ES2921180T3

ES2921180T3 - Método para medir la toxicidad del CSF humano

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Publication number: ES2921180T3
Application number: ES15779412T
Authority: ES
Original assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2035-04-16
Also published as: JP6683602B2; EP3133394A1; EP3133394B1; WO2015159963A1; US20170043039A1; JPWO2015159963A1; EP3133394A4; US10232056B2

Abstract

El problema es proporcionar un método que pueda evaluar de manera rápida y eficiente la toxicidad del líquido cefalorraquídeo humano (LCR) con pequeñas cantidades de LCR humano. El problema se resuelve mediante un método que comprende la administración de CSF humano en el ventrículo cerebral de un roedor como un ratón, y evalúa la función cognitiva del roedor mediante el uso de una técnica farmacológica conductual. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para medir la toxicidad del CSF humano

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para medir la toxicidad del líquido cefalorraquídeo humano (al que en adelante se hace referencia como “CSF”), un método para determinar la enfermedad de Alzheimer, y un método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer Antecedentes de la técnica

Se ha sugerido que los agregados solubles (oligómeros) de amiloide p (amiloide beta; en adelante, al que se hace asimismo referencia como “Ap”) son la principal causa patógena de la enfermedad de Alzheimer (en adelante, a la que se hace asimismo referencia como “AD”) (bibliografía 1 no de patente).

Aunque se reconoce comúnmente que el oligómero de Ap en el CSF representa un biomarcador clínico importante para medir el efecto medicinal de un agente que se dirige a Ap, tal como un anticuerpo anti-Ap, los atributos detallados (tales como la estructura, el tamaño y el origen) del oligómero de Ap que en realidad provoca patología en pacientes con AD sigue siendo esquivo (bibliografía 2 no de patente). Por lo tanto, se desea alguna forma de medir tales oligómeros de Ap patológicos.

Un método que mide bioquímicamente los niveles de oligómero de Ap en el CSF humano, y un bioensayo que mide la bioactividad del CSF humano, están actualmente disponibles como métodos para medir el oligómero de Ap en el CSF humano. Se han estudiado sistemas de ensayo basados en inmunoensayos como método para medir bioquímicamente los niveles de oligómero de Ap. Sin embargo, debido a los niveles de oligómero de Ap considerablemente bajos en el CSF, casi no existe ningún informe que haya tenido éxito en dicha medida. El bioensayo está disponible como un ensayo in vitro e in vivo, como se describe a continuación.

Existe un informe de un ensayo in vitro en el que se produjeron muerte celular, degeneración sináptica, y otros cambios en células nerviosas cultivadas a las que se aplicó una alta concentración (orden nM) de oligómero de Ap artificial (Bibliografía 3 no de patente).

Asimismo existen informes de que las células nerviosas se dañan cuando el CSF obtenido de un paciente con AD (en adelante, denominado “CSF de paciente con AD”) actúa sobre las líneas celulares de las células nerviosas (bibliografías 4 y 5 no de patente).

Asimismo existe un informe de que la electroestimulación de un corte de hipocampo de ratón después de la exposición a un oligómero de Ap artificial suprime la potenciación a largo plazo (en adelante, “LTP”), que es un fenómeno asociado con la formación de la memoria del cerebro, en el corte (bibliografía 6 no de patente).

En cuanto al ensayo in vivo, existe un informe en el que la electroestimulación después de la administración de CSF de paciente con AD en el ventrículo cerebral de la rata suprimió la LTP en el cerebro de la rata (bibliografía 7 no de patente).

Asimismo existen informes de que el comportamiento de aprendizaje de ratas o ratones se obstaculiza cuando se administran en los ventrículos cerebrales de rata o ratón un oligómero u oligómeros de Ap artificiales extraídos de células cultivadas o tejido cerebral (bibliografías 8 y 9 no de patente). Sin embargo, no existe ningún informe sobre la administración de CSF de pacientes con AD a roedores, ni de la medida en los animales para determinar la presencia o ausencia de cualquier deterioro resultante del comportamiento de aprendizaje.

Si bien los bioensayos de oligómeros de Ap en CSF de pacientes con AD están disponibles como se describe anteriormente, no existe un bioensayo establecido que pueda evaluar rápida y eficientemente la bioactividad del CSF humano, es decir, la toxicidad del CSF humano, con pequeñas cantidades de CSF.

Técnica relacionada

Documento no de patente

[NPL 1] Nat. Neurosci., 2012, vol. 15, p. 349

[NPL 2] Nat. Med., 2010, vol. 16, p. 1218

[NPL 3] Neuron., 2010, vol. 66, p. 739

[NPL 4] Cell. Stress. Chaperones., 2010, vol. 15, p. 115

[NPL 5] Cell. Biochem. Funct., 2009, vol. 27, p. 395

[NPL 6] Brain. Res., 2009, vol. 1269, p. 176

[NPL 7] J. Neurosci., 2008, vol. 28, p. 4231

[NPL 8] PLoS. One., 2012, vol. 7, e29940

[NPL 9] Neurobiol. Aging., 2011, vol. 32, p. 1784

Sumario de la invención

Problemas que debe resolver la invención

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método que pueda evaluar rápida y eficazmente la toxicidad del CSF humano con pequeñas cantidades de CSF humano.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para determinar rápida y eficazmente la enfermedad de Alzheimer con una pequeña cantidad de CSF humano.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para medir rápida y eficazmente el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer con pequeñas cantidades de CSF humano.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para medir rápida y eficazmente la sensibilidad de un sujeto a un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer con pequeñas cantidades de CSF humano.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para identificar rápida y eficazmente un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer con pequeñas cantidades de ^cS^fhumano.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para crear rápida y eficazmente un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer con pequeñas cantidades de CSF humano.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores realizaron exhaustivos estudios y encontraron que los problemas anteriores pueden resolverse administrando CSF humano en el ventrículo cerebral de un roedor y evaluando la función cognitiva del roedor usando una técnica farmacológica conductual, completando así la presente invención.

Es decir, la presente invención es como sigue.

1. Un método para medir la toxicidad del líquido cefalorraquídeo humano (en adelante, al que se hace referencia como “CSF”), o para determinar la enfermedad de Alzheimer, o para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método

administrar CSF recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer, o CSF recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer al que se le ha administrado el agente, en el ventrículo cerebral de un roedor seleccionado de un ratón, rata o hámster, y

evaluar la función cognitiva del roedor mediante el uso de una técnica farmacológica conductual.

2. El método según el 1 anterior, en el que la evaluación de la función cognitiva es la evaluación de la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

3. El método según 1 o 2 anteriores, en el que la técnica farmacológica conductual es una prueba de laberinto en Y.

4. El método según uno cualquiera de 1 a 3 anteriores, en el que la dosificación del CSF humano administrado en el ventrículo cerebral del ratón, rata o hámster es 5 pl o más.

5. El método según uno cualquiera de 1 a 4 anteriores, en el que el roedor es un ratón.

6. El método para determinar la enfermedad de Alzheimer según uno cualquiera de 1 a 5 anteriores, en el que el método comprende comparar la función cognitiva del ratón, rata o hámster al que se le administra un control en el ventrículo cerebral y la función cognitiva del ratón, rata o hámster al que se le administra el CSF humano en el ventrículo cerebral.

7. El método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer según uno cualquiera de 1 a 5 anteriores, en el que el método comprende administrar cada uno de CSF humano que se ha recogido de un sujeto que comienza o experimenta continuamente la administración del agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer antes de la administración del agente, y de CSF humano que se ha recogido del sujeto después de la administración del agente, en el ventrículo cerebral de un roedor seleccionado de entre ratón, rata o hámster, y comparar la función cognitiva de los roedores.

8. El método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer según uno cualquiera de 1 a 5 y 7 anteriores, en el que el agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer es un anticuerpo antioligómero p amiloide (beta amiloide, al que se hace referencia en adelante como “Ap”).

9. El método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer según uno cualquiera de 1 a 5, 7 y 8 anteriores, en el que el agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer es un anticuerpo seleccionado de entre los siguientes (a y b):

(a) un anticuerpo monoclonal en el que la región 1 determinante de la complementariedad (a la que se hace referencia en adelante como “CDR”), CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada (a la que se hace referencia en adelante como “VH”) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID N°: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera (a la que se hace referencia en adelante como “VL”) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID N°: 6 , 7 y 8, respectivamente; y

(b) un anticuerpo monoclonal en el que la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 1, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 2.

Efectos de la invención

Según la presente invención, mediante la administración de un CSF humano en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y la evaluación de la función cognitiva del ratón, rata o hámster mediante el uso de una técnica farmacológica conductual, se proporciona un método para evaluar rápida y eficazmente la toxicidad del líquido cefalorraquídeo humano con pequeñas cantidades de CSF humano, un método para determinar rápida y eficazmente la enfermedad de Alzheimer con pequeñas cantidades de CSF humano, y un método para medir rápida y eficazmente el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer con pequeñas cantidades de CSF humano.

Breve descripción de los dibujos

[figura 1] La figura 1 es un diagrama que examina la respuesta a la dosis con respecto al efecto del CSF de paciente con AD sobre la función cognitiva del ratón, en el que el eje vertical representa la alternancia espontánea (%) como un índice de la función cognitiva, y el eje horizontal representa muestras administradas a ratones, junto con sus dosificaciones (jl). Se usó disolución salina fisiológica como simulación (“Sham”). AD CSF representa CSF de paciente con AD. * representa el grupo administrado para p < 0.05 (frente a simulación) en la prueba de Dunnett. El experimento se realizó con N = 12.

[figura 2] La figura 2 es un diagrama que examina el efecto de múltiples CSF de pacientes con AD sobre la función cognitiva del ratón, en el que el eje vertical representa la alternancia espontánea (%) como un índice de la función cognitiva, y el eje horizontal representa muestras administradas a ratones. Se usó disolución salina fisiológica como simulación. AD CSF representa CSF de paciente con AD. Los números 8005 y 8026 para los CSF de pacientes con AD representan el ID del paciente, y conjunto representa una muestra como una mezcla de los CSF de 3 pacientes. ** representa el grupo administrado para p < 0.01 (frente a simulación) en la prueba de Dunnett. * representa el grupo administrado para p < 0.05 (frente a simulación). El experimento se realizó con N = 9.

[figura 3] La figura 3 es un diagrama que examina el efecto de múltiples CSF normales sobre la función cognitiva del ratón, en el que el eje vertical representa la alternancia espontánea (%) como un índice de la función cognitiva, y el eje horizontal representa las muestras administradas a los ratones, y los ID (números) del CSF. Se usó disolución salina fisiológica como simulación. AD representa CSF de paciente con AD. Normal representa CSF normal. *** representa el grupo administrado para p < 0.001 (frente a simulación en la prueba de Dunnett. El experimento se realizó con N = 8.

[figura 4] La figura 4 es un diagrama que examina el efecto del anticuerpo humanizado antioligómero de Ap (6E4HV0LV0) en la administración intravenosa sobre el deterioro de la función cognitiva por el CSF de paciente con AD, en el que el eje vertical representa la alternancia espontánea (%) como un índice de la función cognitiva. La etiqueta superior en el eje horizontal representa el anticuerpo administrado por vía intravenosa a ratones, y la dosificación de anticuerpo (mg/kg). La etiqueta inferior en el eje horizontal representa muestras que tuvieron administración intraventricular. Se usó disolución salina fisiológica como simulación. AD CSF representa CSF de paciente con AD. ** representa el grupo administrado para p < 0.01 (frente a IgG4 humana i.v.-simulación) en la prueba de la t de Student. ## representa el grupo administrado para < 0.01 (IgG4 humana i.v.-AD CSF) en la prueba de Dunnett. El experimento se realizó con N = 8.

[figura 5] La figura 5 es un diagrama que examina el efecto del anticuerpo antioligómero de Ap (6E4HV0LV0) en el pretratamiento sobre el deterioro de la función cognitiva por el CSF de paciente con AD, en el que el eje vertical representa la alternancia espontánea (%) como un índice de la función cognitiva, y el eje horizontal representa muestras administradas a ratones, y concentración de la muestra (ng/ml). Se usó disolución salina fisiológica como simulación. Se utilizó líquido cefalorraquídeo artificial como vehículo. AD CSF representa CSF de paciente con AD. * representa el grupo administrado para p < 0.05 (frente al vehículo-simulación) en la prueba de la t de Student. El experimento se realizó con N = 8.

[figura 6] La figura 6 (a) y la figura 6 (b) son diagramas que explican un aparato de la prueba de laberinto en Y.

Formas de realización para poner en práctica la invención

A continuación, la presente invención se describirá en detalle.

[Método de medida de la toxicidad del CSF humano]

En primer lugar, a continuación se describe un método para medir la toxicidad del CSF humano. El método comprende administrar un CSF humano en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y evaluar la función cognitiva del ratón, rata o hámster usando una técnica farmacológica conductual.

El CSF humano no está particularmente limitado, siempre que sea CSF que se haya recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, el CSF humano puede ser un CSF humano disponible comercialmente, CSF humano que haya sido recogido por un médico de un sujeto, o cualquier otro CSF, incluyendo un CSF inmediatamente después de ser recogido de seres humanos, y un CSF humano recogido que se crioconserva y descongela según sea necesario para su uso.

El método usa ratones, ratas o hámsteres, de los cuales se prefieren los ratones.

Cuando se administra CSF humano en la vía intraventricular, el CSF humano puede administrarse en el ventrículo cerebral izquierdo, el ventrículo cerebral derecho, o ambos ventrículos cerebrales. Como método de administración de CSF humano, se puede utilizar un método convencional de administración de un agente o similar en los ventrículos cerebrales (Scientific Reports, 2014, vol. 4, 6777).

Una dosificación de CSF humano administrada en el ventrículo cerebral es, por ejemplo, preferentemente 5 pl o más, más preferentemente 10 pl, para ratones. Después de una hora desde la administración de 5 pl o más de CSF humano intraventricularmente en el ratón, se puede medir la toxicidad del CSF humano. Una dosificación de CSF humano administrado en los ventrículos cerebrales de roedores distintos de ratones se puede ajustar según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud.

En la presente invención, pueden usarse técnicas farmacológicas conductuales para la evaluación de la función cognitiva de roedores. Como función cognitiva, las funciones incluyen la memoria a corto plazo, la memoria cinestésica, el aprendizaje asociativo, el aprendizaje de terror, el aprendizaje latente, la memoria de percepción visual, la memoria a largo plazo, el trabajo espacial, la memoria de referencia, el aprendizaje espacial, la memoria espacial, la memoria de trabajo, y similares. Los ejemplos de métodos de evaluación de la función cognitiva de ratones, ratas o hámsteres utilizando técnicas farmacológicas conductuales incluyen pruebas conocidas tales como una prueba de laberinto en Y, una prueba de laberinto en T, una prueba de rotarod, una prueba de condicionamiento del miedo contextual, una prueba de búsqueda de agua, una prueba de búsqueda de nuevos objetos, una prueba de evitación pasiva, una prueba de laberinto radial, una prueba de laberinto de agua de Morris, una prueba de emparejamiento retardado y no emparejamiento con la muestra, y similares.

En la presente invención, resulta preferido evaluar la memoria a corto plazo como la función cognitiva del ratón, la rata o el hámster, preferentemente usando una prueba de laberinto en Y como método específico.

La metodología de tal prueba de laberinto en Y se describe en Alkam et al., [Behav. Brain Res.), Vol. 180, p. 139 (2007)].

Específicamente, un aparato de prueba de laberinto en Y se configura como se muestra en la figura 6 (a) y la figura 6 (b). El aparato de prueba del laberinto en Y se construye, por ejemplo, a partir de tres brazos A, B y C, cada uno de los cuales forma paredes acrílicas negras, y éstos se unen entre sí en un ángulo de 120 grados. Se permite que un roedor se mueva libremente dentro de los tres brazos A, B y C.

Un roedor normal presenta la tendencia a entrar sucesivamente en los tres brazos A, B y C, como indica la flecha en la figura 6 (a). Tal comportamiento manifestado como entrada sucesiva en tres brazos diferentes se define como un comportamiento de alternancia espontánea. Un roedor con déficits cognitivos muestra una tendencia a moverse hacia adelante y hacia atrás entre dos brazos, como indica la flecha en la figura 6 (b).

Es decir, el porcentaje de comportamiento de alternancia espontánea durante un cierto período de tiempo es menor en un roedor con déficits cognitivos que en un roedor normal.

El porcentaje de comportamiento de alternancia espontánea durante un cierto período de tiempo se define como alternancia espontánea (%), y puede calcularse según la ecuación (1) a continuación. La presencia o ausencia de deterioro de la función cognitiva se puede determinar sobre la base de la alternancia espontánea como se describe anteriormente, y este valor se puede utilizar como base para la medida de la toxicidad del CSF humano, específicamente la determinación de la presencia o ausencia de toxicidad del CSF humano.

La siguiente ecuación (1) se utiliza para calcular la alternancia espontánea (%). La fórmula (2) representa un método para contar comportamientos de alternancia espontánea.

Alternancia espontánea (%) = {número de comportamientos de alternancia espontánea/(número total de entradas en los brazos - 2 )}x 100% ...Fórmula (1)

Lo siguiente describe el resultado de una prueba de laberinto en Y de ratón y la alternancia espontánea (%) calculada a partir de la ecuación (1). Se describe en primer lugar el resultado de una prueba de laberinto en Y de ratón realizada con el aparato que se muestra en la figura 6 (a) y la figura 6 (b).

[Ec. 1]

.Fórm ula (2)

En la fórmula (2), el número total de entradas en los brazos A, B y C es diez, y cinco de los diez movimientos representan un comportamiento de alternancia espontánea, como lo indican los paréntesis superior e inferior. De la ecuación (1) se deduce que la alternancia espontánea (%) es {5/(10 - 2)} x 100 (%) = 62.5%.

Para determinar si el CSF humano administrado a un ratón presenta toxicidad, se compara la alternancia espontánea (%) entre un roedor que recibió administración intraventricular de CSF humano y un roedor que recibió administración intraventricular de un control tal como disolución salina fisiológica. Se puede determinar que el CSF humano presenta toxicidad cuando el roedor al que se le administra CSF humano presenta una menor alternancia espontánea (%) que el control.

El grado de disminución de la alternancia espontánea (%) puede medirse, por ejemplo, como una disminución estadísticamente significativa. Por “estadísticamente significativo” se entiende, por ejemplo, que la diferencia de los valores de alternancia espontánea (%) obtenidos según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud es significativa para p < 0.05 según lo medido por la prueba de Dunnett realizada para un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de un control tal como disolución salina fisiológica, y un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano.

El grado de disminución de la alternancia espontánea (%) puede ser una disminución del 3% o más, 5% o más, 7% o más, 10% o más, o 20% o más.

[Método de determinación de la enfermedad de Alzheimer]

A continuación, se describe posteriormente un método para determinar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención. El método comprende administrar CSF humano que ha sido recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y evaluar la función cognitiva del ratón, rata o hámster usando una técnica farmacológica conductual.

El CSF humano no está particularmente limitado, siempre que sea CSF que se haya extraído de un paciente con enfermedad de Alzheimer, como se indicó anteriormente. El método usa ratones, ratas o hámsteres, y se prefieren los ratones, como se indicó anteriormente.

El método de administración del CSF humano en los ventrículos cerebrales es el mismo que anteriormente.

Una dosificación de CSF humano administrada en el ventrículo cerebral es, por ejemplo, 5 j l o más, preferentemente 10 jl, para ratones. Una dosificación del CSF humano administrada en los ventrículos cerebrales del ratón, rata o hámster puede establecerse según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud.

En el método para determinar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, la función cognitiva del ratón, rata o hámster se evalúa usando una técnica farmacológica conductual, y pueden usarse diversos ensayos conocidos como tales técnicas, como se ejemplificó anteriormente.

En el método para determinar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, resulta preferido evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster, preferentemente usando una prueba de laberinto en Y que puede evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

La prueba del laberinto en Y, el comportamiento de alternancia espontánea, la alternancia espontánea (%), y los métodos de cálculo son como se describen anteriormente.

Para una determinación precisa, el método para determinar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención comprende preferentemente comparar la alternancia espontánea (%) entre un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de un control (por ejemplo, disolución salina fisiológica) y un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de CSF humano.

En las evaluaciones realizadas por los presentes inventores, se puede determinar que un paciente presenta una alta probabilidad de presentar la enfermedad de Alzheimer cuando un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano recogido del paciente presenta una menor alternancia espontánea (%) que el ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de un control (por ejemplo, disolución salina fisiológica).

El grado de disminución de la alternancia espontánea (%) puede medirse, por ejemplo, como una disminución estadísticamente significativa. Por “estadísticamente significativo” se entiende, por ejemplo, que la diferencia de los valores de alternancia espontánea (%) obtenidos según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud es significativa para p < 0.05 según lo medido por la prueba de Dunnett realizada para un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de un control, tal como disolución salina fisiológica, y un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano.

El método de determinación de la presente invención asimismo se puede usar para determinar la enfermedad de Alzheimer prodrómica.

[Método para medir el efecto medicinal del agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer]

A continuación, se describe posteriormente un método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención. El método comprende administrar CSF humano en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y evaluar la función cognitiva del ratón, rata o hámster usando una técnica farmacológica conductual.

El CSF humano no está particularmente limitado, siempre que sea CSF que se haya recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer al que se le haya administrado el agente, como anteriormente. El método usa ratones, ratas o hámsteres, y se prefieren los ratones, como se indicó anteriormente.

La dosificación de CSF humano administrada en el ventrículo cerebral es, por ejemplo, 5 j l o más, más preferentemente 10 jl, para ratones. La dosificación del CSF humano administrada en los ventrículos cerebrales del ratón, rata o hámster puede establecerse según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud.

En el método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, la función cognitiva del ratón, rata o hámster se evalúa mediante el uso de una técnica farmacológica conductual, y se pueden usar diversos ensayos conocidos como tales técnicas, como se ejemplificó anteriormente.

En el método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, es resulta preferido evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster, preferentemente usando una prueba de laberinto en Y que puede evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

Para la determinación del efecto medicinal, el método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer de la presente invención comprende preferentemente administrar cada uno de CSF humano que se ha recogido de un sujeto que comienza o experimenta continuamente la administración del agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer antes de la administración del agente, y de CSF humano que se ha recogido del sujeto después de la administración del agente, en el ventrículo cerebral de un roedor seleccionado de entre ratón, rata o hámster, y comparar la función cognitiva de los roedores.

Se puede comparar lo siguiente para los CSF humanos recogidos: (A) la alternancia espontánea (%) del ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano recogido antes de la administración del agente, y (B) la alternancia espontánea (%) del ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano recogido después de la administración del agente.

La presencia o ausencia de efecto medicinal puede así medirse con esta técnica. Como se utiliza en la presente memoria, “después de la administración del agente” puede ser después de la administración única o múltiple del agente tras la recolección previa del CSF humano.

El efecto medicinal se puede confirmar, por ejemplo, al comprobar que la alternancia espontánea (%) (B) es mayor que la alternancia espontánea (%) (A). El grado de aumento de la alternancia espontánea (%) puede medirse, por ejemplo, mediante significancia estadística. Por “estadísticamente significativo” se entiende, por ejemplo, que la diferencia entre los dos grupos es significativa para p < 0.05 en una prueba de Dunnett.

En el caso de ratones, por ejemplo, el agente puede considerarse eficaz cuando el porcentaje de mejora (%) de la alternancia espontánea calculado según la ecuación 3 descrita en el ejemplo 6 de la presente solicitud es 40% o más, 60% o más, 80% o más, o 100%.

El agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer incluye todos los agentes que pueden actuar como factores inhibidores de la enfermedad de Alzheimer, incluyendo los agentes para la prevención y la mejora de la enfermedad de Alzheimer.

Los ejemplos incluyen inhibidores de la acetilcolina esterasa conocidos, antagonistas del receptor de NMDA, anticuerpos antioligómero de Ap, y vacunas de amiloide p. Preferidos como agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer son los anticuerpos antioligómero de Ap.

En particular, el anticuerpo antioligómero de Ap es aquel seleccionado de entre los siguientes (a) y (b):

(b) un anticuerpo monoclonal en el que la VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 1, y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID N°: 2.

Estos anticuerpos monoclonales, y los procedimientos de producción de estos anticuerpos, se describen en los documentos WO2009/099176 y WO2011/016567.

El efecto medicinal del agente puede representar un efecto terapéutico en un sujeto al que se le administró el agente según se mide en el momento de la recolección del CSF, o un efecto terapéutico que se espera que ocurra en un sujeto en el futuro.

La presente invención asimismo puede medir el efecto medicinal a lo largo del tiempo en un sujeto al que se le administra continuamente el agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer. Para la medida del efecto medicinal a lo largo del tiempo, resulta preferido que el CSF se haya recogido del sujeto en múltiples puntos de tiempo en el programa de administración del agente.

El método de la presente invención asimismo se puede usar para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer prodrómica.

[Método para determinar la sensibilidad al agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer]

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para determinar la sensibilidad de un sujeto paciente con enfermedad de Alzheimer a un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer. El método comprende administrar CSF humano en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y evaluar la función cognitiva del ratón, rata o hámster usando una técnica farmacológica conductual.

Preferentemente, el sujeto es un paciente con la enfermedad de Alzheimer al que nunca se le ha administrado el agente.

El CSF humano no está particularmente limitado, siempre que sea un CSF que se haya recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer, como anteriormente. El método usa ratones, ratas o hámsteres, y se prefieren los ratones, como se indicó anteriormente.

Una dosificación de CSF humano en el ventrículo cerebral es, por ejemplo, 5 j l o más, más preferentemente 10 |jl, para ratones. Una dosificación del CSF humano administrada en los ventrículos cerebrales del ratón, rata o hámster puede establecerse según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud.

En el método para determinar la sensibilidad de un sujeto a un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, la función cognitiva del ratón, rata o hámster se evalúa utilizando una técnica farmacológica conductual, y se pueden usar diversos ensayos conocidos como tales técnicas como se ejemplifica anteriormente.

En el método para determinar la sensibilidad de un sujeto a un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, resulta preferido evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster, preferentemente usando una prueba de laberinto en Y que puede evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

La prueba del laberinto en Y, el comportamiento de alternancia espontánea, la alternancia espontánea (%), y los métodos de cálculo son como se describen anteriormente. La presencia o ausencia de la sensibilidad de un paciente con enfermedad de Alzheimer al agente puede confirmarse comparando la alteración espontánea de un ratón, rata o hámster cuando se administran al ratón, rata o hámster el agente y el CSF de paciente con AD con la alteración espontánea de un ratón, rata o hámster cuando se administra al ratón, rata o hámster un control y el CSF de paciente con AD. El agente y el CSF de paciente con AD, o el control y el CSF de paciente con AD, pueden administrarse en un estado mixto de antemano, o pueden administrarse por separado. El intervalo de administración y el orden de administración no están limitados cuando se administran por separado. El área de administración o el método de administración del agente de ensayo no están limitados, y por ejemplo se ejemplifica la administración intravenosa o la administración en el ventrículo cerebral. La presencia o ausencia de la sensibilidad de un paciente con enfermedad de Alzheimer al agente puede confirmarse, por ejemplo, según los métodos descritos en los ejemplos 4 y 5 de la presente solicitud.

La sensibilidad al agente significa que la alteración espontánea de un ratón, rata o hámster cuando se administran al ratón, rata o hámster el agente y el CSF de paciente con AD aumenta en comparación con la alteración espontánea de un ratón, rata o hámster cuando se administran al ratón, rata o hámster el control y el CSF de paciente con AD. Por ejemplo, se ejemplifica que el grupo al que se administró agente i.v.-AD CSF presenta una mayor alternancia espontánea que el grupo al que se administró IgG4 humana i.v.-AD CSF, según el método descrito en el ejemplo 4 de la presente solicitud.

La sensibilidad al agente asimismo se puede confirmar al encontrar que el grupo al que se administró agente-AD CSF presenta una mayor alternancia espontánea que el grupo al que se administró vehículo-AD CSF, según el método descrito en el ejemplo 5 de la presente solicitud.

El grado de aumento de la alternancia espontánea (%) puede medirse, por ejemplo, mediante significancia estadística. Por “estadísticamente significativo” se entiende, por ejemplo, que la diferencia entre los dos grupos es significativa para p < 0.05 en una prueba de Dunnett.

En el caso de ratones, por ejemplo, la sensibilidad al agente se puede considerar presente cuando el porcentaje de mejora (%) de la alternancia espontánea calculado según la fórmula (3) descrita en el ejemplo 6 de la presente solicitud es 40% o más, 60% o más, 80% o más, o 100%.

El agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer es como se describe anteriormente.

El método de la presente invención asimismo se puede usar para medir la sensibilidad de un sujeto a un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer prodrómica.

[Método para crear un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer]

La presente descripción asimismo se refiere a un método para crear un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer. El método comprende administrar CSF humano en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y evaluar la función cognitiva del ratón, rata o hámster usando una técnica farmacológica conductual.

El método de administración del CSF humano en los ventrículos cerebrales es el mismo que anteriormente. Una dosificación de CSF humano administrada en el ventrículo cerebral es, por ejemplo, 5 pl o más, preferentemente 10 pl, para ratones. Una dosificación del CSF humano administrada en los ventrículos cerebrales del ratón, rata o hámster puede establecerse según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud. En el método para crear un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer, la función cognitiva del ratón, rata o hámster se evalúa utilizando una técnica farmacológica conductual, y pueden utilizarse diversos ensayos conocidos como tales técnicas, como se ejemplificó anteriormente.

En el método para crear un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer, resulta preferido evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster, preferentemente usando una prueba de laberinto en Y que puede evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

En el método para crear un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer, un ratón, una rata o un hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano puede considerarse un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo cuando el ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano presenta una menor alternancia espontánea (%) en comparación con un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de un control, tal como disolución salina fisiológica.

El grado de disminución de la alternancia espontánea (%) puede medirse, por ejemplo, como una disminución estadísticamente significativa. Por “estadísticamente significativo” se entiende, por ejemplo, que la diferencia de los valores de alternancia espontánea (%) obtenidos según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud es significativa para p < 0.05 según se mide por la prueba de Dunnett realizada para un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular de un control, tal como disolución salina fisiológica, y un ratón, rata o hámster que recibió administración intraventricular del CSF humano.

[Método para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer]

Los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer. El método comprende las etapas de administrar CSF humano en el ventrículo cerebral de un ratón, rata o hámster, y evaluar la función cognitiva del ratón, rata o hámster mediante el uso de una técnica farmacológica conductual. En el método, se puede usar el modelo animal obtenido usando el método para crear un modelo animal similar a la enfermedad de Alzheimer.

El CSF humano no está particularmente limitado, siempre que sea CSF que se haya recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer, como se describe anteriormente. El método utiliza ratones, ratas o hámsteres, de los cuales se prefieren los ratones, como se describe anteriormente.

El método de administración del CSF humano en los ventrículos cerebrales es el mismo que anteriormente. Una dosificación de CSF humano administrada en el ventrículo cerebral es, por ejemplo, 5 pl o más, más preferentemente 10 pl, para ratones. Una dosificación del CSF humano administrada en los ventrículos cerebrales del ratón, rata o hámster puede establecerse según el método descrito en el ejemplo 1 de la presente solicitud.

En el método para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, la función cognitiva del ratón, rata o hámster se evalúa mediante el uso de una técnica farmacológica conductual, y se pueden usar diversos ensayos conocidos como tales técnicas, como se ejemplificó anteriormente.

En el método para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, resulta preferido evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster, preferentemente usando una prueba de laberinto en Y que puede evaluar la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

Como método para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, se ejemplifica que en el caso en el que la alteración espontánea de un ratón, rata o hámster cuando se administran un agente de ensayo y CSF de paciente con AD al ratón, rata o hámster aumenta en comparación con la alteración espontánea de un ratón, rata o hámster cuando se administran un control y CSF de paciente con AD al ratón, rata o hámster, el agente de ensayo se selecciona como candidato del agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer. El agente de ensayo y el CSF de paciente con AD, o el control y el CSF de paciente con AD, pueden administrarse en un estado mixto de antemano, o pueden administrarse por separado. El intervalo de administración y el orden de administración no están limitados cuando se administran por separado. El área de administración o el método de administración del agente de ensayo no están limitados, y por ejemplo se ejemplifica la administración intravenosa o la administración en el ventrículo cerebral. Como ejemplo específico, el método para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer incluye seleccionar el agente de ensayo como un agente candidato para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer cuando un grupo al que se le administró agente de ensayo i.v.-AD CSF presenta una mayor alternancia espontánea que un grupo al que se le administró con IgG4 humana i.v.-AD CSF, según se mide de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 4 de la presente solicitud.

Como otro ejemplo, un agente de ensayo puede seleccionarse como un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer cuando un grupo al que se le administró agente de ensayo-AD CSF presenta una mayor alternancia espontánea que un grupo al que se le administró vehículo-AD CSF, según se mide de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 5 de la presente solicitud.

En el método para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, se puede seleccionar un agente de ensayo como agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer cuando el agente de ensayo mejora la alternancia espontánea 40% o más, 60% o más, 80% o más, o 100% en el caso de, por ejemplo, ratones, calculado según la fórmula (3) descrita en el ejemplo 6 de la presente solicitud.

Los agentes de ensayo usados no están particularmente limitados, y pueden ser, por ejemplo, moléculas pequeñas, proteínas (incluyendo anticuerpos), y péptidos.

El método asimismo se puede usar para identificar un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer prodrómica.

[Ejemplos]

La presente invención se describe a continuación con mayor detalle utilizando los ejemplos. Debe apreciarse, sin embargo, que la presente invención no está limitada por los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

Medida del deterioro de la función cognitiva del ratón por CSF de paciente con AD

La función cognitiva de los ratones a los que se les administró CSF de pacientes con AD se midió mediante la prueba del laberinto en Y. La prueba del laberinto en Y se realizó según el método descrito en Alkam et al., [Behav. Brain Res.), Vol. 180, p. 139 (2007)].

Se administró CSF de paciente con AD (Precision Med) en los ventrículos cerebrales de ratones ICR (machos, Japan SLC) en una dosis de 1, 3, 5 o 10 pl bajo anestesia con isoflurano. El CSF se administró en el ventrículo cerebral izquierdo para la administración de 1, 3 y 5 pl, y en los ventrículos cerebrales izquierdo y derecho para la administración de 10 pl, 5 pl en cada ventrículo.

Como control negativo, se administró disolución salina fisiológica (en adelante, “simulación”; Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) en la dosis máxima de 10 j l en los ventrículos cerebrales de ratón de la misma manera que anteriormente.

Después de 1 hora desde la administración intraventricular, cada ratón se colocó en la punta de uno de los tres brazos A, B y C de un aparato de prueba de laberinto en Y que se muestra en la figura 6 (a) y la figura 6 (b) [cada uno de los brazos está construido como paredes acrílicas negras que miden 25 cm de largo, 5 cm de ancho, y 20 cm de alto, y están unidas entre sí en un ángulo de 120 grados]. A continuación, se permitió al ratón explorar libremente el laberinto durante 7 minutos.

Entonces, una entrada a un brazo se define como el estado cuando las cuatro extremidades del ratón estaban dentro del brazo. Se registró el orden en que el animal entraba en los brazos, y se determinó la alternancia espontánea (%) según la ecuación, fórmula (1) anterior. El resultado se presenta en la figura 1.

Como se muestra en la figura 1, la alternancia espontánea del grupo al que se administró CSF de paciente con AD disminuyó con el aumento de la dosis del CSF de paciente con AD. El grado de disminución de la alternancia espontánea fue particularmente significativo en el grupo al que se administró 10 j l de CSF de paciente con AD en comparación con el grupo al que se administró simulación.

Ejemplo 2

Medida del deterioro de la función cognitiva del ratón por diferentes CSF de pacientes con AD

La función cognitiva de los ratones a los que se administraron CSF de pacientes con AD diferentes del utilizado en el ejemplo 1 se midió mediante la prueba del laberinto en Y. Los c Sf de pacientes con AD utilizados en este ejemplo son CSF de dos pacientes con AD (ambos disponibles de Precision Med), y una muestra preparada como una mezcla de CSF de 3 pacientes que se denomina “conjunto” (Cureline), que son diferentes del CSF utilizado en el ejemplo 1.

Estos CSF de pacientes con AD (10 j l cada uno) o disolución salina fisiológica (10 jl; en adelante, “simulación”) se administraron en los ventrículos cerebrales de ratones ICR bajo anestesia con isoflurano, y cada ratón se analizó mediante la prueba del laberinto en Y de la misma manera como en el ejemplo 1 para determinar la alternancia espontánea (%). Los resultados se presentan en la figura 2. Los CSF de pacientes con AD y la disolución salina fisiológica se administraron en una dosis de 5 j l en cada uno de los ventrículos cerebrales derecho e izquierdo.

Como se muestra en la figura 2, la alternancia espontánea (%) de ratones fue significativamente menor en todos los grupos a los que se administró CSF de pacientes con AD que en el grupo al que se le administró simulación como control negativo.

Los resultados observados en los ejemplos 1 y 2 confirmaron que la administración intraventricular de 10 j l de CSF de paciente con AD reduce significativamente la función cognitiva del ratón en comparación con el grupo de la simulación.

Ejemplo 3

Medida del efecto del CSF normal en la función cognitiva del ratón

La función cognitiva de los ratones a los que se administraron CSF normales se midió mediante la prueba del laberinto en Y. Como CSF normales, se usaron CSF de tres individuos normales (Precision Med). Como control negativo y control positivo, respectivamente Se usaron disolución salina fisiológica (en adelante, “simulación”) y CSF de paciente con AD (Precision Med).

Cada muestra (10 j l ) se administró en los ventrículos cerebrales de ratones ICR bajo anestesia con isoflurano, y cada ratón se analizó mediante la prueba del laberinto en Y de la misma manera que en el ejemplo 1 para determinar la alternancia espontánea (%). Los resultados se presentan en la figura 3. Cada muestra se administró en una dosis de 5 j l en cada uno de los ventrículos cerebrales derecho e izquierdo de los ratones.

Como se muestra en la figura 3, la alternancia espontánea fue significativamente menor en el grupo al que se le administró CSF de paciente con AD de control positivo que en el grupo al que se administró simulación como control negativo. Por otro lado, el grupo al que se le administró CSF normal mostró casi los mismos niveles de alternancia espontánea que el del grupo al que se le administró simulación en todas las muestras.

Como se demostró anteriormente, se encontró que la función cognitiva disminuida observada en ratones a los que se les administró CSF de pacientes con AD en los ejemplos 1 y 2 era un fenómeno específico de CSF de pacientes con AD que no se observaba con el CSF normal. Por lo tanto, se encontró que la administración de CSF de paciente con AD provoca una disminución en la función cognitiva de los ratones, y refleja la afección del paciente.

Ejemplo 4

Medida del efecto de la administración intravenosa de anticuerpos anti-Ap en el deterioro de la función cognitiva del ratón por CSF de pacientes con AD

A continuación, los ratones que recibieron administración intravenosa de anticuerpo antioligómero de Ap se midieron para determinar cambios en la función cognitiva después de la administración de CSF de paciente con AD, utilizando una prueba de laberinto en Y. Como anticuerpo antioligómero de Ap, se produjo un anticuerpo humanizado antioligómero de Ap 6E4HV0LV0 según el método descrito en el documento WO2011/016567 y métodos conocidos, y se usó en el experimento.

Las secuencias de aminoácidos de VH y VL de 6E4HV0LV0 están representadas por SEC ID N°: 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada de 6E4HV0LV0 están representadas por SEC ID N°: 3, 4 y 5, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera están representadas por SEC ID N°: 6 , 7 y 8, respectivamente.

A los ratones ICR se les administró por vía intravenosa 3 mg/kg de IgG4 humana (Sigma-Aldrich), o 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, o 3 mg/kg de 6E4HV0LV0.

Al día siguiente, se administraron 10 pl de disolución salina fisiológica (en adelante, “simulación”) o la misma cantidad de CSF de paciente con AD (Precision Med) en los ventrículos cerebrales de los ratones bajo anestesia con isoflurano. Después, cada ratón se analizó mediante la prueba del laberinto en Y de la misma manera que en el ejemplo 1 para determinar la alternancia espontánea (%). Los resultados se presentan en la figura 4. El CSF de paciente con AD y la disolución salina fisiológica se administraron en una dosis de 5 pl en cada uno de los ventrículos cerebrales derecho e izquierdo.

A continuación, los ratones que recibieron administración intravenosa de IgG4 humana y administración intraventricular de simulación se identificarán mediante el uso de la notación “grupo al que se le administró IgG4 humana i.v.-simulación”. Se utilizan anotaciones similares para los ratones a los que se administran otras muestras.

Como se muestra en la figura 4, la alternancia espontánea fue significativamente menor en el grupo al que se le administró IgG4 humana i.v.-AD CSF que en el grupo al que se le administró IgG4 i.v.-simulación.

Por otro lado, la alternancia espontánea en el grupo al que se le administró 6E4HV0LV0 i.v.-AD CSF aumentó con el aumento de la dosis de 6E4HV0LV0. La alternancia espontánea fue significativamente mayor en el grupo al que se le administraron 3 mg/kg de 6E4HV0LV0 i.v.-AD CSF que en el grupo al que se le administró IgG4 humana i.v.-AD CSF, recuperándose a los mismos niveles que el observado en el grupo al que se le administró IgG4 humana i.v.-simulación.

Ejemplo 5

Medida del efecto del pretratamiento con anticuerpos anti-Ap en el deterioro de la función cognitiva del ratón por CSF de paciente con Ad

El ejemplo 4 examinó el efecto de la administración intravenosa de 6E4HV0LV0. Sin embargo, en una posible aplicación clínica del presente sistema de ensayo para la medida del efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer (por ejemplo, un agente dirigido contra el oligómero de Ap), se recoge CSF del mismo paciente antes y después de la administración del agente, y se mide la función cognitiva de los ratones a los que se les administraron estos CSF. Es decir, la administración intraventricular del CSF del paciente recogido después de la administración del agente implica al agente.

Con el fin de evaluar una muestra que refleje con mayor precisión la muestra clínica real, se midió mediante la prueba del laberinto en Y la función cognitiva de los ratones a los que se les administró un CSF de paciente con AD pretratado con 6E4HV0LV0.

Se añadió 6E4HV0LV0 a CSF de paciente con AD (Precision Med) para lograr una concentración final de 1 ng/ml, 10 ng/ml, o 100 ng/ml, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante alrededor de 1 hora.

Se añadió líquido cefalorraquídeo artificial [líquido cefalorraquídeo artificial (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) suplementado con seroalbúmina humana al 0.02% p/v (Sigma-Aldrich)] (en adelante, “vehículo”) al CSF de paciente con AD o disolución salina fisiológica (en adelante, “simulación”), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente. La muestra preparada se conservó a -80°C, y se usó para el experimento después de descongelarse a temperatura ambiente el día de la prueba del laberinto en Y.

La muestra (10 |jl cada una) se administró en los ventrículos cerebrales de ratones ICR bajo anestesia con isoflurano, y cada ratón se analizó mediante la prueba del laberinto en Y de la misma manera que en el ejemplo 1 para determinar la alternancia espontánea (%). Los resultados se presentan en la figura 5. Cada muestra se administró en una dosis de 5 j l en cada uno de los ventrículos cerebrales derecho e izquierdo de los ratones.

A continuación, la muestra con el CSF de paciente con AD más el vehículo se identificará mediante la notación “vehículo-AD CSF”. Se utilizan anotaciones similares para otras muestras.

Como se muestra en la figura 5, la alternancia espontánea en ratones fue significativamente menor en el grupo al que se le administró vehículo-AD CSF que en el grupo al que se le administró vehículo-simulación.

Por otro lado, la alternancia espontánea fue mayor en el grupo al que se le administró 6E4HV0LV0-AD CSF (concentración final de 10 ng/ml o 100 ng/ml) que en el grupo al que se le administró vehículo-AD CSF. La alternancia espontánea fue particularmente alta en el grupo al que se le administró 6E4HV0LV0-AD CSF (concentración final de 100 ng/ml), recuperándose a los mismos niveles que el observado en el grupo al que se le administró vehículo-simulación.

A partir de estos resultados y los resultados del ejemplo 4, se encontró que la función cognitiva alterada observada en ratones a los que se les administró CSF de paciente con AD puede mejorarse mediante la administración intravenosa y el pretratamiento de 6E4HV0LV0.

Ejemplo 6

Medida enmascarada del deterioro de la función cognitiva del ratón por muestra de CSF, y medida enmascarada de los cambios en la función cognitiva de los ratones después del pretratamiento con 6E4HV0LV0

La función cognitiva de los ratones a los que se les administraron múltiples CSF normales o CSF de pacientes con AD se midió en un experimento enmascarado realizando una prueba de laberinto en Y de la misma manera que en el ejemplo 1. El efecto del pretratamiento con 6E4HV0LV0 asimismo se examinó al mismo tiempo. El experimento se llevó a cabo separando al evaluador responsable de dispensar CSF normales o CSF de pacientes con AD y preparar un CSF de paciente con AD pretratado con 6E4HV0LV0 para un experimento enmascarado, del responsable de administrar las muestras a los ratones y realizar la prueba del laberinto en Y.

Para el experimento enmascarado, el evaluador (A) asignó aleatoriamente números a los CSF normales (Precision Med) y a los CSF de pacientes con AD (Precision Med) dispensados. Para los CSF de pacientes con AD, asimismo se prepararon muestras añadiendo 6E4HV0LV0 a cada ^cS^fdispensado para lograr una concentración final de 10 ng/ml, e incubando la mezcla a temperatura ambiente durante alrededor de 1 hora. Todas las muestras de CSF dispensadas y preparadas se conservaron a -80°C hasta el día de la prueba del laberinto en Y.

El día de la prueba del laberinto en Y, el evaluador (B) recibió las muestras preparadas por el evaluador (A) para el experimento enmascarado, y descongeló las muestras a temperatura ambiente. Cada muestra (10 j l) o disolución salina fisiológica (10 jl; en adelante, “simulación”) se administró en los ventrículos cerebrales de ratones ICR bajo anestesia con isoflurano, y los ratones se analizaron mediante la prueba del laberinto en Y de la misma manera que en el ejemplo 1 para determinar la alternancia espontánea (%). La muestra y la disolución salina fisiológica se administraron en dosis de 5 j l en cada uno de los ventrículos cerebrales derecho e izquierdo de los ratones.

Se determinó que la función cognitiva de los ratones a los que se les administró la muestra de CSF que no presentaba pretratamiento con 6E4HV0LV0 se deterioró cuando la alternancia espontánea del ratón disminuyó 3% o más en comparación con el grupo al que se le administró simulación. Se determinó que la función cognitiva estaba fuertemente deteriorada cuando la alternancia espontánea disminuyó 7 a 10% en comparación con el grupo al que se le administró simulación. Los resultados se muestran bajo el encabezado de la columna “grado del deterioro de la función cognitiva inducido” en la tabla 1 a continuación.

El método para determinar el grado del deterioro de la función cognitiva inducido es el siguiente.

-: La alteración espontánea disminuyó 0 a 3% en comparación con el grupo al que se le administró simulación (sin deterioro de la función cognitiva inducido).

+: La alteración espontánea disminuyó 3 a 7% en comparación con el grupo al que se le administró simulación (deterioro de la función cognitiva inducido débil).

++: La alteración espontánea disminuyó 7 a 10% en comparación con el grupo al que se le administró simulación (deterioro de la función cognitiva inducido fuerte).

Al mismo tiempo, se realizó una prueba de laberinto en Y que utilizó los CSF de pacientes con AD pretratados con 6E4HV0LV0. El porcentaje de mejora de la alternancia espontánea del ratón mediante el pretratamiento con 6E4HV0LV0 se calculó para cada ratón utilizando la fórmula (3) siguiente. Los resultados se muestran bajo el encabezado de la columna “porcentaje de mejora por tratamiento con 6E4HV0LV0 (%)” en la tabla 1.

Porcentaje de mejora (%) de alternancia espontánea del ratón mediante pretratamiento con 6E4HV0LV0 = {(alternancia espontánea de ratón al que se le administró CSF de paciente con AD pretratado con 6E4HV0LV0) -(alternancia espontánea de ratón al que se le administró el mismo CSF de paciente con AD sin pretratamiento con 6E4HV0LV0)}/{(alternancia espontánea de grupo al que se le administró control simulado) - (alternancia espontánea de ratón al que se le administró el mismo CSF de paciente con AD sin pretratamiento con 6E4HV0LV0)} x 100 ...fórmula (3)

[Tabla 1]

Como se muestra en la tabla 1, la función cognitiva del ratón se deterioró en los 15 ratones de muestra a los que se les administró el CSF de paciente con AD que no tenía pretratamiento con 6E4HV0LV0. Por otro lado, 10 de los 11 ratones a los que se les administró CSF normal no mostraron deterioro de la función cognitiva.

Con respecto al efecto del pretratamiento con 6E4HV0LV0, la alternancia espontánea mejoró 80% o más en 7 de las 15 muestras y 40% o más en 6 de las 15 muestras.

La función cognitiva se deterioró en 1 de los 11 ratones a los que se les administró CSF normal. El porcentaje de mejora (%) de la alternancia espontánea del ratón mediante el pretratamiento con 6E4HV0LV0 se midió para el CSF normal administrado al ratón así como para el CSF de paciente con AD. Sin embargo, el pretratamiento con 6E4HV0LV0 no mejoró el deterioro de la función cognitiva ocurrido en este ratón.

Asimismo se encontró a partir de los ensayos enmascarados anteriores que el deterioro de la función cognitiva no se indujo en casi todos los ratones a los que se les administró el CSF normal, sino que se indujo en todos los ratones a los que se les administró el CSF de paciente con AD. Asimismo se encontró que la mayor parte del deterioro de la función cognitiva observado en ratones a los que se les administró el CSF de paciente con AD puede mostrar una recuperación con el pretratamiento con 6E4HV0LV0.

[Listado de señales de referencia]

A, B, C: Brazos

[Texto libre de listado de secuencias]

SEC ID N°: 1

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 6E4HV0LV0

SEC ID N°: 2

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 6E4HV0LV0

SEC ID N°: 3

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada de 6E4HV0LV0 SEC ID N°: 4

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada de 6E4HV0LV0 SEC ID N°: 5

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada de 6E4HV0LV0 SEC ID N°: 6

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera de 6E4HV0LV0 SEC ID N°: 7

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera de 6E4HV0LV0 SEC ID N°: 8

Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera de 6E4HV0LV0

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para medir la toxicidad del líquido cefalorraquídeo (CSF) humano, o para determinar la enfermedad de Alzheimer, o para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método

administrar CSF recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer, o CSF recogido de un paciente con enfermedad de Alzheimer al que se le ha administrado el agente, en el ventrículo cerebral de un roedor seleccionado de entre un ratón, rata o hámster, y

evaluar la función cognitiva del roedor utilizando una técnica farmacológica conductual.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la evaluación de la función cognitiva es la evaluación de la memoria a corto plazo del ratón, rata o hámster.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que la técnica farmacológica conductual es una prueba de laberinto en Y.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la dosificación del CSF humano administrada en el ventrículo cerebral del ratón, rata o hámster es 5 pl o más.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el roedor es un ratón.

6. Método para determinar la enfermedad de Alzheimer según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende comparar la función cognitiva de un ratón, rata o hámster al/a la que se ha administrado un control en el ventrículo cerebral y la función cognitiva de un ratón, rata o hámster al/a la que se ha administrado el CSF humano en el ventrículo cerebral.

7. Método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método comprende administrar cada uno de los CSF humanos que se han recogido de un sujeto que comienza o se somete continuamente a la administración del agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer antes de la administración del agente, y CSF humano que se ha recogido del sujeto después de la administración del agente en el ventrículo cerebral de un roedor seleccionado de entre ratón, rata o hámster y comparar la función cognitiva de los roedores.

8. Método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7, en el que el agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer es un anticuerpo antioligómero de amiloide p (Ap).

9. Método para medir el efecto medicinal de un agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 7 y 8 , en el que el agente para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer es un anticuerpo seleccionado de entre los (a) y (b) siguientes:

(a) un anticuerpo monoclonal en el que la región determinante de la complementariedad (CDR) 1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID N°: 3, 4 y 5, respectivamente, y CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID N°: 6 , 7 y 8, respectivamente; y