ES2922379T3 - Compuestos de imidazo[4,5,D]pirrolo[2,3,B]piridina como inhibidores de Janus quinasas - Google Patents

Abstract

Compuestos de 2-((1r,4r)-4-(imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo, composiciones farmacéuticas que los contienen, métodos de preparación ellos, y métodos para usarlos que incluyen métodos para tratar estados patológicos, trastornos y condiciones mediadas por JAK, tales como enfermedad inflamatoria intestinal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de imidazo[4,5,D]pirrolo[2,3,B]piridina como inhibidores de Janus quinasas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a ciertos compuestos de imidazopirrolopiridina y composiciones farmacéuticas que los contienen.

ANTECEDENTES

Factores internos, factores externos o una combinación de ambos factores pueden desencadenar o estar asociados con el desarrollo de respuestas inmunitarias anormales en el cuerpo. Por consiguiente, se desarrollan estados patológicos en los que los constituyentes, como sustancias y tejidos, que normalmente están presentes en el cuerpo están sujetos a tal respuesta inmune. A estos estados se hace referencia genéricamente como enfermedades del sistema inmunitario. Como está implicado el sistema inmunitario del cuerpo y el daño afecta el tejido corporal, a estas enfermedades también se hace referencia como enfermedades autoinmunes. Como dicho sistema y tejido son parte del mismo cuerpo, los términos "enfermedad autoinmune" y "enfermedad del sistema inmunitario" se usan indistintamente en la presente, independientemente de lo que desencadene la respuesta anómala del sistema inmunitario. Además, la identidad o el mecanismo del problema inmunitario subyacente no siempre está claro. Ver, por ejemplo, D. J. Marks, et al., Crohn's disease: An immune deficiency state, Clinical Reviews in Allergy and Immunology 38(1), 20-30 (2010); J. D. Lalande, et al, Mycobacteria in Crohn's disease: How innate immune deficiency may result in chronic inflammation, Expert Reviews of Clinical Immunology 6(4), 633-41 (2010); J. K. Yamamoto-Furusho, et al., Crohn's disease: Innate immunodeficiency, World Journal of Gastroenterology, 12(42), 6751-55 (2006). Como se usa en la presente, el término "enfermedad autoinmune" no excluye afecciones cuyas causas comprenden factores o agentes externos, como factores ambientales o bacterianos, y factores internos como susceptibilidad genética. Por consiguiente, a una afección como la enfermedad de Crohn (CD) se hace referencia en la presente como una enfermedad autoinmune, independientemente de si está desencadenada por el propio cuerpo o por factores externos. Ver, por ejemplo, J. L. Casanova, et al., Revisiting Crohn's disease as a primary immunodeficiency of macrophages, J. Exp. Med. 206(9), 1839-43 (2009).

Entre los varios efectos adversos provocados por enfermedades autoinmunes, se observa típicamente por lo menos uno de los siguientes: daño y, a veces, destrucción de tejidos y alteración de órganos que pueden afectar el crecimiento y la función de órganos. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes afectan a la mayoría de los órganos principales, las glándulas endocrinas y exocrinas, la sangre y los músculos, y a una pluralidad de sistemas, como los sistemas digestivo, vascular, conectivo y nervioso. A menudo se adoptan tratamientos inmunosupresores para tratar enfermedades autoinmunes.

Se conocen múltiples teorías para explicar cómo surgen las enfermedades autoinmunes, algunas enfocadas en factores endógenos y otras que también incluyen factores exógenos. A nivel molecular, se considera que la vía de señalización Janus quinasa/transductor de señales y activador de la transcripción (JAK/STAT) desempeña un papel importante en la transmisión de información de señales químicas extracelulares al núcleo celular, lo que da como resultado la regulación de genes que están implicados en actividades celulares como la inmunidad. Las citoquinas son un ejemplo de una molécula extracelular que desempeña un papel importante en la señalización celular. Los leucocitos, como los neutrófilos, son reclutados por citoquinas y quimiocinas para, en última instancia, provocar daño tisular en enfermedades inflamatorias crónicas.

La familia de proteínas Janus quinasas (JAK) consiste de 4 tirosina quinasas, JAK1, JAK2, JAK3 y Tyk2, que son fundamentales para la señalización intracelular de los receptores de citoquinas tipo I y tipo II. El término JAK se refiere a cualquiera de JAK1, JAK2, JAK3 o Tyk2, o cualquier combinación de los mismos. Cada JAK se asocia selectivamente con subunidades de receptor que se dimerizan (o multimerizan) para formar receptores funcionales. De acuerdo con J. D. Clark, et al., Discovery and Development of Janus Kinase (JAK) Inhibitors for Inflammatory Diseases, J. Med. Chem. 57(12), 5023-38 (2014), “el paso de activación se produce cuando una citoquina se une a su receptor, induciendo una multimerización (dimerización o complejos de orden superior) de las subunidades del receptor. Esto aproxima las JAK asociadas con cada subunidad, desencadenando una serie de eventos de fosforilación que en última instancia dan como resultado la fosforilación y activación de transductores de señales y activadores de proteínas de transcripción (STAT). Luego, un dímero STAT fosforilado se traslada al núcleo de la célula, donde se une a los genes diana que modulan su expresión”. Una vez en el núcleo, los STAT regulan la transcripción de genes de numerosos mediadores en el proceso inflamatorio mediante la unión a sitios de reconocimiento específicos en el ADN. Ver, por ejemplo, J. Med. Chem. 57(12), 5023-38 (2014), citado anteriormente. Hay considerables evidencias que demuestran la importancia de la vía JAK/STAT en enfermedades inflamatorias, autoinmunes y cáncer. Ver, por ejemplo, M. Coskun, et al., Involvement of JAK/STAT signaling in the pathogenesis of inflammatory bowel disease, Pharmacological Research 76, 1-8 (2013); y J. J. O'Shea, et al., JAKs and STATs in immunity, immunodeficiency, and cancer, The New England Journal of Medicine 368, 161-70 (2013).

Las enfermedades inflamatorias intestinales, incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (UC), se caracterizan por inflamación intestinal recurrente, alteración de la barrera epitelial y disbiosis microbiana. La respuesta inflamatoria excesiva en el tracto gastrointestinal está mediada por varias citoquinas proinflamatorias que incluyen TNFa, IFN-y, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-21 e IL-23 que ejercen sus efectos sobre las células del sistema inmunitario innato y adaptativo, incluyendo los linfocitos T y B, las células epiteliales, los macrófagos y las células dendríticas (DC). Ver, por ejemplo, Pharmacological Research 76, 1-8 (2013), citada anteriormente; S. Danese, et al., JAK inhibition using tofacitinib for inflammatory bowel disease treatment: A hub for multiple inflammatory cytokines, American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology 310, G155-62 (2016); y M. F. Neurath, Cytokines in inflammatory bowel disease, Nature Reviews Immunology 14, 329-42 (2014).

Es deseable la prevención y/o el control de dicha respuesta inflamatoria excesiva. A la luz del mecanismo de dicha respuesta como se ha resumido anteriormente, se concibe la inhibición de JAK (ver la ilustración en la FIG.

1 en forma de flecha dentada que muestra un inhibidor de pan-JAK que golpea la vía de señalización de JAK/STAT y la inflamación) para prevenir o controlar una respuesta inflamatoria excesiva. a los inhibidores de JAK que inhiben una pluralidad de tales proteínas JAK se hace referencia en la presente como inhibidores de pan-JAK. Se han observado ejemplos de beneficios terapéuticos de dicha prevención o control con el tofacitinib, un inhibidor de pan-JAK biodisponible por vía oral aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de la artritis reumatoide y actualmente en desarrollo clínico para la colitis ulcerosa. En un ensayo clínico de fase 2, se evaluó la eficacia clínica de 194 pacientes con colitis ulcerosa de moderada a grave. Ver, por ejemplo, , W. J. Sandborn, et al., Tofacitinib, an oral Janus kinase inhibitor, in active ulcerative colitis, The New England Journal of Medicine 367, 616-24 (2012). La información publicada sobre este ensayo indica que los pacientes que recibieron dosis dos veces al día (BID) de 0,5, 3, 10 y 15 mg lograron tasas de respuesta clínica del 32, 48, 61 y 78%, respectivamente, en comparación con el 42% observado con placebo. Se informó además que el criterio de valoración secundario de la remisión clínica (puntuación de Mayo <2) fue del 13, 33, 48 y 41% en comparación con el 10% observado en el placebo. Ver, por ejemplo, The New England Journal of Medicine 367, 616-24 (2012), citado anteriormente. En un ensayo clínico de fase 3 de UC, 88 de los 476 pacientes alcanzaron la remisión clínica después de 8 semanas de tratamiento con tofacitinib (10 mg BID) en comparación con 10 de 122 pacientes que recibieron tratamiento con placebo. Ver W. J. Sandborn, et al. Efficacy and safety of oral tofacitinib as induction therapy in patients with moderate-to-severe ulcerative colitis: results from 2 phase 3 randomised controlled trials, J. Crohns Colitis 10, S15-S(2016). Los informes sobre la enfermedad de Crohn indican que el tofacitinib también estaba en desarrollo para el tratamiento de la CD; sin embargo, se informó que se suspendió debido a que no se logró la eficacia clínica en un ensayo clínico de 4 semanas/Fase 2 para la CD de moderada a grave. Ver W. J. Sandborn, et al., A phase 2 study of tofacitinib, an oral Janus kinase inhibitor, in patients with Crohn's disease, Clinical gastroenterology and hepatology: The official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12, 1485-93 e2 (2014). En base a la bibliografía disponible públicamente consultada, actualmente no está claro si el fracaso de tofacitinib en la CD se relaciona con el diseño del estudio clínico, las diferencias mecánicas entre la UC y la CD o los eventos adversos sistémicos limitantes de la dosis. Ver, Pharmacological Research 76, 1-8 (2013), citada anteriormente; Clinical gastroenterology and hepatology: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12, 1485-93 e2 (2014), citada anteriormente; y C. J. Menet, et al., Triazolopyridines as selective JAK1 inhibitors: from hit identification to GLPG0634, J. Med. Chem. 57, 9323-42 (2014). A la luz de las características de este inhibidor de JAK, es deseable encontrar inhibidores de JAK adicionales para la prevención y/o el control de la respuesta inflamatoria excesiva.

Se informó de eventos adversos sistémicos con respecto a los ensayos clínicos de enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) tanto de fase 2 como de fase 3 con tofacitinib. Ver The New England Journal of Medicine 367, 616-24 (2012), citado anteriormente; Clinical gastroenterology and hepatology: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 12, 1485-93 e2 (2014), citado anteriormente; y J. Panes, et al. Efficacy and safety of oral tofacitinib for induction therapy in patients with moderate-to-severe Crohn's disease: results of a Phase 2b randomised placebo-controlled trial, J. Crohns Colitis 10, S18-519 (2016). Estos eventos adversos incluyen recuentos absolutos de neutrófilos (ANC) disminuidos, colesterol total elevado (lípidos de baja y alta densidad), perforación intestinal e infección. Tales eventos adversos son consistentes con los observados después del tratamiento con tofacitinib en pacientes con artritis reumatoide (RA) (ver, por ejemplo, J. M. Kremer, et al. The safety and efficacy of a JAK inhibitor in patients with active rheumatoid arthritis: Results of a double-blind, placebocontrolled phase IIa trial of three dosage levels of CP-690,550 versus placebo, Arthritis and Rheumatism 60, 1895­ 905 (2009)), algunos de los cuales probablemente resulten de la inhibición dependiente de JAK2 de EPO, TPO y factores estimulantes de colonias (csf-2 y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos)) y/o inhibición de IL-6 dependiente de JAK1. Ver, Arthritis and Rheumatism 60, 1895-905 (2009), citado anteriormente; y O. H. Nielsen, et al., Will novel oral formulations change the management of inflammatory bowel disease? Expert Opinion on Investigational Drugs 25, 709-18 (2016)

En referencia a la FIG. 1, un medicamento administrado por vía oral puede, en principio, seguir el tracto gastrointestinal desde la boca hasta el esófago (1), el estómago (2) a través del duodeno (3) al yeyuno (4), luego al íleon (5), y luego al colon (6). Las áreas de absorción relativas para estas diversas partes son de aproximadamente el 60% para el yeyuno (4), aproximadamente el 26% para el íleon (5) y aproximadamente el 13% para el colon (6). La absorción a través de estas varias regiones gastrointestinales puede llevar al inicio de una distribución sistémica que, a su vez, podría provocar efectos secundarios indeseables. El tracto gastrointestinal tiene una superficie muy grande. Ver, por ejemplo, H. F. Helander, et al., Surface area of the digestive tract - revisited, Scandinavian Journal of Gastroenterology 49(6), 681-89 (2014); y K. J. Filipski, et al., Intestinal Targeting of Drugs: Rational Design Approaches and Challenges Current Topics in Medicinal Chemistry 13, 776-802 (2013). Una superficie de absorción tan extensa favorece la distribución sistémica de sustancias que pueden atravesar las paredes de las varias partes del tracto intestinal y llegar al torrente sanguíneo y, a su vez, tienen el potencial de provocar efectos secundarios no deseados de una sustancia distribuida sistémicamente. La distribución sistémica está representada por flechas de línea discontinua en la FIG. 1 como permeando a través de las paredes del colon con propósitos ilustrativos simplificados, pero dicha distribución no se limita a las paredes del colon, ya que también puede tener lugar a través de las paredes de otras partes del tracto gastrointestinal mostrado en la FIG. 1, como las del intestino delgado. También se entiende que las líneas de flecha discontinua en la FIG. 1 representan la distribución sistémica más allá del tracto gastrointestinal, ya que se sabe que dicha distribución sistémica tiene lugar en referencia a la fisiología del tracto gastrointestinal, y que tales flechas de líneas discontinuas se refieren simplemente de manera ilustrativa esquemática a dicha distribución sistémica. Ver, por ejemplo, Current Topics in Medicinal Chemistry 13, 777-80 (2013), citado anteriormente, para una descripción del tejido intestinal, el transporte a través del mismo y el metabolismo.

Una de las principales razones del desgaste en los candidatos a fármacos es la seguridad y la tolerabilidad. Ver, por ejemplo, , I. Kola, et al., Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery 3, 711-5 (2004); M. J. Waring, et al., An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery 14, 475-86 (2015); M. Hay, et al., Clinical development success rates for investigational drugs, Nature Biotechnology 32, 40-51 (2014); y M. E. Bunnage, Getting pharmaceutical R&D back on target, Nature Chemical Biology 7, 335-9 (2011). Aumentar las concentraciones tisulares locales del compuesto en el tejido objetivo pretendido, a la vez que se limita la exposición a otros tejidos, puede reducir los efectos secundarios no deseados. Ver, por ejemplo, V. P. Torchilin, Drug targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences 11 Suppl 2, S81-91 (2000). Este concepto ha sido ampliamente aceptado para ciertas enfermedades y tejidos, como el ojo (ver, por ejemplo, R. Gaudana, et al., Ocular drug delivery, The AAPS Journal 12, 348-60 (2010)), piel (ver, por ejemplo, R. Folster-Holst, et al., Topical hydrocortisone 17-butyrate 21-propionate in the treatment of inflammatory skin diseases: pharmacological data, clinical efficacy, safety and calculation of the therapeutic index, Die Pharmazie 71, 115-21 (2016)), y pulmón (ver, por ejemplo, J. S. Patil, et al., Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review, Lung India: official organ of Indian Chest Society 29, 44-9 (2012)). Similar a estos enfoques dirigidos a tejidos, aumentar las concentraciones intestinales del fármaco a la vez que se limitan los niveles no deseados del fármaco en otros tejidos puede aumentar los márgenes de seguridad. Ver, por ejemplo, I. R. Wilding, et al., Targeting of drugs and vaccines to the gut, Pharmacology & Therapeutics 62, 97-124 (1994); D. Charmot, Nonsystemic drugs: a critical review, Current Pharmaceutical Design 18, 1434-45 (2012); y Current Topics in Medicinal Chemistry 13, at 780 (2013), citado anteriormente. La modulación selectiva de tejidos de los objetivos en el tejido gastrointestinal con compuestos que logran exposiciones sistémicas limitadas puede mejorar potencialmente el índice terapéutico de dichos compuestos para el tratamiento de enfermedades del tracto gastrointestinal, incluyendo la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Ver, por ejemplo, O. Wolk, et al., New targeting strategies in drug therapy of inflammatory bowel disease: mechanistic approaches and opportunities, Expert Opin. Drug Deliv. 10(9), 1275-86 (2013). El término "efectos sistémicos'' se usa en la presente para referirse a la exposición sistémica y los efectos de cualquier exposición sistémica, aunque no siempre sean los mismos.

Como algunos inhibidores de JAK conocidos tienen efectos adversos que están asociados con sus efectos sistémicos, es deseable encontrar nuevos inhibidores de JAK como sustancias activas para la prevención y/o control de la respuesta inflamatoria excesiva y cuyos efectos sistémicos se eliminen o reduzcan. Además, es deseable encontrar inhibidores de JAK con efectos locales sobre tejidos gastrointestinales para el tratamiento de afecciones como, pero no limitadas a, IBD, con efectos sistémicos reducidos. Debido al papel que desempeñan las varias proteínas JAK, además es deseable encontrar inhibidores de pan-JAK.

En principio, la orientación al tejido intestinal puede perseguirse de acuerdo con múltiples estrategias. Ver, por ejemplo, Current Topics in Medicinal Chemistry 13, en 780-95 (2013), citado anteriormente, que se refiere a enfoques que incluyen enfoques de propiedades fisicoquímicas, enfoques mediados por transporte, enfoques de profármacos y enfoques de formulación y tecnología. Sin embargo, se reconoce que “hay una serie de desafíos y peligros que son endémicos de los programas dirigidos a tejidos” y, en particular, a los compuestos dirigidos intestinalmente, como se describe en Current Topics in Medicinal Chemistry 13, en 795 (2013), citado anteriormente.

Las condiciones de IBD pueden extenderse a múltiples partes del tracto gastrointestinal. Aunque para propósitos ilustrativos simplificados solo se muestra un sitio de enfermedad colónica (10) en el colon descendente en la FIG. 1, la enfermedad inflamatoria intestinal puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal como es el caso de la enfermedad de Crohn, o en el recto y el colon, como en la colitis ulcerosa. Ver, por ejemplo, NIDDK NIDDK (National Institute of Diabetes, and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, US Department of Health and Human Services, <http://spotidoc.com/doc/71780/crohns-disease---national-digestivediseases-information>, consultado el 29 de noviembre de 2016. Los sitios de enfermedad de la IBD pueden ser, por ejemplo, ileal (localizado en el íleon), ileocólico (que afecta partes del íleon y el colon) y colónico (localizado en el colon), como se muestra ilustrativamente en el colon descendente en la FIG. 1). Por tanto, en ciertos escenarios de enfermedades, puede ser deseable una administración del fármaco a lo largo de la totalidad o una gran parte del tracto intestinal. En otros escenarios de enfermedades, puede ser deseable aumentar la concentración local en cualquier parte dada del tracto gastrointestinal. En otros escenarios más, podría ser deseable una combinación de estas dos formas de administración en diferentes sitios del tracto intestinal.

Uno de tales escenarios se centraría en la administración de una sustancia activa que tiene efectos sistémicos limitados debido a una absorción limitada al pasar por el tracto gastrointestinal, como lo ejemplifican las flechas de línea continua en la FIG. 1, mientras que está disponible para actuar en partes extensas del tracto gastrointestinal (GI), una característica a la que se hace referencia en la presente como "efectos GI locales". Debido a la reducción de los efectos sistémicos, podría evaluarse un intervalo más amplio de dosificaciones para dicha sustancia. Sería deseable además que dicha sustancia activa tuviera una baja permeabilidad, de manera que solo una pequeña cantidad pasase a través de la pared intestinal al torrente sanguíneo para limitar los efectos secundarios adversos no deseados cuando llega a áreas no objetivo.

Además, los inhibidores de JAK se contemplan como candidatos de tratamiento para otras enfermedades. Están concebidos para su uso en el tratamiento de afecciones oculares, incluyendo el ojo seco (B. Colligris, et al., Recent developments on dry eye disease treatment compound, Saudi J. Ophthalmol. 28(1), 19-30 (2014)), neoplasias mieloproliferativas, enfermedades mieloproliferativas (E. J. Baxter, et al., Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders, Lancet 365, 1054-1061 (2005); C. James, et al., A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera, Nature 434, 1144-1148 (2005); R. Kralovics, et al., A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders, N. Engl. J. Med. 352, 1779-1790 (2005); R. L. Levine, et al., Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis, Cancer Cell 7, 387-397 (2005); G. Wernig, et al., Efficacy of TG101348, a selective JAK2 inhibitor, in treatment of a murine model of JAK2V617F-induced polycythemia vera, Cancer Cell 13, 311-320 (2008)), síndrome mieloproliferativo, leucemia mieloide aguda, síndrome de respuesta inflamatoria sistémico, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, artritis idiopática juvenil (H. W. Li, et al., Effect of miR-19a and miR-21 on the JAK/STAT signaling pathway in the peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic juvenile idiopathic arthritis, Exp. Ther. Med. 11(6), 2531-2536 (2016)), reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad tipo IV, inflamación de la aorta, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, atrofia muscular espinal juvenil, retinopatía diabética, enfermedad renal diabética, incluyendo la nefropatía diabética (F. C. Brosius, et al., JAK inhibition in the treatment of diabetic kidney disease, Diabetologia 59(8), 1624-7, (2016); C. C. Berthier, et al., Enhanced expression of Janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathway members in human diabetic nephropathy, Diabetes 58(2), 469-77, (2009); E. N. Gurzov, et al., The JAK/STaT pathway in obesity and diabetes, FeBs J. 283(16), 3002-15 (2016)), microangiopathy, inflammation (M. Kopf, et al., Averting inflammation by targeting the cytokine environment, Nature Reviews Drug Discovery 9, 703-718 (2010); J. J. O'Shea, et al., A new modality for immunosuppression: targeting the JAK/STAT pathway, Nature Rev. Drug Discov.

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192(1), 59-72 (2014)), fiebre reumática aguda, síndrome de Sjogren, síndrome de Sjogren/enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad (T. Fujimura, et al., Significance of Interleukin-6/STAT Pathway for the Gene Expression of REG Ia, a New Autoantigen in Sjogren's Syndrome Patients, in Salivary Duct Epithelial Cells, Clin. Rev. Allergy Immunol. (prepublicación en línea)<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27339601>24 de junio de, 2016), trombocitopenia autoinmune, neuroinflamación, incluyendo la enfermedad de Parkinson (Z. Yan, et al., 3 de octubre de 2016, citada anteriormente). Se ha informado que los inhibidores de JAK tienen aplicaciones terapéuticas en el tratamiento del cáncer además de las enfermedades inflamatorias. (S. J. Thomas, et al., The role of JAK/STAT signaling in the pathogenesis, prognosis and treatment of solid tumors, British J. Cancer 113, 365-71 (2015); A. Kontzias, et al., Jakinibs: A new class of kinase inhibitors in cancer and autoimmune disease, Current Opinion in Pharmacology, 12(4), 464-70 (agosto de 2012); M. Pesu, et al., Therapeutic targeting of JANUS kinases, Immunological Reviews, 223, 132-42 (junio de 2008); P. Norman, Selective JAK inhibitors in development for rheumatoid arthritis, Expert Opinion on Investigational Drugs, 23(8), 1067-77 (agosto de 2014)). Además, los inhibidores de JAK podrían ser útiles en la prevención del cáncer colorrectal porque la reducción de la inflamación en el colon podría llevar a la prevención del cáncer en dicho órgano.

La WO 2011/086053 A1 describe compuestos que "pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables y usarse para el tratamiento de trastornos inmunológicos o hiperproliferativos".

La WO 2013/007765 A1 describe compuestos que "pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables y usarse para el tratamiento de trastornos inmunológicos o hiperproliferativos".

Mark Zak et al. describe "el descubrimiento basado en la estructura de una fracción de hidroxietilo C-2 que proporcionó consistentemente niveles altos de selectividad para JAK1 sobre JAK2 a la serie de imidazopirrolopiridina de inhibidores de JAK1" en la 'identificación de imidazopirrolo-piridinas de hidroxietilo C-2 como potentes inhibidores de JAK1 con propiedades fisicoquímicas favorables y alta selectividad sobre JAK2' Journal of Medicinal Chemistry, vol.56, N° 11,31 de mayo de 2013, páginas 4764-4785.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a los siguientes compuestos:

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida; 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamida;

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)acetamida;

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida; 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos y combinaciones de los mismos.

Se pretende que el término "compuestos de la invención" y "compuesto de la invención" abarque por lo menos un compuesto seleccionado del grupo anterior de compuestos, ya sea en forma libre de solventes o en cualquiera de las formas hidratadas y/o solvatadas como se ilustra en la presente.

Las realizaciones de la presente invención se refieren a compuestos y composiciones farmacéuticas que los contienen. Se divulgan métodos para elaborarlos y purificarlos, métodos para usarlos como inhibidores de JAK y métodos para usarlos en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones mediados por JAK.

Las realizaciones de esta invención muestran efectos de inhibición de pan-JAK con efectos de GI locales y efectos sistémicos bajos o insignificantes. Además, las realizaciones de esta invención con tales características pueden administrarse por vía oral.

En la presente se divulgas un método para tratar a un sujeto que padece o al que se le ha diagnosticado una enfermedad, trastorno o afección médica mediada por JAK usando compuestos de la invención o agentes activos de la invención.

Las realizaciones, características y ventajas adicionales de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada ya través de la puesta en práctica de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.

Diagrama esquemático de parte del tracto gastrointestinal humano, que se muestra como una representación extendida no a escala. El duodeno (3), el yeyuno (4) y el íleon (5) (todos mostrados esquemáticamente) forman el intestino delgado después del estómago (2) y el esófago (1). El intestino grueso comprende el colon (6), que a su vez incluye el ciego (7) y el apéndice (no mostrado), el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide (no se muestra el giro en el mismo) y el recto (11). El colon transverso es la parte comprendida entre los ángulos colónicos derecho (8) e izquierdo (9), el colon ascendente se extiende desde el ciego (7) hasta el ángulo colónico derecho (8), y el colon descendente se extiende desde el ángulo colónico izquierdo (9) al recto (11). Se ilustran varios patrones de distribución en referencia al colon por conveniencia, pero también pueden referirse a otras partes del tracto gastrointestinal. La distribución sistémica está representada por flechas de línea discontinua en la FIG. 1 como permeando a través de las paredes del colon con propósitos ilustrativos simplificados, pero dicha distribución no se limita a las paredes del colon, ya que también puede tener lugar a través de las paredes de otras partes del tracto gastrointestinal mostrado en la FIG.

1, como las del intestino delgado. La distribución con cierta penetración tisular se representa mediante flechas de línea sólida en la FIG. 1 como penetrando en el tejido del colon con propósitos ilustrativos simplificados, pero dicha penetración no se limita al tejido del colon, ya que también puede tener lugar en el tejido de otras partes del tracto gastrointestinal que se muestra en la FIG. 1, como el tejido del intestino delgado. El efecto de una realización de un inhibidor de JAK de acuerdo con esta invención se muestra ilustrativamente como una interrupción de la vía de señalización de JAK/STAT que, de otro modo, llevaría a una inflamación asociada con una enfermedad inflamatoria intestinal ("IBD"), como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa. A modo de ejemplo, pero no como limitación, se muestra ilustrativamente un sitio de enfermedad como un sitio de enfermedad colónica (10) en el colon descendente.

Figura 2.

Diagrama esquemático que muestra la preparación/interconversión de realizaciones del compuesto de Ej. 1. Figura 3.

Superposición de patrones de difracción de rayos X en polvo de alto rendimiento (HT-XRPD) para las siguientes realizaciones del compuesto de Ej. 1, de abajo hacia arriba: 1s, 2 (obtenido por equilibrio a temperatura ambiente en 1,4-dioxano), 3b (obtenido por termociclado en ciclohexanona), 1b+4 (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala pl en metanol/agua (50/50, v/v), 5 (obtenido por termociclado en cloroformo), 6 (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala ml en acetonitrilo), 7 (obtenido de 1s+7, obtenido a su vez por equilibrio de solventes en heptano), 7 (obtenido por desolvatación de 1s+7, obtenido a su vez por equilibro de solventes en heptano), 8 (obtenido por desolvatación de la realización 5 mediante calorimetría diferencial de barrido cíclica) y 9 (obtenido por desolvatación de la realización 2 mediante calorimetría diferencial de barrido cíclica).

Figura 4.

Superposición de patrones de difracción de rayos X en polvo de alto rendimiento (HT-XRPD) para las siguientes realizaciones del compuesto de Ej. 1, de abajo hacia arriba: 1s (material de partida), 1a (obtenido después de la exposición a condiciones de envejecimiento acelerado (AAC) (40° C y 70% de humedad relativa) varias formas de muestras de realización), 1b (obtenido por equilibrio de solventes a temperatura ambiente en tolueno), 1c (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala pl en acetato de etilo/1,4-dioxano (50/50, v/v)), 1d (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala de pl en acetonitrilo/cloroformo (50/50, v/v)), 1e (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala de pl en acetato de etilo/1,4-dioxano (50/50, v/v)), 1f (obtenido por equilibrio de solventes a temperatura ambiente en p-xileno), 1 g (obtenido por equilibro de solventes a 50° C en anisol),

Figura 5.

Superposición de patrones de difracción de rayos X en polvo de alto rendimiento (HT-XRPD) para las siguientes realizaciones del compuesto de Ej. 1, de abajo hacia arriba: 1s, 3b (obtenido por termociclado en ciclohexanona), 3c (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala de pl en 1,4-dioxano), 3d (obtenido por cristalización por enfriamiento a escala de pl en tetrahidrofurano) y 3e (obtenido por termociclado en isobutanol).

Figura 6.

Difractogramas de HR-XRPD de la realización 1s en su forma inicial ("1s"), después de una exposición de cuatro días a 40° C y 70% de humedad relativa ("1s 70 HR"), y después de una exposición de cuatro días a 25° C y 100% de humedad relativa ("10").

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se usa en la presente, los términos "que incluye", "que contiene" y "que comprende" se usan en su sentido abierto y no limitativo.

Se pretende que cualquier fórmula proporcionada en la presente represente compuestos que tienen estructuras representadas por la fórmula estructural, así como ciertas variaciones o formas. Ciertas estructuras pueden existir como tautómeros. Además, también se contemplan como partes de esta invención una forma amorfa, hidratos, solvatos, polimorfos y pseudopolimorfos de tales compuestos de esta invención, y mezclas de los mismos. Las realizaciones de esta invención están en forma libre de solvente o en cualquiera de las formas hidratadas y/o solvatadas como se ilustra en la presente.

La referencia a un compuesto en la presente significa una referencia a cualquiera de: (a) la forma realmente citada de dicho compuesto, y (b) cualquiera de las formas de dicho compuesto en el medio en el que se considera el compuesto cuando se nombra. Por ejemplo, la referencia en la presente a un compuesto como R-COOH abarca la referencia a cualquiera de, por ejemplo, R-COOH^(s), R-COOH^(sol) y R-COO^-(sol). En este ejemplo, R-COOH^(s) se refiere al compuesto sólido, como podría ser, por ejemplo, en un comprimido o alguna otra composición o preparación farmacéutica sólida; R-COOH^(sol) se refiere a la forma no disociada del compuesto en un solvente; y R-COO^{- (sol)} se refiere a la forma disociada del compuesto en un solvente, como la forma disociada del compuesto en un ambiente acuoso, ya sea que dicha forma disociada se derive de R-COOH, de una sal del mismo o de cualquier otra entidad que produzca R-COO- tras la disociación en el medio que se está considerando. En otro ejemplo, una expresión como "exponer una entidad al compuesto de fórmula R-COOH" se refiere a la exposición de dicha entidad a la forma o formas del compuesto R-COOH que existe, o existen, en el medio en que se produce tal exposición. En otro ejemplo más, una expresión como "hacer reaccionar una entidad con un compuesto de fórmula R-COOH" se refiere a la reacción de (a) dicha entidad en la forma o formas químicamente relevantes de dicha entidad que existe, o existen, en el medio en el que tiene lugar dicha reacción, con (b) la forma o formas químicamente relevantes del compuesto R-COOH que existe, o existen, en el medio en el que tiene lugar dicha reacción. A este respecto, si tal entidad está por ejemplo en un medio acuoso, se entiende que el compuesto R-COOH está en ese mismo medio, y por lo tanto la entidad se está exponiendo a especies como R-COOH^(ac) y/o R— COO^{- (ac)}, donde el subíndice “(ac)” significa “acuoso” de acuerdo con su significado convencional en química y bioquímica. En estos ejemplos de nomenclatura se ha elegido un grupo funcional de ácido carboxílico; sin embargo, no se pretende que esta elección sea una limitación, sino que es simplemente una ilustración. Se entiende que pueden proporcionarse ejemplos análogos en términos de otros grupos funcionales, incluyendo pero no limitados a, hidroxilo, miembros nitrogenados básicos, como los de las aminas, y cualquier otro grupo que interactúe o se transforme de acuerdo con maneras conocidas en el medio que contiene el compuesto. Tales interacciones y transformaciones incluyen, pero no se limitan a, disociación, asociación, tautomerismo, solvólisis, incluyendo la hidrólisis, solvatación, incluyendo la hidratación, protonación y desprotonación. No se proporcionan ejemplos adicionales a este respecto porque estas interacciones y transformaciones en un medio dado con conocidas por los expertos en la técnica.

También se pretende que cualquier fórmula dada en la presente represente formas no marcadas así como formas marcadas isotópicamente de los compuestos. Los compuestos marcados isotópicamente tienen estructuras representadas por las fórmulas dadas en la presente, excepto que uno o más átomos se reemplazan por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa seleccionado en una forma enriquecida. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los compuestos de la invención en una forma que excede las abundancias naturales incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno y oxígeno como ²H, ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, respectivamente. Tales compuestos marcados isotópicamente son útiles en estudios metabólicos (preferiblemente con ¹⁴C), estudios cinéticos de reacción (con, por ejemplo, deuterio (es decir, D o ²H); o tritio (es decir, T o ³H)), técnicas de detección o imagenología [como la tomografía por emisión de positrones (PET) o la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT)], incluyendo los ensayos de distribución de fármacos o sustratos en tejidos, o en el tratamiento radiactivo de pacientes. En particular, puede preferirse particularmente un compuesto marcado con ¹⁸F o ¹¹C para estudios PET o SPECT. Además, la sustitución con isótopos más pesados como el deuterio (es decir, ²H) puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una vida media local in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos. Los compuestos marcados isotópicamente de esta invención pueden prepararse generalmente llevando a cabo los procedimientos divulgados en los esquemas o en los ejemplos y las preparaciones descritas a continuación sustituyendo un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible por un reactivo no marcado isotópicamente.

Los "tautómeros" se refieren a compuestos que son formas intercambiables de una estructura de compuesto particular y que varían en el desplazamiento de átomos de hidrógeno y electrones. Por tanto, dos estructuras que tienen un miembro H en diferentes posiciones pueden estar en equilibrio y satisfacer las reglas de valencia. Por ejemplo, los enoles y las cetonas son tautómeros porque se interconvierten rápidamente mediante el tratamiento con ácidos o bases.

Cuando se hace referencia a cualquier fórmula proporcionada en la presente, no se pretende que la selección de una fracción particular de una lista de posibles especies para una variable específica defina la misma elección de la especie para la variable que aparece en otro lugar. En otras palabras, cuando una variable aparece más de una vez, la elección de la especie de una lista específica es independiente de la elección de la especie para la misma variable en otra parte de la fórmula, a menos que se indique lo contrario.

A modo de primer ejemplo sobre la terminología de los sustituyentes, si el sustituyente S^1ejemplo es uno de

S¹ y S², y el sustituyente S^2ejemplo es uno de S³ y S⁴, entonces estas asignaciones se refieren a realizaciones de esta invención dadas de acuerdo con las opciones S^1ejemplo es S¹ y S^2ejemplo es S³ ; S^1ejemplo es S¹ y S^2ejemplo es S⁴ ; S^1ejemplo es S² y S^2ejemplo es S³ ; S^1ejemplo es S² y S^2ejemplo es S⁴ ; y equivalentes de cada una de tales opciones. La terminología más corta “Se ^jemplo es uno de S¹ y S², y S^2ejemplo es uno de S³ y S⁴” se usa en la presente en aras de la brevedad, pero no a modo de limitación. Se pretende que el primer ejemplo anterior sobre terminología de sustituyentes, que se expone en términos genéricos, ilustre las varias asignaciones de sustituyentes descritas en la presente.

Además, cuando se proporciona más de una asignación para cualquier miembro o sustituyente, las realizaciones de esta invención comprenden las varias agrupaciones que puedan realizarse a partir de las asignaciones enumeradas, tomadas de manera independiente, y equivalentes de las mismas. A modo de segundo ejemplo de terminología de sustituyentes, si se describe en la presente que el sustituyente S^ejemplo es uno de S¹, S² y

S³, este listado se refiere a realizaciones de esta invención para las que S^ejemplo es S¹; S^ejemplo es S² ; S^ejemplo es S³ ;

S^ejemplo es uno de S¹ y S² ; S ^ejemplo es uno de S¹ y S³ ; S^ejemplo es uno de S² y S³ ; S^ejemplo es uno de S¹, S² y S³ ; y S^ejemplo es cualquier equivalente de cada una de estas opciones. La terminología más corta "S^ejemplo es uno de S¹, S² y S³ " se usa por lo tanto en la presente en aras de la brevedad, pero no a modo de limitación. Se pretende que el segundo ejemplo anterior sobre terminología de sustituyentes, que se expone en términos genéricos, ilustre las varias asignaciones de sustituyentes descritas en la presente.

Los siguientes inhibidores de JAK son realizaciones ilustrativas de la invención:

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4

il)metil)acetamida;

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)acetamida;

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida; y

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida.

Realizaciones adicionales de la invención son sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos dados anteriormente.

Las realizaciones adicionales de la invención son composiciones farmacéuticas que cada una comprenden una cantidad eficaz de por lo menos uno de los compuestos dados anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal de un compuesto que no es tóxico, es biológicamente tolerable o es biológicamente adecuado de otro modo para su administración al sujeto. Ver, en general, S. M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66, 1-19 (1977), and Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use, Stahl and Wermuth, Eds., Wiley-VCH and VHCA, Zurich, 2002. Los compuestos de la invención pueden poseer un grupo suficientemente ácido, un grupo suficientemente básico, o ambos tipos de grupos funcionales, y por consiguiente reaccionan con una serie de bases inorgánicas u orgánicas y ácidos inorgánicos y orgánicos para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sulfatos, pirosulfatos, bisulfatos, sulfitos, bisulfitos, fosfatos, monohidrogenofosfatos, dihidrogenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloruros, bromuros, yoduros, acetatos, propionatos, decanoatos, caprilatos, acrilatos, formiatos, isobutiratos, caproatos, heptanoatos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, suberatos, sebacatos, fumaratos, maleatos, butino-1,4-dioatos, hexino-1,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzoatos, dinitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, xilenosulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, Y-hidroxibutiratos, glicolatos, tartratos, metanosulfonatos, propanosulfonatos, naftaleno-1-sulfonatos, naftaleno-2- sulfonatos y mandelatos.

Si el compuesto de la invención contiene por lo menos un nitrógeno básico, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier método adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido nítrico, ácido bórico y ácido fosfórico, o con un ácido orgánico, como ácido acético, ácido fenilacético, ácido propiónico, ácido esteárico, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido isetiónico, ácido succínico, ácido valérico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido láurico, un ácido piranosidilo, como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un ácido alfa-hidroxi, como ácido mandélico, ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, como ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido naftoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico, como ácido laurilsulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, cualquier mezcla compatible de ácidos como los que se dan como ejemplos en la presente, y cualquier otro ácido y mezcla de los mismos que se consideren equivalentes o sustitutos aceptables a la luz del nivel ordinario de capacidad en esta tecnología.

No todas las realizaciones de sales farmacéuticamente aceptables de compuestos de acuerdo con esta invención pueden ser igualmente adecuadas para su desarrollo, para compuestos que son suficientemente débilmente básicos (por ejemplo, pK^a de aproximadamente 4) podría no formar sales suficientemente estables para propósitos de desarrollo. Ver, por ejemplo, G. A. Stephenson, et al., J. Pharm. Sciences 100(5), 1607-17 (2011) “Physical stability of salts of weak bases in the solid state”. Se prevé que algunas realizaciones de esta invención abarquen formas cocristalizadas de un compuesto de acuerdo con esta invención con un formador de cocristales adecuado. El diseño y las propiedades de los cocristales para uso farmacéutico y los métodos para elaborarlos y caracterizarlos se han proporcionado, por ejemplo, en N. Shan, et al., Drug Discovery Today, 13(9/10), 440-46 (2008) “The role of cocrystals in pharmaceutical science”; N. Qiao, et al., Intl. J. Pharmaceutics, 419, 1-11 (2011) “Pharmaceutical cocrystals: An overview”; R. Thakuria, et al., Intl. J. Pharmaceutics, 453, 101-25 (2013) “Pharmaceutical cocrystals and poorly soluble drugs”.

Los compuestos de la invención, incluyendo sus sales farmacéuticamente aceptables, ya sea solos o en combinación (colectivamente, "agente activo" o "agentes activos") son útiles como inhibidores de JAK en los métodos de la invención. Tales métodos para modular la actividad de JAK comprenden exponer JAK a una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto químico de la invención.

El inhibidor de JAK puede usarse en un sujeto al que se le ha diagnosticado o que padece una enfermedad, trastorno o afección médica mediada por la actividad de JAK, como las descritas en la presente. Se pretende que los síntomas o estados de enfermedad estén incluidos dentro del alcance de "enfermedades, trastornos o afecciones médicas".

Por consiguiente, los agentes activos descritos en la presente pueden usarse para tratar sujetos a los que se les ha diagnosticado o que padecen una enfermedad, trastorno o afección médica mediada por JAK. Se pretende que el término "tratar" o "que trata" como se usa en la presente se refiera a la administración de un agente activo o una composición de la invención a un sujeto con el propósito efectuar un beneficio terapéutico o profiláctico a través de la modulación de JAK. El tratamiento incluye revertir, mejorar, aliviar, inhibir el progreso, disminuir la gravedad, reducir o prevenir una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de dicha enfermedad, trastorno o afección mediados por la modulación de la actividad de JAK. El término "sujeto" se refiere a un paciente mamífero con necesidad de dicho tratamiento, como un humano. El término "inhibidores" o "inhibidor" se refiere a compuestos que disminuyen, previenen, inactivan, desensibilizan o regulan por disminución la expresión o actividad de JAK.

Las realizaciones de esta invención proporcionan inhibidores de JAK para la prevención y/o el control de una respuesta inflamatoria excesiva. Las realizaciones de inhibidores de JAK de acuerdo con esta invención son inhibidores de pan-JAK.

A menos que se indique lo contrario, el término "propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK" se refiere a las propiedades nombradas correspondientes de la siguiente manera:

como se proporciona en la descripción de los compuestos de Ej. 1-12, en el caso de masas molares;

como se determina de acuerdo con las definiciones respectivas, en el caso de números de donantes de enlaces, aceptores y enlaces giratorios de H; y

como se mide con referencia a la Tabla 1a, columna 2, en el caso de las concentraciones en plasma, y la Tabla 7, columnas 3 y 4, en el caso de los coeficientes de permeabilidad A-B en presencia del inhibidor de P-gp y los coeficientes de permeabilidad B-A.

En la presente se divulgan métodos para inhibir JAK, que comprenden exponer un receptor JAK a un inhibidor de JAK que se caracteriza por tener las siguientes propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK: una concentración en plasma en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ ml, cLogP en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,8, coeficientes de permeabilidad A-B en presencia de un inhibidor de P-gp en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5, coeficientes de permeabilidad B-A en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20, tPSA en el intervalo de aproximadamente 85 a aproximadamente 120.

En métodos para inhibir JAK, la concentración en plasma está en el intervalo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml.

En métodos para inhibir JAK, cLogP está en el intervalo de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,4. En métodos para inhibir JAK, el coeficiente de permeabilidad A-B en presencia de un inhibidor de P-gp está en el intervalo de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 1,5.

En métodos para inhibir JAK, el coeficiente de permeabilidad B-A está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5.

En métodos para inhibir JAK, el tPSA está en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 120.

En la presente se divulgan métodos para inhibir JAK, que comprenden exponer un receptor de JAK a un inhibidor de JAK que se caracteriza además por tener las siguientes propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK: una masa molar en el intervalo de aproximadamente 300 g mol-1 a aproximadamente 500 g mol-1, una cantidad de donantes de enlaces de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, una cantidad de aceptores de enlaces de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 5, y una cantidad de enlaces giratorios en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, además de las concentraciones en plasma, los valores de clogP, los coeficientes de permeabilidad y los valores de tPSA descritos anteriormente para las metodologías de inhibición de JAK de acuerdo con esta invención.

En métodos para inhibir JAK, la masa molar está en el intervalo de aproximadamente 340 g mol-1 a aproximadamente 430 g mol-1.

En métodos para inhibir JAK, el número de enlaces giratorios está en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.

Las realizaciones de esta invención pueden usarse en métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal de un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de JAK que se caracteriza por tener las siguientes propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK: una concentración en plasma en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ml, cLogP en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,8, coeficientes de permeabilidad A-B en presencia de un inhibidor de P-gp en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5, coeficientes de permeabilidad B-A en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20, tPSA en el intervalo de aproximadamente 85 a aproximadamente 120.

En métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, la concentración en plasma está en el intervalo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml.

En métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, cLogP está en el intervalo de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,4.

En métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, el coeficiente de permeabilidad A-B en presencia de un inhibidor de P-gp está en el intervalo de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 1,5.

Ene métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, el coeficiente de permeabilidad B-A está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5.

En métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, tPSA está en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 120.

En la presente se divulgan métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal de un sujeto en donde las propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK se caracterizan además por tener las siguientes propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK: una masa molar en el intervalo de aproximadamente 300 g mol-1 a aproximadamente 500 g mol-1, una cantidad de donantes de enlaces de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, una cantidad de aceptores de enlaces de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 5, y una cantidad de enlaces giratorios en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, además de las concentraciones en plasma, valores de cLogP, coeficientes de permeabilidad y valores de tPSA descritos anteriormente para las metodologías de tratamiento de la inflamación de acuerdo con esta invención.

En métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, la masa molar está en el intervalo de aproximadamente 350 g mol-1 a aproximadamente 430 g mol-1.

En métodos para tratar la inflamación en el tracto gastrointestinal, el número de enlaces giratorios está en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.

En la presente se divulgan inhibidores de JAK que tienen las siguientes propiedades fisicoquímicas de JAK: una concentración en plasma en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ml, un cLogP en el intervalo de 0,1 a aproximadamente 2,8, un coeficiente de permeabilidad A-B en presencia de un inhibidor de P-gp en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5, un coeficiente de permeabilidad B-A en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20, y un tPSA en el intervalo de aproximadamente 85 a aproximadamente 120.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen una concentración en plasma que está en el intervalo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen valores de cLogP en el intervalo de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,4.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen un coeficiente de permeabilidad A-B en presencia de un inhibidor de P-gp en el intervalo de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 1,5.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen un coeficiente de permeabilidad B-A en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen valores de tPSA en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 120.

En la presente se divulgan inhibidores de JAK que tienen las siguientes propiedades fisicoquímicas del inhibidor de JAK: una masa molar en el intervalo de aproximadamente 300 g mol-1 a aproximadamente 500 g mol-1, una cantidad de donantes de enlaces de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, un número de aceptores de enlaces de hidrógeno en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 5, y un número de enlaces giratorios en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 además de las concentraciones en plasma, valores de cLogP, coeficientes de permeabilidad y valores de tPSA descritos anteriormente para los inhibidores de JAK de acuerdo con esta invención.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen una masa molar que está en el intervalo de aproximadamente 350 g mol-1 a aproximadamente 430 g mol-1.

En la presente se divulgan además inhibidores de JAK que tienen un número de enlaces giratorios en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.

En los métodos de tratamiento, se administra una cantidad eficaz de por lo menos un agente activo de acuerdo con la invención a un sujeto que padece o al que se le ha diagnosticado dicha enfermedad, trastorno o afección médica. Una "cantidad eficaz" significa una cantidad o dosis suficiente para generar generalmente el beneficio terapéutico o profiláctico deseado en pacientes con necesidad de dicho tratamiento para la enfermedad, trastorno o afección médica designada. Las cantidades o dosis eficaces de los agentes activos de la presente invención pueden determinarse mediante métodos rutinarios como modelado, estudios de escalamiento de dosis o ensayos clínicos, y tomando en consideración factores rutinarios, por ejemplo, el modo o vía de administración o administración del fármaco, la farmacocinética del agente, la gravedad y el curso de la enfermedad, trastorno o afección, la terapia previa o en curso del sujeto, el estado de salud del sujeto y la respuesta a los fármacos, y el juicio del médico tratante. Para un humano de 70 kg, un intervalo ilustrativo para una cantidad de dosificación adecuada es de aproximadamente 1 a 1000 mg/día en unidades de dosificación individuales o múltiples.

Las realizaciones de esta invención son nuevos inhibidores de JAK como sustancias activas para la prevención y/o control de la respuesta inflamatoria excesiva y cuyos efectos sistémicos son eliminados o reducidos. Realizaciones adicionales de esta invención son inhibidores de JAK con efectos locales sobre tejidos gastrointestinales para el tratamiento de afecciones como, pero no limitadas a, IBD, sin provocar efectos sistémicos o con tales efectos sistémicos aceptablemente reducidos.

Las realizaciones de esta invención son inhibidores de JAK de baja permeabilidad. Realizaciones adicionales de esta invención son inhibidores de JAK que tienen solubilidad acuosa.

Una vez que se ha producido una mejoría de la enfermedad, el trastorno o la afección del paciente, la dosis puede ajustarse para un tratamiento preventivo o de mantenimiento. Por ejemplo, la dosificación o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse en función de los síntomas, hasta un nivel en el que se mantenga el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Por supuesto, si los síntomas se han aliviado a un nivel apropiado, el tratamiento puede suspenderse. Sin embargo, los pacientes pueden requerir un tratamiento intermitente a largo plazo ante cualquier recurrencia de los síntomas.

Además, se concibe el uso de los compuestos de la invención solos, en combinación con uno o más de los otros compuestos de esta invención, o en combinación con ingredientes activos adicionales en el tratamiento de las afecciones que se analizan a continuación. Los ingredientes activos adicionales pueden coadministrarse por separado con por lo menos un compuesto de la invención, con agentes activos de la invención o incluirse con dicho agente en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. En una realización ilustrativa, los ingredientes activos adicionales son aquellos que se sabe o se descubre que son eficaces en el tratamiento de afecciones, trastornos o enfermedades mediadas por la actividad de JAK, como otro inhibidor de JAK o un compuesto activo contra otro objetivo asociado con la afección, trastorno o enfermedad particular. La combinación puede servir para aumentar la eficacia (por ejemplo, incluyendo en la combinación un compuesto que potencie la potencia o eficacia de un agente de acuerdo con la invención), disminuir uno o más efectos secundarios, o disminuir la dosis requerida del agente activo de acuerdo con la invención.

Cuando se hace referencia a la inhibición del objetivo, una "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para afectar a la actividad de por lo menos una de las proteínas de la familia JAK. La medición de la actividad del objetivo puede realizarse mediante métodos analíticos rutinarios.

Se concibe el uso de los agentes activos de la invención, solos o en combinación con uno o más ingredientes activos adicionales, para formular composiciones farmacéuticas de la invención. Una composición farmacéutica de la invención comprende una cantidad eficaz de por lo menos un agente activo de acuerdo con la invención.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados comúnmente en las composiciones farmacéuticas son sustancias que no son tóxicas, son biológicamente tolerables y de otro modo biológicamente adecuadas para su administración a un sujeto, como una sustancia inerte, añadida a una composición farmacológica o usada de otro modo como vehículo, portador o diluyente para facilitar la administración de un agente y que es compatible con el mismo. Los ejemplos de tales excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las formas de administración de las composiciones farmacéuticas que contienen una o más unidades de dosificación de los agentes activos pueden prepararse usando excipientes farmacéuticamente aceptables y técnicas de composición conocidas o que están disponibles para los expertos en la técnica. Las composiciones pueden administrarse en los métodos de la invención mediante una vía de administración adecuada, por ejemplo, vía oral, parenteral, rectal, tópica u ocular, o mediante inhalación.

La preparación puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, bolsitas, grageas, polvos, gránulos, pastillas para chupar, polvos para reconstitución, preparaciones líquidas o supositorios. Las composiciones pueden formularse para cualquiera de una pluralidad de vías de administración como infusión intravenosa, inyección subcutánea, administración tópica o administración oral. Preferiblemente, las composiciones pueden formularse para administración oral.

Para la administración oral, los agentes activos de la invención pueden proporcionarse en forma de comprimidos, cápsulas o perlas, o como una solución, emulsión o suspensión. Para preparar las composiciones orales, los agentes activos pueden formularse para proporcionar una dosificación, por ejemplo, para un humano de 70 kg, de aproximadamente 1 a 1000 mg/día en unidades de dosificación individuales o múltiples como un intervalo ilustrativo.

Los comprimidos orales pueden incluir el o los ingredientes activos mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables compatibles, como diluyentes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes. Las cargas inertes adecuadas incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, lactosa, almidón, azúcar, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los excipientes orales líquidos ejemplares incluyen etanol, glicerol, agua y similares. El almidón, la polivinilpirrolidona (PVP), el glicolato sódico de almidón, la celulosa microcristalina y el ácido algínico son ejemplos de agentes disgregantes. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina. El agente lubricante, si lo hay, puede ser estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si es deseado, los comprimidos pueden recubrirse con un material como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal, o pueden recubrirse con un recubrimiento entérico. Los recubrimientos adicionales que pueden usarse incluyen recubrimientos que están diseñados para liberar el compuesto o agente activo en función del tiempo, el pH o el contenido bacteriano.

Las cápsulas para administración oral incluyen gelatina dura y blanda o cápsulas de (hidroxipropil)metilcelulosa. Para preparar cápsulas de gelatina dura, el o los ingredientes activos pueden mezclarse con un diluyente sólido, semisólido o líquido. Las cápsulas de gelatina blanda pueden prepararse mezclando el ingrediente activo con un aceite como aceite de cacahuete o aceite de oliva, parafina líquida, una mezcla de mono- y diglicéridos de ácidos grasos de cadena corta, polietilenglicol 400 o propilenglicol. Los líquidos para administración oral pueden estar en forma de suspensiones, soluciones, emulsiones o jarabes o pueden liofilizarse o presentarse como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales composiciones líquidas pueden contener opcionalmente: excipientes farmacéuticamente aceptables como agentes de suspensión (por ejemplo, sorbitol, metilcelulosa, alginato de sodio, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio y similares); vehículos no acuosos, por ejemplo, aceite (por ejemplo, aceite de almendras o aceite de coco fraccionado), propilenglicol, alcohol etílico o agua; conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico); agentes humectantes como lecitina; y, si se desea, agentes aromatizantes o colorantes.

Los agentes activos de esta invención también pueden administrarse por vías no orales. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse para administración rectal como un supositorio, enema o espuma. Para uso parenteral, incluyendo las vías intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, los agentes de la invención pueden proporcionarse en soluciones o suspensiones acuosas estériles, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados o en un aceite aceptable por vía parenteral. Los vehículos acuosos adecuados incluyen solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. Tales formas pueden presentarse en forma de dosis unitaria, como ampollas o dispositivos de inyección desechables, en formas multidosis, como viales de los que puede extraerse la dosis adecuada, o en forma sólida o preconcentrada que puede usarse para preparar una formulación inyectable. Las dosis de infusión representativas varían de aproximadamente 1 a 1000 pg/kg/minuto de agente mezclado con un portador farmacéutico durante un periodo que varía de varios minutos a varios días.

Para administración tópica, los agentes pueden mezclarse con un portador farmacéutico a una concentración de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 20% de fármaco a vehículo, preferiblemente del 0,1% al 10%. Otro modo de administrar los agentes de la invención puede utilizar una formulación de parche para efectuar la administración transdérmica.

Los agentes activos pueden administrarse alternativamente en los métodos de esta invención por inhalación, por vía nasal o por vías orales, por ejemplo, en una formulación de pulverización que también contiene un portador adecuado.

Las realizaciones de la invención pueden usarse en un método para tratar a un sujeto que padece o al que se le ha diagnosticado una enfermedad, trastorno o afección médica mediada por JAK, que comprende administrar al sujeto con necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz del agente activo.

En ciertos métodos, la enfermedad, trastorno o afección médica es una enfermedad intestinal inflamatoria, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.

Las realizaciones de esta invención pueden usarse en un método para modular la actividad de JAK, incluso cuando dicha quinasa está en un sujeto, que comprende exponer JAK a una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto seleccionado de los compuestos de la invención.

Los compuestos de la invención son útiles como inhibidores de JAK que pueden dosificarse por vía oral y distribuirse específicamente al tejido intestinal a la vez que se mantienen exposiciones sistémicas bajas. Esto contrasta con la mayoría de los inhibidores de JAK conocidos que se dosifican por vía oral y se distribuyen a muchos tejidos debido al hecho de que tienen una exposición sistémica extensa.

La Tabla 1a y la Tabla 1b muestran los resultados de los experimentos in vivo. Estos resultados comprenden concentraciones en plasma y tejido de colon para quince compuestos que se habían administrado a ratones como se describe en los Protocolos 1, 2 o 3. Los resultados de concentración en plasma y colon se obtuvieron siguiendo el Protocolo 1 usando venopunción del sangrado de la vena metatarsiana dorsal para los Compuestos (B), (C) y los Ejemplos 6 y 11. Los resultados de concentración en plasma y colon se obtuvieron siguiendo el Protocolo 2 usando sangrado retroorbital para los Compuestos (A), y los Ejemplos 1 y 3-5 y el Protocolo 2 usando venopunción de la vena metatarsiana dorsal para los Ejemplos 2, 7-10 y 12. Los resultados de los Protocolos 1 y 2 se muestran en la Tabla 1a. Los resultados de concentración en plasma y colon se obtuvieron siguiendo el Protocolo 3 para los Ejemplos 1, 3 y 4. Los resultados del Protocolo 3 se muestran en la Tabla 1b. Estos protocolos se describen a continuación en el encabeza Estudios in vivo.

Tabla 1a. Resultados de experimentos in vivo después de dosificación p.o. - Concentración media de compuestos r

continuación

Tabla 1b. Resultados de experimentos in vivo después de dosificación i.c. - Concentración media de compuestos

Los compuestos (A)-(C) son los siguientes compuestos de referencia que se han divulgado en la WO2013/007765 o la WO2011/086053 para su uso como inhibidores de Janus quinasas:

Los Compuestos de Ej. 1-12 en las Tablas 1a y 1b son realizaciones de esta invención proporcionadas en los Ejemplos respectivos.

Como se demuestra en la Tabla 1a, las concentraciones en el colon para los compuestos de Ej. 1-12 resultaron ser mucho más altas que las concentraciones en plasma respectivas, con proporciones de concentración [colon (4 h)]: [plasma (0,5 h)] que varían de aproximadamente 52 a aproximadamente 3.000. Por el contrario, tales proporciones para los compuestos (A)-(C) variaron de aproximadamente 3 a aproximadamente 17. La Tabla 1b también proporciona datos de apoyo de que los Ejemplos 1, 3 y 4 tienen exposiciones sistémicas bajas después de la dosificación i.c. El contraste entre las propiedades de las realizaciones de esta invención con respecto a los compuestos de referencia es mucho más acentuado cuando la comparación se refiere a los valores de concentración en plasma de 4 h. A este respecto, las proporciones de concentración [colon (4 h)]: [plasma (4 h)] para los compuestos de Ej. 1-12 varían de aproximadamente 888 a aproximadamente 6886. Por el contrario, tales proporciones para los compuestos (A)-(C) varían de aproximadamente 11 a aproximadamente 538. Estas proporciones de concentración en colon a plasma son indicativas de que los compuestos de Ej. 1-12 tienen efectos sistémicos bajos en cualquier momento posterior a la dosis oral, mientras que los compuestos (A)-(C) tienen efectos sistémicos comparativamente altos. Este es un descubrimiento inesperado de los efectos GI locales para los compuestos de Ej. 1-12.

Como se muestra en la Tabla 4, se midió la actividad enzimática de los compuestos de Ej. 1-12 para determinar la actividad de cada enzima individual. Para todos los compuestos probados, se midió la inhibición de la actividad enzimática, lo que demuestra que estos compuestos son inhibidores de pan-JAK. Los datos proporcionados en esta tabla para los compuestos (A)-(C) también demuestran la inhibición de la actividad enzimática para todas las proteínas de JAK por estos compuestos.

Como se muestra en la Tabla 5, las actividades celulares de los compuestos de Ej. 1-12 se evaluaron en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando estímulos IL-2, IFN-a y GM-CSF y midiendo la inhibición de la fosforilación de STAT5, STAT4 y STAT5, respectivamente. Para todos los compuestos probados, se midió la inhibición de la fosforilación de STAT con los tres estímulos.

Como se muestra en la Tabla 6, se midieron las solubilidades de los compuestos de Ej. 1-12 en fluido gástrico simulado ("SGF") y fluido intestinal simulado ("SIF"). Todos los compuestos probados mostraron una solubilidad medible por encima de 400 pM en SGF, y en el intervalo de 81 pM a más de 400 pM con SIF. Como se muestra en la misma tabla, estos datos de solubilidad eran comparables a las solubilidades de los compuestos (A)-(C).

Como se muestra en la Tabla 7, la permeabilidad de los compuestos (A)-(C) y Ej. 1-12 se midió usando la línea celular MDCK-MDR1 con y sin elacridar, un inhibidor de P-gp. Todos los compuestos demostraron baja permeabilidad para las mediciones de transporte de apical a basolateral, con y sin inhibidor de P-gp (elacridar). Los valores del coeficiente de permeabilidad para los compuestos (A)-(C) y Ej. 1-12 fueron bajos y comparables para el transporte de apical a basolateral sin elacridar (para todos estos compuestos) y con elacridar (para los compuestos (B)-(C) y los compuestos de Ej. 1-12) (columnas 2 y 3 en dicha tabla), pero los coeficientes de permeabilidad de basolateral a apical para los compuestos (A)-(C) fueron mayores que los de la mayoría de los compuestos de Ej. 1­ 12, como se muestra en la columna 4 de la misma tabla. Con referencia a las columnas 3 y 4 en la Tabla 7, la mayoría de los compuestos de Ej. 1-12 tienen coeficientes de permeabilidad de apical a basolateral bajos medidos en presencia de elacridar (columna 3), y también coeficientes de permeabilidad de basolateral a apical bajos (columna 4). Estas dos características caracterizan a tales compuestos como compuestos de baja permeabilidad. No puede hacerse la misma caracterización para los compuestos (A)-(C), cuyos coeficientes de permeabilidad de basolateral a apical (columna 4) son mayores que los de la mayoría de los compuestos de Ej. 1-12. Las proporciones de eflujo dadas en la misma tabla para los compuestos (A)-(C) y Ej. 1-12 muestran que todos estos compuestos son sustratos de P-gp.

No hay enseñanza o sugerencia de referencia conocida que indique que la escasez marcada de efectos sistémicos para las realizaciones de esta invención en comparación con los de los compuestos de referencia (A)-(C) pueda inferirse y/o predecirse en base a comparaciones estructurales u otros características de los compuestos (A)-(C) como los analizados en referencia a las Tablas 4, 6 y 7. Esto es así aunque los compuestos de referencia (A)-(C) presentan similitudes estructurales de ciertas fracciones con fracciones similares de realizaciones de este invención.

Además, no hay ninguna enseñanza o sugerencia de referencia conocida que indique que la característica de baja permeabilidad para las realizaciones de esta invención en comparación con las de los compuestos de referencia (A)-(C) pueda inferirse y/o predecirse en base a comparaciones estructurales.

Los siguientes ejemplos específicos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención y varias realizaciones.

Para obtener los compuestos descritos en los ejemplos siguientes y los datos analíticos correspondientes, se siguieron los siguientes protocolos experimentales y analíticos a menos que se indique lo contrario.

A menos que se indique lo contrario, las mezclas de la reacción se agitaron magnéticamente a temperatura ambiente (ta). Cuando las soluciones se “secan”, generalmente se secan sobre un agente desecante como Na²SO⁴ o MgSO⁴. Cuando las mezclas, soluciones y extractos se "concentraban", generalmente se concentraban en un evaporador rotatorio a presión reducida.

La cromatografía en capa fina se realizó utilizando gel de sílice Merck 60 F²⁵⁴ de 2,5 cm x 7,5 cm, 250 jm o 5,0 cm x 10,0 cm, 250 jm de placas de gel de sílice recubiertas previamente.

La cromatografía en columna ultrarrápida (FCC) de fase normal se realizó en gel de sílice (SiO²) eluyendo con NH³2 M en MeOH/DCM, a menos que se indique lo contrario.

Los espectros de masas (MS) se obtuvieron en un MSD Agilent serie 1100 usando ionización por electropulverización (ESI) en modo positivo a menos que se indique lo contrario. La masa calculada (calcd.) corresponde a la masa exacta.

Los espectros de resonancia magnética nuclear (NMR) se obtuvieron en espectrómetros Bruker modelo DRX. El formato de los datos de ¹H NMR a continuación es: desplazamiento químico en ppm campo abajo de la referencia de tetrametilsilano (multiplicidad, constante de acoplamiento J en Hz, integración).

Los nombres químicos fueron generados o por ChemDraw (CambridgeSoft, Cambridge, MA) o ACD/Name versión 9 (Advanced Chemistry Development, Toronto, Ontario, Canadá). A modo de ejemplo, la designación (1r,4r) se refiere a la orientación trans alrededor del anillo de ciclohexilo generada usando la función de nomenclatura de Chemdraw Ultra Pro 14.0.

Para proporcionar una descripción más concisa, algunas de las expresiones cuantitativas dadas en la presente no están calificadas con el término “aproximadamente”. Se entiende que, ya sea que el término "aproximadamente" se use explícitamente o no, cada cantidad dada en la presente se refiere al valor real dado, y se pretende que también se refiera a la aproximación a dicho valor dado que se inferiría razonablemente en base a la capacidad ordinaria en la técnica, incluyendo equivalentes y aproximaciones debido a las condiciones experimentales y/o de medición para dicho valor dado.

Siempre que se dé un rendimiento en porcentaje, dicho rendimiento se refiere a una masa de la entidad para la que se da el rendimiento con respecto a la cantidad máxima de la misma entidad que podría obtenerse en las condiciones estequiométricas particulares. Las concentraciones de reactivo que se dan como porcentajes se refieren a proporciones de masa, a menos que se indique lo contrario.

Las abreviaturas y los acrónimos usados en la presente incluyen lo siguiente, como se muestra a continuación:

Abreviaturas acrónimos definidos

Producto intermedio 1 síntesis y Caracterización

2-((1 r,4r)-4-((5-Nitro-1-(fenilsulfonil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)ciclohexil)acetonitrilo

Paso A: N-[(1r,4r)-4-(hidroximetil)ciclohexil]carbamato de terc-butilo. En un matraz de fondo redondo de 4 bocas de 20 l y, purgado y mantenido con una atmósfera inerte de nitrógeno, se colocó ácido (1r,4r)-4-[[(tercbutoxi)carbonil]amino]ciclohexano-1-carboxílico (1066 g, 4,38 mol, 1,00 equiv) y EL (10 l). A esto le siguió la adición gota a gota de BH³-Me²S (10 M, 660 ml) a -10° C durante 1 h. La solución resultante se agitó durante 3 h a 15° C. Esta reacción se realizó tres veces en paralelo y se combinaron las mezclas de la reacción. Luego, la reacción se inactivó mediante la adición de metanol (2 l). La mezcla resultante se concentró al vacío. Esto dio como resultado N-[(1r,4r)-4-(hidroximetil)ciclohexil]carbamato de terc-butilo (3000 g, 99,6%) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C¹²H²³NO³, 229.32; m/z encontrado, 215.2 [M-tBu+MeCN+H]⁺; ¹H NMR: (300 MHz, CDCl³): 64.40 (s, 1H), 3.45 (d, J=6.3 Hz, 2H), 3.38 (s, 1H), 2.05-2.02 (m, 2H), 1.84-1.81 (m, 2H), 1.44 (s, 11H), 1.17-1.01 (m, 4H).

Paso B: N-[(1r,4r)-4-[(metanosulfoniloxi)metil]ciclohexil]carbamato de terc-butilo. En un matraz de fondo redondo de 4 bocas de 20 l, purgado y mantenido con una atmósfera inerte de nitrógeno, se colocó N-[(1r,4r)-4-(hidroximetil)ciclohexil]carbamato de terc-butilo (1000 g, 4,36 mol, 1,00 equiv.), diclorometano (10 l), piridina (1380 g, 17,5 mol, 4,00 equiv.). A esto le siguió la adición gota a gota de MsCl (1000 g, 8,73 mol, 2,00 equiv.) a -15° C. La solución resultante se agitó durante la noche a 25° C. Esta reacción se realizó en paralelo 3 veces y se combinaron las mezclas de la reacción. Luego, la reacción se inactivó mediante la adición de 2 l de agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (1 x 9 l). La capa orgánica se separó y se lavó con HCl 1M (3 x 10 l), NaHCO³ (ac. saturada) (2x10 l), agua (1x10 l) y salmuera (1x10 l). La mezcla se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Esto dio como resultado N-[(1r,4r)-4-[(metanosulfoniloxi)metil]ciclohexil]carbamato de terc-butilo (3300 g, 82%) como un sólido blanco. LC-MS: MS (ESI): masa calculada para C¹³H²⁵NO⁵S, 307.15; m/z encontrado 292.1, [M-tBu+MeCN+H]⁺; ¹H NMR: (300 MHz, CDCl^s): 64.03 (d, J=6.6 Hz, 2H), 3.38 (s, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.07-2.05 (m, 2H), 1.87-1.84 (m, 2H), 1.72-1.69 (m, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.19-1.04 (m, 4H).

Paso C: N-[(1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil]carbamato de terc-butilo. En un matraz de fondo redondo de 4 bocas de 10 l, se colocó N-[(1r,4r)-4-[(metanosulfoniloxi)metil]ciclohexil]carbamato de terc-butilo (1100 g, 3,58 mol, 1,00 equiv.), DMSO (5500 ml) y NaCN (406 g, 8,29 mol, 2,30 equiv.). La mezcla resultante se agitó durante 5 h a 90° C. Esta reacción se realizó en paralelo 3 veces y se combinaron las mezclas de la reacción. Luego, la reacción se inactivó mediante la adición de 15 l de agua/hielo. Los sólidos se recogieron por filtración. Los sólidos se lavaron con agua (3 x 10 l). Esto dio como resultado N-[(1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil]carbamato de terc-butilo (2480 g, 97%) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C¹³H²²N²O², 238.17; m/z encontrado 224 [M-tBu+MeCN+H]⁺; ¹H NMR: (300 MHz, CDCl³): 64.39 (s, 1H), 3.38 (s, 1H), 2.26 (d, J=6.9 Hz, 2H), 2.08-2.04 (m, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.67-1.61 (m, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.26-1.06 (m, 4H).

Paso D: clorhidrato de 2-[(1r,4r)-4-aminociclohexil]acetonitrilo. En un matraz de fondo redondo de 10 l se colocó N-[(1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil]carbamato de terc-butilo (620 g, 2,60 mol, 1,00 equiv.) y 1,4-dioxano (2 l). A esto le siguió la adición de una solución de HCl en 1,4-dioxano (5 l, 4 M) gota a gota con agitación a 10° C. La solución resultante se agitó durante la noche a 25° C. Esta reacción se realizó 4 veces. y se combinaron las mezclas de la reacción. Los sólidos se recogieron por filtración. Los sólidos se lavaron con 1,4-dioxano (3 x 3 l), acetato de etilo (3 x 3 l) y hexano (3 x 3 l). Esto dio como resultado clorhidrato de 2-[(1r,4r)-4-aminociclohexil]acetonitrilo (1753 g, 96%) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C⁸H¹⁴N², 138.12; m/z encontrado 139.25, [M+H]+; ¹H NMR: (300 MHz, DMSO-d^a): 68.14 (s, 3H), 2.96-2.84 (m, 1H), 2.46 (d, J=6.3 Hz, 2H), 1.98 (d, J=11.1 Hz, 2H), 1.79 (d, J=12.0 Hz, 2H), 1.64-1.49 (m, 1H), 1.42-1.29 (m, 2H), 1.18-1.04 (m, 2H).

Paso E: 2-((1 r,4r)-4-((5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)ciclohexil)acetonitrilo. A un matraz de fondo redondo de 1000 ml que contenía clorhidrato de 2-[(1r,4r)-4-aminociclohexil]acetonitrilo (29,10 g, 166,6 mmol) se le añadió DMA (400 ml). La suspensión resultante se trató con 4-cloro-5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina (51,53 g, 152,6 mmol), seguido de DIPEA (63,0 ml, 366 mmol). La mezcla de la reacción se colocó bajo N² y se calentó a 80° C durante 4 h. La mezcla de la reacción bruta se enfrió a temperatura ambiente y se vertió lentamente en un matraz de 2 l agitado vigorosamente que contenía 1,6 l de agua. La suspensión resultante se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego se filtró y se secó durante 16 h en un horno de vacío con calentamiento a 70° C para proporcionar el compuesto del título (63,37 g, 95%) como un sólido amarillo. MS (ESI): masa calculada para C²¹H²¹N⁵O⁴S, 439.1; m/z encontrado, 440.1 [M+H]⁺.¹H N^m R (500 MHz, CDCL): 5 9.10 (s, 1H), 8.99 (d, J=7.8 Hz, 1H), 8.23-8.15 (m, 2H), 7.66-7.59 (m, 2H), 7.56-7.49 (m, 2H), 6.67 (d, J=4.2 Hz, 1H), 3.95-3.79 (m, 1H), 2.38 (d, J=6.2 Hz, 2H), 2.32-2.21 (m, 2H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.88-1.76 (m, 1H), 1.60-1.32 (m, 4H).

Producto intermedio 2 síntesis y caracterización

2-((1r,4r)-4-((5-amino-1-(fenilsulfonil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)ciclohexil)acetonitrilo

Se disolvió 2-((1 r,4r)-4-((5-nitro-1 -(fenilsulfonil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)ciclohexil)acetonitrilo (Producto intermedio 1, 58,60 g, 133,3 mmol) en THF/MeOH (1:1, 4800 ml). La mezcla se pasó a través de un reactor de hidrogenación de flujo continuo (10% Pd/C), como un Thales Nano H-Cube®, a 10 ml/min con 100% de hidrógeno (presión atmosférica, 80° C), luego la solución se concentró para proporcionar el producto como un sólido púrpura. El sólido se trituró con EtOAc (400 ml) y luego se trituró de nuevo con MeOH (200 ml), luego se filtró y se secó al vacío para proporcionar el compuesto del título (50,2 g, 91,9% de rendimiento). MS (ESI): masa calculada para C²¹H²³N⁵O²S, 409.2; m/z encontrado, 410.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CDCl^s) 58.10-8.03 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.51-7.43 (m, 1H), 7.43-7.34 (m, 3H), 6.44 (d, J=4.2 Hz, 1H), 4.61 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.65-3.51 (m, 1H), 2.74 (s, 2H), 2.26 (d, J=6.4 Hz, 2H), 2.19-2.05 (m, 2H), 1.97-1.86 (m, 2H), 1.76-1.59 (m, 1H), 1.33-1.12 (m, 4H).

Producto intermedio 3 síntesis y caracterización

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de etilo

A un matraz de fondo redondo de 1 l que contenía una barra agitadora y 2-((1r,4r)-4-((5-amino-1-(fenilsulfonil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il)amino)ciclohexil)acetonitrilo (producto intermedio 2, 58,31 g, 142,4 mmol) se le añadió 3-etoxi-3-iminopropanoato de etilo (60,51 g, 309,3 mmol), seguido de EtOH (600 ml, secado sobre tamices moleculares de 3Á durante 48 h). Se unió un condensador de reflujo al matraz de reacción, la reacción se purgó con N² y se calentó a 90° C durante 9 h. La mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se dejó reposar durante 30 h hasta que el producto cristalizó en forma de agujas marrones. Los sólidos se rompieron con una espátula y la mezcla de la reacción se transfirió a un matraz de 2 l. Se añadió agua (1,4 l) lentamente a través de un embudo de decantación con agitación vigorosa. Una vez se hubo completado la adición del agua, la suspensión se agitó durante 30 minutos. Las agujas marrones se aislaron por filtración y luego se secaron tirando aire a través del filtro durante 1 h. El producto se transfirió a un matraz de 500 ml y se trató con EtOAc (200 ml). Se añadió una pequeña cantidad de cristales semilla, lo que indujo la formación de un precipitado sólido blanco. La suspensión se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se filtró, se enjuagó con EtOAc (25 ml), y se secó al vacío para proporcionar el producto como un sólido blanco (48,65 g, 68% de rendimiento). Ms (ESI): masa calculada para C²⁶H²⁷N⁵O⁴S, 505.2; m/z encontrado, 506.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CDCl^s) 58.85 (s, 1H), 8.28-8.19 (m, 2H), 7.84 (d, J=4.0 Hz, 1H), 7.61-7.53 (m, 1H), 7.52-7.43 (m, 2H), 6.84 (d, J=4.1 Hz, 1H), 4.32 (s, 1H), 4.20 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.09 (s, 2H), 2.44 (d, J=6.2 Hz, 2H), 2.40-2.27 (m, 2H), 2.16 (d, J=13.3 Hz, 2H), 2.12-1.96 (m, 3H), 1.54-1.38 (m, 2H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3H).

Producto intermedio 4 síntesis y caracterización

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio

A una solución de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de etilo (Producto intermedio 3, 9,50 g, 18,8 mmol) en MeOH (30 ml) y T^h F (30 ml) se le añadió hidróxido de sodio acuoso (56,4 ml, 56,4 mmol, 1 M) y se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. El solvente se eliminó a presión reducida a temperatura ambiente para proporcionar el compuesto del título (7 g) como un sólido marrón, que se usó en el paso siguiente sin purificación adicional. MS (ESI): masa calculada para C¹⁸H^1aN^sNaO², 359.1; m/z encontrado, 337.9 [M+H-Na]⁺.¹H NMR (400 MHz, CD³OD) 58.52-8.47 (m, 1H), 7.85-7.81 (m, 2H), 7.46-7.41 (m, 4H), 6.85-6.81 (m, 1H), 4.60-4.46 (m, 1H), 3.96 (s, 2H), 2.59-2.49 (m, 4H), 2.19-2.05 (m, 6H), 1.56-1.43 (m, 2H) (una mezcla 1:1 del compuesto del título y ácido bencenosulfónico).

Ejemplo 1 síntesis y caracterización

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida

Paso A: 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida. Para garantizar que el material de partida esté seco, se calentó 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3]-b]piridin-2-il)acetato de etilo (Producto intermedio 3) al vacío a 50°C durante 18 h antes de la reacción. En un matraz de 1 l, se suspendió 2-(1 -((1 r, 4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3]-b]piridin-2-il)acetato de etilo (Producto intermedio 3, 52,585 g, 104,01 mmol) en DMA (50 ml). Se añadió 1 -amino-2-metilpropan-2-ol (50 ml) y la reacción se calentó a 110° C durante 45 minutos, luego a 125° C durante 5 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc (800 ml). La capa orgánica se extrajo tres veces con una solución de agua/salmuera en donde la solución estaba compuesta de 1 l de agua más 50 ml de salmuera. Las capas acuosas se volvieron a extraer con EtOAc (2 x 600 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 anhidro, se concentraron hasta la sequedad y luego se secaron durante 3 días al vacío para proporcionar el compuesto del título (65,9 g, 98% de rendimiento) como una espuma amarilla. El producto se llevó al paso siguiente sin purificación adicional. MS (ESI): masa calculada para C²⁸H³²N⁶O⁴S, 548.22; m/z encontrado, 549.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CDCI³): 6 8.76 (s, 1H), 8.26-8.19 (m, 2H), 7.84 (d, J=4.1 Hz, 1H), 7.60-7.53 (m, 1H), 7.50-7.44 (m, 2H), 6.84 (d, J=4.2 Hz, 1H), 4.76­ 4.61 (m, 1H), 3.97 (s, 2H), 3.45 (s, 1H), 3.27 (d, J=5.9 Hz, 2H), 2.41 (d, J=6.5 Hz, 2H), 2.38-2.25 (m, 2H), 2.23-2.12 (m, 2H), 2.09-1.94 (m, 4H), 1.48 (qd, J=13.6, 4.0 Hz, 2H), 1.21 (s, 6H).

Paso B: 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)- N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida. Se añadió 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida (65,90 g, 102,1 mmol) a un matraz de 1 l que contenía una barra agitadora. Se añadió 1,4-dioxano (300 ml), seguido de KOH acuoso (3 M, 150 ml). La reacción se calentó a 80° C durante 2 h. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y el volumen de solvente se redujo a aproximadamente 200 ml en un evaporador rotatorio. El residuo se trató con una solución de agua/salmuera (100 ml/100 ml), luego se extrajo con MeOH al 10% en CH²Cl² (2 x 1l). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre MgSO⁴ anhidro y se concentraron hasta la sequedad para proporcionar un sólido amarillo. El sólido se suspendió en CH²Cl² (200 ml), se agitó vigorosamente durante 30 minutos y luego se recogió por filtración. El sólido se enjuagó con CH²Cl² (100 ml), se secó tirando aire a través del filtro y luego se secó al vacío a temperatura ambiente durante 16 h para proporcionar el compuesto del título (41,59 g, 89% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²²H²⁸N⁶O², 408.23; m/z encontrado, 409.2 [M+H]⁺ .¹H NMR (600 MHz, DMSO-d^a): 6 11.85 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.21-8.10 (m, 1H), 7.49-7.43 (m, 1H), 6.74-6.65 (m, 1H), 4.53-4.42 (m, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.08 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.58 (d, J=6.1 Hz, 2H), 2.41-2.28 (m, 2H), 2.09-1.92 (m, 5H), 1.42-1.31 (m, 2H), 1.09 (s, 6H). La síntesis y la caracterización del compuesto activo de cada una de las realizaciones de esta invención se proporcionan en la presente en forma de ejemplos. Debido a la estructura cristalina de algunas de las realizaciones de esta invención, puede realizarse una selección de polimorfos para caracterizar adicionalmente formas específicas de cualquiera de tales compuestos. Esto se ilustra de manera no limitativa para el compuesto de Ej. 1 por el ejemplo bajo el título selección de polimorfos.

Ejemplo 2 síntesis y caracterización

2-((1 r,4r)-4-(2-(1H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1(6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo

Paso A: 2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)-6-(fenilsulfonil)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo. Se añadió 2-((1 r,4r)-4-((5-nitro-1-(fenilsulfonil)-1 H-pirrolo[2,3-b]pi ridin-4-il)amino)ciclohexil)acetonitrilo (Producto intermedio 1, 23,3 g, 53,0 mmol) a un matraz de fondo redondo de 1 l que contenía una barra de agitación magnética seguido de la adición de DMSO (200 ml) y metanol (200 ml). Se añadió 1H-imidazol-4-carbaldehído (8,56 g, 89,1 mmol) como un sólido, seguido de la adición de hidrosulfito de sodio (32,7 g, 188 mmol) como una solución en agua (100 ml). El recipiente de reacción se equipó con un condensador de reflujo y se calentó a 90° C en un bloque calefactor durante 15 h. Luego, la mezcla de la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió a un matraz que contenía agua (2000 ml) con agitación, lo que dio como resultado la formación de un precipitado blanco. La mezcla se agitó durante 30 minutos y los sólidos se recogieron por filtración. Los sólidos se secaron haciendo pasar aire a través del filtro durante 6 h y luego se secaron adicionalmente en un horno de vacío calentando a 60° C durante 3 días para proporcionar el compuesto del título (22,7 g, 88% de rendimiento) como un sólido amarillo. MS (ESI): masa calculada para C²⁵H²³N⁷O²S, 485.16; m/z encontrado, 486.1 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CDCl^s): 68.74 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.20-8.11 (m, 2H), 8.04-7.96 (m, 2H), 7.76-7.68 (m, 1H), 7.68-7.60 (m, 2H), 7.19 (d, J=4.2 Hz, 1H), 5.56 (s, 1H), 2.58 (d, J=6.3 Hz, 2H), 2.38-2.24 (m, 2H), 2.07 (s, 1H), 1.98 (d, J=10.8 Hz, 5H), 1.35 (q, J=12.3 Hz, 2H).

Paso B: 2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-Imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo. El compuesto del título se preparó usando condiciones análogas a las descritas en el Ejemplo 1, Paso B usando 2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)-6-(fenilsulfonil)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo (222 mg, 0,46 mmol) en lugar de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil))ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (NH³-MeOH/AE 2N al 0-15%) para proporcionar el compuesto del título (97 mg, rendimiento del 69%). MS (ESl): masa calculada para C¹⁹H¹⁹N⁷,345.17; m/z encontrado, 346.0 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, DMSO-d^a): 6 12.61 (s, 1H), 11.86 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.92 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.48 (t, J=3.0 Hz, 1H), 6.76 (dd, J=3.5, 1.8 Hz, 1H), 5.85 (s, 1H), 2.60 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.57-2.41 (m, 2H), 2.14-1.88 (m, 5H), 1.45-1.27 (m, 2H).

Ejemplo 3 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(danometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida

Paso A: 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridina-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida. Se calentó una mezcla de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de etilo (producto intermedio 3, 555 mg, 1,06 mmol) y ciclopropilmetilamina (1,87 ml, 21,1 mmol) a 125° C durante 1 h en un reactor de microondas. El residuo se trató con agua y luego se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se pasaron a través de un lecho de sílice y se concentraron hasta la sequedad usando un evaporador rotatorio para proporcionar el compuesto del título (642 mg). MS (ESI): masa calculada para C²⁸H³⁰N⁶O³S, 530.21; m/z encontrado, 531.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CD³OD): ó 8.64 (s, 1H), 8.19-8.11 (m, 2H), 7.95 (d, J=4.1 Hz, 1H), 7.66-7.57 (m, 1H), 7.57-7.48 (m, 2H), 7.11 (d, J=4.1 Hz, 1H), 4.53 (s, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.07 (d, J=7.1 Hz, 2H), 2.53 (d, J=5.9 Hz, 2H), 2.45-2.30 (m, 2H), 2.14-2.03 (m, 5H), 1.55-1.42 (m, 2H), 1.02-0.94 (m, 1H), 0.54-0.47 (m, 2H), 0.24-0.18 (m, 2H).

Paso B: 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida. A una mezcla de 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida (560 mg, 1,05 mmol) en 1,4-dioxano (4,22 ml) se le añadió KOH 3N (2,81 ml). La mezcla se calentó a 80° C durante 1 h, luego se purificó con HPLC básica: Xbridge Prep OBD C¹⁸ 50 mm x 100 mm, columna de 5 pm (eluyente 0-100% NH⁴OH/ACN ac. (10 min)) para proporcionar el compuesto del título (187 mg, 46% de rendimiento). MS (ESI): masa calculada para C²²H²⁶N⁶O, 390.22; m/z encontrado, 391.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CD³OD): ó 8.57 (s, 1H), 7.50 (d, J=3.5 Hz, 1H), 6.86 (d, J=3.5 Hz, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.13 (d, J=7.0 Hz, 2H), 2.67-2.52 (m, 4H), 2.20-2.03 (m, 5H), 1.58-1.44 (m, 2H), 1.12-0.97 (m, 1H), 0.60-0.48 (m, 2H), 0.31-0.22 (m, 2H).

Ejemplo 4 síntesis y caracterización

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin- 2-il)acetamida

A una solución de 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio (producto intermedio 4, 400 mg, 1,11 mmol) y 3-aminopropanonitrilo (320 mg, 2,24 mmol) en DMF (5 ml) se le añadieron PyBOP (870 mg, 1,67 mmol) y DIPEA (0,60 ml, 3,5 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 h. Después de eliminar la DMF al vacío, el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna usando acetato de etilo al 50-100% en heptano. Las fracciones recogidas se concentraron al vacío hasta un pequeño volumen y el sólido blanco que había precipitado se filtró, se lavó con MeOH al 10% en CH²C^L y se secó para proporcionar el compuesto del título (75 mg, 17% de rendimiento). El filtrado se concentró hasta la sequedad y se purificó por HPLC de fase inversa usando una columna Varian Pursuit XR^s5 Difenil de 100 mm x 30 mm (eluyente 10-90% CH³CN en agua, TFA al 0,1%) para proporcionar un aceite transparente. Este material se disolvió en MeOH al 10% en CH²Cl², se pasó a través de tres columnas de 500 mg de carbonato SILICYCLE SPE-R66030B-03P (cartucho de extracción en fase sólida eliminador de ácido SiliaBond) para eliminar el TFA y se eluyó con MeOH al 10% en CH²C² para proporcionar una fracción adicional del compuesto del título (88 mg, 20% de rendimiento). Las dos fracciones se combinaron para proporcionar el producto final (163 mg, 37% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²¹H²³N⁷O, 389.20; m/z encontrado, 390.3 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CD³OD): 68.53 (s, 1H), 7.48 (d, J=3.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J=3.5 Hz, 1H), 4.51 (br s, 1H), 4.12 (s, 2H), 3.50 (t, J=6.6 Hz, 2H), 2.71 (t, J=6.6 Hz, 2H), 2.45-2.63 (m, 4H), 2.03-2.19 (m, 5H), 1.44-1.57 (m, 2H).

Ejemplo 5 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida

Se calentó una mezcla de 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de etilo (producto intermedio 3, 309 mg, 0,61 mmol) y 4-aminotetrahidropirano (195 mg, 1,93 mmol) en 1,4-dioxano (0,5 ml) en un reactor de microondas a 180° C durante 1 h. Luego, la mezcla de la reacción se diluyó con 1,4-dioxano (1,5 ml), se trató con KOH acuoso 3N (2 ml) y se calentó a 80°C durante 1,5 horas. Luego, el residuo se trató con agua (10 ml) y se extrajo con CH²Cl² (3 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre MgSO⁴ y se concentraron al vacío. El material bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (5-10% de MeOH/CH²Cl²) para proporcionar el compuesto del título (146 mg, 57% de rendimiento). MS (ESI): masa calculada para C²³H²⁸N⁶O², 420.23; m/z encontrado, 421.2 [M+H]⁺.¹H NMR (600 MHz, DMSO-d^a): 611.84 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.36 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.46 (t, J=3.0 Hz, 1H), 6.73-6.67 (m, 1H), 4.54-4.41 (m, 1H), 3.98 (s, 2H), 3.86-3.81 (m, 2H), 3.81-3.74 (m, 1H), 3.40-3.34 (m, 2H), 2.60 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.41-2.29 (m, 2H), 2.10-2.01 (m, 1H), 2.00-1.93 (m, 4H), 1.77-1.70 (m, 2H), 1.49-1.33 (m, 4H).

Ejemplo 6 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamida

A un vial de microondas se le añadieron 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3]-b]piridin-2-il)acetato de etilo (Producto intermedio 3, 300 mg, 0,593 mmol) y 4-aminometiltetrahidropirano (683 mg, 5,93 mmol). La solución resultante se agitó a 125° C durante 1 hora. Luego se añadieron dioxano (2,37 ml) y KOH (3 M en agua, 1,58 ml, 4,75 mmol) y la reacción se agitó en el microondas a 80° C durante 1 h. La reacción se purificó mediante HPLC básica usando una columna Waters Xbridge Prep OBD C¹⁸ de 150 mm x 30 mm, 5 gm (eluyente 0-100% de agua (0,05% de NH⁴OH)/ACN (10 min)) para proporcionar el compuesto del título. (97 mg, 38% de rendimiento). MS (ESI): masa calculada para C²⁴H³⁰N⁶O², 434.24; m/z encontrado, 435.2 [M+H]⁺ .¹H NMR (500 MHz, CD³OD): 6 8.43 (s, 1H), 7.38 (d, J=3.5 Hz, 1H), 6.74 (d, J=3.5 Hz, 1H), 4.43 (s, 1H), 4.03-3.96 (m, 2H), 3.89-3.79 (m, 2H), 3.34-3.25 (m, 2H), 3.04 (d, J=6.8 Hz, 2H), 2.54-2.38 (m, 4H), 2.08-1.96 (m, 5H), 1.74-1.63 (m, 1H), 1.59-1.54 (m, 2H), 1.46-1.33 (m, 2H), 1.25-1.14 (m, 2H).

Ejemplo 7 síntesis y caracterización

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida

Se agitó una solución de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio (producto intermedio 4, 300 mg, 0,835 mmol), 3-amino-2,2-dimetilpropanonitrilo (82,0 mg, 0,835 mmol), DIPEA (216 mg, 1,67 mmol) y DMF (5 ml) a 0° C durante 1 h. Luego se añadió PyBrOP (467 mg, 1,00 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se inactivó con 10 ml de agua y se purificó mediante HPLC preparativa usando una columna Waters Xbridge Prep OBD C¹⁸ de 150 mm x 30 mm de 5 |jm (eluyente: 28% de agua (0,05% de hidróxido de amoníaco v/v)-ACN para proporcionar el compuesto del título (58 mg, 16% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²³H²⁷N⁷O, 417.23; m/z encontrado, 418.2 [M+H]⁺.1H NMR (400 MHz, DMSO-d^a): 6 11.86 (br s, 1H), 8.71-8.66 (m, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.48-7.45 (m, 1H), 6.73-6.69 (m, 1H), 4.53-4.42 (m, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.33-3.31 (m, 1H), 2.57 (d, J=5.6 Hz, 2H), 2.41-2.27 (m, 2H), 2.05-1.93 (m, 5H), 1.45-1.26 (m, 9H).

Ejemplo 8 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroxiciclobutil)metil)acetamida

Se agitó una solución de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio (producto intermedio 4, 300 mg, 0,835 mmol), 1-(aminometil)ciclobutanol (84,4 mg, 0,835 mmol), DIPEA (216 mg, 1,67 mmol) y DMF (5 ml) a 0° C durante 1 H. Luego, se añadió PyBrOP (467 mg, 1,00 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche, luego se inactivó con 10 ml de agua. La reacción se purificó mediante HPLC básica preparativa usando una columna Kromasil de 150 mm x 25 mm, 10 |jm (eluyente: agua (0,05% de hidróxido amónico v/v)-ACN del 9% al 39%, v/v) para proporcionar el compuesto del título (90 mg, 26% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²³H²⁸N⁶O², 420.23; m/z encontrado, 421.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, DMSO-d^a): 6 11.58 (br s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.94-7.85 (m, 1H), 7.46-7.40 (m, 1H), 6.75-6.70 (m, 1H), 4.89 (br s, 1H), 4.57-4.47 (m, 1H), 4.04 (s, 2H), 3.27 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.55 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.45-2.31 (m, 2H), 2.10-1.88 (m, 9H), 1.71-1.60 (m, 1H), 1.54-1.35 (m, 3H).

Ejemplo 9 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridi n-2-il)-N-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)acetamida

A una solución de 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio (producto intermedio 4, 100 mg, 0,278 mmol) y 1-metil-1H-pirazol-4-amina (54,0 mg, 0,557 mmol) en DMF (0,8 ml) se le añadieron PyBrOP (217 mg, 0,417 mmol) y DIPEA (0,144 ml, 0,835 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El DMF se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (EtOAc/heptanos al 50-100%, luego MeOH/DCM al 10%) y, posteriormente, mediante HPLC de fase inversa usando una columna Varian Pursuit XR^s5 Difenil de 100 mm x 30 mm (eluyente 10-90% de CH³CN en agua, 0,1% de TFA) para proporcionar el producto como la sal de TFA. Este material se disolvió en MeOH al 10% en CH²Cl² y se pasó a través de una columna de 500 mg de carbonato SILICYCLE SPE-R66030B-03P (cartucho de extracción en fase sólida de eliminador de ácido SiliaBond) para eliminar el TFA y proporcionar el compuesto del título (34 mg, 29% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²²H²⁴N⁸O, 416.21; m/z encontrado, 417.3 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, CDCl³) 6=12.77 (br s, 1H), 11.24 (br s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.89 (br s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.29-7.20 (m, 1H), 6.74 (br s, 1H), 4.85-4.65 (m, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.80-2.55 (m, 1H), 2.45 (d, J=6.6 Hz, 2H), 2.32-1.98 (m, 6H), 1.62-1.44 (m, 2H).

Ejemplo 10 síntesis y caracterización

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida

Paso A: ciclopentano-1,3-dicarboxilato de dimetilo. Se enfrió una solución de ácido ciclopentano-1,3-dicarboxílico (70,0 g, 443 mmol) y metanol anhidro (300 ml) a 0°C en un baño de agua con hielo. Se añadió gota a gota ácido sulfúrico concentrado (14 ml), manteniendo la temperatura a <15° C. Después de la adición, la reacción se calentó a 90° C y se agitó durante la noche. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró hasta la sequedad. El residuo se trató con MTBE (500 ml) y H²O (100 ml). La capa acuosa se separó y se extrajo con MTBE (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con bicarbonato de sodio saturado (2 x 100 ml), salmuera (100 ml), se secaron sobre MgSO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad para proporcionar el compuesto del título (72,5 g, 88%) como un aceite de color amarillo pálido. ¹H NMR (400 MHz, CDCl^s) 63.65 (s, 6H), 2.84-2.72 (m, 2H), 2.26-2.17 (m, 1H), 2.11-2.02 (m, 1H), 1.96-1.88 (m, 4H).

Paso B: biciclo[2.2.1]heptano-1,4-dicarboxilato de dimetilo. Se añadió lentamente n-butillitio (2,5 M en hexano, 419,0 ml, 1048 mmol) a una solución de diisopropilamina (152 ml, 1090 mmol) y THF anhidro (1000 ml) a -78° C (hielo seco/acetona) bajo N². Luego, la reacción se agitó durante 0,5 horas a 0° C antes de enfriarla a -78° C. Se añadió DMPU (404 ml, 3350 mmol) a través de un embudo de adición. Luego, se añadió lentamente mediante un embudo de adición una solución de ciclopentano-1,3-dicarboxilato de dimetilo (78,0 g, 419 mmol) y THF anhidro (300 ml). La reacción se calentó a 0° C y se agitó durante 30 minutos, luego se enfrió a -78° C y se trató con una solución de 1-bromo-2-cloroetano (59,0 ml, 712 mmol) y THF anhidro (200 ml). La reacción se dejó calentar lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con cloruro de amonio acuoso saturado (400 ml). La reacción se diluyó con acetato de etilo (500 ml), la capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (2 x 300 ml), se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad. El residuo se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice y se lavó con acetato de etilo (2000 ml). El filtrado se concentró hasta la sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/acetato de etilo, 30:1 a 20:1, gradiente de elución) para proporcionar el compuesto del título (48,5 g, 54%) como un sólido blanco. 1H NMR (400 MHz, CDCla): 53.69 (s, 6H), 2.08-1.99 (m, 4H), 1.91 (s, 2H), 1.73-1.63 (m, 4H).

Paso C: ácido 4-(metoxicarbonil)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxílico. Se añadió lentamente una solución de metanol (80 ml) de hidróxido de sodio (5,145 g, 128,6 mmol) a una solución de biciclo[2.2.1]heptano-1,4-dicarboxilato de dimetilo (27,3 g, 129 mmol) y THF (700 ml) a 0°C y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se concentró hasta la sequedad y el residuo se trituró con MTBE (15 ml). El precipitado se recogió por filtración, se lavó con MTBE (5 ml) y se disolvió en 100 ml de H²O. La solución se acidificó a pH=4 con HCl 2 M. El precipitado se recogió por filtración y se secó al vacío para proporcionar el compuesto del título (13,0 g, 51,0%) como un sólido blanco. El filtrado se extrajo con acetato de etilo (3 x 75 ml) y los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre MgSO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad para proporcionar una segunda fracción del compuesto del título (8,0 g, 31%) como un sólido blanco. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d^s) 5 12.21 (br s, 1H), 3.59 (s, 3H), 1.94-1.86 (m, 4H), 1.74 (s, 2H), 1.61-1.54 (m, 4H).

Paso D: 4-(((benciloxi)carbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxilato de metilo. Se añadió difenilfosforilazida (17,1 ml, 78,6 mmol) a una solución de ácido 4-(metoxicarbonil)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxílico (13,0 g, 65,6 mmol), DIPEA (22,8 ml, 131 mmol) y tolueno anhidro (200 ml) y la mezcla de la reacción se agitó a 110° C durante 2 horas. La reacción se enfrió a 50° C y se añadió alcohol bencílico (13,6 ml, 131 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a 110° C durante la noche. La reacción se concentró hasta la sequedad, se disolvió en MTBE (250 ml) y se lavó con H²O (150 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con MTBE (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre MgSO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/acetato de etilo, 10:1 a 5:1, gradiente de elución) para proporcionar un producto impuro (28,5 g) como un aceite de color amarillo pálido. El producto se purificó adicionalmente mediante HPLC ácida preparativa usando una columna Phenomenex Synergi Max-RP de 250 x 50 mm x 10 j m (eluyente: del 38% al 68% (v/v) de CH³CN y H²O con 0,1% de TFA). Las fracciones puras se combinaron y los volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se diluyó con H²O (80 ml), el pH de la solución se ajustó a pH=8 con solución acuosa saturada de NaHCO³ y la solución resultante se extrajo con CH²Cl² (3 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (75 ml), se secaron sobre MgSO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad para proporcionar el compuesto del título (17,3 g, 85%) como un aceite incoloro. MS (ESI): masa calculada para C¹⁷H²¹NO⁴, 303.2; m/z encontrado, 303.9 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, DMSO-d^s) 57.56 (br s, 1H), 7.37-7.30 (m, 5H), 4.97 (s, 2H), 3.58 (s, 3H), 1.90-1.80 (m, 6H), 1.65-1.59 (m, 4H).

Paso E: 4-((terc-butoxicarbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxilato de metilo. Se añadió una mezcla de 4-(((benciloxi)carbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxilato de metilo (17 g, 56 mmol), dicarbonato de di-tercbutilo (18,35 g, 84,06 mmol), MeOH (200 ml) y Pd/C húmedo (4 g, 10% en peso, 50% de H²O) a un matraz de fondo redondo de 500 ml con un globo de hidrógeno (13 psi) y se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. El catalizador se filtró y el filtrado se concentró hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/acetato de etilo, 20:1 a 1:1, gradiente de elución) para proporcionar el compuesto del título (12,0 g, 79,5%) como un sólido blanco. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶) 57.04 (br s, 1H), 3.57 (s, 3H), 1.93-1.78 (m, 4H), 1.77 (s, 2H), 1.63-1.53 (m, 4H), 1.35 (s, 9H).

Paso F: ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxílico. A una solución de 4-((tercbutoxicarbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxilato de metilo (5,0 g, 19 mmol), THE (40 ml) y MeOH (20 ml) se le añadió hidróxido de sodio acuoso. (1,0 M, 46,4 ml, 46,4 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se concentró hasta la sequedad y el residuo se diluyó con H²O (20 ml), se acidificó a pH=4-5 con HCl 2 M para proporcionar un precipitado. El precipitado se disolvió en 150 ml de acetato de etilo, se lavó con salmuera (45 ml), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y se concentró hasta la sequedad para proporcionar el compuesto del título (4,74 g, 100% de rendimiento) como un sólido blanco, que se usó directamente en el paso siguiente. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶) 5 12.06 (br s, 1H), 7.00 (br s, 1H), 1.87-1.73 (m, 6H), 1.58-1.50 (m, 4H), 1.35 (s, 9H).

Paso G: (4-(hidroximetil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)carbamato de terc-butilo. Se añadió lentamente una solución de complejo de borano-tetrahidrofurano (1,0 M, 37,1 ml, 37,1 mmol) a una solución de ácido 4-((tercbutoxicarbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptano-1-carboxílico (4,74 g, 18.6 mmol) y THF anhidro (50 ml) a 0° C bajo atmósfera de nitrógeno. Una vez completada la adición, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió lentamente agua (30 ml) a la mezcla y se agitó durante 30 minutos adicionales. La reacción se concentró hasta la sequedad y el residuo se diluyó con acetato de etilo (50 ml), se lavó con H²O (15 ml) y salmuera (10 ml), se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y se concentró hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/acetato de etilo, 2:1) para proporcionar el compuesto del título (4,0 g, 89% de rendimiento) como un sólido blanco. TLC (éter de petróleo/acetato de etilo, 2:1), R^f=0.5. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶): 6.88 (br s, 1H), 4.38 (t, J=5.4 Hz, 1H), 3.36 (d, J=5.4 Hz, 2H), 1.73 (br s, 2H), 1.64-1.49 (m, 4H), 1.42 (s, 2H), 1.39-1.33 (m, 9H), 1.25-1.16 (m, 2H).

Paso H: metanosulfonato de (4-((terc-butoxicarbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)metilo. Se añadió piridina (2,7 ml, 33 mmol) a una solución de (4-(hidroximetil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)carbamato de terc-butilo (2,0 g, 8,3 mmol) y CH²G ² anhidro (30ml). La reacción se enfrió a 0° C y se añadió cloruro de metansulfonilo (2,0 ml, 25,0 mmol) y la mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con CH²G ² (50 ml) y agua (30 ml)^. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (15 ml), se secó sobre MgSO⁴ anhidro, se filtró y se concentró hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/acetato de etilo, 5:1 a 1:1, gradiente de elución) para proporcionar el compuesto del título (2,58 g, 97%) como un sólido blanco. TLC (éter de petróleo/acetato de etilo, 1:1), R^f=0.85. ¹H Nm R (400 MHz, CDG³) 4.73 (br s, 1H), 4.21 (s, 2H), 2.98 (s, 3H), 1.93-1.90 (m, 2H), 1.78-1.62 (m, 6H), 1.53-1.34 (m, 11H).

Paso I: (4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)carbamato de terc-butilo. A una solución de metanosulfonato de (4-((terc-butoxicarbonil)amino)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)metilo (2,58 g, 8,07 mmol) u DMSO (25 ml) se le añadió cianuro de sodio (1,20 g, 24,5 mmol). La reacción se calentó a 100° C y se agitó durante 24 horas. La reacción se diluyó con 50 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 40 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (éter de petróleo/acetato de etilo, 5:1) para proporcionar el compuesto del título (1,8 g, 89% de rendimiento) como un sólido blanco. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶): ó 7.00 (br s, 1H), 2.67 (s, 2H), 1.82 (br s, 2H), 1.69-1.52 (m, 6H), 1.47-1.40 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).

Paso J: clorhidrato de 2-(4-aminobiciclo[2.2.1]heptan-1-il)acetonitrilo. A una suspensión de (4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)carbamato de terc-butilo (850 mg, 3,40 mmol) y acetato de etilo (2 ml) a 0° C se le añadió una solución de HCl en acetato de etilo (4,0 M, 10 ml, 40 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla se concentró hasta la sequedad bajo presión reducida. El residuo se trituró con MTBE (5 ml) y la suspensión se aisló por filtración. La torta del filtro se lavó con MTBE (1 ml) y se secó a presión reducida para dar el compuesto del título (450 mg, 71%) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C⁹H¹⁴N²150.12 m/z, encontrado 151.1 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, DMSO-d^a) ó 8.59 (br.s., 3H), 2.78 (s, 2H), 1.90­ 1.77 (m, 2H), 1.74-1.62 (m, 4H), 1.60 (s, 2H), 1.56-1.46 (m, 2H).

Paso K: N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida. A una solución de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio (producto intermedio 4, 300 mg, 0,835 mmol), clorhidrato de 2-(4-aminobiciclo[2.2.1]heptan-1-il)acetonitrilo (138 mg, 0,918 mmol) y DIPEA (0,291 ml, 1,67 mmol) en DMF seco (6 ml) se le añadió PyBrOp (428 mg, 0,918 mmol) a 0° C. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla se inactivó con 10 ml de agua y se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad. El residuo se purificó por HPLC preparativa (usando una columna Xtimate Cis 150x25 mmx5 gm (eluyente: del 23% al 33% (v/v) de CH³CN y H²O con NH⁴HCO³ 10 mM) y por TLC preparativa (diclorometano:metanol = 15:1) para proporcionar el compuesto del título (36,6 mg, 9% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²⁷H³¹N⁷O, 469.3; m/z encontrado, 470.2 [M+H]⁺ .¹H NMR (400 MHz, CD³OD): ó 8.53 (s, 1H), 7.48 (d, J=4.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.47 (br s, 1H), 4.07-4.02 (m, 2H), 2.63 (s, 2H), 2.61-2.50 (m, 4H), 2.18-1.98 (m, 7H), 1.94-1.84 (m, 2H), 1.82 (s, 2H), 1.79-1.68 (m, 2H), 1.62-1.43 (m, 4H).

Ejemplo 11 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida

Paso A: 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroi midazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]pi ridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamida. El compuesto del título (383 mg, 70%) se preparó de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 1, Paso A usando 1H-pirazol-3-amina (465 mg, 5,48 mmol) en lugar de 1-amino-2-metilpropan- 2-ol.

MS (ESI): masa calculada para C²⁷H²⁶N⁸O³S, 542.2; m/z encontrado, 543.2 [M+H]⁺.¹H NMR (500 MHz, DMSO-d⁶) 6 12.36 (s, 1H), 11.36 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.14-8.10 (m, 2H), 7.96 (d, J=4.1 Hz, 1H), 7.72-7.68 (m, 1H), 7.63-7.60 (m, 2H), 7.30 (s, 1H), 7.13 (d, J=4.2 Hz, 1H), 6.44-6.41 (m, 1H), 5.41 (s, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 2.56 (d, J=6.2 Hz, 2H), 2.23-2.13 (m, 2H), 2.02-1.95 (m, 1H), 1.41-1.32 (m, 2H).

Paso B: 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida. El compuesto del título se preparó de manera análoga al Ejemplo 1, Paso B usando 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1H-pirazol-3-il)acetamida (270 mg, 0,500 mmol) en lugar de 2-(1-((1r, 4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-6-(fenilsulfonil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida y se purificó por HPLC básica usando una Xbridge Prep ^o B^d C¹⁸ de 150 mm x 30 mm, 5 pm, eluyente 5% de ACN/NH⁴OH (ac.) (10 min) para proporcionar el compuesto del título (15 mg, 7%). MS (ESI): masa calculada para C²¹H²²N⁸O, 402.5; m/z encontrado, 403.2 [M+H]⁺.¹H NMR (500 MHz, DMSO-d^a): 612.35 (s, 1H), 11.85 (s, 1H), 10.84 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.58 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.46 (d, J=3.4 Hz, 1H), 6.72 (d, J=3.5 Hz, 1H), 6.47-6.39 (m, 1H), 4.64-4.46 (m, 1H), 4.21 (s, 2H), 2.57 (d, J=6.1 Hz, 2H), 2.45-2.26 (m, 2H), 2.08-1.88 (m, 5H), 1.39 (q, J=11.7 Hz, 2H).

Ejemplo 12 síntesis y caracterización

2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1-hidroxiciclopropil)metil)acetamida

Se agitó una solución de 2-(1-((1r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetato de sodio (producto intermedio 4, 300 mg, 0,835 mmol), 1-(aminometil)ciclopropanol (72,7 mg, 0,835 mmol), DIPEA (216 mg, 1,67 mmol) y DMF (5 ml) a 0° C durante 1 H. Luego se añadió PyBrOP (467 mg, 1,00 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se inactivó con 10 ml de agua y se purificó mediante HPLC básica preparativa usando una columna Kromasil de 150 mm x 25 mm, 10 pm (eluyente: agua (0,05% de hidróxido amónico v/v)-ACN del 5% al 35%, v/v) para proporcionar el compuesto del título (84 mg, 25% de rendimiento) como un sólido blanco. MS (ESI): masa calculada para C²²H²⁶N⁶O², 406.21; m/z encontrado, 407.2 [M+H]⁺.¹H NMR (400 MHz, DMSO-d^a): 6 11.53 (br s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.03-7.93 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 1H), 6.74­ 6.71 (m, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.58-4.49 (m, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.29 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.55 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.45-2.31 (m, 2H), 2.10-1.97 (m, 5H), 1.50-1.37 (m, 2H), 0.62-0.55 (m, 2H), 0.55-0.48 (m, 2H).

Ejemplo de selección de polimorfos

Algunas realizaciones de compuestos de acuerdo con esta invención como bases libres presentan múltiples configuraciones cristalinas que tienen un comportamiento complejo en estado sólido, algunas de las cuales a su vez pueden presentar características diferenciadoras entre sí debido a las diferentes cantidades de solvente incorporado. Algunas realizaciones de compuestos de acuerdo con esta invención están en forma de pseudopolimorfos, que son realizaciones del mismo compuesto que presentan diferencias en la composición de la red cristalina debido a diferentes cantidades de solvente en la propia red cristalina. Además, la solvatación de canales también puede estar presente en algunas realizaciones cristalinas de compuestos de acuerdo con esta invención, en las que el solvente se incorpora dentro de canales o espacios vacíos que están presentes en la red cristalina. Por ejemplo, las varias configuraciones cristalinas dadas en la Tabla 2 se encontraron para el compuesto de Ej. 1. Debido a estas características, a menudo se observaron solvatos no estequiométricos, como se ilustra en la Tabla 2. Además, la presencia de tales canales o espacios vacíos en la estructura cristalina de algunas realizaciones de acuerdo con esta invención permite la presencia de moléculas de agua y/o solvente que se mantienen dentro de la estructura cristalina con varios grados de fuerza de unión. Por consiguiente, los cambios en las condiciones ambientales específicas pueden conducir fácilmente a alguna pérdida o ganancia de moléculas de moléculas de agua y/o solvente en algunas realizaciones de acuerdo con esta invención. Se entiende que "solvatación" (tercera columna en la Tabla 2) para cada una de las realizaciones enumeradas en la Tabla 2 es la fórmula solvatación, y que la determinación real de la misma como un número estequiométrico (cuarta columna en la Tabla 2) puede variar ligeramente de la fórmula de solvatación dependiendo de las condiciones ambientales reales cuando se determina experimentalmente. Por ejemplo, si aproximadamente la mitad de las moléculas de agua en una realización pueden estar presentes como enlaces de hidrógeno para el compuesto activo en la red cristalina, mientras que aproximadamente la otra mitad de las moléculas de agua pueden estar en canales o espacios vacíos en la red cristalina, entonces los cambios en las condiciones ambientales pueden alterar la cantidad de moléculas de agua sueltas contenidas en espacios vacíos o canales y, por lo tanto, dar lugar a una ligera diferencia entre la fórmula de solvatación que se asigna de acuerdo con, por ejemplo, la difracción de un solo cristal y la estequiometría que se determina mediante, por ejemplo, análisis termogravimétrico acoplado con espectroscopia de masas.

T l 2 R liz i n f rm ri lin l m E 1

El compuesto que se obtuvo como se describe en el Ejemplo 1 se cristalizó adicionalmente mediante la preparación de una lechada en DCM (1:3, por ejemplo, 10 g de compuesto en 30 ml de DCM) que se agitó a 40° C durante 4 horas y se agitó adicionalmente durante 14 horas a 25° C, luego se añadió lentamente heptano (1:2, por ejemplo, 20 ml de heptano en el compuesto/lechada de DCM/solución) a 25° C, se agitó a 40° C durante 4 horas, se enfrió a 25° C y se agitó durante 14 horas más a 25° C. La filtración subsiguiente llevó al compuesto de Ej. 1 en forma de un sólido blanquecino, que se identificó como un monohidrato, como realización 1s.

Las realizaciones 1-10 en la Tabla 2 y la FIG. 2 son cristalinas. Las realizaciones 1s y 1a a 1h son isoestructurales. La realización 1s cristaliza en un grupo espacial triclínico centrosimétrico P-1. El término "realización 1" se refiere colectivamente a las realizaciones isoestructurales 1s y 1a a 1h. Cualquiera de estas realizaciones 1s y 1a a 1h a veces se denomina miembro isoestructural de la realización 1 o simplemente miembro de la realización 1. Las realizaciones 3b, 3c, 3d y 3e son isoestructurales y cristalizan en el sistema monoclínico, grupo espacial C 2/c. El término "realización 3" se refiere colectivamente a las realizaciones isoestructurales 3b, 3c, 3d y 3e. Cualquiera de dichas realizaciones 13b, 3c, 3d y 3e se denomina a veces miembro isoestructural de la realización 3 o simplemente miembro de la realización 3. Las realizaciones isoestructurales son tales que poseen propiedades estructurales cristalinas similares (mismas simetrías y parámetros de celda unitaria y compactación cristalina similares) mientras que tienen diferentes composiciones químicas (es decir, diferentes moléculas de solvente y/o agua incorporadas en la red cristalina). Los parámetros de la celda unitaria en las realizaciones isoestructurales pueden diferir ligeramente debido a la diferente composición (solvente o agua incorporada en la estructura cristalina). Las realizaciones a las que se hace referencia en la Tabla 2 se prepararon y/o se interconvirtieron como se muestra esquemáticamente en la FIG. 2 y como se describe con más detalle en las siguientes técnicas de selección.

La selección incluyó protocolos de cristalización como equilibrio de solventes en solventes puros, cristalización por evaporación, cristalización por enfriamiento con filtración en caliente, cristalización por choque con antisolvente y cristalización por termociclado. Los sólidos se analizaron por HT-XRPD. Cuando correspondía, los licores madre se evaporaron por completo y los sólidos restantes también se analizaron mediante HT-XRPD. La forma sólida predominante que se identificó fue la realización de material de partida 1s como monohidrato.

Equilibrado de solventes a 25° C y 50° C.

Se realizaron experimentos de lechadas a largo plazo suspendiendo la realización 1s del compuesto en veinte solventes puros y agitando a temperatura ambiente durante dos semanas y a 50°C durante una semana. Una vez finalizado el tiempo de equilibrio, se separaron los sólidos residuales de los licores madre. Los sólidos se secaron en condiciones ambientales y se secaron al vacío (5 mBar) antes de ser analizados por HT-XRPD. Posteriormente, los sólidos se expusieron a condiciones de envejecimiento acelerado (40° C/70% de humedad relativa) durante dos días y se analizaron de nuevo por HT-XRPD.

A partir de la mayoría de los solventes de cristalización, se obtuvo el material de partida como la realización 1s. A partir de varios solventes de cristalización, se descubrió que los patrones de HT-XRPD eran similares a los de la realización inicial 1s. En la mayoría de estos patrones de difracción, se identificaron desplazamientos de picos y/o picos adicionales. Cada uno de estos patrones correspondía a una realización que se etiquetó como una de 1a a 1h, y en base a las similitudes en los patrones de difracción HT-XRPD para tales realizaciones, se presentan como realizaciones que son miembros isoestructurales de la realización 1. Todos los miembros isoestructurales de la realización 1 se convirtieron a la realización 1a después de la exposición a 40° C y 75% de HR durante dos días.

La realización 1 se convirtió en la realización hidratada 10 cuando se expuso a una HR del 100% a 25° C. Sin embargo, la realización 10 no era físicamente estable en condiciones ambientales. Mientras que la realización 1s cristalizó en el sistema triclínico, grupo espacial P-1, se descubrió que la realización 10 cristalizó en el sistema monoclínico, grupo espacial C 2/c. La realización 10 tenía una estabilidad física limitada en condiciones ambientales y se convirtió en otra realización, como 1s o 1a. Este comportamiento es atribuible a una unión desigualmente fuerte de todas las moléculas de hidratación/solvatación. En este caso, la realización 10 tendría una segunda molécula de agua unida con menos fuerza que se perdería en condiciones ambientales. Más precisamente, la estabilidad física de la realización 1s se investigó en cámaras climáticas exponiendo una muestra de 20 mg de dicha realización a 40° C y 70% de humedad relativa durante cuatro días, y otra muestra de 20 mg de la misma realización se expuso también durante cuatro días a 25° C y 100% de humedad relativa. Después de cuatro días, las varias muestras sólidas se analizaron mediante HR-XRPD, se determinaron los parámetros de la celda cristalina y se indexaron los difractogramas. Los difractogramas se muestran en la FIG. 6. De abajo hacia arriba, el primer difractograma en la FIG. 6 corresponde a la realización 1s como material de partida, y la segunda corresponde a la misma forma después de una exposición de 4 días a 40° C y 70% de humedad relativa, indicada como '1 s 70 RH' en la misma figura. Este análisis reveló que la realización inicial 1s había sido recuperada aunque con una pequeña cantidad de una segunda forma cristalina que posiblemente era otra realización hidratada con un mayor contenido de agua. La indexación de dicha forma no fue posible debido a la pequeña cantidad en la que estaba presente. El tercer difractograma corresponde a la realización 1s después de 4 días de exposición a 25° C y 100% de humedad relativa, señalada como '10' en la misma figura. Estas condiciones llevan a la conversión de la realización 1s en la realización 10, con una pequeña contaminación de la realización inicial y solvatación como se caracteriza en la Tabla 2. Tras la deshidratación, ambas realizaciones 1s y 10 volvieron a cristalizar a la forma anhidra con un punto de fusión de 148° C.

El equilibrio de solventes a temperatura ambiente produjo la realización 1b con tolueno como solvente de cristalización y la realización 1f con p-xileno como solvente de cristalización.

Se identificaron y designaron tres realizaciones sólidas adicionales como realizaciones 2, 3 y 7. La realización 2 se identificó a partir del experimento de equilibrio de solventes realizado a temperatura ambiente en 1,4-dioxano, mientras que la realización 7 se descubrió como una mezcla con la realización 1s en el experimento de equilibrio de solventes individuales a 50° C de heptano. Se identificaron varios difractogramas similares pero no idénticos que se agruparon como realizaciones 3b, 3c, 3d y 3e que son miembros isoestructurales de la realización 3. Los miembros isoestructurales de la realización 3 se encontraron mezclados con miembros de la realización 1. Las mezclas que contienen miembros de la realización 3 se transformaron en algunos casos a la realización 1a o en mezclas de las realizaciones 1a y 3e. La realización 7 parecía ser físicamente estable, pero la realización 2 se convirtió en la realización 3e después de la exposición a AAC durante dos días.

Cristalización por evaporación

Los licores madre guardados de los experimentos de equilibrio de solventes realizados a temperatura ambiente se usaron para experimentos de cristalización por evaporación lenta. Los licores madre se filtraron para eliminar cualquier material particulado y se dejaron evaporar lentamente en condiciones ambientales. Los sólidos obtenidos se analizaron por HT-XRPD y nuevamente después de la exposición a AAC durante dos días.

Debido a la escasa solubilidad del compuesto de Ej. 1 en algunos de los solventes, no se recuperaron sólidos cuando se usaron dichos solventes. En los experimentos en los que habían precipitado sólidos, se recuperaron un residuo amorfo o miembros isoestructurales de las realizaciones 1 o 3. Durante el estudio de estabilidad, los diferentes miembros de la realización 1 se convirtieron en la realización 1a mientras que la muestra de la realización 3 parecía ser físicamente estable. Los sólidos amorfos en algunos casos permanecieron amorfos después del estudio de estabilidad, se volvieron delicuescentes o mostraron algunos signos de cristalinidad.

Cristalización por enfriamiento

Los licores madre de los experimentos de equilibrio de solventes realizados a 50° C se filtraron a 50° C para eliminar cualquier material particulado. Las suspensiones a 50° C se filtraron usando filtros de PTFE de 0,2 pm, y las soluciones se colocaron a 5° C y se envejecieron durante 72 horas. Cuando los sólidos habían precipitado durante el envejecimiento, estos sólidos se separaron del líquido, se secaron en condiciones ambientales y al vacío, y se analizaron por HT-XRPD. Los licores madre restantes se dejaron evaporar lentamente y los sólidos restantes se analizaron mediante HT-XRPD. Las muestras en las que no se produjo precipitación se colocaron al vacío y los sólidos secos se analizaron mediante HT-XRPD. Luego todos los sólidos se expusieron a AAC (2 días a 40° C/70% de HR) y se volvieron a analizar mediante HT-XRPD.

Los sólidos no precipitaron al enfriarse en algunas de las soluciones, en cuyo caso las soluciones se evaporaron en condiciones ambientales. Debido a la baja solubilidad del compuesto de Ej. 1 en algunos solventes, no se obtuvieron sólidos de algunas soluciones.

A partir de cuatro solventes (2-propanol, 2-butanona, acetonitrilo y metanol), se produjo la precipitación. La realización 6 se identificó después de la evaporación de un único experimento de cristalización por enfriamiento a escala de ml en 800 pl de acetonitrilo, concentración de 25 mg/ml. La realización 6 parecía ser una forma sólida estable después de 2 días de AAC y parecía una realización no solvatada.

Cristalización por enfriamiento/evaporación a escala de pl

Los experimentos de cristalización por enfriamiento/evaporación a escala de pl se realizaron en una placa de 96 pocillos, usando 12 solventes puros y 12 mezclas de solventes y aplicando cuatro perfiles de temperatura. En cada pocillo se dosificaron aproximadamente 4 mg de sólidos de la realización 1. Posteriormente, se añadieron los solventes de cristalización (80 pl) y las mezclas de solventes para alcanzar una concentración de 50 mg/ml, y la placa, con cada pocillo sellado individualmente, para posteriormente experimentar uno de los cuatro perfiles de temperatura. Una vez finalizado el perfil de temperatura, se permitió que los solventes se evaporaran a baja presión ambiental (24 horas) y los sólidos restantes se analizaron mediante HT-XRPD antes y después de la exposición a AAC durante 2 días (40° C/70% de HR).

Los miembros de las realizaciones 1 y 3 se encontraron en la mayoría de los sistemas de solventes y perfiles de temperatura. Sin embargo, se observó una cierta tendencia de la forma sólida frente al perfil de temperatura. La realización 1b se identificó principalmente a partir de los perfiles de temperatura cortos (envejecimiento de 3 horas). No obstante, los mismos sistemas de solventes con largos tiempos de envejecimiento llevaron a la identificación de la realización 1f, miembros de la realización 3 o mezclas de miembros de las realizaciones 1 y 3. La realización 3c se obtuvo con 1,4-dioxano como solvente de cristalización y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenida durante 60 min, seguido de enfriamiento a razón de 1° C/h a una temperatura final de 20° C, mantenida durante 48 h; la realización 3d se obtuvo con tetrahidrofurano como solvente de cristalización y el mismo perfil de temperatura que para la realización 3c.

La realización 4 se identificó en experimentos realizados en metanol/agua (50/50, v/v), THF y DCM/IPA (50/50, v/v) cuando se aplicaron condiciones de envejecimiento corto. La realización 4 se obtuvo tratando la realización 1 con una mezcla (50/50) de agua y metanol y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenida durante 60 min, seguido de enfriamiento a una velocidad de 20° C/h a una temperatura final de 5°C, mantenida durante 3 h, lo que dio lugar a la realización 4 junto con la realización 1b. La realización 4 junto con la realización 1b también se obtuvo mediante el tratamiento con una mezcla (50/50) de agua y metanol y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenida durante 60 min, seguido de enfriamiento a una velocidad de 20° C/h a una temperatura final de 20° C, mantenida durante 3 h. La realización 4 no parecía ser físicamente estable en condiciones ambientales. Los experimentos de cristalización por enfriamiento produjeron la realización 1c a partir de acetato de etilo/1,4-dioxano (50/50, v/v) como solvente de cristalización y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenido durante 60 min, seguido de enfriamiento a una velocidad de 1° C/h a una temperatura final de 5° C, mantenida durante 48 h; realización 1d a partir de acetonitrilo/cloroformo (50/50, v/v) como solvente de cristalización y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenida durante 60 min, seguido de enfriamiento a una velocidad de 1° C/h hasta una temperatura final de 5°C, mantenida durante 48 h; y la realización 1e a partir de acetato de etilo/1,4-dioxano (50/50, v/v) como solvente de cristalización y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenido durante 60 min, seguido de enfriamiento a una velocidad de 1° C/h hasta una temperatura final de 20° C, mantenida durante 48 h.

La realización 5 se identificó en experimentos realizados en cloroformo como solvente de cristalización y un perfil de temperatura de 50° C como temperatura inicial, mantenida durante 60 min, seguido de enfriamiento a una velocidad de 1° C/h hasta una temperatura final de 20° C, mantenida durante 48 h.

Se observaron conversiones similares durante el estudio de estabilidad como se había observado previamente en los otros métodos de cristalización. En la mayoría de los casos, todas las formas sólidas se convirtieron en la realización 1a o en mezclas que contenían la realización 1a.

Cristalización por evaporación a partir de mezclas sólidas

En la cristalización por evaporación usando mezclas de solvente/antisolvente, se preparan soluciones trasparentes de un compuesto a partir de las cuales el solvente se evapora primero (alta presión de vapor), lo que hace que el compuesto precipite en cierta medida en forma de cristales. Estos cristales luego actúan como semillas cuando se evapora el antisolvente (presión de vapor más baja).

El compuesto de Ej. 1 no se disolvió completamente en cada uno de los sistemas solventes. Por esta razón, todos los experimentos incluyeron filtración previa a la evaporación.

Los resultados del análisis HT-XRPD demostraron que el compuesto de Ej. 1 cristalizó principalmente como la realización 1s tras la evaporación de las mezclas de solventes. Esto se observó para los siguientes sistemas de solvente/antisolvente: tetrahidrofurano/agua, acetonitrilo/agua, cloroformo/etanol, metanol/acetato de etilo, 2-butanona/isopropanol y heptano/acetona. A partir de dos sistemas, acetona/cumeno y 1,4-dioxano/formiato de etilo, se identificaron las realizaciones isoestructurales 3b y 3e, que después de AAC se convirtieron en diferentes mezclas de las realizaciones 1a y 3d, 1s y 3e, respectivamente.

Cristalización del antisolvente

Se prepararon soluciones saturadas del compuesto de Ej. 1 en solventes puros. Las adiciones de antisolvente se realizaron en adiciones directas e inversas. En la adición directa, el antisolvente se añadió en tres partes alícuotas a la solución del compuesto. La adición inversa se realizó añadiendo un volumen de solución de compuesto a un gran exceso de antisolvente (20 ml).

Después de la precipitación, los sólidos se separaron de los líquidos, se secaron en condiciones ambientales y se secaron al vacío (5 mbar) antes de ser analizados por HT-XRPD. Los experimentos en los que no se produjo precipitación tras la adición de antisolvente se almacenaron a 5° C durante 48 horas para inducir la precipitación. Luego se separaron los sólidos precipitados y se analizaron por HT-XRPD. Cuando no se obtuvieron sólidos, las soluciones se evaporaron en condiciones suaves y los sólidos residuales se analizaron por HT-XRPD. Todos los sólidos se expusieron a AAC (2 días a 40° C/70% de HR) y se volvieron a analizar mediante HT-XRPD.

La cristalización directa del antisolvente directo mostró precipitación en todos los casos. Todos los sólidos podrían clasificarse como miembros isoestructurales (1s, 1b, 1j, 1f) de la realización 1 o de la realización 3 (3b, 3d, 3f). Después de la exposición a AAC, todas las muestras sólidas se convirtieron en la realización 1a, excepto una que se convirtió en una mezcla de las realizaciones 1a y 3e.

Los experimentos de cristalización inversa de antisolvente realizados en DMSO como solvente dieron diferentes formas sólidas dependiendo del antisolvente usado. Con diclorometano o p-xileno se identificaron los miembros isoestructurales (1s y 1b) de la realización 1, mientras que con MTBE se obtuvo un residuo amorfo. La evaporación de dos soluciones con heptano y agua como antisolventes que no habían precipitado tras la adición del antisolvente llevó a un aceite. Se observaron conversiones a la realización 1a después de AAC, y los residuos amorfos se volvieron delicuescentes.

Experimentos de filtración en caliente

Los experimentos de cristalización por enfriamiento con filtración en caliente se realizaron a partir de soluciones sobresaturadas del compuesto de Ej. 1 preparado a 50° C en diferentes mezclas de solventes. Las soluciones filtradas en caliente se sometieron a un perfil de enfriamiento de 48 horas. Los viales en los que habían precipitado sólidos después del perfil de temperatura se centrifugaron y los sólidos se separaron del líquido y se analizaron por HT-XRPD (después de secar al vacío). Si no habían precipitado sólidos, las soluciones se evaporaron al vacío y los sólidos se analizaron por HT-XRPD. Todos los sólidos se expusieron a AAC (2 días a 40° C/70% HR) y se volvieron a analizar por HT-XRPD. En la mitad de los experimentos de filtración en caliente no se produjo precipitación y tras la evaporación de los solventes no se recuperaron suficientes sólidos debido a la escasa solubilidad del compuesto de Ej. 1 en esos sistemas solventes. En tres experimentos, se recuperó un residuo amorfo que después de AAC cristalizó en una mezcla de miembros de la realización 1 (1s o 1a) y 3 (3e) o se volvió delicuescente. La realización 5 se identificó a partir del experimento en acetona/cloroformo (50/50, v/v). Esta realización parecía ser físicamente inestable ya que se observó conversión a la realización 1a después de AAC.

Experimentos de termociclado

Se prepararon suspensiones de aproximadamente 6 mg de la realización 1 en 10 solventes a temperatura ambiente. Las suspensiones se ciclaron entre 5° C y 50° C. Tras finalizar el termociclado, los sólidos se separaron por centrifugación y se secaron en condiciones ambientales y al vacío (5 mbar) antes de analizarlos por HT-XRPD. Posteriormente, todos los sólidos se expusieron a AAC durante dos días y se analizaron de nuevo por HT-XRPD. Los experimentos de termociclado suelen promover la formación de la forma polimórfica más estable. Con la excepción del experimento realizado en ciclohexanona, todos los viales contenían sólidos después del perfil térmico. La solución de ciclohexanona se evaporó lentamente a vacío suave. Los miembros de las realizaciones 1, 3 o mezclas de los mismos se identificaron principalmente en los sólidos húmedos. Tras secarse estos sólidos, se observó la conversión a la realización 1. Las realizaciones 3b y 3e se obtuvieron a partir del termociclado en 300 pl de ciclohexanona a una concentración de 51 mg/ml (3b), y en 400 pl de isobutanol a una concentración de 37,3 mg/ml (3e). La realización 5 se obtuvo por termociclado en 800 pl de cloroformo a una concentración de 18,6 mg/ml.

Las Figuras 3, 4 y 5 muestran una superposición de patrones de HT-XRPD para las realizaciones enumeradas en la Tabla 2 y también a las que se hace referencia en las selecciones descritas anteriormente.

La realización 1s se recuperó de la mayoría de los experimentos de cristalización. Es un hidrato de canal que tiene un número variable de moléculas de agua y/u otros solventes incorporados dependiendo de las condiciones ambientales. Se observó conversión a la realización 1a. Esta forma contenía un poco más de agua (1,3 moléculas de agua). Todos los miembros isoestructurales de la realización 1 se convirtieron en la realización 1a después de la exposición a 40° C y 75% de HR durante dos días. Los desplazamientos de algunos picos de difracción en los patrones de XRPD para los miembros de la realización 1 podrían atribuirse a las diferentes moléculas de solvente o agua que se incorporaron en la red cristalina. La FIG. 4 muestra una superposición de patrones de HT-XRPD para miembros de la realización 1. El difractograma 1s corresponde al compuesto de Ej. 1 como material de partida en forma de realización 1s. El difractograma 1a corresponde a la realización 1a que se obtuvo después de la exposición a AAC de varias muestras de la realización 1s. El difractograma 1b corresponde a la realización 1b que se obtuvo a partir del experimento de equilibrio del solvente a temperatura ambiente en tolueno. El difractograma 1c corresponde a la realización 1c que se obtuvo del experimento de cristalización por enfriamiento a escala pl en acetato de etilo/1,4-dioxano (50/50, v/v). El difractograma 1c corresponde a la realización 1d que se obtuvo del experimento de cristalización por enfriamiento a escala pl en acetonitrilo/cloroformo (50/50, v/v). El difractograma 1e corresponde a la realización 1e que se obtuvo del experimento de cristalización por enfriamiento a escala pl en acetato de etilo/1,4-dioxano (50/50, v/v). El difractograma 1f corresponde a la realización 1f que se obtuvo del experimento de equilibrio del solvente a temperatura ambiente en p-xileno. El difractograma 1g corresponde a la realización 1g que se obtuvo del experimento de equilibrio del solvente a 50° C en anisol. El difractograma 1h corresponde a la realización 1h obtenida del experimento de cristalización por enfriamiento a escala de pl en p-xileno.

Los difractogramas para los miembros de la realización 3 se muestran en la FIG. 5. Los cambios observados en los diferentes patrones de HT-XRPD son más probablemente atribuibles a las diferentes moléculas de solvente que se incorporaron en la red cristalina. La realización 3 se obtuvo calentando la realización 2 a 40° C a 70% de HR durante 4 días. Las realizaciones 3b a 3e eran formas solvatadas que contenían una cantidad no estequiométrica de solvente que variaba dependiendo del solvente incorporado en la estructura cristalina (0,3-0,7 moléculas). Las mezclas que contenían miembros de la realización 3 eran inestables tras la exposición a AAC y se transformaron en algunos casos en la realización 1a o en mezclas de las realizaciones 1a y 3e. La conversión a la realización 1a se atribuye al intercambio de moléculas de solvente por moléculas de agua tras la exposición a una humedad relativa alta y la recristalización en la realización 1a hidratada.

La realización 9 se obtuvo calentando la realización 2 a una temperatura de aproximadamente 200° C seguido de enfriamiento a 25° C y también por DSC cíclico 25-200-25-300° C.

La realización 8 se obtuvo calentando la realización 5 a una temperatura de aproximadamente 175° C.

Las realizaciones de esta invención incluyen el compuesto de Ej. 1 en por lo menos una de las formas 1s, 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g, 1h, 2, 3b, 3c, 3d, 3e, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Las realizaciones de esta invención incluyen compuestos de acuerdo con esta invención en forma de cocristales farmacéuticamente aceptables.

Los ejemplos 1-12 son inhibidores de JAK y se probaron en ensayos enzimáticos y celulares. Los resultados del ensayo enzimático se presentan en la Tabla 4, que se titula Resultados de los ensayos de inhibición enzimática. Los ejemplos 1-12 también se probaron en tres ensayos celulares: IL-2 pSTAT5 (JAK1/JAK3), IFNa pSTAT4 (JAK1/TYK2) y GM-CSF pSTAT5 (JAK2/JAK2) con los resultados presentados en la Tabla 5 titulada Datos de ensayos basados en células. A continuación se muestra la descripción de cómo se realizó el ensayo enzimático, incluyendo los materiales usados en el ensayo (bajo el encabezado Materiales), cómo se configuró el ensayo (bajo el encabezado Protocolo de ensayo) y el método usado para analizar los datos (bajo el encabezado Método de espectrometría de masas de alto rendimiento (HTMS)).

Ensayo de inhibición enzimática

Materiales

El sustrato (NH2-KGGEEEEYFELVKK-CO2), el péptido estándar interno (NH2-SWGAIETDKEYYTVKD-CO2) y el péptido producto (solo para la curva estándar) (NH2-KGGEEEEY-Pi-FELVKK-CO2), se adquirieron de AnaSpec (Fremont, CA, USA). JAK1-JH1JH2 (574-1154 con una etiqueta His-GST y un sitio de escisión C-terminal tev (ENLYFQ-G)), JAK3-JH1JH2 (512-1124 con una etiqueta GST y un sitio de escisión C-terminal tev (ENLYFQ-G)) y Tyk2-JH1JH2 (8H_tev_580-1182-C936A-C1142A con un sitio de escisión C-terminal tev (En Ly FQ-G)) se purificaron internamente. JAK2-JH1JH2 (532-1132 con una etiqueta GST y un sitio de escisión tev C-terminal (ENLYFQ-G)), se adquirió de Invitrogen. El agua de grado LC/MS y el acetonitrilo (ACN) se adquirieron de HoneyWell, Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA). El dimetilsulfóxido al 99,8% (DMSO) y el ácido trifluoroacético al 99,5% (TFA) se adquirieron de EMD Chemical (Gibbstown, NJ, USA). El trifosfato de adenosina (ATP), ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS), cloruro de magnesio (MgCL), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ditiotreitol (DTT), ácido fórmico >95% (FA) y Tween-20 se adquirieron de Sigma (St Louis, MO, USA). Se adquirieron placas de polipropileno de 384 pocillos, N° de catálogo 781280 de Greiner (Monroe, NC), columna A C4 cartucho RapidFire™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Los experimentos HTMS se realizaron en modo de ionización positiva en un instrumento RapidFire 300 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), acoplado con un sistema ABSiex QTrap 4000 con una fuente de ionización por electropulverización (RF-MS) (Concord, ON, Canadá). El sistema RapidFire se ejecutó con 3 bombas isocráticas Agilent serie 1200 de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) y una bomba peristáltica modelo ISM832C de Ismatec (Wertheim, Alemania). Todo el sistema se hizo funcionar usando el software RapidFire interconectado con el software Analyst para el espectrómetro de masas.

Protocolo de ensayo

Se realizaron series de dosificación de 11 puntos para cada compuesto diluyendo en serie 1:3 o 1:4 en DMSO, siendo el punto 12 un control de DMSO. De las placas de dilución en serie, la muestra se transfirió a una placa de ensayo de 384 pocillos (N° 781280, Greiner, Monroe, NC) usando Labcyte Echo (Sunnyvale, CA) o Biosero ATS (San Diego, CA). Los compuestos se probaron por duplicado. La columna 12 se usó para controles positivos y la columna 24 contenía controles negativos sin enzima añadida. Se usó como compuesto de referencia un compuesto de nuestra colección interna, con actividad inhibidora de las isoformas de JAK. La concentración final de DMSO fue de <0,25% en una reacción de 20 pl. Las condiciones de ensayo para cada una de las proteínas se resumen en la Tabla 3. La reacción enzimática se inició mediante la adición de 10 pl de enzima y mezcla de ATP a 10 pl de solución de sustrato preparada en tampón de reacción (MOPS 50 mM pH 7,5, MgCl210 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM, Tween-20 al 0,002%). La enzima Tyk2 se preincubó con ATP 2 mM durante 30 min antes del inicio de la reacción. Inmediatamente después de la adición de la enzima a la mezcla de la reacción, la placa se centrifugó a 1000 rpm durante 1 minuto y se incubó a 25° C durante 45 minutos para JAK3 y 90 minutos para JAK1, JAK2 y Tyk2. La reacción se inactivó mediante la adición de 20 pl de TFA al 0,5% que contenía 0,15 pM de péptido estándar interno usando un dispensador de reactivos Multidrop Combi (Thermo Scientific, Waltham, MA). Típicamente se usaron varios pocillos en la columna 24 para la curva estándar del producto. Después de la inactivación, la placa de ensayo se centrifugó a 3000 rpm durante 3 minutos y se selló con papel de aluminio perforable (N° de catálogo 06644-001, Agilent) usando un PlateLoc (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Luego, las placas se transfirieron al RapidFire para el análisis MS. La inhibición del compuesto se evaluó mediante una disminución de los niveles de producto fosforilado en los pocillos de muestra en comparación con la reacción enzimática no inhibida. Las condiciones de ensayo para los ensayos anteriores se muestran en la Tabla 3 y los resultados de los Ej. 1-12, como se probaron en estos ensayos, se muestran en la Tabla 4.

Tabla 3. Condiciones de ensa o ara ensa os enzimáticos de la familia JAK

Método de espectrometría de masas de alto rendimiento (HTMS)

El análisis de muestras en RapidFire se realizó usando una fase móvil A1 que consistía de agua/TFA/FA (100:0,01:0,1, v/v/v), una fase móvil B1 que consistía de ACN/agua/TFA/FA (80: 20:0.01:0.1, v/v/v). Se usaron los siguientes parámetros de ejecución: estado 1 (aspirado), 250 ms; estado 2 (carga/lavado), 3000 ms; estado 3 (eluido), 4000 ms; estado 4 (reequilibrado), 1000 ms con un caudal de 1,25 ml/min. Las muestras se aspiraron directamente de la placa de ensayo de 384 pocillos y se colocaron en un cartucho de extracción C4 en fase sólida a microescala RF-MS (Tipo A). El componente no deseado como la sal, el cofactor, el detergente y la proteína grande se eliminaron por lavado y los analitos retenidos (sustrato, producto e IS) se coeluyeron directamente en el sistema ABSiex Qtrap 4000. La cuantificación de péptido (sustrato), fosfopéptido (producto) y péptido de estándar interno (IS) se realizó por MRM usando 562^136.0, 589.2^-215.7 y 953.2^-158.8 (o 974.2^-158.8) transiciones respectivamente.

Tabla 4 Resultados de ensa os de inhibición enzimáticos

Ensayos celulares

Ensayo celular IL-2 pSTAT5 (JAK1/JAK3)

Se realizó el ensayo AlphaLISA (basado en Alpha Technology de PerkinElmer) colocando primero en placas PBMC recién descongeladas (Biological Specialty Corporation) en placas de 384 pocillos a 30.000 células por 4 |jl por pocillo en HBSS (solución salina equilibrada de Hanks) que contenía 0,1% de BSA (albúmina sérica bovina) libre de proteasa y libre de IgG (inmunoglobulina G), (Jackson ImmunoResearch N° de Cat. 001-000-161). Luego, las células se trataron con 2 jl/pocillo de compuestos diluidos en DMSO a concentraciones tituladas semilogarítmica, con una concentración de prueba más alta de 10 pM y una concentración final de DMSO del 0,5%, durante treinta minutos a 37° C. Luego, las células se estimularon con 2 pl/pocillo de IL-2 (R&D Systems N° de Cat.

202-IL-050) a 5 ng/ml durante treinta minutos a 37° C. Las reacciones celulares se terminaron mediante la adición de 2 pl/pocillo de tampón de lisis (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST5-A10K) seguido de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 pl/pocillo de mezcla aceptora (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST5-A10K) a las células y se incubaron en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, se añadieron a las células 5 pl/pocillo de mezcla de donante (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST5-A10K) y se incubaron en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se leyeron en un PerkinElmer EnVision para la detección de la señal de fluorescencia resuelta en el tiempo. El porcentaje de inhibición de pSTAT5 dependiente de IL-2 se determinó a las concentraciones de prueba del compuesto; y para cada compuesto se generó una curva de dosis y se calculó la IC50. La IC50 del compuesto se calculó mediante regresión no lineal, análisis de respuesta a la dosis sigmoidal de la curva de titulación de dilución semilogarítmica de la concentración del compuesto frente a la señal Alpha. El acrónimo “Aphfa” significa ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado; la señal Alpha es una señal luminiscente/fluorescente.

Ensayo celular de IFNa pSTAT4 (JAK1/TYK2)

El ensayo AlphaLISA (basado en Alpha Technology de PerkinElmer) se realizó colocando primero en placas PBMC recién descongeladas (Biological Specialty Corporation) en placas de 384 pocillos a 100.000 células por 6 pl por pocillo en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) que contenía FBS al 10% (suero bovino fetal) y 1.000 Ul/ml de penicilina y 1.000 pg/ml de estreptomicina. Luego las células se trataron con 2 pl/pocillo de compuestos diluidos en DMSO a concentraciones tituladas semilogarítmicas, con una concentración de prueba más alta de 10 pM y una concentración final de DMSO del 0,5%, durante treinta minutos a 37° C. Luego, las células se estimularon con 2 pl/pocillo de IFNa (PBL Assay Science N° de Cat. 11101-2) a 4 ng/ml durante treinta minutos a 37° C. Las reacciones celulares terminaron mediante la adición de 2 pl/pocillo de tampón de lisis (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST4-A10K) seguido de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 4 pl/pocillo de mezcla aceptora (PerkinElmer N° de Cat ALSU-PST4-A10K) a las células y se incubaron en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, se añadieron a las células 4 pl/pocillo de mezcla de donante (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST4-A10K) y se incubaron en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se leyeron en un PerkinElmer EnVision para la detección de la señal de fluorescencia resuelta en el tiempo. El porcentaje de inhibición de pSTAT4 dependiente de IFNa se determinó a las concentraciones de prueba del compuesto; y para cada compuesto se generó una curva de dosis y se calculó la IC50. La IC50 del compuesto se calculó mediante regresión no lineal, análisis de respuesta a la dosis sigmoidal de la curva de titulación de dilución semilogarítmica de la concentración del compuesto frente a la señal Alpha. El término "Alpha" se define en la descripción del ensayo celular inmediatamente anterior.

Ensayo celular GM-CSF pSTAT5 (JAK2/JAK2)

El ensayo AlphaLISA (basado en Alpha Technology de PerkinElmer) se realizó colocando primero en placas PBMC recién descongeladas (Biological Specialty Corporation) en placas de 384 pocillos a 30.000 células por 4 pl por pocillo en HBSS que contenía 0,1% de BSA libre de proteasa y libre de IgG (Jackson ImmunoResearch N° de Cat. 001-000-161). Luego, las células se trataron con 2 pl/pocillo de compuestos diluidos en DMSO a concentraciones tituladas semilogarítmicas, con una concentración de prueba más alta de 10 pM y una concentración final de DMSO del 0,5%, durante treinta minutos a 37° C. Luego las células se estimularon con 2 pl/pocillo de GM-CSF (R&D Systems N° de Cat. 215-GM-050) a 11 pg/ml durante quince minutos a 37° C. Las reacciones celulares se terminaron mediante la adición de 2 pl/pocillo de tampón de lisis (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST5-A10K) seguido de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 pl/pocillo de mezcla aceptora (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST5-A10K) a las células y se incubaron en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, se añadieron a las células 5 pl/pocillo de mezcla de donante (PerkinElmer N° de Cat. ALSU-PST5-A10K) y se incubaron en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se leyeron en un PerkinElmer EnVision para la detección de la señal de fluorescencia resuelta en el tiempo. El porcentaje de inhibición de pSTAT5 dependiente de GM-CSF se determinó a las concentraciones de ensayo del compuesto; y para cada compuesto se generó una curva de dosis y se calculó la IC50. La IC50 compuesto se calculó mediante regresión no lineal, análisis de respuesta a la dosis sigmoidal de la curva de titulación de dilución semilogarítmica de la concentración del compuesto frente a la señal Alpha. El término "Alpha" se define en la descripción del ensayo celular IL-2 pSTAT5 (JAK1/JAK3).

Tabla 5. Datos de ensa o basado en células

Los ejemplos 1-12 se probaron ensayos de solubilidad y permeabilidad. Los resultados del ensayo de solubilidad se presentan en la Tabla 6, titulada Datos del ensayo de solubilidad, y los resultados del ensayo de permeabilidad se presentan en la Tabla 7, titulada Datos de permeabilidad de MDCK-MDR1. Estos ensayos de solubilidad y permeabilidad se describen a continuación bajo los encabezados Ensayos de solubilidad y Ensayos de permeabilidad, respectivamente.

Ensayos de solubilidad

Las mediciones de solubilidad se realizaron en los siguientes medios de solubilidad: fluidos gástricos simulados (34,2 mM de cloruro de sodio y 100 mM de ácido clorhídrico) o fluidos intestinales simulados (en ayunas [pH 6,5]: 3 mM de taurocolato de sodio, 0,75 mM de lecitina, 28,4 mM de fosfato monobásico de sodio, 8,7 mM de hidróxido de sodio y 105,9 mM de cloruro de sodio). Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO a una concentración de 10 mM. Los compuestos de prueba se dispensaron (20 |jl) en placas Nunc 1-ml-96-Deep-Well-PP, y el DMSO se evaporó mediante purga de nitrógeno desde un TurboVap 96 durante 6 horas o hasta que se produjo un residuo seco. Luego, se añadieron 400 j l de medio de solubilidad al pocillo que contenía el sólido seco. Se colocó de forma segura una tapa de pocillos precortada sobre el bloque de placas de pocillos y las muestras se agitaron vigorosamente durante 2-5 días a temperatura ambiente. Después del período de incubación, las muestras se filtraron a través de una placa AcroPrep 1 -ml-96-Filter en una placa nueva de 2-ml-96-Deep-Well-PP, y los sobrenadantes se cuantificaron por UV-HPLC usando una calibración de 3 puntos que variaba entre 0,004 y 0,55 mM. La solubilidad de cada compuesto se calculó a partir de la siguiente ecuación:

Area Pico de la Muestra

Solubilidad = ----------------------------------------------------------------------------Factor de respuesta media de 3 estándares

Los valores de solubilidad estuvieron en el intervalo de 4-400 jM . Los valores fuera de este intervalo se informaron como <4 jM o >400 jM . Las solubilidades se informan siempre que el compuesto en estudio sea lo suficientemente estable para completar la determinación de solubilidad correspondiente.

Tabla 6. Datos de ensa o de solubilidad

Ensayos de permeabilidad

Las mediciones de permeabilidad se realizaron de acuerdo con el protocolo Cyprotex usando la línea celular MDCK-MDR1 obtenida del NIH (Rockville, MD, USA). Las células entre los números de pase 6-30 se sembraron en una Multiscreen Plate™ (Millipore) a una densidad celular de 3,4 x 105 células/cm2 y se cultivaron durante tres días antes de realizar los estudios de permeabilidad. Las células en este ensayo forman una lámina cohesiva de una sola capa de células que cubre el área de la superficie de la placa de cultivo, también conocida como monocapa confluente, y el cuarto día se añadió el compuesto de prueba al lado apical de la membrana y se monitorizó el transporte del compuesto a través de la monocapa durante un período de tiempo de 60 min.

En una forma sencilla y básica de introducir los términos "A" y "B" que se usan a menudo en estos ensayos, el lado o compartimento apical ("A") de una entidad es el lado de dicha entidad que está expuesto a la luz o ambiente exterior, mientras que el lado o compartimiento basolateral (“B”) es el lado o compartimiento de dicha entidad que está expuesto al ambiente típicamente interno, abarcando el lado opuesto. Por ejemplo, cuando dicha entidad es ilustrativamente una célula del epitelio intestinal, el lado apical de dicha célula intestinal sería el lado de la célula expuesto a la luz intestinal, mientras que el lado basolateral sería el lado que está expuesto a la sangre.

Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO a una concentración de 10 mM. Las soluciones de dosificación se prepararon diluyendo el compuesto de prueba con tampón de ensayo (solución salina equilibrada de Hanks), pH 7,4, a una concentración final de 5 |^jM. Para la evaluación de la permeabilidad de apical a basolateral ("A-B"), se retiró el tampón del compartimento apical y se reemplazó con una solución de dosificación del compuesto de prueba con o sin el inhibidor de la glicoproteína de permeabilidad ("PgP", "P-gP", "Pgp" o "P-gp”) elacridar (2 |jM). Para la evaluación de la permeabilidad de basolateral a apical ("B-A"), se retiró el tampón de la placa complementaria y se reemplazó con la solución de dosificación del compuesto de prueba. Las incubaciones se realizaron por duplicado a 37° C en una atmósfera de 5% de CO2 con una humedad relativa del 95%. Cada ensayo incluía los marcadores de referencia propranolol (alta permeabilidad) y prazosin (sustrato de PgP). Después de una incubación de 60 minutos, las muestras apicales y basolaterales se diluyeron y los compuestos de prueba se cuantificaron mediante LC/MS/MS usando una calibración de 8 puntos en el intervalo de 0,0039 a 3 j M con la dilución adecuada de las muestras (factor de dilución del receptor = 1; factor de dilución de donante y C0 = 10). El coeficiente de permeabilidad (Papp) de cada compuesto se calculó a partir de la siguiente ecuación: Papp =(dQ/dt)/(Cü x S), donde dQ/dt es la tasa de permeación del fármaco a través de las células, C0 es la concentración del compartimento donante en el momento cero y S es el área de la monocapa celular.

Se midió el porcentaje de recuperación para todas las condiciones de incubación. Estas medicione no revelaron unión inaceptable de compuesto/placa ni acumulación de compuesto en la monocapa celular.

La segunda y tercera columnas de la Tabla 7 muestran los valores de Papp(A-B) para el transporte de compuestos de apical a basolateral sin (segunda columna) y con un inhibidor de P-gp (tercera columna, indicada como Peapp(A-B)) eso fue elacridar. Papp(A-B) da una indicación del grado de permeación a través de las células en este ensayo, que está previsto para modelar el transporte transcelular a través de células que expresan Pgp, como las células del tracto gastrointestinal que expresan Pgp. Se determinan los valores de Peapp(A-B) (Papp(A-B) en presencia del inhibidor de P-gp) dados en la columna 3 para confirmar el papel de P-gp en el flujo de salida del compuesto. La cuarta columna de la Tabla 7 muestra los valores de Papp(B-A) para el transporte del compuesto de basolateral a apical. Las proporciones de flujo de salida del compuesto de prueba se dan en la quinta columna de la Tabla 7 como Papp(B-A)/Papp(A-B) usando los valores de coeficiente de permeabilidad correspondientes de la cuarta y segunda columnas en la misma tabla. Las relaciones de flujo de salida (quinta columna, Tabla 7) son consistentemente mayores que 2 para los compuestos (A)-(C) y también para los compuestos de Ej. 1-12, lo que indica que la salida de compuestos se produce para todos estos compuestos.

Los valores de Papp(A-B) en la columna 2 son generalmente bajos y comparables para los compuestos de referencia (A)-(C) y también para los compuestos de Ej. 1-12. Estos valores bajos indican una permeabilidad baja para todos estos compuestos, lo que se debe a los efectos de P-gp, ya que todos estos compuestos son sustratos de P-gp, como lo indican los valores dados en la columna 5, que son todos mayores que 2. Para caracterizarse como de baja permeabilidad, los valores dados en la tercera y cuarta columnas para Peapp(A-B) y Papp(B-A), respectivamente, deben ser bajos. Sin embargo, estos datos muestran que los valores de Papp(B-A) para los compuestos (A)-(C) son mayores que los valores correspondientes de los compuestos de Ej. 1-12.

Se monitorizó la integridad de cada monocapa examinando la permeación de amarillo lucifer mediante análisis fluorimétrico. Este examen reveló que las células en este ensayo mantuvieron una monocapa confluente satisfactoria.

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Estudios in vivo

Dosificación oral - Protocolo 1

A tres ratones hembra C57BL/6 sin ayuno se les administró por vía oral el compuesto de prueba a una dosis de 25 mg/kg p.o. como una solución en hidroxipropil-beta-ciclodextrina al 20% (HPpCD) a un volumen de dosis de 5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre a las 0,5, 2 y 4 h después de la dosis mediante sangrado retroorbital o venopunción de la vena metatarsiana dorsal. Las muestras de sangre se recogieron en tubos que contenían anticoagulante (heparina-Na) y se colocaron en hielo húmedo. La fracción de plasma se separó por centrifugación y se congeló a -20° C durante un máximo de 4 h y a -80° C después de 4 h, a menos que se analizara poco después de la recogida de la muestra. Las muestras de colon se recogieron 4 h después de la dosis. Desde el comienzo del ciego, se diseccionó una muestra de colon de 4-6 cm, se abrió por corte en el eje longitudinal y se retiraron los contenidos sólidos enjuagando 2 ml de solución salina. Se lavó adicionalmente el colon colocándolo en 5 ml de solución salina y se agitó durante 5 segundos. Luego, la muestra de colon se secó golpeándola, se pesó y se homogeneizó como 1 parte de tejido (g) por 4 partes de agua de grado HPLC (ml). Las concentraciones del compuesto en plasma y homogeneizado de colon se determinaron usando un método calificado de cromatografía líquida-espectrometría de masas de triple cuadrupolo (LC-MS/MS). Este protocolo se usó para evaluar los siguientes compuestos de prueba: Compuestos (B) y (C) y Ejemplos 6 y 11.

Protocolo de dosificación oral 2

A tres ratones hembra C57BL/6 sin ayuno se les administró por vía oral el compuesto de prueba a una dosis de 25 mg/kg p.o, como una solución en HPpCD al 20% a un volumen de dosis de 5 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre a las 0,5, 2 y 4 h después de la dosis a través de una hemorragia retroorbitaria o de la vena metatarsiana dorsal. Las muestras de sangre se recogieron en tubos que contenían anticoagulante (heparina-Na) y se colocaron en hielo húmedo. La fracción de plasma se separó por centrifugación y se congeló a -20° C durante un máximo de 4 h y a -80° C después de 4 h, a menos que se analizara poco después de la recogida de la muestra. Las muestras de colon se recogieron 4 h después de la dosis. Desde 2 cm por debajo del ciego, se diseccionó una muestra de 4 cm del colon, se abrió por corte en el eje longitudinal y se retiraron los contenidos sólidos enjuagando con 2 ml de solución salina. Se lavó adicionalmente el colon colocándolo en 5 ml de solución salina y se agitó durante 5 segundos. Luego, la muestra de colon se secó golpeándola, se pesó y se homogeneizó como 1 parte de tejido (g) por 4 partes de agua de grado HPLC (ml). Las concentraciones del compuesto en plasma y homogeneizado de colon se determinaron usando un método calificado de cromatografía líquida-espectrometría de masas de triple cuadrupolo (LC-MS/MS). Este protocolo se usó para evaluar los siguientes compuestos de prueba: Compuesto (A) y Ejemplos 1-5, 7-10 y 12.

Protocolo de dosificación IC 3

Grupo de dosis intracolónica (IC): después de la anestesia con isoflurano por inhalación, a tres ratones hembra C57BL/6 sin ayuno se les administró el compuesto por vía intracolónica a través de una pequeña incisión en la pared abdominal usando una jeringuilla y una aguja a una dosis de 5 mg/kg como una solución en HPpCD al 20% a un volumen de dosis de 1 ml/kg. Se recogieron muestras de sangre a las 0,5, 2 y 4 h después de la dosis mediante sangrado retroorbital. Las muestras de sangre se recogieron en tubos que contenían anticoagulante (heparina-Na) y se colocaron en hielo húmedo. La fracción de plasma se separó por centrifugación y se congeló a -20° C durante un máximo de 4 h y a -80° C después de 4 h, a menos que se analizara poco después de la recogida de la muestra. Las muestras de colon se recogieron 4 h después de la dosis. Desde 2 cm por debajo del ciego, se diseccionó una muestra de 4 cm del colon, se abrió por corte en el eje longitudinal, y los contenidos sólidos se retiraron enjuagando con 2 ml de solución salina. Se lavó adicionalmente el colon colocándolo en 5 ml de solución salina y se agitó durante 5 segundos. Luego, la muestra de colon se secó golpeándola, se pesó y se homogeneizó como 1 parte de tejido (g) por 4 partes de agua de grado HPLC (ml). Las concentraciones del compuesto en plasma y homogeneizado de colon se determinaron usando un método calificado de cromatografía líquida-espectrometría de masas de triple cuadrupolo (LC-MS/MS). Este protocolo se usó para evaluar la dosificación IC de los siguientes compuestos de prueba: Ejemplos 1, 3 y 4.

Los compuestos de Ej. 1-12 se caracterizan adicionalmente por las propiedades fisicoquímicas proporcionadas en la Tabla 8. Los valores de cLog P y tPSA se calcularon usando ChemBioDraw Ultra 14.0, donde P es el coeficiente de partición n-octanol - agua. El área superficial polar total (tPSA) se calcula como la suma de la superficie de todos los átomos polares, principalmente oxígeno y nitrógeno, incluyendo también sus hidrógenos unidos.

T l Al n r i fii ími l m E 1-12

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida; 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamida;

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)acetamida;

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

2. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida; 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

3. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida; 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

4. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1

hidroxiciclobutil)metill)acetamida y

sales farmacéuticamente aceptable y combinaciones de los mismos,

opcionalmente en donde dicho compuesto es:

(a) 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropill)acetamido; o

(b) 2-(1 -((1 r,4r)-4-(2-1 H-imidazol-4-il)-imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo; o

(c) 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida.

5. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamida;

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)acetamida;

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismas.

6. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida; 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

7. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamida;

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

8. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

9. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metill)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos,

opcionalmente en donde dicho compuesto se selecciona de:

(a) el grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropill)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(2-1 H-imidazol-4-il)-imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos; o

(b) el grupo que consiste de

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metill)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos; o

(c) el grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metill)acetamida; y

sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.

10. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(ciclopropilmetil)acetamida;

N-(2-cianoetil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida; 2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acetamida;

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)acetamida;

N-(2-ciano-2-metilpropil)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metil)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)acetamida;

N-(4-(cianometil)biciclo[2.2.1]heptan-1-il)-2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)acetamida;

2-(1 -((1 r,4r)-4-cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 H-pirazol-3-il)acetamida; 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida; y

cocristales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

11. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 10 seleccionado del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2

metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclobutil)metill)acetamida; y

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1.

13. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 12, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de

2-(1-((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropil)acetamida;

2-((1 r,4r)-4-(2-(1 H-imidazol-4-il)imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo;

2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-((1 -hidroxiciclopropil)metill)acetamida y

sales farmacéuticamente aceptable, y combinaciones de los mismos,

opcionalmente en donde dicho compuesto es:

(a) 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroimidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(2-hidroxi-2-metilpropill)acetamido; o

(b) 2-(1 -((1 r,4r)-4-(2-1 H-imidazol-4-il)-imidazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-1 (6H)-il)ciclohexil)acetonitrilo; o

(c) 2-(1 -((1 r,4r)-4-(cianometil)ciclohexil)-1,6-dihidroim idazo[4,5-d]pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-N-(1 -hidroxiciclopropil)metil)acetamida.