ES2908041T3 - Uso de inhibidores de MAPK para reducir la pérdida de células madre hematopoyéticas durante el cultivo ex vivo y la manipulación genética - Google Patents
Uso de inhibidores de MAPK para reducir la pérdida de células madre hematopoyéticas durante el cultivo ex vivo y la manipulación genética Download PDFInfo
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Abstract
Un método para preservar la actividad de injerto de células madre hematopoyéticas (HSC) sometidas a una manipulación genética ex vivo, que comprende: i) realizar la manipulación genética ex vivo de las HSC en fase de reposo G0; y ii) cultivar las HSC modificadas genéticamente producidas en la etapa (i) en un medio que contiene un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK).
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de inhibidores de MAPK para reducir la pérdida de células madre hematopoyéticas durante el cultivo ex vivo y la manipulación genética
Antecedentes
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son una población única y rara de células que tienen la capacidad de reconstituir todo el sistema hematopoyético y de autorrenovarse para el mantenimiento de su población. La terapia génica (GT), que implica transferir un gen a las HSC, ofrece una estrategia de tratamiento atractiva para curar los trastornos hematopoyéticos. Sin embargo, la GT requiere la manipulación ex vivo y el cultivo de las HSC resulta en gran medida una gran cantidad de pérdida de HSC a medida que se diferencian en células progenitoras hematopoyéticas (HPC).
Actualmente, el número de HSC humanas que se repueblan después de los trasplantes autólogos es una limitación importante para la transferencia génica eficaz. Por lo tanto, a menudo se requiere un condicionamiento mieloablativo para destruir las HSC residentes, lo que brinda una ventaja de injerto al número limitado de HSC manipuladas genéticamente después de la manipulación ex vivo.
Falta un buen modelo experimental de HSC humanas que no sean modelos de primates no humanos, que tienen limitaciones con respecto a la disponibilidad, la cantidad de animales que pueden trasplantarse y los altos costos. Los ratones inmunodeficientes, específicamente los NOD/SCID/IL-2Rgnull (ratones NSG), pueden injertar de manera robusta CD34+ HSC/P humano, dando lugar a una progenie de células B, mieloides y T, y se han usado para estudiar la hematopoyesis humana in vivo. Sin embargo, la mayoría de los estudios en ratones NSG usan sangre de cordón umbilical CD34+ HSC/P que se injertan fácilmente pero no imitan la cinética o el injerto de HSC/P derivado de la médula ósea (BM) o la sangre periférica movilizada (MPB). Estos últimos se usan principalmente para la terapia génica.
Por lo tanto, el desarrollo de un modelo robusto de injerto de HSC humano (no HPC) que pueda usarse para probar el mantenimiento de HSC durante la manipulación ex vivo hará avanzar en gran medida el campo de la terapia génica.
Resumen
La presente descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que la inhibición de la activación de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK) en células madre, por ejemplo, mediante el uso de un inhibidor de MAPK p38 como doramapimod, redujo con éxito la pérdida de las células madre durante el cultivo in vitro o ex vivo en donde las células madre se sometieron a manipulaciones genéticas que inducen una ruptura de la doble cadena de ADN, como la integración del vector, aumentando de esta manera el injerto de las células madre cultivadas in vivo.
La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En consecuencia, un aspecto de la presente descripción presenta un método para preparar células madre tales como células madre hematopoyéticas (HSC) que tienen actividad de injerto mejorada. El método comprende el cultivo de células madre (por ejemplo., HSC) que se sometieron a una manipulación genética en un medio de cultivo que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de p38 MAPK. La manipulación genética induce una ruptura de la doble cadena de ADN en las células madre. Por ejemplo, las células madre que son susceptibles a los métodos descritos en la presente descripción pueden ser células madre no cíclicas o que no se dividen (células en reposo). En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para preparar células madre humanas tales como células madre hematopoyéticas (HSC) que tienen capacidad de injerto mejorada, comprendiendo el método: cultivar células madre adultas humanas (por ejemplo, HSC adultas humanas) en un medio que comprende un cantidad eficaz de un inhibidor de p38 MAPk . En algunos ejemplos, las células madre adultas humanas (por ejemplo, HSC adultas humanas) son células madre adultas humanas no cíclicas o que no se dividen.
Cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción comprende, antes de la etapa de cultivo, manipular genéticamente las células madre. La manipulación genética puede comprender transducir las células madre con un vector de integración o realizar la edición del genoma en las células madre. La edición del genoma puede implicar el uso de, por ejemplo, pero sin limitarse a, sistemas CRISPR-Cas9, nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y/o nucleasas basadas en efectores similares a activadores de transcripción (TALEN). La manipulación genética se realiza antes de un ciclo de división celular, más particularmente en la fase G0 de reposo. Los ejemplos de un vector de integración incluyen, pero no se limitan a, vectores virales tales como vectores lentivirales y vectores retrovirales.
Las HSC que se cultivaron en presencia de un inhibidor de MAPK p38 son útiles para administrar o trasplantar a un sujeto que lo necesite. Las hSc pueden cultivarse durante 1 a 7 días antes de su administración o trasplante al sujeto.
Las HSC son útiles en un método para tratar un trastorno hematopoyético en un sujeto que necesita el tratamiento. El método comprende: (a) proporcionar HSC que se manipularon genéticamente y cultivaron en un medio que comprende una cantidad eficaz de p38 durante al menos 24 horas o más, (b) trasplantar una primera población de HSC al sujeto después de (a), y opcionalmente (c) trasplantar una segunda población de HSC al sujeto después de (b).
En cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, las células madre (por ejemplo, HSC) pueden derivarse de la médula ósea, células de sangre periférica y/o sangre del cordón umbilical de una fuente adecuada (por ejemplo, humana). Las células madre (por ejemplo, HSC) pueden ser células madre alogénicas (por ejemplo, HSC) o células madre autólogas (por ejemplo, HSC).
En cualquiera de los aspectos descritos en la presente descripción, el inhibidor de MAPK p38 puede ser una proteína, un ácido nucleico, una molécula pequeña o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, el inhibidor de MAPK p38 puede ser un agente bloqueador de MAPK p38 (por ejemplo, una molécula pequeña que se une a p38-a y bloquea la señalización de MAPK p38). Los ejemplos de inhibidores de MAPK p39 incluyen, pero no se limitan a, doramapimod (por ejemplo, BIRB-796), ralimetinib (por ejemplo, dimesilato de LY2228820), inhibidores de MAPK p38 basados en aminopiridina competitivos con ATP (por ejemplo, Vx702), inhibidores de piridinil imidazol (por ejemplo, SB203580), y cualquiera de sus combinaciones.
En cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, la cantidad del inhibidor de MAPK p38 puede ser eficaz para aumentar la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase de reposo G0 y para disminuir la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase S-G2-M antes del primer ciclo de división celular (por ejemplo, 24 horas); para retrasar la transición de las células madre de la fase de reposo G0 a la fase S; para reducir la pérdida de potencial de repoblación a largo plazo (LTRP) en las células madre; para reducir el fenotipo de sesgo mieloide en las células madre; y/o promover el injerto de las HSC trasplantadas al sujeto.
En cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el sujeto puede ser un sujeto humano. En algunas modalidades, el sujeto es un paciente humano que tiene un trastorno hematopoyético.
En algunas modalidades, las HSC pueden ser HSC adultas humanas, que pueden obtenerse de la médula ósea o de células sanguíneas periféricas de un sujeto humano. Las HSC se cultivan ex vivo antes de la etapa (ii). Las HSC se someten a una manipulación genética que induce una rotura de la doble cadena de ADN en el cultivo ex vivo. La manipulación genética puede ser la transducción de un vector de integración, por ejemplo, un vector viral tal como un vector retroviral o un vector lentiviral. Cuando las HSC se transducen por un vector lentiviral, las HSC pueden trasplantarse al animal después de 18-96 horas del cultivo ex vivo. Cuando las HSC se transducen por un vector retroviral, las HSC pueden trasplantarse al animal después de 72-96 horas del cultivo ex vivo. La manipulación genética puede comprender realizar la edición del genoma en las células madre, por ejemplo, mediante el uso cualquier método conocido en la técnica, incluidos, por ejemplo, sistemas CRISPR-Cas9, nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y/o nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN).
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el posible destino de las células madre hematopoyéticas. El panel A es un esquema que ilustra que las células CD34+ humanas comprenden el tronco hematopoyético y el compartimento progenitor, que incluye células madre hematopoyéticas (HSC) y células progenitoras hematopoyéticas (HPC). La decisión del destino de las HSC es autorrenovarse o comprometerse con la diferenciación en HPC. El panel B muestra la hipótesis de que la manipulación genética altera el destino de las HSC a las HPC.
Figura 2 Un modelo preclínico para estudiar la manipulación ex vivo y la transferencia de genes de HSC humanas adultas y su efecto en LTRP. (Panel A) Para el estudio se utilizaron células CD34+ derivadas de sangre periférica movilizada (MPB) recién aisladas o descongeladas. Se utilizaron dos protocolos diferentes para el estudio en el que se realizó la transferencia de genes mediada por lentivirus (LV) o Y-Retrovirus (RV) en los puntos de tiempo indicados. 0 h, 18-24 h, 36-42 h y 72-96 h indican la cantidad total de tiempo en el que las células estuvieron expuestas en el cultivo ex vivo después del aislamiento de CD34 antes de la inyección en ratones NSG. (Panel B) Después del tiempo indicado en cultivo y transducción, se trasplantaron 1 millón de células equivalentes iniciales CD34+ por ratón NSG después de TBI por vía intravenosa (trasplante primario = 1T). Se analizó el injerto humano primario y la reconstitución multilinaje en ratones en los períodos de tiempo indicados después de la recolección de médula ósea a las 6 y 12 semanas (semanas) de los fémures izquierdo y derecho, y después del sacrificio a las 24 semanas, de todos los huesos. Una parte de las células se analizó para FACS y el resto se agotó en células CD45+ de ratón y se trasplantaron una a una, en ratones secundarios (trasplante secundario = 2T).
La Figura 3 muestra que los inhibidores de p38 previenen la pérdida de HSC e incluso pueden retener HSC a través de la división celular durante el cultivo ex vivo. Cuatro inhibidores de p38 diferentes aumentan el porcentaje de hHSC ex vivo en estudios de cultivo de hasta 72 horas.
La Figura 4 muestra que BIRB-796 reduce significativamente p-p38 en hHSC en cultivos ex vivo (panel A). El panel B muestra un análisis del porcentaje de hHSC en células CD34+ cultivadas en el intervalo de tiempo indicado con o sin BIRB-796. Los paneles C y D muestran que el inhibidor de p38 BIRB-796 pareció aumentar las HSC humanas in vitro, a concentraciones de 400, 600 y 800 nm.
La Figura 5 muestra que la inhibición de p38 aumenta significativamente el injerto humano en ratones con trasplante primarios y también aumenta el número de ratones 2T con injerto de células humanas. Panel A: injerto de células hCD45+ en médula ósea de ratones 1T a las 24 semanas después del trasplante de células hCD34+ cultivadas con o sin el inhibidor de p38 Birb796. Panel B: el número de ratones 2T injertados (>0,01 % de células hCD45+ en BM) se muestra encima de la barra central y los no injertados debajo. Cada símbolo representa un ratón y se indican los números totales. 9 = control, B = BIRB-796, 0, 24, 36 y 72 indican horas de cultivo ex vivo mientras se transduce con el vector Lentivirus (LV) o Retrovirus (RV) que codifica GFP.
La Figura 6 muestra un modelo de xenoinjerto humano de células madre hematopoyéticas adultas. Células CD34+ derivadas de MPB humana recién aisladas (1 millón de células CD34+ /ratón) se transdujeron con un vector de lentivirus en 24 horas y se inyectaron por vía intravenosa en ratones NSG letalmente irradiados. Se analizó el injerto humano primario en ratones a las 6 semanas, tanto en médula ósea (BM) (Panel A) como en sangre periférica (PB) (Panel B). Cada símbolo representa un ratón individual y se representa como media ± SEM (Los datos son representativos de BM: 0 h n=13, 18-24 h n=14, 36-42 h n=15; p B: 0 h n=6, 18-24 h n=7, 36-42 h n=8 ratones). Panel C: A las 6, 12 y 24 semanas después del trasplante primario (1T), se analizó la BM para las diferentes poblaciones de células humanas mediante citometría de flujo. Las gráficas FACS representativas muestran las células CD45+ humanas totales (CD45+) seguidas de la selección de células GFP+ (transducidas) frente a las células GFP-(no transducidas). De las poblaciones CD45+ humanas GFP- y GFP+, se analizaron células mieloides CD33+ humanas, células linfoides B CD19+ y linfoides T CD3+ humanas y HSPC CD34+ humanas, que eran negativas para CD19. El gráfico FACS a partir de la semana 24 después de 1T se muestra en el Panel C. El porcentaje de injerto multilinaje analizado a las 6, 12 y 24 semanas después del trasplante primario (1T) de células CD34+ derivadas de MPB no cultivadas se muestra en el Panel D, representado como la media± SEM Los datos son representativos de 6 semanas n=20, 12 semanas n=12, 24 semanas n=10 ratones).
La Figura 7 muestra el marcado de GFP in vitro e in vivo. Se cultivaron células MPB CD34+ humanas y se transdujeron con el LV o el RV durante las horas indicadas como se describe en la Figura 2 (Panel A), y las células unitarias formadoras de colonias (CFUc) se sembraron en una pequeña proporción de células CD34+, mientras que el resto (1 millón de equivalentes iniciales) se trasplantaron IV en ratones NSG. La BM se aspiró a las 6 y 12 semanas de los fémures derecho e izquierdo, y los ratones se sacrificaron a las 24 semanas; se analizó la BM para células GFP+ hCD45+ a las 6, 12 y 24 semanas (durante 18-24 h n=20, durante 36-42 h n=9 y durante 72-96 h n=7 para el total de 36 ratones; datos presentados como media ± SEM).
La Figura 8 muestra la manipulación ex vivo y la transferencia génica en HSPC MPB CD34+ humanas durante más de 24 h que dan como resultado una pérdida significativa de LTRP y una progenie modificada genéticamente con sesgo mieloide. Panel A: Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humana recién aisladas o descongeladas y se transdujeron con el vector de lentivirus (LV) o el vector de Y-retrovirus (RV) durante las horas indicadas. Se inyectó una entrada equivalente a un millón de células CD34+ por ratón NSG irradiado. Se muestra el porcentaje de células CD45+ humanas en BM de ratones NSG primarios en los puntos de tiempo indicados. El eje x indica el número de semanas después del trasplante primario (1T). Los datos son representativos de: simulación para 0 h n=10, para 18-24 h n=20, para 36-42 h n=9, para 72-96 h n=19 ratones. Panel B: Las células humanas totales en BM de ratones NSG primarios se trasplantaron una a una en ratones secundarios irradiados. Se muestra el injerto humano en la médula ósea (eje Y) 6 semanas después del trasplante secundario (2T) (simulación para 0 h n=7, para 18-24 h n=5, para 36-42 h n=14, para 72-96 h n=14, para el total de 40 ratones. La reconstitución multilinaje se analizó 24 semanas después de 1T. Se muestra tanto la población mieloide CD33+ humana no transducida (GFP') como la transducida (GFP+) (Paneles C y D), la población B-Linfoide CD19+ humana (Panel E, Panel F), T-Linfoide CD3+ humana (Paneles G y H), y HSPC CD34+ humana (Paneles I y J) (n=17-22 por condición). Los datos se expresaron como la media ± SEM. Estadísticas: prueba U de Mann Whitney, **** P<0,0001, *** P<0,001, **P<0,01,*P<0,05.
La Figura 9 muestra el injerto de múltiples linajes de células hCD34+ derivadas de MPB manipuladas y cultivadas ex vivo en ratones NSG. Células MPB CD34+ humanas se cultivaron durante las horas indicadas (ejes X) y se transdujeron con el vector de lentivirus (LV) o el vector de Y-retrovirus (RV) que codifica la proteína fluorescente verde mejorada (GFP) como marcador de células transducidas; a partir de entonces, se inyectó una entrada equivalente a un millón de células CD34+ por ratón NSG irradiado (280cGy). Se analizó la médula ósea para la reconstitución de múltiples linajes a las 6 semanas (Paneles A, C, E y G) y 12 semanas (Paneles B, D, F y H) después del trasplante primario. Se muestra tanto la población mieloide CD33+ humana no transducida (GFP-) como la transducida (GFP+) (Paneles A y B), la población B-Linfoide CD19+ humana (Paneles C y D), T-Linfoide CD3+ humana (Paneles E y F), y HSPC CD34+ humana (paneles G y H) (los datos son representativos de 0 h n=12, 18-24 h n=7, 36-42 h n=11, 72-96 h n=20, para el total de
50 NSG ratones). Los datos se expresaron como la media ± SEM. Estadísticas: prueba de Mann Whitney, ** P<0,01.
La Figura 10 muestra que los vectores tanto lentivirales (LV) como retrovirales (RV) transducen células progenitoras hematopoyéticas humanas (HPC) y células madre hematopoyéticas (HSC) de manera comparable. Gráfico representativo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que muestra la expresión del marcador de la proteína fluorescente verde (GFP) en varios subconjuntos de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) después de la transducción de LV durante 42 horas (Panel A), en células madre/progenitoras hematopoyéticas CD34+ humanas (HSPC) versus HSC CD34+ 38- 90+ 45RA-49f+ después de la transducción de LV o RV durante 72 horas (izquierda) y la cuantificación (derecha) (Panel B) (n=3 experimentos independientes) y en MPP versus HSC después de la transducción de LV (Panel C) o RV (Panel D) durante 72 horas junto con la cuantificación de los respectivos grupos (Paneles E y F). Se muestra el gráfico de barras con la media ± SEM de la transducción de LV (Panel E) o la transducción de RV (Panel F) (n=3 experimentos independientes).
La Figura 11 muestra que la manipulación ex vivo no se asocia con una viabilidad reducida o apoptosis de las HSC, sino con un aumento de las HSC fenotípicas con ROS mayores; la reducción de ROS disminuye la transferencia de genes. Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humana y se transdujeron con lentivirus (LV) o retrovirus (RV) durante los puntos de tiempo indicados. Panel A: La viabilidad celular total después de la recolección se determinó mediante el método de exclusión con azul de tripano. Panel B: Células CD34+ 38- 90+ Anexina V+ (apoptóticas) después de que el cultivo ex vivo se detectara por citometría de flujo. Panel C: Se calculó el aumento de veces en HSC humanas fenotípicas (células CD34+ 38- 90+ 45RA-49f+) después del análisis de citometría de flujo (n=3). Estadística: prueba t de Student, *p<0,05. Panel D: Estado de proliferación de HSPC CD34+ humanas frente a la población CD34+ 38- 90+ enriquecida con HSC durante el cultivo ex vivo determinado por la proporción de las HSPC y HSC EdU+ en el ensayo de incorporación de EdU (n=3). Panel E: Los niveles de ROS intracelulares se determinaron mediante el uso de fluorescencia CM-H2DCFDA; el cambio de veces en MFI de DCFDA en células CD34+ 38- 90+ humanas transducidas en LV y RV se muestra como la media de ± SEM (n=3). Estadística: prueba t de Student, *p<0,05. Panel F: Histogramas representativos que muestran MitoSOX para la medición de ROS mitocondriales específicos en células humanas CD34+ 38- 90+ cultivadas durante 24 horas frente a 72 horas. Los números representan la MFI. Panel G: Gráficos de histograma que muestran los niveles de MitoSOX con dosis crecientes del antioxidante N-acetilcisteína amida (NACA) y Pane1H: porcentaje correspondiente de células CFP+ CD34+ 38- 90+ medidas por citometría de flujo.
La Figura 12 muestra el aumento en el tiempo en que el cultivo activa MAPK p38 en HSC. Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humano y se transdujeron como se describe en la Figura 7. Gráficos de histogramas representativos que muestran los niveles por citometría de flujo de fosfo-ERK (p-ERK) (Panel A), fosfo-JNK (p-JNK) (Panel B) y fosfo-p38MAPK (p-p38) (Panel C) en la población enriquecida con HSc CD34+ 38' 90+ humanas. Se muestra el cambio de veces cuantitativo en la intensidad fluorescente media (MFI) de p-ERK (Panel D), p-JNK (Panel E) y p-p38 (Panel F) en los tiempos indicados. Los datos se expresan como la media ± SEM de 3 experimentos independientes mediante el uso tres donantes de MPB diferentes. Estadística: prueba t de Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. (Paneles G y H). Gráfico de histograma representativo del nivel de p-p38 en poblaciones enriquecidas con HSC no cíclicas (en la fase GO-G1 del ciclo celular) versus células enriquecidas con HSC cíclicas (en la fase S-G2-M del ciclo celular, determinado por tinción con Hoechst 33342). Los números indican la MFI. Paneles I y J: El cambio de veces cuantitativo en p-p38 MFI en células enriquecidas con HSC cíclicas frente a no cíclicas (Panel I) y no transducidas (GFP) frente a transducidas (GFP+) de 3 experimentos independientes se muestra como la media ± SEM. Estadística: prueba t de Student, *p<0,05. Panel K: Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humana con o sin varios inhibidores de p38 (B= BIRB-796, Vx= VX 745 y Ly= Ly2228820) y se transdujeron con retrovirus (RV) durante 72 horas. Se muestran gráficos de histogramas representativos de los niveles de pp38 en células CD34+ 38‘ 90+ humanas. Panel I: Se muestra el cambio de veces cuantitativo en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de p-p38 en células CD34+ 38‘ 90+ humanas en comparación con células no manipuladas (Panel H). Los datos se expresan como la media ± SEM de 5 experimentos independientes mediante el uso de 5 donantes de MPB diferentes. Estadística: prueba t de Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 13 muestra que la inhibición de p38MAPK durante el cultivo ex vivo rescata el potencial de repoblación a largo plazo (LTRP) de las HSC y revierte parcialmente el fenotipo de sesgo mieloide. Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humana frescas o descongeladas y se transdujeron con lentivirus (LV) o retrovirus (RV) que expresan GFP durante los puntos de tiempo indicados. Se recolectaron las células y se detectó la fosfo-p38MAPK mediante citometría de flujo. Panel A: Gráfico de histograma representativo de p-p38 (el número representa la intensidad de fluorescencia media (MFI). Panel B: Cambio de veces de MFI de MAPK p-p38 (± SEM) en células CD34+ 38‘ 90+ 45RA’ 49f+ humanas con o sin inhibidor de p38 (p38i). Panel C: Injerto de CD45+ humano en ratones NSG con (barras rayadas) o sin inhibidor de p38 (barras sólidas) después de 24 semanas de trasplante primario. Panel D: Injerto humano en ratones NSG con o sin p38i después de 6 semanas de trasplante secundario. Se muestran como porcentaje los ratones injertados (>0,01 % de células CD45+ en toda la médula ósea) sobre el total de ratones con trasplante. Se muestran la reconstitución con o sin p38i (Paneles E, G e I): GFP- no transducida; (Paneles F, H y J): GFP+ transducidas de las células mieloide CD33+ humanas (Paneles E y F), células linfoides B CD19+ humanas (Paneles G y H) y células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas CD34+ (HSPC) (Paneles I y J) en ratones con
trasplante primario 24 semanas después del trasplante. Los datos se expresan como la media ± SEM de 5 experimentos independientes (n = 12-21 ratones por grupo). Estadística: prueba t de Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 14 muestra la inhibición de p38MAPK durante el cultivo ex vivo que retiene el injerto humano en los ratones NSG de trasplante secundario. Injerto humano en ratones NSG con o sin BIRB-796 después de 6 semanas de trasplante secundario. Se muestran los ratones injertados (>0,01 % de células CD45+ en toda la médula ósea) encima de la barra central, el número total de ratones injertados se muestra en el lateral. Los triángulos vacíos son de control y los triángulos llenos se tratan con BIRB-796. Cada símbolo representa un ratón individual. Los datos se expresan como la media ± SEM de 5 experimentos independientes (n=7-29 ratones por grupo). Estadística: prueba t de Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 15 muestra el marcaje en la médula ósea de ratones NSG. Se cultivaron células CD34+ humanas como se describe en la Figura 13 y se trasplantaron a ratones NSG. Las células GFP+ totales se analizaron in vitro antes del trasplante (Panel A) e in vivo a las 6 semanas (Panel B) y 24 semanas después (Panel C) del trasplante primario. En el Panel A, 18-24 horas no fue tiempo suficiente para medir la expresión de GFP y, por lo tanto, no se muestra. Los datos se expresan como la media ± SEM de 5 experimentos independientes (n = 12-21 ratones por grupo). Estadística: prueba t de Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 16 muestra que la inhibición de p38 no cambia el número/viabilidad, la apoptosis y el nivel de ROS total de células CD34+, pero puede retener el porcentaje de HSC fenotípicas. Las células CD34+ humanas se cultivaron y transdujeron como se describe en la Figura 13, panel A. Las células recolectadas se tiñeron con azul de tripano para determinar la viabilidad, se muestra el número total de células CD34+ (Panel A), el cambio de veces en el porcentaje de CD34+ 38' 90+ 45RA’ 49f+ humanas (HSC) (Panel B), el porcentaje de células anexina V+ (apoptótica) CD34+ 38‘ 90+ (Panel C), el cambio de veces en la eficiencia de transducción (basado en el porcentaje del marcador GFP) sobre células CD34+ 38‘ 90+ no tratadas (Panel D) y el cambio de veces en MitoSOX MFI en células CD34+ 38‘ 90+ (Panel E). Los datos representan la media ± SEM. Estadística: prueba t de Student, **0,01>p, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 17 muestra que la inhibición de p38MAPK reduce la respuesta al daño del ADN (DDR) y retiene las HSC en la fase de reposo G0 durante el período de tiempo temprano del cultivo ex vivo. Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humana y se transdujeron con lentivirus (LV) o retrovirus (RV) durante los puntos de tiempo indicados. Imágenes representativas de inmunofluorescencia de la población CD34+ 38‘ 90+ humana clasificada tratada con o sin p38i durante 72 horas teñida con anti-YH2AX y 53BP1 (Panel A) y cuantificación de Y-H2AX (Panel B) y 53BP1 (Panel C) MFI/ célula. Panel D: Gráfico de histograma representativo del análisis por citometría de flujo de células CD34+ 38‘ 90+enriquecidas con HSC teñidas para Y-H2AX con o sin inhibidor de p38 (p38i) y cuantificación del cambio de veces en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de Y-H2AX en las HSC (Panel E) y porcentaje de células GH2AX+ (Panel F) en el período de tiempo indicado. El porcentaje que se muestra en los histogramas son células positivas para YH2AX y los números a continuación son la intensidad de fluorescencia media (MFI) (n=5 experimentos independientes). Gráfico FACS que representa las HSC en las fases G0 (reposo), G1 y S-G2-M del ciclo celular con o sin p38i (Panel G) y cuantificación (Panel H) de la población enriquecida con HSC en diferentes fases del ciclo celular en el momento indicado de cultivo ex vivo. El porcentaje (± SEM) de las HSC K¡67‘ (G0) y Ki67+ (G1-S-G2-M) se representa en el eje y. (n=4 experimentos independientes para 24 h LV y n=5 experimentos independientes para 42 h LV y 72h RV)). Estadística: prueba t de Student pareada, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 18 muestra que la inhibición de p38MAPK reduce la respuesta al daño del ADN (DDR) en células CD34+ 38‘ 90+ humanas durante el cultivo ex vivo y la transferencia génica. Se cultivaron células CD34+ derivadas de MPB humana y se transdujeron como se describe en la Figura 17. Panel A: Cuantificación de células Y-H2AX+ CD34+ 38‘ 90+ a las 24, 42 y 72 horas. n= 5-8 experimentos/condición independientes). Panel B: Cuantificación del análisis de inmunofluorescencia para MFI Y-H2AX (izquierda) y 53BP1 (derecha) por célula humana CD34+ 38‘ 90+ clasificada con o sin p38i durante 42 horas. Panel C: Gráfico cuantitativo que representa células CD34+ 38‘ 90+ en fase G0-G1 y S-G2-M del ciclo celular con o sin p38i a las 42 horas de cultivo ex vivo y transducción de lentivirus (LV). (n=6 experimentos/condición independientes). Estadística: prueba t de Student pareada, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Estadística: prueba t de Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La Figura 19 muestra que la inhibición de p38MAPK también reduce la respuesta al daño del ADN (DDR) en células CD34+ 38‘ 90+ humanas derivadas de la médula ósea (BM). Se cultivaron células CD34 derivadas de BM humana y se transdujeron con lentivirus (LV) durante 48 horas. Gráfico FACS representativos que representa la población CD34+ 38‘ 90+ enriquecida con HSC derivada de la médula ósea en las fases G0 (reposo), G1 y S-G2-M del ciclo celular con o sin p38i (izquierda) y el gráfico de histograma representativo correspondiente a yH2AX en el tiempo y tratamiento indicado. El porcentaje que se muestra en el histograma se refiere a las células positivas para yH2AX y los números a continuación son la intensidad de fluorescencia media (MFI).
La Figura 20 muestra células de linaje humano en la médula ósea a lo largo del tiempo. Se necesita una dosis de células CD34+ casi diez veces mayor para un injerto robusto. La cinética del injerto multilinaje es mucho más lenta. Los trasplantes secundarios requieren un injerto multilinaje a largo plazo. El injerto en la sangre no refleja el injerto en la médula ósea.
La Figura 21 muestra que la progenie de hHSC se vuelve mieloide desviada con el aumento del tiempo en cultivo.
La Figura 22 muestra que la manipulación ex vivo aumenta la señalización de estrés de HSC.
Descripción detallada de la invención
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son dianas deseables para la terapia génica para varias enfermedades hematológicas hereditarias que incluyen, por ejemplo, hemoglobinopatías. Sin embargo, la transferencia de genes a las HSC generalmente implica manipulación y cultivo ex vivo, lo da como resultado una gran cantidad de pérdida de HSC con su diferenciación a células progenitoras hematopoyéticas (HPC), lo que hace que estas células sean menos competentes en el injerto in vivo. Actualmente, el número limitado de HSC que se repueblan después del trasplante autólogo es una limitación importante para la transferencia eficaz de genes. Por lo tanto, actualmente se requieren grandes HSC transducidas en el condicionamiento mieloablativo para destruir las HSC residentes para proporcionar una ventaja del injerto. Sin embargo, la fuente de HSC es limitada y el condicionamiento mieloablativo podría inducir efectos adversos o complicaciones en pacientes sensibles a dicho procedimiento. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar métodos y composiciones para preparar células madre hematopoyéticas (HSC) para aumentar el injerto en sujetos que necesitan un trasplante de HSC.
La presente descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que el cultivo ex vivo prolongado y la manipulación génica inducen una respuesta al daño del ADN (DDR) en células madre hematopoyéticas (HSC) durante el cultivo ex vivo, que está mediada por la activación de la señalización de estrés de MAPK p38. Por ejemplo, tales HSC después de un cultivo ex vivo prolongado y la manipulación genética mostraron un aumento de las rupturas de doble cadena del ADN (por ejemplo, un aumento de la señalización de Y-H2AX), un aumento de la respuesta al daño del ADN (por ejemplo, un aumento de la señalización de 53BP1), la pérdida del potencial de repoblación a largo plazo, un aumento de la desviación del linaje mieloide y/o un aumento del nivel de fosforilación de MAPK p38 en las HSC. Además, se descubrió que el bloqueo de la señalización de MAPK p38 (por ejemplo, a través de un inhibidor anti- MAPK p38) disminuyó significativamente las rupturas de la doble cadena del ADN y/o la respuesta al daño del ADN que se produjo en las HSC tanto con el aumento del tiempo en cultivo como con la transducción, retuvo el potencial de repoblación de gérmenes durante mucho tiempo, redujo el sesgo del linaje mieloide en las HSC y/o aumentó el injerto de las HSC trasplantadas in vivo. Por lo tanto, se esperaría que los inhibidores de MAPK p38 mejoraran la capacidad de injerto de las HSC cultivadas ex vivo bloqueando la señalización de estrés de MAPK p38 y reduciendo, por ejemplo, las rupturas de la doble cadena de ADN.
Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente descripción proporciona métodos de cultivo celular ex vivo para preservar la pluripotencialidad de las células pluripotenciales tales como las HSC en presencia de uno o más inhibidores de MAPK p38, que suprime al menos la respuesta al daño del ADN debido al cultivo ex vivo prolongado y la manipulación genética. Dichas células madre pueden haber sufrido una manipulación que provoque una ruptura de la doble cadena del ADN, por ejemplo, transducida por un vector que sea capaz de integrarse en el genoma de las células madre, o inducida por la edición del genoma. Los métodos de edición del genoma generalmente se clasifican según el tipo de endonucleasa que participa en la generación de rupturas de la doble cadena en el ácido nucleico diana. Los ejemplos de métodos de edición del genoma incluyen, por ejemplo, el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de transcripción (TALEN), meganucleasas y/o sistemas CRISPR/Cas. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, la manipulación ex vivo de las HSC puede activar la señalización de estrés, lo que da como resultado su compromiso con las células progenitoras hematopoyéticas (HPC) a expensas de la autorrenovación de las HSC. Los eventos que involucran rupturas de la doble cadena de ADN (porejemplo, eventos de integración de vectores) pueden exacerbar la pérdida de las HSC y el presente descubrimiento mostró que el bloqueo de la vía de señalización de MAPK p38 rescataría la pérdida de las HSC en el cultivo ex vivo. Por consiguiente, en la presente descripción también se describen métodos y composiciones ex vivo para preparar células madre tales como las HSC que tienen actividad de injerto mejorada mediante el uso de uno o más inhibidores de MAPK p38. Los métodos y composiciones descritos en la presente descripción promueven el injerto de HSC en un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) después del trasplante de HSC.
I. Inhibidores de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) p38
Las proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK) p38 son una clase de proteínas quinasas activadas por mitógeno que responden a estímulos de estrés, como citoquinas, radiación ultravioleta, choque térmico y/o choque osmótico. La familia MAPK p38 incluye cuatro miembros, p38-a (MAPK14), p38-p (MAPK11), p38-Y (MAPK12/ERK6) y p38-5 (MAPK13/SAPK4), que participan en una cascada de señalización que controla la respuesta celular a citocinas y estrés. Los inhibidores para cualquiera de los miembros de MAPK p38 pueden usarse en los métodos de cultivo ex vivo descritos en la presente descripción. En algunos ejemplos, los inhibidores usados en la presente descripción son específicos de uno de los miembros, por ejemplo, específicos de p38-a, p38-p, p38-Y o p38-5. En otros ejemplos, los inhibidores de MAPK p38 son universales para dos o más miembros de la familia MAPK p38. En un ejemplo, los inhibidores usados en la presente descripción son específicos o selectivos para p38-a (MAPK14).
Como se usa en la presente, el término "MAPK p38" se refiere a un polipéptido de MAPK p38 que tiene la misma o similar bioactividad que una MAPK p38 de tipo salvaje. Un polipéptido MAPK p38 puede tener una secuencia de aminoácidos al menos 70 % o más (incluyendo al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la de una MAPK p38 de tipo salvaje, y es capaz de desencadenar la ruta de señalización de p38a.
El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y otros, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteínas en BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación =50, longitud de palabra =3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína como se describe en la presente descripción. Cuando existen espacios entre dos secuencias, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul y otros, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
Las secuencias de MAPK p38 de tipo salvaje (por ejemplo, secuencias de p38-a (MAPK14), p38-p (MAPK11), p38-Y (MAPK12/ERK6) y p38-5 (MAPK13/SAPK4)) de varias especies están disponibles en la red mundial del Nc BI, incluidos humanos, ratones y ratas. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una isoforma de p38-a humana (MAPK14) está disponible en NCBI con el número de acceso NM_001315 y su secuencia de aminoácidos correspondiente está bajo el número de acceso NP_001306.
Como se usa en la presente, el término "inhibidor de MAPK p38 " se refiere a una molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de una proteína MAPK p38. Las moléculas inhibidoras adecuadas incluyen específicamente anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, proteínas o péptidos recombinantes, etc. Los métodos para identificar inhibidores de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula inhibidora de MAPK p38 candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido.
Un inhibidor de MAPK p38 puede ser una molécula de cualquier tipo que interfiere con la señalización asociada con al menos uno o más miembros de la familia MAPK p38 (por ejemplo, p38-a (MAPK14), p38-p (MAPK11), p38-Y (MAPK12/ERK6) y p38-5 (MAPK13/SAPK4)) en una célula, por ejemplo, ya sea al disminuir la transcripción o traducción del ácido nucleico que codifica MAPK p38, o al inhibir o bloquear la actividad del polipéptido MAPK p38, o ambos. En algunos ejemplos, un inhibidor de MAPK p38 es un agente que interfiere con la señalización asociada con p38-a (MAPK). Los ejemplos de inhibidores de MAPK p38 incluyen pero no se limitan a, polinucleótidos antisentido, ARN de interferencia, ARN catalítico, quiméricos de ARN-ADN, aptámeros específicos de MAPK p38, anticuerpos anti-MAPK p38, fragmentos de unión a MAPK p38 de anticuerpos anti-MAPK p38, moléculas pequeñas que se unen a MAPK p38, péptidos que se unen a MAPK p38 y otros polipéptidos que se unen específicamente a MAPK p38 (incluidos, pero sin limitarse a, fragmentos de unión a MAPK p38 de uno o más ligandos de MAPK p38, opcionalmente fusionados con uno o más dominios adicionales), tal que la interacción entre el inhibidor de MAPK p38 y MAPK p38 da como resultado una reducción o cese de la actividad o expresión de MAPK p38. Un experto en la técnica entenderá que, en algunos casos, un inhibidor de MAPK p38 puede antagonizar o neutralizar una actividad de MAPK p38 sin afectar a otra actividad de MAPK p38. Por ejemplo, un inhibidor de MAPK p38 deseable para usar en algunos de los métodos de la presente descripción es un inhibidor de MAPK p38 que se une a p38-a y bloquea la señalización de MAPK p38, por ejemplo, sin afectar o afectando mínimamente a cualquiera de las otras interacciones de MAPK p38, por ejemplo, unir p38-p, p38-Y y/o p38-5.
En algunas modalidades, los inhibidores de MAPK p38 usados para los métodos descritos en la presente descripción son permeables a las células.
En algunas modalidades, un inhibidor de MAPK p38 es un agente que inhibe o reduce directa o indirectamente las rupturas de la doble cadena del ADN y/o la respuesta al daño del ADN en células madre manipuladas genéticamente como las HSC (por ejemplo, mediante el uso de un vector de integración como vectores virales o al realizar la edición del genoma, por ejemplo, que implica el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN), meganucleasas y/o sistemas CRISPR/Cas), en donde la doble cadena del ADN se rompe y/o la respuesta del daño del ADN está mediada por uno o más miembros de la familia de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y, p38-5 y cualquiera de sus combinaciones). Por consiguiente, un inhibidor de MAPK p38 puede dirigirse a MAPK p38 (porejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y, p38-5 y cualquiera de sus combinaciones) o cualquiera de las moléculas aguas arriba de MAPK p38. Los ejemplos de inhibidores de MAPK p38 incluyen, sin limitaciones, moléculas anti-p38-a, moléculas anti-p38-p, moléculas anti-p38-y, moléculas anti-p38-5 y cualquiera de sus combinaciones. Un inhibidor de MAPK p38 puede ser una proteína, un péptido, un peptidomimético, un aptámero, un ácido nucleico, un anticuerpo, una molécula pequeña o cualquiera de sus combinaciones.
Un inhibidor de MAPK p38 puede ser una molécula (por ejemplo, un anticuerpo, un aptámero o una molécula pequeña) que interfiere con la unión de uno o más miembros de la familia de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y, p38-8 y cualquiera de sus combinaciones). Alternativamente, el inhibidor de MAPK p38 puede ser una molécula (por ejemplo, un polinucleótido u oligonucleótido inhibidor tal como ARN de interferencia u oligonucleótido antisentido) que suprime la transcripción y/o traducción de uno o más miembros de la familia de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y, p38-8 y cualquiera de sus combinaciones), reduciendo de esta manera el nivel de ARNm/proteína de esta enzima. El inhibidor de MAPK p38 como se describe en la presente descripción puede reducir la señalización de MAPK P38 en células madre o las HSC (por ejemplo, durante el cultivo ex vivo después de la manipulación genética) en al menos un 20 % o más, por ejemplo, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% o superior. La actividad inhibitoria de dicho inhibidor frente a MAPK p38 puede determinarse mediante métodos convencionales, por ejemplo, midiendo el nivel de fosforilación de p-p38, por ejemplo, mediante el uso de ensayos de proteínas como ELISA o transferencia Western.
En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es un anticuerpo que se une específicamente a uno o más miembros de la familia de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y, p38-8 y cualquiera de sus combinaciones) y neutraliza su actividad para activar la vía de señalización MAPK p38. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" incluye pero no se limita a policlonales, monoclonales, humanizados, quiméricos, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab') y fragmentos F(ab')2, así como fragmentos monocatenarios anticuerpos (scFv), proteínas de fusión y otras proteínas sintéticas que comprenden el sitio de unión al antígeno del anticuerpo.
Los anticuerpos pueden fabricarse por un experto en la técnica mediante el uso de métodos y servicios y kits comercialmente disponibles conocidos en la técnica. Los métodos de preparación de anticuerpos monoclonales se conocen bien en la técnica e incluyen tecnología de hibridomas y tecnología de presentación en fagos. Otros anticuerpos adecuados para su uso en la presente descripción se describen, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: Antibodies A Laboratory Manual, Segunda edición. Edward A. Greenfield. Cold Spring Harbor Laboratory Press (30 de septiembre de 2013)); Making and Using Antibodies: A Practica1Handbook, Segunda edición. Editores Gary C. Howard y Matthew R. Kaser. CRC Press (29 de julio de 2013); Antibody Engineering: Methods and Protocols, Segunda edición (Methods in Molecular Biology). Patricio Chames. Humana Press (21 de agosto de 2012); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Editores Vincent Ossipow y Nicolás Fischer. Humana Press (12 de febrero de 2014)); y Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Michael Steinitz. Humana Press (30 de septiembre de 2013))).
Los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas estándar, por ejemplo mediante inmunización con el polipéptido apropiado o parte(s) del mismo, o mediante el uso de una biblioteca de expresión en fagos. Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (porejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico que porta uno o más epítopos deseados, opcionalmente haptenizado a otro polipéptido. En dependencia de la especie huésped, pueden usarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, geles minerales de Freund tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. El suero del animal inmunizado se recoge y trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales contra el epítopo deseado contiene anticuerpos contra otros antígenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad o cualquier otro método conocido en la técnica. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales se conocen bien en la técnica.
Un inhibidor de MAPK p38 se une específicamente a un miembro de MAPK p38 (porejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) si el inhibidor se une al miembro específico de MAPK p38 con una afinidad mayor que para un polipéptido irrelevante. En algunas modalidades, el inhibidor se une a un miembro de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) con al menos 5, o al menos 10 o al menos 50 veces mayor afinidad que para el polipéptido irrelevante. En algunas modalidades, el inhibidor se une a un miembro de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) con al menos 100, o al menos 1000, o al menos 10000 veces mayor afinidad que para el polipéptido irrelevante. Dicha unión puede determinarse mediante métodos que se conocen bien en la técnica, tal como la resonancia de plasmones superficiales, tal como un sistema Biacore®. En algunas modalidades, el inhibidor tiene una afinidad (medida por una constante de disociación, Kd ) por un miembro específico de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) de al menos 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M o 10-11 M.
En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es una molécula pequeña, como una molécula orgánica pequeña, que normalmente tiene un peso molecular inferior a 5000 kDa. Las moléculas pequeñas adecuadas incluyen aquellas que se unen a uno o más miembros de la familia de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) o un fragmento de la misma, y pueden identificarse mediante métodos como la selección de grandes bibliotecas de compuestos (Beck- Sickinger & Weber (2001) Estrategias Combinacionales en Biología y Química Combinational Strategies in Biology and Chemistry (John Wiley & Sons, Chichester, Sussex); por relación estructuraactividad por resonancia magnética nuclear (Shuker y otros (1996) "Discovering highaffinity ligands for proteins: SAR by NMR. Science 274: 1531-1534); bibliotecas químicas codificadas de autoensamblaje Melkko y otros (2004) "Encoded self-assembling chemical libraries." Nature Biotechnol. 22: 568-574); DNA-templated chemistry (Gartner y otros (2004) "DNA-tem plated organic synthesis and selection of a library of macrocycles. Science 305: 1601-1605);
química combinatoria dinámica (Ramstrom & Lehn (2002) "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries." Nature Rev. Drug Discov. 1 : 26-36); anclaje (Arkin & Wells (2004) "Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nature Rev. Drug Discov. 3: 301-317); y selección de velocidad (Muckenschnabel y otros (2004) "SpeedScreen: label-free liquid chromatography-mass spectrometry-based highthroughput screening for the discovery of orphan protein ligands." Anal. Biochem. 324: 241-249). Por lo general, las moléculas pequeñas tendrán una constante de disociación para MAPK P38 en el intervalo nanomolar.
En la Tabla 1 más abajo se proporcionan ejemplos de inhibidores de MAPK p38 de molécula pequeña para su uso en el método de cultivo ex vivo descrito en la presente descripción:
Tabla 1. Inhibidores de MAPK p38 ilustrativos
Los inhibidores de MAPK p38 ilustrativos también incluyen doramapimod (por ejemplo, BIRB-796), ralimetinib (por ejemplo, dimesilato de LY2228820), inhibidores de MAPK p38 competitivos con ATP basados en aminopiridina (por ejemplo, Vx702), inhibidores de piridinil imidazol (por ejemplo, SB203580), y cualquiera de sus combinaciones. Otros inhibidores de MAPK p38 se conocen bien en la técnica, por ejemplo, los descritos en las Patentes de Estados Unidos núm. 7,169,779, 6,635,644, 6,608,060, 6,632,945, 6,528,508, 6,509,363 (inhibidores heterocíclicos de p38), 6,147,080, 6,800,626, 6,093,742, 6,949,560 (Compuestos imidazosustituidos), 6,852,740 (Derivados de pirazol), 6,630,485, 6,759,410 (3,4-dihidro-(1h)-quinazolin-2onas), 6,696,471 (Compuestos de aminopirrol), 6,696,443 (Inhibidores tipo piperidina/piperazina), 6,509,361 (pirazoles sustituidos con 1,5-diaril), 6,444,696 (derivados de pirazol), y las publicaciones de patentes PCT WO2000017175, WO2000017204, WO1996021654, WO1999000357, WO1999064400. Otros inhibidores de MAPK p38 como se describe en Xing "Clinical candidates of small molecule p38 MAPK inhibitors for inflammatory diseases" (2015) MAP Kinase 4: 5508 también pueden usarse para los métodos y composiciones ex vivo descritos en la presente descripción.
En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es un ARN de interferencia tal como un ARN de interferencia pequeño (ARNip) y un ARN de horquilla corta (ARNhc). En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es un ARN de interferencia pequeño (ARNip) que se une al ARNm de uno o más miembros de la familia de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) y bloquea su traducción o degrada el ARNm a través de la interferencia de ARN. Ejemplos de a Rn de interferencia pequeños se describen mediante Hannon y otros, Nature, 418 (6894): 244 51 (2002); Brummelkamp y otros, Science 21, 21 (2002); y Sui y otros, Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 99, 5515-5520 (2002). El ARN de interferencia (ARNi) es el proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia en animales iniciado por el ARN bicatenario (ARNbc) que es homólogo en secuencia al gen silenciado. Los ARNip son generalmente dúplex de ARN con cada hebra de 20 a 25 (como 19 a 21) pares de bases de longitud. En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es un ARN de horquilla corta (ARNhc) que es complementario a un ácido nucleico de MAPK p38 (porejemplo, un ARNm de MAPK p38). Un ARNhc normalmente contiene un tallo de 19 a 29 pares de bases, un bucle de al menos 4 nucleótidos (nt) y, opcionalmente, un saliente de dinucleótido en el extremo 3'. La expresión de ARNhc en un sujeto puede obtenerse mediante el suministro de un vector (por ejemplo, un plásmido o vectores virales o bacterianos) que codifica el ARNhc. Los ARNip y ARNhc pueden diseñarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica o comercialmente disponible (ver, por ejemplo, productos disponibles de Dharmacon y Life Technologies). Un ARNip también puede comprender una o más modificaciones químicas, como una modificación de base y/o una modificación de enlace para al menos mejorar su estabilidad y afinidad de unión al ARNm diana.
En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es un oligonucleótido antisentido que es complementario a un ácido nucleico de MAPK p38 (por ejemplo, un ARNm de MAPK p38). Los oligonucleótidos antisentido son generalmente ácidos nucleicos monocatenarios (ya sea una molécula de ADN, ARN o ARN-ADN híbrido), que son complementarios a una secuencia de ácido nucleico diana, como una porción de un ARNm de MAPK p38. Al unirse a la secuencia diana, se forma un dúplex de ARN-ARN, ADN-ADN o ARN-ADN, lo que inhibe la función o el nivel del ácido nucleico diana, ya sea mediante el bloqueo de la transcripción, el procesamiento, la adición de poli(A), la replicación, la traducción o la promoción de mecanismos inhibidores de las células, como la promoción de la degradación del ARNm. En algunas modalidades, un oligonucleótido antisentido tiene una longitud de 10 a 40, de 12 a 35 o de 15 a 35 bases, o cualquier número entero intermedio. Un oligonucleótido antisentido puede comprender una o más bases modificadas, como 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina (2-amino-dA), 5-bromo dU, 5-metil dC, desoxiinosina, ácido nucleico bloqueado (LNA), 5-Nitroindol, 2'-O-Metil bases, hidroxmetil dC, 2' Fluoro bases. Un oligonucleótido antisentido puede comprender uno o más enlaces modificados, como un enlace de fosforotioato.
En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es una ribozima que es complementaria a un ácido nucleico de MAPK p38 (por ejemplo, un ARNm de MAPK p38) y escinde el ácido nucleico de MAPK p38. Las ribozimas son complejos de ARN o ARN-proteína que escinden los ácidos nucleicos de una manera específica del sitio. Las ribozimas tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad endonucleasa. Las ribozimas de la presente descripción pueden ser ribozimas sintéticas, como las descritas en la Patente de Estados Unidos núm. 5,254,678. Estas ribozimas sintéticas tienen regiones de hibridación y regiones catalíticas separadas; por lo tanto, las regiones de hibridación pueden diseñarse para reconocer una secuencia diana, como una secuencia MAPK p38.
Los ARNip, ARNhc, ribozimas y oligonucleótidos antisentido como se describen en la presente descripción pueden ser complementarios a un ácido nucleico de MAPK p38 (por ejemplo, un ARNm de MAPK p38), o una porción del mismo. Debe entenderse que la complementariedad incluye el 100% de complementariedad, pero no necesariamente excluye los emparejamientos incorrectos en una o más ubicaciones, lo que da como resultado, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de complementariedad.
En algunas modalidades, el inhibidor de MAPK p38 es un péptido o una proteína que no es un anticuerpo. El péptido o proteína puede comprender una secuencia de aminoácidos que interfiere con la señalización de MAPK p38. Las proteínas y los péptidos pueden diseñarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante la selección de bibliotecas de proteínas o péptidos para la unión a MAPK p38 o la inhibición de la unión de MAPK p38 a un ligando, como MAPK p38.
La capacidad de un compuesto candidato, como una molécula pequeña, proteína o péptido, para unirse o interactuar con un polipéptido MAPK p38 o un fragmento del mismo puede medirse mediante cualquier método de detección/medición de una interacción proteína/proteína u otra interacción compuesto/proteína. Los métodos adecuados incluyen métodos tales como, por ejemplo, dos interacciones híbridas de levadura, copurificación, ELISA, coinmunoprecipitación y métodos de resonancia de plasmones superficiales. Por lo tanto, el compuesto candidato puede considerarse capaz de unirse al polipéptido o fragmento del mismo si puede detectarse una interacción entre el compuesto candidato y el polipéptido o fragmento del mismo mediante ELISA, coinmunoprecipitación o métodos de resonancia de plasmones superficiales o mediante un método de copurificación o de dos interacciones híbridas de levadura, los cuales se conocen todos en la técnica. También se contemplan los ensayos de selección que son capaces de operar con un alto rendimiento. Los ejemplos pueden incluir ensayos basados en células y ensayos de unión proteína-proteína.
II. Métodos para preservar la pluripotencialidad de las células madre en cultivo ex vivo
Cualquiera de los inhibidores de MAPK p38, por ejemplo, los descritas en la presente descripción, pueden usarse para conservar la pluripotencialidad de las células pluripotenciales (por ejemplo, células pluripotenciales hematopoyéticas) en cultivos ex vivo o in vitro. Pluripotencialidad se refiere a la capacidad de las células no especializadas para renovarse como células no especializadas, pero aún conservan esta capacidad de especializarse para producir tipos específicos de células. El potencial de las células madre, o "pluripotencialidad " de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) se basa en una combinación de propiedades: quiescencia, potencial de repoblación, potencial de autorrenovación y potencial de diferenciación multilinaje. La quiescencia del ciclo celular en las células madre (por ejemplo, HSC) mantiene la pluripotencialidad al proteger a las células de la diferenciación o la senescencia.
La presente descripción presenta métodos de cultivo ex vivo para preservar la pluripotencialidad de las células madre en cultivos celulares mediante el cultivo de células madre (por ejemplo, HSC) en presencia de uno o más inhibidores de MAPK p38. La célula madre así preparada puede usarse para tratar enfermedades adecuadas a través del trasplante de células madre.
Para realizar los métodos de cultivo ex vivo descritos en la presente descripción, puede obtenerse una población adecuada de células madre (por ejemplo, células madre pluripotentes) de una fuente adecuada. En algunos casos, la población de células madre (por ejemplo, HSC) puede derivarse de un sujeto humano, por ejemplo, de células de la médula ósea, células de sangre periférica y/o células de sangre del cordón umbilical del sujeto humano, a través de un método convencional. En algunos ejemplos, las células madre son células madre adultas (por ejemplo, HSC), que pueden derivarse de la médula ósea o de células sanguíneas periféricas de un adulto humano. En algunos ejemplos, la población de células madre está sustancialmente libre de células madre umbilicales.
En algunas modalidades, cualquiera de las poblaciones de células madre descritas en la presente descripción se ha sometido a una manipulación genética que provoca un daño en el ADN, por ejemplo, rupturas de doble cadena, dimerización o reticulación, bases no apareadas, bases modificadas, conversión de una base en otra que da como resultado bases no apareadas, desenrollamiento de la cromatina u otras modificaciones, etc. En algunas modalidades, cualquiera de las poblaciones de células madre descritas en la presente descripción se ha sometido a una manipulación genética que rompe una doble cadena. Una manipulación genética incluye modificar, insertar o eliminar al menos uno de los genes en las células madre (por ejemplo, HSC). La manipulación genética puede incluir la transducción con un vector que sea capaz de integrarse en el genoma celular.
Un "vector", como se usa en la presente descripción, es cualquier vehículo de ácido nucleico (ADN o ARN) capaz de facilitar la transferencia de una molécula de ácido nucleico a las células madre (por ejemplo, HSC). En general, los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, vectores virales y otros vehículos derivados de fuentes virales o bacterianas que se manipularon mediante la inserción o incorporación de una secuencia de nucleótidos diana. Los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores que comprenden secuencias de nucleótidos derivadas del genoma de los siguientes virus: retrovirus; lentivirus; adenovirus; virus adenoasociado; virus tipo SV40; virus de polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus vaccinia; virus de la poliomielitis. Pueden emplearse fácilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la técnica.
Los vectores virales pueden basarse en virus eucariotas no citopáticos en los que los genes no esenciales se reemplazaron con una secuencia de nucleótidos diana. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus (por ejemplo, lentivirus), cuyo ciclo de vida implica la transcripción inversa del ARN viral genómico en ADN con la integración proviral posterior en el ADN celular huésped. Los retrovirus se aprobaron para ensayos de terapia génica humana. Los más útiles son aquellos retrovirus que tienen una replicación deficiente (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retroviral alterados genéticamente tienen una utilidad general para la transducción de genes de alta eficacia in vivo. Se conocen en la técnica protocolos estándar para producir retrovirus con replicación deficiente (incluidos las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una célula empaquetada revestida con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular empaquetada, recolección de partículas virales de medios de cultivo de tejidos, e infección de las células diana con partículas víricas).
Otros vectores virales incluyen adenovirus y virus adenoasociados, que son virus de ADN de doble cadena que también se aprobaron para su uso humano en terapia génica. El virus adenoasociado puede diseñarse para que sea deficiente en la replicación y es capaz de infectar una amplia gama de tipos y especies de células. Los vectores lentivirales son un tipo de retrovirus que pueden infectar tanto a las células en división como a las que no se dividen debido a que su complejo de preintegración ("cáscara" del virus) puede atravesar la membrana intacta del núcleo de la célula diana. Un vector lentiviral ejemplar incluye, pero no se limita a, un vector derivado del VIH.
Otros vectores incluyen vectores de plásmidos no virales, que se han descrito ampliamente en la técnica y se conocen bien por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4ta edición (15 de junio de 2012). Los plásmidos ilustrativos incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript. Otros plásmidos se conocen bien por los expertos en la
técnica. Además, los plásmidos pueden diseñarse a la medida mediante el uso de enzimas de restricción y reacciones de ligación para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN.
En algunas modalidades, las células madre implicadas en los métodos y/o composiciones descritos en la presente descripción (por ejemplo, HSC) se manipularon genéticamente mediante el uso de un vector viral, como un vector retroviral o un vector lentiviral. Por consiguiente, en algunas modalidades, las células madre implicadas en los métodos y/o composiciones descritos en la presente descripción son células madre modificadas genéticamente (por ejemplo, HSC).
La manipulación genética (por ejemplo, transducción) de las células madre se realiza preferentemente cuando las células madre son células en reposo (no cíclicas), es decir, células que no están en división. Dichas células en reposo pueden estar en la fase G0 inactiva. Los fenotipos de HSC en reposo se conocen en la técnica y pueden usarse para identificar dichas HSC para los métodos y/o composiciones descritos en la presente descripción. Por ejemplo, la población enriquecida con HSC es al menos CD34+CD38-CD90+. Como todas las células somáticas, las células madre (por ejemplo, HSC) progresan a través del ciclo celular, que se caracteriza por cuatro fases: G1 (interfase), S (fase de síntesis de a Dn ), G2 (interfase) y M (fase de mitosis). Las células madre (por ejemplo, HSC) que superan el punto de restricción en la fase G1 entran en la fase S, mientras que las que no superan el punto de restricción permanecen sin dividir. Estas células no divididas pueden retirarse del ciclo celular y entrar en la fase G0: un estado en el que las células se denominan en reposo o inactivas. Dichas células en reposo en la fase G0 pueden reingresar de manera reversible al ciclo celular y dividirse o permanecer latentes, perdiendo el potencial de ciclo y, en algunos casos, volviéndose senescentes. La quiescencia es, por tanto, una propiedad que caracteriza a las células madre (por ejemplo, HSC) y les permite mantener la pluripotencialidad de las células. Sin desear limitarse a la teoría, cuando las células madre (por ejemplo, HSC) se manipulan o modifican genéticamente antes de que entren en un ciclo celular (por ejemplo, cuando las células están no cíclicas) y posteriormente se cultivan en presencia de un inhibidor de MAPK p38, el inhibidor MAPK p38 retrasa la transición de las células madre (por ejemplo, HSC) a la fase S, lo que probablemente permita que las células madre (por ejemplo, HSC) reparen cualquier daño en el ADN, por ejemplo, inducido por la manipulación genética, lo que retiene de esta manera la pluripotencialidad de las células madre (por ejemplo, HSC). Esto puede caracterizarse por un potencial de repoblación retenido a largo plazo y/o una producción de linaje equilibrada. En consecuencia, en algunas modalidades de las células madre involucradas en los métodos y/o composiciones descritos en la presente descripción, las células madre (por ejemplo, HSC) son células no cíclicas o no que se dividen, por ejemplo, las células madre están en la fase de reposo G0.
Cualquiera de las poblaciones de células madre descritas en la presente descripción puede cultivarse en un medio adecuado (por ejemplo, medio de cultivo celular) en presencia de una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de MAPK p38 como los descritos en la presente descripción durante un período de tiempo adecuado, por ejemplo, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 84 horas, al menos 96 horas, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente 7 días, o mayor. En algunas modalidades, cualquiera de las poblaciones de células madre descritas en la presente descripción puede cultivarse en un medio adecuado (por ejemplo, medio de cultivo celular) en presencia de una cantidad eficaz de uno o más inhibidores de MAPK p38 como los descritos en la presente descripción durante aproximadamente 18 horas a aproximadamente 7 días, o aproximadamente 1 día a aproximadamente 7 días, o aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días, o aproximadamente 3 días a aproximadamente 7 días, o mayor.
Una "cantidad eficaz", "dosis eficaz" o una "cantidad eficaz para", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad de un inhibidor de MAPK p38 como se describe en la presente descripción que es eficaz para preservar al menos una característica de la pluripotencialidad (quiescencia, potencial de repoblación, potencial de autorrenovación y potencial de diferenciación multilinaje) de células madre, por ejemplo, HSCS, y/o da como resultado un efecto clínico deseado, tal como un aumento del injerto de HSC en un sujeto después del trasplante de HSC. Esto puede monitorearse mediante métodos de rutina o puede monitorearse de acuerdo con el método para evaluar el injerto de HSC descrito en la presente descripción. Las cantidades eficaces varían, como reconocen los expertos en la técnica, en dependencia de, por ejemplo, la potencia del inhibidor de MAPK p38 usado.
Por ejemplo, la cantidad eficaz de un inhibidor de MAPK p38 para el cultivo de células madre (por ejemplo, HSC) en los métodos descritos en la presente descripción da como resultado un aumento en la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase de reposo G0 en al menos aproximadamente 10 % o más, que incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos alrededor del 80%, al menos aproximadamente el 90% o más, en comparación con la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase de reposo G0 sin cultivar en presencia de un inhibidor de MAPK p38. En algunas modalidades, la cantidad eficaz de un inhibidor de MAPK p38 da como resultado un aumento en la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase de reposo G0 en al menos aproximadamente 1,1 veces o más, que incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos
aproximadamente 10 veces o más, en comparación con la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase de reposo G0 sin cultivar en presencia de un inhibidor de MAPK p38.
En algunas modalidades, la cantidad eficaz de un inhibidor de p38 MAPK usado en los métodos descritos en la presente descripción da como resultado una disminución en la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase S-G2-M antes del primer ciclo de división celular (por ejemplo, 24 horas) en al menos aproximadamente 10 % o más, que incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con la proporción de células madre (por ejemplo, HSC) en la fase S-G2-M antes del primer ciclo de división celular sin cultivar en presencia de un inhibidor de MAPK p38.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, las células madre (porejemplo, HSC) se cultivan en presencia de un inhibidor de MAPK p38 en una cantidad eficaz para reducir el daño del ADN o la ruptura de la doble cadena del ADN (por ejemplo, medido por la expresión del foco de yH2AX o 53bp1) en las células madre (por ejemplo, HSC) en al menos aproximadamente 20 % o más, que incluye, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o más, en comparación con el nivel de daño en el ADN o ruptura de la doble cadena de ADN medido en células madre sin cultivar en presencia de un inhibidor de MAPK p38.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, las células madre (porejemplo, HSC) se cultivan en presencia de un inhibidor de MAPK p38 en una cantidad eficaz para reducir la pérdida del potencial de repoblación a largo plazo (LTRP) (por ejemplo, como se evalúa en el trasplante secundario (2T)) en al menos aproximadamente 20 % o más, que incluye, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con la LTRP cuando las células se cultivan sin un inhibidor de MAPK p38. Los ejemplos 1-2 que incluyen la Figura 2 (panel B) describen un método ilustrativo para determinar LTRP en xenoinjertos 2T.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, las células madre (por ejemplo, HSC) se cultivan en presencia de un inhibidor de MAPK p38 en una cantidad eficaz para reducir la desviación del sesgo mieloide en las células madre en al menos aproximadamente 20 % o más, que incluye, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con la desviación del sesgo mieloide cuando las células se cultivan sin un inhibidor de MAPK p38. Los ejemplos 1-2 que incluyen la Figura 2 (panel B) describen un método ilustrativo para la reconstitución de múltiples linajes para evaluar la desviación del sesgo mieloide.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la cantidad eficaz de un inhibidor de MAPK p38 para cultivar las células madre (por ejemplo, las HSC) da como resultado una disminución en el nivel de fosforilación de al menos uno o más (que incluye, por ejemplo, al menos dos, o al menos tres) miembros de MAPK p38 (por ejemplo, p38-a, p38-p, p38-Y o p38-8) en las células madre (por ejemplo, las HSC), por ejemplo, en al menos aproximadamente 20 %, que incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 % o más, en comparación con el nivel de fosforilación del miembro correspondiente de MAPK p38 en las células madre (por ejemplo, las HSC) sin el tratamiento del inhibidor de MAPK p38.
En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la cantidad eficaz de un inhibidor de MAPK p38 no aumenta sustancialmente el nivel de fosforilación de ERK o JNK en las células madre (por ejemplo, las HSC), por ejemplo, en no más del 20 %, que incluye, por ejemplo, no más del 10 %, no más del 5 %, no más del 3 % o menos, en comparación con el nivel de fosforilación de ERK o JNK en las células madre (por ejemplo, las HSC) sin el tratamiento del inhibidor de MAPK p38.
En algunas modalidades, las células madre (por ejemplo, las HSC), antes del trasplante in vivo, se cultivan en un medio que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor de p38 descrito en la presente descripción, en donde la cantidad eficaz da como resultado un aumento en el injerto posterior de células madre (por ejemplo, las HSC) in vivo en al menos aproximadamente 10 % o más, que incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con el injerto de células madre (por ejemplo, las HSC) sin cultivar las células con un inhibidor de MAPK p38 antes del trasplante. En algunas modalidades, la cantidad eficaz de un inhibidor de MAPK p38 da como resultado un aumento en el injerto posterior de células madre (por ejemplo, las HSC) en al menos aproximadamente 1,1 veces o más, que incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5
veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces o más, en comparación con el injerto de células madre (por ejemplo, las HSC) sin cultivar las células con un inhibidor de MAPK p38 antes del trasplante.
Una dosis eficaz de un inhibidor de MAPK p38 para los métodos descritos en la presente descripción puede ser al menos aproximadamente 10 nM, al menos aproximadamente 20 nM, al menos aproximadamente 30 nM, al menos aproximadamente 40 nM, al menos aproximadamente 50 nM, al menos aproximadamente 100 nM, al menos aproximadamente 200 nM, al menos aproximadamente 300 nM, al menos aproximadamente 400 nM, al menos aproximadamente 500 nM, al menos aproximadamente 600 nM, al menos aproximadamente 700 nM, al menos aproximadamente 800 nM, al menos aproximadamente 900 nM, al menos aproximadamente 1 pM, al menos aproximadamente 2 pM, al menos 3 pM, al menos aproximadamente 4 pM, al menos aproximadamente 5 pM, al menos aproximadamente 6 pM, al menos aproximadamente 7 pM, al menos aproximadamente 8 pM, al menos aproximadamente 9 pM, o al menos alrededor de 10 pM. En algunas modalidades, la dosis eficaz de un inhibidor de MAPK p38 para los métodos descritos en la presente descripción no puede ser más de 10 pM, no más de 9 pM, no más de 8 pM, no más de 7 pM, no más de 6 pM, no más de 5 pM, no más de 4 pM, no más de 3 pM, no más de 2 pM, no más de 1 pM, no más de 900 nM, no más de 800 nM, no más de 700 nM, no más de 600 nM, no más de 500 nM, no más de 400 nM, no más de 300 nM, no más de 200 nM, no más de 100 nM, no más de 50 nM, no más de 40 nM, no más de 30 nM, no más de 20 nM, o no más de 10 nM. También son posibles combinaciones de los intervalos antes mencionados. Por ejemplo, una dosis eficaz de un inhibidor de MAPK p38 para los métodos descritos en la presente descripción puede ser aproximadamente 30 nM a aproximadamente 10 pM, o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 5 pM, o aproximadamente 400 nM a aproximadamente 800 nM.
Las células madre pueden conservar su pluripotencialidad cuando se cultivan en presencia de un inhibidor de MAPK p38 de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, el porcentaje de células madre pluripotentes después del proceso de cultivo ex vivo es al menos 70 % (por ejemplo, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o superior) del anterior al cultivo ex vivo. En otras modalidades, menos del 30 % (por ejemplo, menos del 25%, 20%, 15%, 10% o 5% o menos) de las células madre se diferenciarían, por ejemplo, de células madre pluripotentes a células madre multipotentes, o de células multipotentes a células especializadas, durante el proceso de cultivo ex vivo descrito en la presente descripción. La presencia de diferentes tipos de células madre, por ejemplo, células madre pluripotentes y células multipotentes, y células especializadas en el cultivo ex vivo puede monitorearse a través de un método de rutina, por ejemplo, monitorearse mediante la presencia de marcadores de superficie celular específicos para un tipo específico de células madre o específicas de una célula especializada.
En algunas modalidades, las HSC adultas se someten al proceso de cultivo ex vivo descrito en la presente descripción, que implica el uso de uno o más inhibidores de MAPK p38. El porcentaje de las HSC después del cultivo puede ser al menos el 70 % (por ejemplo, 80 %, 90 %, 95 % o más) del de las HSC antes del cultivo. Alternativamente o además, el porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) en las células después del cultivo ex vivo puede ser inferior al 30 % (por ejemplo, inferior al 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 %).
III. Terapia con células madre
Las células madre preparadas mediante los métodos de cultivo ex vivo descritos en la presente descripción pueden usarse en la terapia con células madre, que es el uso de células madre para tratar o prevenir una enfermedad o afección, que incluye, por ejemplo, enfermedades y afecciones neurodegenerativas, diabetes, enfermedades del corazón y otras condiciones. Ejemplos de condiciones adecuadas para ser tratadas por terapia con células madre incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, neuroblastoma, Sarcoma de Ewing, síndromes mielodisplásicos, gliomas y otros tumores sólidos. La terapia con células madre también puede aplicarse a afecciones no malignas como la talasemia, la anemia aplásica, la anemia de Fanconi, los síndromes de inmunodeficiencia o los errores congénitos del metabolismo. En algunas modalidades, las HSC preparadas mediante los métodos de cultivo ex vivo descritos en la presente descripción pueden usarse para el trasplante en el tratamiento de trastornos hematopoyéticos, que incluyen, entre otros, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielomonocítica juvenil, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin.
El trasplante de células madre hematopoyéticas (TPH) es el trasplante de células madre hematopoyéticas multipotentes, generalmente derivadas de la médula ósea, sangre periférica o sangre del cordón umbilical. En algunos casos, las HSC pueden ser autólogas (las propias células madre del paciente se cultivan mediante los métodos de cultivo ex vivo descritos en la presente descripción y se usan para tratar una enfermedad). En otros ejemplos, las HSC pueden ser alogénicas (las células madre provienen de un donante y luego se cultivan mediante los métodos de cultivo ex vivo descritos en la presente descripción). Dichas HSC pueden usarse para tratar ciertos cánceres de la sangre o la médula ósea, como el mieloma múltiple o la leucemia. En estos casos, el sistema inmunitario del receptor suele destruirse con radiación o quimioterapia antes del trasplante.
En algunos ejemplos, las HSC descritas en la presente descripción (por ejemplo, las HSC adultas humanas) pueden manipularse genéticamente para expresar una globina y para su uso en el tratamiento de la anemia, como la anemia de células falciformes y la talasemia. Véase, por ejemplo, US20110294114 y WO2015/117027.
En cualquiera de las terapias con células madre descritas en la presente descripción, las células madre adecuadas pueden recolectarse del método de cultivo ex vivo descrito en la presente descripción y mezclarse con un marcador farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacéutica, que también está dentro del alcance de la presente descripción.
Para realizar los métodos de tratamiento descritos en la presente descripción, puede administrarse una cantidad eficaz de células madre a un sujeto que necesite el tratamiento. Las células madre pueden ser autólogas del sujeto. La administración de células autólogas a un sujeto puede dar como resultado un rechazo reducido de las células madre en comparación con la administración de células no autólogas. Alternativamente, las células madre son células alogénicas. Por ejemplo, las células madre alogénicas pueden derivarse de un donante humano y administrarse a un receptor humano que es diferente del donante.
En algunas modalidades, las células madre pueden usarse junto con un agente terapéutico para una enfermedad diana, tal como las descritas en la presente descripción. La eficacia de la terapia con células madre descrita en la presente descripción puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica y sería evidente para un profesional médico experto. La determinación de si una cantidad de las células o composiciones descritas en la presente descripción logró el efecto terapéutico sería evidente para un experto en la técnica. Las cantidades eficaces varían, como lo reconocen los expertos en la técnica, en dependencia de la condición particular que se trate, la gravedad de la condición, los parámetros individuales del paciente, incluidos la edad, la condición física, el tamaño, el sexo y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional de la salud. En algunas modalidades, la cantidad eficaz alivia, calma, aminora, mejora, reduce los síntomas, o retrasa la progresión de cualquier enfermedad o trastorno en el sujeto.
Técnicas Generales
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, tales como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook, y otros, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, editor, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, editor, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, editor, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, editores, 1993-8) J. Wiley y Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, editores.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, editores, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, y otros, editores, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, y otros, editores, 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan y otros, editores, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., editor, IRL Press, 1988 1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, editores, Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, editores, Harwood Academic Publishers, 1995).
Ejemplos
Ejemplo 1: Desarrollo de un modelo animal para estudiar las HSC humanas adultas y el efecto de la manipulación ex vivo
Los objetivos del presente estudio fueron desarrollar un modelo animal robusto de HSC humana en un modelo de xenoinjerto que imite los datos de ensayos clínicos en humanos, estudiar el mecanismo de pérdida de HSC durante el cultivo ex vivo y la transferencia de genes, y usar inhibidores de moléculas pequeñas de vías identificadas para revertir la pérdida de HSC durante el cultivo ex vivo y/o la manipulación genética.
El cultivo ex vivo de HSC puede activar la señalización de estrés (MAPK p38) en HSC, lo que da como resultado una división asimétrica de HSC o un compromiso simétrico de HPC a expensas de la autorrenovación de HSC. Los eventos de integración de vectores instigan aún más una respuesta de daño en el ADN que resulta en su diferenciación a HPC. Por lo tanto, el uso de un inhibidor de MAPK p38 puede revertir la pérdida de HSC durante el cultivo ex vivo y/o la manipulación genética (por ejemplo, integración de vectores).
Desarrollo de modelo de células madre mesenquimales humanas adultas (MSC)
(i) Condicionamiento mieloablativo
Se han realizado dos ensayos recientes de terapia génica que exploran el condicionamiento mieloablativo (Tabla 3). Kang y otros, Blood (2010); Cavazzana-Calvo y otros, Nature (2010) En los estudios se infundieron aproximadamente entre 4 y 70 millones de células CD34 y, entre ellas, la cantidad de células CD34+ transducidas que se infundieron osciló entre 1 y 30 millones. Cuando se extrapolaron los números en términos de HSC transducidas, se infundieron entre 13 000 y 300 000, pero esto resultó en un injerto a largo plazo de aproximadamente 0-1 %, lo que muestra una pérdida tremenda.
Tabla 3: Resumen de estudios recientes de condicionamiento mieloablativo
(ii) Modelo de xenoinjerto de HSC humanas adultas
Se desarrolló un modelo de xenoinjerto para estudiar el injerto de hHSC. En el modelo de xenoinjerto de HSC humanas adultas, las células CD34+ se derivaron y aislaron de MPB fresco. Las células CD34+ frescas se trasplantaron directamente a ratones NSG inmunocomprometidos o se cultivaron con citoquinas humanas y luego se transdujeron con lentivirus o retrovirus. Para el vector de lentivirus (LV), las células cultivadas se transdujeron durante 18-24 horas y se recolectaron e inyectaron en ratones NSG después de 18-24, 36-42 y 72-96 horas de cultivo ex vivo. Para el vector de retrovirus (RV), las células se inyectaron en ratones NSG después de 72-96 horas de cultivo ex vivo. A continuación, se midió la progenie hematopoyética humana multipotencial (hCD45+) después del trasplante de huCD34+ en ratones NSG para confirmar que el injerto de HSC humano modelo de CD34+ hSc /P adulto (sangre periférica movilizada) imita los resultados observados en los ensayos clínicos de terapia génica. Injerto de células humanas en la médula ósea de ratones NSG a las 6, 12 y 24 semanas después del trasplante primario (1T) y 6 semanas después del trasplante secundario (2T) de células CD34+ humanas frescas/cultivadas. Las células se transdujeron con vector lentiviral (LV) o retroviral (RV).
Se observó que el aumento del tiempo en cultivo conduce a la división de HSC y que una parte de las HSC transducidas sufre apoptosis. El mayor tiempo de manipulación ex vivo de las HSC humanas no afecta el injerto en ratones NSG primarios, incluso a los 6 meses, pero reduce el injerto secundario. Por lo tanto, el aumento del tiempo de manipulación ex vivo de las HSC humanas (hHSC) da como resultado la pérdida del potencial de injerto a largo plazo de hHSC en un modelo de xenoinjerto. Se encontró que la pérdida del injerto secundario se correlacionaba con la división de HSPC y HSC, y se observó que una parte de HSC (CD34+38-90+) con integración de vector a través de citometría de flujo experimentaba apoptosis. La población apoptótica tiene una alta expresión de GFP en los estudios de citometría de flujo, lo que sugiere que las HSC no toleran bien el alto número de copias del vector o el aumento de las rupturas de la doble cadena (DSB) que se producen a partir de la integración del vector.
Mecanismos de pérdida de HSC durante el cultivo ex vivo y la transferencia de genes
Se encontró que la pérdida del injerto secundario se correlaciona con la división de HSPC y HSC, ya que los cultivos extendidos dan como resultado la división tanto de HSPC como de HSC. Además, la activación de MAPK p38 aumenta a medida que las HSC avanzan a través del ciclo celular.
A continuación, las células cultivadas ex vivo se sometieron a citometría de flujo para su posterior caracterización. Se observó que un mayor tiempo en cultivo mostró un aumento en el nivel de MAPK p-p38 en las HSC humanas. Las HSC humanas pueden caracterizarse como CD34+CD38lowCD90+CD45RA-CD49f+. También pareció haber un ligero aumento en ERK a las 72 horas.
La citometría de flujo también demostró que los inhibidores de MAPK p38 pueden prevenir la pérdida de HSC e incluso pueden conservar el estado de HSC a través de la división celular durante cultivos ex vivo. Se demostró que cuatro inhibidores de p38 diferentes aumentan el porcentaje de hHSC ex vivo (Figura 3). Se seleccionó un inhibidor de p38, BIRB-796, para análisis adicional. Se observó que BIRB-796 disminuyó p-p38 en hHSC en cultivos ex vivo, lo que resultó en un aumento significativo de hHSC en cultivo (Figura 4).
También se demostró que la inhibición de p38 aumenta significativamente el número de ratones 2T (6 semanas después del trasplante secundario) con cualquier injerto de células humanas sin afectar el injerto de células humanas en general en los ratones 1T (excepto las células transducidas con lentivirus cultivadas durante 72 horas).
Para el injerto en el modelo 1T, se evaluó el injerto de células hCD45+ en la médula ósea de ratones 1T 24 semanas después del trasplante de cultivo de células hCD34+ con o sin el inhibidor de BIRB-796 de p38.
También se demostró que la inhibición de p38, por ejemplo, con BIRB-796, mantiene la fase de reposo G0 de las HSC transducidas y no transducidas durante el período de tiempo inicial del cultivo ex vivo. El Ki67, un antígeno nuclear asociado con la proliferación celular, se usó para determinar el estado del ciclo celular mediante citometría de flujo; se consideró que las tinciones negativas representaban las HSC en reposo.
Los datos de 10 experimentos demostraron que lentivirus y retrovirus transducen HSC y HPC de manera comparable.
Los ratones con trasplante primario (1T) (n=8-16) se analizaron 24 semanas después de sus respectivos trasplantes con respecto a la progenie de HPC. Un análisis multilinaje de las células recolectadas demostró que la manipulación genética de las células CD34+ durante el cultivo ex vivo muestra una pérdida del potencial linfoide y un sesgo mieloide de la progenie in vivo a largo plazo. La inhibición de MAPK p38 dio como resultado una capacidad de repoblación a largo plazo, pero no revierte el efecto.
La inhibición de p38 mantiene la fase de reposo de las HSC y reduce la respuesta al daño del ADN (DDR) al principio del cultivo. La entrada en el ciclo celular y la manipulación génica inducen una DDR en las HSC humanas que se reduce al inhibir MAPK p38 al principio del cultivo. Las rupturas de la doble cadena de ADN en HSC humanas se evaluaron mediante tinción con Y-H2AX, un indicador sensible y específico de rupturas de doble cadena de ADN.
Resumen
La división de las HSC en cultivo disminuye el potencial de autorrenovación de la lectura de las HSC humanas adultas en el trasplante secundario. Algunas HSC con un alto nivel de transducción sufren apoptosis.
Se ha demostrado que el aumento del tiempo en cultivo activa p38MAPK en HSC humana, mientras que la inhibición de p38MAPK durante cultivos ex vivo parece mantener o aumentar el fenotipo de HSC in vitro. Funcionalmente, la inhibición de p38MAPK durante la manipulación ex vivo y la transferencia de genes retiene el injerto de HSC humano en ratones con trasplante secundario. La inhibición de p38 puede ejercer su efecto al mantener la inactividad de las HSC durante la manipulación del cultivo ex vivo.
Ejemplo 2: Mecanismos de pérdida de células madre hematopoyéticas humanas durante la manipulación y transferencia de genes ex vivo
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son dianas ideales para la terapia génica para varias enfermedades hematológicas hereditarias, incluidas las hemoglobinopatías. La transferencia de genes a las HSC implica un cultivo ex vivo de 2 a 4 días, lo que hace que estas células sean menos competentes en el injerto in vivo. Esto requiere grandes dosis de HSC transducidas (tHSC) y condicionamiento mieloablativo para destruir las HSC residentes. En este ejemplo, las HSPC CD34+ humanas transducidas se modelaron con potencial de repoblación a largo plazo (LTRP) en ratones NOD.LtSz-scid Il2ry-/-(NSG) mediante el uso de trasplantes primarios y secundarios, con reconstitución de células B, mieloides y T. Se usaron células CD34+ de sangre periférica movilizadas (que contienen células madre hematopoyéticas adultas), ya que estas son las dianas relevantes para la terapia génica y su cinética de injerto difiere enormemente de las células CD34+ de sangre del cordón umbilical, que se usan comúnmente en el modelo de ratón NSG. La transferencia de genes en hHSPC por vectores de lentivirus (LV) o Y-retrovirus (RV) seguida del injerto en ratones NSG reveló resultados similares a los observados en los ensayos de terapia génica, lo que demuestra que el tiempo prolongado de manipulación ex vivo de células hCD34+ da como resultado enormes pérdida de la LTRP en ratones con trasplante secundario. Además, la progenie de células CD34+ manipuladas genéticamente transducidas en condiciones de cultivo de 3-4 días mostró una pérdida relativa del potencial linfoide a expensas de un aumento del sesgo del linaje mieloide, que es específico de las células transducidas. Mecánicamente, el cultivo ex vivo prolongado y la manipulación génica indujeron una respuesta al daño del ADN (DDR) en las hHSC, como lo revela el aumento de la señalización de Y-H2AX y 53BP1 que se asocia con la activación de MAPK p38; este efecto se revirtió mediante el uso de un inhibidor de p38, que ayudó a retener la LTRP y el injerto en ratones NSG con trasplante secundarios y revirtió parcialmente el fenotipo de sesgo mieloide.
El cultivo ex vivo prolongado de HSPC humanas da como resultado una pérdida sustancial de LTRP y una progenie modificada genéticamente sesgada mieloide
La transferencia de genes a HSC requiere condiciones de cultivo ricas en citoquinas para la transferencia de genes terapéuticamente relevantes. Girard-Gagnepain, A., y otros, Blood (2014) 124(8): páginas 1221-31. Para investigar el efecto del cultivo ex vivo y la manipulación genética sobre el potencial de repoblación a largo plazo (LTRP) de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) CD34+ humanas adultas, el modelo de ratón NOD.Cg-Pr^dc scidIl2rgtm1wjl/SzJ (Jackson Laboratory; hoja de datos de cepas de ratones: 005557), también conocido como modelo de xenoinjerto NOD/SCID/IL2rg nulo o NSG, se adaptó a un modelo de HSC adulto, ya que la mayoría de los
estudios en este modelo se basan en sangre de cordón umbilical derivada (CB) de células CD34+; y las células CD34+ adultas no se injertan lo suficiente, ni sostienen un injerto secundario a las dosis de células CD34+ usadas para las células CB CD34+ en este modelo (datos no mostrados). Se trasplantaron un millón de células CD34+ de sangre periférica (MPB) movilizada con G-CSF en ratones NSG irradiados, y se evaluó el injerto en serie en la médula ósea (BM) de los animales a las 6, 12 y 24 semanas [las células humanas circulantes no se correlacionan con el injerto en BM (Figura 6, paneles A-B)]. Un injerto multipotencial compuesto por células B, T y mieloides solo fue evidente a las 24 semanas en ratones con trasplante primario con células MPB CD34+ (Figura 6, paneles C y D); un trasplante secundario 1:1 (2T) realizado a las 6, 12 y 24 semanas en ratones con trasplante primario (1T) solo produjo un injerto secundario humano exitoso (>0,01 % de células CD45+ humanas) de los ratones de 1T de 24 semanas. Por lo tanto, este modelo de hematopoyesis humana adulta puede evaluar la hematopoyesis multipotencial a los 6 meses en xenoinjertos de 1T y LTRP en xenoinjertos de 2T.
Se usaron dos protocolos para la transferencia génica del vector lentivirus (LV) y del vector Y-retrovirus (RV), comúnmente usados para transducciones clínicas: las HSPC MPB CD34+ se transdujeron con (a) LV que codifica GFP durante 18-24 horas (18-24 h) y se trasplantaron inmediatamente o se mantuvieron en cultivo durante 12-16 h adicionales y se trasplantaron a las 36-42 h en ratones NSG irradiados; (b) alternativamente, las células CD34+ se estimularon previamente durante 2 días ex vivo, y luego se transdujeron con un RV que codifica GFP autoinactivante en los días 2 y 3, y se trasplantaron a ratones NSG entre 72 y 96 h. En particular, la edición de genes también requiere condiciones similares, la primera para la interrupción o eliminación de genes (24 h o 36 h) mediante el uso de la vía de reparación celular n HeJ, y la última condición para la reparación dirigida por homología, que requiere ciclos de HSC. Como control, se trasplantaron ratones NSG con HSPC CD34+ sin manipular inmediatamente después de su aislamiento (0 h). En algunos experimentos se realizaron variaciones en el tiempo del cultivo ex vivo o en el tiempo de exposición a los vectores, para obtener controles apropiados (Figura 7). A las 24 semanas después de 1T, se observó un injerto hematopoyético humano robusto (células CD45+ humanas) en la MO en todas las condiciones de cultivo ex vivo y transferencia de genes, sin variaciones importantes (Figura 8, panel A). Sin embargo, hubo una pérdida significativa de LTRP en animales 2T cuando las células se cultivaron durante más de 24 h, siendo la pérdida mayor en el grupo RV 72-96 h (Figura 8, panel B). La eficacia de la transferencia de genes en células CD34+ in vitro (mediante el uso del ensayo de formación de colonias convencional) mostró que tanto el RV como el LV transducían células CD34+ de manera comparable en este ensayo (Figura 7). Sin embargo, aunque hubo una ligera disminución en las células humanas transducidas por LV (GFP+) (de un promedio de 80 % in vitro a 50-60 % a las 24 semanas in vivo), hubo una reducción significativa y progresiva en células (GFP+) transducidas con RV al 5-8 % in vivo (Figura 7). Por lo tanto, el injerto humano transducido por RV se perdió con el tiempo en los ratones NSG, mientras que el transducido con vectores LV se mantuvo en los animales a los 6 meses.
A continuación, se analizó la reconstitución multilinaje a las 6, 12 y 24 semanas en BM de animales de 1T, tanto de la progenie no transducida (GFP') como transducida (GFP+). Se observaron proporciones de linaje similares (principalmente B-mieloide en las poblaciones GFP+ y GFP), comparables con el patrón de linaje del injerto derivado de células CD34+ no manipuladas (0 h) a las 6 semanas después de 1T. Sin embargo, a las 12 semanas, la población modificada con el gen RV de 72-96 h mostró un aumento significativo de células mieloides, que se produjo a expensas de una progenie reducida de células B (Figura 9; Figuras 20-21); y a las 24 semanas, la desviación mieloide también era evidente en los injertos humanos transducidos con LV de 36-42 h, y este sesgo era extremo en los injertos transducidos con RV de 72-96 h, a expensas de una población linfoide B y T significativamente reducida; también hubo significativamente menos células GFP+ CD34+ en los injertos de LV de 36-42 h y de RV de 72-96 h (Figura 8, paneles CJ). Además, no hubo sesgo de linaje en las células no transducidas en ninguna de las condiciones probadas, lo que indica que esto no fue un efecto de las condiciones de citoquina/cultivo, donde el patrón de linaje no transducido fue similar al del injerto humano derivado de células CD34+ no manipuladas (0 h). Estos datos demuestran que la desviación del linaje mieloide fue secundario a la transducción y al aumento del tiempo en cultivo. Se observa que el RV usado en este ejemplo tenía un diseño de autoinactivación e impulsado por un promotor celular EF1a, por lo que carece de sus potenciadores de repetición terminal larga (LTR), que se sabe que causan genotoxicidad por inserción y potencialmente sesgan los linajes al influir en la expresión de genes que flanquean el sitio de inserción, y no mostró los eventos adversos de inserción observados con RV convencional (LTR-intact) en modelos experimentales (Thornhill, SI, y otros, Mol Ther (2008) 16(3): páginas 590-8; Zychlinski, D., y otros, Mol Ther (2008) 16(4): páginas 718-25) y en ensayos con humanos (Hacein-Bey-Abina, S., y otros, N Engl J Med (2014) 371(15): páginas 1407-17; De Ravin, SS, y otros, Sci Transl Med (2016) 8(335): páginas 335ra57). El vector LV usado también se probó en ensayos en humanos sin eventos adversos por la inserción del vector. Cartier, N., y otros, Science (2009) 326 (5954): páginas 818-23. Colectivamente, el cultivo ex-vivo más allá de las primeras 24 horas y la transferencia de genes dan como resultado la pérdida de la capacidad para repoblar la hematopoyesis en 2T (LTRP) y la progenie transducida restante tiene una desviación mieloide, a expensas de la progenie linfoide. El modelo también refleja los resultados de numerosos ensayos de terapia génica de RV, donde hubo un éxito modesto a pesar de la robusta transferencia de genes in vitro (Kang, EM, y otros, Blood (2010) 115(4): páginas 783 91) o solo injerto a corto plazo. Además, el modelo también simula algunos ensayos exitosos de terapia génica de LV que mostraron un marcado génico estable con transferencia génica a corto plazo (Cartier, N., y otros, Science (2009) 326 (5954): páginas 818-23; Biffi, A., y otros, Science (2013) 341 (6148): páginas 1233158; Aiuti, A., y otros, Science (2013) 341(6148): páginas 1233151; y Cavazzana-Calvo, M., y otros, Nature (2010) 467(7313): páginas 318-22), pero de un éxito modesto al fracaso en otros ensayos de LV en los que la transferencia de genes se realizó
a las 72-96 h, lo que validó este modelo como un modelo preclínico para la transferencia de genes de HSC en humanos adultos.
Se investigaron los mecanismos para la pérdida de LTRP y la progenie sesgada de linaje mieloide. La RV solo transduce células en división mientras que LV puede transducir tanto células en división como no en división, aunque LV también transduce preferentemente células en división. Lewis, PF y M. Emerman, J Virol (1994) 68(1): páginas 510-6. Por lo tanto, se supone que el fracaso de los ensayos de RV se debió a la integración preferencial de transgenes en células progenitoras hematopoyéticas (HPC) o progenitores multipotentes (MPP) que comprenden el 99 % de la población de HSPC CD34+, y la transducción deficiente de la población de HSC en reposo. Mediante el uso del fenotipo de HSC humano identificado por Dick y colaboradores (Notta, F., y otros, Science (2011) 333(6039): páginas 218-21), se encontró que las condiciones de transducción clínica estaban optimizadas para transducir HSC humana (CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+), (MPP, definida como CD34+CD38-CD90-CD45RA-(Id.; Huntsman, HD, y otros, Blood (2015) 126(13): páginas 1631-3)) y células CD34+ totales de manera comparable con RV y LV (Figura 10), pero las HSC transducidas mueren o cambian el destino a HPC con la transferencia de genes. Una evaluación cuidadosa de los compartimentos de HSPC y HSC no mostró pérdida de viabilidad de las células CD34+ ni apoptosis en la subpoblación de HSC dentro de ellas ex vivo; de hecho, hubo un aumento en el porcentaje de las HSC fenotípicas con el aumento del tiempo en cultivo (Figura 11, paneles A-C). También se observó que la población enriquecida con HSC comenzó a entrar en la fase S solo después de 24 h de cultivo ex vivo, y una gran proporción estaba en ciclo a las 72 h. Se planteó la hipótesis de que las HSC se mantienen fisiológicamente en sus nichos hipóxicos (Kubota, Y., y otros, Biochem Biophys Res Commun (2008) 366(2): páginas 335-9), la inducción de la división celular en cultivo en condiciones normóxicas probablemente induce un alto estrés oxidativo. Mantel, C.R., y otros, Cell (2015) 161(7): páginas 1553-65. De hecho, las especies reactivas de oxígeno (ROS) aumentaron significativamente en la población CD34+CD38-CD90+ (enriquecida con HSC) con 72-96 h de cultivo, y parecía que las ROS se generaron a partir de las mitocondrias (Figuras 11, paneles DF). La amida de N-acetilcisteína pudo disminuir las ROS en la población enriquecida con HSC, pero dio como resultado una disminución recíproca en la eficiencia de la transferencia de genes (Figura 11, paneles G-H). Por lo tanto, se investigaron las vías aguas abajo activadas por el aumento del estrés oxidativo. Se demostró que ROS induce vías de señalización de estrés, especialmente proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Ito, K., y otros, Nat Med (2006) 12(4): páginas 446-51. Se analizó el estado de fosforilación de ERK, JNK y MAPK p38 en las diferentes condiciones y se encontró una activación significativa solo de MAPK p38 (p38) con cultivo ex vivo más allá de las 24 h (Figura 12, paneles A-F; Figura 22). Curiosamente, hubo una mayor activación de p38 en el ciclo de HSC; aunque las HSC transducidas no tenían una mayor activación de p38 (Figura 12, paneles G-H; Figura 22). Un estudio anterior demostró que las células CB CD34 cultivadas durante una semana dieron como resultado una mayor activación de p38. Zou, J., y otros, Ann Hematol (2012) 91(6): páginas 813-23. Por lo tanto, la pérdida de HSC LTRP humana puede deberse al tiempo prolongado en cultivo en lugar de a la transducción de LV o RV. Para garantizar que este sea el efecto específico solo de p38 MAPK, se usaron varios inhibidores de MAPK (McGuire, VA, y otros, Mol Cell Biol (2013) 33(21): páginas 4152-65; Campbell, RM, y otros, Mol Cancer Ther (2014) 13(2): páginas 364-74) en cultivos de células CD34+ durante 72 h y se observó una disminución de la activación de p38 en la población enriquecida con HSC (Figura 12, paneles J-K; Figura 22).
Entre estos inhibidores de p38 (p38i), Birb-796, un inhibidor de p38a altamente selectivo (Pargellis, C., y otros, Nat Struct Biol (2002) 9(4): páginas 268-72), se usó para estudios posteriores. El p38i fue capaz de reducir significativamente los niveles de p-p38 en la población de HSC a los observados en las HSC no manipuladas en todos los diferentes puntos de tiempo en cultivo y transducciones (Figura 13, paneles A-B). A continuación, se realizaron trasplantes en serie de HSPC CD34+ humanas con o sin p38i, para evaluar su efecto sobre LTRP y sobre la desviación del linaje mieloide. Las HSPC CD34+ humanas se transdujeron con LV durante las primeras 18-24 h, y se mantuvieron en cultivo durante 24, 46-42 o 72-96 h antes del trasplante, o se transdujeron con RV a las 44 h y 68 h y se trasplantaron a las 72-96 h (Figura 7). A las 24 semanas después de 1T, el injerto de células CD45+ humanas en el NSG BM fue similar entre todos los grupos sin p38i (Figura 13, panel C) y mejoró ligeramente con p38i para los grupos LV y RV de 72-96 h.
Sorprendentemente, sin embargo, p38i fue capaz en todos los puntos de tiempo de retener el potencial de injerto secundario o potencial de repoblación a largo plazo (LTRP) a los niveles observados después de trasplantar células CD34+ no manipuladas (Figura 13, panel D, y Figura 14): casi un tercio de los ratones no tienen LTRp cuando las células CD34+ estuvieron en cultivo durante más de 24 h sin p38i, incluido e1HSPC transducido con LV dentro de las 24 h pero mantenido en cultivo durante 72-96 h o aquellos transducidos con RV después de 2 días en cultivo. Pero la adición de un p38i durante el período de cultivo restaura el LTRP en 2T.
Con la exposición a p38i durante el cultivo ex vivo, el sesgo del linaje mieloide se restauró a niveles similares a las células no transducidas o controles 0 h si las HSPC se transducían dentro de las primeras 24 h con LV, incluso si se mantuvieran en cultivos prolongados hasta 72-96 h. Sin embargo, en el grupo de RV de 72-96 h, donde el sesgo mieloide fue más pronunciada a expensas del linaje linfoide y las células CD34+ sin p38i, hubo alguna mejora en la desviación, pero aún no estaba equilibrada en el linaje. Todavía se observó un aumento significativo en la progenie mieloide, con una reducción en las células linfoides B y las células CD34+, y hubo una pérdida significativa de HSPC humanas (Figura 13, paneles I-J), aumento de la desviación mieloide (Figura 13, paneles E-F) en el costo de las células linfoides B (Figura 13, paneles G-H) en la población transducida por RV.
Por lo tanto, el sesgo del linaje era específico de las células que se transducían cuando se estaban dividiendo. El p38i pudo revertir significativamente este fenotipo pero solo parcialmente (Figura 13, paneles E-J). Además, el p38i no tuvo efecto en la eficiencia de transferencia de genes (GFP), in vitro e in vivo a las 6 y 24 semanas después de 1T (Figura 15, paneles A-C). Tomados en conjunto, los resultados indican que la inhibición de p38 puede mantener las HSC durante las condiciones de cultivo ex vivo para la transferencia de genes que de otra manera se perderían debido a la activación del estrés inducido por la transducción y el cultivo rico en citoquinas ex vivo.
La inhibición de P38 retuvo las HSC en fase de reposo durante el cultivo ex vivo temprano y redujo la respuesta al daño del ADN
A continuación, se investigó el mecanismo por el cual la inhibición de p38 es capaz de retener la LTRP de las HSC cultivadas y transducidas. No hubo cambios significativos en el número total de células CD34+ ni en su viabilidad con o sin p38i. La población CD34+ 38' 90+ enriquecida con HSC no mostró diferencias en la apoptosis, niveles de ROS o eficiencia de transducción (Figura 16, paneles A-D), y la inhibición de p38 aumentó el porcentaje de HSC fenotípica (Figura 16, panel E).
Dado que se ha demostrado que la transición de las HSC en reposo al ciclo celular desencadena la respuesta al daño del ADN (DDR) y la vía de reparación (Walter, D., y otros, Nature (2015) 520 (7548): páginas 549-52), se examinó si la activación de p38 que se produce con la división de HSC media la vía de DDR en HSPC cultivadas y transducidas ex vivo. De hecho, se encontraron focos de yH2AX aumentados en la población enriquecida de HSC CD34+ CD38‘ CD90+ que se cultivó y transdujo durante 36-42 horas o 72 horas; tal respuesta al daño del ADN se rescató por la inhibición de p38 (Figura 17, paneles A-B). Además, se realizó simultáneamente la tinción de 53bp1 para asegurar que el aumento de yH2AX asociado con los focos de DDR (Figura 17, panel C). La DDR se confirmó mediante citometría de flujo, donde se observó un aumento progresivo de los niveles de yH2AX con un mayor tiempo de cultivo, y se examinó la activación de DDR en células transducidas frente a células no transducidas. La integración del vector ocurre después de una ruptura de la doble cadena de ADN y, por lo tanto, puede provocar un DDR. Skalka, y otros, Cell Death Differ (2005) 12 Suplemento 1: páginas 971-8. En comparación con las HSC no manipuladas (0 h), se observó un aumento de la tinción de yH2AX a las 24 horas, que volvió a los niveles observados en las HSC no manipuladas con tratamiento con p38i (Figura 17, paneles D-F). La expresión de la proteína GFP no está presente en el punto de tiempo de 24 h, ya que es poco después de la transducción. En particular, después de 36 horas, la población no transducida (GFP-) frente a la transducida (GFP+) podría analizarse por separado. La población transducida (GFP+) tenía un yH2AX más alto que la población no transducida (GFP-), tanto en el grupo de 36-42 h como en el de 72-96 h; y p38i redujo significativamente el porcentaje de células yH2AX+, aunque los niveles no volvieron a los observados en HSC a las 0 h, tanto el porcentaje de HSC que se tiñe para yH2AX (Figura 17, panel F) en comparación con HSC a las 0 h (Figura 17, panel D), y el MFI de yH2AX (Figura 17, paneles D-E). Esto indica que la inhibición de p38 reduce significativamente el DDR que ocurre en las HSC tanto con el aumento del tiempo en cultivo como con la transducción, aunque no lo reduce a niveles basales en HSC a las 0 h después de 24h de cultivo y transducción.
A continuación, se examinó el papel de p38i en el ciclo celular de HSC, ya que se demostró que la transición de HSC en reposo al ciclo celular desencadena la vía DDR. Walter, D., y otros, Nature (2015) 520 (7548): páginas 549 52. Casi todas las HSC estaban en fase G0 cuando se aislaron recientemente de MPB. A las 24 h, casi un tercio de ellos pasó a la fase G1. El p38i aumentó significativamente la proporción de HSC en la fase de reposo G0 y disminuyó la proporción de HSC en la fase S-G2-M antes de la primera división HSC (24 h). Sin embargo, después de 24 h, a medida que HSC avanzaba a través del ciclo celular, se perdió el efecto de p38i. Por lo tanto, los datos sugieren que cuando la transducción ocurre en las primeras 24 horas (cuando las HSC están no cíclicas), el retraso mediado por p38i en la transición a la fase S (Figura 17, paneles G-H y Figura 18) probablemente permite a las HSC reparar el daño del ADN, y la reparación de los resultados de DDR en la retención del destino HSC, como lo demuestra el LTRP retenido y una producción de linaje equilibrada. Sin embargo, cuando las HSC se transducen durante el ciclo activo (fase SG2-M), como ocurre con RV, el efecto de p38i se pierde (Figura 17, paneles G-H y Figura 18), y hay una pérdida significativa de LTRP de las HSC transducidas; además, la transducción de las HSC cíclicas hace que produzcan una progenie con desviación mieloide, que recuerda a las HSC envejecidas. Este fenómeno no se limita a las HSC derivadas de MPB, sino que también se observa en las HSC derivadas de la médula ósea humana adulta (Figura 19).
En resumen, estos resultados pueden utilizarse para desarrollar un protocolo clínico de terapia génica para prevenir la pérdida de las hHSC modificadas genéticamente y mejorar el injerto general.
Claims (9)
1. Un método para preservar la actividad de injerto de células madre hematopoyéticas (HSC) sometidas a una manipulación genética ex vivo, que comprende:
i) realizar la manipulación genética ex vivo de las HSC en fase de reposo G0; y
ii) cultivar las HSC modificadas genéticamente producidas en la etapa (i) en un medio que contiene un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK).
2. El método de la reivindicación 1, en donde la manipulación genética comprende la transducción de un vector de integración o en donde la manipulación genética comprende la edición del genoma.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde las HSC se obtienen de un sujeto, opcionalmente en donde el sujeto es un sujeto humano.
4. El método de la reivindicación 3, en donde las HSC son HSC adultas obtenidas de la médula ósea o células de sangre periférica del sujeto humano, o en donde las HSC se obtienen de células de la sangre del cordón umbilical del sujeto humano.
El método de la reivindicación 2, en donde el vector de integración es un vector viral, opcionalmente en donde el vector viral es un vector retroviral o un vector lentiviral.
6. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde las HSC son HSC adultas humanas.
El método de una cualquiera de la reivindicación 6, en donde las HSC adultas humanas se obtienen de la médula ósea o de células de sangre periférica.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el inhibidor de MAPK es doramapimod, ralimetinib, un inhibidor de MAPK p38 basado en aminopiridina competitivo con ATP o un inhibidor piridinil imidazol.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el cultivo se realiza durante 1 a 7 días.
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