ES2908029B2 - Proceso para la obtención, a nivel industrial, de un extracto concentrado en compuestos bioplaguicidas a partir de microalgas y/o cianobacterias, extracto así obtenido y uso del mismo - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para la obtención, a nivel industrial, de un extracto concentrado en compuestos bioplaguicidas a partir de microalgas y/o cianobacterias, extracto así obtenido y uso del mismo

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se engloba en el campo de la producción de productos bioplaguicidas para la agricultura.

Más en concreto, la invención proporciona un proceso de extracción de compuestos con actividad inhibidora del crecimiento de microorganismos fitopatógenos a partir de biomasa de microalgas y/o cianobacterias, con aplicación tanto en la agricultura extensiva como intensiva. En consecuencia, la invención también se refiere al uso del extracto obtenido mediante dicho procedimiento como bioplaguicida en la agricultura.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El impacto ambiental de los plaguicidas de síntesis química, en contraposición a los bioplaguicidas, se ha convertido en una preocupación importante, no solo por la persistencia de los químicos en la capa superior del suelo o por su lixiviación a las aguas subterráneas, sino también por sus efectos no deseados sobre las áreas habitadas que pueden alcanzar estos plaguicidas volatilizados, siendo ya de relevancia, además del impacto ambiental sobre la flora y la fauna, también el efecto tóxico de la exposición a este tipo de químicos sobre la salud del ser humano.

Por ello, el uso de compuestos naturales para el control de plagas, también denominados bioplaguicidas, es una alternativa viable, sostenible y eficaz frente al uso masivo de plaguicidas de síntesis química.

Los bioplaguicidas son productos obtenidos a partir de microorganismos vivos o de productos naturales, que son utilizados para prevenir, repeler, destruir o mitigar cualquier plaga o agente que causa daño a cultivos de plantas, humanos u otros animales. Entre estas plagas se pueden citar insectos, animales, plantas no deseadas, microorganismos (bacterias, hongos, virus) y priones (proteínas que pueden actuar como agentes infecciosos) (Chandler et al., “The development, regulation and use of biopesticides for integrated pest management”, Phil. Trans. R. Soc. B 12 July 2011 vol. 366 no. 15731987-19982011; Carlos Hernández y Gamboa-Angulo, “Metabolites from freshwater aquatic microalgae and fungi as potential natural pesticides”, Phytochemistry Reviews, 2011).

El potencial de las microalgas y cianobacterias, como fuente para la obtención de diversos productos de gran interés para la agricultura, ha ganado relevancia en las últimas décadas. La incidencia de enfermedades causadas por hongos y bacterias fitopatógenas es un problema evidente que genera gran preocupación. En este sentido, las microalgas y las cianobacterias se han posicionado como fuentes de compuestos bioplaguicidas de potencial uso en agricultura. Ambos grupos de organismos fotosintéticos están representados por una gran variedad de especies, adaptadas a muy diversos hábitats ecológicos. Para sobrevivir en un ambiente altamente competitivo, a menudo sufriendo grandes fluctuaciones de los parámetros físicos y químicos, han desarrollado estrategias defensivas y de adaptación, incluyendo la síntesis de numerosos compuestos obtenidos por diferentes rutas metabólicas.

Algunos compuestos destacables sintetizados por las microalgas y/o cianobacterias son: sustancias con actividad antioxidante, como carotenoides y polifenoles; compuestos promotores del crecimiento vegetal, como fitohormonas y esteroles; y sustancias con actividad antimicrobiana, cómo ácidos grasos o polisacáridos. Muchos de estos metabolitos presentan estructuras químicas muy específicas y complejas que no se encuentran entre los organismos terrestres, lo que hace difícil reproducirlas por síntesis química (Falaise et al., “Antimicrobial Compounds from Eukaryotic Microalgae against Human Pathogens and Diseases in Aquaculture”, Mar Drugs. 2016 Sep 2;14(9), 2016; Michalak & Chojnacka, “Algal extracts: Technology and advances”, Engineering in Life Sciences, Vol. 14, 2014; Najdenski et al., “Antibacterial and antifungal activities of selected microalgae and cianobacteria”, Food Science and Technology, Col. 48, 2013; Suárez-Estrella et al., “Biological control of plant pathogens by microorganisms isolated from agro-industrial composts”, Biological Control, 2013).

Así, gracias a su enorme biodiversidad, facilidad de cultivo, rápido crecimiento y control del metabolismo, las microalgas y cianobacterias son cada vez más utilizadas para producir compuestos bioactivos con diferentes aplicaciones, empleándose en forma tanto de extractos microalgales como de metabolitos purificados (Elarroussi et al, “Microalgae polysaccharídes a pmmising plant growth biostimulant”, Journal of Algal Biomass Utilization, 2016).

Las microalgas y cianobacterias han demostrado ser eficaces frente a una gran variedad de agentes fitopatógenos, en general bacterias, hongos y nemátodos. Esta actividad biocida se debe principalmente a la producción de enzimas hidrolíticas y otros compuestos que provocan disrupciones de la membrana citoplasmática, inactivación de enzimas, inhibición de la síntesis de proteínas, etc. (Renuka et al., “Microalgae as multi-functional options in modern agriculture: current trends, prospects and challenges”, Biotechnology Advances 36(4), 2018). Se ha visto que los compuestos fenólicos, como pueden ser los flavonoides o las cumarinas, son los principales metabolitos producidos por microalgas que presentan un amplio espectro de actividad antimicrobiana (Pina-Pérez et al., “Antimicrobial potential of macro and microalgae against pathogenic and spoilage microorganisms in food”, food Chemistry, 2017). Otros compuestos aislados de microalgas que presentan propiedades biocidas son los terpenos, polisacáridos, pigmentos como la clorofila y los carotenoides, y ácidos grasos, como el ácido propanoico y el ácido butanoico (Hernández-Carlos and Gamboa-Angulo, 2011; Michalak and Chojnacka, 2014).

Por ejemplo, en el documento CN107135829A se describe un extracto de algas marrones capaz de reducir la concentración de residuos de pesticidas en plantas y árboles. En el documento CN103114003A se describe un desinfectante preparado a partir de complejos enzimáticos de organismos marinos, fosfatidil deshidrogenasa, enzimas de microalgas marinas y alcaloides pirrólicos marinos para el mismo fin.

Los autores de la invención, tras un importante trabajo de experimentación, han desarrollado un nuevo método para extraer compuestos bioplaguicidas de uso agrícola a partir de biomasa de microalgas y/o cianobacterias.

La novedad del proceso desarrollado se basa en que es un proceso industrial, escalable y realizable a un coste razonable, a diferencia de los métodos descritos en el estado de la técnica, que son métodos analíticos y, como tales, persiguen una cuantificación/extracción completa de los bioplaguicidas sin tener en cuenta su escalado ni coste.

Así, por ejemplo, en el documento de Devi K M et al. (“Antimicrobial activities of freshwater cyanobacterium”, Nostoc sp. from tamdil wetland of mizoram, India: An identification of bioactive compounds by GC-MS. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2016, vol. 7 (3), páginas 1179 - 1191, DOI:10.13040/IJPSR.0975-8232.7(3).1179-91) se describe un método analítico de extracción de compuestos a partir de biomasa (cianobacterias), utilizando disolventes puros o sus mezclas, y ensayando los extractos una vez eliminado por completo el agente extractante. No es en ningún caso un método industrializare, ya que las cantidades de disolvente que utilizan son muy elevadas, requiere de una etapa de purificación del extracto mediante cromatografía, así como el empleo de disolventes puros que extraen compuestos diferentes, por tener polaridades muy diferentes a los de la presente invención. Además, requieren inevitablemente de una etapa de evaporación del disolvente que no es necesaria en esta invención.

En el documento de Salem et al. (“Antimicrobial activity of microalgal extracts with emphasize on Nostoc sp". Life Science Journal, 2014, vol. 11 (12), páginas 752-758) también se describe un método analítico de preparación de extractos de microalgas empleando acetona y metanol puros. Incluye además una etapa de rotura mediante molturación tras congelación con nitrógeno líquido, así como la eliminación del disolvente por evaporación. De nuevo es un método inviable industrialmente que extrae además compuestos distintos en base a las diferentes condiciones de extracción.

En el artículo de Saber A et al. (Insecticidal prospects of algal and cyanobacterial extracts against the cotton leafworm Spodoptera littoralis. Vie et Milieu 2018, vol. 68 (4), páginas 199­ 212, ISSN 0240-8759) se reporta un método analítico de extracción a partir de biomasa de microalgas, que emplea disolventes puros, tiempos de contacto muy elevados, de varias horas, cantidades de disolvente a biomasa muy en exceso, y métodos de rotura solo aplicables a escala de laboratorio.

Por otro lado, en el estado de la técnica, las microalgas y cianobacterias siempre se cosechan húmedas y se secan posteriormente porque, en caso contrario, la biomasa se corrompe rápidamente. Por ello en los métodos descritos en el estado de la técnica se parte de biomasa seca, la cual se somete a humedad justo antes de comenzar los procesos de extracción.

Los autores de la invención han tenido así que superar numerosas dificultades técnicas para poder desarrollar un método que permita la extracción de compuestos bioplaguicidas a partir de microalgas y/o cianobacterias a escala industrial. El método propuesto evita la realización de una etapa de secado tras el cosechado de la biomasa, lo cual supone un gasto económico y energético relevante a nivel industrial, y emplea cantidades muy bajas de disolvente, mezcladas con agua, de polaridad optimizada, que extraen preferentemente los compuestos de interés, en lugar de todos los contenidos en la biomasa de forma indiscriminada.

El presente proceso es robusto y escalable y puede llevarse a cabo en distintas ubicaciones, ya que no depende de un tipo de microalga o cianobacteria en concreto, sino que es adaptable a cualquier especie. Además, es un proceso competitivo en coste, sencillo en su metodología y no requiere de una gran infraestructura o equipamiento.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona un proceso a escala industrial de extracción de compuestos con actividad inhibidora del crecimiento de microorganismos fitopatógenos, denominados aquí en general como compuestos bioplaguicidas, a partir de biomasa de microalgas y/o cianobacterias.

Así, en un aspecto principal de la invención se contempla un procedimiento para la obtención, a nivel industrial, de un extracto concentrado en compuestos bioplaguicidas, a partir de microalgas y/o cianobacterias, que comprende las siguientes etapas:

i) Proporcionar una biomasa de microalgas y/o cianobacterias,

ii) Concentrar o resuspender en medio líquido la biomasa proporcionada en i) hasta alcanzar una concentración en sólidos de entre 60 y 200 g/l,

iii) Liberar el contenido celular de la biomasa obtenida en ii) mediante homogenización a alta presión, operado a una presión moderada, comprendida entre 710i) *7 y 1108 Pa, durante un tiempo optimizado,

iv) Extraer los componentes bioplaguicidas liberados en la etapa iii) en un tanque agitado, empleando una mezcla de un disolvente orgánico, con una polaridad entre 0 y 9, y agua, con una concentración de disolvente entre el 3 y el 44 % (v/v), a una agitación entre 50 y 150 rpm, durante un tiempo entre 0,5 horas y 6 horas, y a una temperatura entre 20°C y 65°C, y

v) Separar mediante medios físicos el extracto que contiene los componentes bioplaguicidas obtenido en iv).

El origen de la biomasa de microalgas y/o cianobacterias, empleada como producto de partida en el proceso de la invención, no es crítico, pudiendo obtenerse a partir de su cultivo para este fin en aguas limpias y con fertilizantes químicos, o bien de procesos de cultivo en los que se use como fuente nutriente aguas residuales y/o de tratamientos de efluentes agroindustriales, purines animales, digestatos de residuos orgánicos, o lixiviados de residuos agrícolas. En este contexto, las microalgas y/o cianobacterias, se pueden producir en cualquier tipo de fotobiorreactor, ya sea en condiciones autótrofas como mixotróficas o heterótrofas.

Las características del proceso de la invención han permitido conectar el cosechado de la biomasa con su procesado, pudiendo, a diferencia de los procesos descritos en el estado de la técnica, partir tanto de biomasa húmeda como de biomasa seca, ya que no se requiere de una etapa de secado, lo que supone un ahorro energético y económico relevante.

En la presente invención, la expresión "biomasa húmeda” se refiere a la biomasa que procede directamente del cosechado y que está en suspensión a una determinada concentración. Es por tanto una pasta de microalgas y/o cianobacterias constituida por la biomasa en sí y por un medio líquido, generalmente el medio acuoso que proviene del medio de cultivo, aunque también puede ser agua procedente del lavado del medio, o cualquier otra fase líquida, en proporciones variables tales que le confieran un grado de humedad.

En una forma particular de realización de la invención se parte de cosechar aproximadamente entre el 5% y el 60% del volumen de un fotobiorreactor que contiene una concentración variable de biomasa de microalgas y/o cianobacterias en suspensión de entre 0,1 g/l y 20 g/l.

La biomasa húmeda, procedente directamente del cosechado, se somete a una etapa de concentración (ii) para alcanzar la concentración de sólidos requerida. En una realización preferida, la concentración de la biomasa húmeda se lleva a cabo mediante centrifugación o filtración por membrana hasta la concentración requerida de entre 60 y 200 g/L.

Opcionalmente, la biomasa húmeda se puede pre-concentrar adicionalmente mediante otros métodos físicos, en particular mediante una etapa de sedimentación o mediante floculación, a una concentración en sólidos de entre 10 y 40 g/l. En el caso de añadir un agente floculante, se selecciona preferentemente de entre sales de Fe y Al, así como polielectrolitos de carácter catiónico, en una concentración de entre el 0,1 y el 20% (p/v).

En caso de partir de biomasa seca, dicha biomasa habrá de resuspenderse en un medio líquido, antes del paso iii) de rotura celular mediante altas presiones, hasta alcanzar la concentración anteriormente indicada (60-200 g/l).

La extracción de los compuestos bioplaguicidas se hace siempre, por tanto, a partir de biomasa con una concentración en sólidos de entre 60 y 200 g/L, previo proceso optimizado de pretratamiento de la biomasa para lograr la rotura celular de las microalgas y/o cianobacterias.

Los autores de la invención han desarrollado un proceso de rotura mediante homogenización de alta presión, pero operado a presión moderada, durante un tiempo optimizado. Dicho proceso se basa en un sistema en el que el flujo de biomasa húmeda entre en una cámara, donde se somete a presiones comprendidas entre 7107 y 1108 Pa, provocando dicha presión la rotura de las células. El tiempo de este proceso se puede optimizar ya que el mismo fluido consistente en la biomasa húmeda puede pasar por la cámara una o varias veces, si fuera necesario, contemplándose preferiblemente en la presente invención entre 1 y 3 pasos por la cámara. Este tipo de proceso es industrial y se aplica en otros campos, pero nunca en métodos a escala de laboratorio, como los descritos en bibliografía, los cuales utilizan molinos de bolas o mortero (ya que requieren partir de biomasa seca) y no son métodos industrializables.

La etapa iv), para la extracción de los compuestos bioplaguicidas, se lleva a cabo en un sistema de agitación y calefacción, tal como un reactor de tanque agitado calefactado. Como agente extractante, se emplea un disolvente orgánico miscible completamente con agua (polaridad entre 0-9). En realizaciones preferidas, el disolvente orgánico empleado en iv) tiene un índice de polaridad entre 3,9 y 7,2, y se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetonitrilo, etilenglicol, isopropanol, metanol, metil etil cetona, nitrometano o tetrahidrofurano o combinaciones de los mismos.

La etapa v) de separación del extracto de la biomasa residual de microalgas y/o cianobacterias, se puede llevar a cabo por cualquier método físico de separación adecuado, por ejemplo, por centrifugación o filtración.

Las principales ventajas que se derivan del procedimiento de la presente invención son:

- Se aplica a biomasa húmeda sin necesidad de ser secada, ya que el método permite conectar el cosechado con el procesado de la biomasa. La mayoría, si no todos, los métodos de laboratorio emplean biomasa seca como punto de partida. El secado de la biomasa es costoso y poco sostenible a nivel industrial, además de dañar algunos compuestos de interés. No obstante, el proceso de la invención también se puede llevar a cabo partiendo de biomasa seca.

- Se utilizan solventes biocompatibles, como acetona, para que el proceso sea realizable a nivel industrial y se cumpla la normativa vigente. Los métodos analíticos pueden emplear este u otros disolventes no biocompatibles, algunos de ellos pueden resultar tóxicos o explosivos cuando se manejan en grandes cantidades por lo que no está permitido su uso industrial.

- La extracción se hace previo proceso optimizado de pretratamiento de la biomasa. - La proporción de disolvente, tiempo y condiciones de extracción se han optimizado para que sea realizable y ajustado en coste a nivel industrial. En los métodos analíticos la proporción de disolvente es siempre en gran exceso, así como el tiempo de extracción para garantizar la extracción completa de los compuestos de interés. Las condiciones de extracción son también "extremas” para priorizar la extracción de los compuestos objetivo independientemente del coste que ello suponga o el deterioro que produzca en el resto de la biomasa.

- El producto final no requiere separación del disolvente. Los métodos analíticos u otras patentes requieren separar el disolvente para que producto final no sea tóxico o perjudicial para su aplicación.

En otro aspecto principal de la invención, se contempla el extracto obtenido a partir del procedimiento de la invención. El producto así obtenido es un extracto bioplaguicida líquido rico en compuestos con actividad bioplaguicida de origen natural.

Los compuestos bioplaguicida de interés se seleccionan preferentemente de entre ácidos grasos, incluyendo ácido láurico (C12:0), ácido palmítico (C16:0), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido oleico (C18:1) y ácido esteárico (C18:0), que tienen usos potenciales como antibióticos y como agentes antifúngicos; también terpenos (algunos halogenados), con propiedades bactericidas, antioxidantes, antimaláricas, insecticidas y citotóxicas, polifenoles, polisacáridos, pigmentos como clorofila y carotenoides, ácidos orgánicos tales como ácido propánico y ácido butanoico, y otros compuestos como Laxaficina A, Laxaficina B, Anatoxina-A, Eremofilona, Ambigol A, Ambigol B, Isonitrilo de ambiguina, Pahayokolidos, Microcistina y Criptoficina).

En otro aspecto principal de la invención se contempla una formulación con actividad bioplaguicida que comprende el extracto obtenido mediante el procedimiento de la invención.

En una realización particular, la formulación comprende una dilución del extracto de entre el 10% y el 40%, un compuesto mojante, y agua desmineralizada hasta completar el volumen final de la formulación.

El agente mojante empleado en la formulación del producto final se puede seleccionar de entre propilenglicol, lauril éter sulfato sódico y alcohol etoxilado, o cualquier otro agente análogo de propiedades físico-químicas similares. De forma preferida, se emplea alcohol etoxilado a una concentración de entre el 2 y el 20%.

Finalmente, en otro aspecto principal de la invención se contempla el uso del extracto obtenido como bioplaguicida en agricultura, preferiblemente mediante aplicación foliar o fertirrigación en cultivos, empleándose el extracto en forma diluida a una concentración de entre 0,2 g/l y 6,0 g/l.

A continuación, se describe la invención en base a un ejemplo de realización de la misma.

EJEMPLO

A partir de los sistemas de producción de biomasa de microalgas y/o cianobacterias, se cosechó un cultivo de biomasa de microalgas y cianobacterias, en modo continuo, conteniendo la biomasa a una concentración aproximada de 1g/L, concentrando la biomasa en continuo hasta 140 g/L mediante un sistema de centrífugas de boquillas en serie. A continuación, la biomasa concentrada se pasó a un sistema de homogenización a alta presión donde se procedió a la rotura controlada de la biomasa a una presión moderada de trabajo de 1108 Pascales. Posteriormente, la biomasa concentrada y homogenizada, se pasó a un reactor tipo tanque agitado de 500 L donde tuvo lugar el proceso de extracción en modo semi-continuo, en condiciones de temperatura controlada, empleando volúmenes adecuados de disolventes biocompatibles.

En este ejemplo, como disolvente extractante se utilizó acetona a una concentración de 10 ml por g equivalente de biomasa. El proceso de extracción se llevó a cabo ajustando la agitación a 50 rpm, a una temperatura de 60°C, manteniéndose en agitación durante 0,6 horas.

Posteriormente, se procedió a la separación de la biomasa residual del extracto conteniendo los compuestos de actividad bioplaguicida. Para ello, el volumen de extracción se sometió a centrifugación en continuo mediante el uso de una centrifuga de cámara y discos. El proceso de extracción en modo semi-continuo se repitió por lotes hasta el total procesado de la biomasa concentrada y homogenizada disponible.

A partir del extracto concentrado en compuestos bioplaguicidas obtenido, se formuló el producto final. La formulación final se obtuvo mediante una dilución del 12% del extracto obtenido, y alcohol etoxilado como compuesto mojante, a una concentración del 2%, completándose con agua desmineralizada hasta el volumen final.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la obtención, a nivel industrial, de un extracto concentrado en compuestos bioplaguicidas, a partir de microalgas y/o cianobacterias, que comprende las siguientes etapas:

i) Proporcionar una biomasa de microalgas y/o cianobacterias,

ii) Concentrar o resuspender en medio líquido la biomasa proporcionada en i) hasta alcanzar una concentración de sólidos entre 60 y 200 g/L,

iii) Liberar el contenido celular de la biomasa obtenida en ii) mediante homogenización a alta presión, operado a una presión moderada, comprendida entre 7105 *7 y 1108 Pa, durante un tiempo optimizado,

iv) Extraer los componentes bioplaguicidas liberados en la etapa iii) en un tanque agitado, empleando una mezcla de un disolvente orgánico, con una polaridad entre 0 y 9, y agua, con una concentración de disolvente entre el 3 y el 44 % (v/v), a una agitación entre 50 y 150 rpm, durante un tiempo entre 0,5 horas y 6 horas, y a una temperatura entre 20°C y 65°C, y

v) Separar mediante medios físicos el extracto que contiene los componentes bioplaguicidas obtenido en iv).

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, donde la biomasa proporcionada en el paso i) es biomasa húmeda.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, donde la concentración de la biomasa húmeda en el paso ii) se lleva a cabo mediante centrifugación o filtración por membrana.

4. Procedimiento, según la reivindicación 2 ó 3, donde adicionalmente la biomasa húmeda se pre-concentra mediante sedimentación o floculación.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, donde la biomasa húmeda se pre­ concentra mediante sedimentación a una concentración en sólidos de entre 10 y 40 g/l.

6. Procedimiento, según la reivindicación 4, donde la biomasa húmeda se pre­ concentra mediante la adición de un agente floculante en una concentración de entre 0,1 y 20 % (p/v).

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el disolvente orgánico empleado en iv) tiene una índice de polaridad entre 3,9 y 7,2.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, donde el disolvente se selecciona del grupo consistente en acetona, acetonitrilo, etilenglicol, isopropanol, metanol, metil etil cetona, nitrometano o tetrahidrofurano o combinaciones de los mismos.

9. Extracto concentrado con actividad bioplaguicida obtenido según el procedimiento de las reivindicaciones 1-8.

10. Formulación con actividad bioplaguicida que comprende el extracto de la reivindicación 9.

11. Formulación, según la reivindicación 10, que comprende una dilución del extracto de entre el 10% y el 40%, un compuesto mojante, y agua desmineralizada hasta completar el volumen final.

12. Formulación, según la reivindicación 11, donde el agente mojante empleado es alcohol etoxilado a una concentración entre el 2 y el 20%.

13. Uso de un extracto, según la reivindicación 9, o una formulación, según la reivindicación 10, como bioplaguicida en agricultura.