ES2909835T3

ES2909835T3 - Métodos para determinar y alcanzar dosis terapéuticamente efectivas de agentes anti-CD47 en el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2909835T3
Application number: ES17783254T
Authority: ES
Inventors: Irving L Weissman; Mark P Chao; Ravindra Majeti; Jie Liu; Jens-Peter Volkmer
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: JP7532009B2; JP2022172278A; EP4074339A1; PL3442578T3; EP3442578A4; EP4349412A2; JP7442591B2; US20230406923A1; KR102505253B1; PT3442578T; EP4349412A3; KR20240016445A; CN117695387A; SI3442578T1; WO2017181033A1; US11472878B2; CN115350276A; US11718670B2; AU2017250809B2; CN109152837A

Abstract

Un agente anti-CD47 para usar en un método para tratar el cáncer en un sujeto humano, comprendiendo el método: (a) administrar una dosis de sensibilización del agente anti-CD47 al sujeto, donde la dosis de sensibilización es de 0,5 a 5 mg/kg, en donde la dosis de sensibilización se administra al sujeto humano en una infusión con una concentración de 0,05 mg/ml a 0,5 mg/ml de agente anti-CD47, en donde la infusión se administra durante un período de al menos 3 horas, y en donde la dosis de preparación conduce a la hemaglutinación inmediatamente después de la infusión, y (b) administrar una dosis terapéuticamente efectiva del agente anti-CD47 al sujeto, donde la dosis terapéuticamente efectiva es 10-40 mg/kg, donde el paso (b) es 3-10 días después de comenzar el paso (a), donde la dosis de cebado ceba al sujeto para la administración de la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD47 de manera que la dosis terapéuticamente eficaz no produzca una pérdida grave de glóbulos rojos, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo IgG4 anti-CD47 que bloquea la interacción entre CD47 y SIRPα, y donde: (i) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia: y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia: o (ii) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia: y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia: o (iii) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia: y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para determinar y alcanzar dosis terapéuticamente efectivas de agentes anti-CD47 en el tratamiento del cáncer

ANTECEDENTES

[0001] La gran mayoría de los cánceres en todo el mundo son tumores sólidos. En 2016, se estima que a más de 1.600.000 personas se les diagnosticará un tumor sólido maligno en los EE. UU. (Siegel et al. (2016), Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 66:7-30). Los estándares actuales de atención para los tumores sólidos incluyen la escisión quirúrgica, la radioterapia, la quimioterapia citotóxica y las moléculas pequeñas dirigidas molecularmente y los anticuerpos monoclonales (mAbs). A pesar de estas terapias, la mayoría de los pacientes con cáncer metastásico morirán a causa de la enfermedad y/o de las complicaciones del tratamiento. Las moléculas pequeñas que se dirigen a los cánceres tienen una eficacia limitada como agentes únicos debido a la resistencia preexistente o emergente y, por lo general, presentan toxicidad para las células normales.

[0002] El desarrollo de mAbs terapéuticos ha impactado sustancialmente en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Convencionalmente, estas proteínas recombinantes se unen específicamente a las células cancerosas y bloquean las vías de señalización o las marcan para que el sistema inmunitario las destruya. Sin embargo, los mAbs dirigidos existen solo para unos pocos tipos de cáncer, incluso los mAbs más efectivos pueden requerir una terapia combinada con quimioterapia convencional y, a menudo, producen una respuesta terapéutica incompleta. En muchos pacientes, la enfermedad se vuelve resistente al tratamiento con mAb por la pérdida del objetivo del anticuerpo (cuando la molécula no es esencial para la supervivencia de las células tumorales) o por el desarrollo de resistencia a la destrucción del tumor. Por lo general, los pacientes experimentan una recaída de su enfermedad.

[0003] El CD47 se ha identificado como una molécula clave que media en la evasión de la fagocitosis de las células cancerosas por parte del sistema inmunitario innato. CD47 parece ser un medio indispensable por el cual las células cancerosas, incluidas las células madre cancerosas, superan la expresión intrínseca de sus señales profagocíticas de "cómeme". La progresión de una célula normal a una célula cancerosa implica cambios en los genes y/o en la expresión génica que desencadenan la muerte celular programada (PCD) y la eliminación celular programada (PCR). Muchos de los pasos en la progresión del cáncer subvierten los múltiples mecanismos de la PCD, y la expresión de la señal antifagocítica dominante, CD47, puede representar un punto de control importante.

[0004] La expresión de CD47 aumenta en la superficie de las células cancerosas de un gran número de diversos tipos de tumores humanos que incluyen las siguientes neoplasias malignas primarias: cabeza y cuello, melanoma, mama, pulmón, ovario, páncreas, colon, vejiga, próstata, leiomiosarcoma, glioblastoma, meduloblastoma, oligodendroglioma, glioma, linfoma, leucemia y mieloma múltiple. En estudios de xenoinjertos murinos, se ha demostrado que los anticuerpos bloqueadores de CD47 inhiben el crecimiento y la metástasis del cáncer humano al permitir la fagocitosis y la eliminación de células madre cancerosas y células cancerosas de diversas neoplasias malignas hematológicas y varios tumores sólidos.

[0005] CD47 sirve como ligando para SIRPa, que se expresa en células fagocíticas que incluyen macrófagos y células dendríticas. Cuando SIRPa se activa por la unión de CD47, inicia una cascada de transducción de señales que da como resultado la inhibición de la fagocitosis. De esta forma, CD47 funciona como una señal antifagocítica al enviar una señal inhibitoria dominante a las células fagocíticas. Se ha demostrado que un mAb anti-CD47 bloqueador permitió la eliminación fagocitaria de células madre cancerosas y células cancerosas.

[0006] En xenoinjertos de ratón, los mAbs bloqueadores de CD47 inhiben el crecimiento y la metástasis de tumores de xenoinjertos humanos al permitir la fagocitosis y la eliminación de células cancerosas de diversas neoplasias malignas hematológicas y tumores sólidos. Además, los mAbs bloqueadores de CD47 actúan en sinergia con los mAbs establecidos dirigidos contra las células cancerosas rituximab, trastuzumab y cetuximab para mejorar la eficacia terapéutica en algunos tipos de tumores.

[0007] El documento WO 2015/105995 describe una terapia dirigida para el cáncer de pulmón de células pequeñas. El documento WO 2014/149477 describe métodos para lograr dosis terapéuticamente eficaces de agentes anti-CD47. WO 2016/028810 describe anticuerpos anti-CD40 y usos de los mismos. Sternebring (2016) Clinical Cytometry 90 B:220-229 describe un método ponderado para la estimación de la ocupación del receptor para mediciones farmacodinámicas en el desarrollo de fármacos. El documento WO 2015/050983 describe métodos para modular la eritropoyesis con moléculas del receptor 1B de arginina vasopresina. WO 2014/179132 describe el uso de agentes anti-CD47 para mejorar la inmunización. El documento WO 2014/160753 describe el uso de biomarcadores para evaluar el tratamiento de trastornos inflamatorios gastrointestinales con antagonistas de la integrina beta7. Liu et al. (2015) PLOS ONE 10(9):1 -23 describe el desarrollo preclínico de un anticuerpo anti-CD47 humanizado con potencial terapéutico contra el cáncer.

[0008] Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia (o para el diagnóstico).

[0009] Los métodos para la administración eficaz de anticuerpos que bloquean la interacción de CD47 con SIRPa son de interés clínico y se proporcionan en el presente documento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0010] La invención proporciona un agente anti-CD47 para usar en un método para tratar el cáncer en un sujeto humano, comprendiendo el método:

(a) administrar una dosis de sensibilización del agente anti-CD47 al sujeto, donde la dosis de sensibilización es de 0,5 a 5 mg/kg, en donde la dosis de sensibilización se administra al sujeto humano en una infusión con una concentración de 0,05 mg/ml a 0,5 mg/ml de agente anti-CD47, en donde la infusión se administra durante un período de al menos 3 horas, y en donde la dosis de preparación conduce a la hemaglutinación inmediatamente después de la infusión, y

(b) administrar una dosis terapéuticamente efectiva del agente anti-CD47 al sujeto, donde la dosis terapéuticamente efectiva es 10-40 mg/kg,

donde el paso (b) es 3-10 días después de comenzar el paso (a), donde la dosis de cebado ceba al sujeto para la administración de la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD47 de manera que la dosis terapéuticamente eficaz no produzca una pérdida grave de glóbulos rojos,

en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo IgG4 anti-CD47 que bloquea la interacción entre CD47 y SIRPa, y donde:

(i) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia:

DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLIYK

VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCFQGSHVPYTFGGGTK

VEIK,

y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWIGTIY

PGNDDTSYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS; o (ii) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYK

VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTK

LEIK,

y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTI

YPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAM

DYWGQGTLVTVSS;

o

(iii) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia:

DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYK

VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCFQGSHVPYTFGQGTK

LEIK,

y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWIGTIY

PGNDDTSYNQKFKDRATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAM

DYWGQGTLVTVSS.

[0011] Se proporcionan métodos para tratar a un individuo con una dosis terapéutica de agente anti-CD47. Los métodos de la invención administran dosis terapéuticas y de cebado efectivas de un agente que se une a CD47, que está presente en las células cancerosas y que puede estar presente en los glóbulos rojos (RBC). Un agente anti-CD47 para uso en los métodos de la invención, como se define en la reivindicación 1, interfiere con la unión entre CD47 presente en una célula cancerosa y SIRPa presente en una célula fagocítica. Generalmente, ambas células están presentes en el individuo que se está tratando. Dichos métodos, en presencia de una señal profagocítica, pueden aumentar la fagocitosis de la célula cancerosa objetivo mientras reducen los efectos secundarios indeseables en las poblaciones de glóbulos rojos.

[0012] Los agentes adecuados incluyen, sin limitación, Hu5F9, incluido Hu5F9-G4.

[0013] Como se ha descrito previamente, una dosis terapéutica de un agente de unión a CD47 puede provocar una pérdida de eritrocitos (RBC) y anemia. La administración de una dosis de cebado del agente de unión a CD47 reduce significativamente la toxicidad debida a la pérdida de eritrocitos más viejos, al mismo tiempo que preserva los eritrocitos más jóvenes. Sin estar ligado a la teoría, se cree que el agente iniciador aumenta la producción de reticulocitos (RBC más jóvenes), que pueden ser más resistentes a la fagocitosis mediada por CD47 y, por lo tanto, son menos susceptibles de pérdida durante la administración posterior del agente anti-CD47. Se proporcionan métodos para determinar una dosis de sincronización adecuada para uso preclínico o clínico, determinando la ocupación del receptor de CD47 de células sanguíneas, p. ej., glóbulos rojos y glóbulos blancos. En el presente documento se muestra que una dosis de cebado adecuada proporciona más de aproximadamente el 50 % de ocupación del receptor en RBC. Los métodos para determinar la dosis de cebado se pueden aplicar a cualquier agente de unión a CD47.

[0014] La dosis de cebado es de 0,05 a 5 mg/kg. En algunas formas de realización de la invención, se proporciona una dosis de sensibilización eficaz de Hu-5F9G4, donde la dosis de sensibilización eficaz para un ser humano es de aproximadamente 1 mg/kg, p. ej., desde al menos aproximadamente 0,75 mg/kg hasta no más de aproximadamente 1,25 mg/kg; desde al menos aproximadamente 0,95 mg/kg hasta no más de aproximadamente 1,05 mg/kg; y puede rondar alrededor de 1 mg/kg.

[0015] Una dosis inicial de un agente de unión a CD47, que incluye pero no se limita a una dosis de cebado, también puede conducir a la hemaglutinación durante un período de tiempo inmediatamente después de la infusión. Sin estar ligado a la teoría, se cree que la dosis inicial de un agente de unión a CD47 multivalente puede provocar la reticulación de los RBC unidos al agente. En ciertas formas de realización de la invención, un agente de unión a CD47 se infunde a un paciente en una dosis inicial y, opcionalmente, en dosis posteriores, durante un período de tiempo y/o concentración que reduce la posibilidad de microambientes hematológicos donde hay una alta concentración local de RBC y del agente.

[0016] En algunas formas de realización de la invención, se infunde una dosis inicial de un agente de unión a CD47 durante un período de al menos aproximadamente 3,5 horas, al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 4,5 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas o más. En algunas formas de realización, se infunde una dosis inicial durante un período de tiempo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas. En algunas de tales formas de realización, la dosis de agente en la infusión es de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml; por ejemplo, de alrededor de 0,1 mg/ml a alrededor de 0,25 mg/ml.

[0017] En algunas formas de realización, una dosis de preparación se fracciona en dos o más subdosis, administradas durante un período de tiempo de aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 10 días, aproximadamente 2 semanas.

[0018] En otras formas de realización, se administra una dosis inicial de un agente de unión a CD47, p. ej., una dosis de cebado, mediante fusión continua, p. ej., como bomba osmótica, parche de administración, etc., donde la dosis se administra durante un período de al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 3 días.

[0019] En algunas formas de realización, una dosis de cebado puede administrarse por vía subcutánea, mediante inyección, parche, bomba osmótica y similares, como se conoce en la técnica.

[0020] Después de la administración del agente de cebado, y dejando un período de tiempo efectivo para un aumento en la producción de reticulocitos, se administra una dosis terapéutica de un agente anti-CD47. La dosis terapéutica se puede administrar de varias maneras diferentes. En algunas formas de realización, se administran dos o más dosis terapéuticamente eficaces después de administrar un agente iniciador, p. ej., en un programa de dosificación semanal. En algunas formas de realización, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 se administra como dos o más dosis de concentración creciente, en otras, las dosis son equivalentes.

[0021] En algunas formas de realización de la invención, la dosis terapéutica (de mantenimiento) es suficiente para alcanzar un nivel circulante superior a 100 mg/ml durante un período de tiempo prolongado. En algunas de tales formas de realización, el agente anti-CD47 es el anticuerpo 5F9. En algunas formas de realización, el período sostenido de tiempo es de hasta aproximadamente 1 semana. En algunas formas de realización, el período sostenido de tiempo es de hasta aproximadamente 10 días. En algunas formas de realización, el período de tiempo sostenido es de hasta aproximadamente 2 semanas. En algunas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 12,5 mg/kg a aproximadamente 22,5 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 17,5 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg, desde alrededor de 10 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg. La dosis de mantenimiento se puede administrar con una periodicidad que proporcione niveles séricos sostenidos superiores a aproximadamente 100 mg/ml, donde la administración puede ser semanal, cada 8 días, cada 9 días, cada 10 días, cada 11 días, cada 12 días, cada 13 días, cada dos semanas, cada 3 semanas, y puede proporcionar una terapia de seguimiento de administración menos frecuente, p. ej., mensual, quincenal, bimensual, etc.

[0022] En algunas formas de realización, un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer comprende la administración de una dosis de carga de un anticuerpo anti-CD47, que incluye, entre otros, 5F9-G4, donde la dosis de carga se administra dos veces por semana a una dosis de 10 mg/kg a 40 mg/kg; y puede administrarse dos veces por semana a una dosis de 20 mg/kg a 30 mg/kg. Luego se administra al paciente una dosis de mantenimiento, semanal o quincenalmente, a una dosis de 10 mg/kg a 40 mg/kg; y puede estar en una dosis de 20 mg/kg a 30 mg/kg. En algunas de tales formas de realización, el cáncer es un tumor sólido. En algunas de tales formas de realización, el cáncer es un cáncer hematológico, p. ej., una leucemia, que incluye, entre otros, leucemia mieloide aguda.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0023] La invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. El expediente de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Se enfatiza que, de acuerdo con la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.

Figura 1. Los glóbulos rojos se saturan con anticuerpos en dosis bajas. El gráfico muestra la ocupación del receptor de CD47 en RBC en pacientes que recibieron dosis de Hu5F9-G4 en la dosis indicada. Una dosis de 1 mg/kg es suficiente para saturar los sitios de unión de RBC.

Figura 2. La ocupación del receptor WBC CD47 aumenta con la concentración de la dosis. El gráfico representa la ocupación del receptor de CD47 en WBC en pacientes que recibieron dosis de Hu5F9-G4 en la dosis indicada. Figura 3. La ocupación del receptor WBC CD47 aumenta con la concentración de la dosis. Los gráficos representan la ocupación del receptor de CD47 en WBC a dosis variables de anticuerpo.

Figura 4 proporciona gráficos que muestran los niveles mínimos objetivo de anticuerpo anti-CD47 para uso clínico.

Figura 5 es un gráfico que muestra la farmacocinética de los niveles mínimos objetivo del anticuerpo anti-CD47. Figura 6 es un gráfico que muestra que los niveles mínimos objetivo se aproximan con dosis repetidas de 10 mg/kg en pacientes humanos.

Figura 7 es un gráfico que muestra anemia con reticulocitosis compensatoria tras la administración de anticuerpo anti-CD47.

Figura 8A-8B. La hemaglutinación se mitiga con un tiempo de infusión prolongado de la dosis de cebado. Muestra micrografías de frotis periféricas y gráficos de hemaglutinación asociados con una infusión inicial de un anticuerpo anti-CD47. A. Micrografías de frotis periféricas representativas tomadas de pacientes antes del tratamiento y 4 horas después de la primera dosis de 1 mg/kg (cebado) de Hu5F9-G4. Se observa una hemaglutinación significativa en la infusión de 1 hora que se reduce significativamente en la infusión de 3 horas. B. La extensión de la duración de la infusión de la dosis inicial de 1 a 3 horas reduce significativamente la frecuencia y la gravedad de la hemaglutinación. 1+ a 3+ representa el porcentaje de glóbulos rojos aglutinados observados en el frotis periférico 4 horas después del tratamiento. N= número de pacientes tratados con cada tiempo de infusión. Figura 9. Hu5F9-G4 puede alcanzar niveles farmacocinéticos objetivo en dosis clínicamente factibles. Los datos muestran que Hu5F9-G4 puede saturar el sumidero tisular interno de CD47 en dosis clínicamente viables; y la vida media del anticuerpo se prolonga después de que se ha producido la saturación del sumidero de tejido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0024] La presente invención se refiere a métodos para tratar a un sujeto con una dosis terapéutica de agente anti-CD47.

[0025] Antes de que se describan los presentes métodos y composiciones, debe entenderse que esta invención no se limita a un método o composición en particular descritos, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir formas de realización particulares solamente, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

[0026] Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese rango también se revela específicamente. Cada rango más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese rango establecido está abarcado dentro de la invención. El límite superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el rango, y cada rango en donde ninguno de los límites o ambos están incluidos en los rangos más pequeños también está incluido dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la invención.

[0027] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

[0028] Cualquier método enumerado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

[0029] Debe señalarse que tal como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "ella" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, p. ej., la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "el péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, p. ej., polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, etc.

[0030] Las publicaciones discutidas en este documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí contenido debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden diferir de las fechas de publicación reales, por lo que es posible que sea necesario confirmarlas de forma independiente.

Definiciones

[0031] Agente anti-CD47. Como se usa aquí, el término "agente anti-CD47" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CD47 (p. ej., en una célula objetivo) a SIRPa (p. ej., en una célula fagocítica). El agente anti-CD47 para uso en los métodos de la invención se define en la reivindicación 1. Un agente anti-CD47 puede regular al alza la fagocitosis en al menos un 10 % (p. ej., al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 120 %, al menos 140 %, al menos 160 %, al menos 180 %, o al menos 200 %) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente. En algunos casos, el agente anti-CD47 no activa CD47 al unirse. Cuando se activa CD47, puede ocurrir un proceso similar a la apoptosis (es decir, muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, 1 de febrero de 2004). Por tanto, en algunos casos, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47.

[0032] Anticuerpos anti-CD47. El agente anti-CD47 para usar en los métodos de la invención es el anticuerpo anti-CD47 IgG4 definido en la reivindicación 1. Los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 se describen en la publicación de patente internacional WO 2011/143624. El clon CC-9002 se describe en el documento WO2013119714. Los anticuerpos anti-CD47 incluyen versiones totalmente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados (p. ej., hu5F9-G4) son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en seres humanos debido a su baja antigenicidad.

[0033] Reactivo SIRPa. Un reactivo SIRPa comprende la parte de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión.

[0034] Un reactivo SIRPa puede reducir (p. ej., bloquear, prevenir, etc.) la interacción entre las proteínas nativas SIRPa y CD47. El reactivo SIRPa normalmente comprenderá al menos el dominio d1 de SIRPa. Un reactivo SIRPa puede ser una proteína de fusión, p. ej., fusionada en marco con un segundo polipéptido. El segundo polipéptido puede ser capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, p. ej., de modo que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. El segundo polipéptido puede ser parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo SIRPa de alta afinidad. Alternativamente, el segundo polipéptido puede ser cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, p. ej., que proporcione un mayor tamaño, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig. Un agente SIRPa ejemplar es TTI-621, consulte el identificador de ensayo clínico NCT02663518.

[0035] Otro ejemplo de un agente anti-CD47 es un "reactivo SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos SIRPa de alta afinidad se describen en la Solicitud Internacional WO 2013/109752. Los reactivos SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína SIRPa nativa. Un reactivo SIRPa de alta afinidad puede ser soluble, donde el polipéptido carece del dominio transmembrana SIRPa y comprende al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia de SIRPa de tipo salvaje, y donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47, p. ej., disminuyendo la tasa de separación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o más.

[0036] Un reactivo SIRPa de alta afinidad comprende la parte de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, p. ej., alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. El reactivo SIRPa de alta afinidad normalmente comprenderá al menos el dominio d1 de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. Una variante de SIRPa puede ser una proteína de fusión, p. ej., fusionada en fase con un segundo polipéptido.

En algunos casos, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, p. ej., de modo que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunos casos, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo SIRPa de alta afinidad. En otros casos, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, p. ej., que proporcione un mayor tamaño, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig. Los cambios de aminoácidos que proporcionan una mayor afinidad se localizan en el dominio d1 y, por lo tanto, los reactivos SIRPa de alta afinidad comprenden un dominio d1 de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1. Tal reactivo SIRPa de alta afinidad comprende opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales, p. ej., secuencias Fc de anticuerpos; partes de la proteína SIRPa humana de tipo salvaje distintas del dominio d1, incluidos, entre otros, los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de la misma, normalmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares.

[0037] Los reactivos SIRPa de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. y/o efecto fisiológico. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma(s) de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización parcial o completa o cura para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento" abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad y/o síntoma(s) ocurra(n) en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero aún no ha sido diagnosticado de tenerlo; (b) inhibir la enfermedad y/o síntoma(s), es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar los síntomas de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o los síntomas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya lo padecen (p. ej., aquellos con cáncer, aquellos con una infección, etc.), así como aquellos en los que se desea la prevención (p. ej., aquellos con mayor susceptibilidad al cáncer, aquellos con mayor probabilidad de infección), aquellos que se sospecha que tienen cáncer, aquellos que se sospecha que albergan una infección, etc.).

[0038] Como se usa en el presente documento, una "célula objetivo" es una célula que expresa CD47 en la superficie, enmascarando o alterando de otro modo el fenotipo positivo de CD47 (por ejemplo, por la administración de un agente anti-CD47) da como resultado un aumento de la fagocitosis. Normalmente, una célula objetivo es una célula de mamífero, p. ej., una célula humana.

[0039] Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se usan indistintamente en este documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea un diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente humanos. "Mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. En los métodos de la invención, el sujeto es humano.

[0040] Una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" es una cantidad suficiente para lograr los resultados clínicos deseados (es decir, lograr la eficacia terapéutica). Una dosis terapéuticamente eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una dosis terapéuticamente efectiva de un agente anti-CD47 es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, retardar o retrasar la progresión del estado de la enfermedad (p. ej., cáncer) al aumentar la fagocitosis de una célula objetivo (por ejemplo, una célula objetivo). Por tanto, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 reduce la unión de CD47 en una célula objetivo a SIRPa en una célula fagocítica, a una dosis eficaz para aumentar la fagocitosis de la célula objetivo.

[0041] En algunas formas de realización, una dosis terapéuticamente eficaz conduce a niveles séricos sostenidos del agente anti-CD47, es decir, niveles mínimos (p. ej., un anticuerpo anti-CD47) de aproximadamente 40 pg/ml o más (p. ej., aproximadamente 50 pg/ml o más, aproximadamente 60 pg/ml o más, aproximadamente 75 pg/ml o más, aproximadamente 100 pg/ml o más, aproximadamente 125 pg/ml o más, o aproximadamente 150 pg/ml o más). En algunas formas de realización, una dosis terapéuticamente eficaz conduce a niveles séricos sostenidos de agente anti-CD47 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47) que oscilan entre aproximadamente 40 pg/ml y aproximadamente 300 pg/ml (por ejemplo, entre aproximadamente 40 pg/ml y aproximadamente 250 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 150 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, o de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml). En algunas formas de realización, una dosis terapéuticamente eficaz para tratar tumores sólidos conduce a niveles séricos sostenidos del agente anti-CD47 (p. ej., un anticuerpo anti-CD47) de aproximadamente 100 pg/ml o más, p. ej., niveles séricos sostenidos que oscilan entre aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 400 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 300 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml.

[0042] En consecuencia, una serie de dosis terapéuticamente eficaces sería capaz de alcanzar y mantener un nivel sérico de agente anti-CD47. Una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 puede depender del agente específico utilizado, pero normalmente es de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o más (p. ej., aproximadamente 8 mg/kg o más, aproximadamente 10 mg/kg o más, aproximadamente 15 mg/kg o más, aproximadamente 20 mg/kg o más, aproximadamente 25 mg/kg o más, aproximadamente 30 mg/kg o más, aproximadamente 35 mg/kg o más, o aproximadamente 40 mg/kg o más), o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg). La dosis terapéuticamente eficaz en los métodos de la invención es de 10 a 40 mg/kg. La dosis requerida para lograr y/o mantener un nivel sérico particular es proporcional a la cantidad de tiempo entre las dosis e inversamente proporcional al número de dosis administradas. Así, a medida que aumenta la frecuencia de dosificación, disminuye la dosis requerida. La optimización de las estrategias de dosificación será fácilmente comprendida y puesta en práctica por un experto en la materia.

[0043] En algunas formas de realización, una dosis de cebado se define como una dosis (es decir, una cantidad) que es suficiente para causar reticulocitosis compensatoria, sin anemia indebida. En algunas formas de realización, una dosis de cebado se define como una dosis que provoca una anemia que no empeora con las dosis posteriores. Una dosis inicial de un agente anti-CD47 puede depender del agente específico usado, pero generalmente es de alrededor de 0,5 a alrededor de 5 mg/kg. La dosis de cebado en los métodos de la invención es de 0,5 a 5 mg/kg.

[0044] El término "dosis de preparación" o como se usa aquí se refiere a una dosis de un agente anti-CD47 que prepara a un sujeto para la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de agente anti-CD47 tal que la dosis terapéuticamente efectiva no resulte en una pérdida severa de glóbulos rojos (hematocrito reducido o hemoglobina reducida). La dosis de cebado adecuada específica de un agente anti-CD47 puede variar dependiendo de la naturaleza del agente utilizado y de numerosos factores específicos del sujeto (p. ej., edad, peso, etc.). Los ejemplos de dosis de cebado adecuadas de un agente anti-CD47 incluyen desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 4 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg. La dosis de cebado en los métodos de la invención es de 0,5 a 5 mg/kg.

[0045] Una "dosis de mantenimiento" es una dosis destinada a ser una dosis terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, en experimentos para determinar la dosis terapéuticamente eficaz, pueden administrarse múltiples dosis de mantenimiento diferentes a diferentes sujetos. Como tal, algunas de las dosis de mantenimiento pueden ser dosis terapéuticamente eficaces y otras pueden ser dosis subterapéuticas.

[0046] Se puede usar una "dosis de carga" para lograr un nivel terapéutico de anticuerpo antes de cambiar a una dosis de mantenimiento. Una dosis de carga puede ser igual, mayor o menor que la dosis de mantenimiento, pero generalmente proporcionará una mayor administración global del agente durante un período de tiempo determinado. Por ejemplo, una dosis de carga puede ser igual o menor que una dosis de mantenimiento, pero administrada con mayor frecuencia, p. ej., diariamente, cada dos días, cada tercer día, dos veces por semana, semanalmente y similares. Alternativamente, una dosis de carga puede ser una dosis más alta que una dosis de mantenimiento y administrarse con la misma periodicidad o con mayor frecuencia, p. ej., diariamente, cada dos días, cada tercer día, dos veces por semana, semanalmente y similares.

[0047] Los términos "unión específica", "se une específicamente" y similares, se refieren a la unión preferencial no covalente o covalente a una molécula en relación con otras moléculas o restos en una solución o mezcla de reacción (p. ej., un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido o epítopo particular en relación con otros polipéptidos disponibles, o la unión de un polipéptido SIRPa). En algunas formas de realización, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una Kd (constante de disociación) de 10-5 M o menos (por ejemplo, 10-6 M o menos, 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos, o 10-16 M o menos). "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, estando correlacionada una mayor afinidad de unión con una Kd más baja.

[0048] El término "miembro de unión específica" como se usa en el presente documento se refiere a un miembro de un par de unión específica (es decir, dos moléculas, generalmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas, p. ej., un primer miembro de unión específica, a través de medios no covalentes que se unen específicamente a la otra molécula, p. ej., un segundo miembro de unión específica). Los miembros de unión específica adecuados incluyen agentes que se unen específicamente a CD47 y/o SIRPa (es decir, agentes anti-CD47), o que bloquean de otro modo la interacción entre CD47 y SIRPa.

[0049] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales.

[0050] Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente aquí para referirse a una célula que es capaz de fagocitosis. Hay tres categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.

[0051] El término "muestra" con respecto a un paciente abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas o aisladas de las mismas y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, como por tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para ciertas poblaciones de células, como las células cancerosas. La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas para tipos particulares de moléculas, p. ej., ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

[0052] El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra que comprende células objetivo o células de control normales o que se sospecha que comprende dichas células o fluidos biológicos derivados de las mismas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas, etc.), p. ej., una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene a partir de tales células (p. ej., un lisado celular u otro extracto celular que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos). Una muestra biológica que comprende una célula infligida de un paciente también puede incluir células no infligidas.

[0053] El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (p. ej., los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Abs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo son, p. ej., producidos en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles elevados por los mielomas.

[0054] "Fragmento de anticuerpo", y todas las variantes gramaticales del mismo, como se usa en el presente documento, se definen como una parte de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, donde la parte está libre de los dominios de cadena pesada constante (es decir, CH2, CH3 y CH4, según el isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab^{’ )2}y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consista en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominado en el presente documento "fragmento de anticuerpo de cadena única" o "polipéptido de cadena única"), incluidos, entre otros, (1) moléculas de cadena Fv (scFv) (2) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociado (3) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin un resto de cadena ligera asociado y (4) nanocuerpos que comprenden dominios Ig únicos de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio único específicos; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, la(s) cadena(s) pesada(s) puede(n) contener cualquier secuencia de dominio constante (p. ej., CH1 en el isotipo IgG) que se encuentra en una región no Fc de un anticuerpo intacto y/o puede contener cualquier secuencia de región de bisagra que se encuentra en un anticuerpo intacto, y/o puede contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de la región bisagra o la secuencia del dominio constante de la(s) cadena(s) pesada(s).

[0055] Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Métodos

[0056] El ensayo de ocupación del receptor (RO) mide el nivel de ocupación de CD47 por agentes de unión a CD47, p. anticuerpo anti-CD47 (Ab). El propósito de medir el nivel de CD47 RO es determinar la relación entre la dosis de un agente de unión a CD47, la saturación del receptor de CD47 y el efecto farmacológico. El porcentaje de ocupación del receptor a lo largo del tiempo puede proporcionar información útil sobre la cantidad de fármaco o la duración de la exposición necesaria para producir el efecto farmacológico deseado. Este ensayo se puede utilizar para determinar la RO total en el cuerpo midiendo la RO CD47 en células sustitutas, p. ej., en glóbulos rojos (RBC) CD45 negativos (-) y glóbulos blancos (WBC) CD45 positivos (+), u otras poblaciones de células, p. ej., médula ósea o células tisulares obtenidas a través de biopsias tisulares. El ensayo de RO también se puede utilizar para determinar CD47 RO en células objetivo, p. ej., glóbulos rojos, células de leucemia o células tumorales sólidas, para terapias de unión o bloqueo de CD47.

[0057] Es de interés el uso de este ensayo para determinar el umbral de ocupación del receptor CD47 que se correlaciona con el efecto farmacológico deseado. Este umbral puede determinarse mediante ensayos realizados ex vivo (in vitro) o mediante análisis de muestras durante la dosificación/tratamiento in vivo.

[0058] En una forma de realización del ensayo, se elabora una curva estándar de unión a CD47 en una célula de interés utilizando anticuerpo conjugado con fluorocromo a diversas concentraciones. La ocupación del receptor se mide incubando las células objetivo con anticuerpos no marcados en diferentes concentraciones, y luego las células se analizaron en fagocitosis in vitro o se incubaron con una concentración saturada de anticuerpo marcado en función de la curva estándar y se analizó la unión mediante citometría de flujo. La ocupación del receptor se calculó de la siguiente manera:

% RO= 100 — ((MFI prueba -MFI no teñido)/(MFI STD saturado -MFI no teñido)) X 100

[0059] En otras formas de realización, el ensayo se realiza infundiendo a un paciente una dosis definida de anticuerpo, obteniendo una muestra de tejido, p. ej., una muestra de sangre, del paciente, normalmente antes y después de la infusión del anticuerpo. La muestra de tejido se incuba con una concentración saturada de anticuerpo marcado y se analiza mediante citometría de flujo. El análisis puede seleccionarse, p. ej., en glóbulos rojos, glóbulos blancos, células cancerosas, etc. compensación de la anemia y reducir el grado de anemia en dosis posteriores.

[0060] En seres humanos, se ha encontrado que la dosis de cebador es como se discutió anteriormente, es decir, desde alrededor de 0,5 mg/kg hasta alrededor de 5 mg/kg. En algunas formas de realización de la invención, se realiza un ensayo de ocupación del receptor con un agente de unión a CD47 candidato para determinar el nivel de dosis de cebado que proporciona al menos alrededor del 50 % de saturación en RBC, al menos alrededor del 60 % de saturación, al menos alrededor del 70 % saturación, al menos alrededor del 80 % de saturación, al menos alrededor del 90 % de saturación, al menos alrededor del 95 % de saturación, al menos alrededor del 99 % de saturación, o más.

[0061] Se puede realizar un ensayo de ocupación del receptor para determinar la dosis de cebado apropiada para un agente anti-CD47 candidato, p. ej., un anticuerpo que se une a CD47, un polipéptido SIRPa, etc.

Métodos de tratamiento

[0062] Se proporcionan métodos para tratar a un sujeto con una dosis terapéutica del agente anti-CD47. Los métodos en cuestión incluyen una etapa de administración de un agente cebador al sujeto, seguida de una etapa de administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 al sujeto. El paso de administrar una dosis terapéuticamente efectiva se realiza después de 3 a 10 días de comenzar la administración de un agente iniciador. Este período de tiempo es, p. ej., suficiente para proporcionar una mayor producción de reticulocitos por parte del individuo.

[0063] La administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 se puede lograr en una serie de formas diferentes. En algunos casos, se administran dos o más dosis terapéuticamente eficaces después de administrar un agente iniciador. La administración adecuada de una dosis terapéuticamente eficaz puede implicar la administración de una sola dosis, o puede implicar la administración de dosis diarias, quincenales, semanales, una vez cada dos semanas, una vez al mes, anualmente, etc. En algunos casos, una dosis terapéuticamente eficaz se administra como dos o más dosis de concentración creciente (es decir, dosis crecientes), donde (i) todas las dosis son dosis terapéuticas, o donde (ii) se administra una dosis subterapéutica (o dos o más dosis subterapéuticas) dadas inicialmente y las dosis terapéuticas se alcanzan mediante dicho aumento. Como un ejemplo no limitativo para ilustrar la concentración creciente (es decir, dosis crecientes), se puede administrar semanalmente una dosis terapéuticamente eficaz, comenzando con una dosis subterapéutica (por ejemplo, una dosis de 5 mg/kg), y cada dosis subsiguiente puede incrementarse en un incremento particular (p. ej., en 5 mg/kg), o en incrementos variables, hasta alcanzar una dosis terapéutica (p. ej., 30 mg/kg), momento en el cual la administración puede cesar o continuar (p. ej., continuación de la dosis terapéutica, p. ej., dosis de 30 mg/kg). Como otro ejemplo no limitativo para ilustrar la concentración creciente (es decir, dosis crecientes), se puede administrar semanalmente una dosis terapéuticamente eficaz, comenzando con una dosis terapéutica (p. ej., una dosis de 10 mg/kg), y cada dosis subsiguiente se puede aumentar por un incremento particular (p. ej., 10 mg/kg), o por incrementos variables, hasta alcanzar una dosis terapéutica (p. ej., 30 mg/kg, 100 mg/ml, etc.), momento en el cual la administración puede cesar o puede continuar (p. ej., dosis terapéuticas continuadas, p. ej., dosis de 30 mg/kg, 100 mg/ml, etc.). En algunas formas de realización, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz puede ser una infusión continua y la dosis puede modificarse (p. ej., aumentarse) con el tiempo.

[0064] La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la vida media del agente anti-CD47 en el paciente. Un experto en la técnica entenderá que dichas directrices se ajustarán al peso molecular del agente activo, p. ej. en el uso de fragmentos de anticuerpos, en el uso de conjugados de anticuerpos, en el uso de reactivos SIRPa, en el uso de péptidos CD47 solubles, etc. La dosificación también puede variar para la administración localizada, p. ej., intranasal, inhalación, etc., o para administración sistémica, p. ej. i.m., i.p., i.v., s.c. y similares.

[0065] Administración eficaz del agente cebador. Una dosis inicial de un agente de unión a CD47, que incluye pero no se limita a una dosis de preparación, puede provocar hemaglutinación durante un período de tiempo inmediatamente después de la infusión. Sin estar ligado a la teoría, se cree que la dosis inicial de un agente de unión a CD47 multivalente puede provocar la reticulación de los RBC unidos al agente. En ciertas formas de realización de la invención, un agente de unión a CD47 se infunde a un paciente en una dosis inicial y, opcionalmente, en dosis posteriores, durante un período de tiempo y/o concentración que reduce la posibilidad de microambientes hematológicos donde hay una alta concentración local de RBC y el agente.

[0066] En algunas formas de realización de la invención, se infunde una dosis inicial de un agente de unión a CD47 durante un período de al menos aproximadamente 3,5 horas, al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 4,5 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos unas 6 horas o más. En algunas formas de realización, se infunde una dosis inicial durante un período de tiempo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas. La dosis de agente en la infusión es de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml; por ejemplo, de alrededor de 0,1 mg/ml a alrededor de 0,25 mg/ml.

[0067] En otras formas de realización, se administra una dosis inicial de un agente de unión a CD47, p. ej., una dosis de cebado, mediante fusión continua, p. ej., como bomba osmótica, parche de administración, etc., donde la dosis se administra durante un período de al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 3 días. Muchos de tales sistemas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la tecnología DUROS, proporciona un sistema de dos compartimentos separados por un pistón. Uno de los compartimentos consta de motor osmótico específicamente formulado con un exceso de NaCl sólido, de forma que permanece presente durante todo el periodo de entrega y da como resultado un gradiente osmótico constante. También consta de una membrana semipermeable en un extremo a través de la cual se introduce agua en el motor osmótico y se establece un gradiente osmótico grande y constante entre el agua tisular y el motor osmótico. El otro compartimento consta de una solución de fármaco con un orificio por el que se libera el fármaco debido al gradiente osmótico. Esto ayuda a proporcionar un suministro sistémico y específico del fármaco cuando se implanta en seres humanos. El sitio preferido de implantación es la colocación subcutánea en el interior de la parte superior del brazo.

[0068] Después de la administración del agente de cebado, y dejando un período de tiempo efectivo para un aumento en la producción de reticulocitos, se administra una dosis terapéutica de un agente anti-CD47. La dosis terapéutica se puede administrar de varias maneras diferentes. En algunas formas de realización, se administran dos o más dosis terapéuticamente eficaces después de administrar un agente iniciador, p. ej., en un programa de dosificación semanal. En algunas formas de realización, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 se administra como dos o más dosis de concentración creciente, en otras, las dosis son equivalentes. Hay una reducción de la hemaglutinación después de la dosis inicial y, por lo tanto, no se requiere un tiempo de infusión prolongado.

[0069] Utilidad. Los métodos en cuestión se pueden usar para tratar cualquier afección en donde las células objetivo muestren una expresión aumentada de CD47 en relación con las células normales del mismo tipo. El agente anti-CD47 que se administra inhibe la interacción entre SIRPa (p. ej., en un fagocito) y CD47 en una célula objetivo (p. ej., en una célula cancerosa, en una célula infectada, etc.), aumentando así la fagocitosis in vivo de la célula objetivo. Los métodos en cuestión incluyen administrar a un sujeto que necesita tratamiento una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47, incluidas, entre otras, combinaciones del reactivo con otro fármaco (p. ej., un fármaco contra el cáncer, etc.).

[0070] El término "cáncer", como se usa aquí, se refiere a una variedad de condiciones causadas por el crecimiento anormal e incontrolado de células. Las células capaces de causar cáncer, denominadas "células cancerosas", poseen propiedades características tales como proliferación descontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, rápido crecimiento y tasa de proliferación, y/o ciertas características morfológicas. Un cáncer se puede detectar de varias formas, incluidas, entre otras, la detección de la presencia de un tumor o tumores (p. ej., por medios clínicos o radiológicos), el examen de células dentro de un tumor o de otra muestra biológica (p. ej.,, a partir de una biopsia de tejido), medir marcadores sanguíneos indicativos de cáncer y detectar un genotipo indicativo de cáncer. Sin embargo, un resultado negativo en uno o más de los métodos de detección anteriores no indica necesariamente la ausencia de cáncer, p. ej., un paciente que ha mostrado una respuesta completa a un tratamiento contra el cáncer aún puede tener cáncer, como lo demuestra una recaída posterior.

[0071] El término "cáncer" como se usa en el presente documento incluye carcinomas (p. ej., carcinoma in situ, carcinoma invasivo, carcinoma metastásico) y condiciones premalignas, es decir, cambios neomórficos independientes de su origen histológico. El término "cáncer" no se limita a ninguna etapa, grado, característica histomorfológica, invasividad, agresividad o malignidad de un tejido afectado o agregación celular. En particular, se incluyen cáncer en estadio 0, cáncer en etapa I, cáncer en etapa II, cáncer en etapa III, cáncer en etapa IV, cáncer de grado I, cáncer de grado II, cáncer de grado III, cáncer maligno y carcinomas primarios.

[0072] Los cánceres y las células cancerosas que se pueden tratar incluyen, entre otros, cánceres hematológicos, que incluyen leucemia, linfoma y mieloma, y cánceres sólidos, que incluyen, p. ej., tumores cerebrales (glioblastomas, meduloblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, ependimomas), carcinomas, p. ej., carcinoma de pulmón, hígado, tiroides, hueso, suprarrenal, bazo, riñón, ganglio linfático, intestino delgado, páncreas, colon, estómago, mama, endometrio, próstata, testículo, ovario, piel, cabeza y cuello, y esófago.

[0073] En una forma de realización, el cáncer es un cáncer hematológico. En una forma de realización, el cáncer hematológico es una leucemia. En otra forma de realización, el cáncer hematológico es un mieloma. En una forma de realización, el cáncer hematológico es un linfoma.

[0074] En una forma de realización, la leucemia se selecciona de leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia mielógena crónica (LMC). En una forma de realización, la leucemia es LMA. En una forma de realización, la leucemia es LLA. En una forma de realización, la leucemia es LLC. En una forma de realización adicional, la leucemia es LMC. En una forma de realización, la célula cancerosa es una célula leucémica, p. ej., pero sin limitación, una célula LMA, una célula LLA, una célula LLC o una célula LMC.

[0075] Los cánceres adecuados que responden al tratamiento usando un agente anti-CD47 incluyen, sin limitación, leucemia; leucemia mieloide aguda (LMA); leucemia linfoblástica aguda (LLA); metástasis; enfermedad residual mínima; cánceres de tumores sólidos, p. ej., de mama, vejiga, colon, ovario, glioblastoma, leiomiosarcoma y carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello; etc. Para ver ejemplos, véase: (i) Willingham et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2012 Abr 24;109(17):6662-7: "The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors"; (ii) Edris et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2012 Abr 24;109(17):6656-61: "Antibody therapy targeting the CD47 protein is effective in a model of aggressive metastatic leiomyosarcoma"; y (iii) Solicitud de Patente de EE. UU.

20110014119.

[0076] Composiciones farmacéuticas. Se pueden proporcionar agentes anti-CD47 y/o agentes cebadores adecuados en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, p. ej. para el tratamiento humano. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención o sus sales, ésteres o solvatos farmacéuticamente aceptables. En algunas otras formas de realización, el uso de un agente anti-CD47 o agente iniciador incluye el uso en combinación con otro agente terapéutico (p. ej., otro agente antiinfeccioso u otro agente anticancerígeno). Las formulaciones terapéuticas que comprenden uno o más agentes anti-CD47 y/o agentes cebadores de la invención se preparan para el almacenamiento mezclando el agente anti-CD47 o el agente cebador que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. La composición del agente anti-CD47 o del agente cebador se formulará, dosificará y administrará de manera compatible con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos.

[0077] Un agente anti-CD47 o un agente cebador a menudo se administra como una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico activo y otro excipiente farmacéuticamente aceptable. La forma preferida depende del modo previsto de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina tamponada con fosfato fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

[0078] Normalmente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas como poliláctido, poliglicólido o copolímero para mejorar el efecto adyuvante, como se discutió anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención se pueden administrar en forma de inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal manera que se permite una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en pleno cumplimiento de todas las normas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Drogas y Alimentos de EE.UU.

[0079] La toxicidad de los agentes anti-CD47 y/o los agentes cebadores se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., determinando la DL⁵⁰(la dosis letal para el 50 % de la población) o la DL¹⁰⁰(la dosis letal para el 100 % de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar para optimizar aún más un rango de dosificación terapéutica y/o un rango de dosificación de cebado para uso en humanos. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual en vista de la condición del paciente.

EXPERIMENTAL

[0080] Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

[0081] La presente invención ha sido descrita en términos de formas de realización particulares encontradas o propuestas por la presente invención para comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que, a la luz de la presente descripción, se pueden realizar numerosas modificaciones y cambios en las formas de realización particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance previsto de la invención. Por ejemplo, debido a la redundancia de codones, se pueden realizar cambios en la secuencia de ADN subyacente sin afectar la secuencia de la proteína. Además, debido a consideraciones de equivalencia funcional biológica, se pueden realizar cambios en la estructura de la proteína sin afectar la acción biológica en tipo o cantidad. Todas estas modificaciones están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Ensayo para la ocupación del receptor y determinación de la dosificación eficaz

[0082] Las concentraciones séricas de Hu5F9-G4 entre 50 y 250 pg/ml se correlacionan con la eficacia terapéutica en LMA y tumores sólidos en modelos de ratón con xenoinjerto. Dosis de mantenimiento de 10 mg/kg dos veces por semana alcanzan concentraciones séricas de Hu5F9-G4 en el rango potencialmente terapéutico en primates no humanos. Las dosis semanales de mantenimiento de 10 mg/kg logran concentraciones séricas de Hu5F9-G4 en el rango potencialmente terapéutico en los pacientes.

[0083] La ocupación del receptor se midió incubando las células objetivo con Hu5F9-G4 sin marcar en diferentes concentraciones, y, a continuación, las células se analizaron en fagocitosis in vitro o se incubaron con una concentración saturada de AF488-Hu5F9-G4 basada en la curva estándar y se analizó la unión por citometría de flujo, se clasificó en la población doble de APC/FITC y se calculó el MFI para cada muestra.

ocupación del receptor:

% RO= 100 - ((MFI prueba -MFI no teñido)/(MFI STD saturado -MFI no teñido)) X 100

[0084] Primero evaluamos Hu5F9-G4 administrado a monos cynomolgus como una única infusión intravenosa a 0, 0,1, 0,3, 1,3, 10 y 30 mg/kg en individuos separados. Todos los animales fueron evaluados en cuanto a cambios en los signos clínicos, consumo de alimentos, pesos corporales y parámetros de patología clínica. La administración de Hu5F9-G4 fue generalmente bien tolerada y no se observaron efectos relacionados con el tratamiento en una lista completa de observaciones clínicas, consumo de alimentos, pesos corporales o parámetros químicos clínicos indicativos de efectos renales, hepáticos o cardíacos. La evaluación de hematología clínica indicó que Hu5F9-G4 provocó una anemia dependiente de la dosis asociada con reticulocitosis y esferocitosis en todos los animales. El nadir de la anemia ocurrió aproximadamente 5 a 7 días después de la infusión y generalmente se correlacionó con la dosis. La severidad de la anemia fue variable ya que los dos animales a los que se administró 30 mg/kg exhibieron diferentes respuestas. Es importante destacar que en todos los animales la anemia se resolvió espontáneamente y volvió a los niveles iniciales después de aproximadamente dos semanas. En todos los casos no se detectó hemoglobina plasmática libre, lo que indica ausencia de hemólisis intravascular. No se observaron otras anormalidades de glóbulos blancos o plaquetas. Por lo tanto, de acuerdo con su función conocida en la regulación de la fagocitosis de RBC, Hu5F9-G4 provocó una anemia transitoria, probablemente debida a eritrofagocitosis, pero por lo demás fue bien tolerada.

[0085] Con la administración de una dosis única de Hu5F9-G4, los datos farmacocinéticos demostraron que solo los niveles de dosis de 10 y 30 mg/kg fueron capaces de alcanzar transitoriamente niveles séricos en el rango asociado con la eficacia en estudios de xenoinjertos. Esto probablemente se deba al gran sumidero de antígenos de CD47 expresado en glóbulos rojos y blancos circulantes, además de otros tejidos no hematopoyéticos. Con base en el papel descrito anteriormente de CD47 en la eliminación normal de los glóbulos rojos envejecidos, la anemia relacionada con Hu5F9-G4 observada en este estudio se consideró relacionada con la acción farmacológica de la unión de Hu5F9-G4 a CD47 expresada en los glóbulos rojos. La pérdida prematura de glóbulos rojos se compensó con la reticulocitosis resultante y, con el tiempo, la anemia inicial se resolvió con el reemplazo por células más jóvenes.

[0086] A partir de estas consideraciones, llevamos a cabo un estudio separado de escalada de dosis en NHP basado en la hipótesis de que las dosis bajas iniciales mitigarían la pérdida de glóbulos rojos y estimularían la producción de glóbulos rojos jóvenes menos susceptibles, facilitando así la tolerancia de dosis mayores posteriores. Se inscribieron dos animales en este estudio y se les administró la dosis a intervalos de una semana: uno con pretratamiento de EPO (3, 10, 30, 100 y 300 mg/kg) y uno sin pretratamiento (1,3, 10, 30 y 100 mg/kg). En ambos casos, el NHP mostró una anemia leve con la dosis inicial que no empeoró con las administraciones repetidas. De hecho, la hemoglobina solo alcanzó el umbral superior para la transfusión en humanos, incluso sin pretratamiento con EPO. Sorprendentemente, los animales toleraron bien todas las dosis, incluidas 100 y 300 mg/kg, sin anomalías sanguíneas o metabólicas adicionales. Al final del estudio, ambos animales fueron sacrificados y la necropsia y el análisis histopatológico no revelaron anomalías.

[0087] A partir de este estudio de aumento de dosis, determinamos la farmacocinética de Hu5F9-G4 en NHP. De acuerdo con la presencia de un gran sumidero de antígenos de CD47 expresado por tejidos normales, las dosis bajas iniciales de Hu5F9-G4 se eliminaron rápidamente del suero. Por el contrario, las dosis más altas de Hu5F9-G4 produjeron niveles séricos sostenidos que indicaban la saturación del sumidero de antígeno. Sorprendentemente, el animal que recibió una dosis de 300 mg/kg tuvo un nivel máximo de 5 mg/ml con un nivel sostenido de más de 1 mg/ml durante al menos 2 semanas. Estos datos sugieren que una dosis inicial seguida de un régimen de dosis de mantenimiento mayor debería ser capaz de alcanzar el nivel sérico sostenido de 50-250 gg/ml que se asoció con una eficacia potente en los modelos preclínicos de xenoinjerto.

[0088] Estos resultados nos llevaron a realizar otro estudio piloto de NHP utilizando un enfoque de dosificación de cebado y mantenimiento para modelar posibles estrategias de dosificación clínica. El objetivo de la dosis de preparación sería estimular la producción de glóbulos rojos jóvenes que luego facilitarían dosis de mantenimiento más grandes capaces de alcanzar niveles séricos sostenidos. Realizamos un estudio en monos cynomolgus en donde se administró una dosis inicial (PD) de 1 o 3 mg/kg el día 1, seguida una semana después de una dosis semanal de mantenimiento (DM) de 30 mg/kg durante seis semanas. Todos los animales fueron evaluados en cuanto a cambios en las observaciones clínicas, consumo de alimentos, pesos corporales y parámetros de patología clínica. No se observaron muertes ni cambios en los parámetros químicos clínicos clave indicativos de efectos renales, hepáticos o cardíacos. La administración de Hu5F9-G4 fue bien tolerada durante todo el ciclo de dosificación. En ambos casos, la dosis de cebado resultó en anemia leve y reticulocitosis. Como se planteó como hipótesis, las dosis de mantenimiento fueron bien toleradas sin más descensos en la hemoglobina a lo largo del ciclo de tratamiento. Al final del estudio, los niveles de hemoglobina volvieron al rango normal. El análisis farmacocinético indicó que la exposición a Hu5F9-G4 medida por Cmax y el área bajo la curva de concentración sérica (AUC0-43) en ambos animales logró niveles sostenidos de Hu5F9-G4 sérico dentro o por encima del rango terapéutico potencial durante la duración del período de dosis de mantenimiento con vida media prolongada después de la última dosis. Estos resultados sugieren que las estrategias de dosificación de PD1/MD30 o PD3/MD30 saturan el sumidero del antígeno CD47. En conjunto, estos estudios con monos cynomolgus demostraron que una dosis de cebado baja de Hu5F9-G4 da como resultado una anemia modesta y una respuesta de reticulocitosis compensatoria que permitió que las dosis posteriores de mantenimiento más altas del fármaco fueran bien toleradas.

[0089] Se realizó una curva estándar de unión a CD47 en pacientes humanos después del tratamiento con una dosis de cebado variable de Hu5F9-G4 usando Hu5F9-G4 conjugado con AF488, como se muestra en la figura 1. Puede verse que una dosis de cebado de 1 mg/kg o más fue capaz de saturar más del 80 % de las moléculas CD47 en los glóbulos rojos con la primera dosis en pacientes y previene la aglutinación de glóbulos rojos con dosis posteriores. Se muestran las concentraciones de dosis, donde 1/3 y 1/10 representan una primera dosis de sensibilización de 1 mg/kg seguida de dosis de mantenimiento de 3 mg/kg y una primera dosis de sensibilización de 1 mg/kg seguida de dosis de mantenimiento de 10 mg/kg, respectivamente.

[0090] En las figuras 2 y 3 se muestran los resultados de ocupación del receptor con diferentes pacientes, que muestran el efecto del aumento de la dosis y la saturación de los receptores en los glóbulos blancos de los pacientes humanos. Cada línea corresponde a un paciente diferente. Se muestran las concentraciones de dosis, donde 1/3 y 1/10 representan una primera dosis de sensibilización de 1 mg/kg seguida de dosis de mantenimiento de 3 mg/kg y una primera dosis de sensibilización de 1 mg/kg seguida de dosis de mantenimiento de 10 mg/kg, respectivamente.

[0091] Como se muestra en la figura 4, en un modelo de ratón de xenoinjerto preclínico, los niveles mínimos de 100-200 pg/ml son el rango terapéutico, con saturación del sumidero de CD47 endógeno. Estos niveles mínimos se correlacionaron con la eficacia antitumoral terapéutica. En un modelo preclínico de primates no humanos (NHP), después de la dosis inicial, se alcanzaron niveles mínimos objetivo de 100 pg/ml en la cohorte de 10 mg/kg. Los perfiles farmacocinéticos son predictivos de la farmacocinética clínica.

[0092] Con la administración semanal de una dosis de 10 mg/kg en un paciente humano con tumor sólido, se alcanza el mínimo objetivo de 100 pg/kg, lo que ilustra el poder predictivo del modelo preclínico de NHP, cuando se convierte convenientemente usando las pautas de la FDA. En primates no humanos, la dosis es dos veces por semana a 10 mg/kg (figura 5) y en humanos, la dosis es de 10 mg/kg por semana (figura 6).

[0093] La anemia inicial asociada con la administración del anticuerpo anti-CD47 tiene reticulocitosis compensatoria. Como se muestra en la figura 7, hay un aumento en el % de reticulocitos durante la administración semanal de Hu5F9-G4 en un paciente humano que se ve principalmente después de la primera dosis (cebado). Hu5F9-G4 se administra semanalmente.

Ejemplo 2

Reducción de la hemaglutinación con tiempo de infusión prolongado.

[0094] Los eritrocitos expresan CD47 en la superficie celular. Sin embargo, los eritrocitos envejecidos pierden la expresión de la superficie celular de CD47 y ganan la expresión de señales profagocíticas. La pérdida o el bloqueo de CD47 en la superficie celular junto con la ganancia de señales profagocíticas conduce a la eliminación fagocítica de los eritrocitos. Como se discutió en el Ejemplo 1, durante un período de varios días a varias semanas, la administración de una dosis inicial de anticuerpo anti-CD47 puede compensar una anemia transitoria inicial causada por la administración del anticuerpo anti-CD47 al eliminar los eritrocitos envejecidos e inducir reticulocitosis, donde la población sanguínea de glóbulos rojos cambia a células más jóvenes que expresan CD47 pero no tienen señales profagocíticas.

[0095] Además del efecto prolongado de anemia y compensación, puede haber un efecto agudo de hemaglutinación inmediatamente después de la administración de un anticuerpo anti-CD47. Sin estar ligado a la teoría, esto puede atribuirse a concentraciones altas de anticuerpos y glóbulos rojos a muy corto plazo localizadas en el sitio de administración, hasta que la dinámica del flujo sanguíneo normal distribuya las células y los anticuerpos de manera más equitativa. A altas concentraciones, el anticuerpo puede unirse a diferentes glóbulos rojos, provocando así un efecto de entrecruzamiento no deseado.

[0096] Para reducir la hemaglutinación aguda, por lo tanto, es deseable administrar el anticuerpo de una manera que reduzca la concentración inmediata en el sitio de infusión a niveles en los que los glóbulos rojos no estén entrecruzados. En los protocolos iniciales, se administró una dosis de cebado de anticuerpo en volúmenes de 250 ml. para dosis de 0,1 mg/kg y 0,3 mg/kg; y en un volumen de 500 ml para una dosis de 1 mg/kg. durante un período de una hora. Como se muestra en la figura 8, este protocolo puede provocar una hemaglutinación no deseada.

[0097] Por el contrario, cuando se administra la misma dosis y concentración de anticuerpo a un paciente durante un período de 3 horas, hay una mejora notable en el nivel de aglutinación, que se muestra en la figura 8. La administración prolongada se puede realizar para dosificación terapéutica, después de completar el cebado, pero no es necesario ya que hay una reducción en los glóbulos rojos envejecidos que expresan señales profagocíticas después de completar la dosis de cebado.

Ejemplo 3

Protocolo de ensayo clínico

[0098] Un mAb terapéutico novedoso se une específicamente a CD47 y bloquea su interacción con su ligando, la proteína reguladora de señales alfa (SIRPa), en células fagocíticas. Esto da como resultado la fagocitosis y la eliminación de células cancerosas a través de señales profagocíticas, que pueden incluir fosfatidilserina, calreticulina y otras. Con la excepción de los glóbulos rojos, las células normales generalmente no expresan señales profagocíticas y no se ven afectadas por el mAb anti-CD47. El mAb de bloqueo de CD47 humanizado, Hu5F9-G4, se ha desarrollado para pruebas clínicas y se ha administrado de forma segura a niveles séricos potencialmente terapéuticos a primates no humanos (NHP). Se realizaron estudios de toxicología no clínicos en NHP (monos cynomolgus y rhesus) para respaldar la administración intravenosa de Hu5F9-G4 en el entorno clínico. Según los datos del estudio toxicológico de 8 semanas de GLP realizado en monos cynomolgus, la dosis inicial segura estimada para ensayos en humanos es de 0,1 mg/kg.

[0099] La farmacocinética (PK) y la toxicocinética (TK) de Hu5F9-G4 se han estudiado en el mono cynomolgus junto con el estudio de toxicología GLP. La PK y TK recopiladas de estos estudios indican que Hu5F9-G4 exhibe una vida media variada (t1/ ²), que varía de 6,35 a 320 horas después de dosis únicas y múltiples. El volumen de distribución se aproximó al volumen de suero de mono, como se esperaba para un anticuerpo monoclonal. La vida media parece aumentar y el aclaramiento parece disminuir con el aumento de la dosis y con dosis repetidas, lo que sugiere una saturación del aclaramiento mediado por el objetivo a través del sumidero celular CD47 endógeno. Hubo una incidencia notable de anticuerpos antidrogas (ADA) confirmados en monos, particularmente para dosis de 10 mg/kg o menos, que parecían correlacionarse con concentraciones más bajas de Hu5F9-G4. No obstante, la exposición se mantuvo para dosis iguales o superiores a 10 mg/kg durante la duración del tratamiento en los estudios de dosis repetidas.

[0100] Se realizaron estudios no clínicos en NHP (monos cynomolgus y rhesus) para respaldar el uso de Hu5F9-G4 para administración intravenosa durante 8 semanas en el ensayo clínico. El estudio de toxicología de GLP se realizó en monos cynomolgus, con una fase de dosificación de 8 semanas de duración seguida de un período de recuperación de 8 semanas. En el estudio toxicológico de 8 semanas de GLP, se administró Hu5F9-G4 a monos cynomolgus machos y hembras a través de una infusión intravenosa de 1 hora usando un programa de dosis de cebado/mantenimiento durante un total de 8 semanas. Hu5F9-G4 se administró como dosis inicial (5 mg/kg) el día 1, seguida de dosis de mantenimiento de 5, 10, 50 o 100 mg/kg administradas dos veces por semana los días 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50 y 53.

[0101] El principal hallazgo relacionado con el tratamiento observado en este estudio (así como en los estudios piloto de toxicología previos) fue una disminución de la masa de glóbulos rojos, incluyendo el recuento de glóbulos rojos (RBC), la hemoglobina y el hematocrito. La disminución de la hemoglobina se observó en todos los animales tratados con Hu5F9-G4 luego de la administración de la dosis inicial el Día 1, y la disminución de la hemoglobina fue generalmente más pronunciada luego de la administración de la primera dosis de mantenimiento el Día 8. La gravedad y la incidencia de la anemia relacionada con Hu5F9-G4 varió entre los animales y, aunque la disminución de la hemoglobina no se produjo de manera claramente dependiente de la dosis, el grupo de mantenimiento con dosis alta (100 mg/kg) tuvo la mayor incidencia de animales con un nivel de hemoglobina < 10,0 g/dl el día 11 (90 %). Es importante destacar que los niveles de hemoglobina mostraron una tendencia hacia la recuperación en todos los animales (generalmente comenzando alrededor de los días 15 a 32) y continuaron recuperándose hasta el final del estudio. Debido a anemia severa (hemoglobina < 7,0 g/dl), dos animales (uno en el grupo de 5/50 mg/kg y otro en el grupo de 5/100 mg/kg) se colocaron en vacaciones de dosis para evaluar la recuperación de la anemia y cómo respondieron los animales una vez resumida la dosificación. La disminución en el nivel de hemoglobina para el animal en el grupo de dosis de mantenimiento de 50 mg/kg fue tan bajo como 5,7 g/dl en los días 15 y 18 y, por lo tanto, tuvo vacaciones de dosis en los días 25 a 36 (dosis de mantenimiento 6 a 9). La hemoglobina de este animal comenzó a recuperarse el día 36 y, por lo tanto, se reanudó la dosificación para este animal el día 39 (dosis 10). Aunque se reanudó la dosis de mantenimiento, el nivel de hemoglobina de este animal continuó recuperándose hasta el final del estudio. El nivel de hemoglobina del animal en el grupo de dosis de mantenimiento de 100 mg/kg descendió a 6,9 g/dl el día 18 y, por lo tanto, se comenzó la suspensión de dosis el día 25; este animal continuó en vacaciones de dosis hasta el final del estudio. Los niveles de hemoglobina de este animal también mostraron una tendencia continua a la recuperación hasta el final del estudio.

[0102] Así, aunque parece que un pequeño número de animales puede ser especialmente sensible a la anemia producida por Hu5F9-G4, no se observaron signos clínicos de toxicidad en estos animales, y además, la anemia es transitoria y se recuperan los niveles de hemoglobina a lo largo del tiempo. Además de las disminuciones en la masa de glóbulos rojos, se observaron aumentos en los reticulocitos en todos los grupos tratados con Hu5F9-G4, lo que es indicativo de una respuesta eritropoyética robusta asociada con las disminuciones en la masa de glóbulos rojos.

[0103] De acuerdo con los estudios previos, la disminución de la masa de glóbulos rojos también se asoció con disminuciones en el volumen corpuscular medio (MCV) y haptoglobina y aumentos en la concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), reticulocitos y ancho de distribución de glóbulos rojos (RDW). En particular, no se observó hemoglobina plasmática libre en ninguno de los grupos tratados con Hu5F9-G4, lo que es indicativo de ausencia de hemólisis intravascular. También se observaron aumentos de mínimos a leves en los linfocitos, pero estos aumentos fueron de naturaleza transitoria y esporádica y no se produjeron de manera dependiente de la dosis. Se consideró que los cambios en la morfología de las células sanguíneas estaban asociados con una destrucción/aclaramiento acelerado de glóbulos rojos y un aumento de la eritropoyesis, e incluían anisocitosis, esferocitos (microcitos), excentrocitos, fragmentos de eritrocitos atípicos consistentes con una lesión/aclaramiento de eritrocitos, aglutinación de eritrocitos y plaquetas grandes, así como cambios asociados con el aumento de la eritropoyesis que consiste en anisocitosis y macrócitos policromatofílicos.

[0104] Todos los cambios relacionados con el tratamiento en los parámetros hematológicos, incluida la morfología de las células sanguíneas, mostraron una tendencia continua hacia la recuperación hasta el final del estudio. Los cambios en las evaluaciones de frotis de médula ósea se limitaron a cambios morfológicos mínimos a leves en el linaje eritroide (displasia), que consistía en células ocasionales con formas nucleares anormales, núcleos múltiples, ampollas nucleares y/o asincronía de maduración del núcleo al citoplasma (núcleo anormal a maduración del citoplasma). La reticulocitosis marcada se asoció con la disminución de la masa de glóbulos rojos relacionada con el tratamiento, lo que es indicativo de eritropoyesis acelerada. Los cambios adicionales que se consideraron relacionados con la respuesta eritropoyética acelerada asociada con Hu5F9-G4 incluyeron disminuciones leves en la proporción media de M:E junto con un cambio mínimo a leve apropiado a precursores eritroides más inmaduros asociados con la eritropoyesis acelerada. De acuerdo con estudios previos, los cambios relacionados con el tratamiento en los parámetros hematológicos (es decir, disminución de la hemoglobina, aumento de reticulocitos) observados en el estudio GLP de 8 semanas se asociaron con aumentos en la bilirrubina total y disminuciones en la haptoglobina.

[0105] Se observaron otros cambios en los parámetros de química clínica solo en el grupo de dosis de mantenimiento de 100 mg/kg, e incluyeron una ligera disminución en la albúmina (dos animales hembra), un ligero aumento en la globulina y una disminución correspondiente en la proporción de albúmina:globulina. Todos los cambios relacionados con el tratamiento en los parámetros de química clínica fueron parcial o completamente reversibles al final de la fase de dosificación.

[0106] Basándose en el papel conocido de CD47 en la eliminación normal de los glóbulos rojos envejecidos, la anemia relacionada con Hu5F9-G4 observada en este estudio se considera relacionada con la acción farmacológica de la unión de Hu5F9-G4 a CD47 expresada en los glóbulos rojos. Nuestra hipótesis es que la administración de Hu5F9-G4 acelera el proceso de eliminación de los glóbulos rojos envejecidos al sustituir la pérdida gradual de CD47 por el bloqueo inmediato de CD47 en los glóbulos rojos envejecidos. La pérdida prematura de glóbulos rojos envejecidos se compensa con la reticulocitosis resultante (que se observó en todos los estudios) y, con el tiempo, la anemia inicial se resuelve a medida que los glóbulos rojos envejecidos se reemplazan con células más jóvenes y, como resultado, la distribución por edad del grupo de los glóbulos rojos se traslada a células más jóvenes.

[0107] En general, la administración de Hu5F9-G4 a través de una infusión i.v. de 1 hora a una dosis inicial de 5 mg/kg en la Semana 1 (Día 1), seguida de dosis de mantenimiento dos veces por semana durante 7 semanas consecutivas a dosis de hasta 100 mg/kg, fue clínicamente bien tolerado en monos cynomolgus. A pesar de la anemia relacionada con el tratamiento, no se observaron signos de toxicidad clínica, incluso en los animales que tuvieron vacaciones de dosis debido a la anemia severa observada. Los cambios hematológicos observados en este estudio fueron consistentes con estudios previos y se consideró que estaban relacionados con la acción farmacológica de Hu5F9-G4 para acelerar el proceso de eliminación de glóbulos rojos envejecidos mediante la unión de Hu5F9-G4 a CD47 expresado en glóbulos rojos. Todos los cambios relacionados con el tratamiento en los parámetros hematológicos y de química clínica fueron parcial o completamente reversibles al final del estudio. Por lo tanto, en base a la totalidad de los datos, se consideró que la dosis no tóxica más alta (HNSTD) más alta para este estudio era la dosis inicial/de mantenimiento de 5/100 mg/kg, la dosis más alta evaluada. El margen de seguridad previsto (basado en el AUC) proporcionado por la dosis de mantenimiento de 100 mg/kg es más que adecuado y oscila entre 766 y 803 veces por encima de la dosis inicial de 0,1 mg/kg para el estudio clínico propuesto.

[0108] El anticuerpo anti-CD47 humanizado, Hu5F9-G4, se probó por sus efectos sobre el tipo de sangre antes de la transfusión y la compatibilidad cruzada en la preparación de estrategias para el manejo de pacientes que podrían necesitar una transfusión durante el tratamiento con Hu5F9-G4. Los resultados mostraron que Hu5F9-G4 no interfirió con la detección de anticuerpos en plasma, lo que hizo posible detectar aloanticuerpos y proceder con la transfusión de concentrados de glóbulos rojos (PRBC) si es médicamente necesario. Sin embargo, en sangre completa, Hu5F9-G4 interfirió con los resultados de la tipificación sanguínea ABO, la prueba de antiglobulina directa (DAT) y la inmunofenotipificación de glóbulos rojos (RBC). Por lo tanto, será importante realizar el tipaje sanguíneo ABO, DAT e inmunofenotipado de RBC en muestras de sangre obtenidas antes del inicio del tratamiento con Hu5F9-G4. Hu5F9-G4 se incubó con glóbulos rojos de primates no humanos y donantes humanos. Hu5F9-G4 no indujo hemólisis in vitro de glóbulos rojos humanos, incluso en presencia de suero que contenía complemento. El estudio no mostró evidencia de hemaglutinación (HA) en siete muestras de NHP. Sin embargo, se observó HA en las 14 muestras de sangre de donantes humanos en presencia de 10 microgramos/ml de Hu5F9-G4.

[0109] A diferencia de la mayoría de los casos de anemia hemolítica autoinmune relacionada con la aglutinación donde la HA es causada por aglutininas IgM frías, la aglutinación causada por Hu5F9-G4, una IgG4, se produjo a 37°C pero no a 4°C. Si bien la aglutinación de glóbulos rojos se puede ver en varias condiciones (generalmente en asociación con agentes infecciosos, con y sin secuelas clínicas), la importancia clínica de la aglutinación que se observa aquí es incierta.

[0110] Este es un estudio abierto, no aleatorizado, de Fase 1, primero en humanos, de cohorte de dosis creciente del anticuerpo bloqueador de CD47 Hu5F9-G4. La DLT esperada de este fármaco es anemia, debido a la fagocitosis de eritrocitos senescentes por macrófagos. Los estudios piloto de toxicología realizados en monos cynomolgus mostraron que la administración de una dosis baja de cebado de anticuerpos produjo una anemia modesta y una respuesta de reticulocitos que permitió que las dosis de mantenimiento más altas posteriores del fármaco fueran bien toleradas. Por lo tanto, la estrategia en este ensayo de Fase 1 es establecer primero una dosis de preparación óptima en un diseño de cohorte de dosis creciente (Parte A) en donde 6 de 6 pacientes mantienen una hemoglobina de 8 g/dl o más en ausencia de transfusión para las primeras cuatro semanas y que produce una DLT, distinta de la anemia, en no más de 1 de cada 6 pacientes. Una vez que se establezca esta dosis de preparación óptima en la Parte A, se administrará el Día 1 de la Semana 1, seguida una semana más tarde por la dosis de mantenimiento semanal en la Parte B y, si es necesario, por la Parte C (dosis de carga dos veces por semana durante las Semanas 2-4, seguido de una dosis de mantenimiento semanal). La dosis inicial de 0,1 mg/kg en la primera cohorte está respaldada por un margen de seguridad de 766 veces a 803 veces en relación con la dosis de mantenimiento de 100 mg/kg dos veces por semana, que es la HNSTD en el estudio fundamental de toxicología BPL. Sobre la base de estos estudios, y suponiendo una escala lineal de los márgenes de seguridad (que pueden no ser aplicables), esperamos que Hu5F9-G4 sea clínicamente tolerado en dosis de hasta 10 mg/kg y tal vez más. Por lo tanto, se seleccionó un esquema de escalada de dosis de 0,1,0,3, 1, 3, 10 y 20 mg/kg.

[0111] Para la Parte A, para el primer paciente de cada cohorte, la evaluación de DLT se completará el día 29 antes de la inscripción del segundo paciente en la cohorte. El segundo paciente de una cohorte de 3 no podrá comenzar el tratamiento hasta 2 semanas después de que el primer paciente haya comenzado el período de evaluación de DLT (14 días desde el inicio de la terapia). El tercer paciente puede comenzar 4 semanas después de que el primer paciente haya comenzado el período de evaluación de DLT (28 días desde el inicio de la terapia). Para las Partes B y C, para el primer paciente de cada cohorte, la evaluación de DLT se completará el día 29 antes de la inscripción del segundo paciente en la cohorte. Los pacientes subsiguientes en cada cohorte pueden comenzar el tratamiento dos semanas después de que el paciente anterior comience la terapia. Además, el tercer paciente de la cohorte requerirá observación durante 28 días antes de pasar a la siguiente cohorte o expandirse a una cohorte de 6. Si una cohorte se expande de 3 a 6 pacientes, esos pacientes pueden recibir tratamiento 28 días después de que el tercer paciente haya iniciado la terapia, sin un período de observación adicional entre el cuarto y el sexto paciente de esa cohorte. La CTMc decidirá la asignación del nivel de dosis.

[0112] Este es un ensayo de etiqueta abierta de un solo centro con tres partes. Lo siguiente se aplica a todas las partes del estudio: El aumento de la dosis se realizará a través de los niveles de dosis designados, y las decisiones con respecto al aumento de la dosis se basarán en las primeras 4 semanas de tratamiento en la cohorte actual, denominada "Período de evaluación de la toxicidad limitante de la dosis (DLT)", junto con evaluaciones en curso para pacientes en cohortes anteriores que continuaron la terapia más allá de las 4 semanas. Las decisiones sobre cohortes adicionales para refinar aún más el DMT o RP2DS serán tomadas por el CTMC y requerirán una enmienda del estudio.

[0113] Definición de toxicidad limitante de dosis (DLT). Una DLT se define como un evento adverso (EA) posiblemente, probablemente o definitivamente relacionado con el fármaco, que ocurre dentro de las primeras cuatro semanas de tratamiento, de la siguiente manera: EA de grado 3 o mayor con las excepciones enumeradas a continuación; la anemia como consecuencia del IMP se considera una toxicidad de Grado 3 si está indicada la transfusión, independientemente del nivel de hemoglobina. Cualquier transfusión o Grado 3 o mayor gravedad de la anemia o la necesidad de utilizar agentes estimulantes de la eritropoyesis se considerará una DLT y conducirá a la eliminación del protocolo del estudio. Los siguientes no se considerarán DLT y están excluidos de la definición de DLT: náuseas de Grado 3 en pacientes que no han recibido tratamientos óptimos con antieméticos, y que se resuelven a < Grado 2 dentro de las 48 horas; vómitos de Grado 3 en pacientes que no han recibido un tratamiento óptimo con antieméticos, y que se resuelven a < Grado 2 dentro de las 48 horas; diarrea de Grado 3 en pacientes que no han recibido un tratamiento óptimo con antidiarreicos, y que se resuelve a < Grado 2 dentro de las 48 horas; fatiga de Grado 3 que se resuelve en dos semanas con el estudio; reacciones a la infusión de grado 3 en ausencia de tratamiento previo. Aumento de Grado 3 en la bilirrubina en sangre indirecta/no conjugada que se resuelve a la línea base o Grado 1 dentro de los 7 días o antes de la siguiente dosis programada de Hu5F9-G4, lo que ocurra primero y el aumento en la bilirrubina indirecta/no conjugada no está asociado temporalmente con un aumento de Grado 2 o superior de AST, ALT y/o fosfatasa alcalina de origen hepático (el fraccionamiento de la fosfatasa alcalina para determinar el origen queda a criterio del investigador). Los criterios para la clasificación de la gravedad de la bilirrubina indirecta/no conjugada y directa/conjugada utilizarán los criterios CTCAE 4.03 tal como se aplicarían a la bilirrubina en sangre. Un aumento en la bilirrubina total no será una DLT si la bilirrubina directa/conjugada es de Grado 2 o inferior y se ha determinado que la elevación de la bilirrubina indirecta/no conjugada no es una DLT.

[0114] Definición de dosis máxima tolerada (DMT). La dosis de preparación óptima para la Semana 1, Día 1 en las Partes B y C se seleccionará como la dosis máxima en la Parte A a la que 6 de 6 pacientes no requirieron transfusión de hemoderivados y mantuvieron una hemoglobina mayor o igual a 8 g/dl (Anemia de grado 0-2) y con no más de 1 de 6 pacientes con una DLT diferente a la anemia durante las primeras 4 semanas de tratamiento. La DMT para las Partes B y C se define como el nivel de dosis máxima en donde no más de 1 de 6 pacientes experimentaron una DLT y por debajo del nivel de dosis en donde 2 o más pacientes experimentaron una DLT para aquellos pacientes que reciben al menos una dosis de mantenimiento de Hu5F9-G4. Los EA que ocurren para los pacientes en las Partes B y C que no reciben al menos una dosis de mantenimiento (para la Parte B) o al menos una dosis de carga (para la Parte C) no se incluirán en la evaluación de DMT para la selección del mantenimiento (Parte B) o dosis de carga (Parte C). Es posible que no se logre una DMT en las Partes B o C, en cuyo caso se determinará la dosis máxima tolerada administrada. La dosis de mantenimiento semanal máxima planificada es de 20 mg/kg.

[0115] Evaluabilidad del paciente. Todos los pacientes expuestos al IMP, Hu5F9-G4, serán evaluables para la seguridad y contribuirán con datos a las decisiones de escalada de dosis. Pacientes que (1) rechacen la participación y no experimenten una DLT, o (2) sean eliminados del estudio por motivos no relacionados con los EA relacionados con Hu5F9-G4, o (3) tengan un EA no relacionado con Hu5F9-G4 que requiera eliminación del estudio antes de completar las primeras cuatro semanas de terapia, puede reemplazarse agregando otro paciente a esa cohorte.

[0116] Administración de Medicamentos. Hu5F9-G4 se administrará por vía intravenosa. Para la Parte A: La duración de las infusiones i.v. de Hu5F9-G4 será de 60 minutos (± 10 minutos) para las dosis de 0,1 a 1 mg/kg y de dos horas (± 10 minutos) para las dosis superiores a 1 mg/kg.

[0117] Para las Partes B y C: la dosis de preparación es la primera dosis que recibirán los sujetos de las Partes B y C y se determinó que es de 1 mg/kg al finalizar la Parte A. Para los sujetos de las Partes B y C, la duración de la infusión de la dosis de cebado, a saber, 1 mg/kg, será de tres horas. Las dosis de mantenimiento se administrarán después de completar la dosis de cebado. La duración de la infusión de las dosis de mantenimiento será de dos horas para dosis superiores a 1 mg/kg. Los pacientes con retraso de la dosis o suspensión del fármaco de 2 semanas o más serán revacunados, en cuyo caso se administrará la dosis de cebado de 1 mg/kg durante las tres horas previas a la reanudación de la dosis de mantenimiento asignada. La premedicación se puede administrar antes de la segunda dosis o de las subsiguientes para los pacientes que experimentan una reacción a la infusión a la administración anterior de Hu5F9-G4. El régimen de premedicación sugerido podría incluir una combinación de acetaminofeno 500 mg PO, dexametasona 8 mg i.v. y difenhidramina 25 mg i.v. administrados 30 minutos antes de la infusión de Hu5F9-G4. En el caso de una reacción a la infusión, el régimen de premedicación para los tratamientos posteriores queda a criterio del investigador.

Identificación de la dosis de cebado

[0118] El objetivo general de esta parte del estudio es identificar la dosis de cebado que da como resultado un nivel aceptable de anemia (menos de Grado 3) dentro de las primeras 4 semanas en los 6 pacientes de la cohorte definitoria de la dosis. Por lo tanto, el nivel de dosis de preparación óptimo será el nivel de dosis máxima en donde los 6 pacientes mantienen una hemoglobina de 8 g/dl o más en ausencia de transfusión durante las primeras cuatro semanas y que produce una DLT distinta de la anemia en no más de 1 de 6 pacientes. Los pacientes serán evaluados en cohortes de dosis sucesivas de la siguiente manera: 0,1,0,3, 1,3, 10 y 20 mg/kg administrados como infusión IV. El aumento de dosis en la Parte A seguirá un diseño de titulación acelerada modificado para niveles de dosis por debajo de 3 mg/kg y el diseño de aumento de dosis estándar 3 más 3 para niveles de dosis de 3 mg/kg y superiores. Para el diseño de titulación acelerada, se inscribirá un paciente por cohorte hasta que se observe un EA de Grado 2 o superior relacionado con Hu5F9-G4 dentro de las primeras cuatro semanas. Tal evento dará como resultado la expansión de la cohorte a 3 pacientes. Sin embargo, cualquier ocurrencia de anemia de Grado 3 en las primeras cuatro semanas para cualquier paciente en la Parte A dará como resultado el cese de una mayor acumulación en esa cohorte y dará como resultado la expansión de la siguiente cohorte de dosis más baja. Para los EA distintos de la anemia, un paciente con DLT (EA de grado 3 o mayor relacionado con Hu5F9-G4) en los primeros tres pacientes dará como resultado una expansión de la cohorte a 6 pacientes. Dos pacientes con DLT indican que se excedió la dosis de preparación máxima tolerada, no se permitirá la inscripción adicional en esa cohorte y la siguiente cohorte de dosis más baja, si contiene 3 o menos pacientes, se ampliará a 6 pacientes. Los pacientes inscritos en la Parte A continuarán el tratamiento semanal al nivel de dosis asignado hasta que se presente toxicidad inaceptable o documentación de enfermedad progresiva (según lo determinado por RECIST v 1.1 para tumores sólidos o los criterios IWG para linfomas) o el retiro voluntario del paciente del estudio. Excepto por la dosis inicial del Día 1 de las Partes B y C, seguida de dosis más altas de mantenimiento y/o carga, no habrá aumento de la dosis intrapaciente en este estudio. Tenga en cuenta que cualquier anemia de grado 3 en las primeras 4 semanas de la Parte A provocará el cese de la cohorte y la expansión de la siguiente cohorte de dosis más baja. Además, el diseño de titulación acelerada solo se aplica a niveles de dosis inferiores a 3 mg/kg. Los niveles de dosis de 3 mg/kg o mayores se realizarán con un diseño estándar de 3 más 3. Después de completar la Parte A y según la Enmienda 4.0 del protocolo, la dosis inicial se identificó como 1 mg/kg. Además, el tratamiento semanal en curso con 1 mg/kg en la Parte A estableció que 1 mg/kg también es seguro como dosis de mantenimiento.

[0119] Evaluación de seguridad ampliada de la dosis de cebado durante las Partes B y C. Los pacientes de las Partes B y C recibirán la dosis de cebado óptima de 1 mg/kg en la Semana 1, Día 1 que se determinó a partir de la Parte A, seguido de mantenimiento semanal dosis a partir del día 8. Si se produce un EA o EAG después de que un paciente recibe la dosis de preparación, pero antes de que el paciente reciba una dosis de mantenimiento, este AE o EAG se atribuirá a la dosis de preparación y contribuirá a la evaluación de seguridad ampliada de la dosis de preparación. El CTMC seguirá supervisando de cerca los EAG y los EA atribuidos a la dosis de cebado con reuniones periódicas o con mayor frecuencia si es necesario (según los estatutos del CTMC).

[0120] Parte B: Identificación de la DMT para la dosificación de mantenimiento semanal después de una dosis de cebado única. Todos los pacientes de la Parte B recibirán la dosis inicial óptima en la Semana 1, Día 1 que se determinó a partir de la Parte A, seguida de dosis de mantenimiento semanales a partir del Día 8. La dosis de mantenimiento semanal administrada está determinada por la cohorte de dosis asignada de la Parte B. Las cohortes de dosis propuestas originalmente para la Parte B eran 0,3, 1, 3, 10 y 20 mg/kg. Las cohortes de dosis de mantenimiento semanales comenzarán con la dosis que sea un nivel de dosis más alta que la dosis inicial óptima. Se determinó que el nivel de dosis de 1 mg/kg de la Parte A era la dosis inicial óptima y se determinó que la dosis de mantenimiento semanal de 1 mg/kg era segura; por lo tanto, el primer nivel de dosis de mantenimiento asignado en la Parte B será el nivel de dosis semanal i.v. de 3 mg/kg y se omitirán los niveles de dosis de mantenimiento de 0,3 y 1 mg/kg. El aumento de dosis en la Parte B seguirá un diseño de aumento de dosis estándar de 3 más 3. La DMT para la Parte B es el nivel de dosis máxima en donde no más de 1 de 6 pacientes experimenta una DLT y por debajo del nivel de dosis en donde 2 o más pacientes experimentan una DLT para aquellos pacientes que reciben al menos una dosis de mantenimiento de Hu5F9-G4. Los EA que ocurren en pacientes de la Parte B que no reciben al menos una dosis de mantenimiento de Hu5F9-G4 no se incluirán en la evaluación de DLT para la selección de la dosis de mantenimiento. Para refinar aún más la DMT, se puede probar un nivel de dosis a mitad de camino entre la DMT nominal y el siguiente nivel de dosis superior. Por ejemplo, si dos o más sujetos en el nivel de dosis de 3 mg/kg experimentan una DLT atribuida a la dosis de mantenimiento, se puede probar un nivel de dosis intermedio entre 1 mg/kg y 3 mg/kg, es decir, 2 mg/kg, para refinar aún más la DMT permitiendo que la determinación final de la DMT aumente de 1 mg/kg a 2 mg/kg si no más de 1 de 6 sujetos a 2 mg/kg experimentan una DLT a 2 mg/kg. De manera similar, se pueden agregar niveles de dosis de 6,5 mg/kg y 15 mg/kg si la DMT nominal es de 3 mg/kg o 10 mg/kg, respectivamente. Es posible que no se logre una DMT en la Parte B para la dosis de mantenimiento, en cuyo caso se determinará la dosis máxima tolerada administrada porque la dosis semanal máxima será de 20 mg/kg. El período de evaluación de DLT para la dosis de mantenimiento de la Parte B comenzará desde el momento de la administración de la primera dosis de mantenimiento (Semana 2, Día 8) hasta una semana después de completar la tercera dosis de mantenimiento (Semana 4, Día 29). Los pacientes inscritos en la Parte B continuarán el tratamiento semanal al nivel de dosis asignado hasta que se presente toxicidad inaceptable o documentación de enfermedad progresiva según lo determinado por RECIST v 1.1 para tumores sólidos, o los criterios IWG para linfomas, o el retiro voluntario del paciente del estudio. Excepto por la dosis inicial del Día 1 de las Partes B y C, seguida de dosis más altas de mantenimiento y/o carga, no habrá aumento de la dosis intrapaciente en este estudio. Los objetivos farmacocinéticos para RP2DS son el logro y mantenimiento de un nivel mínimo del anticuerpo Hu5F9-G4 por encima de 100 microgramos/mL en plasma en cinco de seis pacientes en RP2DS. Cuando se ha determinado la DMT o la dosis máxima tolerada administrada (en ausencia de una DMT) o la dosis biológica óptima (basada en PK) para la administración semanal, el estudio puede modificarse para agregar cohortes adicionales a la Parte B donde la dosificación semanal es seguida por dosificación diaria Q14 y/o Q21. Los programas más prolongados se iniciarían solo después de una revisión detallada de los datos disponibles de seguridad, PK y farmacodinámica. Por ejemplo, esto podría iniciarse cuando los parámetros PK indican la saturación del aclaramiento mediado por el objetivo y la prolongación de la vida media de Hu5F9-G4. La dosificación durante las cohortes de intervalos de días Q14 o Q21 se puede aumentar a 30 mg/kg mediante la modificación del protocolo si se tolera bien la dosis de 20 mg/kg.

[0121] Parte C: Identificación de la DMT para la dosificación de carga dos veces por semana, después de una dosis de cebado inicial y antes de la dosificación de mantenimiento semanal, si no se logran los parámetros PK adecuados en la Parte B mediante la dosificación semanal. La Parte C puede iniciarse si no se logra una exposición adecuada a Hu5F9-G4 en la Parte B. La exposición adecuada se define como un nivel mínimo de anticuerpos por encima de 100 microgramos/ml logrado en cinco de seis pacientes con la dosis recomendada de Fase 2 para el Día 57. Todos los pacientes de la Parte C recibirán la dosis de preparación óptima determinada en la Parte A en la Semana 1, Día 1, seguida de dosis de carga dos veces por semana de acuerdo con la cohorte de dosis asignada de la Parte C. El CTMC seguirá supervisando de cerca los EAG y los EA atribuidos a la dosis de cebado con reuniones periódicas o con mayor frecuencia si es necesario (según los estatutos del CTMC). Las cohortes de dosis propuestas originalmente para la Parte C eran 0,3, 1,3, 10 y 20 mg/kg. Las cohortes de dosis de carga dos veces por semana comenzarán en el nivel de dosis que sea un nivel más bajo que la DMT de la Parte B o la dosis máxima tolerada administrada. Por lo tanto, si 20 mg/kg era la DMT en la Parte B, la dosis de carga dos veces por semana en la Parte C será de 10 mg/kg. Se administrarán dosis de carga dos veces por semana (administradas el primer y cuarto día de cada período semanal) durante las Semanas 2, 3 y 4. A esto le seguirán dosis de mantenimiento semanales en las Semanas 5 a 8. Después de completar y analizar las concentraciones séricas de Hu5F9-G4 dentro de las cohortes propuestas en la Parte C y en caso de que no se logre una exposición adecuada durante la administración dos veces por semana al final de las tres semanas de carga (Semanas 2 4), el protocolo puede modificarse para incluir cohortes de dosis de carga dos veces por semana durante períodos adicionales de 2 semanas más allá de la semana 4. Los niveles de dosis superiores a 20 mg/kg para carga o mantenimiento en la Parte C requerirán una modificación del protocolo. De manera similar a la Parte B, se pueden agregar cohortes adicionales a la Parte C cuando se haya determinado la DMT o la dosis máxima tolerada administrada (en ausencia de DMT) o la dosis biológica óptima, donde la dosis de carga dos veces por semana, luego la dosis de mantenimiento semanal, es seguida por dosificación en días Q14 o Q21 basada en datos de seguridad, FC y farmacodinámicos. Por ejemplo, un programa más prolongado comenzaría en un punto de tiempo cuando los parámetros PK indican la saturación del aclaramiento mediado por el objetivo y la prolongación de la vida media de Hu5F9-G4. La dosis empleada para las cohortes de día Q14 o día Q21 puede aumentarse a 30 mg/kg, modificando el protocolo, si se tolera bien la dosis de 20 mg/kg. El aumento de dosis en la Parte C seguirá un diseño estándar de 3 más 3 para todos los niveles de dosis. La evaluación de DLT hacia la DMT se aplicará a aquellos pacientes que reciban al menos una dosis de carga para la Parte C. Las DLT que ocurran para pacientes en la Parte C que no reciban al menos una dosis de carga de Hu5F9-G4 no se incluirán en la evaluación de DLT para la identificación de la DMT para la dosis de carga. Si ningún paciente experimenta una DLT, entonces el aumento de la dosis puede proceder al siguiente nivel de dosis más alto. Si uno de los tres pacientes experimenta una DLT, entonces esa misma cohorte de nivel de dosis se ampliará a 6 pacientes. Si 2 o más de 6 pacientes experimentan una DLT, no se permitirán más inscripciones a ese nivel de dosis y se habrá excedido la DMT. La DMT para la Parte C es el nivel de dosis máxima en donde no más de 1 de 6 pacientes experimenta una DLT y por debajo del nivel de dosis en donde 2 o más de 6 pacientes experimentan una DLT. El período de evaluación de DLT para la dosis de carga en la Parte C comenzará desde el momento de la administración de la primera dosis de carga (Semana 2, Día 8) hasta la Semana 4, Día 29. Los pacientes inscritos en la Parte C continuarán el tratamiento con el nivel de dosis asignado hasta toxicidad inaceptable o documentación de enfermedad progresiva según lo determinado por RECIST v 1.1 para tumores sólidos o por los criterios IWG para linfomas o retiro voluntario del paciente del estudio.

[0122] Aumento de la dosis intrapaciente. Excepto por la dosis inicial del Día 1 de las Partes B y C, seguida de dosis más altas de mantenimiento y/o carga, no habrá aumento de la dosis intrapaciente en este estudio.

Agente en investigación

[0123] El ingrediente farmacéutico activo (API) es Hu5F9-G4, un anticuerpo monoclonal humanizado del isotipo IgG4 kappa que contiene una sustitución Ser-Pro (SP) en la región bisagra de la cadena pesada para reducir el intercambio de brazos Fab. Se compone de un tetrámero glicosilado con enlace disulfuro que consta de dos cadenas gamma pesadas idénticas de 444 aminoácidos y dos cadenas ligeras kappa idénticas de 219 aminoácidos. Hu5F9-G4 apunta a CD47. El producto farmacéutico Hu5F9-G4 se proporciona en una forma de dosificación líquida destinada a la infusión IV. Hu5F9-G4 se suministra en viales de 10 ml de un solo uso que contienen 200 mg del anticuerpo, en una formulación de acetato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % (p/v), polisorbato 20 al 0,01 % (p/v), pH 5,0.

[0124] El fármaco Hu5F9-G4 se ha fabricado en Lonza Group, Ltd (Slough, RU), y el fármaco ha sido fabricado por Patheon UK Limited (Swindon, RU). El producto farmacéutico, al que se hace referencia como IMP a lo largo de este documento, será suministrado por el Patrocinador de este ensayo, la Universidad de Stanford, a través de un contrato de almacenamiento y distribución con Fisher BioServices.

Detalles de la administración de Hu5F9-G5

[0125] Cálculo de la dosis. La dosis individual se calcula utilizando el peso corporal real del paciente en el momento de la inscripción (utilizando el peso obtenido en la selección o el día 1), y la dosis puede permanecer constante durante todo el estudio a menos que se observe un cambio de peso superior al 10 %. Se debe usar la siguiente fórmula para calcular el volumen de Hu5F9-G4 de los viales que contienen 20 mg/ml (200 mg en total de Hu5F9-G4 por vial) necesarios para cada administración:

Peso corporal (kg) x Dosificación deseada (mg / kg) = Volumen de Hu5F9-G4 (ml) 20 mg / ml

[0126] Para la Parte A: Para pacientes con aumento de dosis requiriendo una dosis de 1 mg/kg o menos, Hu5F9-G4 se administrará como una infusión i.v. continua en 250 ml durante 60 minutos (± 10 minutos). Todas las demás infusiones para dosis superiores a 1 mg/kg se administrarán en 500 ml durante 2 horas (± 10 minutos).

[0127] Para las Partes B y C: la dosis de preparación es la primera dosis que recibirán los pacientes de las Partes B y C y se determinó que era de 1 mg/kg al finalizar la Parte A. Los EAG y los EA atribuidos a la dosis de preparación continuarán siendo monitoreados de cerca por la CTMC con reuniones para convocar regularmente o con mayor frecuencia según sea necesario (según el estatuto de la CTMC). Para los sujetos de las Partes B y C, la duración de la infusión de la dosis inicial, es decir, 1 mg/kg, será de tres horas. En la Parte B, las dosis de mantenimiento se administrarán a partir del Día 8, una semana después de completar la dosis de preparación. La duración de la infusión de las dosis de mantenimiento será de dos horas para dosis superiores a 1 mg/kg. En la Parte C, las dosis de carga se administrarán a partir del Día 8, una semana después de completar la dosis de preparación, y las dosis de mantenimiento se administrarán a partir del Día 29. La duración de la infusión de las dosis de carga y mantenimiento será de dos horas para dosis superiores a 1 mg/kg.

[0128] Los pacientes en las Partes B y C con retraso de la dosis o suspensión del fármaco de 2 semanas o más serán recebados, en cuyo caso se administrará la dosis de cebado de 1 mg/kg durante tres horas antes de la reanudación de la dosis de tratamiento de mantenimiento asignada; para los pacientes de la Parte A, la duración de la infusión de recebado será de una hora según el protocolo. Hu5F9-G4 NO debe administrarse como inyección en bolo.

[0129] Se permitirán ajustes al programa de dosificación para la toxicidad relacionada con el tratamiento de la siguiente manera: No se aceptan retrasos en el tratamiento durante las primeras cuatro semanas de tratamiento. A partir de entonces, el tratamiento se puede retrasar hasta tres semanas para dar tiempo suficiente a la recuperación de las toxicidades no relacionadas con el tratamiento DLT. Los pacientes que desarrollen anemia de Grado 2 pueden tener un retraso en el tratamiento de hasta tres semanas a partir de la semana 5 para permitir la recuperación de la anemia al Grado 1. Sin embargo, cualquier DLT requerirá la eliminación del paciente del estudio. Los retrasos en el tratamiento de más de tres semanas (como por una condición médica no relacionada con recuperación esperada) deben ser aprobados por CTMC. Además, se permitirán vacaciones de medicamentos de hasta 2 semanas después del día 57 a discreción del investigador y con la aprobación por escrito del Patrocinador. "Drogas de vacaciones" se define como unas vacaciones del tratamiento, las evaluaciones y los procedimientos especificados en el protocolo. Debe haber un mínimo de 6 días entre las infusiones de Hu5F9-G4 en las Partes A y B y un mínimo de 3 días entre las infusiones de Hu5F9-G4 administradas por infusiones dos veces por semana. Los pacientes en las Partes B y C con un retraso en el tratamiento o vacaciones de 2 semanas o más deben ser "reiniciados" recibiendo la dosis inicial de 1 mg/kg i.v. durante tres horas nuevamente antes de reanudar la dosis de tratamiento de mantenimiento asignada; para los pacientes de la Parte A, la duración de la infusión de recebado será de una hora según el protocolo.

Ensayo de ocupación del receptor

[0130] Se extraerán muestras de ocupación del receptor según el programa de evaluaciones. Los glóbulos se analizarán mediante citometría de flujo para determinar la ocupación del receptor CD47 en las fracciones de glóbulos blancos y glóbulos rojos. La muestra inicial (Día 1) de cada paciente, recolectada antes de la primera incubación del anticuerpo Hu5F9-G4, se incubará con concentraciones crecientes de anticuerpo Hu5F9-G4 para establecer una curva estándar para la ocupación del receptor/molécula CD47. Además, la expresión de fosfatidilserina en glóbulos rojos puede evaluarse mediante la expresión de anexina V al inicio (día 1) y el día 8, que puede completarse como un aspecto adicional del ensayo de ocupación del receptor sin extracciones de sangre adicionales.

[0131] La ocupación del receptor CD47 se determinará en células cancerosas primarias mediante citometría de flujo o inmunofluorescencia en muestras obtenidas de derrames malignos o biopsias de tejido, cuando estén disponibles.

[0132] Los cambios en la composición del compartimento de células inmunitarias en los tumores se determinarán en biopsias tumorales recogidas antes y después del tratamiento, cuando estén disponibles.

[0133] Asociación de mutaciones de cáncer somático con respuesta a Hu5F9-G4. Por ejemplo, los tumores colorrectales, de pulmón y de cabeza y cuello pueden analizarse en busca de mutaciones en KRAS, BRAF, NRAS y/o PIK3CA.

[0134] Respuesta al tratamiento con Hu5F9-G4 para pacientes de estudio individuales que utilizan ensayos in vitro y estudios de ratón de xenotrasplante.

[0135] Evaluación de la resistencia potencial a Hu5F9-G4 y exploración de estrategias alternativas de bloqueo de CD47 para superar la resistencia (p. ej., proteínas de fusión SIRP-alfa Fc de alta afinidad).

[0136] Evaluación de frotis de sangre periférica: los frotis periféricos se evaluarán para determinar la presencia de hemaglutinación además de la evaluación de la morfología celular estándar. Estos laboratorios deben dibujarse en el brazo contralateral a la infusión del fármaco, si es posible. Durante las primeras 2 semanas de tratamiento en las Partes A y B, los frotis periféricos se realizarán los Días 1 y 8 antes de la dosis y 4 horas después del final de cada infusión de IMP (± 30 minutos), los Días 2 y 9 a las 24 horas. después de la infusión IMP (± 4 horas), los días 4 y 11 en el punto de tiempo de 72 horas (± 24 horas). En la Parte A, después de la semana 2, los frotis periféricos se realizarán antes de la dosis el día 15 y posteriormente, a discreción del investigador. En la Parte B, después de la semana 2, los frotis periféricos también se realizarán antes de la dosis los días 15 y 22, pero para D15, los frotis periféricos también se realizarán 4 horas después del final de la infusión (± 30 minutos). Para los días 29 y siguientes, se realizarán frotis periféricos a discreción del investigador y en la visita de finalización del estudio. En la Parte C, los frotis periféricos se realizarán los Días 1 y 8 antes de la dosis y 4 horas después del final de la infusión de IMP (± 30 minutos), los Días 2 y 9 a las 24 horas posteriores a la infusión de IMP (± 4 horas), Día 4 en el punto de tiempo de 72 horas (± 24 horas), y también se realizará antes de la dosis y 4 horas después del final de la infusión de IMP (± 30 minutos) en los días 11, 15, 18, 22, 25 y 29. Para los días 30 y posteriores, se realizarán frotis periféricos a discreción del investigador y en la visita de finalización del estudio. Para los pacientes que se someten a una transfusión de sangre, se realizarán frotis periféricos antes de la transfusión de sangre y nuevamente 4 horas (± 30 minutos) después de completar la transfusión.

Análisis farmacocinéticos

[0137] El conjunto de análisis de seguridad se incluirá en las poblaciones para PK, ocupación del receptor CD47, inmunogenicidad y biomarcadores exploratorios si los datos están disponibles para el análisis. Además, la población PK requiere suficientes datos de concentración medibles para la estimación de los parámetros PK, mientras que la población de concentración PK incluirá a todos los pacientes con cualquier concentración medible de Hu5F9-G4. La inclusión de pacientes con infracciones del protocolo se evaluará paciente por paciente para su inclusión en la población farmacocinética antes del análisis. Los datos de concentración versus tiempo serán resumidos de forma descriptiva, incluyendo N, Media, DE, Media Geométrica, Mediana, Min, Max y % CV. Se presentarán gráficamente las curvas de concentración de Hu5F9-G4 individual y media frente al tiempo. Los parámetros farmacocinéticos que se calcularán utilizando métodos no compartimentales incluyen los siguientes: Cmax, Tmax, t1/2, área bajo la curva de tiempo de concentración sérica desde el tiempo cero hasta la última concentración medible (AUCo-t), AUC desde el tiempo cero hasta el infinito (AUCü-~), aclaramiento (CL) y volumen de distribución (Vss, Vz). Todos los parámetros farmacocinéticos, incluida la exposición (Cmax, AUC) a Hu-5F9-G4, se resumirán para pacientes individuales y por cohortes de dosis. Se pueden realizar análisis exploratorios para evaluar la relación entre uno o más parámetros farmacocinéticos y medidas seleccionadas de seguridad y eficacia (por ejemplo, hemoglobina, reticulocitosis, saturación del receptor por citometría de flujo o inmunogenicidad).

Evaluaciones de inmunogenicidad

[0138] La tasa y la magnitud de la positividad del anticuerpo anti-Hu5F9-G4 se evaluarán para pacientes individuales, para cada Parte A, B, C/nivel de dosis, y para la población de pacientes agrupada. Se pueden realizar evaluaciones exploratorias para determinar la relación entre la positividad del ensayo de inmunogenicidad y uno o más parámetros de seguridad, farmacocinética o eficacia (por ejemplo, eliminación del fármaco, EA, respuesta tumoral).

Actividad antitumoral

[0139] El análisis de la respuesta tumoral se llevará a cabo para el Conjunto Evaluable para Evaluación Tumoral. Se aplicarán los criterios RECIST v 1.1 o IWG, y la evaluación será por parte del investigador. La proporción de pacientes con RC, PR, SD, enfermedad estable sostenida durante 6 meses (SD6) y PD se calculará en cada momento. La respuesta objetiva se calculará como RC+PR con los intervalos de confianza del 95 % para cada parte A, B, C/nivel de dosis y se tabulará el total para cada punto de tiempo de medición. La proporción de pacientes definidos que lograron un beneficio clínico se calculará como RC+PR+SD6 con intervalos de confianza del 95 %. También se evaluará la mejor respuesta general. La duración de la respuesta se calculará desde el momento en que se identificó por primera vez la respuesta inicial hasta el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. La progresión se evalúa en relación con la medida tumoral más pequeña. Los detalles con respecto al análisis de la actividad antitumoral se especificarán en el PAE.

[0140] En resumen, en base a los resultados de los estudios de toxicología, el programa de evaluación de seguridad no clínica respalda la administración de Hu5F9-G4 (p. ej., como una infusión IV) para un ensayo clínico.

Ejemplo 4

[0141] En ensayos preclínicos, se ha demostrado que un nivel sérico superior a 100 pg/mg es terapéuticamente eficaz. Los datos proporcionados en la figura 9 demuestran una dosis en pacientes humanos que proporciona este nivel de fármaco.

[0142] Como se muestra en la figura 9, cada uno de los gráficos representa una cohorte de dosificación de pacientes humanos con tumores sólidos, tratados con una dosis inicial de 1 mg/kg de 5F9 y las dosis de mantenimiento indicadas. Cada línea muestra el valor medio de la concentración de fármaco libre (Hu5F9-G4) en pg/ml en una muestra de suero, con barras de error para 3 pacientes. Los valores de la siguiente tabla muestran la Cmax media para cada cohorte en la semana 2 y el último AUC muestra cuánto tiempo se han mantenido (horas).

[0143] El eje X de los gráficos representa el tiempo de las muestras con respecto a la dosificación, donde 0 indica la muestra antes de la infusión y el resto son puntos de tiempo por horas después de la infusión.

[0144] La línea marcada Semana 2 representa la curva de concentración después de la primera dosis de mantenimiento a 3, 10 o 20 mg/ml (la semana uno es la dosis inicial). Los datos de la Semana 5 representan los valores después de la cuarta dosis de mantenimiento. El punto más alto de cada curva determina la Cmax y la pendiente de la curva determina el aclaramiento o mantenimiento del fármaco en el suero.

[0145] Los datos de una primera dosis de mantenimiento de 3 mg/kg muestran una eliminación rápida del suero. Esta dosis también se eliminó con bastante rapidez, incluso después de la semana 5 de tratamiento. También se puede señalar que una dosis de 3 mg/kg no alcanza el nivel sérico objetivo de más de 100 pg/ml, incluso como Cmax.

[0146] A una dosis de 10 mg/kg se alcanzó una Cmax de/por encima de 100 pg/ml, pero el nivel no se mantuvo pero no se mantiene bien por encima de 100 pg/ml con el aclaramiento observado después de la dosis de la semana 2. La dosis de 10 mg/kg proporciona un nivel más sostenido en la semana 5, lo que puede atribuirse a la saturación del sumidero de CD47 con el programa de dosificación repetida.

[0147] Con una dosis de mantenimiento de 20 mg/kg, los niveles séricos sostenidos por encima del nivel objetivo de 100 pg/ml podrían lograrse con la primera dosis de mantenimiento (semana 2). Como se muestra en la figura 9, la curva es plana, casi horizontal.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente anti-CD47 para usar en un método para tratar el cáncer en un sujeto humano, comprendiendo el método:

(i) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLI

YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCFQGSHVPYTFG

GGTKVEIK,

y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWIG

TIYPGNDDTSYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGG

YRAMDYWGQGTLVTVSS;

o

(ii) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLI

YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFG

QGTKLEIK,

y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHVWRQAPGQRLEWM

GTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARG

GYRAMDYWGQGTLVTVSS;

o

(iii) el dominio VL del anticuerpo tiene la secuencia:

DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLI

YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCFQGSHVPYTFG

QGTKLEIK,

y el dominio VH del anticuerpo tiene la secuencia:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHVWRQAPGQRLEWIG

TIYPGNDDTSYNQKFKDRATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGG

YRAMDYWGQGTLVTVSS.

2. El agente anti-CD47 para uso de la reivindicación 1, que comprende además después del paso (a) y antes del paso (b): un paso para determinar si la administración de la dosis de cebado fue efectiva.

3. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 2, en donde el paso de determinación comprende realizar un recuento de reticulocitos, en donde se determina que la administración del agente iniciador ha sido eficaz si (a) el recuento de reticulocitos es de 100 X 109 reticulocitos por l a 1000 X 109 reticulocitos por l,

(b) el porcentaje de reticulocitos en la sangre es superior al 1,5 %, o

(c) el índice de reticulocitos es superior al 2 %.

4. El agente anti-CD47 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el cáncer es un linfoma.

5. El agente anti-CD47 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde se determina que la dosis de cebado satura al menos el 50 % de los sitios CD47 de los glóbulos rojos.

6. El agente anti-CD47 para uso de la reivindicación 5, en donde la dosis se determina mediante un ensayo de ocupación del receptor, en donde después de la administración de una dosis de agente anti-CD47 no marcado al sujeto, se obtiene una muestra de sangre y se combina con una dosis de saturación de anticuerpo anti-CD47 marcado de forma detectable; y determinar el nivel de unión.

7. El agente anti-CD47 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la dosis terapéuticamente efectiva de (b) es suficiente para lograr un nivel circulante de más de 100 gg/ml del agente anti-CD47 durante un período sostenido de tiempo.

8. El agente anti-CD47 para uso de la reivindicación 7, en donde el período de tiempo sostenido es de 1 semana a 2 semanas.

9. El agente anti-CD47 para uso de la reivindicación 7 u 8, en donde la dosis terapéuticamente eficaz es de 10 mg/kg a 25 mg/kg.

10. El agente anti-CD47 para uso de la reivindicación 7 u 8, en donde la dosis terapéuticamente eficaz es de 17,5 mg/kg a 20 mg/kg.

11. El agente anti-CD47 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, donde la dosis terapéuticamente efectiva se administra cada 7 días a cada 14 días.