JPWO2015159963A1 - ヒトｃｓｆの毒性を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）における毒性を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく評価できる方法を提供することを課題とし、ヒトＣＳＦをマウスのようなげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む方法により解決した。
Description
本発明は、ヒト脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、以下ＣＳＦと記載する）の毒性を測定する方法、アルツハイマー病の判定方法、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法、被験者のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する感受性を判定する方法、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法ならびにアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法に関する。
近年、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＡＤとも言う）は、アミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ、以下Ａβと言う）の可溶性凝集体（オリゴマー）が病態の主原因であることが提唱されている（非特許文献１）。
抗Ａβ抗体等のＡβを標的とする薬剤の薬効を測定する臨床バイオマーカーとして、ＣＳＦ中のＡβオリゴマーが重要であることは一般的に認識されているが、実際にＡＤ患者で病態を惹起しているＡβオリゴマーの詳細な性状（構造、大きさ、由来等）は不明である（非特許文献２）。そのため、病態を惹起しているＡβオリゴマーを測定する方法が求められている。
ヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマーの測定方法としては、ヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマー量を生化学的に測定する方法、ヒトＣＳＦの生物活性を測定するバイオアッセイ方法がある。Ａβオリゴマー量を生化学的に測定する方法としては、イムノアッセイを用いた測定系等が検討されているが、ＣＳＦ中のＡβオリゴマー量は非常に少ないため、測定の成功例はほとんど無い。一方、バイオアッセイについては、後述のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ ｖｉｖｏ試験がある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験については、ｎＭオーダーの高濃度の人工Ａβオリゴマーを培養神経細胞に作用させると、細胞死、シナプス変性等が起こることが報告されている（非特許文献３）。
また、神経細胞株化細胞にＡＤ患者から採取したＣＳＦ（以下、ＡＤ患者ＣＳＦと表記する）を作用させると、神経細胞に障害が起こることが報告されている（非特許文献４、５）。
また、マウス海馬スライスに人工Ａβオリゴマーを作用させた後に電気刺激を与えると、脳での記憶形成に関わる現象である長期増強（Ｌｏｎｇ―Ｔｅｒｍ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ、以下ＬＴＰと称する）が、マウス海馬スライス内で抑制されることが報告されている（非特許文献６）。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験については、ラットの脳室内にＡＤ患者ＣＳＦを投与した後に電気刺激を与えると、ラットの脳内でＬＴＰが抑制されることが報告されている（非特許文献７）。
さらに、人工Ａβオリゴマーや培養細胞・脳組織抽出オリゴマーをラット又はマウスの脳室内に投与すると、それらの学習行動が障害されるという報告がある（非特許文献８、９）。しかしながら、げっ歯類動物にＡＤ患者ＣＳＦを投与し、それらの学習行動への障害の有無を測定した報告は無い。
以上、ＡＤ患者ＣＳＦ中のＡβオリゴマーのバイオアッセイについて述べたが、ヒトＣＳＦの生物活性すなわちヒトＣＳＦにおける毒性を、少量のＣＳＦを用いて短時間に効率よく評価できるバイオアッセイについては、確立されていない。
「ネイチャー・ニューロサイエンス（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）」、２０１２年、ｖｏｌ．１５、ｐ．３４９
「ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）」、２０１０年、ｖｏｌ．１６、ｐ．１２１８
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「ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）」、２００８年、ｖｏｌ．２８、ｐ．４２３１
「プロス・ワン（ＰＬＯＳ．Ｏｎｅ．）」、２０１２年、ｖｏｌ．７、ｅ２９９４０
「ニューロバイオロジー・オブ・エイジング（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ．）」、２０１１年、ｖｏｌ．３２、ｐ．１７８４
したがって本発明の目的は、ヒトＣＳＦにおける毒性を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく評価できる方法を提供することにある。
また本発明の別の目的は、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よくアルツハイマー病の判定を行う方法を提供することにある。
また本発明の別の目的は、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく測定する方法を提供することにある。
また本発明の別の目的は、被験者のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する感受性を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく測定する方法を提供することにある。
また本発明の別の目的は、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よくスクリーニングする方法を提供することにある。
また本発明の別の目的は、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よくアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法を提供することにある。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価することによって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．ヒト脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、以下ＣＳＦと記載する）をげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、ヒトＣＳＦの毒性を測定する方法。
２．前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである前記１に記載の方法。
３．前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である前記１または２に記載の方法。
４．前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である前記１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．前記げっ歯類動物が、マウスである前記１〜４のいずれか１に記載の方法。
６．ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、アルツハイマー病の判定方法。
７．前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである前記６に記載の方法。
８．前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である前記６または７に記載の方法。
９．前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である前記６〜８のいずれか１に記載の方法。
１０．コントロールを脳室内投与した前記げっ歯類動物の認知機能と、ヒトＣＳＦを脳室内投与した前記げっ歯類動物の認知機能とを比較する工程を含む前記６〜９のいずれか１に記載の方法。
１１．前記げっ歯類動物が、マウスである前記６〜１０のいずれか１に記載の方法。
１２．ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法。
１３．前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである前記１２に記載の方法。
１４．前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である前記１２または１３に記載の方法。
１５．前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である前記１２〜１４のいずれか１に記載の方法。
１６．下記工程（１）及び（２）を含む、前記１２〜１５のいずれか１に記載の方法。
（１）アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を投与開始または連投中の被験者について、ヒトＣＳＦを該薬剤の投与前後に採取する工程
（２）工程（１）で採取した該薬剤の投与前後のヒトＣＳＦを、それぞれげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を比較する工程
１７．前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬が、抗アミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ、以下Ａβと記載する）オリゴマー抗体である前記１２〜１６のいずれか１に記載の方法。
１８．前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬が、下記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる一つの抗体である前記１２〜１７のいずれか１に記載の方法。
（ａ）抗体の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＨと記載する）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記載する）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５で表わされるアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＬと記載する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（ｂ）抗体のＶＨが配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
１９．前記げっ歯類動物が、マウスである前記１２〜１８のいずれか１に記載の方法。
１．ヒト脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、以下ＣＳＦと記載する）をげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、ヒトＣＳＦの毒性を測定する方法。
２．前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである前記１に記載の方法。
３．前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である前記１または２に記載の方法。
４．前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である前記１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．前記げっ歯類動物が、マウスである前記１〜４のいずれか１に記載の方法。
６．ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、アルツハイマー病の判定方法。
７．前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである前記６に記載の方法。
８．前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である前記６または７に記載の方法。
９．前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である前記６〜８のいずれか１に記載の方法。
１０．コントロールを脳室内投与した前記げっ歯類動物の認知機能と、ヒトＣＳＦを脳室内投与した前記げっ歯類動物の認知機能とを比較する工程を含む前記６〜９のいずれか１に記載の方法。
１１．前記げっ歯類動物が、マウスである前記６〜１０のいずれか１に記載の方法。
１２．ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法。
１３．前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである前記１２に記載の方法。
１４．前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である前記１２または１３に記載の方法。
１５．前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である前記１２〜１４のいずれか１に記載の方法。
１６．下記工程（１）及び（２）を含む、前記１２〜１５のいずれか１に記載の方法。
（１）アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を投与開始または連投中の被験者について、ヒトＣＳＦを該薬剤の投与前後に採取する工程
（２）工程（１）で採取した該薬剤の投与前後のヒトＣＳＦを、それぞれげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を比較する工程
１７．前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬が、抗アミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ、以下Ａβと記載する）オリゴマー抗体である前記１２〜１６のいずれか１に記載の方法。
１８．前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬が、下記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる一つの抗体である前記１２〜１７のいずれか１に記載の方法。
（ａ）抗体の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＨと記載する）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記載する）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５で表わされるアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＬと記載する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（ｂ）抗体のＶＨが配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
１９．前記げっ歯類動物が、マウスである前記１２〜１８のいずれか１に記載の方法。
本発明によれば、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価することによって、ヒトＣＳＦにおける毒性を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく評価できる方法、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よくアルツハイマー病の判定を行う方法、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく測定できる方法、被験者のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する感受性を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よく予測できる方法、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を、少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よくスクリーニングする方法ならびに少量のヒトＣＳＦを用いて短時間に効率よくアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法を提供することができる。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
［ヒトＣＳＦの毒性を測定する方法］
まず、ヒトＣＳＦの毒性を測定する方法について説明する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
まず、ヒトＣＳＦの毒性を測定する方法について説明する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
ヒトＣＳＦとしては、ヒトから採取したＣＳＦであれば特に限定されない。例えば、市販されているヒトＣＳＦであっても、医師が被験者から採取したヒトＣＳＦであってもよい。また、ヒトから採取された直後のＣＳＦ、ヒトから採取されたＣＳＦを凍結保存し、必要時に融解させたＣＳＦ等いかなるものであってもよい。
げっ歯類動物としては、例えば、マウス、ラット及びハムスター等が挙げられ、中でもマウスが好ましい。
脳室へのヒトＣＳＦの投与は、左側脳室内であっても、右側脳室内であってもよいし、その両方に投与してもよい。脳室へのヒトＣＳＦの投与方法は、従来知られている脳室内への薬物等の投与方法を利用できる（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，ｖｏｌ．４，６７７７参照）。
脳室へのヒトＣＳＦの投与量は、例えば、マウスであれば好ましくは５μｌ以上、より好ましくは１０μｌである。マウスの脳室内に５μｌ以上のヒトＣＳＦを投与した１時間後に、ヒトＣＳＦの毒性の測定が可能になる。マウス以外のげっ歯類動物については、本願実施例１に記載の方法に準じて脳室へのヒトＣＳＦの投与量を設定することができる。
本発明において、げっ歯類動物の認知機能の評価は行動薬理学的な手法を用いることができる。認知機能としては、短期記憶、運動記憶、連合学習、恐怖学習、潜在学習、視覚的認知記憶、長期記憶、空間作業、参照記憶、空間学習、空間記憶及び作業記憶などの機能が挙げられる。げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的に評価する手法としては、例えば、公知のＹ字型迷路試験、Ｔ字型迷路試験、ロータロッド試験、恐怖条件付け文脈学習試験、水探索試験、新奇物質探索試験、受動回避試験、放射状迷路試験、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験及び遅延見本合わせ・非見本合わせ試験等が挙げられる。
本発明では、げっ歯類動物の認知機能として、短期記憶を評価するのが好ましく、具体的な評価手法としてＹ字型迷路試験を採用するのが好ましい。
Ｙ字型迷路試験は、Ａｌｋａｍらの文献［ビヘイビオラル・ブレイン・リサーチ（Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ）、１８０巻、１３９ページ（２００７年）］に記載された方法である。
具体的には、図６（ａ）及び図６（ｂ）に示す、Ｙ字型迷路試験装置を準備する。Ｙ字型迷路試験装置は、例えば黒色アクリル製の壁でできた３本のアームＡ，Ｂ及びＣを、それぞれ１２０度の角度で接続した装置である。げっ歯類動物は、３本のアームＡ，Ｂ及びＣ内を自由に行動することができるようになっている。
正常なげっ歯類動物は、図６（ａ）の矢印に示すように、３本のアームＡ，Ｂ，Ｃ内を連続して進入する傾向がある。この異なる３本のアームに連続して侵入する行動のことを自発交替行動と定義する。認知機能に異常をきたしているげっ歯類動物は、図６（ｂ）の矢印に示すように、２つのアーム間を往復する行動が増える。
すなわち、認知機能に異常をきたしているげっ歯類動物では、正常なげっ歯類動物と比べて一定時間における自発交替行動の割合が低下する。
一定時間における自発交替行動の割合を自発交替行動率（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）（％）と定義し、下記式（１）に示す数式にて算出することができる。以上のように認知機能の障害の有無については自発交替行動率により判定することができ、この値をもとにヒトＣＳＦの毒性の測定、すなわちヒトＣＳＦの毒性の有無を判定することができる。
下記式（１）は、自発交替行動率（％）の算出のための計算式である。また式（２）は、自発交替行動の回数のカウント方法を示している。
自発交替行動率（％）＝｛自発交替行動の回数／（全アームの進入回数−２）｝×１００（％） …式（１）
以下にマウスのＹ字型迷路試験の結果と、上記式（１）を用いて算出した自発交替行動率（％）を示す。まず、図６（ａ）及び図６（ｂ）に示す装置を用いてマウスのＹ字型迷路試験を行った結果を以下に示す。
上記式（２）において、全アームＡ，Ｂ，Ｃの進入回数は１０回であり、そのうち、自発交替行動の回数は上下の括弧でくくったように５回である。したがって、上記式（１）の計算式より、自発交替行動率（％）は、｛５／（１０−２）｝×１００（％）＝６２．５％となる。
マウスに投与したヒトＣＳＦが毒性を有するか否かを判定する方法としては、ヒトＣＳＦを脳室内に投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）と、生理食塩液などのコントロールを脳室内に投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）とを比較し、コントロールよりも自発交替行動率（％）が低下していれば、該ヒトＣＳＦは毒性を有していると判定することができる。
自発交替行動率（％）の低下の度合いとしては、例えば、統計学的に有意に低下していることが挙げられる。統計学的に有意であるとは、例えば、生理食塩液などのコントロールを脳室内に投与したげっ歯類動物と該ヒトＣＳＦを脳室内に投与したげっ歯類動物について、本願実施例１に記載の方法に準じて得られた自発交替行動率（％）の差が、ダネット検定においてｐ＜０．０５となることなどが挙げられる。
また、自発交替行動率（％）の低下の度合いとしては、３％以上、５％以上、７％以上、１０％以上または２０％以上低下していてもよい。
［アルツハイマー病の判定方法］
次に、本発明のアルツハイマー病の判定方法について説明する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
次に、本発明のアルツハイマー病の判定方法について説明する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
ヒトＣＳＦとしては、上記のように、ヒトから採取したＣＳＦであれば特に限定されない。また、げっ歯類動物としては、上記のように、例えば、マウス、ラット及びハムスター等が挙げられ、中でもマウスが好ましい。
脳室へのヒトＣＳＦの投与方法は上記と同様である。
脳室へのヒトＣＳＦの投与量は、例えば、マウスの場合は５μｌ以上、好ましくは１０μｌである。他のげっ歯類動物についても本願実施例１に記載の方法に準じて脳室へのヒトＣＳＦの投与量を設定することができる。
本発明のアルツハイマー病の判定方法において、げっ歯類動物の認知機能は行動薬理学的な手法により評価され、該手法としては上記と同様の各種公知の試験を例示することができる。
中でも、本発明のアルツハイマー病の判定方法では、げっ歯類動物の短期記憶を評価するのが好ましく、これらの中でもげっ歯類動物の短期記憶を評価するＹ字型迷路試験を採用するのが好ましい。
Ｙ字型迷路試験、自発交替行動、自発交替行動率（％）及びその算出方法に関する説明は上記と同様である。
本発明のアルツハイマー病の判定方法では、コントロール（例えば生理食塩液）を脳室内投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）と、ヒトＣＳＦを脳室内投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）とを比較する工程を含むことが、正確な判定を下すうえで好ましい。
本発明者らの検討によれば、ヒトＣＳＦを脳室内に投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）が、コントロール（例えば、生理食塩液）を脳室内投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）に対して低下したときに、ヒトＣＳＦを採取した患者がアルツハイマー病に罹患している可能性が高いと判定することができる。
自発交替行動率（％）の低下の度合いとしては、例えば、統計学的に有意に低下していることが挙げられる。統計学的に有意であるとは、例えば、生理食塩液などのコントロールを脳室内に投与したげっ歯類動物と該ヒトＣＳＦを脳室内に投与したげっ歯類動物について、本願実施例１に記載の方法に準じて得られた自発交替行動率（％）の差が、ダネット検定においてｐ＜０．０５となることなどが挙げられる。
また、自発交替行動率（％）の低下の度合いとしては、３％以上、５％以上、７％以上、１０％以上または２０％以上低下していてもよい。
本発明の判定方法は、前駆期アルツハイマー病の判定にも使用できる。
［アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法］
次に、本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法について説明する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
次に、本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法について説明する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
ヒトＣＳＦとしては、上記のように、ヒトから採取したＣＳＦであれば特に限定されない。また、げっ歯類動物としては、上記のように、例えば、マウス、ラット及びハムスター等が挙げられ、中でもマウスが好ましい。
脳室へのヒトＣＳＦの投与方法は上記と同様である。
脳室へのヒトＣＳＦの投与量は、例えば、マウスの場合は好ましくは５μｌ以上、より好ましくは１０μｌである。他のげっ歯類動物についても、本願実施例１の記載に準じて、脳室へのヒトＣＳＦの投与量を設定することができる。
本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法において、げっ歯類動物の認知機能は行動薬理学的な手法により評価され、該手法としては上記と同様の各種公知の試験を例示することができる。
中でも、本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法では、げっ歯類動物の短期記憶を評価するのが好ましく、これらの中でもげっ歯類動物の短期記憶を評価するＹ字型迷路試験を採用するのが好ましい。
Ｙ字型迷路試験、自発交替行動、自発交替行動率（％）及びその算出方法に関する説明は上記と同様である。
本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法では、下記（１）及び（２）の工程を含むことが薬効の判定のために好ましい。
（１）アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を投与開始または連投中の被験者について、ヒトＣＳＦを該薬剤の投与前後に採取する工程
（２）工程（１）で採取した該薬剤の投与前後のヒトＣＳＦを、それぞれげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を比較する工程
（１）アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を投与開始または連投中の被験者について、ヒトＣＳＦを該薬剤の投与前後に採取する工程
（２）工程（１）で採取した該薬剤の投与前後のヒトＣＳＦを、それぞれげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を比較する工程
前記工程（２）においては、工程（１）で採取したヒトＣＳＦについて、前記薬剤投与前のヒトＣＳＦを脳室内投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）（Ａ）と該薬剤投与後のヒトＣＳＦを脳室内投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）（Ｂ）とを比較する。
このような手法によれば、前記薬剤の薬効の有無を測定することが可能となる。本発明において該薬剤投与後とは、該薬剤投与前にヒトＣＳＦを採取した後、薬剤を１回投与した後であっても複数回投与した後であってもよい。
前記薬剤が薬効を有しているということは、前記自発交替行動率（％）（Ｂ）が、前記自発交替行動率（％）（Ａ）よりも増加していることなどで確認することができ得る。自発交替行動率（％）の増加の程度としては、例えば、統計学的に有意であることが挙げられる。統計学的に有意であるとは、例えば両群間の差がダネット検定でｐ＜０．０５であることが挙げられる。
また、前記薬剤が薬効を有しているということは、例えば、マウスの場合、本願実施例６に記載の数３に準じて算出される自発交替行動率の改善率（％）が４０％以上、６０％以上、８０％以上または１００％であることでもよい。
本発明においてアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としては、アルツハイマー病の予防から改善まで、アルツハイマー病の阻害因子となる全ての薬剤が含まれる。
例えば、公知のアセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、抗Ａβオリゴマー抗体及びアミロイドβワクチン等が挙げられ、中でも抗Ａβオリゴマー抗体が前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬として好ましい。
とくに、抗Ａβオリゴマー抗体として、下記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる一つの抗体であることがさらに好ましい。
（ａ）抗体の重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＨと表記する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，以下ＣＤＲと表記する）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５で表わされるアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＬと表記する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（ｂ）抗体のＶＨが配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（ａ）抗体の重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＨと表記する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，以下ＣＤＲと表記する）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５で表わされるアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＬと表記する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（ｂ）抗体のＶＨが配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
これらのモノクローナル抗体及びその製造方法は、国際公開第２００９／０９９１７６号及び国際公開第２０１１／０１６５６７号に開示されている。
前記薬剤の薬効としては、該薬剤投与後のＣＳＦを採取した時点における被験者の治療効果を表すものであってもよいし、被験者が将来的に得られると予測される治療効果を表わすものであってもよい。
また本発明は、前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬を連投している被験者について、該薬剤の経時的な薬効を測定することもできる。経時的な薬効を測定するためには、該薬剤の投与スケジュールの複数点で、被験者からＣＳＦを採取することが好ましい。
本発明の方法は、前駆期アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬としての薬効を測定する方法にも使用できる。
［アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する感受性を判定する方法］
また本発明は、被験者であるアルツハイマー病患者について、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する感受性を判定する方法に関する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
また本発明は、被験者であるアルツハイマー病患者について、アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する感受性を判定する方法に関する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
被験者としては、これまでに該薬剤の投与を受けたことがないアルツハイマー病患者であることが好ましい。
ヒトＣＳＦとしては、上記のように、ヒトから採取したＣＳＦであれば特に限定されない。また、げっ歯類動物としては、上記のように、例えば、マウス、ラット及びハムスター等が挙げられ、中でもマウスが好ましい。
脳室へのヒトＣＳＦの投与方法は上記と同様である。
脳室へのヒトＣＳＦの投与量は、例えば、マウスの場合は好ましくは５μｌ以上、より好ましくは１０μｌである。他のげっ歯類動物についても、本願実施例１の記載に準じて、脳室へのヒトＣＳＦの投与量を設定することができる。
本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する被験者の感受性を判定する方法において、げっ歯類動物の認知機能は行動薬理学的な手法により評価され、該手法としては上記と同様の各種公知の試験を例示することができる。
中でも、本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する被験者の感受性を判定する方法においては、げっ歯類動物の短期記憶を評価するのが好ましく、げっ歯類動物の短期記憶を評価可能なＹ字型迷路試験を採用するのが好ましい。
Ｙ字型迷路試験、自発交替行動、自発交替行動率（％）及びその算出方法に関する説明は上記と同様である。アルツハイマー病患者における該薬剤に対する感受性の有無は、該薬剤とＡＤ患者ＣＳＦをげっ歯類動物に投与したときの該げっ歯類動物の自発交替行動率を、コントロールとＡＤ患者ＣＳＦをげっ歯類動物に投与したときの該げっ歯類動物の自発交替行動率と比較することで確認できる。該薬剤とＡＤ患者ＣＳＦまたはコントロールとＡＤ患者ＣＳＦは、予め混合させたものを投与してもよいし、別々に投与してもよい。別々に投与する際の投与間隔や投与の順序は特に限定されない。また、被験薬剤の投与部位または投与方法についても特に限定されないが、たとえば静脈内投与や脳室内投与が挙げられる。アルツハイマー病患者における該薬剤に対する感受性の有無は、たとえば本願実施例４及び５に記載の方法に準じて確認することができる。
前記薬剤に対する感受性が有るとは、該薬剤とＡＤ患者ＣＳＦをげっ歯類動物に投与したときの該げっ歯類動物の自発交替行動率が、コントロールとＡＤ患者ＣＳＦをげっ歯類動物に投与したときの該げっ歯類動物の自発交替行動率よりも増加していることなどをいう。たとえば、本願実施例４に記載の方法に準じて、該薬剤 ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率が、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率よりも増加していることをいう。
また、本願実施例５に記載の方法に準じて、前記薬剤−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率が、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率よりも増加していることでも確認することができる。
自発交替行動率（％）の増加の程度としては、例えば、統計学的に有意であることが挙げられる。統計学的に有意であるとは、例えば、両群間の差がダネット検定でｐ＜０．０５であることが挙げられる。
また、前記薬剤に感受性があることは、例えばマウスの場合、本願実施例６に記載の式（３）に準じて算出される自発交替行動率の改善率（％）が４０％以上、６０％以上、８０％以上または１００％であることでもよい。
前記アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に関する発明は上記と同様である。
本発明の方法は、前駆期アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬に対する被験者の感受性を測定する方法にも使用できる。
[アルツハイマー病様モデル動物を作製する方法]
また、本発明はアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法に関する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
また、本発明はアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法に関する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。
ヒトＣＳＦとしては、上記のように、ヒトから採取したＣＳＦであれば特に限定されない。また、げっ歯類動物としては、上記のように、例えば、マウス、ラット及びハムスター等が挙げられ、中でもマウスが好ましい。
脳室へのヒトＣＳＦの投与方法は上記と同様である。
脳室へのヒトＣＳＦの投与量は、例えば、マウスの場合は好ましくは５μｌ以上、より好ましくは１０μｌである。他のげっ歯類動物についても、本願実施例１の記載に準じて、脳室へのヒトＣＳＦの投与量を設定することができる。
本発明のアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法において、げっ歯類動物の認知機能は行動薬理学的な手法により評価され、該手法としては上記と同様の各種公知の試験を例示することができる。
中でも、本発明のアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法では、げっ歯類動物の短期記憶を評価するのが好ましく、これらの中でもげっ歯類動物の短期記憶を評価するＹ字型迷路試験を採用するのが好ましい。
Ｙ字型迷路試験、自発交替行動、自発交替行動率（％）及びその算出方法に関する説明は上記と同様である。
本発明のアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法について、例えばヒトＣＳＦを脳室内に投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）と、生理食塩液などのコントロールを脳室内に投与したげっ歯類動物の自発交替行動率（％）とを比較し、コントロールよりも自発交替行動率（％）が低下していれば、該ヒトＣＳＦを脳室内投与したげっ歯類動物はアルツハイマー病様モデル動物であるということができる。
自発交替行動率（％）の低下の度合いとしては、例えば、統計学的に有意に低下していることが挙げられる。統計学的に有意であるとは、例えば、生理食塩液などのコントロールを脳室内に投与したげっ歯類動物と該ヒトＣＳＦを脳室内に投与したげっ歯類動物について、本願実施例１に記載の方法に準じて得られた自発交替行動率（％）の差が、ダネット検定においてｐ＜０．０５となることなどが挙げられる。
また、自発交替行動率（％）の低下の度合いとしては、３％以上、５％以上、７％以上、１０％以上または２０％以上低下していてもよい。
[アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法]
また、本発明は、アルツハイマー病の予防薬及び/または治療薬をスクリーニングする方法に関する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。当該方法は、上述したアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法により得られた当該モデル動物を用いてもよい。
また、本発明は、アルツハイマー病の予防薬及び/または治療薬をスクリーニングする方法に関する。該方法は、ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む。当該方法は、上述したアルツハイマー病様モデル動物を作製する方法により得られた当該モデル動物を用いてもよい。
ヒトＣＳＦとしては、上記のように、ヒトから採取したＣＳＦであれば特に限定されない。また、げっ歯類動物としては、上記のように、例えば、マウス、ラット及びハムスター等が挙げられ、中でもマウスが好ましい。
脳室へのヒトＣＳＦの投与方法は上記と同様である。
脳室へのヒトＣＳＦの投与量は、例えば、マウスの場合は好ましくは５μｌ以上、より好ましくは１０μｌである。他のげっ歯類動物についても、本願実施例１の記載に準じて、脳室へのヒトＣＳＦの投与量を設定することができる。
本発明のアルツハイマー病の予防薬及び/または治療薬をスクリーニングする方法において、げっ歯類動物の認知機能は行動薬理学的な手法により評価され、該手法としては上記と同様の各種公知の試験を例示することができる。
中でも、本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法では、げっ歯類動物の短期記憶を評価するのが好ましく、これらの中でもげっ歯類動物の短期記憶を評価するＹ字型迷路試験を採用するのが好ましい。
Ｙ字型迷路試験、自発交替行動、自発交替行動率（％）及びその算出方法に関する説明は上記と同様である。
本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法としては、被験薬とＡＤ患者ＣＳＦをげっ歯類動物に投与したときの該動物の自発交替行動率が、コントロールとＡＤ患者ＣＳＦをげっ歯類動物に投与したときの該動物の自発交替行動率よりも増加する場合に、該被験薬をアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬の候補として選択することなどが挙げられる。前記被験薬とＡＤ患者ＣＳＦまたはコントロールとＡＤ患者ＣＳＦは、予め混合させたものを投与してもよいし、別々に投与してもよい。別々に投与する際の投与間隔や投与の順序は特に限定されない。また、被験薬剤の投与部位または投与方法についても特に限定されないが、たとえば静脈内投与や脳室内投与が挙げられる。本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法としては、たとえば具体的には本願実施例４に記載の方法に準じて、被験薬 ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率が、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率よりも増加している被験薬を、アルツハイマー病の予防及び／または治療薬の候補として選択することなどが挙げられる。
また、本願実施例５に記載の方法に準じて、被験薬−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率が、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率よりも増加している被験薬を、アルツハイマー病の予防及び／または治療薬として選択することなどが挙げられる。
自発交替行動率（％）の増加の程度としては、例えば、統計学的に有意であることが挙げられる。統計学的に有意であるとは、例えば、両群間の差がダネット検定でｐ＜０．０５であることが挙げられる。
また、本発明のアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法としては、例えばマウスの場合、本願実施例６に記載の式（３）に準じて算出される自発交替行動率の改善率（％）が４０％以上、６０％以上、８０％以上または１００％である被験薬を、アルツハイマー病の予防及び／または治療薬として選択することが挙げられる。
本発明における被験薬としては、低分子、抗体を含むタンパク質、ペプチドなどが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の方法は、前駆期アルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬をスクリーニングする方法にも使用できる。
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記実施例に制限されない。
実施例１ ＡＤ患者ＣＳＦによるマウスの認知機能障害の測定
ＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。Ｙ字型迷路試験はＡｌｋａｍらの文献［ビヘイビオラル・ブレイン・リサーチ（Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ）、１８０巻、１３９ページ（２００７年）］に記載の方法に準じて行った。
ＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。Ｙ字型迷路試験はＡｌｋａｍらの文献［ビヘイビオラル・ブレイン・リサーチ（Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ）、１８０巻、１３９ページ（２００７年）］に記載の方法に準じて行った。
ＩＣＲマウス（雄性、日本エスエルシー）にイソフルラン麻酔下で、ＡＤ患者ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）を１、３、５または１０μｌの容量で脳室内投与した。１、３、５μｌ投与の際は左側脳室内に、１０μｌ投与の際は左側脳室内及び右側脳室内にそれぞれ５μｌずつ投与した。
陰性対照として、最大容量である１０μｌの生理食塩液（以下Ｓｈａｍと表記する）（大塚製薬工場）を前記と同様にマウスの脳室内に投与した。
脳室内投与の１時間後に、マウスを図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すようなＹ字型迷路試験装置［黒色アクリル製の壁からなる３本のアームＡ，Ｂ，Ｃ（それぞれ長さ２５ｃｍ、幅５ｃｍ、高さ２０ｃｍを有する］を、それぞれ１２０度の角度で接続した装置）のいずれかのアームの先端に入れ、迷路内を７分間自由に探索させた。
このとき、動物の四肢が全て１つのアーム内に入った状態をアームへの進入と定義し、動物がアームに進入した順番を記録し、上記の計算式・式（１）に従って自発交替行動率（％）を求めた。この結果を図１に示した。
図１に示したように、ＡＤ患者ＣＳＦ投与群の自発交替行動率は、ＡＤ患者ＣＳＦの投与量の増加に伴い低下した。特に、１０μｌのＡＤ患者ＣＳＦ投与群の自発交替行動率は、Ｓｈａｍ投与群の自発交替行動率に対して有意に低下していた。
実施例２ 異なる複数のＡＤ患者ＣＳＦによるマウス認知機能障害の測定
次に、実施例１とは異なるＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。ＡＤ患者ＣＳＦとして、実施例１とは異なる２名のＡＤ患者由来ＣＳＦ（いずれもＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）及びｐｏｏｌと表記する３名の患者由来のＣＳＦを混ぜ合わせたサンプル（Ｃｕｒｅｌｉｎｅ社）を用いた。
次に、実施例１とは異なるＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。ＡＤ患者ＣＳＦとして、実施例１とは異なる２名のＡＤ患者由来ＣＳＦ（いずれもＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）及びｐｏｏｌと表記する３名の患者由来のＣＳＦを混ぜ合わせたサンプル（Ｃｕｒｅｌｉｎｅ社）を用いた。
イソフルラン麻酔下で、１０μｌの上記ＡＤ患者ＣＳＦまたは１０μｌの生理食塩液（以下Ｓｈａｍと表記する）をＩＣＲマウスに脳室内投与し、実施例１に記載の方法でＹ字型迷路試験を実施し、自発交替行動率（％）を求めた。この結果を図２に示した。ＡＤ患者ＣＳＦ及び生理食塩液は、マウスの左側脳室内及び右側脳室内にそれぞれ５μｌずつ投与した。
図２に示したように、いずれのＡＤ患者ＣＳＦ投与群についても、マウスの自発交替行動率（％）が陰性対照であるＳｈａｍ投与群に対して有意に低下していた。
実施例１及び実施例２の結果より、１０μｌのＡＤ患者ＣＳＦをマウスの脳室内に投与すると、当該マウスの認知機能がＳｈａｍ群に対して有意に低下することが明らかになった。
実施例３ 健常人ＣＳＦがマウス認知機能に与える影響の測定
次に、健常人ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。健常人ＣＳＦとして３名の健常人由来ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）、陰性対照として生理食塩液（以下Ｓｈａｍと表記する）及び陽性対照としてＡＤ患者ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）を用いた。
次に、健常人ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。健常人ＣＳＦとして３名の健常人由来ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）、陰性対照として生理食塩液（以下Ｓｈａｍと表記する）及び陽性対照としてＡＤ患者ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）を用いた。
イソフルラン麻酔下で上記の各サンプルを１０μｌずつＩＣＲマウスに脳室内投与し、実施例１に記載の方法でＹ字型迷路試験を実施し自発交替行動率（％）を求めた。得られた結果を図３に示した。上記各サンプルは、マウスの左側脳室内及び右側脳室内にそれぞれ５μｌずつ投与した。
図３に示したように、陽性対照であるＡＤ患者ＣＳＦ投与群では、陰性対照であるＳｈａｍ投与群に対して自発交替行動率が有意に低下した。一方、健常人ＣＳＦ投与群では、いずれのサンプルにおいてもＳｈａｍ投与群とほぼ同等の自発交替行動率を示した。
以上より、実施例１及び実施例２で見られたＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能の低下は、健常人ＣＳＦでは見られないＡＤ患者ＣＳＦ特異的な現象であることが明らかになった。すなわち、ＡＤ患者ＣＳＦはマウスの認知機能の低下を引き起こし、患者の病態を反映することが明らかになった。
実施例４ ＡＤ患者ＣＳＦによるマウスの認知機能障害に対する、抗Ａβ抗体の静脈内投与の効果の測定
次に、抗Ａβオリゴマー抗体を静脈内投与したマウスについて、ＡＤ患者ＣＳＦ投与による当該マウスの認知機能の変化を、Ｙ字型迷路試験により測定した。抗Ａβオリゴマー抗体として、抗Ａβオリゴマーヒト化抗体６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０を国際公開公報第２０１１／０１６５６７号に開示された方法及び既知の方法に準じて作製し、実験に使用した。
次に、抗Ａβオリゴマー抗体を静脈内投与したマウスについて、ＡＤ患者ＣＳＦ投与による当該マウスの認知機能の変化を、Ｙ字型迷路試験により測定した。抗Ａβオリゴマー抗体として、抗Ａβオリゴマーヒト化抗体６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０を国際公開公報第２０１１／０１６５６７号に開示された方法及び既知の方法に準じて作製し、実験に使用した。
６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に記載する。また６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３、４及び５に記載し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６、７及び８に記載する。
ＩＣＲマウスに３ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇの６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０を静脈内投与した。
その翌日に、イソフルラン麻酔下で１０μｌの生理食塩液（以下、Ｓｈａｍと表記する）または同量のＡＤ患者ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）を該マウスの脳室内に投与し、実施例１に記載の方法でＹ字型迷路試験を実施し自発交替行動率（％）を求めた。得られた結果を図４に示した。ＡＤ患者ＣＳＦ及び生理食塩液は、マウスの左側脳室内及び右側脳室内にそれぞれ５μｌずつ投与した。
以下、静脈内投与にヒトＩｇＧ４を使用し、かつ脳室内投与にＳｈａｍを使用したマウスをＨｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−Ｓｈａｍ投与群と表記し、他のサンプルを投与したマウスについても同様の表記をした。
図４に示したように、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群では、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−Ｓｈａｍ投与群に対して自発交替行動率が有意に低下していた。
一方、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０ ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群では、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の投与量の増加に従って自発交替行動率が上昇した。更に、３ｍｇ／ｋｇ ６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０ ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群では、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−ＡＤ ＣＳＦ投与群に対して自発交替行動率が有意に上昇しており、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉ．ｖ．−Ｓｈａｍ投与群の自発交替行動率と同程度にまで回復していた。
実施例５ ＡＤ患者ＣＳＦによるマウスの認知機能障害に対する、抗Ａβ抗体前処置の効果の測定
実施例４では、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の静脈内投与での作用を検討した。しかし、本測定系を臨床でアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬、例えばＡβオリゴマーを標的とする薬剤の薬効の測定に応用することを考えた場合、同一の患者から該薬剤を投与する前後のＣＳＦを採取し、それぞれのＣＳＦを投与したマウスの認知機能を測定することになる。つまり、該薬剤投与後の患者由来ＣＳＦ中には、該薬剤が存在した状態でマウスの脳室内に投与することになる。
実施例４では、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の静脈内投与での作用を検討した。しかし、本測定系を臨床でアルツハイマー病の予防薬及び／または治療薬、例えばＡβオリゴマーを標的とする薬剤の薬効の測定に応用することを考えた場合、同一の患者から該薬剤を投与する前後のＣＳＦを採取し、それぞれのＣＳＦを投与したマウスの認知機能を測定することになる。つまり、該薬剤投与後の患者由来ＣＳＦ中には、該薬剤が存在した状態でマウスの脳室内に投与することになる。
そこで、実際の臨床サンプルと同様のサンプルを評価する目的で、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置したＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、Ｙ字型迷路試験を用いて測定した。
６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０を終濃度が１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌとなるようにＡＤ患者ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）に添加し、室温で約１時間インキュベーションした。
また、人工脳脊髄液［人工髄液（大塚製薬工場）に０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したもの］（以下、Ｖｅｈｉｃｌｅと表記する）をＡＤ患者ＣＳＦまたは生理食塩液（以下Ｓｈａｍと表記する）に添加し、室温でインキュベーションした。調製したサンプルは、その後−８０℃で保存し、Ｙ字型迷路試験当日に室温で融解させて実験に使用した。
ＩＣＲマウスにイソフルラン麻酔下で、上記のサンプルを１０μｌずつマウス脳室内に投与し、実施例１に記載の方法でＹ字型迷路試験を実施し自発交替行動率（％）を求めた。得られた結果を図５に示した。上記のサンプルは、マウスの左側脳室内及び右側脳室内にそれぞれ５μｌずつ投与した。
以下、ＶｅｈｉｃｌｅをＡＤ患者ＣＳＦに添加したサンプルをＶｅｈｉｃｌｅ−ＡＤ ＣＳＦと表記し、他のサンプルについても同様の表記をした。
図５に示したように、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＡＤ ＣＳＦ投与群では、マウスの自発交替行動率がＶｅｈｉｃｌｅ−Ｓｈａｍ投与群に対して有意に低下していた。
一方、終濃度が１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌの６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０−ＡＤ ＣＳＦ投与群では、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＡＤ ＣＳＦ投与群に対して自発交替行動率が上昇した。特に、終濃度が１００ｎｇ／ｍｌの６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０−ＡＤ ＣＳＦ投与群の自発交替行動率は、Ｖｅｈｉｃｌｅ−Ｓｈａｍ投与群と同程度にまで回復していた。
実施例４及び本実施例より、ＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスで見られた認知機能の低下は、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の静脈内投与及び前処置によって改善されることが明らかとなった。
実施例６ 盲検化したＣＳＦサンプルによるマウスの認知機能障害の測定、及び６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置による当該マウスの認知機能の変化の測定
盲検化した複数の健常人ＣＳＦまたはＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、実施例１と同様のＹ字型迷路試験によって測定した。同時に、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置の作用についても検討した。健常人ＣＳＦまたはＡＤ患者ＣＳＦの分注、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置したＡＤ患者ＣＳＦの調製及び盲検化を行う担当者と、該サンプルをマウスに投与してＹ字型迷路試験を行う担当者を別にして実験を行った。
盲検化した複数の健常人ＣＳＦまたはＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの認知機能を、実施例１と同様のＹ字型迷路試験によって測定した。同時に、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置の作用についても検討した。健常人ＣＳＦまたはＡＤ患者ＣＳＦの分注、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置したＡＤ患者ＣＳＦの調製及び盲検化を行う担当者と、該サンプルをマウスに投与してＹ字型迷路試験を行う担当者を別にして実験を行った。
まず、担当者（Ａ）が分注した健常人ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）及びＡＤ患者ＣＳＦ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社）にランダムに番号を割り付けて盲検化した。ＡＤ患者ＣＳＦについては、分注したＣＳＦに６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０を終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、室温で約１時間インキュベーションしたサンプルも調製した。分注及び調製したＣＳＦサンプルは全て−８０℃でＹ字型迷路試験当日まで保存した。
Ｙ字型迷路試験日に、担当者（Ｂ）が盲検化されたサンプルを担当者（Ａ）から受け取り、室温で融解させた。その後、ＩＣＲマウスにイソフルラン麻酔下で、１０μｌの各サンプルまたは１０μｌの生理食塩液（以下Ｓｈａｍと表記する）をマウスに脳室内投与し、実施例１に記載の方法でＹ字型迷路試験を実施し自発交替行動率（％）を求めた。上記の各サンプル及び生理食塩液は、マウスの左側脳室内及び右側脳室内にそれぞれ５μｌずつ投与した。
６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置を行っていないＣＳＦサンプルを投与したマウスについては、Ｓｈａｍ投与群と比較してマウスの自発交替行動率が３％以上低下した場合を、認知機能が障害されていると判定した。特に、Ｓｈａｍ投与群と比較して自発交替行動率が７〜１０％低下していた場合を認知機能が強く障害されていると判定した。得られた結果を下記表１の認知機能障害惹起の程度の欄に示した。
認知機能障害惹起の程度の判定方法を以下に記す。
−：Ｓｈａｍ投与群と比較して、自発交替行動率が０〜３％低下した（認知機能障害惹起なし）
＋：Ｓｈａｍ投与群と比較して、自発交替行動率が３〜７％低下した（弱い認知機能障害惹起）
＋＋：Ｓｈａｍ投与群と比較して、自発交替行動率が７〜１０％低下した（強い認知機能障害惹起）
認知機能障害惹起の程度の判定方法を以下に記す。
−：Ｓｈａｍ投与群と比較して、自発交替行動率が０〜３％低下した（認知機能障害惹起なし）
＋：Ｓｈａｍ投与群と比較して、自発交替行動率が３〜７％低下した（弱い認知機能障害惹起）
＋＋：Ｓｈａｍ投与群と比較して、自発交替行動率が７〜１０％低下した（強い認知機能障害惹起）
同時に、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置をしたＡＤ患者ＣＳＦを用いたＹ字型迷路試験も実施した。得られたマウスの自発交替行動率について、以下に記載の式（３）を用いることにより、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置によるマウスの自発交替行動率の改善率を算出した。その結果を下記表１の６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０処置による改善率（％）の欄に記した。
６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置によるマウスの自発交替行動率の改善率（％）＝｛（６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置したＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの自発交替行動率）−（６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置していない同一のＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの自発交替行動率）｝／｛（Ｓｈａｍ投与群の自発交替行動率）−（６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置していない同一のＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスの自発交替行動率）｝×１００ …式（３）
表１に示すように、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０で前処置していないＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスについては、１５例全てでマウスの認知機能が障害されていた。一方、健常人ＣＳＦを投与したマウスについては、１１例中１０例でマウスの認知機能は障害されていなかった。
また、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置による作用としては、１５例中７例で８０％以上、１５例中６例で４０％以上の自発交替行動率の改善率を示した。
健常人ＣＳＦを投与したマウスでは、１１例中１例でマウスの認知機能が障害された。当該マウスに投与した健常人ＣＳＦについて、上記のＡＤ患者ＣＳＦと同様に、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置によるマウスの自発交替行動率の改善率（％）を測定した。しかし、当該マウスに生じた認知機能の障害は、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０前処置によっては改善されなかった。
以上より、盲検化試験においても、健常人ＣＳＦを投与したほとんどのマウスでは認知機能障害が惹起されないのに対し、ＡＤ患者ＣＳＦを投与した全てのマウスでは認知機能障害が惹起されることが明らかになった。さらに、ＡＤ患者ＣＳＦを投与したマウスで見られた認知機能障害の多くは、６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の前処置によって回復することが明らかとなった。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１４年４月１６日付で出願された米国仮出願（ＵＳ６１／９８０，２０６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
Ａ，Ｂ，Ｃ アーム
配列番号１−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８−人工配列の説明；６Ｅ４ＨＶ０ＬＶ０の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
Claims (19)
- ヒト脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、以下ＣＳＦと記載する）をげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、ヒトＣＳＦの毒性を測定する方法。
- 前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである請求項１に記載の方法。
- 前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である請求項１または２に記載の方法。
- 前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記げっ歯類動物が、マウスである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、アルツハイマー病の判定方法。
- 前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである請求項６に記載の方法。
- 前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である請求項６または７に記載の方法。
- 前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
- コントロールを脳室内投与した前記げっ歯類動物の認知機能と、ヒトＣＳＦを脳室内投与した前記げっ歯類動物の認知機能とを比較する工程を含む請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記げっ歯類動物が、マウスである請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- ヒトＣＳＦをげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を行動薬理学的な手法により評価する工程を含む、アルツハイマー病の予防薬および／または治療薬としての薬効を測定する方法。
- 前記認知機能の評価が、前記げっ歯類動物の短期記憶を評価するものである請求項１２に記載の方法。
- 前記行動薬理学的な手法が、Ｙ字型迷路試験である請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記げっ歯類動物の脳室内へのヒトＣＳＦの投与量が、５μｌ以上である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
- 下記工程（１）および（２）を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（１）アルツハイマー病の予防薬および／または治療薬を投与開始または連投中の被験者について、ヒトＣＳＦを該薬剤の投与前後に採取する工程
（２）工程（１）で採取した該薬剤の投与前後のヒトＣＳＦを、それぞれげっ歯類動物の脳室内に投与し、該げっ歯類動物の認知機能を比較する工程 - 前記アルツハイマー病の予防薬および／または治療薬が、抗アミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ、以下Ａβと記載する）オリゴマー抗体である請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アルツハイマー病の予防薬および／または治療薬が、下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる一つの抗体である請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）抗体の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＨと記載する）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記載する）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４および５で表わされるアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＶＬと記載する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７および８で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（ｂ）抗体のＶＨが配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体 - 前記げっ歯類動物が、マウスである請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
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