos;
la fórmula 4 es un dominio de dedo de cinc con la secuencia X 2 C X 2 ,4 C X 5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X 3 , 4 ,5 h/c y la fórmula 6 es un dominio de dedo de cinc con la secuencia X 2 C X 2 C X 5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X 3 H, en donde
X es cualquier aminoácido, los números en subíndice indican los posibles números de restos representados por X en esa posición, y el número en superíndice indica la posición del aminoácido en la secuencia de reconocimiento del dominio del dedo de cinc; y
en donde al menos 8 dominios de dedo de cinc adyacentes tienen una secuencia de reconocimiento X-1 X+1 X+2 X+3
X+4 X+5 X+6 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se selecciona entre una combinación de las SEQ ID NO: 2 y 5; de una combinación de las SEQ ID NO: 3 y 4; de una combinación de las SEQ
ID NO: 2, 3 o 4, o entre una combinación de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5.
2. Un polipéptido que comprende un péptido de dedo de cinc, teniendo el péptido de dedo de cinc de 8 a 32 dominios de dedo de cinc y que se une a secuencias de ácido nucleico con repetición de trinucleótidos de CAG y/o CTG; en donde el péptido de dedo de cinc comprende la secuencia:
N’- [(Fórmula 4) - L3]n0 - {[(Fórmula 6) - L 2 -(Fórmula 6) - L3]n1 -[(Fórmula 6) - L 2 -(Fórmula 6) -XL]}n 2 -[(Fórmula 4) -L 2 -(Fórmula 6) - L3]n3 -[(Fórmula 6) - L 2 -(Fórmula 6)] -[L 3 -(Fórmula 6) -]n4 -C’,
en donde n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, L 2 es la secuencia enlazadora -TGe/qk/rP-(SEQ ID NO: 7), L 3 es la secuencia enlazadora -TGg/se/qk/rP-(SEQ ID NO: 8), y Xl es una secuencia enlazadora de entre 8 y 50 aminoácidos;
la fórmula 4 es un dominio de dedo de cinc con la secuencia X 2 C X 2 ,4 C X 5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X 3 , 4 ,5 h /c y la fórmula 6 es un dominio de dedo de cinc con la secuencia X 2 C X 2 C X 5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X 3 H, en donde
X es cualquier aminoácido, los números en subíndice indican los posibles números de restos representados por X en esa posición, y el número en superíndice indica la posición del aminoácido en la secuencia de reconocimiento del dominio del dedo de cinc; y
en donde al menos 8 dominios de dedo de cinc adyacentes tienen una secuencia de reconocimiento X-1 X+1 X+2 X+3
X+4 X+5 X+6 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se selecciona entre una combinación de las SEQ ID NO: 2 y 5; de una combinación de las SEQ ID NO: 3 y 4; de una combinación de las SEQ
ID NO: 2, 3 o 4, o entre una combinación de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5.
3. El ácido nucleico según la reivindicación 1 o el polipéptido según la reivindicación 2, en donde L3 se selecciona del grupo que consiste en -TGSERP- (SEQ ID NO: 10) y -TGSQKP- (SEQ ID NO: 16; y/o en donde L2 se selecciona del grupo que consiste en -TGEKP- (SEQ ID NO: 6) y -TGQKP- (SEQ ID NO: 65).
4. El ácido nucleico según las reivindicaciones 1 o 3 o el polipéptido según las reivindicaciones 2 o 3, en donde todos los dominios de dedo de cinc se definen de acuerdo con la fórmula 6.
5. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde:
(i) el péptido de dedo de cinc tiene de 10 a 18 dominios de dedo de cinc y todos los dominios de dedo de cinc del péptido de dedo de cinc tienen una secuencia de reconocimiento X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 de acuerdo con la SEQ
ID NO: 1 y en donde al menos 8 dominios de dedo de cinc adyacentes tienen una secuencia de reconocimiento seleccionada entre una combinación de las SEQ ID NO: 2 y 5; de una combinación de las SEQ ID NO: 3 y 4; de una combinación de las SEQ ID NO: 2, 3 o 4, o entre una combinación de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5; y/o
(ii) el péptido de dedo de cinc tiene 10, 11, 12 o 18 dominios de dedo de cinc y todos los dominios de dedo de cinc del péptido de dedo de cinc tienen una secuencia de reconocimiento X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 seleccionada de una combinación de las SEQ ID NO: 2 y 5; de una combinación de las SEQ ID NO: 3 y 4; de una combinación de las SEQ ID NO: 2, 3 o 4, o entre una combinación de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5.
6. El ácido nucleico o el polipéptido según la reivindicación 5, parte (ii), en donde L2 es - TGEKP- (SEQ ID NO: 6); L3 se selecciona del grupo que consiste en -TGSERP- (SEQ ID NO: 10) y -TGSQKP- (SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 1
se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3 y 4 o del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2 y 5; opcionalmente en donde Xl se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 21,22, 23 y 24.
7. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 6 o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el polipéptido comprende el dominio represor KRAB humano de Kox-1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 39 o el dominio represor KRAB de ratón de ZF87 de acuerdo con la SEQ ID NO: 40; opcionalmente en donde la secuencia de SEQ ID NO: 39 y de SEQ ID NO: 40 está unida al C-terminal del péptido de dedo de cinc mediante la secuencia enlazadora de SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43.
8. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 7 o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde el polipéptido comprende la secuencia de señal de localización nuclear de SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38; y/o en donde el péptido de dedo de cinc comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 31,33 y 35; y/o en donde el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 49 a 56 y 59, 61 y 63; y/o en donde el polipéptido comprende una secuencia peptídica que tiene al menos un 95 % de identidad respecto de una secuencia peptídica seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 31,33, 35, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 59, 61 y 63.
9. Una construcción de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 8.
10. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 9.
11. El vector según la reivindicación 10, en donde el vector es un vector vírico procedente de retrovirus, tales como de la gripe, VIS, VIH, lentivirus y leucemia murina de Moloney; adenovirus; virus adenoasociados (AAV); virus del herpes simple (VHS); y virus quiméricos; opcionalmente en donde: el vector de virus adenoasociado (AAV) es un vector de virus adenoasociado (AAV) del subtipo AAV2/1 o el vector de virus adenoasociado (AAV) es un vector de virus adenoasociado (AAV) del subtipo AAV2/9.
12. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde el péptido de dedo de cinc se une a secuencias de ácido nucleico de repetición de trinucleótidos bicatenarias que comprenden secuencias de repetición de CAG, de repetición de CTG y/o de repetición de CAGCTG que contienen al menos 22 repeticiones de tripletes; opcionalmente en donde el péptido de dedo de cinc se une a secuencias de ácido nucleico de repetición de trinucleótidos bicatenarias que contienen al menos 22 repeticiones de tripletes y en donde la afinidad de unión es al menos 1 nM; al menos 100 pM o al menos 10 pM.
13. Un vector según las reivindicaciones 10 u 11 o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 o 12, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad poliglutamínica en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método administrar al individuo el vector o el polipéptido; opcionalmente en donde la enfermedad poliglutamínica se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Huntington (EH), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA), ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1), ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), ataxia espinocerebelosa tipo 3 o enfermedad de Machado-Joseph (SCA3), ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7), ataxia espinocerebelosa de tipo 6 (SCA6) y ataxia espinocerebelosa de tipo 17 (SCA17), opcionalmente en donde la enfermedad poliglutamínica es la enfermedad de Huntington (EH).
14. Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 9, el vector de las reivindicaciones 10 u 11 o el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 o 12.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad poliglutamínica, en donde el uso es en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales; opcionalmente en donde la enfermedad poliglutamínica es la enfermedad de Huntington.
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