ES2911715T3 - Micelas para suministro de fármacos mucoadhesivos - Google Patents

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Abstract

Micelas de copolímeros de bloques mucoadhesivos biocompatibles que comprenden un componente hidrófobo degradable, un componente hidrófilo sintético degradable y un componente mucoadhesivo, en donde el componente hidrófobo se selecciona del grupo que consiste en poliésteres, poliuretanos, poliureas, policarbonatos, poliéteres, polisulfuros, polisulfonatos, poliimidas, polibencimidazoles, un lipoglicano, un proteoglicano y sus combinaciones, el componente hidrófilo comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en ácido metacrílico, ácido acrílico, metacrilato de hidroxietilo, hidroxipropilmetacrilamida, acrilato de hidroxietilo, metacrilato de polietilenglicol, alcohol vinílico, vinilpirrolidona y sus combinaciones, el componente mucoadhesivo se selecciona del grupo que consiste en un ácido borónico o derivados del mismo, un compuesto que contiene tiol, un acrilato, quitosano, celulosa, quitosano tiolado, ácido hialurónico tiolado, ácido poli(acrílico) tiolado y sus mezclas, y el copolímero de bloque se prepara mediante combinación y polimerización de los componentes hidrófobos, hidrófilos y mucoadhesivos para producir un copolímero de bloque a partir del cual se preparan las micelas que tienen un núcleo hidrófobo y una cubierta hidrófila que incorpora el componente mucoadhesivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Micelas para suministro de fármacos mucoadhesivos
La invención
La presente invención se refiere generalmente a materiales para el suministro de fármacos y, más particularmente, a micelas para la administración de fármacos mucoadhesivos.
Antecedentes de la invención
El método más común para tratar las enfermedades del segmento anterior del ojo es mediante la administración de gotas tópicas debido a su bajo costo, facilidad de aplicación y no invasividad. Desafortunadamente, numerosas barreras impiden el suministro eficiente de la terapia al segmento anterior, lo que da como resultado que menos del 5 % de la dosis administrada llegue a los tejidos anteriores en la mayoría de los casos. Las barreras estáticas, incluidas las uniones estrechas de la conjuntiva, el epitelio corneal hidrófobo y el estroma corneal hidrófilo, y las barreras dinámicas, que incluyen la rápida renovación lagrimal y la vasculatura y los vasos linfáticos de la conjuntiva, contribuyen a la superficie anterior altamente impenetrable. Los mecanismos de aclaramiento precorneal, tal como el parpadeo, el recambio lagrimal rápido y el drenaje lagrimal, son barreras adicionales que deben superarse incluso antes de llegar a los tejidos anteriores. Tras la instilación de una gota para los ojos, el máximo de 30 pL que se puede retener en el fondo de saco se restaura a su volumen normal de 7 pL de lágrima dentro de 2 a 3 minutos, lo que da como resultado en el drenaje rápido del 80 % o más del fármaco a través del conducto nasolagrimal para la absorción sistémica y los posibles efectos secundarios.
La película lagrimal en sí está compuesta por una capa lipídica externa, una capa acuosa intermedia que contiene mucina secretada y una capa interna de mucina inmovilizada en el glucocáliz que cubre el epitelio corneal y conjuntival. Se cree que la capa interna de mucina inmovilizada actúa como otra barrera protectora contra la difusión de macromoléculas, microbios y moléculas hidrófobas debido a su naturaleza hidrófila. Se ha demostrado que el rosa de bengala, un colorante aniónico, tiñe el epitelio corneal más fácilmente con menos mucina, lo que demuestra que la mucina tiene un efecto sobre el suministro de fármacos.
Un método que se ha explorado para mejorar el transporte de fármacos a los tejidos oculares ha sido utilizar polímeros mucoadhesivos que aumentan la biodisponibilidad del fármaco en la capa de mucina inmovilizada. Hay muchos polímeros mucoadhesivos naturales bien conocidos que incluye quitosano, los derivados de celulosa, los tiómeros y muchos otros, pero estos materiales generalmente carecen de la versatilidad para el diseño de nanopartículas para lograr las características de liberación convenientes. El ácido fenilborónico (PBA) es una molécula sintética que se ha usado ampliamente en los sistemas de detección de glucosa y suministro de insulina debido a su capacidad para formar complejos de alta afinidad con 1,2-cis-dioles. Esta afinidad entre los ácidos borónicos y los dioles también se ha utilizado en otros sistemas de suministro de fármacos mucoadhesivos, tal como la administración vaginal de interferón, la administración nasal de insulina y la administración ocular de ciclosporina A (CicA).
Sería conveniente desarrollar métodos novedosos para suministrar carga, tal como agentes terapéuticos, a superficies mucosas, incluida la mucosa ocular.
Resumen de la invención
Las nuevas micelas de polímero de bloque mucoadhesivo, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan en la presente descripción que comprenden un componente mucoadhesivo, un componente degradable y un componente formador de micelas. Las micelas son útiles para el suministro de carga a una superficie mucosa.
Por lo tanto, en un aspecto de la invención, se proporcionan micelas de copolímero de bloque mucoadhesivo biocompatible que comprenden un polímero hidrófobo degradable, un polímero hidrófilo sintético degradable y un componente mucoadhesivo.
En otro aspecto, un método para suministrar carga a una superficie mucosa en un mamífero que comprende administrar a las micelas de mamífero que comprenden un polímero hidrófobo degradable, un polímero hidrófilo sintético degradable y un componente mucoadhesivo.
En otro aspecto, se proporciona un sistema de suministro de fármacos oftálmicos basado en mucoadhesivo que comprende micelas de copolímero de poli(L-lactida)-b-poli(ácido metacrílico-co-ácido fenilborónico).
Estos y otros aspectos de la invención se describen en la descripción detallada que sigue con referencia a las siguientes figuras.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la cinética de polimerización de MAAy PBA en la síntesis del copolímero LMP-10;
la Figura 2 muestra los cambios estructurales propuestos en las micelas de copolímero LMP;
la Figura 3 muestra el potencial Zeta de las micelas LMP a pH 7,4. La medición se realizó a 1 % en peso de micelas. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Todas las demás comparaciones no fueron significativamente diferentes (p>0,05);
la Figura 4 muestra la concentración crítica de micelas para copolímeros LMP en PBS (pH 7,4) determinada a partir de la relación de intensidad fluorescente a 373 nm a 383 nm después de la excitación a 340 nm;
la Figura 5 muestra las eficiencias de atrapamiento de los copolímeros LMP y el control CicA. ***p<0,001 en comparación con todos los copolímeros LMP. Todas las demás comparaciones no fueron significativas p>0,05;
la Figura 6 muestra la distribución de carga de CicA propuesta en copolímeros LMP con cantidades variables de PBA;
la Figura 7 muestra la liberación acumulativa de CicA de la micela LMP;
la Figura 8 muestra un sensograma SPR de micelas LMP. STF y LMP representan el flujo de líquido lagrimal simulado y micelas LMP, respectivamente;
la Figura 9 muestra la Viabilidad de HCEC por A) ensayo MTT, B) CalAM y C) EthD-1;
la Figura 10 ilustra gráficamente el efecto de las micelas en el volumen de lágrimas in vivo en un modelo de rata DED;
la Figura 11 ilustra gráficamente el efecto de las micelas en la osmolaridad de la película lagrimal in vivo; y
la Figura 12 ilustra que las micelas no tienen ningún efecto adverso mediante el uso de Draize modificado y puntuación de fluoresceína.
Descripción detallada de la invención
En la presente descripción se proporcionan nuevas micelas mucoadhesivas biocompatibles que comprenden un componente hidrófobo, un componente hidrófilo y un componente mucoadhesivo. Las micelas son útiles para el suministro de carga, tal como un agente terapéutico, a una superficie mucosa.
Las presentes micelas mucoadhesivas comprenden un componente hidrófobo que forma el núcleo de las micelas. El componente hidrófobo será generalmente un polímero degradable que tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 2000 kDA, y preferiblemente, de 1 a 200 kDa. El componente hidrófobo puede comprender polímeros hidrófobos sintéticos tales como, entre otros, poliésteres, poliuretanos, poliureas, policarbonatos, poliéteres, polisulfuros, polisulfonatos, poliimidas, polibencimidazoles y sus combinaciones. El polímero hidrófobo también puede ser un polímero hidrófobo natural tal como un lipoglicano, un proteoglicano y similares, versiones modificadas de los mismos o sus combinaciones. Los ejemplos de polímeros hidrófobos para su inclusión en las presentes micelas incluyen, por lo tanto, pero no se limitan a, una polilactida, poliglicólido, poli(lacida-co-glicólido, poli(£-caprolactona), poli-3-hidroxibutirato, poli(dioxanona), poli(3-hidroxibutirato), poli(3-hidroxivalcrato), poli(valcrolactona), poli(ácido tartónico), poli(ácido malónico), poli(anhídridos), poli(ortoésteres), polifosfacenos y acriloiloxi dimetil-Y-butirolactona (DBA) y otros polímeros que contienen lactona, y sus combinaciones.
El componente hidrófilo forma una cubierta exterior de las presentes micelas. El componente hidrófilo puede comprender polímeros hidrófilos sintéticos degradables que comprenden entidades reactivas y que tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1000 kDA, y preferentemente, en el intervalo de 1 a 100 kDa. El término "sintético" se usa en la presente descripción para referirse a polímeros que se sintetizan químicamente en oposición a los que se producen de forma natural. Los ejemplos de polímeros hidrófilos sintéticos adecuados para su inclusión en las presentes micelas incluyen, entre otros, ácidos poliacrílicos, polialcoholes, poliacrilatos, poliuretanos, poliacrilaminas, poliacrilamidas, poliéteres y polipirrolidonas. Por lo tanto, los polímeros hidrófilos adecuados pueden incluir aquellos que comprenden uno o más monómeros seleccionados de acrilato, ácido acrílico, metacrilato, ácido metacrílico, acrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, acrilonitrilo, 2-cloroetilviniléter, acrilato de
2-etilhexilo, metacrilato de hidroxietilo, acrilato de butilo, metacrilato de butilo, triacrilato de trimetilolpropano, hidroxipropilmetacrilamida, acrilato de hidroxietilo, metacrilato de poli(etilenglicol), poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(2-oxazolina), polietilenglicol, o polímeros de polivinilpirrolidona, o copolímeros de los mismos.
El componente hidrófilo está unido a un componente mucoadhesivo que funciona para adherir las micelas a una superficie mucosal diana. El componente mucoadhesivo está unido al componente hidrófilo a través de entidades reactivas sobre el componente hidrófilo. El término "unido" se usa en la presente descripción para referirse a enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y similares. Las entidades reactivas pueden existir naturalmente o ser innatas en el componente hidrófilo, o pueden introducirse en el componente hidrófilo. Tales entidades reactivas pueden incluir, por ejemplo, grupos hidroxilo, amina, tiol, cetona y ácido carboxílico.
El componente mucoadhesivo se selecciona por su capacidad para adherirse o unirse a una superficie mucosa, para retener las micelas presentes en un sitio mucoso objetivo. Por tanto, el componente mucoadhesivo generalmente reconocerá y se unirá a un constituyente de una superficie mucosa diana, incluyendo una glicoproteína tal como mucina, un receptor, un polisacárido u otro constituyente.
En una modalidad, el componente mucoadhesivo es capaz de unirse a la mucina. Con respecto a esto, el mucoadhesivo se seleccionará para unirse a los grupos cis-diol presentes en los carbohidratos dentro de la mucina, por ejemplo, ácidos siálicos, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, galactosa y fucosa. Los ejemplos de un mucoadhesivo adecuado para este fin incluyen, entre otros, ácidos borónicos tales como ácido fenilborónico, ácido 2-tienilborónico, ácido metilborónico, ácido cis-propenilborónico, ácido trans-propenilborónico, ácido (4-alilaminocarbonil)bencenoborónico, ácido (4-aminosulfonilfenil)borónico, ácido (4-benciloxi-2-formil)fenilborónico, ácido (4-hidroxi-2-metil)fenilborónico, ácido (4-hidroxi-2-metil)fenilborónico, ácido (4-metanosulfonilaminometilfenil)borónico, ácido (4-metanosulfonilaminometilfenil)borónico, ácido (4-metilaminosulfonilfenil)borónico, ácido (4-metilaminosulfonilfenil)borónico, ácido (4-fenilaminocarbonilfenil)borónico, ácido (4-fenilaminocarbonilfenil)borónico, ácido (4-sec-butil)bencenoborónico, ácido (2,6-dimetoxi-4-metilfenil)borónico, ácido (2,6-dimetoxi-4-metilfenil)borónico, ácido (2-metilpropil)borónico, ácido (2-metilpropil)borónico, ácido (3-acetamido-5-carboxi)fenilborónico, ácido (3-acetamido-5-carboxifenil)borónico, ácido (3-acetamidometilfenil)borónico, ácido (3-acetamidometilfenil)borónico, ácido (3-alilaminocarbonil)bencenoborónico, ácido (3-cianometilfenil)borónico y derivados de los mismos, incluidos los ésteres borónicos formados por reacción del ácido borónico con un alcohol. Los ejemplos de ésteres borónicos incluyen, entre otros, éster de pinacol de ácido alilborónico, éster de trimetilenglicol de ácido fenilborónico, diisopropoximetilborano, bis(hexilenglicolato)diboro, t-butil-N[4(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil]carbamato, 2,6-dimetil-4(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzoato, 4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina, ácido 4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzoico, 4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenol, 2-metoxi-4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenol, y similares.
En otra modalidad, el mucoadhesivo se selecciona para unirse a los residuos de cisteína en la mucina. Los ejemplos del mucoadhesivo incluyen compuestos que contienen tiol, tal como la cisteamina. En otra modalidad, el mucoadhesivo se selecciona para unirse a glicoproteínas en mucina que contienen grupos hidroxilo. Los mucoadhesivos de unión a glicoproteínas adecuados incluyen compuestos de acrilato tales como metacrilato, acrilato de etilo y diacrilato. Otros compuestos mucoadhesivos incluyen polímeros naturales tales como quitosano, celulosa, ácido hialurónico y tiómeros tales como quitosano tiolado, ácido hialurónico tiolado y ácido poli(acrílico) tiolado. También se pueden usar mezclas de compuestos mucoadhesivos.
Los componentes hidrófobos, hidrófilos y mucoadhesivos se combinan para preparar las presentes micelas mediante el uso de métodos establecidos en la técnica. En primer lugar, los componentes se polimerizan mediante el uso de métodos conocidos en la técnica de la química de polímeros. En una modalidad, podría usarse la polimerización por radicales libres para preparar las micelas. En otra modalidad, puede usarse una polimerización por radicales de desactivación reversible, que incluye la polimerización por transferencia de cadena de fragmentación por adición reversible (RAFT). La polimerización RAFT usa compuestos de tiocarboniltio, tales como ditioésteres, tiocarbamatos y xantatos, para mediar en la polimerización a través de un proceso de transferencia de cadena reversible. Generalmente, se combina una cantidad adecuada de cada uno de los polímeros hidrófobos, hidrófilos y mucoadhesivos. Un experto en la técnica apreciará que las cantidades de cada uno usadas para preparar las presentes micelas variarán con los polímeros usados. En una modalidad, polímero hidrófobo (por ejemplo, en una cantidad en un intervalo de aproximadamente 1-5 por ciento molar, por ejemplo, aproximadamente 2 por ciento molar); polímero hidrófilo (por ejemplo, en una cantidad en un intervalo de aproximadamente 75-85 por ciento molar, por ejemplo, aproximadamente 80 por ciento molar) polímero mucoadhesivo (por ejemplo, en una cantidad en un intervalo de aproximadamente 15-25 por ciento molar, por ejemplo, aproximadamente 20 por ciento molar, y un iniciador de radicales libres, se disuelven en un solvente apropiado (que puede variar con los polímeros usados). Dioxano:agua, acetona:agua y DMSO:agua son ejemplos de disolventes adecuados. Los ejemplos de iniciadores de radicales libres que se pueden usar incluyen moléculas de halógeno, compuestos azo tales como azobisisobutironitrilo (AIBN), 4,4'-azobis (ácido 4-cianovalérico), 1,1'-azobis (ciclohexanocarbonitrilo y 2,2'-azobis (2-metilpropionitrilo, peróxidos orgánicos (por ejemplo, hidroperóxido de terc-butilo, peróxido de dicumilo y peróxido de benzoilo) y peróxidos inorgánicos (por ejemplo, persulfato de potasio, persulfato de sodio o persulfato de amonio). A continuación, la solución se calienta con agitación durante un período de tiempo apropiado. El copolímero de bloque mucoadhesivo resultante se puede aislar por precipitación.
Los copolímeros de bloques mucoadhesivos apropiados para usar para hacer micelas de acuerdo con la invención tendrán una relación de polímero hidrófobo: polímero hidrófilo: mucoadhesivo de aproximadamente 0,5:94,5:5 a aproximadamente 5:65:30.
El copolímero mucoadhesivo aislado se forma en micelas por precipitación. El polímero se disuelve primero en un disolvente apropiado, tal como acetona, para formar una solución de copolímero. A continuación, la solución de copolímero se añade al agua con agitación constante hasta que se haya evaporado el disolvente. Se forman micelas de tamaño nanométrico, por ejemplo, menos de 500 nm, preferiblemente menos de aproximadamente 200 nm, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1-150 nm, por ejemplo, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o 20 nm o menos. Las micelas tienen un núcleo hidrófobo y una cubierta hidrófila que incorpora el componente mucoadhesivo. Las micelas son útiles para el suministro de carga, por ejemplo, productos terapéuticos, a superficies mucosas que incluyen, entre otras, la mucosa ocular, la mucosa nasal, la mucosa oral, la mucosa olfativa, la mucosa bronquial, la mucosa esofágica, la mucosa gástrica, la mucosa intestinal, el endometrio, mucosa del pene, mucosa vaginal y mucosa anal. Las micelas que contienen carga se preparan fácilmente disolviendo el copolímero mucoadhesivo en un disolvente que comprende la carga y añadiendo la solución al agua con agitación para formar las micelas como se describe anteriormente. Generalmente, las micelas se cargan con una cantidad de carga en el intervalo de 5­ 50 % en peso de las micelas.
Como apreciará un experto en la técnica, las micelas pueden incluir varios tipos de carga, incluidos agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico y similares. El cargamento puede ser moléculas pequeñas o compuestos más grandes como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o similares. Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden cargarse en las presentes micelas incluyen analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antipatógenos que incluyen agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos, agentes gastrointestinales, antihistamínicos, agentes antialérgicos, agentes anticancerígenos, agentes anti-nauseosos, agentes antiasmáticos, descongestionantes, medicamentos para el glaucoma, fármacos reductores de la presión intraocular (agentes reductores de PIO), lubricantes, emolientes, contrairritantes, lágrimas hipertónicas, así como también agentes terapéuticos, de diagnóstico y antiototóxicos aplicados al oído interno.
Los agentes terapéuticos preferidos son aquellos que tratan una afección dentro de la proximidad de un sitio mucoso. Los ejemplos incluyen fármacos oftálmicos tales como ciclosporina A, aciclovir, atropina, acetazolamida, alfagan, azitromicina, bacitracina, betadina, betaxolol, betoptic, brinzolamida, carbachol, cefazolina, celluvisc, cloranfenicol, ciloxan, ciprofloxacina, cefalosporina, emecario, dexametasona, dipivefrina, dorzolamida, epinefrina, eritromicina, fluoresceína, flurbiprofeno, quinolonas tales como fluoroquinolona, gentamicina, goniosol, gramicidina, ganciclovir, gatafloxacino, humorsol, hilartina, itraconazol, ketotifeno, latanoprost, levofloxacino, bimatoprost, travoprost, pilocarpina, polimixina B, prednisolona, proparacaína, propina, puralube, manitol, metazolamida, miconazol, miostat, moxifloxacina, natamicina, neomicina, neptazane, ocuflox, ofloxacina, oxitetraciclina, olopatadina, fenilefrina, prostaglandina, hialuronato de sodio, suprofeno, terramicina, timolol, tobramicina, triamcinolona, trfluridina, tropicamida, vidarabina, valciclovir, vancomicina, xalatan, fenilefrina, prostaglandinas y anti-VEG Medicamentos F tales como ranibizumab y pegaptanib sódico.
Los ejemplos de agentes terapéuticos para el suministro a otros sitios de la mucosa incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona dirigida a la mucosa mastoidea del oído medio para tratar la enfermedad de Meniere; clotrimazol administrado a la mucosa vaginal para tratar infecciones por hongos; balsalazida dirigida a la mucosa intestinal para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal; ipratropio administrado a través de un inhalador al pulmón para el asma aguda, y azelastina administrada a través de un aerosol nasal para reducir la irritación alérgica. Como apreciará un experto en la técnica, un agente terapéutico dirigido a cualquier tejido con una membrana mucosa asociada que sea susceptible de disfunción o enfermedad puede suministrarse mediante el uso de las presentes micelas.
Los ejemplos de agentes de diagnóstico que pueden suministrarse en un sitio mucoso mediante el uso del presente sistema de administración micelar incluyen agentes de contraste tales como quelatos de gadolinio, hierro, magnesio, manganeso, cobre y cromo, agentes de formación de imágenes tales como agentes a base de yodo y moléculas fluorescentes y radionucleótidos, tales como emisores gamma, emisores de positrones y emisores de rayos X. Las presentes micelas se pueden formular para la administración por varias vías, que incluyen oral, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intraarterial, intramedular, intrauterina, intratecal, inhalación, ocular, transdérmica, vaginal, rectal, infusión o inyección, por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa. Las presentes micelas, por lo tanto, pueden combinarse para formar una composición con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables para facilitar su suministro a un sitio mucoso objetivo. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aceptable para su uso en las técnicas farmacéutica y veterinaria, es decir, que no sea inaceptablemente tóxico o de cualquier otra manera inadecuado. Los ejemplos de adyuvantes farmacéuticamente aceptables son los que se usan convencionalmente con fármacos basados en micelas, tales como diluyentes, excipientes y similares. Se puede hacer referencia a "Remington's: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005, para obtener orientación sobre formulaciones de fármacos generalmente. La selección del adyuvante depende del modo previsto de administración de la composición. En una modalidad de la invención, los compuestos se formulan como gel, solución o ungüento para administración tópica en el ojo o el oído. Dichas formulaciones tópicas pueden incluir grasas, aceites, ceras, polietilenglicol, silicona, ácido silícico, óxido de zinc, almidón y derivados de celulosa. Se pueden preparar cremas, lociones y ungüentos para aplicación transdérmica mediante el uso de una base apropiada tal como una base de triglicéridos, o una o más grasas, aceites, ceras, polietilenglicol, silicona, ácido silícico, óxido de zinc, almidón y derivados de celulosa. Tales cremas, lociones y ungüentos también pueden contener un agente tensioactivo. Las cremas, lociones y ungüentos pueden formularse como supositorios para administración rectal o vaginal. También pueden prepararse formulaciones en aerosol para la administración nasal en las que se usan adyuvantes propulsores adecuados. Para la administración oral a través de tabletas, cápsulas o suspensión, las presentes micelas se pueden combinar con adyuvantes que incluyen azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y derivados de la misma, incluyendo carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetatos de celulosa; tragancanto en polvo; malta; gelatina; talco; ácidos esteáricos; estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceites de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de maíz; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; agar; ácidos algínicos; agua; solución salina isotónica y tampón de fosfato. También pueden estar presentes agentes humectantes, lubricantes tales como laurilsulfato de sodio, estabilizantes, agentes formadores de tabletas, antioxidantes, conservantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes. También se pueden añadir otros adyuvantes a la composición independientemente de cómo se vaya a administrar, por ejemplo, se pueden añadir agentes antimicrobianos a la composición para evitar el crecimiento microbiano durante periodos de almacenamiento prolongados.
Las presentes micelas se administran en el tratamiento o diagnóstico de una afección en una superficie o sitio de la mucosa diana en una cantidad suficiente para suministrar una dosis efectiva de carga terapéutica o diagnóstica a la superficie o el sitio diana. Las dosis efectivas de dicho cargamento, como se ejemplifica en la presente descripción, serán conocidas por los expertos en la técnica y pueden corresponder a las dosis administradas a través de otros sistemas de suministro. Así, por ejemplo, para el suministro de un fármaco oftálmico, las dosis para usar con las presentes micelas se corresponderán con las dosis generalmente usadas en la técnica. Alternativamente, la dosificación efectiva puede reducirse de la administrada a través de otros sistemas de suministro. Por ejemplo, CicA normalmente se administra en exceso a través de una alícuota de ~500 pl que contiene 0,05 % de CicA que se deja caer sobre la superficie ocular dos veces al día. Sin embargo, esta tecnología de micelas representa una desviación fundamental de este paradigma. Dada la mucoadhesión y la liberación controlada proporcionadas por las presentes micelas, la frecuencia de dosificación y la cantidad total de CicA requerida para lograr el efecto terapéutico pueden reducirse. En una modalidad, se puede usar una sola gota (0,05 ml) a 5 mg/ml de CicA puede usarse una vez por semana.
Las presentes micelas, que incluyen un agente terapéutico o de diagnóstico apropiado, pueden administrarse a una superficie mucosa diana en un método para tratar o diagnosticar diversas afecciones patógenas tales como afecciones que afectan los ojos, la nariz, la boca, los oídos, la garganta, el esófago, el estómago, los intestinos, endometrio, pene, vagina o ano. Tales afecciones pueden incluir, pero no se limitan a, infección, inflamación, cáncer, enfermedad degenerativa, reacción alérgica, lesión, cicatrización y similares.
En una modalidad, las presentes micelas se usan en el tratamiento de una afección que afecta al ojo. Dichas afecciones pueden incluir, pero no se limitan a, infecciones, glaucoma, cataratas, retinopatía diabética, distrofia macular, ojo seco, queratocono, linfoma, alergias, inflamación, oclusiones, hipertensión, nistagmo, degeneración macular, trasplante de córnea, deficiencia de vitamina A, úlcera dendrítica, quistes, cicatrices y abrasiones.
Las presentes micelas proporcionan ventajosamente un sistema de suministro que se dirige de manera efectiva a los sitios de la mucosa para el suministro de carga, tal como agentes terapéuticos o de diagnóstico, a los mismos. Debido a la inclusión de un componente hidrófilo sintético, las micelas exhiben una buena estabilidad y se pueden adaptar para lograr un suministro óptimo de la carga seleccionada a un sitio mucoso objetivo. El uso de un componente hidrófilo sintético también puede proporcionar micelas que no son inmunogénicas.
Las modalidades de la invención se describen en los siguientes ejemplos específicos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplo 1
Materiales: a menos que se indique lo contrario, todos los materiales se compraron a Sigma Aldrich (Oakville, ON, Canadá) y se usaron tal como se recibieron. El ácido 3-acrilamidofenilborónico se purificó por recristalización en agua. El azobisisobutironitrilo (AIBN) se purificó por recristalización en metanol. Se adquirieron 1,4-dioxano, tetrahidrofurano, éter dietílico, N,N-dimetilformamida y acetonitrilo de Caledon Laboratories (Caledon, ON) y se usaron tal como se recibieron. El DMSO-d6 se adquirió de Cambridge Isotope Laboratories Inc. (Andover, MA, EE. UU.) y se usó tal como se recibió. Se preparó agua purificada con una resistividad de 18,2 MQ cm mediante el uso de un sistema de purificación de agua Milli-pore Barnstead (Graham, NC, EE. UU.). La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirió de BioShop (Burlington, ON, Canadá). Las membranas de diálisis de celulosa con valores de corte de peso molecular (MWCO) de 3,5 y 50 kDa se adquirieron de Spectrum Laboratories Inc. (Rancho Domínguez, CA, e E. UU.). El bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio (MTT), la calceína AM y el bromuro de etidio se compraron de Life Technologies (Carlsbad, CA, EE. UU.) y se usaron tal como se recibieron.
Síntesis y caracterización del copolímero pLA-bp(MAA-PBA) - Los copolímeros pLA-bp(MAA-PBA) (LMP) se sintetizaron mediante polimerización RAFT. En un procedimiento de reacción típico (80:20:1,4:0,2 relación molar de alimentación de MAA:PBA:pLA:AIBN), ácido metacrílico (MAA; 192,9 mg, 2,24 mmol), PBA (107,1 mg, 0,56 mmol), poli(L-lactida) pentoato de 4-ciano-4-[(dodecilsulfaniltiocarbonil)sulfanil] (pLA-CDP; 200,0 mg, 0,04 mmol), AIb N (1,10 mg, 0,01 mmol) se disolvieron en 5 ml de 90:10 1,4-dioxano: agua para formar una solución al 10 %. La solución se desgasificó realizando tres ciclos de congelación-bombeo-descongelación seguidos de reemplazo de la atmósfera con nitrógeno seco. A continuación, el matraz se calentó a 70 °C durante 24 horas con agitación constante. Este copolímero, denominado LMP-20 (20 % en peso de PBA en el bloque de poli(MAA-co-PBA)) se aisló por precipitación en un exceso de 10 veces de éter dietílico anhidro frío y se purificó adicionalmente por precipitación repetida en éter dietílico de tetrahidrofurano. El copolímero se secó en un horno de vacío a 50 °C durante 24 horas hasta alcanzar un peso constante.
La composición del copolímero LMP y el peso molecular se determinaron mediante el uso de 1RMN H (Bruker AV 600) en DMSO-d6. Se estudió la cinética de polimerización de LMP para determinar la distribución de PBA dentro del bloque MAA-PBA y la naturaleza controlada de la polimerización. La polimerización se realizó como se indicó anteriormente, aunque en puntos de tiempo específicos se usó una aguja hermética purgada con nitrógeno para extraer muestras de 50 pL para resonancia magnética nuclear de protones (1RMN H; Bruker AV 600) en DMSO-d6.
Formación y Caracterización de micelas - Las micelas se formaron por el método de precipitación. Se disolvieron 20 mg de copolímero LMP en 2 ml de acetona. La solución de copolímero se añadió gota a gota a 6 ml de agua purificada con agitación constante. A continuación, las soluciones de acetona/agua se agitaron descubiertas a temperatura ambiente durante 48 horas para evaporar la acetona antes de la caracterización adicional. El tamaño de la micela se determinó mediante el uso de un instrumento de seguimiento de nanopartículas individuales NanoSight LM10 (Malvern Instruments Ltd.). Las soluciones de micelas en agua purificada se diluyeron a 5 * 10-2 mg ml'1 antes de la medición en pH 7,4 PBS. La estabilidad de las micelas se evaluó mediante el uso del potencial Zeta (ZetaPlus Analyzer, Brookhaven) en PBS de pH 7,4 con NaCl 10 mM. El potencial Zeta se midió para 1 mg ml-1 LMP.
La concentración crítica de micelas (CMC) se determinó mediante el uso del método de sonda fluorescente de pireno. Se disolvió una cantidad predeterminada de pireno en acetona y se añadió a viales de 2 ml y se dejó evaporar. Soluciones de micelas que van desde 10 mg ml-1 a 10'5 mg ml-1 se agregaron y se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente, lo que resultó en concentraciones finales de pireno de 6,0 * 10-7 mol L-1. La fluorescencia se midió mediante el uso de un lector de placas TECAN M1000 Pro (Mannedorf, Suiza). El espectro de excitación se midió después de una longitud de onda de excitación de 340 nm. La CMC se determinó trazando la relación de intensidad de los picos a 373 nm frente a los de 383 nm frente al logaritmo de la concentración. Los anchos de banda de emisión y excitación para todas las mediciones fueron de 5 nm.
Mucoadhesión por Resonancia de Plasmón Superficial: la mucoadhesión se determinó mediante el uso de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR; SPR Navi™ 200, BioNavis). Brevemente, los sensores de oro SPR102-AU se limpiaron mediante el uso de piraña (3:1 94 % de ácido sulfúrico: peróxido de hidrógeno), se enjuagaron abundantemente con agua purificada y se secaron bajo una corriente de nitrógeno. Estos sensores luego se incubaron en 100 pL de 100 pg ml-1 mucina de la glándula submaxilar bovina durante 24 horas a 20 °C y luego se enjuagó con agua purificada para eliminar la mucina no unida. Las mediciones de SPR se realizaron mediante el flujo de líquido lagrimal simulado (STF; KCl 23,1 mM, NaHCO 20,0 mM3 , CaCl 1 mM2^2H2O, NaCl 113,5 mM) durante 10 minutos para lograr una línea de base estable. Luego se cambió la solución a 1 mg ml-1 solución de quitosano o micelas de LMP durante 50 minutos. En este punto, la solución se volvió a cambiar a fluido lagrimal simulado para evaluar la estabilidad de la mucoadhesión. Todas las mediciones se realizaron a un caudal de 50 pL min-1, una temperatura de 22 °C y un ángulo de exploración fijo de 65,4 °.
Liberación de Ciclosporina A (CicA) - La liberación de CicA de las micelas se determinó mediante el uso de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Brevemente, se disolvieron 20 mg del copolímero LMP en 2 ml de acetona que contenía 1,5 mg ml-1 CicA. Esta solución se añadió gota a gota a 6 ml de agua purificada. La solución se dejó en agitación durante 24 horas para evaporar la acetona. Se retiraron 0,5 ml y se filtraron con unidades centrífugas Nanosep 10K Omega (10 kDa MWCO, Pall Corporation) para separar las micelas de la CicA libre. El filtrado se recogió para determinar la eficiencia de atrapamiento (EE). A continuación, se añadieron 5 ml de muestra no centrifugada a tubos de diálisis MWCO de 50 kDa y se colocaron en 15 ml de STF. En los puntos de tiempo especificados, se retiraron muestras de 2,5 ml y se reemplazaron con STF precalentado nuevo. Estas muestras se analizaron mediante el uso de un Waters HPLC que consta de un muestreador automático 2707, un espectrofotómetro UV 2489, una bomba de HPLC binaria 1525 y el software Breeze 2 (Build 2154). Se utilizó un caudal isocrático de 0,7 ml min-1 de acetonitrilo:0,1 % de ácido trifluoroacético en agua purificada como fase móvil 80:20, una temperatura de columna de 60 °C, un volumen de inyección de muestra de 20 pL y una longitud de onda de detección de 210 nm. Las concentraciones de la muestra se determinaron en base a una curva de calibración estándar de CicA en la fase móvil.
Cultivo celular: para el cultivo celular, todos los copolímeros se dializaron extensamente en soluciones de acetona:agua 2:1 frente a un tubo de diálisis MWCO de 3,5 kDa para evitar la formación de micelas, seguido de la transición a agua purificada y luego se liofilizaron. A continuación, se disolvieron 50 mg de copolímero en 1 ml de acetona y se añadieron gota a gota con agitación constante a 2,5 ml de agua estéril. Se dejó evaporar la acetona durante 48 horas con agitación constante, de manera que se añadieron PBS concentrado y penicilina/estreptomicina a concentraciones finales de 0,1 M y 1 % (v/v), respectivamente.
Se cultivaron células epiteliales corneales humanas (HCEC) en medios sin suero de queratinocitos (KSFM) suplementados con extracto de pituitaria bovina (BPE, 0,05 mg/ml) y factor de crecimiento epidérmico (EGF, 0,005 mg ml).1). Las HCEC se sembraron en placas de 96 pocillos a densidades de 5,000 pocillos de células-1 e incubado en un CO2 de temperatura controlada, incubadora (37 °C, 5 % CO2 , 95 % aire, 100 % humedad). Después de 24 horas de crecimiento, el medio se reemplazó con 150 pL de KSFM y 50 pL de PBS, 20 mg ml-1 micelas LMP, o 4 mg ml-1 micelas para la concentración final de micelas LMP de 0, 5 y 1 mg ml"1. Las placas se incubaron a 37 °C, momento en el que se evaluó la viabilidad celular mediante el uso de un ensayo MTT y se determinaron los recuentos de células vivas/muertas mediante un ensayo de calceína AM (CalAM)/homodímero de etidio-1 (EthD-1) después de 24 y 72 horas.
Análisis Estadístico: se usó un análisis de varianza de un factor (ANOVA) para analizar el tamaño de la micela, el potencial Zeta y la viabilidad de HCEC mediante el uso de a = 0,05 con Tukey post hoc. El análisis estadístico se realizó mediante el uso del software estadístico IBM SPSS Statistics V22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, EE. UU.). Todas las barras de error representan la desviación estándar.
Resultados
Caracterización de Copolímeros - Se usó 1RMN H para determinar la composición molar y el peso molecular medio numérico de los copolímeros LMP. De acuerdo con la Tabla 1, se determinó que las composiciones finales eran consistentes con las relaciones de alimentación, y el peso molecular era similar al peso molecular teórico basado en las proporciones de los reactivos.
Tabla 1. Datos de polimerización del copolímero de bloque LMP.
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Debido a las propiedades anfifílicas del copolímero LMP, así como también a la afinidad del ácido fenilborónico no protegido, la cromatografía de filtración en gel no proporcionó resultados representativos. Por esta razón, se realizó un estudio cinético para comprender mejor el proceso de polimerización y la distribución del ácido fenilborónico en el bloque hidrófilo, que se muestra en la Figura 1. Este estudio cinético no mostró una relación de orden cero entre la conversión y el tiempo, lo que se espera para una polimerización RAFT bien controlada. Por lo tanto, es probable que la polidispersidad sea mayor que la polimerización RAFT tradicional. La cinética también muestra que, durante las etapas iniciales de polimerización, mAa reacciona más rápido que PBA, pero después de 12 horas alcanzan una velocidad de polimerización similar. Esto provoca dos resultados: la composición de copolímero final tiene una relación MAA/PBA más alta que la relación de alimentación, y la distribución de PBA aumenta durante el curso de la polimerización para producir un gradiente dentro del segmento poli(MAA-co-PBA). El gradiente de PBA puede ser beneficioso para la mucoadhesión porque se ubicará más PBA en la superficie para interactuar con la mucina. Morfología de la micela: mediante el uso del potencial de NanoSight y Zeta, se formuló la hipótesis del efecto de PBA en el tamaño y la estructura de la micela, que se muestra en la Figura 2. Debido al pKa de MAA de ~4,6 y el pKa de PBA de ~8,8, la mayoría de los grupos MAA deben estar cargados negativamente mientras que la mayoría de los grupos PBA deben estar descargados en PBS de pH 7,4 [27]. Según el diámetro de la micela, que se muestra en la Tabla 2, se pueden ver dos tendencias.
Tabla 2. Tamaño determinado mediante el uso de NanoSight de micelas de copolímero de bloque LMP. Todas las medidas informadas representan el diámetro ± SD en nm.
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En primer lugar, a medida que aumenta la relación de PBA/MAA en las micelas de LMP que contienen PBA, aumenta el diámetro. En segundo lugar, las micelas LMP-0 son más grandes que las micelas LMP que contienen cantidades mínimas de PBA. Estos resultados pueden explicarse por la presencia de dos fuerzas en competencia: las interacciones intermoleculares entre el MAA cargado negativamente y el agua, y las interacciones hidrófobas intermoleculares e intramoleculares inducidas por el PBA. Los grupos MAA cargados negativamente en el copolímero LMP-0 hacen dos cosas: se repelen electrostáticamente entre sí y forman interacciones electrónicas con las moléculas de agua. Estos efectos forman una gran cubierta exterior hidratada, que contribuye al gran diámetro. La adición de una pequeña cantidad de PBA en la cubierta exterior provoca la expulsión de algunas de estas moléculas de agua, lo que hace que la cubierta exterior se vuelva menos hidratada y más pequeña. Sin embargo, a medida que aumenta aún más la fracción de PBA, se produce la expulsión de agua, lo que permite un aumento de las interacciones hidrófobas entre las cadenas de polímeros, lo que conduce a un empaquetado más compacto. Además, el anillo de fenilo grande y voluminoso crea un impedimento estérico intramolecular dentro de la cadena polimérica (MAA-co-PBA), creando un polímero más rígido incapaz de doblarse y plegarse en una estructura voluminosa. La mayor rigidez permite que los polímeros hidrófilos de poli(MAA-co-PBA) se empaqueten más juntos, lo que da como resultado un radio de curvatura efectivo más grande, lo que aumenta el diámetro de la micela.
El potencial Zeta, que se muestra en la Figura 3, tuvo tendencias similares al tamaño de la micela. Las micelas de LMP que contenían PBA mostraron que las micelas se cargaron más negativamente a medida que aumentaba la composición de PBA. Aunque inicialmente parece contrario a la intuición que aumentar la composición de PBA neutral daría como resultado más micelas cargadas negativamente, el cambio puede explicarse por la densidad de carga en lugar de la carga total. Como se discutió anteriormente, los polímeros LMP con composiciones de PBA más altas se juntan más estrechamente debido a las interacciones hidrófobas y al impedimento estérico. El mayor empaquetamiento da como resultado una mayor carga superficial medida por el potencial Zeta.
Las propiedades características de las micelas fueron confirmadas por CMC y TEM. La caracterización TEM mostró una morfología circular indicativa de micelas esféricas. Todas las micelas LMP muestran diámetros relativamente monodispersos de menos de 100 nm en su estado seco. Se usó CMC para caracterizar la concentración a la que comienzan a formarse micelas a partir de copolímeros de bloques libres en solución. La CMC, que se muestra en la Figura 4, se determinó para los copolímeros LMP-0, 5, 10, 20 y 30 en 73,0, 47,8, 40,6, 41,0 y 32,5 mg ml-1 respectivamente. La ligera tendencia decreciente en CMC con el aumento de la composición de PBA puede explicarse por las diferencias en la solubilidad del copolímero de bloque y la estabilidad de la micela. El aumento de la composición de PBA hace que el bloque de poli(MAA-co-PBA) sea menos soluble en agua, lo que reduce la fuerza impulsora para que entre en solución. Adicionalmente, las interacciones hidrófobas entre el PBA en la cubierta exterior aumentan la estabilidad de la micela al bloquearla ligeramente en su lugar evitando la liberación del copolímero de bloque en la solución.
Liberación de Ciclosporina A: se atrapó CicA dentro de las micelas de LMP disolviendo ambos componentes en acetona seguido de la adición gota a gota en agua purificada en una relación de 20 mg de copolímero por 3 mg de CicA. Tras la evaporación de la acetona con agitación constante durante 24 horas, las micelas cargadas con fármaco se filtraron para determinar el % de eficiencia de atrapamiento (EE). La Figura 5 muestra los EE para copolímeros LMP, así como también una formulación de CicA de control. Todas las micelas de LMP mostraron EE superiores al 99,8 %, mientras que la formulación de CicA tuvo un EE significativamente menor de 98,7 %, lo que representa la solubilidad máxima de CicA en agua. Esto muestra que las micelas LMP son muy eficientes para atrapar CicA, lo que puede reducir la liberación inicial indeseable en ráfaga tras la aplicación. Las micelas LMP cargadas con CicA tenían transparencias variables. Las micelas LMP-0/5/10 eran casi transparentes, mientras que las micelas cargadas con LMP-20 y LMP-30 formaban suspensiones opacas. Esto probablemente se deba a la distribución de CicA en la micela, que se representa en la Figura 6.
Las micelas LMP-20/30 contienen una cantidad significativa de PBA hidrófobo en la cubierta hidrófila exterior, lo que aumenta la distribución de CicA en el núcleo y la cubierta de la micela, lo que provoca cambios en el índice de refracción de la micela. Sin embargo, las micelas LMP-0/5/10 tienen la mayor parte de CicA cargada dentro de su núcleo de poli(lactida) hidrófobo y una carga mínima en la cubierta exterior hidrófila, lo que da como resultado cambios mínimos en el índice de refracción. Estas distribuciones hidrófobas dentro de la micela también muestran un efecto sobre las características de liberación del fármaco de estas micelas.
Curiosamente, todos los copolímeros LMP mostraron una mayor liberación en comparación con CicA en STF, que se muestra en la Figura 7. Este aumento de la liberación probablemente se deba a la difusión del copolímero de bloque libre a través de la membrana de diálisis de 50 kDa MWCO que lleva consigo CicA en el bloque de poli(lactida) hidrófobo, que es más indicativo de condiciones in vivo en las que no habría barreras para la difusión de copolímeros de bloques individuales. Todos los copolímeros LMP mostraron un perfil de liberación de dos fases caracterizado por una fase de explosión inicial que duró aproximadamente 24 horas, lo que resultó en una liberación del 35 al 45 % seguida de una liberación no lineal de entre el 74 y el 80 % después de 14 días, en dependencia de la composición. Durante la liberación en ráfaga inicial, la tasa de liberación fue mayor para las micelas con una composición de PBA más baja. Esto se puede atribuir a la mayor carga de CicA dentro del núcleo de la micela y al menor diámetro de la micela, lo que da como resultado un mayor gradiente de concentración y una distancia de difusión más corta, lo que provoca una liberación más rápida en comparación con las micelas con alto contenido de PBA, que son más grandes y tienen CicA distribuida por todo el núcleo de la micela y cubierta. Después de la liberación inicial, el gradiente de concentración se reduce, lo que permite que la difusividad de CicA a través de la cubierta exterior domine las características de liberación. Las micelas con una composición más alta de PBA tendrán cubiertas exteriores más hidrófobas, lo que aumentaría la difusividad de CicA desde la micela y provocaría una liberación más rápida en comparación con las micelas con menos PBA. La eliminación del disolvente orgánico antes de la liberación del fármaco muestra perfiles de liberación del fármaco más realistas.
La mucoadhesión de los copolímeros de LMP se estudió mediante el uso de SPR con quitosano como control positivo para la comparación de mucoadhesivos. La Figura 8 muestra el sensograma SPR de ángulo único para quitosano y los copolímeros LMP. Puede verse en esta figura que la mucoadhesión de las micelas de LMP aumenta con el aumento del contenido de PBA, pero parece alcanzar un techo de manera que el PBA adicional no aumenta mucho la mucoadhesión. Es probable que este efecto de techo se deba a la saturación de la monocapa de mucina, de manera que ningún polímero LMP adicional puede adherirse a la superficie, lo cual es representativo de condiciones in vivo. Esto sugiere que las composiciones de PBA superiores, que no son transparentes, pueden no ser beneficiosas para las aplicaciones in vivo. Todas las micelas lMP-10/20/30 alcanzaron una intensidad relativa significativamente mayor en comparación con las micelas de quitosano y LMP-0/5, lo que representa una mayor mucoadhesión. Las micelas LMP-0 muestran la mucoadhesión más baja de lo esperado. Al igual que con el quitosano, también mostraron una mayor reducción en la intensidad relativa después de la etapa de lavado en comparación con las micelas que contenían PBA. Esta reducción representa la estabilidad de la capa adsorbida. Esto probablemente se deba a la unión más fuerte entre el PBA y los dioles del ácido siálico en comparación con las micelas LMP-0 que forman enlaces de hidrógeno y el quitosano que forma enlaces electrostáticos y de hidrógeno. Las micelas de LMP que contienen PBA muestran una in vitro mucoadhesión, que tiene el potencial de mejorar la biodisponibilidad de los fármacos aplicados tópicamente.
Viabilidad HCEC - A prueba in vitro viabilidad celular, las micelas LMP se incubaron con HCEC a concentraciones de 1 mg ml-1 y 5 mg ml-1 durante 24 y 72 horas. En cada punto de tiempo, la actividad metabólica celular se determinó mediante el uso de un ensayo MTT y los recuentos de células vivas/muertas se determinaron mediante el uso de ensayos CalAM/EthD-1, respectivamente. Se puede observar, a partir de los resultados del ensayo MTT, (Figura 9A) que el metabolismo celular se reduce en comparación con los controles. También muestra una tendencia que después de 72 horas el metabolismo de HCEC incubadas con 1 mg ml-1 micelas es significativamente mayor que las incubadas con 5 mg ml-1 micelas. La viabilidad, determinada a partir de la tinción fluorescente con CalAM (Figura 9B), mostró que la viabilidad era mayor después de 72 horas en comparación con las muestras de 24 horas. Esto sugiere que las micelas no son citotóxicas, sino que inhiben el crecimiento. La fluorescencia de CalAM también mostró que la viabilidad era mayor para 1 mg ml-1 micelas en comparación con los 5 mg ml-1 micelas. El ensayo EthD-1 (Figura 9C) mostró una morbilidad de menos de tres veces para todas las micelas en comparación con los controles, lo que sugiere que las micelas LMP no son significativamente citotóxicas. El ensayo EthD-1 también mostró una tendencia de que el % de morbilidad fue significativamente menor después de 72 horas en comparación con 24 horas, lo que puede deberse a que las células de control alcanzan la confluencia, lo que inicia la muerte celular, mientras que las HCEC que contienen micelas de crecimiento más lento no lo hicieron. Curiosamente, las HCEC cultivadas con micelas que contienen PBA muestran grupos densos de células en lugar de propagarse como se ve en las micelas que no contienen PBA y los controles.
Las micelas de PBA podrían estar mediando la adhesión célula-célula al interactuar con las mucinas de la superficie celular, lo que evita que se propaguen en la placa. No se cree que la inhibición del crecimiento celular observada con estas micelas LMP afecte a las células de la córnea in vivo por dos razones: la concentración de micelas de LMP en la superficie de la córnea será más baja que las probadas debido a la rápida renovación lagrimal tras la administración tópica de gotas para los ojos, y la capa anterior de células de la córnea no se divide activamente, por lo que la reducción in vitro la proliferación puede no traducirse en condiciones in vivo. Los resultados de viabilidad celular muestran que estas micelas que contienen PBA no son citotóxicas, pero inhiben el crecimiento de HCEC y provocan la agrupación celular en lugar de propagarse por la placa.
Conclusiones
Las micelas mucoadhesivas ofrecen un potencial significativo para aumentar la biodisponibilidad de los fármacos aplicados tópicamente a las superficies mucosas, tales como los fármacos oftálmicos. Esto ayudará a disminuir la dosis, la frecuencia de la dosis y la toxicidad sistémica fuera del objetivo que comúnmente se asocian con las gotas tópicas. Se sintetizó una serie de micelas de copolímero de poli(L-lactida)-b-poli(ácido metacrílico-co-ácido fenilborónico) con cantidades variables de ácido fenilborónico mediante polimerización por transferencia de cadena de fragmentación por adición reversible. Estas micelas han mostrado una mucoadhesión mejorada en comparación con el quitosano mucoadhesivo comúnmente conocido con la capacidad de mejorar el suministro de un fármaco, por ejemplo, ciclosporina A. La viabilidad celular mostró cambios en la proliferación y morfología celular, pero no mostró una citotoxicidad significativa, lo que sugiere la traducción segura a condiciones in vivo. Este método simple para sintetizar micelas mucoadhesivas ofrece un potencial significativo para mejorar la biodisponibilidad de fármacos aplicados tópicamente a las superficies mucosas para tratar enfermedades.
Ejemplo 2
Este experimento se realizó para confirmar que las presentes micelas exhiben mucoadhesión en un entorno in vivo.
Las micelas que contenían PBA al 20 % se modificaron covalentemente con 5-aminofluoresceína (FA) mediante el uso del acoplamiento mediado por carbodiimida. En un procedimiento de reacción típico, el copolímero se disolvió en sulfóxido de dimetilo seco en un matraz sellado que contenía una barra agitadora y se cubrió con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. A esta solución, se añadieron 5-aminofluoresceína, N,N'-diciclohexilcarbodiimida y 4-dimetilaminopiridina para lograr relaciones molares de 100:30:110:10 para grupos MAA:FA:DCC:DMAP, respectivamente. El matraz se selló con un tapón de goma y se dejó en agitación durante 24 horas. Después de 24 horas de reacción, la solución se dializó hasta una pureza suficiente. Se dejó caer una única gota de 50 pl con 5 mg/ml de micela en el ojo de una rata sana. Después de una única instilación, las micelas que contenían 0 % de PBA no mostraron tinción con fluoresceína después de 1 hora, mientras que las micelas que contenían 20 % de PBA fueron claramente visibles después de 1 hora, lo que confirma la unión a la superficie ocular de las micelas que contienen PBA en un ambiente in vivo.
Ejemplo 3
Para confirmar que las micelas presentes son adecuadas para su uso in vivo, Se usó un modelo preclínico de DED en el que se indujo DED mediante el uso del agente químico cáustico, cloruro de benzalconio (BAC) (como se describe en Xiong y otros, Córnea, mayo de 2008).
En primer lugar, se determinó qué efecto, en su caso, tenían las micelas sin fármaco en este modelo de DED mediante el uso de la prueba de Schrimer en la que las tiras reactivas de papel con marcas graduadas absorben la película lagrimal y determinan el volumen lagrimal. Mediante el uso de la prueba de Schrimer modificada para su uso en ratas (es decir, las tiras de prueba diseñadas para humanos se cortaron en tercios para que cada tira tuviera solo 1/3 del ancho) volúmenes de lágrimas de ratas con DED después del "tratamiento" con micelas durante 5 días (DED con micelas) no se encontró que fueran significativamente diferentes a los volúmenes de lágrimas de ratas con DED no tratadas inmediatamente después de la inducción de DED y después de 5 días como se muestra en la Figura 10. Los animales sin DED exhibieron un volumen significativamente mayor de película lagrimal (Control).
La osmolaridad lagrimal a menudo está desregulada en la DED. De manera similar al ejemplo anterior, la osmolaridad de la película lagrimal medida con el osmómetro TearLab no muestra diferencias después del tratamiento con micelas (Figura 11).
Los oftalmólogos utilizan una variedad de sistemas de puntuación semicuantitativos para evaluar la gravedad de la lesión o enfermedad ocular, que incluyen (a) la prueba de Draize y (b) una prueba fluorométrica en la que la fluoresceína tiñe los tejidos corneales dañados, de esta manera los hace más visibles bajo la luz azul. Cuanto mayor sea el número, mayor será el daño de los tejidos oculares. Nuevamente, similar a lo anterior, una puntuación modificada de Draize y fluoresceína muestra que las micelas no tienen efectos adversos (Figura 12).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Micelas de copolímeros de bloques mucoadhesivos biocompatibles que comprenden un componente hidrófobo degradable, un componente hidrófilo sintético degradable y un componente mucoadhesivo, en donde el componente hidrófobo se selecciona del grupo que consiste en poliésteres, poliuretanos, poliureas, policarbonatos, poliéteres, polisulfuros, polisulfonatos, poliimidas, polibencimidazoles, un lipoglicano, un proteoglicano y sus combinaciones, el componente hidrófilo comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en ácido metacrílico, ácido acrílico, metacrilato de hidroxietilo, hidroxipropilmetacrilamida, acrilato de hidroxietilo, metacrilato de polietilenglicol, alcohol vinílico, vinilpirrolidona y sus combinaciones, el componente mucoadhesivo se selecciona del grupo que consiste en un ácido borónico o derivados del mismo, un compuesto que contiene tiol, un acrilato, quitosano, celulosa, quitosano tiolado, ácido hialurónico tiolado, ácido poli(acrílico) tiolado y sus mezclas, y el copolímero de bloque se prepara mediante combinación y polimerización de los componentes hidrófobos, hidrófilos y mucoadhesivos para producir un copolímero de bloque a partir del cual se preparan las micelas que tienen un núcleo hidrófobo y una cubierta hidrófila que incorpora el componente mucoadhesivo.
2. Las micelas de conformidad con la reivindicación 1, en donde el componente hidrófobo se selecciona del grupo que consiste en una polilactida, poliglicólido, poli(lacida-co-glicólido), poli(£-caprolactona), poli-3-hidroxibutirato, poli(dioxanona), poli(3-hidroxibutirato), poli(3-hidroxivalcrato), poli(valcrolactona), poli(ácido tartónico), poli(ácido malónico), poli(anhídridos), poli(ortoésteres), polifosfacenos y acriloiloxidimetil-Y-butirolactona (DBA) o una de sus combinaciones.
3. Las micelas de conformidad con la reivindicación 1, en donde el componente mucoadhesivo se selecciona del grupo que consiste en ácido fenilborónico, ácido 2-tienilborónico, ácido metilborónico, ácido cis-propenilborónico, ácido trans-propenilborónico, ácido (4-alilaminocarbonil)bencenoborónico, ácido (4-aminosulfonilfenil)borónico, ácido (4-benciloxi-2-formil)fenilborónico, ácido (4-hidroxi-2-metil)fenilborónico, ácido (4-hidroxi-2-metil)fenilborónico, ácido (4-metanosulfonilaminometilfenil)borónico, ácido (4-metanosulfonilaminometilfenil)borónico, ácido (4-metilaminosulfonil-fenil)borónico, ácido (4-metilaminosulfonilfenil)borónico, ácido (4-fenilamino-carbonilfenil)borónico, ácido (4-fenilaminocarbonilfenil)borónico, ácido (4-sec-butil)bencenoborónico, ácido (2,6-dimetoxi-4-metilfenil)borónico, ácido (2,6-dimetoxi-4-metilfenil)borónico, ácido (2-metilpropil)borónico, ácido (2-metilpropil)borónico, ácido (3-acetamido-5-carboxi)fenilborónico, ácido (3-acetamido-5-carboxi)fenilborónico, ácido (3-acetamidometilfenil)borónico, ácido (3-acetamidometilfenil)borónico, ácido (3-alilaminocarbonil)bencenoborónico, ácido (3-cianometilfenil)borónico, éster de pinacol de ácido alilborónico, éster de trimetilenglicol de ácido fenilborónico, diisopropoximetilborano, bis(hexilenglicolato)diboro, t-butil-N-[4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil]carbamato, 2,6-dimetil-4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzoato, 4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborlan-2-il)anilina, ácido 4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzoico, 4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenol o 2-metoxi-4-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenol y sus mezclas.
4. Las micelas de conformidad con la reivindicación 3, en donde el componente mucoadhesivo es un ácido borónico o un éster borónico.
5. Las micelas de conformidad con la reivindicación 1, que tienen un tamaño inferior a 200 nm.
6. Las micelas de conformidad con la reivindicación 1, cargadas con carga, tal como un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antipatógenos que incluyen agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos, agentes gastrointestinales, antihistamínicos, agentes antialérgicos, agentes anticancerígenos, antieméticos, agentes antiasmáticos, descongestionantes, medicación para el glaucoma, fármacos reductores de la presión intraocular (agentes reductores de PIO), lubricantes, emolientes, contrairritantes, lágrimas hipertónicas, agentes antiototóxicos, proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos, o un agente de diagnóstico, en donde la carga comprende aproximadamente 5­ 50 % en peso de las micelas.
7. Las micelas de conformidad con la reivindicación 6, en donde la carga es un fármaco oftálmico tal como ciclosporina A, aciclovir, atropina, acetazolamida, alfagan, azitromicina, bacitracina, betadina, betaxolol, betoptic, brinzolamida, carbacol, cefazolina, celluvisc, cloranfenicol, ciloxan, ciprofloxacina, cefalosporina, emecarium, dexametasona, dipivefrina, dorzolamida, epinefrina, eritromicina, fluoresceína, flurbiprofeno, quinolonas tales como fluoroquinolona, gentamicina, goniosol, gramicidina, ganciclovir, gatafloxacina, humorsol, hilartina, itraconazol, ketotifeno, latanoprost, levofloxacina, bimatoprost, travoprost, pilocarpina, polimixina B, prednisolona, proparacaína, propina, puralube, manitol, metazolamida, miconazol, miostat, moxifloxacina, natamicina, neomicina, neptazane, ocuflox, ofloxacina, oxitetraciclina, olopatadina, fenilefrina, prostaglandina, hialuronato de sodio, suprofeno, terramicina, timolol, tobramicina, triamcinolona, trfluridina, tropicamida, vidarabina, valciclovir, vancomicina, xalatan, fenilefrina, una prostaglandina o un fármaco anti-VEGF.
8. Una composición que comprende las micelas de conformidad con la reivindicación 1 combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable y formulada para administración oral, intranasal, enteral, tópico, sublingual, intraarterial, intramedular, intrauterino, intratecal, por inhalación, ocular, transdérmico, vaginal, rectal, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, formulada para administración tópica en el ojo o en oídos.
10. Las micelas de conformidad con la reivindicación 6 para el uso en un método de suministro de carga tal como analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antipatógenos que incluyen agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos, agentes gastrointestinales, antihistamínicos, agentes antialérgicos, agentes anticancerígenos, antieméticos, agentes antiasmáticos, descongestionantes, medicación para el glaucoma, fármacos reductores de la presión intraocular (agentes reductores de PIO), lubricantes, emolientes, contrairritantes, lágrimas hipertónicas, agentes antiototóxicos, proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos a una superficie mucosa en un mamífero.
11. Las micelas para el uso de acuerdo con la reivindicación 10 para tratar o diagnosticar una afección patógena que afecta el ojo, la nariz, la boca, los oídos, la garganta, el esófago, el estómago, los intestinos, el endometrio, el pene, la vagina o el ano, tal como infección, inflamación, cáncer, enfermedad degenerativa, reacción alérgica o lesión mecánica.
12. Las micelas para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la carga es un fármaco oftálmico.
13. Un sistema de suministro de fármacos oftálmicos basado en mucoadhesivo que comprende micelas de copolímero de poli(L-lactida)-b-poli(ácido metacrílico-co-ácido acrilamidofenilborónico).
14. El sistema de suministro de fármacos de conformidad con la reivindicación 13, que comprende adicionalmente un fármaco oftálmico tal como ciclosporina A, aciclovir, atropina, acetazolamida, alfagan, azitromicina, bacitracina, betadina, betaxolol, betoptic, brinzolamida, carbacol, cefazolina, celluvisc, cloranfenicol, ciloxan, ciprofloxacina, cefalosporina, emecarium, dexametasona, dipivefrina, dorzolamida, epinefrina, eritromicina, fluoresceína, flurbiprofeno, quinolonas tales como fluoroquinolona, gentamicina, goniosol, gramicidina, ganciclovir, gatafloxacina, humorsol, hilartina, itraconazol, ketotifeno, latanoprost, levofloxacina, bimatoprost, travoprost, pilocarpina, polimixina B, prednisolona, proparacaína, propina, puralube, manitol, metazolamida, miconazol, miostat, moxifloxacina, natamicina, neomicina, neptazane, ocuflox, ofloxacina, oxitetraciclina, olopatadina, fenilefrina, prostaglandina, hialuronato de sodio, suprofeno, terramicina, timolol, tobramicina, triamcinolona, trfluridina, tropicamida, vidarabina, valciclovir, vancomicina, xalatan, fenilefrina, una prostaglandina o un fármaco anti-VEGF.
15. Las micelas de conformidad con la reivindicación 1, en donde la relación de componente hidrófilo:
componente mucoadhesivo está en el intervalo de 94,5:5 a 65:30.
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