ES2906102T3 - Cultivo escalable en suspensión de agregados de células madre pluripotentes de primate y su diferenciación - Google Patents

Abstract

Un sistema de frasco rodante que comprende, un frasco rodante y medios para hacer girar el frasco rodante, en donde el frasco rodante comprende un cultivo de agregados de células madre pluripotentes de primate (pPSC) o agregados derivados de pPSC en suspensión en un medio fisiológicamente aceptable, en donde dichos agregados son agregados homocelulares o heterocelulares distintos de los cuerpos embrionarios y en donde los medios para hacer girar el frasco rodante son adecuados para hacer girar el frasco rodante a una velocidad de giro de 3 rpm a 30 rpm.

Description

DESCRIPCIÓN

Cultivo escalable en suspensión de agregados de células madre pluripotentes de primate y su diferenciación DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O EL DESARROLLO CON FONDOS FEDERALES

Parte del trabajo realizado durante el desarrollo de esta invención utilizó fondos del Gobierno de EE.UU. de la Beca N.° 5 R24 RR021313-05 del National Institutes of Health. El gobierno de EE.UU. posee determinados derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas de frascos rodantes que comprenden agregados de células en suspensión y métodos para generar y diferenciar dichos agregados en frascos rodantes.

Antecedentes de la invención

Hasta ahora, no existe ningún sistema eficiente que proporcione un proceso de fabricación a gran escala ("escalado") para células pluripotentes de mamíferos tales como células madre embrionarias humanas (hESC) como se describe en el presente documento. Para mantener las hESC en un estado indiferenciado in vitro, las hESC se mantienen en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y se hacen pases mediante disociación mecánica manual (por ejemplo, microdisección) y transfiriendo partes de colonias individuales. Estos métodos son suficientes para estudios de investigación que no requieren producción a gran escala de hESC indiferenciadas o hESC diferenciadas, direccionamiento génico, descubrimiento de fármacos, toxicología in vitro, aplicaciones clínicas futuras que requieren métodos mejorados para la expansión estable a gran escala de hESC, incluyendo el pase enzimático.

Puede realizarse la expansión enzimática de hESC, pero estos métodos tienen desventajas técnicas porque las hESC dependen de las interacciones célula-célula, así como de las señales paracrinas y autocrinas para la supervivencia. Por tanto, las hESC prefieren este microambiente celular en comparación con el que existe como células individuales. Además, hay informes que indican que la disociación enzimática de hESC puede conducir a cariotipos anormales y dar como resultado cambios genéticos y epigenéticos. Por lo tanto, proporcionar un entorno de cultivo de gran apoyo y, al mismo tiempo, permitir una expansión fuerte a gran escala (es decir, un proceso de fabricación) de hES indiferenciadas o hESC diferenciadas sin comprometer la pluripotencia, la multipotencia o la estabilidad genética durante períodos de cultivo prolongados es esencial.

Las células pluripotentes humanas ofrecen oportunidades únicas para investigar las etapas tempranas del desarrollo humano, así como para la intervención terapéutica en diversas patologías, tales como diabetes mellitus y enfermedad de Parkinson. Por ejemplo, el uso de células p productoras de insulina derivadas de hESC ofrecería una gran mejora con respecto a los procedimientos de terapia celular actuales que utilizan células de páncreas de donantes. Actualmente los tratamientos de terapia celular para la diabetes mellitus, que utilizan células de páncreas de donantes, están limitadas por la escasez de células de los islotes de alta calidad necesarias para el trasplante. La terapia celular para un solo paciente diabético tipo I requiere un trasplante de aproximadamente 8x108 células de los islotes pancreáticos (Shapiro et al. 2000, N Engl J Med 343:230-238; Shapiro et al. 2001a, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15:241-264; Shapiro et al. 2001, British Medical Journal 322:861). Como tal, se requieren al menos dos órganos de donantes sanos para obtener suficientes células de los islotes para un trasplante exitoso.

Por lo tanto, las hESC representan un poderoso sistema modelo para la investigación de los mecanismos que subyacen a la biología de células pluripotentes y la diferenciación dentro del embrión temprano, así como brindar oportunidades para la manipulación genética de mamíferos y la comercialización, las aplicaciones médicas y agrícolas resultantes. Adicionalmente, la proliferación y diferenciación apropiadas de hESC puede usarse posiblemente para generar una fuente ilimitada de células adecuadas para el trasplante en el tratamiento de enfermedades resultantes de daños o disfunciones celulares. Otras células pluripotentes y líneas celulares que incluyen células de tipo ectodermo primitivo temprano (EPL, por sus siglas en inglés) como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 99/53021, ICM/epiblasto derivado in vivo o in vitro, ectodermo primitivo derivado in vivo o in vitro, células germinales primordiales (células EG), células de teratocarcinoma (células EC) y células pluripotentes derivadas por desdiferenciación o por transferencia nuclear compartirán algunas o todas estas propiedades y aplicaciones. La solicitud de patente internacional WO 97/32033 y la patente de EE.UU. n.° 5.453.357 describen células pluripotentes que incluyen células de especies distintas de roedores. Las células madre embrionarias humanas se han descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO 00/27995 y en la patente de EE.UU. n.° 6.200.806 y las células EG humanas se han descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO 98/43679.

Los mecanismos bioquímicos que regulan la pluripotencia y la diferenciación de las células madre embrionarias son muy poco conocidos. Sin embargo, los limitados datos empíricos disponibles (y mucha evidencia anecdótica) sugieren que el mantenimiento continuo de células ES pluripotentes en condiciones de cultivo in vitro dependen de la presencia de citocinas y factores de crecimiento presentes en el medio extracelular.

Aunque las ESC humanas ofrecen una fuente de material de partida a partir del cual desarrollar cantidades sustanciales de células diferenciadas de alta calidad para terapias con células humanas, estas células deben obtenerse y/o cultivarse en condiciones que sean compatibles con las directrices reguladoras esperadas que rigen la seguridad y eficacia clínicas. Es probable que dichas pautas requieran el uso de medios con todos los componentes obtenidos con GMPc. El desarrollo de tales condiciones convencionales químicamente definidas/GMP es necesario para facilitar el uso de hESC y células derivadas de hESC con fines terapéuticos en seres humanos.

Además, la eventual aplicación de terapias de reemplazo celular basadas en hESC requerirá el desarrollo de métodos que permitan condiciones de cultivo y diferenciación a gran escala que cumplan con las directrices reguladoras. Aunque varios grupos han notificado condiciones de crecimiento simplificadas para hESC, existen limitaciones sustanciales con estos estudios. Sin embargo, hasta ahora, el aislamiento, mantenimiento clonal prolongado, manipulación genética y transmisión de la línea germinal exitosos de células pluripotentes generalmente ha sido difícil.

La mayoría de las condiciones de cultivo celular de células madre siguen conteniendo sustituto de suero (KSR) en los medios (Xu et al. 2005 Stem Cells, 23:315-323; Xu et al. 2005 Nature Methods, 2:185-189; Beattie et al. 2005 Stem Cells, 23:489-495; Amit et al. 2004 Biol. Reprod., 70:837-845; James et al. 2005 Development, 132:1279-1282). KSR contiene una fracción sin elaborar de seroalbúmina bovina (BSA, bovine serum albumin) en lugar de una fuente altamente purificada. Otros investigadores solo han realizado estudios a corto plazo y, por lo tanto, no está claro si sus condiciones permitirían el mantenimiento de la pluripotencia durante períodos prolongados (Sato et al.

2004, Nature Med. 10:55-63; Publicaciones de Patentes de EE.UU. N.° 2006/0030042 y 2005/0233446). Otros investigadores han demostrado un mantenimiento prolongado de la pluripotencia en un medio químicamente definido con FGF2, activina A e insulina, pero las células se cultivaron en placas recubiertas con suero humano, que fue "lavado" antes de la siembra en placa de células (Vallier et al. 2005 J Cell Sci., 118(Pt 19):4495-509). Aunque el FGF2 ha sido un componente de todos estos medios, no está claro si proporciona una señal de autorrenovación primaria o secundaria (Bendall et al. 2007 Nature 448:1015-1027); particularmente porque en algunas formulaciones es necesario usarlo en una concentración alta (hasta 100 ng/ml, Xu et al. 2005 Nature Methods, 2:185-189).

Adicionalmente, todos estos grupos han incluido insulina en sus medios a niveles de pg/ml, o tienen insulina presente debido al uso de KSR. Se considera normalmente que la insulina funciona en el metabolismo de la glucosa y en la señalización de la "supervivencia celular" a través de la unión al receptor de insulina. Sin embargo, a niveles superiores a las concentraciones fisiológicas, la insulina también puede unirse al receptor de IGF1 con una eficiencia menor y conferir la actividad clásica del factor de crecimiento a través de la ruta PI3 Cinasa/AKT. La presencia/requerimiento de niveles tan altos de insulina (niveles de pg/ml) en KSR o estas otras condiciones de los medios sugiere que la actividad principal se provoca a través de la unión al receptor de IGF1, que se expresa por las hESC (Sperger et al. 2003 PnAs , 100(23):13350-13355). Otros investigadores han observado la expresión de un complemento completo de IGF1R y de miembros de la ruta de señalización intracelular en las hESC, lo que probablemente signifique la actividad funcional de esta ruta (Miura et al. 2004 Aging Cell, 3:333-343). La insulina o el IGF1 pueden provocar una señal importante necesaria para la autorrenovación de las hESC, como se sugiere por el hecho de que todas las condiciones desarrolladas hasta ahora para el cultivo de hESC contienen cualquiera de insulina, insulina proporcionada por KSR o IGF1 proporcionado por el suero. En apoyo de este concepto, se ha demostrado que si la PI3 cinasa se inhibe en los cultivos de hESC, las células se diferencian (D'Amour et al. 2005, Nat. Biotechnol 23:1534-41; McLean et al. 2007 Stem Cells 25:29-38).

Una publicación reciente describe un medio definido humanizado para las hESC (Ludwig et al. Nature Biotechnology, publicado en línea el 1 de enero de 2006, doi:10.1038/nbtl 177). Sin embargo, esta formulación reciente, incluye diversos factores que se sugiere que influyen en la proliferación de hESC, incluyendo FGF2, TGFp, LiCl, ácido ^y-aminobutírico y ácido pipecólico. Se observa que este medio de cultivo celular recientemente definido también contiene insulina.

El solicitante informó anteriormente un paradigma de señalización de autorrenovación para hESC basado en una combinación de señalización de insulina/IGF1, herregulina, Activina A. Véase Wang et al. 2007 Blood 110:4111-4119. En este contexto los presentes inventores han descubierto que una señal de FGF2 exógena es redundante y no es necesaria (Schulz & Robins 2009, citado anteriormente) Schulz y Robins 2009, (En: Lakshmipathy et al. eds., Emerging Technology Platforms for Stem Cells. John Wiley y Sons., Hoboken, NJ, págs. 251-274); La herregulina es un miembro de la familia de factores de crecimiento eGf . Hay al menos 14 miembros, incluyendo, pero sin limitación, EGF, TGFp, EGF de unión a heparina (hb-EGF), neurregulina-p (también denominada herregulina-p (HRG-p), factor de crecimiento glial y otros), HRG-a, anfirregulina, betacelulina y epirregulina. Todos estos factores de crecimiento contienen un dominio EGF y normalmente se expresan primero como proteínas transmembrana que son procesadas por proteínas metaloproteinasas (específicamente, ADAm ) para generar factores de crecimiento de ectodominio solubles. Los miembros de la familia ^eG^f interactúan con homo o heterodímeros de los receptores de superficie celular ErbB1, 2, 3 y 4 con diferentes afinidades (Jones et al. FEBS Lett, 1999, 447:227-231). eGf , TGFa y hbEGF se unen a homodímeros ErbB1/1 (EGFR) y heterodímeros ErbB1/2 con alta afinidad (intervalo 1-100 nM), mientras que HRG-p se une a ErbB3 y ErbB4 con una afinidad muy alta (rango <1 nM). Los receptores ErbB activados envían señales a través de la ruta PI3 Cinasa/AKT y también a través de la ruta MAPK. ErbB2 y ErbB3 se encuentran entre los receptores de factores de crecimiento más altamente expresados en las hESC (Sperger et al.

2003, PNAS, 100:13350-13355) y se ha demostrado anteriormente que HRG-p apoya la expansión de las células germinales primordiales de ratón (Toyoda-Ohno et al. 1999, Dev. Biol., 215:399-406). Adicionalmente, la sobreexpresión y la posterior activación inapropiada de ErbB2 se asocia a tumorigénesis (Neve et al. 2001 Ann. Oncol, 12(Supl 1):S9-13; Zhou y Hung, 2003 Semin. Oncol. 30(5 Supl 16):38-48; Yarden, 2001, Oncology, 61 Supl 2:1-13). ErbB2 humano (Cromosoma 17q) y ErbB3 (Cromosoma 12q) están presentes en los cromosomas que se ha observado que se acumulan como trisomías en algunas hESC (Draper et al. 2004 Nat. Biotechnol. 22:53-4; Cowan et al. 2004 N Engl. J. Med. 350(13): 1353-6; Brimble et al. 2004 Stem Cells Dev., 13:585-97; Maitra et al. 2005 Nat. Genet. 37:1099-103; Mitalipova et al. 2005 Nat. Biotechnol. 23: 19-20; Draper et al. 2004 Stem Cells Dev., 13:325-36; Ludwig et al. Nature Biotech, publicado en línea el 1 de enero de 2006, doi:10.1038/nbtl 177).

ErbB2 y ErbB3 (Brown et al. 2004 Biol. Reprod., 71:2003-11; Salas-Vidal y Lomeli, 2004 Dev Biol. 265:75-89) se expresan en el blastocisto de ratón, aunque no se restringen específicamente a la masa celular interna (ICM) y ErbB1, EGF y TGFp se expresan en el blastocisto humano (Chia et al. 1995 Development, 1221(2):299-307). HB-EGF tiene efectos proliferativos en el cultivo de blastocisto IVF humano (Martin et al. 1998 Hum. Reprod. 13:1645-52; Sargent et al. 1998 Hum. Reprod. 13(Supl 4):239-48) y efectos adicionales moderados sobre células ES de ratón cultivadas en suero al 15 % (Heo et al. 2006 Am. J. Phy. Cell Physiol. 290:C123-33, Epub 17 de agosto de 2005. El desarrollo previo y posterior a la implantación temprana no parece verse afectado en embriones nulos ErbB2-/-, ErbB3-/-, Neurregulina1-/-(Britsch et al. 1998 Genes Dev., 12:1825-36), ADAM17-/-(Peschon et al. 1998 Science, 282: 1281-1284) y ADAM19-/-(Horiuchi 2005 Dev. Biol. 283:459-71). Por lo tanto, la importancia de la señalización a través de la familia de receptores ErbB en hESC es, hasta el momento, poco clara.

La neurregulina-1 (NRG1) es un gen grande que exhibe múltiples variantes de procesamiento de corte y empalme y proteínas. Esta genera una gran cantidad de isoformas de proteínas, que en su conjunto, en el presente documento, recibe el nombre de neurregulina. La neurregulina se expresa predominantemente como una proteína transmembrana de la superficie celular. La región extracelular contiene un dominio de tipo inmunoglobulina, una región modificada con carbohidratos y el dominio EGF. Las isoformas de expresión de NRG1 se han revisado anteriormente (Falls 2003 Exp. Cell Res. 284:14-30). Se ha demostrado que las metaloproteasas de la membrana celular ADAM 17 y ADAM 19 procesan la forma o formas transmembrana de neurregulina-1 a neurregulina/herregulina soluble. HRG-a y -p son los ectodominios escindidos de neurregulina, que contienen el EGF y otros dominios. Como el dominio EGF es responsable de la unión y activación de los receptores ErbB, una molécula recombinante que contiene solo este dominio puede exhibir esencialmente todos los efectos del factor de crecimiento soluble de esta proteína (Jones et al. 1999 FEBS Lett. 447:227-31). Además, hay isoformas transmembrana procesadas de neurregulina que se cree que desencadenan la señalización yuxtacrina en células adyacentes a través de la interacción del dominio EGF con los receptores ErbB.

Aun así, un avance importante en la progresión de la investigación de hESC hacia el mantenimiento de la pluripotencia en cultivo será el esclarecimiento de los medios y las condiciones del cultivo celular que sean compatibles con las directrices reguladoras esperadas que gobiernan la seguridad y eficacia clínicas. Aunque el mejor resultado sería la disponibilidad de medios químicamente definidos para hESC, los componentes que no están definidos químicamente serían aceptables si se produjeran según las normas GMP. Existe la necesidad, por lo tanto, de identificar métodos y composiciones para el cultivo y estabilización de una población de células madre pluripotentes que sean capaces de usarse con fines terapéuticos, en donde las composiciones de cultivo se definen y/o se producen según las normas GMP.

La producción de progenitores comprometidos o tipos de células diferenciadas que pueden funcionar después del trasplante es una promesa central del potencial de la investigación terapéutica basada en hESC. Usando un protocolo paso a paso, en particular, un protocolo escalonado de 4 etapas sustancialmente similar al descrito en el presente documento y anteriormente en las publicaciones de patentes y no patentes del Solicitante, también denominado en el presente documento, células madre pluripotentes de primate (pPSC, por las siglas del inglés primate pluripotent stem cells), por ejemplo, hESC o iPSC, son células diferenciables que pueden dirigirse para diferenciarse a una población mixta de células de tipo pancreático al final de la fase 4. La mezcla de células contiene al menos células comúnmente denominadas "progenitores pancreáticos" o "endodermo pancreático" o "epitelio pancreático", todos también denominados "PE", o "endodermo pancreático positivo para PDX1" o "células de endodermo pancreático" o "PEC" o equivalentes de los mismos.

La composición celular de PEC se ha caracterizado completamente como se describe en las solicitudes de patente y no patentes anteriores del Solicitante, incluyendo, pero sin limitación, Kroon et al. 2008 Nature Biotechnology 26:443-52 y las Patentes de EE.UU. N.° 7.534.608; 7.695.965; y 7.993.920, titulada METHODS FOR MAKING INSULIN IN VIVO y 8.278.106, titulada ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS. Usando citometría de flujo, la cuantificación de más de 20 muestras de más de 10 lotes de desarrollo diferentes de PEC mostró los siguientes tipos de células. Aproximadamente el 50 % (en el intervalo del 33-60 %) de la mezcla de células consistía en células que expresan NKX6-1 pero no Cromogranina (CHGA). Aproximadamente el 44% (intervalo del 33-62%) de las células endocrinas polihormonales expresan CHGA. Se ha demostrado que las células CHGA positivas se desarrollan y maduran a células que expresan glucagón después de trasplante o implantación in vivo. Aproximadamente el 7 % (intervalo del 1,3-13 %) expresa PDX1 mientras que al mismo tiempo no expresa CHGA o NKX6-1 (población solo PDX1). Un grupo muy pequeño de células, aproximadamente el 1 % (intervalo del 0,27-6,9%) en la mezcla o población no expresa ninguno de los marcadores anteriores: ni PDX1, ni NKX6-1, ni CHGA (o células triple negativas). Por tanto, PEC o los equivalentes de los mismos se refiere a esta población o mezcla de células. La composición o población de PEC también se describe con más detalle en el Ejemplo de Referencia 26 y la Tabla 12. Kroon et al. 2008, citado anteriormente, Schulz et al. 2012, citado anteriormente, cuyas divulgaciones se incorporan todas en el presente documento por referencia en sus totalidades.

Las PEC implantadas, encapsuladas o no encapsuladas, dan lugar a estructuras funcionales similares a islotes in vivo a través de un mecanismo que parece implicar principalmente al compromiso de novo de los progenitores pancreáticos con los linajes endocrinos seguido de una maduración adicional de las células p que responden a la glucosa. Por lo tanto dichos injertos son capaces de detectar la glucosa en sangre, respondiendo con liberación medida de insulina humana procesada y protegiendo contra la hiperglucemia inducida por estreptozotocina (STZ) en ratones. Véase Kroon et al. 2008, citado anteriormente.

Mientras que otros linajes pancreáticos candidatos han derivado de hESC, ninguno ha demostrado una función sustancial posterior al injerto in vivo, como se define tanto por la secreción prolongada de péptido c humano sensible a glucosa como por la protección contra la hiperglucemia inducida por STZ. Sin función demostrada en modelos animales, es difícil medir la escalabilidad, o el potencial clínico, de estos protocolos alternativos. Véase Cai J. et al.

2009 J Mol Cell Biol 2:50-60; Johannesson et al. 2009 PLoS One 4:e4794; Mfopou et al. 2010 Gastroenterology 138: 2233-2245; Ungrin et al. 2011 Biotechnol Bioeng. 2 de diciembre. doi:10.1002/bit.24375; Clark et al. 2007 Biochem Biophys Res Commun 356:587-593; Jiang et al. 2007 Cell Res 17: 333-344; y Shim et al. 2007 Diabetologia 50:1228-1238.

La invención descrita en el presente documento sigue la demostración previa del Solicitante de que las condiciones sin alimentador usando medios definidos pueden soportar el pase de células individuales y el cultivo en masa de hESC. Véase Schulz y Robins 2009, citado anteriormente; y la Patente de EE.UU. N.° 8.278.106, titulada ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS. Es fundamental para la progresión de la tecnología basada en hESC a los ensayos clínicos una demostración de escalabilidad comparable. Las mejoras que potencian las eficiencias de la expansión también ahorrarán tiempo y producirán ahorros de costes, así como minimizar la posibilidad de que la población se desplace a lo largo del tiempo dedicado al cultivo. Véase Maitra et al. 2005 Nat Genet 37:1099-1103. Cabe destacar que, el escalado usando frascos rodantes como se describe en el presente documento, por ejemplo, junto con la criopreservación de hESC, proporciona un material definido y consistente para la fabricación de productos para estrategias de investigación y desarrollo a corto y largo plazo.

Sumario de la invención

En el presente documento se desvelan composiciones que comprenden una solución nutritiva de sal basal y un ligando ErbB3, estando las composiciones esencialmente exentas de suero.

En el presente documento también se desvelan composiciones que comprenden una solución nutritiva de sal basal y un medio para estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2 en células diferenciables.

En el presente documento se desvelan métodos de cultivo de células diferenciables, comprendiendo los métodos la siembra en placa de células diferenciables en una superficie de cultivo celular, proporcionar una solución nutritiva de sal basal a las células diferenciables y proporcionar un ligando que se une específicamente a ErbB3.

En el presente documento se desvelan métodos de cultivo de células diferenciables, comprendiendo los métodos la siembra en placa de células diferenciables en una superficie de cultivo celular y proporcionar una solución nutritiva de sal basal a las células diferenciables y un medio para estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2 en las células diferenciables.

En el presente documento se desvelan métodos de cultivo de células diferenciables, comprendiendo los métodos proporcionar una solución de digestión a una capa de células diferenciables que están contenidas en una cámara de cultivo antes de la digestión, donde la digestión separa la capa de células en células individuales. Después de la digestión, las células individuales se colocan en una nueva cámara de cultivo tisular con una solución de cultivo de células diferenciables, en donde la solución de cultivo de células diferenciables comprende una solución nutritiva de sal basal y un ligando ErbB3. Una vez cultivadas, las células diferenciables individuales se colocan en condiciones que permitan el crecimiento y la división de las células individuales.

En el presente documento se desvelan métodos para generar un agregado de células hES en suspensión a partir de un cultivo adherente de hES pluripotente, cultivando una célula hES en una condición de cultivo de crecimiento adherente que permite la expansión en un estado indiferenciado; disociando el cultivo de células hES adherentes en un cultivo en suspensión unicelular; poniendo en contacto el cultivo en suspensión unicelular con una primera condición de cultivo de diferenciación que permite la formación de agregados de células derivadas de hES en suspensión agitando el cultivo en suspensión unicelular hasta un período de tiempo tal en que el cultivo en suspensión unicelular forma un agregado celular derivado de hES en suspensión y, por lo tanto, generando un agregado de células derivadas de hES en suspensión. La agitación del cultivo en suspensión unicelular puede realizarse mediante rotación de aproximadamente 80 rpm a 160 rpm

En el presente documento también se desvelan métodos para generar un agregado de células derivadas de hES en suspensión a partir de una suspensión unicelular derivada de hES, cultivando una célula hES en una condición de cultivo de crecimiento adherente que permite la expansión en un estado indiferenciado; poniendo en contacto la célula hES indiferenciada con una primera condición de cultivo de diferenciación adecuada para diferenciar la célula hES y dando como resultado una célula adherente derivada de hES; disociando la célula derivada de hES adherente en un cultivo en suspensión unicelular; poniendo en contacto el cultivo en suspensión unicelular con una segunda condición de cultivo de diferenciación que permite la formación de agregados de células derivadas de hES en suspensión agitando el cultivo en suspensión unicelular hasta un período de tiempo tal en que el cultivo en suspensión unicelular forma un agregado celular derivado de hES en suspensión y por lo tanto, generando un agregado celular derivado de hES en suspensión. La agitación del cultivo en suspensión unicelular puede realizarse mediante rotación de aproximadamente 80 rpm a 160 rpm.

La invención se refiere a un sistema de frasco rodante que comprende un frasco rodante y medios para hacer girar dicho frasco, en donde el frasco rodante comprende un cultivo de agregados de células madre pluripotentes de primate (pPSC) o agregados derivados de pPSC en suspensión en un medio fisiológicamente aceptable, en donde dichos agregados son agregados homocelulares o heterocelulares distintos de los cuerpos embrionarios y en donde los medios para hacer girar el frasco rodante son adecuados para hacer girar el frasco rodante a una velocidad de giro de 3 rpm a 30 rpm. En determinados aspectos de la invención, los agregados de pPSC son células seleccionadas del grupo que consiste en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En otros casos, los agregados de pPSC pueden ser otras células madre pluripotentes humanas.

Es posible que el frasco rodante no esté ventilado, pero puede ventilarse dependiendo de la capacidad de la incubadora o el horno.

La invención también se refiere a métodos para generar un cultivo de agregados de pPSC suspendidos en un medio fisiológicamente aceptable en un frasco rodante, poniendo en contacto las pPSC con una condición de cultivo de células madre pluripotentes y agitando el cultivo a una velocidad de rotación de 3 rpm a 30 rpm hasta que se formen agregados de pPSC, generando de esta manera un cultivo de agregados de pPSC suspendidos en un medio fisiológicamente aceptable en el frasco rodante. La agitación del cultivo de pPSC puede realizarse mediante rotación a aproximadamente 3 rpm, aproximadamente 4 rpm, aproximadamente 5 rpm, aproximadamente 6 rpm, aproximadamente 7 rpm, aproximadamente 8 rpm, aproximadamente 9 rpm, aproximadamente 10 rpm, aproximadamente 11 rpm, aproximadamente 12 rpm, aproximadamente 13 rpm, aproximadamente 14 rpm, aproximadamente 15 rpm, aproximadamente 16 rpm, aproximadamente 17 rpm, aproximadamente 18 rpm, aproximadamente 19 rpm, aproximadamente 20 rpm, aproximadamente 21 rpm, aproximadamente 22 rpm, aproximadamente 23 rpm, aproximadamente 24 rpm, aproximadamente 25 rpm, aproximadamente 26 rpm, aproximadamente 27 rpm, aproximadamente 28 rpm, aproximadamente 29 rpm y aproximadamente 30 rpm.

Normalmente, la agitación del cultivo de pPSC se realiza mediante rotación a aproximadamente 5 rpm, aproximadamente 6 rpm, aproximadamente 7 rpm, aproximadamente 8 rpm, aproximadamente 9 rpm, aproximadamente 10 rpm, aproximadamente 11 rpm y aproximadamente 12 rpm.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para diferenciar agregados de pPSC en un frasco rodante, que comprende proporcionar un cultivo de pPSC indiferenciadas, agitar las pPSC en un medio fisiológicamente aceptable en un frasco rodante a una velocidad de giro de 3 rpm a 30 rpm para formar agregados de pPSC y poner en contacto los agregados de pPSC en el frasco rodante con un medio de cultivo que diferencie las pPSC para formar agregados de células diferenciadas. La agitación del cultivo en suspensión de agregados derivados de pPSC puede realizarse mediante rotación a aproximadamente 3 rpm, aproximadamente 4 rpm, aproximadamente 5 rpm, aproximadamente 6 rpm, aproximadamente 7 rpm, aproximadamente 8 rpm, aproximadamente 9 rpm, aproximadamente 10 rpm, aproximadamente 11 rpm, aproximadamente 12 rpm, aproximadamente 13 rpm, aproximadamente 14 rpm, aproximadamente 15 rpm, aproximadamente 16 rpm, aproximadamente 17 rpm, aproximadamente 18 rpm, aproximadamente 19 rpm, aproximadamente 20 rpm, aproximadamente 21 rpm, aproximadamente 22 rpm, aproximadamente 23 rpm, aproximadamente 24 rpm, aproximadamente 25 rpm, aproximadamente 26 rpm, aproximadamente 27 rpm, aproximadamente 28 rpm, aproximadamente 29 rpm y aproximadamente 30 rpm. Normalmente, la agitación del cultivo de pPSC se realiza mediante rotación a aproximadamente 5 rpm, aproximadamente 6 rpm, aproximadamente 7 rpm, aproximadamente 8 rpm, aproximadamente 9 rpm, aproximadamente 10 rpm, aproximadamente 11 rpm y aproximadamente 12 rpm.

En el presente documento se desvelan métodos donde el flujo de fluido dentro de un recipiente de tipo frasco rodante implica un movimiento rodante que no requiere el giro o el rodamiento del frasco. El movimiento de tipo rodante puede recrearse sustancialmente pero sin el uso de un recipiente rodante. Un cultivo de células madre pluripotentes de primate puede tener impartido movimiento de fluidos, por ejemplo, bombeando o haciendo fluir un líquido de manera suave, ordenada con poca o ninguna turbulencia. En dichos casos, cualquier subcorriente generalmente se mueve en paralelo con cualquier otra subcorriente o subcorrientes cercanas. Este tipo de movimiento también se caracteriza como flujo laminar (comúnmente usado para mover fluidos viscosos, especialmente aquellos que se mueven a bajas velocidades) o flujo aerodinámico (un movimiento constante de movimiento de fluidos). El movimiento del fluido puede involucrar uno o más deflectores, que distribuyen el flujo de fluido dentro de una cámara para crear una suspensión continua y uniforme de células. El movimiento del fluido puede implicar una o una combinación de placas deflectoras, canales de distribución y/o canales de flujo. En cada caso, se incluye al menos uno o más sellos en el recipiente de cultivo para garantizar un ambiente aséptico dentro del recipiente durante la agregación celular, el crecimiento y la diferenciación.

En el presente documento se desvelan métodos para enriquecer o variar la composición del cultivo celular resultante y/o la población de una suspensión de agregado celular derivada de hES optimizando la densidad celular de los cultivos de células pluripotentes o variando la concentración de varios factores de crecimiento, por ejemplo, FGF10, EGF, KGF, noggina y ácido retinoico, inhibidores apoptóticos, inhibidores de rho-cinasa y similares.

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 representa el análisis de expresión de RT-PCR en tiempo real de ADAM19, Neurregulina1 y ErbB1-3 en BG01v cultivados en condiciones definidas (8 ng/ml de FGF2, 100 ng/ml de LR-IGF1, 1 ng/ml de Activina A). Se indican las reacciones de control de GAPDH y OCT4.

La FIGURA 2 representa la inhibición de la proliferación de células BG01v usando AG879. Las células BG01v se sembraron en bandejas de 6 pocillos y se expusieron a DMSO (A), AG1478 (B) 50 nM-20 pM, o AG879 (C) 100 mM-20 pM 24 horas después de la siembra en placa. Después de 5 días en cultivo, los cultivos se fijaron y tiñeron para determinar la actividad de fosfatasa alcalina. AG 1478 no pareció afectar la proliferación a estas concentraciones (20 pM mostrado en B), pero AG879 ralentizó sustancialmente el crecimiento celular a 5 pM (C).

La FIGURA 3 representa la morfología de las células BG01v cultivadas en DC-HAIF, que es un medio de cultivo definido que contiene 10 ng/ml de HRG-p, 10 ng/ml de Activina A, 200 ng/ml de LR-IGF1 y 8 ng/ml de FGF2 (A y B) y en medios de cultivo definidos (DC) que contienen 10 ng/ml de HRG-p, 10 ng/ml de Activina A y 200 ng/ml de LR-IGF1 (C y D).

La FIGURA 4 representa la expresión de ADAM 19, Neurregulina1 y ErbB1-4 por RT-PCR en células ES de ratón (A) y MEF (B).

La FIGURA 5 representa la inhibición de la señalización de ErbB1 y ErbB2 en células ES de ratón. 2x105 células ES R1 de ratón se colocaron en placa sobre MATRIGEL™ 1:1000 en 10 % de FBS, 10 % de KSR con 1000 U/ml de LIF de ratón (ESGRO). El día siguiente, se añadió DMSO (control de vehículo), 1-50 pM de AG1478 o 1-50 pM de AG879 con medio reciente. Los cultivos se fijaron el día 8 y se tiñeron para determinar la actividad de fosfatasa alcalina. DMSO (A) y AG1478 1-50 pM (B y C) no inhibieron abiertamente la proliferación. AG879 inhibió sustancialmente el crecimiento celular a 50 pM (comparar D y F) y puede haber ralentizado la proliferación a 20 pM (E).

La FIGURA 6 representa la inhibición de la proliferación de células BG02 cultivadas en medios acondicionados (CM, conditionedmedia). (A) AG82550 pM inhibió la proliferación de hESC BG02 que crecían en CM. (B) AG825 inhibe la fosforilación de ErbB2 Y1248 en hESC. (C) Recuento de colonias de pases sucesivos de hESC CyT49 en diferentes combinaciones de factores de crecimiento. (D) Análisis de recuento celular del papel de IGF 1 y HRG en la proliferación de hESC usando células BG02 (izquierda). (E) La inmunotinción de OCT4/DAPI de un experimento repetido duplicado demostró que IGF1 y HRG aumentaron significativamente la proporción de células OCT4+ en comparación con las condiciones ActA/FGF2. (F) análisis de transferencia RTK de hESC BG01 DC-HAIF privadas de factores de crecimiento durante la noche; se muestran cultivos privados, después pulsados con DC-HAIF durante 15 minutos; o en estado estable (izquierda). Se representa gráficamente la media y el intervalo de intensidad relativa normalizada (derecha).

La FIGURA 7 representa células ES de ratón cultivadas en condiciones definidas con diferentes combinaciones de factores de crecimiento. (A) muestra la puntuación de colonias AP+ después de que 2x105 células se cultivaron en diferentes combinaciones de factores de crecimiento durante 8 días. (B-G) muestra imágenes de colonias AP+ con aumento 4x cultivadas en diferentes combinaciones de factores de crecimiento.

La FIGURA 8 representa la caracterización de células ES humanas que se mantienen en medio DC-HAIF. (A) El análisis de teratomas de células BG02 DC-HAIF p25, demostró un potencial de diferenciación pluripotente en el ectodermo, mesodermo y endodermo. (B) Inmunotinción de células BG02 cultivadas en FCS al 15%/KSR al 5% que se han diferenciado. (C) Diagrama de Venn de la distribución de las transcripciones detectadas usando Sentrix Human-6 Expression Beadchips que contiene 47.296 sondas de transcritos en células BG02 mantenidas en CM (64 pases) o DC-HAIF (10 o 32 pases en medios definidos). (D) Análisis de diagrama de dispersión que demuestra que el perfil transcripcional de las células BG02 DC-HAIF p32 es altamente similar al de las células BG02 mantenidas en CM (parte superior), y no se alteró sustancialmente en cultivos de pases tempranos y tardíos en DCHAIF (parte inferior). (E) Dendrograma de agolpamiento jerárquico de expresión génica relativa en diferentes poblaciones generado usando el software Beadstudio.

La FIGURA 9 representa la morfología de las células cultivadas en matrices extracelulares humanizadas (ECM) en presencia de medio DC-HAIF. (A) Células CyT49 (diluidas 1:200) que crecen en MATRIGEF™ reducido en factor de crecimiento (diluido 1:200). Las células CyT49 también podrían crecer en placas de cultivo tisular recubiertas con (B) suero humano completo, (C) flbronectina humana y (D) VITROGRO™.

La FIGURA 10 representa el pase de células individuales de células ES humanas. (A-D) Imágenes por fases de células BG02 después de pases con ACCUTASE™ y de sembrar en placa aproximadamente 5x105 células en una placa de cultivo de 60 mm. (A) 1,5 horas después de la siembra en placa inicial, que muestra células viables adheridas a la placa. (B) A las 20 horas después de la siembra en placa, la gran mayoría de las células se han agregado para formar pequeñas colonias. Estas colonias se expanden por proliferación el día 4, después de la siembra en placa (C), y en el transcurso de 5-6 días para formar una monocapa de tipo epitelial que abarca la placa entera (D). (E) Cariotipo masculino normal demostrado en un cultivo de BG02 pasado 19 veces con ACCUTASE™ en DC-HAIF.

La FIGURA 11 representa la morfología celular después del pase de células ES humanas individuales usando (A) ACCUTASE™, (B) 0,25 % de Tripsina/EDTA, (C) TrypLE o (D) Versene.

La FIGURA 12 representa el crecimiento a gran escala de células ES humanas cultivadas en DC-HAIF. (A) Análisis de citometría de flujo de células BG02 después de la expansión a >1010 células. > 85 % de las células expresaron OCT4, CD9, SSEA-4, TRA-1-81. (B) análisis de RT-PCR de la expresión de marcadores de pluripotencia OCT4, NANOG, REX1, SOX2, UTF1, CRIPTO, FOXD3, TERT y DPPA5. No se detectaron los marcadores de linajes diferenciados a-fetoproteína (AFP), MSX1 y HAND1. (C) La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) usando repeticiones específicas de cromosomas humanos demostró el mantenimiento de números de copias normales para hChr 12, 17, X e Y.

La FIGURA 13 representa la morfología (A) y el cariotipo normal (B) de células hESC BG02 cultivadas en medios definidos que comprenden HRG-p e IGF1, pero en ausencia de FGF2 durante 7 pases o >2 meses.

La FIGURA 14 representa un análisis del diagrama de dispersión de transcritos de las hESC (BG02) que se mantienen en DC-HAIF (32 pases) o DC-HAI (10 pases). Se detectó una gran proporción de los transcritos expresados en ambas muestras y la transcripción no se alteró sustancialmente al cultivar hESC en ausencia de FGF2 exógeno. Se generaron coeficientes de correlación (R2) usando utilizando todos los transcritos detectados con un nivel de expresión de >0 (todos los puntos) o con transcritos que exhiben un nivel de confianza de detección de >0,99 (R2 seleccionado, puntos indicados por un óvalo punteado). Las líneas en ángulo delimitan la media y los límites de una diferencia de 2 veces.

La FIGURA 15 representa un dendrograma de agrupamiento jerárquico de expresión génica relativa en diferentes poblaciones de células BG02 de pase temprano y tardío mantenidas en DC-HAIF. Las células se agruparon firmemente (~0,0075) y mantuvieron una estrecha similitud con las células BG02 y BG03 mantenidas en medio acondicionado (CM) (~0,037). Las células BG02 mantenidas en DC-HAI también se agruparon firmemente con las otras poblaciones de hESC examinadas. A modo de explicación en la FIGURA 15, CM es medio condicionado; DC es medio de cultivo definido, DC-HAIF como se definió anteriormente; ap es el pase de células individuales con ACCUTASE™; DC-HAI es idéntico a DC-HAIF como se define en el presente documento, excepto sin FGF2.

La FIGURA 16 representa la morfología y la tinción con fosfatasa alcalina de células BG02 cultivadas en DC-HAIF en placas de 96 pocillos y 384 pocillos. (A) Imágenes de contraste de fase y (B) tinción con fosfatasa alcalina de células BG02 (104 células/pocillo) que crecen en un pocillo de una placa de 96 pocillos. (C) Imágenes de contraste de fase y (D) tinción con fosfatasa alcalina de células BG02 (10 células/pocillo) que crecen en un pocillo de una placa de 384 pocillos.

La FIGURA 17 representa imágenes de campo oscuro de células BG02 que crecieron en DC-HAIF en cultivo en suspensión. Se muestran los cultivos del día 2 y del día 6. Las imágenes fueron capturadas usando un aumento de 4x

La FIGURA 18 representa las tasas de crecimiento en cultivos adherentes y en suspensión en DC-HAIF. Se sembraron 1x106 células BG02 en pocillos paralelos en cultivo adherente y en suspensión y se realizaron recuentos de células en los días 1-6.

La FIGURA 19 representa el análisis de qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) de las hESC en suspensión y adherentes. Las células BG02 que crecían en suspensión (S. hESC) y el cultivo adherente (hESC) mostraron niveles comparables de OCT4 y carecían de expresión de SOX17. Tanto las células adherentes diferenciadas a endodermo definitivo (DE) como las hESC en suspensión diferenciadas a endodermo definitivo en suspensión (S. DE d3), exhibieron la esperada regulación negativa marcada de OCT4 y la regulación positiva de la expresión de SOX17

La FIGURA 20 representa la mejora de la agregación de hESC en presencia de Y27632 en cultivo en suspensión. Se sembraron 2x106 células BG02 en 3 ml de DC-HAIF o DC-HAiF Y27632, en bandejas de 6 pocillos, en una incubadora sobre una plataforma giratoria a 100 rpm. Se capturaron imágenes de agregados los días 1 y 3.

La FIGURA 21 representa el análisis por RT-PCR de agregados en suspensión en presencia de Y27632. Se realizó RT-PCR en los cultivos expandidos para evaluar la expresión de marcadores de pluripotencia. Se detectó la expresión de OCT4, NANOG, REX1, SOX2, UTF1, CRIPTO, FOXD3, TERT Y DPPA5, mientras que los marcadores de linajes diferenciados AFP, MSX1 y HAND1 no se detectaron.

Las FIGURAS 22 A-P son gráficos de barras que muestran los patrones de expresión de los genes marcadores OCT4 (panel A), BRACH (panel B), SOX17 (panel C), FOXA2 o HNF3beta (panel D), HNFlbeta (panel E), PDX1 (panel F) NKX6.1 (panel G), NKX2.2 (panel H), INS (panel I), GCG (panel J), SST (panel K), SOX7 (panel L), ZIC1 (panel M), AFP (panel N), HNF4A (panel O) y PTF1A (panel P), que no es una lista exhaustiva, sino marcadores que pueden usarse para identificar células madre embrionarias humanas pluripotentes (hES) (fase0, d0), células de endodermo definitivas (fase 1; d2), células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas (fase2; d5), células del endodermo PDX1 positivas (fase3, d8), células del endodermo pancreático (fase4; d11), precursores endocrinos pancreáticos y/o células secretoras de hormonas (fase5; d15).

La FIGURA 23 es un gráfico que muestra el intervalo de diámetros de los agregados celulares en suspensión (micrómetros) en relación con el volumen total (ml) de medio en el cultivo.

Las FIGURAS 24 A-D son gráficos de barras que muestran los patrones de expresión de los genes marcadores PDX1 (panel A) NKX6.1(B), NGN3 (panel C) y NKX2.2 (panel D) en células derivadas de hES en relación con la densidad celular de los cultivos de células hES de los que derivaron.

La FIGURA 25 es un diagrama que muestra los diámetros de agregados celulares de las células pluripotentes el día cero (d0) y los agregados celulares de diferenciación los días 2, 5, 8 y 12 (d2, d5, d8 y d12, respectivamente). Los tamaños de los agregados celulares se midieron y se representaron gráficamente mostrando el mínimo, el máximo, el 2° y el 3er cuartil y la mediana. Cada día muestra la gráfica de los agregados celulares formados a partir de 1 x 106 células/ml (izquierda) y 2 x 106 células/ml (derecha).

Las FIGURAS 26A-D son gráficos de barras que muestran los patrones de expresión de los diversos genes marcadores indicados en formato de recipiente de frasco rodante. La muestra de la izquierda de cada gráfico representa los agregados de células del día cero (d0) formados en bandejas de 6 pocillos (control de marcador de células pluripotentes). Las muestras marcadas con barras representan (de izquierda a derecha): agregados indiferenciados en el día 0 y agregados diferenciados en los días 2, 5, 8 y 12. Barra negra, frascos rodantes a 1 x 106 células/ml; barra punteada negra, frascos rodantes a 2 x 106 células/ml; barra gris, bandeja de 6 pocillos.

Las FIGURAS 27A-D son gráficos de barras que muestran los patrones de expresión de los diversos genes marcadores indicados en formatos de recipiente de frasco rodante más grandes como se describe en las Tablas 11 y 12 en el Ejemplo de Referencia 26. La muestra de la izquierda representa una agregación y diferenciación de hESC en bandeja de 6 pocillos (control; FIG. 27A); Se muestra la diferenciación los días 0, 2, 5, 8 y 12 en frascos rodantes ventilados (V) o no ventilados (NV) de 490 cm2 (aproximadamente 1,2 l de capacidad). Las muestras del día 2 no se recolectaron para la última muestra 490V (columna del extremo derecho) debido a la pérdida de cultivo. Se usó el mismo control d0 para cada diferenciación de frasco rodante (asterisco).

Descripción detallada de la invención

A diferencia de los métodos de ingeniería tisular anteriormente conocidos, que se basan en la siembra de células individuales en armazones poliméricos, matrices y/o geles, los métodos descritos en el presente documento usan suspensiones de agregados celulares formadas a partir de suspensiones unicelulares de hES pluripotentes o de suspensiones unicelulares derivadas de hES (diferenciadas) como los bloques de construcción de formación de tejido. Los agregados celulares a menudo están compuestos por cientos o miles de células individuales, conectadas a través de adherencias de unión y matriz extracelular que contribuyen colectivamente al producto diferenciado final. En este sentido, los agregados celulares pueden definirse como un tipo de tejido que proporciona una serie de ventajas de rendimiento con respecto a los tejidos diseñados por ingeniería genética más tradicionales.

En el presente documento se desvelan métodos para producir suspensiones de agregados de células hES a partir de una suspensión unicelular de cultivos de células madre pluripotentes o de cultivos de células derivadas de hES. Las células madre pluripotentes pueden cultivarse inicialmente en alimentadores de fibroblastos o pueden estar libres de alimentadores. Los métodos para aislar hESC y cultivar tales en células de alimentación humanas se describió en la Patente de EE.UU. N.° 7.432.104 titulada METHODS FOR THE CULTURE OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS ON HUMAN FEEDER CELLS. Los cultivos en suspensión de agregados de células ES pluripotentes preparados directamente o iniciados a partir de hESC cultivadas en alimentadores evitan la necesidad de fabricar monocapas de hESC, por ejemplo, como en los cultivos adherentes. Estos métodos se describen en detalle en los Ejemplos de Referencia 17 y 18.

En el presente documento se desvelan métodos para producir suspensiones de agregados celulares directamente en un medio de diferenciación, por ejemplo, un medio diferenciador que contiene un agente, preferentemente un miembro de la familia TGFp, que es capaz de activar una familia de receptores TGFp. Dichos agentes incluyen, pero sin limitación, Activina A, Activina B, GDF-8, GDF-11 y Nodal. Los métodos de producción de suspensión de agregados celulares en un medio de diferenciación se distinguen de otros métodos, también descritos en el presente documento, que permiten la producción de cultivos en suspensión de agregados celulares en un medio de células madre pluripotentes, por ejemplo, StemPro.

En el presente documento se desvelan métodos para producir suspensiones de agregados celulares formadas a partir de cultivos de células hES diferenciadas (también denominados "cultivos de células derivadas de hES" o "célula o células derivadas de hES"), por ejemplo, células de las fases 1, 2, 3, 4 y 5 como se describe en D'Amour et al. 2005, citado anteriormente y D'Amour et al. 2006, Nature Biotech 262006: 1392-1401). Por tanto, los métodos para producir los agregados celulares descritos en el presente documento no se limitan a ninguna fase pluripotente o multipotente de una célula hES o derivada de hES, más bien, la forma de uso y la necesidad de optimización del tipo de célula dictará qué métodos se prefieren. Estos métodos se describen en detalle en los Ejemplos de Referencia 19-22.

En el presente documento se desvelan métodos para controlar la composición celular resultante, por ejemplo, controlar el porcentaje de células de endodermo pancreático, células endocrinas pancreáticas y/o células de endodermo que expresan PDX1, variando la concentración de diferentes factores de crecimiento. Estos métodos se describen en detalle en el Ejemplo de Referencia 21.

A menos que se indique lo contrario, los términos usados en el presente documento han de entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos habituales en la materia relevante. Además de las definiciones de términos que se proporcionan a continuación, las definiciones de términos comunes en biología molecular también pueden encontrarse en Rieger et al. 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5a Ed., Berlin: Springer-Verlag; y en Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al. Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley y Sons, Inc., (1998 Suplemento). Debe entenderse que como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un/a" o "uno/una" puede significar uno/una o más, dependiendo del contexto en el que se use. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que puede utilizarse al menos una célula.

Además, para los fines de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, a menos que se indique otra cosa, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, porcentajes o proporciones de materiales, condiciones de reacción y otros valores numéricos usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, deben entenderse estando modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, salvo que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no en un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos indicados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales.

"Aproximadamente", como se usa en el presente documento, significa que un número al que se hace referencia como "aproximadamente" comprende el número enumerado más o menos el 1-10 % de ese número enumerado. Por ejemplo, "aproximadamente" 100 células puede significar 95-105 células o tan solo 99-101 células dependiendo de la situación. Cada vez que aparece en el presente documento, un intervalo numérico tal como "de 1 a 20" se refiere a cada número entero en el intervalo dado; por ejemplo, "de 1 a 20 células" significa 1 célula, 2 células, 3 células, etc., hasta e incluyendo 20 células. Cuando "aproximadamente" modifica un intervalo expresado en números no enteros, significa el número recitado más o menos el 1-10 % en el mismo grado de cifras significativas expresadas. Por ejemplo, de aproximadamente 1,50 a 2,50 mM puede significar tan poco como 1,35 M o tanto como 2,75 M o cualquier cantidad intermedia en aumentos de 0,01.

La presente invención proporciona métodos para la producción de agregados de células derivadas de hES a partir de suspensiones unicelulares derivadas de hES. Debido a que diversos factores mecánicos y no fisiológicos afectan al movimiento y la agregación de las células en cultivo, el microambiente mecánico de fluidos que se correlaciona con la viabilidad y el rendimiento óptimos del agregado celular, así como para proporcionar una variable de normalización que puede usarse para el escalado, era necesario caracterizar el movimiento de las células que crecen o se diferencian en diversos recipientes de cultivo, placas, matraces de Erlenmeyer, biorreactores, frascos y similares y los efectos, si los hay, de diversas condiciones de los medios en las células. Algunos de estos factores incluyen, pero sin limitación, velocidad de cizalla y tensión de cizalla, densidad celular y concentración de varios factores de crecimiento en cualquier medio celular.

La velocidad de cizalla y la tensión de cizalla son características mecánicas que definen el corte de fluido dentro de un sistema. La velocidad de cizalla se define como la velocidad del fluido en una distancia dada y se expresa como s-1. La velocidad de cizalla es proporcional a la tensión de cizalla donde la velocidad de cizalla (□) = tensión de cizalla (t)/viscosidad (|j). La tensión de cizalla se define como la fuerza de cizalla del fluido que actúa tangencialmente en la superficie de la célula y se expresa como fuerza por unidad de área (dinas/cm2 o N/m2). El esfuerzo de cizalla puede generarse por el líquido agitado que pasa por células estáticas, células agitadas que se mueven a través de líquido estático o por células que se mueven dentro de un entorno fluido agitado, dinámico. La viscosidad del fluido se mide normalmente en poise donde 1 poise = 1 dina s/cm2 = 100 centipoises (cp). La viscosidad del agua, uno de los fluidos menos viscosos conocidos, es de 0,01 cp. La viscosidad de una suspensión típica de células eucariotas en el medio está entre 1,0 y 1,1 cp a una temperatura de 25 °C. Tanto la densidad como la temperatura pueden afectar la viscosidad de un fluido.

La velocidad del fluido también dicta si el flujo será laminar o turbulento. El flujo laminar se produce cuando dominan las fuerzas viscosas y se caracteriza por líneas aerodinámicas suaves, uniformes a bajas velocidades. Por el contrario, la alta velocidad y las fuerzas de inercia dominan durante el flujo turbulento, que se caracteriza por la aparición de remolinos, vórtices y fluctuaciones caóticas en el flujo a través del espacio y el tiempo. Un valor adimensional conocido como número de Reynold (Re) se usa normalmente para cuantificar la presencia de flujo laminar o turbulento. El número de Reynold es la relación entre las fuerzas inerciales y las viscosas y se cuantifica como (densidad * velocidad * escala de longitud)/(viscosidad). El flujo laminar domina con Re<2300 mientras que el flujo turbulento domina cuando Re>4000. Basado en esta relación con la velocidad del fluido, el número de Reynold y, por lo tanto, el grado en que el flujo de fluido es laminar o turbulento es directamente proporcional a la velocidad de cizalla y a la tensión de cizalla que experimentan las células en suspensión. Sin embargo, pueden generarse condiciones de alta tensión de cizalla tanto en entornos de fluidos laminares como turbulentos. Inicialmente, hay una tendencia a que el líquido se resista al movimiento, experimentando el fluido más cercano a una superficie sólida fuerzas atractivas que generan una capa límite o una región sin flujo inmediatamente adyacente a la superficie. Esto crea un gradiente en la velocidad del fluido desde la superficie hasta el centro del flujo del fluido. La pendiente del gradiente de velocidad es función de la velocidad a la que se mueve el líquido y la distancia desde la capa límite hasta la región de mayor velocidad del fluido. A medida que se acelera el caudal de líquido a través o alrededor de un recipiente, la velocidad del flujo supera la viscosidad del líquido y el gradiente laminar suave se rompe produciendo un flujo turbulento. Thomas et al. demostraron que la lisis celular en condiciones turbulentas se produce lo más frecuentemente en regiones de alta tensión de cizalla localmente y altas tasas de disipación de energía. Véase Thomas et al. (1994) Cytotechnology 15: 329-335. Estas regiones aparecen al azar, pero a menudo se encuentran cerca de la capa límite donde el gradiente de velocidad es más alto. Estas fluctuaciones aleatorias en la velocidad del fluido pueden generar regiones de tensión de cizalla muy alta que, en última instancia, pueden tener un efecto negativo en el escalado de los sistemas de fabricación basados en cultivos celulares. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos que puedan mantener la densidad y viabilidad celular en un sistema de fabricación escalado de cultivos de células de mamíferos controlando las principales fuentes de fuerzas de cizalla en tales sistemas.

Siguiendo los métodos proporcionados por Henzler (Henzler, 2000, Particle stress in bioreactors, En Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T. Ed. Springer-Verlag, Berlin) y Colomer et al. (Colomer, J. et al.

2005. Experimental analysis of coagulation of particles under low-shear flow. Water Res. 39:2994), se calcularon las propiedades mecánicas del fluido a granel en una placa giratoria de 6 pocillos. La tensión adimensional es igual a la constante de turbulencia * (diámetro agregado/microescala de Kolmogorov) A exponente de turbulencia. El esfuerzo de cizalla es igual al esfuerzo adimensional * densidad del fluido * (viscosidad cinemática * potencia de entrada)A0,5. La velocidad de cizalla es igual al esfuerzo de cizalla/viscosidad cinemática. Para el cálculo de la entrada de energía y la microescala de Kolmogorov, se requiere el número de Reynold en cada tasa de giro y es igual a (tasa de giro* diámetro del matraz)A2/viscosidad. Como tanto la entrada de energía como la microescala de Kolmogorov son funciones del número de Reynold, todos los cálculos de tensión de cizalla y velocidad de cizalla varían con la tasa de giro.

Además, la tensión de cizalla y la velocidad de cizalla son funciones de la tensión adimensional, que depende del diámetro de formación de agregados, por lo tanto se espera que la tensión de cizalla y la velocidad experimentada por los agregados aumenten con el tiempo de rotación. En el Ejemplo de referencia 17 se muestran ejemplos de cálculos de diámetros de agregado entre 100-200 jm y velocidades de giro entre 60-140 rpm. Estos métodos se usaron para proporcionar una estimación del cizallamiento promedio en el fluido a granel a lo largo del tiempo. Sin embargo, se espera que la tensión de cizalla en la pared del recipiente sea la más alta debido a los efectos de los límites. Para estimar la tensión de cizalla de la pared, Ley et al. propusieron que la tensión de cizalla de la pared en una placa de 6 pocillos fuese igual al radio de giro* (densidad* viscosidad dinámica* (2*pi*tasa de giro)A3)A0,5. Uando este enfoque, la tensión de cizalla de la pared se calculó para velocidades de giro que variaban de 60 rpm a 140 rpm y se muestra en el Ejemplo de Referencia 18. Obsérvese que, a diferencia de la tensión cizalla promediada en el tiempo que experimentan los agregados en el fluido a granel, la tensión de cizalla que se produce en la pared es independiente del diámetro del agregado.

La densidad de las células de cultivo también es un factor crítico para la función del tejido y es difícil de lograr y/u optimizar en tejidos tradicionales que son bidimensionales (por ejemplo, construcciones de ingeniería genética adherentes). El efecto de la densidad celular sobre la diferenciación se describe con más detalle en el Ejemplo de Referencia 20. Los agregados celulares pueden superar esta limitación asumiendo una arquitectura tridimensional (3D) organizada que refleja con mayor precisión una densidad y conformación celular in vivo. Como resultado, el período de tiempo para que las células alcancen su estructura deseada puede reducirse significativamente y/o hacerse más consistente y eficiente. Además, en el formato de agregado 3D, las células pueden diferenciarse y funcionar de manera más óptima, ya que esta arquitectura se asemeja más a la fisiología normal que a los cultivos adherentes. Además, las dificultades mecánicas implicadas en el proceso de fabricación son menos dañinas para los agregados celulares que flotan libremente en el cultivo en suspensión en comparación con las dificultades mecánicas, por ejemplo, en un cultivo adherente.

El cultivo en suspensión a escala de fabricación típico también utiliza la perfusión continua de los medios como método para mantener la viabilidad celular mientras se maximiza la densidad celular. En este contexto, el intercambio de medios contribuye a la cizalla del fluido en el cultivo que afecta de manera diferente a las células adherentes y a los agregados suspendidos. Las células adherentes inmóviles están sometidas a tensión de cizalla del fluido a medida que el medio fluye tangencialmente a través de la superficie celular. Por el contrario, los agregados suspendidos experimentan una tensión de cizalla significativamente menor en la superficie del agregado, ya que los agregados pueden caer libremente en respuesta a la fuerza de cizalla aplicada. Se espera que la tensión de cizalla prolongada sea perjudicial para las células madre embrionarias adherentes y que se prefiera el formato de agregado suspendido para una supervivencia y función óptimas. Por lo tanto, basándose en la necesidad de un proceso de fabricación eficiente para la producción de células madre pluripotentes y/o células progenitoras multipotentes derivadas de células madre pluripotentes y la mecánica observada anteriormente relacionada con la velocidad de cizalla y la tensión de cizalla, la presente invención proporciona por primera vez métodos de fabricación para la producción de células madre pluripotentes y/o células progenitoras multipotentes derivadas de células madre pluripotentes en formato en suspensión, en particular, en formato de suspensión de agregado celular.

Como se usa en el presente documento, "suspensión unicelular" o equivalentes de la misma, se refiere a una suspensión unicelular de célula hES o a una suspensión unicelular derivada de hES por cualquier medio mecánico o químico. Existen varios métodos para disociar grupos de células para formar suspensiones unicelulares a partir de tejidos primarios, células adheridas en cultivo y agregados, por ejemplo, fuerzas físicas (disociación mecánica como raspador de células, trituración a través de una pipeta de calibre estrecho, aspiración con aguja fina, desagregación en vórtice y filtración forzada a través de una malla fina de nailon o acero inoxidable), enzimas (disociación enzimática tal como tripsina, colagenasa, Acutase y similares) o una combinación de ambos. Además, los métodos y condiciones de los medios de cultivo capaces de soportar la disociación unicelular de hESC es útil para la expansión, la clasificación de células y la siembra definida para ensayos en placas de múltiples pocillos y permiten la automatización de los procedimientos de cultivo y la expansión clonal. Por lo tanto, en el presente documento se desvelan métodos para generar una disociación enzimática unicelular estable de células hES o un sistema de cultivo celular derivado de hES capaz de soportar el mantenimiento prolongado y la expansión eficiente de célula hES pluripotente indiferenciada o hESC diferenciada.

Como se usa en el presente documento, "frasco que rueda" o "frasco rodante" o equivalentes de las mismas se refiere a un recipiente cilíndrico adaptado para girar sobre sus ejes. Estos recipientes incluyen, pero sin limitación, frascos rodantes comercializados por Coming, Fisher Scientific y otros fabricantes, así como tambores, barriles y otros recipientes de tipo frasco que se puedan girar sobre su pared lateral, por ejemplo. Los frascos rodantes descritos en el presente documento no tienen que ser cilíndricos ni tener una sección transversal circular. Pueden ser, por ejemplo, no circulares, de curva cerrada, de anchura constante. En una realización, la curva es un triángulo de Reuleaux o un triángulo de Reuleaux con esquinas redondeadas como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.866.419. Los frascos rodantes de sección transversal circular no son la única forma o geometría que proporciona una rotación suave porque existe un número infinito de tales curvas y están contempladas por la invención. Sin embargo, tales curvas no se encuentran generalmente en la industria porque la mayoría de los mecanismos utilizados para hacer girar frascos requieren que el eje horizontal que corre perpendicular a la curva permanezca en una ubicación fija, lo cual no ocurre con los frascos rodantes no circulares porque tienen ejes con un movimiento de traslación hacia adelante y hacia atrás mientras ruedan. Este movimiento o rotación adicional, además del movimiento circular habitual como en otras frascos rodantes cilíndricos, puede mejorar el intercambio de gases en comparación con los frascos rodantes de sección transversal circular.

Un frasco rodante cilíndrico típico incluye una pared inferior, una pared superior y una pared lateral cilíndrica que se extienden entre las paredes inferior y superior. La pared superior incluye una abertura para proporcionar acceso al interior del frasco rodante. Las superficies internas de tales frascos rodantes proporcionan superficies activas para la interacción y/o unión celular. Por tanto, el Oxford Dictionary of Biochemistry establece que los frascos rodantes son recipientes cilíndricos que se usan para el cultivo de monocapas de células adherentes. De hecho, los frascos rodantes son deseables para el crecimiento de grandes cantidades de células, tales como células adherentes, o para producir subproductos celulares, tales como las sustancias farmacéuticas que se secretan por las células. La pared lateral cilíndrica de los frascos rodantes puede ser lisa o estampada, por lo que el patrón se extiende sustancialmente desde la pared inferior hasta la pared superior para aumentar el área de la superficie de crecimiento celular y para facilitar el flujo de líquido a todas las superficies interiores del frasco cuando este rueda alrededor del eje de la pared lateral.

Independientemente de la sección transversal (circular o no circular) del frasco rodante, el medio de crecimiento líquido se introduce en un frasco rodante y se guarda en dicho frasco. El movimiento giratorio del frasco mantiene las superficies internas humedecidas con el medio líquido, fomentando de esta manera el crecimiento de células. Para hacer que giren los frascos rodantes de la invención, se emplean rodillos giratorios de un equipo apropiado.

Los frascos rodantes generalmente se fabrican con cualquiera de vidrio, acero inoxidable o plástico transparente, tales como poliestireno, poliuretano, cloruro de polivinilo, policarbonato, poliolefinas tales como polipropileno, polietilen tereftalato con aditivos de glicol, etilenglicol-1,4, copoliéster de ciclohexano dimetanol tereftalato y similares. Se prefieren los materiales transparentes, ya que el crecimiento celular puede controlarse colocando el frasco en un microscopio invertido.

Los sistemas de frascos rodantes manuales y automatizados se han usado durante más de 40 años en los campos de farmacéutica, de bioquímica y médico para procesos tales como el crecimiento celular y la infección, producción de glucoproteínas heterólogas, preparación de vacunas y cultivo de células vegetales de alta densidad. Véanse Tanaka et al. 1983, Biotechnol. Bioeng. 25:2359; Tanaka 1987, Process Biochem. Ago., 106; Hong, et al. 1989, Biotechnol. Prog. 5:137; Elliot 1990, Bioprocess Tech. 10:207; Tsao 1992, Annals N.Y. Acad. Sci. 665:127; Pennell y Milstein 1992, J. of lmmun. Meth. 146:43; Olivas et al., 1995, Immun. Meth. 182, 73 (1995); Singhvi et al. 1996, Cytotechnology 22:79; y Kunitake et al.1997, Biotechnology 52:3289. Adicionalmente, para la producción a escala industrial de productos de cultivo celular (es decir, vacunas), las células se pasan con frecuencia en frascos rodantes antes de transferirlas a cultivos de micro-vehículos para una fase de crecimiento final, incluso cuando se utilizan sistemas basados en operaciones unitarias. Véase Edy, 1984, Adv. Exp. Med. Biol. 172:169.

Hasta ahora, el uso generalizado de frascos rodantes para cultivar células adherentes puede atribuirse a varios factores. El proceso se basa en: (i) un recipiente cilíndrico horizontal que contiene un volumen suficiente de medio o fluido y que gira axialmente; dado que el aumento de escala del frasco rodante es una función de la longitud, no se requiere desarrollo o invención a gran escala, dando como resultado plazos de desarrollo reducidos para la industria y una introducción más rápida en el mercado de nuevos productos; (ii) los sistemas de frascos rodantes permiten un contacto constante entre el fluido y el gas, es decir, debido a la rotación axial, en todo momento hay al menos una capa delgada de fluido o medio que recubre la superficie interior del frasco a medida que éste gira; esta capa permite un mayor intercambio fluido-gas y, a medida que gira el frasco, el gas regresa a las células que se encuentran en el grupo de medios en la parte inferior del frasco rodante; (iii) es posible mantener condiciones estériles durante períodos prolongados en cultivos a gran escala porque la contaminación de uno o más frascos rodantes no da como resultado la contaminación de un lote completo; (iv) es posible un control exacto de los niveles de nutrientes y productos de desecho; y (v) seguimiento directo de las células, por ejemplo, la identificación de ciertos marcadores celulares para garantizar una diferenciación eficiente y una especificación adecuada de las células después de las fases 1-4, por ejemplo, es relativamente sencilla.

Sin querer limitarse al uso de recipientes de frasco rodante o de tipo rodante para cultivar agregados de células tridimensionales, se pretende que existan otros medios para fabricar los agregados celulares, aunque empleando el movimiento creado por un frasco rodante o un tipo de recipiente cilíndrico que gira sobre un tambor, por ejemplo. El tipo de movimiento usado para agregar pPSC en general puede producirse, por ejemplo, aerosolizando el recipiente o la cámara para producir un flujo más laminar. El movimiento también puede crearse al tener una entrada y un puerto de salida para ayudar a la entrada y salida del medio fluido, o incluso las propias células, para crear un movimiento similar al logrado con los frascos rodantes descritos en el presente documento. El movimiento también puede lograrse con el uso de uno o más o una combinación de distribuidores de flujo. Por ejemplo, dicho distribuidor de flujo puede incluir un deflector para distribuir el flujo de fluido o medio dentro de la cámara y, por lo tanto, crear una mezcla uniforme, continua de los agregados celulares tridimensionales. En otro ejemplo, el distribuidor de flujo puede ser una combinación de una o más placas deflectoras, canales de distribución y/o canales de flujo, que crean un movimiento de fluido similar al que se encuentra en los frascos rodantes sin que necesariamente se produzca en un tipo de frasco rodante, recipiente cilíndrico o cámara. Por lo tanto, los medios alternativos para crear un movimiento fluido de una manera que no sea turbulenta, generan todavía fuerza de cizalla suficientemente baja para promover la colisión celular y permitir que las células se adhieran entre sí y formen los agregados celulares como se describe en el presente documento.

Aun así, ciertas propiedades del crecimiento de células adherentes o dependientes de anclaje en frascos rodantes, tienen sus desventajas. Por ejemplo, el crecimiento de las células adherentes, por su naturaleza, requiere una superficie sustancial para que la célula se fije y los frascos rodantes tienen un área de superficie limitada que está disponible para el crecimiento. El método convencional de mezcla en frascos rodantes es la rotación a una velocidad uniforme en una dirección para todos los fines, por ejemplo, crecimiento o siembra de células, crecimiento celular y/o propagación y expansión de virus. Las frecuencias de rotación convencional de la mayoría de los procesos de frascos rodantes para cultivar células adherentes y dependientes del anclaje es de aproximadamente 0,125 rpm a 5 rpm. Para estos cultivos, es importante que las células entren en contacto con los lados del frasco rodante lo más rápido posible, ya que solo después de la unión a la pared del vaso, las células pueden proliferar posteriormente y formar láminas de células. La unión lenta de las células a las paredes internas del recipiente conduce a una baja viabilidad de las células y/o una plantación no homogénea y, por tanto, un crecimiento no homogéneo en la superficie del frasco rodante. Además, la mezcla ineficaz limita el crecimiento celular porque las células no obtienen los nutrientes adecuados (por ejemplo, oxígeno) o retirada adecuada de toxinas (por ejemplo, dióxido de carbono) de una lámina de células sumergida, adherida a la superficie a medida que gira el frasco. De manera interesante, estas desventajas no son críticas para el uso de frascos rodantes en la agregación, el crecimiento, la expansión y la diferenciación de células pluripotentes diferenciables en suspensión.

En vista de las propiedades descritas anteriormente y además en vista de la propia divulgación del Solicitante de los métodos para producir agregados de células hES en bandejas de 6 pocillos y similares, un experto en la materia no recurriría al uso de frascos rodantes para fabricar agregados de células madre pluripotentes. Véase Schulz et al.

2012, Stem Cells 7: 1-17, e37004 y las Patentes de EE.UU. N.° 8.153.429 y 8.008.075. Por ejemplo, Schulz et al.

2012, citado anteriormente, enseña que las células madre pluripotentes pueden agregarse eficazmente mediante un movimiento circular o radial, o movimiento o rotación, que se impone sobre un vórtice central y atrae las células a una densidad local más alta en el medio del recipiente de cultivo, por ejemplo, extrayendo células en el centro de un pocillo de una bandeja de 6 pocillos, o en el centro de un matraz Erlenmeyer o en el centro de un biorreactor basado en un formato rotacional. Este vórtice radial no se puede lograr en frascos rodantes porque, por su naturaleza, el frasco rodante gira sobre su pared lateral y no sobre su base, por lo tanto, no es intuitivo transferir métodos de un sistema que incluye un movimiento de vórtice central a uno que no lo hace, tales como los frascos rodantes como se describe en el presente documento.

Los solicitantes han realizado estudios de cultivos estáticos usando otros tipos de movimiento incluyendo estudios de balanceo, agitación y centrifugación de células hES, y estos tipos de movimientos fueron incapaces de permitir la formación de agregados de células hES o agregados de células diferenciables. Además, estos agregados derivados de células hES o hES que se formaron en estas condiciones no dieron lugar a tipos de células funcionales sensibles a la glucosa in vivo, que es la prueba definitiva de cualquier método para la fabricación exitosa de PEC. Véase al menos Kroon et al. 2008, citado anteriormente y Schulz et al. (2012) citado anteriormente. Por tanto, no puede afirmarse que solo el movimiento y el desplazamiento por sí solos sean suficientes para formar agregados en suspensión de células madre pluripotentes o células hES o agregados de células diferenciables, porque no lo es. Estos estudios (datos no mostrados) indicaron que algo más que el movimiento de fluido y las fuerzas generadas con dicho movimiento facilitan el contacto adhesivo necesario para la formación de agregados celulares que da como resultado la transición de células madre pluripotentes unicelulares a agregados de célula-célula estables.

Como ya se ha mencionado brevemente, la rotación de un frasco rodante es muy diferente de la rotación de una bandeja de 6 pocillos, matraces de Erlenmeyer y similares que se produce alrededor de un vórtice central. En una frasco rodante, la mayor parte del volumen del cultivo permanece en el fondo del frasco cuando el frasco gira sobre su pared lateral, y una fina capa de fluido o medio de cultivo recubre la superficie interior del frasco a medida que éste gira. Esta fina capa de fluido ha aumentado el intercambio de gases a medida que el frasco gira y, por lo tanto, aumenta los niveles de O² al medio de cultivo en general; es decir, una vez que la capa fina de medio de cultivo vuelve al fondo del frasco donde reside la mayor parte del medio de cultivo, lo lleva consigo lo que aumenta las cantidades de O². No es intuitivo entonces que este movimiento, especialmente cuando se gira a velocidades muy bajas que son convencionales en la técnica para células adherentes (por ejemplo, de 0,125 a 5 rpm) permitiría suficiente contacto o colisiones de célula a célula, mientras que al mismo tiempo mantendría la baja fuerza de cizalla suficiente para permitir la formación de agregados de células madre pluripotentes de primate (pPSC), y mucho menos la diferenciación de agregados celulares diferenciables.

El uso de frascos rodantes para agregar, crecer, hacer pases, expandir y diferenciar las células también es diferente de las bandejas de 6 pocillos, matraces de Erlenmeyer, biorreactores debido a las diferentes velocidades de rotación entre los dos formatos. Las bandejas de 6 pocillos, matraces de Erlenmeyer, biorreactores y similares, por ejemplo, usan velocidades de giro más altas de aproximadamente 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 y 120 rpm, que se requieren al menos con el fin de evitar que los agregados celulares se aglomeren o formen grupos o masas celulares más grandes en cultivo. Obsérvese, que los grupos de células aglomeradas (por ejemplo, grandes agregados de 300 |jm o más) no deben confundirse con los agregados de células aproximadamente esféricas, que son más pequeños (aproximadamente 100 - 200 jm ) y de tamaño uniforme. Por el contrario, la agregación, el crecimiento, la realización de pases, la expansión y la diferenciación de las pPSC en frascos rodantes, se realiza a velocidades de rotación relativamente bajas de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 rpm. Estas velocidades de giro más bajas no crean el mismo grado de fuerza de cizalla que el producido en las bandejas de 6 pocillos, matraces de Erlenmeyer, biorreactores y similares, y en vista de la experiencia previa del Solicitante (véase Schulz et al. 2012, citado anteriormente), no se esperaba que la formación de agregados celulares tuviera éxito en estas condiciones.

Una ventaja de usar frascos rodantes para agregar, cultivar, realizar pases, expandir y diferenciar células madre pluripotentes sobre la de otros recipientes de cultivo celular, es que una vez optimizado en el frasco rodante más pequeño, las metodologías funcionarán de manera muy similar en frascos más grandes sin una invención sustancial adicional. Por ejemplo, usando frascos más largos con la misma sección transversal convencional, pero con una capacidad sustancialmente mayor, o usando conjuntos de frascos, la masa de cultivo total puede escalarse usando el mismo diámetro de frasco, relación diámetro/volumen y velocidad de giro. Un aumento en la longitud del frasco rodante (escalamiento) no afecta a los procesos de agregación o diferenciación celular. De este modo, el escalado del proceso o la fabricación celular a partir de frascos rodantes de 490 cm2 (11,12 cm de diámetro, 17,30 cm de longitud incluyendo la tapa) a frascos rodantes de 850 cm2 (11,63 cm de diámetro, 27,36 cm de longitud incluyendo la tapa) a frascos rodantes de 1750 cm2 (11,73 cm de diámetro, 53,16 cm de longitud incluyendo la tapa) o más grandes, no implica modificación sustancial o significativa distinta de las descritas en el presente documento.

Por al menos las razones anteriores, la escalabilidad de la fabricación de células en frascos rodantes es diferente de la de los sistemas de plataforma rotacional de bandejas de 6 pocillos, matraces de Erlenmeyer, biorreactores y similares. Por ejemplo, para lograr un cultivo de células madre pluripotentes IF de 1 x 106 células/ml, se necesitarían aproximadamente treinta (30) bandejas de 6 pocillos. Dicho de otra manera, en lugar de usar ochenta (80) bandejas de 6 pocillos (un total de 480 pocillos), el experto en la materia solo necesitaría 4 frascos rodantes, 850 cm2. El experto en la materia apreciará que la menor manipulación y mano de obra que se necesita para el cultivo en frascos rodantes es una mejora en la fabricación. Además, los ajustes deben hacerse en volumen, velocidad y radio de rotación para lograr la agregación cuando se utilizan plataformas de rotación a diferentes escalas. Puede lograrse la agregación de PSC de primates en matraces cónicos, por ejemplo, pero se produce mejor a velocidades de giro relativamente altas, aproximadamente 150 rpm, y esto provoca demasiada turbulencia y fuerza de cizalla que conduce a un aumento de la muerte celular (datos no mostrados). La mera colocación de un frasco o bote sobre una plataforma oscilante no produce los agregados de suspensión celular descritos en el presente documento (datos no mostrados). El movimiento de balanceo no crea un movimiento de fluido adecuado para apoyar el contacto y la adherencia adecuada célula-célula, y posiblemente crea demasiada turbulencia y fuerza de cizalla, provocando un aumento de la muerte celular. De forma similar, los frascos de forma cuadrada y los botes de vidrio de 15 cm son recipientes de cultivo inadecuados para aumentar la formación de agregados de pPSC por razones similares (datos no mostrados). Además, el mero contacto de célula a célula por sí solo no provoca la formación de agregados de pPSC porque cuando los sedimentos celulares se recuperan después de centrifugar suspensiones unicelulares de células hES, no se observaron agregados celulares (datos no mostrados). Por lo tanto, descubrir un sistema verdaderamente escalable con un movimiento de fluido apropiado que admita una agregación celular eficiente y consistente (incluyendo un diámetro de agregado constante) no ha sido en absoluto sencillo o rutinario, y sustancialmente más difícil de lo que un experto en la materia anticiparía o esperaría. De hecho, ha sido sorprendente que los frascos rodantes, que se han usado tradicionalmente para cultivos en escalado de tipos de células adherentes y dependientes del anclaje, junto con una reducción de hasta 30 veces en la velocidad proporcionaría las condiciones adecuadas para la producción de agregados de pPSC y la diferenciación como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "contactar" (es decir, poner en contacto una célula, por ejemplo, una célula diferenciable, con un compuesto) pretende incluir la incubación del compuesto y la célula juntos in vitro (por ejemplo, añadir el compuesto a las células en cultivo). El término "contactar" no incluye la exposición in vivo de células a un medio celular definido que comprende un ligando ErbB3 y, opcionalmente, un miembro de la familia TGF-p, que puede producirse de forma natural en un sujeto (es decir, exposición que puede ocurrir como resultado de un proceso fisiológico natural). La etapa de poner en contacto la célula con un medio celular definido que comprende un ligando ErbB3 y, opcionalmente, un miembro de la familia TGF-p, puede realizarse de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, las células pueden tratarse en cultivo adherente o en cultivo en suspensión. Se entiende que las células en contacto con el medio definido se pueden tratar adicionalmente con un entorno de diferenciación celular para estabilizar las células o diferenciar las células.

Como se usa en el presente documento, el término "diferenciar" se refiere a la producción de un tipo de célula que está más diferenciado que el tipo de célula del que deriva. El término engloba por lo tanto tipos de células que se diferencian parcial y terminalmente. Las células diferenciadas derivadas de hESC se denominan generalmente células derivadas de hES o cultivos agregados de células derivadas de hES, o suspensiones unicelulares derivadas de hES, o cultivos adherentes de células derivadas de hES y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere en gran medida o grado, por ejemplo, "sustancialmente similar" en el contexto se usa para describir un método que es en gran medida o grado similar o diferente a otro método. Sin embargo, como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente libre", por ejemplo, "sustancialmente exento" o "sustancialmente exento de contaminantes", o "sustancialmente exento de suero" o "sustancialmente exento de insulina o factor de crecimiento similar a la insulina" o equivalentes de los mismos, significa que la solución, medio, suplemento, excipiente y similares, está al menos el 98 %, o al menos el 98,5 %, o al menos el 99 %, o al menos el 99,5 %, o al menos el 100 % exento de suero, contaminantes o equivalente de los mismos. En el presente documento se desvela un medio de cultivo definido sin suero, o el 100% sin suero, o sustancialmente exento de suero. A la inversa, como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente similar" o equivalentes del mismo significa que la composición, proceso, método, solución, medio, suplemento, excipiente y similares es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % similar al descrito anteriormente en la memoria descriptiva del presente documento, o en un proceso o método descrito anteriormente incorporado en el presente documento en su totalidad.

El término "enriquecido", como se usa en el presente documento, se refiere a un cultivo celular que contiene más de aproximadamente el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % del linaje celular deseado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz", o equivalentes de la misma, de un compuesto, se refiere a la concentración del compuesto que es suficiente en presencia de los demás componentes del medio definido para efectuar la estabilización de la célula diferenciable en cultivo durante más de un mes en ausencia de una célula alimentadora y en ausencia de suero o reemplazo de suero. Esta concentración se determina fácilmente por un experto en la materia.

Como se usa en el presente documento, el término "expresar" se refiere a la transcripción de un polinucleótido o a la traducción de un polipéptido en una célula, de tal manera que los niveles de la molécula son considerablemente más altos en una célula que expresa la molécula que en una célula que no expresa la molécula. Los métodos para medir la expresión de una molécula son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, sin limitación, transferencia Northern, RT-PCR, hibridación in situ, transferencia Western e inmunotinción.

Como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a una célula, línea celular, cultivo celular o población de células, el término "aislado" se refiere a estar sustancialmente separado de la fuente natural de las células de tal manera que la célula, línea celular, cultivo celular o población de células sean capaces de cultivarse in vitro. Además, el término "aislar" se usa para referirse a la selección física de una o más células de un grupo de dos o más células, en donde las células se seleccionan basándose en la morfología celular y/o la expresión de diversos marcadores.

La presente invención y las divulgaciones en el presente documento pueden entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada, los Ejemplos y los Ejemplos de Referencia incluidos en el presente documento. Sin embargo, antes de que se desvelen y se describan las presentes composiciones y métodos, ha de entenderse que esta invención no se limita a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos celulares específicos, células hospedadoras específicas, condiciones específicas o métodos específicos, etc., ya que pueden, por supuesto, variar, y las numerosas modificaciones y variaciones en los mismos serán evidentes para los expertos en la materia.

Las técnicas estándar para la clonación, el aislamiento, la amplificación y la purificación del ADN, para las reacciones enzimáticas en las que intervienen la ADN ligasa, la ADN polimerasa, las endonucleasas de restricción y otras similares, y las diversas técnicas de separación, son las conocidas y comúnmente empleadas por los expertos en la materia. Varias técnicas convencionales se describen en Sambrook et al. 1989 "Molecular Cloning", Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nueva York; Maniatis et al. 1982 "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nueva York; Wu (ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Parte I; Wu (ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 y 101; Grossman and Moldave (eds.) 1980 Meth. Enzymol.

65; Miller (ed.) 1972 "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Old y Primrose, 1981 "Principles of Gene Manipulation", University of California Press, Berkeley; Schleif y Wensink, 1982 "Practical Methods in Molecular Biology"; Glover (ed.) 1985 "DNA Cloning" Vol. I y II, IRL Press, Oxford, RU; Hames y Higgins (eds.) 1985 "Nucleic Acid Hybridization", IRL Press, Oxford, RU; y Setlow y Hollaender 1979 "Genetic Engineering: Principles and Methods", Vol. 1-4, Plenum Press, Nueva York. Las abreviaturas y la nomenclatura, cuando se emplean, se consideran convencionales en el campo y se usan comúnmente en revistas profesionales tales como las que se citan en el presente documento.

En el presente documento se desvelan composiciones y métodos que comprenden una solución nutritiva de sal basal y una cantidad eficaz de un ligando ErbB3, estando las composiciones esencialmente exentas de suero. Las composiciones y métodos son útiles para cultivar células, en particular, células diferenciables. Se entiende que en diferentes puntos durante el cultivo de las células diferenciables, pueden añadirse diversos componentes al cultivo celular de modo que el medio pueda contener componentes distintos de los descritos en el presente documento. Se contempla, sin embargo, que al menos en un momento durante la preparación del cultivo, o durante el cultivo de las células diferenciables, el medio definido comprende una solución nutritiva de sal basal y un medio para activar la tirosina cinasa dirigida por ErbB2.

Aunque se emplea una solución nutritiva de sal basal como se describe en este documento para mantener el crecimiento celular y la viabilidad de hESC, los medios alternativos de cultivo de células madre para mantener la pluripotencia o para diferenciar las células pluripotentes, trabajan en medios sustancialmente similares, incluyendo, pero sin limitación, KSR (Invitrogen), o KSR exento de xeno (Invitrogen), StemPro® (Invitrogen), mTeSR™1 (StemCell Technologies) y HEScGRO (Millipore), medios basados en DMEM y similares.

hESC pueden cultivarse en los medios definidos descritos en el presente documento en ausencia y/o presencia de proteínas de la matriz extracelular (ECM), por ejemplo, MATRIGEL. Las células madre embrionarias humanas cultivadas en ausencia de ECM contienen aproximadamente el 0,5 al 10% de suero humano (hS) o fracciones de retenido de hS de una columna de giro de corte de 300 K y/o 100 K (Microcon). Las suspensiones de agregados de células hES pueden producirse incubando directamente la hESC en el medio que contiene fracciones de hS o retenido de hS; o después de incubar los recipientes de cultivo con las fracciones de retenido de hS o hS durante aproximadamente 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4, horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas y 24 horas a 37 °C. La eficiencia de la siembra en placa para la hESC en el medio que contiene la fracción retenida de hS o hS fue comparable a la observada en hESC cultivada en DC-HAIF como se describe en el documento PCT/US2007/062755, o cultivada en medio DC-HAIF usando MATRIGEF™ como una ECM, u otras matrices similares. Los métodos para cultivar hESC en un medio definido sustancialmente exento de suero se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 11/8875.057, presentada el 19 de octubre de 2007, titulada METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM.

Las suspensiones de agregados de células hES pueden cultivarse en un medio sustancialmente exento de suero y además en ausencia de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) añadido exógenamente. Esto se distingue de la Patente de EE.UU. N.° 7.005.252 (Thomson), que requiere el cultivo de hESC en un medio sin suero pero que contiene factores de crecimiento añadidos de forma exógena, incluyendo FGF.

La regulación celular puede efectuarse mediante la transducción de señales extracelulares a través de la membrana que, a su vez, modula las rutas bioquímicas dentro de la célula. La fosforilación de proteínas representa un transcurso por el cual las señales intracelulares se propagan de molécula a molécula dando como resultado finalmente una respuesta celular. Estas cascadas de transducción de señales están altamente reguladas y a menudo se superponen como lo evidencia la existencia de muchas proteína cinasas así como fosfatasas. Se ha informado que en seres humanos, se sabe que las proteínas tirosina cinasas tienen un papel importante en el desarrollo de muchas patologías incluyendo diabetes, cáncer y también se han relacionado con una amplia diversidad de síndromes congénitos. Las serina/treonina cinasas, por ejemplo, Rho cinasas, son una clase de enzimas, que si se inhiben pueden tener relevancia para el tratamiento de enfermedades humanas, incluyendo diabetes, cáncer y una diversidad de trastornos cardiovasculares inflamatorios y SIDA. La mayoría de los inhibidores identificados/diseñados hasta ahora actúan en el sitio de unión al ATP. Dichos inhibidores competitivos con ATP han demostrado selectividad en virtud de su capacidad para dirigirse a las áreas menos conservadas del sitio de unión al ATP.

La familia Rho cinasa de pequeñas proteínas de unión a GTP contiene al menos 10 miembros, incluyendo Rho A-E y G, Rac 1 y 2, Cdc42 y TC10. Los inhibidores a menudo se denominan inhibidores de ROK o ROCK, y se usan indistintamente en el presente documento. Los dominios efectores de RhoA, RhoB y RhoC tienen la misma secuencia de aminoácidos y parecen tener dianas intracelulares similares. Rho cinasa funciona como un mediador principal posterior a Rho y existe como dos isoformas: a (ROCK2) y p (ROCK1). Las proteínas de la familia Rho cinasa tienen un dominio catalítico (cinasa) en su dominio de extremo N, un dominio en superhélice en su parte central y un supuesto dominio de homología de pleckstrina (PH) en su dominio de extremo C. El dominio de unión a Rho de ROCK se localiza en la parte de extremo C del dominio en superhélice y la unión de la forma de Rho unida a GTP da como resultado un aumento de la actividad de la cinasa. La ruta mediada por Rho/Rho-cinasa juega un papel importante en la transducción de señales iniciada por muchos agonistas, incluyendo angiotensina II, serotonina, trombina, endotelina-1, norepinefrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, ATP/ADP y nucleótidos extracelulares y urotensina II. A través de la modulación de sus efectores/sustratos diana, la Rho cinasa juega un papel importante en diversas funciones celulares incluyendo contracción del músculo liso, organización del citoesqueleto de actina, adhesión celular y motilidad y expresión génica. En virtud del papel que desempeña la proteína Rho cinasa en la mediación de una serie de funciones celulares que se perciben como asociadas a la patogénesis de la arteriosclerosis, los inhibidores de esta cinasa también pueden ser útiles para el tratamiento o prevención de diversas enfermedades cardiovasculares arterioescleróticas e implicados en la contracción endotelial y la mejora de la permeabilidad endotelial que se cree que progresa a aterosclerosis. Por tanto, pueden añadirse agentes que promuevan y/o soporten la supervivencia celular a diversos medios de cultivo celular desvelados en el presente documento, por ejemplo, Inhibidores de rho-cinasa Y-27632, Fasudil y H-l 152P e ITS (insulina/transferrina/selenio; Gibco). Estos agentes de supervivencia celular funcionan, en parte, promoviendo la reasociación de células hES disociadas o cultivos derivados de hES, por ejemplo, endodermo del intestino anterior, endodermo pancreático, epitelio pancreático, poblaciones de progenitores pancreáticos y similares, particularmente endodermo pancreático disociado y poblaciones progenitoras pancreáticas. El aumento de la supervivencia de las células hES o derivadas de hES se logró independientemente de si las células se produjeron a partir de agregados celulares en suspensión o de cultivos en placa adherentes (con o sin matriz extracelular, con o sin suero, con o sin alimentadores). El aumento de la supervivencia de estas poblaciones de células facilita y mejora los sistemas de purificación usando un clasificador de células y, por lo tanto permite una recuperación mejorada de las células. El uso de inhibidores de la Rho cinasa, tal como Y27632, puede permitir la expansión de tipos de células derivadas de hES, así como promover su supervivencia durante pases sucesivos de células individuales disociadas o procedentes de preservación criogénica. No obstante, los inhibidores de la Rho cinasa, tal como Y27632, se han probado en cultivos celulares de hES y derivados de hES, los inhibidores de la Rho cinasa pueden aplicarse a otros tipos de células, por ejemplo, en general, células epiteliales incluyendo, pero sin limitación, células intestinales, de pulmón, de timo, de riñón así como tipos de células neurales tales como del epitelio retiniano pigmentado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "célula diferenciable" se usa para describir una célula o población de células que pueden diferenciarse en células al menos parcialmente maduras, o que pueden participar en la diferenciación de células, por ejemplo, fusionarse con otras células, que pueden diferenciarse en células al menos parcialmente maduras. Como se usa en el presente documento, "células parcialmente maduras", "células progenitoras", "células inmaduras", "células precursoras", "células multipotentes" o equivalentes de las mismas y también incluye aquellas células que se diferencian terminalmente, por ejemplo, células endodérmicas definitivas, células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas, células del endodermo pancreático PDX1 positivas que incluyen además células endodérmicas pancreáticas PDX1 positivas y células apicales del endodermo pancreático PDX1 positivas. Todas son células que exhiben al menos una característica del fenotipo, como la morfología o la expresión de proteínas, de una célula madura del mismo órgano o tejido, pero que pueden diferenciarse además en al menos otro tipo de célula. Por ejemplo, un hepatocito maduro, normal expresa normalmente proteínas tales como albúmina, fibrinógeno, alfa-1-antitripsina, factores de coagulación de protrombina, transferrina y enzimas desintoxicantres tales como el citocromo P-450s, entre otros. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, un "hepatocito parcialmente maduro" puede expresar albúmina u otra una o más proteínas, o comenzar a tener el aspecto o la función de un hepatocito maduro normal.

A diferencia de los agregados celulares producidos por métodos anteriormente conocidos que pueden variar tanto en tamaño como en forma, los agregados celulares y los métodos descritos en el presente documento tienen una distribución de tamaño y forma estrecha, es decir, los agregados celulares son sustancialmente uniformes en tamaño y/o forma. La uniformidad de tamaño de los agregados celulares es fundamental para el rendimiento de diferenciación y la homogeneidad del cultivo. Aplicando análisis básico de transporte de masa a los agregados, se espera que la difusión de oxígeno y nutrientes en el centro de grandes agregados sea lenta en comparación con la difusión en agregados más pequeños, asumiendo la misma permeabilidad. Ya que la diferenciación de células madre embrionarias agregadas en células de linaje pancreático depende de la aplicación temporal de factores de crecimiento específicos, es probable que un cultivo con una mezcla de agregados de diferentes diámetros esté desincronizado en comparación con un cultivo uniforme (tamaño y forma) de agregados celulares. Esta mezcla de agregados celulares da lugar a heterogeneidad y puede resultar en un rendimiento de diferenciación deficiente y, en última instancia, no se presta a ser susceptible de fabricación, escalado y producción. Los agregados de células usados en el presente documento pueden ser de diversas formas, tales como, por ejemplo, una esfera, un cilindro (preferentemente con la misma altura y diámetro), o en forma de varilla, entre otros. Aunque pueden usarse otros agregados conformados, generalmente es preferible que los agregados de células sean esféricos o cilíndricos. Los agregados celulares pueden ser esféricos y sustancialmente uniformes en tamaño y forma. Por ejemplo, si los agregados celulares difieren en tamaño o no son uniformes, será difícil fabricar y realizar de forma fiable procesos de escalado de las células. Por tanto, como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente uniforme" o "sustancialmente uniforme en tamaño y forma" o equivalentes de las mismas, se refiere a la dispersión en la uniformidad de los agregados que no supera aproximadamente el 20 %. De manera alternativa, la dispersión en la uniformidad de los agregados puede ser no superior a aproximadamente el 15 %, el 10 % o el 5 %.

Aunque el número exacto de células por agregado no es crítico, los expertos en la materia reconocerán que el tamaño de cada agregado (y por lo tanto el número de células por agregado) está limitado por la capacidad del oxígeno y los nutrientes para difundirse a las células centrales, y que este número también puede variar dependiendo del tipo de célula y de las necesidades nutritivas de ese tipo de célula. Los agregados de células pueden comprender un número mínimo de células (por ejemplo, dos o tres células) por agregado, o pueden comprender muchos cientos o miles de células por agregado. Normalmente, los agregados de células comprenden de cientos a miles de células por agregado. Para los fines de la presente invención, los agregados celulares tienen normalmente un tamaño de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 600 micrómetros, aunque, dependiendo del tipo celular, el tamaño puede ser menor o mayor que este intervalo. Los agregados celulares pueden tener un tamaño de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 250 micrómetros, o un tamaño de aproximadamente 75 a 200 micrómetros y preferentemente pueden tener un tamaño de aproximadamente 100 a 150 micrómetros. Por el contrario, los agregados de células cilíndricas o no esféricas que pueden presentarse en suspensión son aquellos agregados en los que el diámetro, basado en los ejes mayor y menor (por ejemplo, X, Y y Z), no son iguales. Estos agregados celulares no esféricos tienden a ser de mayor tamaño, de aproximadamente 500 micrómetros a 600 micrómetros de diámetro y altura. Sin embargo, en los métodos descritos en el presente documento, estos agregados de células hES no esféricos se vuelven esféricos una vez que se inicia la diferenciación, si es que aún no lo eran. Los agregados de células no esféricas incluyen, pero sin limitación, agregados de células cilíndricas y cuboidales, pero siguen siendo uniformes en tamaño y forma.

Pueden usarse muchos tipos celulares para formar los agregados de células descritos en el presente documento. En general, la elección del tipo de célula variará dependiendo del tipo de construcción tridimensional que va a diseñarse (por ejemplo, diversas estructuras de órganos incluyendo páncreas, hígado, pulmón, riñón, corazón, vejiga, vasos sanguíneos y similares). Por ejemplo, si la estructura tridimensional es un páncreas, los agregados celulares comprenderán ventajosamente un tipo o tipos de células que se encuentran normalmente en un páncreas (por ejemplo, células endocrinas tales como insulina, glucagón, grelina, células de tipo somatostatina, así como células endoteliales, células de músculo liso, etc.). Un experto en la materia puede elegir un tipo o tipos de células apropiados para los agregados de células, basándose en el tipo de tejido u órgano tridimensional que se desee. Los ejemplos no limitativos de tipos de células adecuados incluyen células madre (por ejemplo, adultas y embrionarias), células contráctiles o musculares (por ejemplo, células musculares estriadas y células musculares lisas), células neurales (por ejemplo, gliales, dendríticas y neuronas), tejido conectivo (incluyendo hueso, cartílago, células que se diferencian en células formadoras de hueso y condrocitos y tejidos linfáticos), células parenquimatosas, células epiteliales (incluyendo las células endoteliales que forman revestimientos en cavidades y vasos o canales, células epiteliales secretoras exocrinas, células absorbentes epiteliales, células epiteliales queratinizantes (por ejemplo, queratinocitos y células epiteliales corneales), células de secreción de matriz extracelular, células epiteliales de la mucosa, células epiteliales renales, células epiteliales pulmonares, células epiteliales mamarias y similares, y células indiferenciadas (tales como células embrionarias, células madre y otras células precursoras), entre otros.

Los agregados celulares descritos en el presente documento pueden ser agregados homocelulares o agregados heterocelulares. Como se usa en el presente documento, "homocelular", agregados celulares "monocelulares" o equivalentes de los mismos se refieren a una pluralidad de agregados celulares en suspensión, en donde cada agregado celular comprende una pluralidad de células vivas de sustancialmente un solo tipo de célula, por ejemplo, los métodos para producir agregados de células hES descritos en el presente documento pueden ser sustancialmente homocelulares, consistir sustancialmente en hESC pluripotentes, consistir sustancialmente en células endodérmicas definitivas, células de endodermo del intestino anterior, consistir sustancialmente en células del endodermo pancreático, que pueden incluir además células del endodermo prepancreático PDX1 positivas, células del endodermo pancreático PDX1 positivas, células apicales del endodermo pancreático PDX1 positivas, células precursoras endocrinas pancreáticas, células endocrinas pancreáticas y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "esencialmente" o "sustancialmente" significa una cantidad mínima o reducida de un componente o célula presente en cualquier tipo de suspensión de agregado celular, por ejemplo, los agregados celulares en suspensión descritos en el presente documento son "esencial o sustancialmente homogéneos", "esencial o sustancialmente homocelulares" o se componen de "esencialmente hESC", "esencial o sustancialmente células endodérmicas definitivas", "esencial o sustancialmente células de endodermo del intestino anterior", "esencial o sustancialmente células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas", "esencial o sustancialmente células del endodermo prepancreático PDX1 positivas", "esencial o sustancialmente células del endodermo pancreático PDX1 positivas o células progenitoras", "esencial o sustancialmente células apicales del endodermo pancreático PDX1 positivas", "esencial o sustancialmente células precursoras endocrinas pancreáticas", "esencial o sustancialmente células endocrinas pancreáticas" y similares.

Algunos de los cultivos en suspensión de agregados celulares sustancialmente homocelulares son, por ejemplo, cultivos en suspensión de agregados celulares derivados de hES que comprenden menos de aproximadamente el 50 % de hESC, menos de aproximadamente el 45 % de hESC, menos de aproximadamente el 40 % de hESC, menos de aproximadamente el 35 % de hESC, menos de aproximadamente el 30 % de hESC, menos de aproximadamente el 25 % de hESC, menos de aproximadamente el 20 % de hESC, menos de aproximadamente el 15 % de hESC, menos de aproximadamente el 10 % de hESC, menos de aproximadamente el 5 % de hESC, menos de aproximadamente el 4 % de hESC, menos de aproximadamente el 3 % de hESC, menos de aproximadamente el 2 % de hESC o menos de aproximadamente el 1 % de hESC del total de células derivadas de hES en el cultivo. Dicho de otra manera, los cultivos en suspensión de agregados celulares derivados de hES, por ejemplo, células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas, células de endodermo prepancreático PDX positivas, células de endodermo pancreático PDX1 positiva o células progenitoras, células apicales pancreáticas PDX1 positivas, células progenitoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas, comprenden al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %,

Como se usa en el presente documento, "heterocelular", "multicelular" o equivalentes de los mismos se refieren a agregados celulares por los que cada agregado celular individual comprende una pluralidad de células de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más tipos de células, o al menos un tipo de célula y un componente no celular, por ejemplo, material de matriz extracelular (ECM, por las siglas del inglés extracellular matrix) (por ejemplo, colágeno, fibronectina, laminina, elastina y/o proteoglucanos). Dichos componentes de ECM pueden secretarse de forma natural por las células, o alternativamente, las células pueden manipularse genéticamente mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica para variar el nivel de expresión del material ECM y/o de moléculas de adhesión celular, tales como selectinas, integrinas, inmunoglobulinas y cadherinas, entre otras. De manera alternativa, en los agregados puede incorporarse material de ECM natural o cualquier componente sintético que imite el material ECM durante la formación de agregados. Por ejemplo, los métodos para la producción de agregados de células derivadas de hES tales como agregados de células epiteliales pancreáticas o del endodermo pancreático (o agregados celulares en fase 4) descritos en el presente documento, consisten sustancialmente en células epiteliales o de endodermo pancreático, pero también pueden consistir en pequeñas cantidades de células, otras células de tipo epitelial no pancreático, u otros progenitores del endodermo, e incluso células secretoras endocrinas pancreáticas (por ejemplo, células secretoras de insulina).

Para que quede claro, los agregados homo o heterocelulares descritos en el presente documento y producidos mediante los métodos de suspensión descritos en el presente documento, no son los mismos agregados celulares que los descritos en la técnica y por otros investigadores y se denominan cuerpos embrioides (EB). Los cuerpos embrioides se distinguen claramente de los agregados celulares descritos en el presente documento porque los EB son agregados celulares de células diferenciadas e indiferenciadas que aparecen cuando las células ES crecen en exceso en cultivos de monocapa, o se mantienen en cultivos en suspensión en medios indefinidos o se diferencian mediante protocolos no dirigidos (es decir, diferenciación aleatoria) hacia múltiples tejidos de la capa germinal. Por el contrario, el método desvelado en el presente documento, analizado en detalle en los Ejemplos de Referencia 17 y 20, disocia enzimáticamente hESC en cultivos en placa adherentes para preparar una suspensión unicelular y después reúne las células para formar agregados celulares; después usando estos cultivos en suspensión de agregados celulares para la diferenciación sustancialmente como se describe en D'Amour et al. 2005, citado anteriormente, y D'Amour et al. 2006, citado anteriormente. Otras diferencias entre los EB y los agregados celulares descritos en el presente documento se analizan con más detalle a continuación.

Otros métodos describen la fabricación de cuerpos embrioides (EB). Como se usa en el presente documento, la expresión "cuerpos embrioides", "cuerpos agregados" o equivalentes de los mismos, se refieren a agregados de células diferenciadas e indiferenciadas que aparecen cuando las células ES crecen en exceso en cultivos monocapa, o se mantienen en cultivos en suspensión en medios indefinidos o se diferencian mediante protocolos no dirigidos hacia múltiples tejidos de la capa germinal. Esto es, los EB no se forman a partir de una suspensión unicelular de células madre pluripotentes como se describe en el presente documento; ni los EB se forman a partir de cultivos adherentes de células multipotentes derivadas de hES. Estas características por sí solas hacen que la presente invención se distinga claramente de un cuerpo embrioide.

Los cuerpos embrioides son una mezcla de diferentes tipos de células, normalmente de varias capas germinales, distinguibles por criterios morfológicos. Los cuerpos embrioides normalmente se refieren a una estructura morfológica compuesta por una población de células, la mayoría de las cuales derivan de células madre embrionarias (ES) que se han sometido a diferenciación no dirigida, es decir, tal como la que se produce cuando las células indiferenciadas se exponen a altas concentraciones de suero en ausencia de factores de crecimiento definidos. En condiciones de cultivo adecuadas para la formación de EB (por ejemplo, la retirada del factor inhibidor de leucemia para células ES de ratón, u otros, factores de bloqueo similares), las células ES proliferan y forman pequeñas masas de células que comienzan a diferenciarse. En primer lugar, correspondiendo a aproximadamente los días 1-4 de diferenciación para las células ES humanas, la pequeña masa de células forma una capa de células endodérmicas en la capa externa y se considera un "cuerpo embrioide simple". En segundo lugar, correspondiendo a aproximadamente los días 3-20 después de la diferenciación para las células ES humanas, se forman "cuerpos embrioides complejos", que se caracterizan por una amplia diferenciación de células ectodérmicas y mesodérmicas y tejido derivado. Como se usa en el presente documento, los EB incluyen EB simples y complejos a menos que el contexto requiera lo contrario. La determinación de cuándo se han formado los cuerpos embrioides en un cultivo de células ES la realizan habitualmente personas con experiencia en la materia mediante, por ejemplo, inspección visual de la morfología. Las masas flotantes de aproximadamente 20 células o más, dependiendo de las condiciones de cultivo, se consideran EB. Véanse, por ejemplo, Schmitt et al. (1991) Genes Dev. 5, 728-740; Doetschman et al.

1985, J. Embryol. Exp. Morph. 87:27-45. El término también se refiere a estructuras equivalentes derivadas de células germinales primordiales, que son células primitivas extraídas de regiones gonadales embrionarias; véase por ejemplo, Shamblott et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 13726. Las células germinales primordiales, a veces también denominadas en la técnica células EG o células germinales embrionarias, cuando se tratan con factores apropiados forman células ES pluripotentes de las que pueden derivar cuerpos embrioides; véase por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.670.372; y Shamblott et al. citado anteriormente.

Existen diversos métodos para preparar EB, por ejemplo, girar cuerpos embrioides como se describe por Ng et al.

2008 Nature Protocols 3:468-776 y EB elaborados a partir de suspensiones unicelulares que se sembraron en placa en islas de matriz extracelular con micropatrones como se describe en Bauwens et al. 2008, Stem Cells 26:2300-10, Epub 26 de junio de 2008. Sin embargo, estos métodos tienen un coste prohibitivo y son menos eficientes para la producción (fabricación) a gran escala de hESC y células derivadas de hES porque requieren demasiadas etapas antes de que pueda comenzar la producción a gran escala. Por ejemplo, Bauwens et al. primero tenían que sembrar hESC en un MATRIGEL™ reducido en factor de crecimiento antes de que las células puedan seleccionarse para iniciar un cultivo en suspensión. El tiempo y el coste de este método lo hacen engorroso porque se requieren placas de cultivo tisular con micro patrones personalizados. Adicionalmente, el método empleado por Ng et al. tampoco es rentable para la fabricación a gran escala de hESC y células derivadas de hES debido al uso de centrifugadoras para crear un EB más uniforme. Estos métodos están limitados por restricciones en el área de la superficie, lo que también afecta a su escalabilidad. Por último, en todas estas metodologías, los agregados de células no se realizan a partir de suspensiones unicelulares de células madre pluripotentes como en la presente invención.

Los cuerpos embrioides son agregados celulares, a diferencia de los agregados celulares descritos en el presente documento, que se componen de numerosos tipos de células de las tres capas germinales y normalmente se crean al exponer agregados de células madre embrionarias indiferenciadas a señales de diferenciación no dirigidas, tales como suero bovino fetal al 20 %. El resultado de esta metodología no dirigida es una mezcla de tipos de células que pretende imitar el desarrollo normal del embrión in vitro. Aunque este enfoque es útil a nivel de investigación básica para examinar el desarrollo embrionario, no es susceptible de ningún proceso de fabricación de terapia celular a gran escala donde el rendimiento celular, identidad de la población, pureza de la población, consistencia del lote, seguridad, función celular y coste de los bienes son preocupaciones primordiales. Además, independientemente de las estrategias de enriquecimiento empleadas para purificar un tipo de célula determinado de un cuerpo embrioide, el protocolo de diferenciación no proporciona un enfoque dirigido que generará una gran población de un solo tipo de célula. Posteriormente, las poblaciones contaminantes siempre predominarán y obstaculizarán cualquier intento de purificar una población específica. Todo el trabajo previo sobre la creación y diferenciación de agregados de células madre embrionarias tiene uno o más de los siguientes componentes en su metodología: 1) uso de células ES de ratón en lugar de humanas, 2) protocolos de agregación forzada que se basan en la centrifugación para agregar células en lugar de procesos de adhesión celular normales, 3) agregación de trozos de células en condiciones estáticas, 4) disociación de células no individuales o raspado de células de las superficies para crear agregados, 5) diferenciación no directa de agregados celulares usando suero de ternero fetal al 15-20%, resultando en la formación de un cuerpo embrioide y tipos de células de todas las capas germinales, 6) formación en condiciones de "gota colgante" que solo se puede realizar a pequeña escala. Según el conocimiento de los presentes inventores, el único estudio que no utiliza un 15-20 % de FCS para diferenciar los cuerpos embrioides describe un protocolo en el que los agregados celulares se forman por agregación forzada, después los agregados se diferencian inmediatamente usando medios apropiados para el mesodermo (Ng et al. 2005, Blood 106:1601). Sin embargo, en este trabajo, los investigadores transfirieron los cuerpos embrioides a un cultivo adherente no agregado después de 10-12 días en un cultivo agregado estático, lo que hizo que las comparaciones con la aplicación actual fueran irrelevantes. A diferencia de todo el trabajo anterior, la solicitud actual presenta un enfoque que 1) disocia células ES humanas en células individuales y después crea agregados mediante cultivo rotacional a velocidades de cizalla optimizadas para mejorar el control del diámetro agregado y la supervivencia celular, 2) diferencia directamente los agregados de células ES en el endodermo definitivo y después elimina el endodermo del intestino, después el endodermo del intestino anterior prepancreático, después el endodermo pancreático y finalmente las células endocrinas pancreáticas. Este protocolo de diferenciación genera poblaciones de linaje endodermo y pancreático definitivas con alta eficiencia y poblaciones de contaminantes mínimas. Además, este enfoque de agregación y diferenciación de células ES no crea cuerpos embrioides, en contraste directo con todas las demás investigaciones publicadas.

A diferencia de los cuerpos embrioides, que son una mezcla de células diferenciadas e indiferenciadas y normalmente consisten en células de varias capas germinales y pasan por una diferenciación aleatoria, los agregados celulares descritos en el presente documento son esencial o sustancialmente homocelulares, existiendo como agregados de células de tipo pluripotente, multipotente, bipotente o unipotente, por ejemplo, células embrionarias, endodermo definitivo, endodermo del intestino anterior, endodermo pancreático PDX1 positivo, células endocrinas pancreáticas y similares.

La presente invención aborda los problemas anteriores proporcionando un proceso de fabricación rentable o métodos capaces de producir de forma reproducible agregados de células que son sustancialmente uniformes en tamaño y forma usando un proceso que puede aplicarse fácilmente a la fabricación a gran escala. Las células diferenciables pueden expandirse en un cultivo en suspensión, usando los medios celulares desvelados en el presente documento. De manera alternativa, las células diferenciables pueden mantenerse y expandirse en suspensión, es decir, permanecen indiferenciadas o se les impide diferenciarse más. El término "expandir" en el contexto del cultivo celular se usa tal como está en la técnica, y se refiere a la proliferación celular y al aumento del número de células, preferentemente el aumento del número de células viables. Las células pueden expandirse en una suspensión de cultivo cultivando durante más de aproximadamente un día, es decir, aproximadamente 24 horas. Las células pueden expandirse en un cultivo en suspensión cultivando durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas.

Las condiciones de cultivo de diferenciación y los tipos de células derivadas de hES descritos en el presente documento son sustancialmente similares a los descritos en D'Amour. et al. 2006, citado anteriormente. D'Amour et al. 2006, describe un protocolo de diferenciación de 5 etapas: fase 1 (da como resultado sustancialmente una producción de endodermo definitivo), fase 2 (da como resultado sustancialmente una producción de endodermo del intestino anterior PDX1 negativo), fase 3 (da como resultado sustancialmente una producción de endodermo del intestino anterior PDX1 positivo), fase 4 (da como resultado sustancialmente una producción de endodermo o epitelio pancreático o progenitor endocrino pancreático) y fase 5 (da como resultado sustancialmente una producción de células endocrinas que expresan hormonas). Cabe destacar que, por primera vez, todos estos tipos de células pueden producirse mediante los métodos de suspensión descritos en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "endodermo definitivo (DE)" se refiere a una célula de linaje endodermo multipotente que puede diferenciarse en células del tubo intestinal u órganos derivados del tubo intestinal. Como se desvela en el presente documento, las células de endodermo definitivo pueden ser células de mamífero y, en algunos casos, las células de endodermo definitivo son células humanas. Como se desvela en el presente documento, las células de endodermo definitivo pueden expresar o no expresar de manera significativa determinados marcadores. Pueden seleccionarse uno o más marcadores de SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3beta, GSC, FGF17, VWF, CAFCR, FOXQ1, CMKOR1, CRIP1 y CER que se expresan en células de endodermo definitivo. De manera alternativa, uno o más marcadores seleccionados de OCT4, alfa-fetoproteína (AFP), Trombomodulina (TM), SPARC, SOX7 y HNF4alfa pueden no expresarse de manera significativa en las células de endodermo definitivo. Las poblaciones celulares de endodermo definitivo y los métodos de producción de las mismas también se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 11/021.618, titulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 23 de diciembre de 2004.

En el presente documento se desvelan cultivos celulares y agregados celulares denominados "células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas", "células de endodermo del intestino anterior" o equivalentes de las mismas. Las células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas también son multipotentes y pueden dar lugar a diversas células y tejidos incluyendo, pero sin limitación, timo, tiroides, paratiroides, pulmones/bronquios, hígado, faringe, bolsas faríngeas, partes del duodeno y la trompa de Eustaquio. Las células de endodermo del intestino anterior pueden expresar niveles elevados de SOX17, HNF1B, HNF1 alfa, FOXA1 en comparación con células que no son de endodermo del intestino anterior, por ejemplo, endodermo definitivo o endodermo PDX positivo que no expresan apreciablemente estos marcadores. Las células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas también expresan niveles bajos o nulos de PDX1, AFP, SOX7 y SOX1. En la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 11/588.693, titulada PDXI-expressing dorsal and ventral foregut endoderm, presentada el 27 de octubre de 2006, se describen poblaciones de células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas y sus métodos de producción.

En el presente documento se desvelan cultivos celulares de "células de endodermo del intestino anterior pancreáticas PDX1 positivas", "de endodermo prepancreático PDX1 positivas", o sus equivalentes. Las células de endodermo prepancreático PDX1 positivas son multipotentes y pueden dar lugar a diversas células y/o tejidos incluyendo, pero sin limitación, estómago, intestino y páncreas. Las células de endodermo prepancreático PDX1 positivas pueden expresar niveles aumentados de PDX1, HNF6, SOX9 y PROX1 en comparación con células de endodermo no prepancreático que no expresan apreciablemente estos marcadores. Las células de endodermo prepancreático P^dX1 positivas también pueden expresar niveles bajos o nulos de NKX6.1, PTF1A, CPA y cMYC. En el presente documento también se desvelan cultivos celulares de "células del endodermo pancreático PDX1 positivas", "progenitor pancreático PDX1 positivo", "epitelio pancreático", "PE" o equivalentes de los mismos. Las células progenitoras pancreáticas PDX1 positivas son multipotentes y pueden dar lugar a diversas células en el páncreas incluyendo, pero sin limitación, células acinares, ductales y endocrinas. Las células progenitoras pancreáticas PDX1 positivas pueden expresar niveles aumentados de PDX1 y NKX6.1 en comparación con las células del endodermo no prepancreático que no expresan apreciablemente estos marcadores. Las células progenitoras pancreáticas PDX1 positivas también pueden expresar niveles bajos o nulos de PTF1A, CPA, cMYC, NGN3, PAX4, ARX y NKX2.2, INS, GCG, GHRL, SST y PP.

En el presente documento se desvelan cultivos celulares de "células de la punta del endodermo pancreático PDX1 positivas", o equivalentes de los mismos, las células apicales del endodermo pancreático PDX1 positivas pueden expresar niveles aumentados de PDX1 y NKX6.1 similares a los de las células progenitoras pancreáticas PDX1 positivas, pero a diferencia de las células progenitoras pancreáticas PDX1 positivas, las células apicales del endodermo pancreático PDX1 positivas pueden expresar adicionalmente niveles aumentados de PTF1A, CPA y cMYC. Las células apicales del endodermo pancreático PDX1 positivas también pueden expresar niveles bajos o nulos de NGN3, PAX4, ARX y NKX2.2, INS, GCG, GHRL, SST y PP.

En el presente documento se desvelan cultivos celulares de "células precursoras endocrinas pancreáticas", "células progenitoras endocrinas pancreáticas" o equivalentes de las mismas. Las células progenitoras endocrinas pancreáticas son multipotentes y dan lugar a células endocrinas maduras que incluyen células alfa, beta, delta y PP. Las células progenitoras endocrinas pancreáticas pueden expresar niveles elevados de NGN3, PAX4, ARX y NKX2.2 en comparación con otros tipos de células progenitoras no endocrinas. Las células progenitoras pancreáticas también pueden expresar niveles bajos o nulos de INS, GCG, GHRL, SST y PP.

En el presente documento se desvelan cultivos celulares de "células endocrinas pancreáticas", "células secretoras de hormonas pancreáticas", "célula que expresa hormonas de los islotes pancreáticos", o equivalentes de los mismos que se refieren a una célula, que se ha derivado de una célula pluripotente in vitro, por ejemplo, células alfa, beta, delta y/o PP o combinaciones de las mismas. Las células endocrinas pueden ser polihormonales o de una sola hormona, por ejemplo, que expresan expresar insulina, glucagón, grelina, somatostatina y polipéptido pancreático o combinaciones de los mismos. Las células endocrinas pueden por lo tanto expresar una o más hormonas pancreáticas, que tienen al menos algunas de las funciones de una célula de islote pancreático humano. Las células que expresan hormonas de los islotes pancreáticos pueden ser maduras o inmaduras. Las células que expresan hormonas de los islotes pancreáticos inmaduras pueden distinguirse de las células que expresan hormonas de los islotes pancreáticos maduros en función de la expresión diferencial de ciertos marcadores o en función de sus capacidades funcionales, por ejemplo, capacidad de respuesta a la glucosa in vitro o in vivo. Las células endocrinas pancreáticas también expresan niveles bajos o nulos de NGN3, PAX 4, ARX y NKX2.2.

La mayoría de los tipos de células anteriores están epitelizados en comparación con las células del endodermo definitivas mesenquimales. Las células del endodermo pancreático pueden expresar uno o más marcadores seleccionados de la Tabla 3 y/o uno o más marcadores seleccionados de la Tabla 4 de la Solicitud de Patente de EE.UU. relacionada N.° 11/588.693 titulada PDX1 EXPRESSING DOSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM, presentada el 27 de octubre de 2006 y también la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 11/115.868, titulada PDX1-expressing endoderm, presentada el 26 de abril de 2005.

En el presente documento se desvelan composiciones y métodos útiles para células diferenciables, independientemente de su origen o de su plasticidad. La "plasticidad" de una célula se usa aquí aproximadamente como en la técnica. Concretamente, la plasticidad de una célula se refiere a la capacidad de una célula para diferenciarse en un tipo de célula particular que se encuentra en los tejidos u órganos de un embrión, feto u organismo desarrollado. Cuanto "más plástica" es una célula, en más tejidos será capaz de diferenciarse la célula. Las "células pluripotentes" incluyen las células y su progenie, que pueden ser capaces de diferenciarse en, o dar lugar a, células pluripotentes, multipotentes, oligopotentes y unipotentes, y/o varios, si no todos, de los tipos de células maduras o parcialmente maduras que se encuentran en un embrión, feto u organismo desarrollado. Las "células multipotentes" incluyen las células y su progenie, que pueden ser capaces de diferenciarse en, o dar lugar a, células progenitoras multipotentes, oligopotentes y unipotentes, y/o uno o más tipos de células maduras o parcialmente maduras, excepto que los tipos de células maduras o parcialmente maduras derivadas de células multipotentes se limitan a células de un tejido en particular, órgano o sistema de órganos. Por ejemplo, una célula progenitora hematopoyética multipotente y/o su progenie poseen la capacidad de diferenciarse o dar lugar a uno o más tipos de células oligopotentes, tales como las células progenitoras mieloides y las células progenitoras linfoides, y también dan lugar a otros componentes celulares maduros que normalmente se encuentran en la sangre. Las "células oligopotentes" incluyen células y su progenie cuya capacidad para diferenciarse en células maduras o parcialmente maduras está más restringida que las células multipotentes. Las células oligopotentes pueden, sin embargo, aún poseer la capacidad de diferenciarse en células oligopotentes y unipotentes, y/o uno o más tipos de células maduras o parcialmente maduras de un tejido dado, órgano o sistema de órganos. Un ejemplo de una célula oligopotente es una célula progenitora mieloide, que finalmente puede dar lugar a eritrocitos maduros o parcialmente maduros, plaquetas, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y monocitos. Las "células unipotentes" incluyen células y su progenie que poseen la capacidad de diferenciarse o dar lugar a otras células unipotentes y/o un tipo de tipo celular maduro o parcialmente maduro.

Las células diferenciables, como se desvela en el presente documento, pueden ser pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o incluso unipotentes. Las células diferenciables pueden ser células diferenciables pluripotentes. Las células diferenciables pluripotentes pueden seleccionarse del grupo que consiste en células madre embrionarias, células ICM/de epiblasto no humanas, células del ectodermo primitivo, células germinales primordiales y células de teratocarcinoma. En un caso, las células diferenciables pueden ser células madre embrionarias de mamífero. Las células diferenciables pueden ser células madre embrionarias humanas.

Las células diferenciables pueden provenir de cualquier fuente dentro de un animal, siempre que las células sean diferenciables como se define en el presente documento. Por ejemplo, las células diferenciables pueden obtenerse de embriones no humanos, o de cualquier capa germinal primordial en los mismos, de tejido placentario o corion, o de tejido más maduro, como células madre adultas incluyendo, pero sin limitación tejido adiposo, médula ósea, tejido nervioso, tejido mamario, tejido hepático, páncreas, epitelial, respiratorio, gonadal y tejido muscular. Por ejemplo, las células diferenciables pueden ser células madre embrionarias. De manera alternativa, las células diferenciables pueden ser células madre adultas o pueden ser células madre derivadas de la placenta o coriónicas.

Por supuesto, las divulgaciones del presente documento contemplan el uso de células diferenciables de cualquier animal capaz de generar células diferenciables. Los animales de los que se obtienen las células diferenciables pueden ser vertebrados o invertebrados, mamíferos o no mamíferos, humanos o no humanos. Los ejemplos de fuentes animales incluyen, pero sin limitación, primates, roedores, cánidos, felinos, equinos, bovinos y porcinos. Las células diferenciables pueden derivarse usando cualquier método conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden producirse células pluripotentes humanas usando métodos de desdiferenciación y transferencia nuclear. Adicionalmente, la célula ICM/de epiblasto no humana o la célula del ectodermo primitivo puede derivarse in vivo o in vitro. Las células del ectodermo primitivo pueden generarse en cultivo adherente o como agregados celulares en cultivo en suspensión, como se describe en el documento WO 99/53021. Adicionalmente, las células pluripotentes humanas pueden pasarse usando cualquier método conocido por los expertos en la, incluyendo, métodos de realización de pases manuales y métodos de realización de pases masivos como el pase enzimático o no enzimático.

Cuando se usan células ES, las células madre embrionarias pueden tener un cariotipo normal, mientras que alternativamente, las células madre embrionarias pueden tener un cariotipo anormal. En un caso, una mayoría de las células madre embrionarias puede tener un cariotipo normal. Se contempla que más del 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o más del 95 % de las metafases examinadas mostrarán un cariotipo normal.

Una mayoría de las células madre embrionarias puede tener un cariotipo anormal. Se contempla que más del 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o más del 95 % de las metafases examinadas puedan mostrar un cariotipo anormal. El cariotipo anormal puede ser evidente después de que las células se hayan cultivado durante más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 20 pases. En el cariotipo anormal puede comprender una trisomía de al menos un cromosoma autosómico, en donde el cromosoma autosómico se selecciona del grupo que consiste en los cromosomas 1, 7, 8, 12, 14 y 17. El cariotipo anormal puede comprender una trisomía de más de un cromosoma autosómico, en donde al menos uno de los más de un cromosoma autosómico se selecciona del grupo que consiste en los cromosomas 1, 7, 8, 12, 14 y 17. El cromosoma autosómico puede ser el cromosoma 12 o 17. El cariotipo anormal puede comprender un cromosoma sexual adicional. El cariotipo puede comprender dos cromosomas X y un cromosoma Y. También se contempla que puedan producirse translocaciones de cromosomas, y tales translocaciones se incluyen en la expresión "cariotipo anormal". Las combinaciones de las anomalías cromosómicas anteriores y otras anomalías cromosómicas, también se incluyen en las divulgaciones del presente documento.

Las composiciones y métodos comprenden una solución nutritiva de sal basal. Como se usa en el presente documento, solución nutritiva de sal basal se refiere a una mezcla de sales que proporcionan a las células agua y determinados iones inorgánicos a granel esenciales para el metabolismo celular normal, mantienen el equilibrio osmótico intra y extracelular, proporcionan un carbohidrato como fuente de energía y proporcionan un sistema

tampón para mantener el medio dentro del intervalo de pH fisiológico. Los ejemplos de soluciones nutritivas de sales basales incluyen, pero sin limitación, Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Medio esencial mínimo

(MEM), Medio basal de Eagle (BME), RPM1 1640, F-10 de Ham, F-12 de Ham, Medio esencial a-mínimo (aMEM),

Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM) y Medio de Dulbecco Modificado de Iscove y mezclas de los mismos.

En un caso, la solución nutritiva de sal basal puede ser una mezcla aproximadamente 50:50 de DMEM y F12 de

Ham.

Se contempla que la composición pueda comprender además oligoelementos. Los oligoelementos pueden adquirirse

en el comercio, por ejemplo, en Mediatech. Los ejemplos no limitativos de oligoelementos incluyen, pero sin limitación, compuestos que comprenden, aluminio, cloro, sulfato, hierro, cadmio, cobalto, cromo, germanio, sodio, potasio, calcio, fosfato y magnesio. Los ejemplos específicos de compuestos que contienen oligoelementos incluyen, pero sin limitación, A IC I³, AgNO³, Ba(C²H³O²)² , CdCl² , CdSO⁴, CoCl², CrCl³, Cr²(SO⁴)³, CuSO⁴, citrato férrico, GeO², KI, KBr, LI, ácido molíbdico, MnSO⁴, MnCh, NaF, Na²SiO³ , NaVO³ , NH⁴VO³ , (NH⁴)aMoyO²⁴, NiSO⁴, RbCl selenio, Na²SeO³, H²SeO³, selenito 2Na, selenometionona, SnCl² , ZnSO⁴ , ZrOCh y mezclas y sales de los mismos.

Si hay selenio, selenita o selenometionona, su concentración es de aproximadamente 0,002 a aproximadamente

0,02 mg/l. Además, también puede haber hidroxiapatita.

Se contempla que puedan añadirse aminoácidos al medio definido. Los ejemplos no limitativos de tales aminoácidos

son glicina, L-Alanina, L-Alanil-L-Glutamina, L-Glutamina/Glutamax, Clorhidrato de L-Arginina, L-Asparagina-H²O,

Ácido L-Aspártico, Clorhidrato de L-Cisteína -H²O, L-Cistina 2HCl, Ácido L-Glutámico, Clorhidrato de L-Histidina-H²O, L-Isoleucina, L-Leucina, Clorhidrato de L-Lisina, L-Metionina, L-Fenilalanina, L-Prolina, L-Hidroxiprolina, L-Serina, L-Treonina, L-Triptofano, Dihidrato de sal disódica de L-Tirosina y L-Valina. En determinadas realizaciones, el aminoácido es L-Isoleucina, L-Fenilalanina, L-Prolina, L-Hidroxiprolina, L-Valina y mezclas de los mismos.

También se contempla que el medio definido pueda comprender ácido ascórbico. Preferentemente el ácido ascórbico está presente en una concentración inicial de aproximadamente 1 mg/la aproximadamente 1000 mg/l, o de aproximadamente 2 mg/l a aproximadamente 500 mg/l, o de aproximadamente 5 mg/l a aproximadamente 100 mg/l, o de aproximadamente 10 mg/l a aproximadamente 100 mg/l o aproximadamente a 50 mg/l.

Además, las composiciones y métodos también pueden comprender otros componentes tales como seroalbúmina, transferrina, L-glutamina, lípidos, antibióticos, p-Mercaptoetanol, vitaminas, minerales, ATP y componentes similares

pueden estar presentes. Los ejemplos de vitaminas que pueden estar presentes incluyen, pero sin limitación, vitaminas A, B¹, B² , B³ , B⁵, Be, B⁷ , B⁹ , B¹², C, D¹, D², D³, D⁴, D⁵ , E, to puede determinar la concentración óptima de minerales, vitaminas, ATP, lípidos, ácidos grasos esenciales, etc., para

su uso en un cultivo dado. La concentración de suplementos puede, por ejemplo, ser de aproximadamente 0,001 pM

a aproximadamente 1 mM o más. Los ejemplos específicos de concentraciones a las que se pueden proporcionar los suplementos incluyen, pero sin limitación aproximadamente 0,005 pM, 0,01 pM, 0,05 pM, 0,1 pM, 0,5 pM,

1,0 pM, 2,0 pM, 2,5 pM, 3,0 pM, 4,0 pM, 5,0 pM, 10 pM, 20 pM, 100 pM, etc. Las composiciones y métodos pueden comprender vitamina B6 y glutamina. De manera alternativa, las composiciones y métodos pueden comprender vitamina C y un suplemento de hierro, o las composiciones y métodos pueden comprender vitamina K¹ y vitamina A.

Las composiciones y métodos pueden comprender vitamina D³ y ATP. Las composiciones y métodos pueden comprender vitamina B¹² y transferrina. De manera alternativa, las composiciones y métodos pueden comprender tocotrienoles y p-Mercaptoetanol. Las composiciones y métodos pueden comprender glutamina y ATP. Las composiciones y métodos pueden comprender un ácido graso omega-3 y glutamina. Las composiciones y métodos pueden comprender un ácido graso omega-6 y vitamina B¹. Las composiciones y métodos pueden comprender ácido

a-linolénico y B².

Las composiciones desveladas en el presente documento están esencialmente exentas de suero. Como se usa en el presente documento, "esencialmente exenta de suero" se refiere a la ausencia de suero en las soluciones desveladas en el presente documento. El suero no es un ingrediente esencial para las composiciones y métodos desvelados en el presente documento. Por lo tanto, la presencia de suero en cualquiera de las composiciones solo

debe ser atribuible a impurezas, por ejemplo, de los materiales de partida o suero residual del cultivo celular primario. Por ejemplo, el medio o ambiente esencialmente exento de suero puede contener menos del 10, 9, 8, 7, 6,

5, 4, 3, 2 o 1 % de suero en el que todavía se observa la capacidad de mantenimiento bioactivo actualmente mejorada del medio o ambiente. La composición esencialmente exenta de suero puede que no contenga suero o reemplazo de suero, o que contenga solo cantidades traza de suero o reemplazo de suero del aislamiento de componentes del suero o reemplazo de suero que se añaden a los medios definidos.

Las composiciones y métodos también comprenden un medio para estimular la actividad tirosina cinasa ErbB2 en

células diferenciables. Las composiciones y métodos pueden comprender la presencia de al menos un ligando ErbB3. Normalmente, un ligando ErbB3 se unirá al receptor ErbB3 y se dimerizará con el receptor ErbB2. El receptor

ErbB2 es, a su vez, generalmente responsable de la actividad tirosina cinasa intracelular dentro de la célula diferenciable.

Como se usa en el presente documento, "ligando ErbB3" se refiere a un ligando que se une a ErbB3, que a su vez

dimeriza a ErbB2, activando así la actividad tirosina cinasa de la porción ErbB2 del receptor heterodimérico ErbB2/ErbB3. Los ejemplos no limitativos de ligandos ErbB3 incluyen Neurregulina-1; variantes de corte y empalme e isoformas de Neurregulina-1, incluyendo, pero sin limitación,HRG-p, HRG-a, Factor de diferenciación neu (NDF), Actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA), Factor de crecimiento glial 2 (GGF2) y Factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF); Neurregulina-2; variantes de corte y empalme e isoformas de Neurregulina-2, incluyendo pero sin limitación NRG2-p; Epirregulina; y Birregulina.

Los medios para estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2 pueden comprender al menos un ligando ErbB3 que se selecciona del grupo que consiste en Neurregulina-1, Herregulina-p (HRG-p), Herregulina-a (HRG-a), Factor de diferenciación neu (NDF), actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA), factor de crecimiento glial 2 (GGF2), factor derivado de neuronas motoras (SMDF), Neurregulina-2, Neurregulina-2p (NRG2-p), Epirregulina, Birregulina y variantes y fragmentos funcionales de los mismos. Las composiciones y métodos pueden comprender más de un medio para estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2, tales como, pero sin limitación, usando más de un ligando ErbB3.

En algunas composiciones y métodos, el ligando ErbB3 puede ser HRG-p o una variante o fragmento funcional del mismo. La especie a partir de la cual se cultivó la proteína aditiva, el polipéptido o variante o fragmento funcional derivado de la misma puede ser el mismo que la especie de las células que se cultivan. Por ejemplo, si se cultivan células ES de ratón, una HRG-p con una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia HRG-p de Mus musculus puede usarse como aditivo en cultivo y se considera que es "de la misma especie". De manera alternativa, la especie de la que deriva el aditivo biológico puede ser diferente de las células que se cultivan. Por ejemplo, si se cultivan células ES de ratón, una HRG-p con una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia HRG-p humana puede usarse como aditivo en cultivo y se considera que es "de diferentes especies".

Como se usa en el presente documento, un "fragmento funcional" es un fragmento o una variante de corte y empalme de un polipéptido de longitud completa que ejerce un efecto fisiológico o celular similar al del polipéptido de longitud completa. El efecto biológico del fragmento funcional no necesita ser idéntico en alcance o fuerza al polipéptido de longitud completa, siempre que se observe un efecto fisiológico o celular similar. Por ejemplo, un fragmento funcional de HRG-p puede estimular de forma detectable la tirosina cinasa dirigida por ErbB2.

Como se usa en el presente documento, el término "variante" incluye polipéptidos quiméricos o de fusión, homólogos, análogos, ortólogos y parálogos. Además, una variante de una proteína o polipéptido de referencia es una proteína o polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos aproximadamente el 80 % idéntica a la proteína o polipéptido de referencia. La variante puede ser al menos aproximadamente el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o incluso el 100 % idéntica a la proteína o polipéptido de referencia. Como se usa en el presente documento, los términos y expresiones "corresponde o corresponden a" y "que corresponde a" en lo que respecta a la alineación de secuencias, pretenden significar posiciones enumeradas dentro de la proteína o polipéptido de referencia, por ejemplo, neurregulina-1 humana o de ratón de tipo silvestre, y aquellas posiciones en la proteína o polipéptido modificado que se alinean con las posiciones en la proteína o polipéptido de referencia. Por lo tanto, cuando la secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido objeto está alineada con la secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido de referencia, la secuencia que "corresponde a" determinadas posiciones enumeradas de la proteína de referencia o secuencia polipeptídica son aquellas que se alinean con estas posiciones de la secuencia de referencia, pero no están necesariamente en estas posiciones numéricas exactas de la secuencia de referencia. Los métodos para alinear secuencias para determinar los aminoácidos correspondientes entre secuencias se describen a continuación.

Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, aproximadamente el 95 % "idéntica" a una referencia que codifica una secuencia de aminoácidos, por ejemplo TGF-p, se entiende que significa que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de aminoácidos puede incluir hasta aproximadamente cinco modificaciones por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia que codifica el TGF-p de referencia. En otras palabras, para obtener un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta aproximadamente el 5 % de los restos de aminoácidos de la secuencia de referencia pueden eliminarse o sustituirse con otro aminoácido o varios aminoácidos hasta aproximadamente el 5 % del total de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas modificaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones de los extremos N o C de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como se usa en el presente documento, "identidad" es una medida de la identidad de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de referencia. En general, las secuencias se alinean de tal manera que se obtenga la coincidencia de mayor orden. La "identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. (Véanse, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York (1991)). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la materia (Carillo, H. y Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, aquellos desvelados en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994) y Carillo, H. y Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988). Los programas de ordenador también pueden contener métodos y algoritmos que calculan la identidad y la similitud. Los ejemplos de métodos de programas de ordenador para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, et al. 1984 Nucleic Acids Research 12:387), BLASTP, ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul et al. 1990, J Molec Biol 215:403) y FASTDB. En Michaels y Garian 2000, Current Protocols in Protein Science, Vol 1, John Wiley y Sons, Inc., se indican ejemplos de métodos para determinar la identidad y la similitud. El algoritmo usado para determinar la identidad entre dos o más polipéptidos puede ser BLASTP.

El algoritmo usado para determinar la identidad entre dos o más polipéptidos puede ser FASTDB, que se basa en el algoritmo de Brutlag et al. (1990, Comp. App. Biosci. 6:237-245). En una alineación de secuencia FASTDB, las secuencias de consulta y objeto son secuencias de aminoácidos. El resultado de la alineación de secuencias está en porcentaje de identidad. Los parámetros que pueden usarse en una alineación FASTDB de secuencias de aminoácidos para calcular el porcentaje de identidad incluyen, pero sin limitación: Matriz = PAM, k-tuplo = 2, Penalización por emparejamiento erróneo = 1, Penalización por unión = 20, Longitud del grupo de aleatorización = 0, Puntación límite = 1, Penalización por huecos = 5, Penalización por tamaño de hueco 0,05, Tamaño de la ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos objeto, lo que sea más corto.

Si la secuencia objeto es más corta o más larga que la secuencia de consulta debido a adiciones o eliminaciones en el extremo N o C, no debido a adiciones o eliminaciones internas, puede realizarse una corrección manual, porque el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos o adiciones de los extremos N y C de la secuencia objeto al calcular el porcentaje de identidad. Para secuencias objeto truncadas en los extremos 5' o 3', en relación con la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia de consulta que están en el extremo N y C en la secuencia de referencia que no coinciden/alinean, como porcentaje del total de bases de la secuencia de consulta. Los resultados de la alineación FASTDB de secuencias determinan el emparejamiento/alineamiento. El porcentaje de alineación se resta después del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de identidad en porcentaje final. Esta puntuación corregida puede usarse para determinar cómo las alineaciones se "corresponden" entre sí, así como el porcentaje de identidad. Los restos de las secuencias de consulta (objeto) o de la secuencia de referencia que se extienden más allá de los extremos N o C de la secuencia de referencia o sujeto, respectivamente, pueden considerarse para los fines de ajustar manualmente la puntuación de identidad en porcentaje. Esto es, los restos que no coinciden/alinean con los extremos N o C de la secuencia de comparación pueden contarse cuando se ajusta manualmente la puntuación de porcentaje de identidad o la numeración de la alineación.

Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos de aminoácidos se alinea con una secuencia de referencia de 100 restos para determinar el porcentaje de identidad. La eliminación se produce en el extremo N de la secuencia objeto y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de los 10 primeros restos en el extremo N. Los 10 restos no apareados representan el 10 % de la secuencia (número de restos en los extremos N y C no emparejados/número total de residuos en la secuencia de consulta), por lo que se resta el 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes coincidieran perfectamente, el porcentaje de identidad final sería del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos se compara con una secuencia de referencia de 100. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas, por lo que no hay restos en los extremos N o C de la secuencia objeto que no coincidan/alineen con la secuencia de consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente.

En el presente documento se desvelan polipéptidos quiméricos o de fusión. Como se usa en el presente documento, un "polipéptido quimérico" o "polipéptido de fusión" comprende al menos una parte de un miembro del polipéptido de referencia unido operativamente a un segundo, polipéptido diferente. El segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente idéntico al polipéptido de referencia y que deriva del mismo organismo o de uno diferente. Con respecto al polipéptido de fusión, la expresión "unido operativamente" pretende indicar que el polipéptido de referencia y el segundo polipéptido están fusionados entre sí de tal manera que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia usada. El segundo polipéptido puede fusionarse al extremo N o C del polipéptido de referencia. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede ser un polipéptido de fusión GST-IGF-1 en el cual una secuencia de IGF-1 se fusiona con el extremo C de las secuencias de ^g S^t . Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de polipéptidos recombinantes. De manera alternativa, el polipéptido de fusión puede contener una secuencia señal heteróloga en su extremo N. En determinadas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamíferos), la expresión y/o secreción de un polipéptido puede aumentarse a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

Además de fragmentos y polipéptidos de fusión, las divulgaciones del presente documento incluyen homólogos y análogos de polipéptidos de origen natural. Los "homólogos" se definen en el presente documento como dos ácidos nucleicos o polipéptidos que tienen secuencias de nucleótidos o de aminoácidos similares o "idénticas", respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas como se definen en lo sucesivo. El término "homólogo" abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de una secuencia de nucleótidos de referencia debido a la degeneración del código genético y, por lo tanto, codifican el mismo polipéptido que el codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. Como se usa en el presente documento, "de origen natural" se refiere a una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que se produce en la naturaleza.

Un agonista de un polipéptido puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas del polipéptido. Un antagonista de un polipéptido puede inhibir una o más de las actividades de origen natural del polipéptido.

En algunas composiciones y métodos, el ligando ErbB3 es HRG-p o una variante o un fragmento funcional del mismo. Los ejemplos adicionales, no limitativos de ligandos ErbB3 se desvelan en las Patentes de EE.UU. N.° 6.136.558, 6.387.638 y 7.063.961.

Las herregulinas se clasifican generalmente en dos tipos principales, alfa y beta, basado en dos dominios similares a variantes EGF que se diferencian en sus partes de extremo C. Estos dominios similares a EGF, sin embargo, son idénticos en el espaciamiento de seis restos de cisteína contenidos en los mismos. Basándose en una comparación de secuencias de aminoácidos, Holmes et al. descubrió que entre la primera y la sexta cisteínas en el dominio similar a EGF, los HRG eran un 45 % similares al factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), un 35 % idénticos a anfirregulina (AR), un 32 % idénticos a TGF-a y un 27 % idénticos a EGF.

El factor de diferenciación neu de 44 kDa (NDF) es el equivalente de rata de HRG humana. Como los polipéptidos HRG, NDF tiene un dominio de homología de inmunoglobulina (Ig) seguido de un dominio similar a EGF y carece de un péptido señal de extremo C. Actualmente, hay al menos seis pro-NDF fibroblásticos distintos, clasificados como polipéptidos alfa o beta, basándose en las secuencias de los dominios similares a EGF. Las isoformas 1 a 4 se caracterizan basándose en un tramo variable entre el dominio similar a EGF y el dominio transmembrana. Por lo tanto, parece que se generan diferentes isoformas de NDF mediante corte y empalme alternativo y pueden realizar distintas funciones específicas de tejido. Véase la Patente europea N.° 505 148; y las Publicaciones de Patente Internacionales N.° WO 93/22424 y WO 94/28133.

Las composiciones y los métodos pueden estar exentos de insulina y sustitutos de insulina exógenos. La expresión "insulina o sustitutos de insulina exógenos" se usa en el presente documento para indicar insulina o sustitutos de insulina que se añaden o no se añaden intencionalmente a las composiciones o métodos de la presente invención. Por lo tanto, los métodos y las composiciones pueden estar exentos de insulina o sustitutos de insulina que se suministren intencionalmente. Las composiciones o métodos pueden, sin embargo, no necesariamente estar exentos de insulina endógena. Como se usa en el presente documento, "insulina endógena" indica que las células cultivadas pueden estar produciendo insulina por sí mismas cuando se cultivan de acuerdo con los métodos de la presente invención. También puede usarse insulina endógena para indicar impurezas residuales del cultivo celular primario o impurezas de los materiales de partida. En ejemplos específicos, las composiciones y métodos del presente documento contienen menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 pg/ml de insulina.

Como se usa en el presente documento, el término "insulina" se refiere a la proteína, o variante o fragmento de la misma que se une al receptor de insulina en concentraciones fisiológicas normales y puede inducir la señalización a través del receptor de insulina. El término "insulina" abarca una proteína que tiene la secuencia polipeptídica de la insulina humana nativa, o de otra insulina de mamífero, o de cualquier homólogo o variante de estas secuencias. Adicionalmente, el término insulina abarca fragmentos polipeptídicos que son capaces de unirse al receptor de insulina para inducir la señalización a través del receptor de insulina. La expresión "sustituto de insulina" se refiere a cualquier compuesto que contenga cinc que pueda usarse en lugar de insulina para dar resultados sustancialmente similares a los de la insulina. Los ejemplos de sustitutos de la insulina incluyen, pero sin limitación, cloruro de cinc, nitrato de cinc, bromuro de cinc y sulfato de cinc.

Para que quede claro, los factores de crecimiento similares a insulina no son sustitutos de la insulina ni homólogos de insulina, como se contempla en la presente invención. En consecuencia, las composiciones y métodos pueden comprender el uso de al menos un factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) o una variante o un fragmento funcional del mismo. De manera alternativa, las composiciones y métodos de la presente invención están exentos de factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) exógenos. Las composiciones y métodos pueden contener menos de 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 ng/ml de IGF-1.

Como se usa en el presente documento, la expresión "activador de IGF-1R" se refiere a mitógenos que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la proliferación celular, diferenciación y apoptosis celular. Los efectos de un activador de IGF-1R están normalmente mediados a través IGF-1R, aunque pueden estar mediados por otros receptores. El IGF-1R también está implicado en la transformación celular inducida por proteínas de virus tumorales y productos oncogénicos y la interacción está regulada por un grupo de proteínas de unión específicas (IGFBP). Además, un gran grupo de proteasas de IGFBP hidrolizan IGFBP, dando como resultado la liberación de IGF unidos que después reanudan su capacidad para interactuar con IGF-1R. Para el fin de las divulgaciones del presente documento, los ligandos, los receptores, las proteínas de unión y las proteasas se consideran todos activadores de IGF-1R. El activador de IGF-1R es IGF-1 o IGF-2. El activador de IGF-1R puede ser un análogo de IGF-1. Los ejemplos no limitativos de análogos de IGF-1 incluyen LongR3-IGF1, Des(1-3)IGF-1, [Arg3]IGF-1, [Ala31]IFG-1, Des(2,3)[Ala31]IGF-1, [Leu24]IGF1, Des(2,3)[Leu24]IGF-1, [Leu60]IGF-1, [Ala31][Leu60]IGF-1, [Leu24][Ala31]IGF-1 y combinaciones de los mismos. De manera alternativa, el análogo de IFG-1 puede ser LongR3-IGF1, que es un análogo recombinante del factor 1 de crecimiento de la insulina humana. Se contempla que LongR3-IGF1 esté inicialmente presente en una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 300 ng/ml o a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml.

Las composiciones y métodos pueden comprender factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) o un miembro de la familia TGF-p o variantes o fragmentos funcionales del mismo. Como se usa en el presente documento, la expresión "miembro de la familia TGF-p" o similar se refiere a factores de crecimiento que generalmente se caracterizan por un experto en la materia como pertenecientes a la familia TGF-p, ya sea debido a la homología con miembros conocidos de la familia TGF-p, o debido a la similitud en la función con miembros conocidos de la familia TGF-p. Si el miembro de la familia TGF-p está presente, el miembro de la familia TGF-p o variante o fragmento funcional del mismo puede activar SMAD 2 o 3. El miembro de la familia TGF-p puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, TGF-p, proteína morfogénica ósea-2 (BMP2) y proteína morfogénica ósea-4 (BMP4). El miembro de la familia TGF-p puede ser Activina A.

Se contempla que si Nodal está presente, inicialmente está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 2000 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 750 ng/ml o más preferiblemente de aproximadamente 25 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml. Se contempla que si se usa, Activina A inicialmente está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 25 ng/ml o lo más preferentemente a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml. Se contempla que si está presente, TGF-p inicialmente está presente en una concentración de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml o más preferiblemente de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml.

Las composiciones y métodos pueden estar exentos de activadores de receptores de FGF. Actualmente hay al menos 22 miembros conocidos de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos, uniéndose estos factores a uno de al menos uno de los cuatro receptores de FGF. Como se usa en el presente documento, la expresión "activador de un receptor de FGF" se refiere a factores de crecimiento que generalmente se caracterizan por un experto en la materia como pertenecientes a la familia FGF, ya sea debido a la homología con miembros conocidos de la familia FGF, o debido a la similitud en la función con miembros conocidos de la familia FGF. El activador de un receptor de FGF puede ser un FGF, tales como, pero sin limitación a-FGF y FGF2. Las composiciones y métodos pueden estar exentos de FGF2 exógeno. La expresión "FGF2 exógeno" se usa en el presente documento para indicar el factor de crecimiento de fibroblastos 2, es decir, FGF básico que no se añade intencionadamente a las composiciones o métodos de la presente invención. Por lo tanto, los métodos y las composiciones pueden estar exentos de FGF2 suministrado intencionalmente. Las composiciones o métodos pueden, sin embargo, no necesariamente estar exentos de FGF2 endógeno. Como se usa en el presente documento, "FGF2 endógeno" indica que las células cultivadas pueden estar produciendo FGF2 por sí mismas cuando se cultivan de acuerdo con los métodos de la presente invención y como se desvela en el presente documento. También puede usarse "FGF2 endógeno" para indicar impurezas residuales del cultivo celular primario o impurezas de los materiales de partida. En ejemplos específicos, las composiciones y métodos del presente documento contienen menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 ng/ml de FGF2.

Se contempla, sin embargo, que las composiciones y métodos pueden incluir al menos un activador de un receptor de FGF, incluyendo cualquiera de los polipéptidos de FGF, fragmentos funcionales de los mismos o variantes de los mismos. Se contempla que si FGF2 está presente, inicialmente está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 25 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 12 ng/ml o lo más preferentemente a una concentración de aproximadamente 8 ng/ml. Las composiciones y métodos pueden incluir al menos un activador de un receptor de FGF, distintos de FGF2. Por ejemplo, las composiciones y métodos pueden comprender al menos uno de FGF-7, FGF-10 o FGF-22 o variantes o fragmentos funcionales de los mismos. Una combinación de al menos dos de FGF-7, FGF-10 y FGF-22 o variantes o fragmentos funcionales de los mismos, puede estar presente. De manera alternativa, los tres de FGF-7, FGF-10 y FGF-22 o variantes o fragmentos funcionales de los mismos, puede estar presente. Se contempla que si cualquiera de FGF-7, FGF-10 o FGF-22 o variantes o fragmentos funcionales están presentes, cada uno inicialmente está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, más específicamente de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, más específicamente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 25 ng/ml, más específicamente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 12 ng/ml o lo más específicamente a una concentración de aproximadamente 8 ng/ml.

Las composiciones y métodos pueden comprender seroalbúmina (SA). La SA puede ser SA bovina (BSA) o SA humana (HAS). La concentración de la SA puede ser más de aproximadamente el 0,2 %, volumen a volumen (v/v), pero menos de aproximadamente el 10% v/v. La concentración de SA puede ser más de aproximadamente el 0,3 %, el 0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,2 %, el 1,4 %, el 1,6 %, el 1,8 %, el 2,0 %, el 2,2 %, el 2,4 %, el 2,6 %, el 2,8 %, el 3,0 %, el 3,2 %, el 3,4 %, el 3,6 %, el 3,8 %, el 4,0 %, el 4,2 %, el 4,4 %, el 4,6 %, el 4,8 %, el 5,0 %, el 5,2 %, el 5,4 %, el 5,6 %, el 5,8 %, el 6,0 %, el 6,2 %, el 6,4 %, el 6,6 %, el 6,8 %, el 7,0 %, el 7,2 %, el 7,4 %, el 7,6 %, el 7,8 %, el 8,0 %, el 8,2 %, el 8,4 %, el 8,6 %, el 8,8 %, el 9,0 %, el 9,2 %, el 9,4 %, el 9,6 % y el 9,8 % (v/v).

Las composiciones y métodos pueden comprender al menos un sustrato insoluble. Por ejemplo, las células diferenciables pueden colocarse en una superficie de cultivo celular que comprende compuestos tales como, pero no se limita a, poliestireno, polipropileno. La superficie puede, a su vez, estar recubierta con un sustrato insoluble. El sustrato insoluble puede seleccionarse del grupo que consiste en un colágeno, una fibronectina y fragmentos o variantes de los mismos. Otros ejemplos de sustratos insolubles incluyen, pero sin limitación, fibrina, elastina, fibronectinas, lamininas y nidógenos.

En consecuencia, los entornos y métodos de cultivo celular pueden comprender la siembra en placa de células en un cultivo adherente. Como se usa en el presente documento, las expresiones "siembra en placa" y "sembrar en placa" se refieren a cualquier proceso que permita que una célula crezca en un cultivo adherente. Como se usa en el presente documento, la expresión "cultivo adherente" se refiere a un sistema de cultivo celular mediante el cual las células se cultivan sobre una superficie sólida, que a su vez puede recubrirse con un sustrato insoluble que a su vez puede recubrirse con otra capa superficial de un sustrato, tales como aquellos listados a continuación, o cualquier otro material químico o biológico que permita que las células proliferen o se estabilicen en cultivo. Las células pueden adherirse o no firmemente a la superficie sólida o al sustrato. El sustrato para el cultivo adherente puede comprender uno cualquiera o una combinación de poliomitina, laminina, poli-lisina, colágeno purificado, gelatina, fibronectina, tenascina, vitronectina, entactina, proteoglucanos de sulfato de heparina, ácido poli glucolítico (PGA), ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glucólico (PLGA). Adicionalmente, el sustrato para el cultivo adherente puede comprender la matriz depositada por una capa alimentadora, o depositada por la célula humana pluripotente o el cultivo celular. Como se usa en el presente documento, la expresión "matriz extracelular" abarca sustratos sólidos tales como pero no limitados a aquellos descritos anteriormente, así como la matriz depositada por una capa de células alimentadoras o por la célula humana pluripotente o el cultivo celular. Las células pueden colocarse en placas recubiertas con mAt RIGEL™. De manera alternativa, las células pueden colocarse en placas recubiertas con fibronectina. Si las células se colocan en placa sobre fibronectina, las placas pueden prepararse revistiéndolas con 10 |jg/ml de fibronectina plasmática humana (Invitrogen, n.° 33016-015), diluida en agua de calidad tisular, durante 2-3 horas a temperatura ambiente. De manera alternativa, el suero puede colocarse en el medio hasta durante 24 horas para permitir que las células se depositen en el plástico. Si se usa suero para promover la fijación de las células, el medio se retira después y las composiciones, que están esencialmente libres de suero, se añaden a las células en placa.

Las composiciones y métodos contemplan que las células diferenciables se cultiven en condiciones que están esencialmente exentas de una célula alimentadora o capa alimentadora. Como se usa en el presente documento, una "célula alimentadora" es una célula que crece in vitro, que se cocultiva con una célula diana y estabiliza la célula diana en su estado actual de diferenciación. Como se usa en el presente documento, una "capa de células alimentadoras" puede usarse indistintamente con la expresión "célula alimentadora". Como se usa en el presente documento, la expresión "esencialmente exenta de una célula alimentadora" se refiere a que las condiciones de cultivo tisular no contienen células alimentadoras, o contienen un número minoritario de células alimentadoras. Por "de minimus", se entiende el número de células alimentadoras que se transfieren a las presentes condiciones de cultivo desde condiciones de cultivo anteriores en las que las células diferenciables se pueden habe cultivado en células alimentadoras. El medio acondicionado puede obtenerse de una célula alimentadora que estabiliza la célula diana en su estado actual de diferenciación. De manera alternativa, el medio definido puede ser un medio no acondicionado, que es un medio que no se obtiene de una célula alimentadora.

Como se usa en el presente documento, el término "estabilizar", cuando se usa en referencia al estado de diferenciación de una célula o cultivo de células, indica que las células continuarán proliferando a lo largo de múltiples pases en cultivo y preferentemente de forma indefinida en cultivo, donde la mayoría, si no todas, de las células del cultivo tienen el mismo estado de diferenciación. Además, cuando las células estabilizadas se dividen, la división produce normalmente células del mismo tipo de célula o produce células del mismo estado de diferenciación. Una célula estabilizada o una población celular en general, no se diferencia ni desdiferencia más si las condiciones del cultivo celular no se alteran, y las células continúan pasando y no crecen demasiado. La célula estabilizada puede ser capaz de proliferar en el estado estable indefinidamente o durante al menos más de 2 pases.

Las células pueden permanecer estables durante más de 3 pases, 4 pases, 5 pases, 6 pases, 7 pases, 8 pases, 9 pases, más de 10 pases, más de 15 pases, más de 20 pases, más de 25 pases o más de 30 pases. En algunos casos, la célula es estable durante más de aproximadamente 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses u 11 meses de pases continuos. De manera alternativa, la célula puede permanecer estable durante más de aproximadamente 1 año de pases continuos. Las células madre pueden mantenerse en cultivo en un estado pluripotente mediante un pase habitual en el medio definido hasta que se desee diferenciarlas. Como se usa en el presente documento, el término "proliferar" se refiere a un aumento en el número de células en un cultivo celular.

Las composiciones y métodos pueden comprender un inactivador de la señalización de BMP. Como se usa en el presente documento, un "inactivador de la señalización de BMP" se refiere a un agente que antagoniza la actividad de una o más proteínas BMP o cualquiera de sus componentes de señalización anteriores o posteriores a través de cualquiera de sus posibles rutas de señalización. El compuesto o compuestos usados para inactivar la señalización de BMP pueden ser cualquier compuesto conocido en la técnica o descubierto posteriormente. Los ejemplos no limitativos de inactivadores de la señalización de BMP incluyen receptor de BMP truncado dominante-negativo, receptores de BMP solubles, quimeras del receptor BMP-Fc, noggina, folistatina, cordina, gremlina, proteínas de la familia cerberus/DAN, ventropina, altas dosis de activina y amnionless.

Las composiciones y métodos pueden comprender al menos una hormona, citocina, adipocina, hormona del crecimiento o variante o fragmento funcional de las mismas. Actualmente se contempla que en determinados casos, la hormona del crecimiento presente en el medio definido será de la misma especie que las células diferenciables que se cultivan con el medio definido. Por lo tanto, por ejemplo, si se cultiva una célula humana, la hormona del crecimiento es la hormona del crecimiento humana. También se contempla el uso de hormona del crecimiento que sea de una especie diferente a las células cultivadas. Preferentemente la hormona, citocina, adipocina y/u hormona del crecimiento están presentes en una concentración inicial de aproximadamente 0,001 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,001 ng/ml a aproximadamente 250 ng/ml o más preferiblemente de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml.

Los ejemplos de citocinas y adipocinas que pueden incluirse en las composiciones y métodos incluyen, pero sin limitación, la familia de citocinas de haz de cuatro hélices a, la familia de citocinas de la interleucina-1 (IL-1), la familia de citocinas de IL-17 y la familia de citocinas de quimiocinas. Por supuesto, las divulgaciones del presente documento contemplan miembros y subclases de cada una de estas familias de citocinas, tales como, pero sin limitación, las quimiocinas CC, las quimiocinas CXC, las quimiocinas C y las quimiocinas CX3C, interferones, interleucinas, linfotoxinas, ligando c-kit, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), leptina, adiponectina, resistina, inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1), factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), factor de necrosis tumoral beta (TNFp), factor inhibidor de la leucemia, visfatina, proteína de unión al retinol 4 (RBP4), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (THPO). Por supuesto, un experto en la materia comprenderá que la invención contempla variantes o fragmentos funcionales de los factores listados anteriormente.

En el presente documento se desvelan métodos de cultivo de células diferenciables, comprendiendo los métodos la siembra en placa de células diferenciables en una superficie de cultivo celular, proporcionando una solución nutritiva de sal basal a las células y proporcionando un medio para estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2 en las células.

Las células diferenciables pueden ponerse en contacto con al menos una de las composiciones desveladas en el presente documento en ausencia de suero o reemplazo de suero y en ausencia de una capa de células alimentadoras, de tal manera que las células se mantengan en un estado indiferenciado durante al menos un mes. La pluripotencia puede determinarse mediante la caracterización de las células con respecto a los marcadores de superficie, marcadores transcripcionales, cariotipo y capacidad para diferenciarse en células de las tres capas germinales. Estas características son bien conocidas por aquellos expertos habituales en la materia.

Se describen en el presente documento diversas pPSC diferenciables incluyendo células madre pluripotentes humanas, tales como hESC de referencia incluyendo, pero sin limitación, CyT49, CyT203, CyT25, BGO1, BG02 y MEL1, y células madre pluripotentes inducidas (iPS) tales como iPSC-482c7 e iPSC-603 (Cellular Dynamics International, Inc., Madison, Wisconsin) e iPSC-G4 e iPSC-B7 (Shinya Yamanaka, Center for iPS Cell Research, Kyoto University); los estudios que usan G4 y B7 se describen en detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 12/765.714, titulada CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, presentada el 22 de abril de 2010. Algunas de estas células madre pluripotentes humanas están registradas en registros nacionales como the National Institutes of Health (NIH) y se listan en the NIH Human Stem Registry (por ejemplo, Registro de CyT49 N.° 0041). También puede encontrarse información sobre CyT49 y otras líneas celulares disponibles en la web mundial en stemcells.nih.gov/research/registry. Otras líneas celulares más, por ejemplo, BG01 y BG01v, se comercializan y se distribuyen a terceros por WiCell®, una filial del Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bank (Nombre del Catálogo, ^bG01) y ATCC (N.° de Catálogo SCRC-2002), respectivamente. Aunque es posible que otras líneas celulares descritas en el presente documento no estén registradas o distribuidas en un biodepósito tal como WiCell® o la ATCC, tales líneas celulares están disponibles al público directa o indirectamente a través de los investigadores principales, laboratorios y/o instituciones. Las solicitudes públicas de líneas celulares y reactivos, por ejemplo, son habituales para los expertos en la técnica de las ciencias de la vida. Normalmente, la transferencia de estas células o materiales se realiza mediante un acuerdo convencional de transferencia de material entre el propietario de la línea celular o el material y el receptor. Estos tipos de transferencias de material se producen con frecuencia en un entorno de investigación, particularmente en las ciencias de la vida. De hecho, el Solicitante ha transferido células desde el momento en que se derivaron y caracterizaron, incluyendo CyT49 (2006), CyT203 (2005), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) y BG01v (2004) a través de dichos acuerdos con socios y colaboradores comerciales y sin fines de lucro de la industria. La fecha entre paréntesis indica la fecha en que la línea celular o el material estuvo disponible públicamente.

En agosto de 2006, Klimanskaya et al. demostraron que la hESC puede derivar de blastómeros individuales, por tanto, manteniendo el embrión intacto y no provocando su destrucción. Se realizaron biopsias de cada embrión utilizando técnicas de micromanipulación y se obtuvieron diecinueve (19) excrecencias similares a células ES y dos (2) líneas de hESC estables. Estas líneas de hESC pudieron mantenerse en un estado indiferenciado durante más de seis (6) meses y mostraron un cariotipo normal y expresión de marcadores de pluripotencia, incluyendo Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, nanog y fosfatasa alcalina. Estas hESC pueden diferenciar y formar derivados de las tres (3) capas germinales embrionarias tanto in vitro como en forma en teratomas in vivo. Estos métodos para crear nuevas líneas de células madre sin destrucción de embriones abordan las preocupaciones éticas del uso de embriones humanos. Véase Klimanskaya et al. 2006 Nature 444:481-5, Epub 23 de agosto de 2006.

Los presentes estudios usaron determinadas líneas celulares de hES de referencia CyT o BG, sin embargo, posterior a la presentación inicial el 16 de junio de 2006 de la solicitud de prioridad provisional, Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 60/805.039, otros investigadores han publicado informes usando los métodos descritos originalmente o variaciones de los mismos, usando otras líneas de células madre pluripotentes humanas, incluyendo, pero sin limitación, líneas celulares de referencia H7, H9, HUES7, H1, HSF6, chHES-8 (ch= China), chHES-20 y chHES-22, H9, BG01, BG02, HUES4, HUES8, HUES9 y HUES 2; otras líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPS) tales como DiPS-H1 y DiPS-H2 (células iPS específicas de diabetes T1) y otras células iPS descritas en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2010-0272695, titulada CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, presentada el 22 de abril de 2010; y células madre pluripotentes humanas tales como células madre partenogenéticas humanas (hpSC). Véanse, por ejemplo, D’ Amour et al. 2005, Nature Biotechnology 23:1534-1541; Cai et al. 2007, Hepatology, 45:1229-39; King et al. 2008, Regen. Med. 3:175-80; Zhou et al. 2008, Stem Cells & Development 17:737-750; Brunner et al. 2009, Genome Res. 19:1044-1056; Maehr et al. 2009, PNAS 106:15768-15773; Argawal et al. 2008, Stem Cells 26:1117-1127; Bingham et al. 2009, Stem Cells & Devel 18:1-10; Borowiak et al. 2009, Cell Stem Cell 4:348-358; Chen et al. 2009, Nature Chem Biology 5:258:265; Revazova et. al. 2007, Cloning Stem Cells 9:432-449; Turovets et. al. 2011, Differentiation 81:292-8, Epub 8 de febrero de 2011. Por lo tanto, la comunidad de investigadores ha proporcionado abundantes pruebas para establecer que los métodos de la presente invención no se limitan a las células pluripotentes descritas en el presente documento.

Las Tablas 1 y 2 son listas no exhaustivas de determinadas hESC e iPSC de referencia, respectivamente, que están disponibles en todo el mundo para fines de investigación y/o comerciales, y son adecuados para su uso en los métodos y composiciones desvelados en el presente documento. La información en las Tablas 1 y 2 derivó de la bibliografía y las bases de datos disponibles públicamente que incluyen, por ejemplo, the National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry, the Human Embryonic Stem Cell Registry y the International Stem Cell Registry ubicado en the University of Massachusetts Medical School, Worcester, Massachusetts, EE.UU. Estas bases de datos se actualizan periódicamente a medida que las líneas celulares están disponibles y se obtiene el registro.

Tabla 1: Humano de referencia Líneas de células ES

Institución (País) Nombre

EE.UU.

BresaGen, Inc., Athens, Georgia BG01, BG02, BG03; BG04; BG01v

(EE.UU.)

Invitrogen (EE.UU.) BG01v/hOG

CyThera, Inc., San Diego, California CyT49, CyT203, CyT25

(EE.UU.)

Geron Corporation, Menlo Park, GE01, GE07, GE09, GE13, GE14, GE91, GE92 (H1, H7, H9, H13, H14, H9.1, California (EE.UU.) H9.2)

University of California, San UC01, UC06 (HSF-1, HSF-6); UCSFB1, UCSFB2, UCSFB3, UCSFB4, Francisco, California (EE.UU.) UCSFB5, UCSFB6, UCSFB7, UCSFB8, UCSFB9 y UCSFB10

(continuación)

Tabla 1: Humano de referencia Líneas de células ES

Institución (País) Nombre

Wisconsin Alumni Research WA01.WA07, WA09, WA13, WA14(H1, H7, H9, H13, H14) Foundation, Madison, Wisconsin

(EE.UU.)

Children's Hospital Corporation CHB-1, CHB-2 CHB-3 CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-(EE.UU.) 11 y CHB-12

The Rockefeller University (EE.UU.) RUES1, RUES2 y RUES3

Harvard University (EE.UU.) HUES 1, HUES2, HUES3, HUES4, HUES5, HUES6, HUES7, HUES8,

HUES9, HUES10, HUES11, HUES12, HUES13, HUES14, HUES15, HUES16, HUES17, HUES18, HUES19, HUES20, HUES21, HUES22, HUES23, HUES24, HUES25, HUES26, HUES27; HUES28; HUES48; HUES49; HUES53; HUES55 y HUES56

Mt Sinai Hosp-Samuel Lunenfeld CA1 y CA2

Research Institute (EE.UU.)

Children’s Memorial Hospital CM-1, CM-2, CM-5, CM-6, CM-7, CM-8, CM-11, CM-12, CM-13, CM-14, CM-(EE.UU.) 16

The University of Texas Health CR1 y CR2

Science Center at Houston

(EE.UU.)

California Stem Cell, Inc. (EE.UU.) CSC14

University of Connecticut School of CSC14, CT1, CT2, CT3, y CT4

Medicine/Dentistry (EE.UU.)

The Third Affiliated Hospital of FY-3PN; FY-hES-1; FY-hES-3; FY-hES-5; FY-hES-7 y FY-hES-8 Guangzhou Medical College

(EE.UU.)

Advanced Cell Technology, Inc. MA 01; MA 09; MA42; MA 50; MA135; NED 1; NED 2; NED 3 y NED 4 (EE.UU.)

Stanford University (EE.UU.) MFS5

New York University School of NYUES1; NYUES2; NYUES3; NYUES4; NYUES5; NYUES6 y NYUES7 Medicine (EE.UU.)

Reprogenetics, LLC (EE.UU.) RNJ7

University of California, Los Ángeles UCLA1; UCLA2 y UCLA3

(EE.UU.)

Eastern Virginia Medical School ES-76; ES-78-1; ES-78-2

(EE.UU.)

Reproductive Genetics Institute RG-222; RG-230; RG-249; RG-308; RG-313;

(EE.UU.) RG-148; DISTROFIA MIOTÓNICA 1 (DM1), afectado, 46,XY;

RG-153; DISTROFIA MIOTÓNICA 1 (DM1), afectado, 46,XX;

RG-170; DISTROFIA MUSCULAR, TIPO BECKER (BMD), afectado, 46,XY; RG-186; ENFERMEDAD DE HUNTINGTON (HD), afectado, 46,XX;

RG-194; ENFERMEDAD DE HUNTINGTON (HD), afectado, 46,XY;

RG-233; LOCUS DE HEMOGLOBINA BETA (HBB), afectado (HbS/HbS -anemia drepanocítica), 46,XX;

RG-245; DISTROFIA MUSCULAR DE EMERY-DREIFUSS, LIGADA A X (EDMD), portador, 47,XXY;

RG-246; DISTROFIA MUSCULAR DE EMERY-DREIFUSS, LIGADA A X (EDMD), afectado, 46,XY;

RG-271; DISTONÍA DE TORSIÓN 1 (DYT1), AUTOSÓMICO DOMINANTE, afectado (N/GAG del), 46,XY;

RG-283; DISTROFIA MUSCULAR, TIPO DUCHENNE (DMD), afectado, 46,XY;

RG-288; FIBROSIS QUÍSTICA (CF), afectado (deltaF508/deltaF508), 46, XY; RG-289; FIBROSIS QUÍSTICA (CF), afectado (deltaF508/deltaF508), 46,XX; RG-301; DISTROFIA MUSCULAR, TIPO DUCHENNE (DMD) afectado, 46,XY;

RG-302; DISTROFIA MUSCULAR, TIPO DUCHENNE (DMD), portador, 46,XX;

RG-315; NEUROFIBROMATOSIS, TIPO 1 (NF1), afectado (R19 47X/N), (con tinuación)

Tabla 1: ^{H um ano de referencia} Líneas de células ES

Institución (País) Nombre

46 ,XY;

RG -316; ESC LER O SIS TU BER O SA, T IPO 1(TSC1), afectado (N/IVS7+1 G-A);

RG -316; ESC LER O SIS TU BER O SA, T IPO 1(TSC1), afectado (N/IVS7+1 G -A);

RG -320; ESC LER O SIS TU BER O SA, T IPO 1(TSC1), afectado (N/IVS7+1 G -A);

RG -326; S IN D R O M E DE PTERIG IUM PO PLITEO (SPP), afectado (R84H/N), 46 ,XY;

RG -328; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado, 46 ,XY;

RG -330; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado, 46 ,XY;

RG -333; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado, 46 ,XX;

RG -356; LO CUS DE H E M O G LO B IN A A LFA (HBA), a fectado (-a lfa /-) , 46 ,XX; RG -357; D IS TR O FIA M U S C U LA R DE EM ER Y-D R EIFU SS, LIG AD A A X (EDM D), afectado, 46 ,XY;

RG -358; D IS TR O FIA M U S C U LA R DE EM ER Y-D R EIFU SS, LIG AD A A X (EDM D), afectado, 46 ,XY;

RG -399; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado, 46 ,XX;

R G -401 ; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado, 46 ,XX;

RG -402; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado, 46 ,XX;

RG -403; D IS TR O FIA M U S C U LA R FA C IO E S C A P U LO H U M E R A L 1A (FSHD), afectado;

RG -404; A TR O FIA M U S C U LA R ESPINAL, T IPO I (SM A1), afectado, 46 ,XY; RG -406; D IS TO N ÍA DE TO R S IÓ N 1, A U TO S Ó M IC A DO M IN AN TE (DYT1), a fec tado (N /G AG del);

RG -413; C Á N C E R DE MAM A, FAM ILIAR (B R C A 2),a fectado (N /IVS7 G T del) & N E O P LA S IA E N D O C R IN A M ÚLTIPLE, TIPO I (M EN1), a fectado (N /3036 4pb del);

RG -414; N EO P LA S IA E N D O C R IN A M ÚLTIPLE, T IPO I (M EN1), a fectado (N /3036 4pb del);

RG -415; E N FER M ED AD DE H U N TIN G TO N (HD), afectado;

RG -416; F IBR O SIS Q U ÍS T IC A (CF), a fectado (de ltaF508/1717-1 G-A);

RG -417; F IBR O SIS Q U ÍS T IC A (CF), a fectado (de ltaF508/1717-1 G-A);

RG -418; LO CUS DE H E M O G LO B IN A BETA (HBB), a fectado (cd8+G /619del); RG -420; LO CUS DE H E M O G LO B IN A BETA (HBB), a fectado (cd8+G /619del); RG -422; F IBR O SIS Q U ÍS T IC A (CF), a fectado (N 1303K/de ltaF508); RG -423; F IB R O S IS Q U ÍS TIC A (CF), portador (N /deltaF508);

RG -424; N EO P LA S IA E N D O C R IN A M ÚLTIPLE, T IPO 2 (M EN2B), afectado (M 918T/N );

RG -426; E N FER M ED AD DE P E LIZA E U S -M E R ZB A C H E R (PM LD), afectado; RG -428; ESC LER O SIS TU BER O SA, T IPO 1 (TSC1), a fectado (N /IVS7+1 G-______________________________________ A)____________________________________________________________________________ S udam érica

Instituto de B iociéncias, Sao Paulo BR-1

(B rasil)

O rien te M edio

Techn ion-ls rae l Institute o f TE03, TE04, TE 06 (I 3, I 4, I 6)

Technology, Haifa (Israel)

H adassah U n iversity Hospita l HAD 1; HAD 2; HAD 3; HAD 4; HAD 5; HAD 6

(Israel)

H ebrew U niversity o f Jerusalem HEFX1

Techn ion - Israel Institute o f 13; 13,2; 13,3; 14; 16; 16,2; J3; J3.2

Techno logy

(continuación)

Tabla 1: ^{Hum ano de referencia} Líneas de células ES

Institución (País) Nombre

Royan Institute (Irán) ARMD.1 H.iPSC.2; BOM .1.H .ÍPSC.1; CNS.1.H .ÍPSC.10; CNS.2.H .ÍPSC.7;

FHC.1 .H.iPSC.3; G SD.1.H .ÍPSC.7; HER.1.H .ÍPSC.1; LCA.1.H.ÍPSC.1; LHON.1.H .ÍPSC.5; R.1 .H .iPSC.1; R.1 .H.iPSC.4; R.1 .H.iPSC.9; Royan Hl; Royan H10; Royan H2; Royan H3; Royan H4; Royan H5; Royan H6; Royan H7; Royan H8; Royan H9; RP.1 .H.iPSC.2; RP2.H .iPSC.3; TYR.1.H .iPSC .1; USH .1.H .ÍPSC .6

Europa

Cellartis AB, G otenberg (Suecia) S A 001, SA002 (Sahlgrenska 1, Sahlgrenska 2); SA002.2; SA003; AS034.1;

A S 034.1.1; AS034.2; AS038; AS046; FC018; ASo85; AS094; SA111; SA121; SA142; SA167; SA181; SA191; SA196; SA202; SA203; SA211; SA218; SA240; SA279; SA348; SA352; SA399; SA461; SA502; SA506; SA521; SA540; SA611

Karolinska Institutet (Suecia) HS181; HS207; HS235; HS237; HS293; HS306; HS346; HS351; HS356;

HS360; HS361; HS362; HS363; HS364; HS366; HS368; HD380; HS382; HS400; HS401; HS402; HS415; HS420; HS422; HS426; HS429; HS429A; HS429B; HS429C; HS429D; HS475; HS480; HS481; HS539

G óteborg University, G oteborg SA04-SA19 (Sahlgrenska 4-Sahlgrenska 19)

(Suecia)

Karolinska Institute, Estocolm o KA08, KA09, KA40, KA41, KA42, KA43 (hlCM 8, hlCM 9, hlCM 40, hlCM41, (Suiza) hlCM 42, hlCM 43)

Geneva University (Suiza) CH-ES1

University of Basel (Suiza) CH-ES3; CH-ES3; CH-ES5

Roslin Cells Ltd (RU) RC2; RC3; RC4; RC5

University of Newcastle upon Tyne NCL-1; NCL-2; NCL-3; NCL-4; NCL-5; NCL-6; NCL-7; NCL-8; NCL-9 (RU)

Roslin Institute (Edim burgo) & R H 1; RH2; RH3; RH4; RH5; RH6; RH7; RH9;

Geron Corporation (RU)

University of M anchester (RU) Man 2

K ing’s College London (RU) KCL-001 (anteriorm ente W T3)

The University of Sheffield, S H E F -1 ; SHEF-2; SHEF-3; SHEF-4; SHEF-5; SHEF-6; SHEF-7; SHEF-8 Sheffie ld (RU)

Universities of Edinburgh & Oxford; E d i-1 ; Edi-2; Edi-3; Edi-4

University of Cam bridge (RU)

Roslin Cells Ltd, Roslin Institute, RCM-1; RC-1; RC-2; RC-3; RC-4; RC-5; RC-6; RC-7; RC-8; RC-9; RC-10 Universities of Edinburgh &

Manchester, Central M anchester &

M anchester C h ild ren ’s U niversity

Hospita ls NHS Trust (RU)

K ing’s College London & G uy ’s KCL-003-CF1 (anteriorm ente CF1); KCL-005-HD1; KCL008-HD-2; KCL009-^{Hospital Trust} / ^Charitable trans-1; KCL-001 (W T-3); KCL-001 (W T-4)

Foundation of G uy’s & St Thom as

(RU)

Stem Cell Sciences Ltd, Austra lia M EL-1; MEL-2; MEL-3; MEL-4

(SCS) & Austra lian Stem Cell

Centre (ASCC)

University of Edinburgh (RU) CB660

A xord ia Ltd. (RU) ^{S he f-1} ; ^{Shef-2; Shef-3; Shef-4; Shef-5; Shef-6; Shef-7}

University of Nottingham (RU) Nott-1; Nott-2

Centre of R egenerative M edicine in ES-2; ES-3; ES-4; ES-5; ES-6; ES-7; ES-8; ES-9; ES-10; ES-11EM; cFA404-Barcelona (España) KÍPS4F-1; CFA404-KÍPS4F-3; KÍPS3F-7; KÍPS4F-1; KÍPS4F-8

Centro de Investigación Príncipe VAL-3; VAL-4; VAL-5; VAL-6M ; VAL-7; VAL-8; VAL-9; VAL-10B

Felipe (España)

Universite Libre de Bruxelles ERA-1; ERA2; ERA-3; ERAM UC-1; ERAMUC-1

(Bélgica)

^{V rije Universite it Brussel (Bélgica) V U B 01} ; ^{VUB02; VUB06; VUB07; V U B 03_D M 1; VUB04_CF;}

(continuación)

Tabla 1: ^{Humano de referencia} Líneas de células ES

Institución (País) Nombre

VUB05 HD; VUB08 MFS; VUB09 FSHD; VUB10 SCA7;

VUB11 FXS; VUB13 FXS; VUB14; VUB19 D M 1 ;V U B 20 CMT1A;

^{VUB22_CF; VUB23_OI; V U B 24_D M 1} ; ^{VUB26; VUB27; VU B28_HD_M FS} Central M anchester y M anchester ^{Man 1} ; ^{Man 2}

Children 's University Hospita ls NHS

(RU)

Université Paris-Sud 11 (Francia) C L01; CL02; CL03; PB04; PB05; PB05-1; PB06; PB06-1; PB07; PB08; PB09;

PB10

INSERM (Francia) OSCAR; STR-I-155-HD; STR-I-171-GLA; STR-l-189-FRAXA; STR-l-203-CFTR; STR-l-209-M EN2a; STR-l-211 -M EN2a; STR-I-221-Sca2; STR-l-229-MTMX; STR-I-231-M TM X; STR-l-233 -FRAXA; STR-I-251-CFTR; STR-l-301-MFS; STR-I-305-APC; STR-l-315-C M T1a; STR-I-347-FRAXA; STR-l-355-

APC; STR-I-359-APC

M asaryk University (República

_Checa) CCTL 6; CCTL 8; CCTL 9; CCTL 10; CCTL 12; CCTL 13; CCRL 14 Aalborg University (D inam arca) C LS 1; CLS2; CLS3; CLS4

University of Copenhagen LR B001; LRB002; LRB003; LRB004; LRB005; LRB006; LRB007; LRB008; (D inam arca) LRB009; LRB010; LRB011; LRB013; LRB014; LRB016; LRB017; LRB018; University of Southern Denm ark KMEB1; KMEB2; KMEB3; KMEB4; KMEB

University of Helsinki (F inlandia) FES21; FES22; FES29; FES30; FES61; FES75

University of Tam pere (F inlandia) Regea 06/015; Regea 06/040; Regea 07/027; Regea 07/046; Regea 08/013;

Regea 08/017; Regea 08/023; Regea 08/056

Leiden University Medical Center HESC-NL1; HESC-NL2; HESC-NL3; HESC-NL4

(Países Bajos)

Russian Academ y of Sciences ESM01; ESM02; ESM03;

(Rusia)

Instanbul Memorial Hospital MINE: NS-2; NS-3; NS-4; NS-5; NS-6; NS-7; NS-8; NS-9; NS-10; OZ-1; OZ-2; (Turquía) OZ-3; OZ-4; OZ-5; OZ-6; OZ-7; OZ-8

Austra lia

Monash University (Australia) Envy

Prince of W ales Hospital, Sydney E 1C 1; E1C2; E1C3; E1C4; Endeavour 1; Endeavour 2; hES3.1; hES3.2; (Australia) hES3.3

Sydney IVF Lim ited (Australia) SIVF01; SIVF03; SIVF05; SIVF06; SIVF07; SIVF08; SIVF09; SIVF10; SIVF11;

SIVF 12; SIVF13

Asia

Kyoto University (Japón) 201B1; 201B2; 201B3; 201B6; 201B7; 243H1; 243H7; 246G1; 246G3; 246G4;

246G5; 246G6; khES-1; khES-2; khES-3;

Stem Cell Consortium de S ingapur ESI-013; ESI-014; ESI-017; ESI-027; ESI-035; ESI-049; ESI-051; ESI-053 ES Cell International Pte Ld ES01, ES02, ES03, ES04, ES05, ES06 (HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-(S ingapur) 5, HES-6

Maria Biotech Co. Ltd. - Maria

Infertility Hospital Medical Institute,

Seúl (Corea) MB01, MB02, MB03; MB04; MB05; MB06; MB07; MB08; MB09

M izMedi Hospital - Seoul National MI01 (M iz-hES1); M iz-hES2; M iz-hES3; M iz-hES4; M iz-hES5; M iz-hES6; M iz-University, Seúl (Corea) hES7; M iz-hES8; M iz-hES9; M iz-hES10; M iz-hES11; M iz-hES12; M iz-hES13;

M iz-hES14; M iz-hES15;

Pochon CH A University College of CHA-hES3; CHA-hES4

M edicine (Corea)

Seoul National University (Corea) S N U hE S I; SNUhES2; SNUhES3; SNUhES4; S N U hE S U ; SNUhES16 National Centre fo r Biological N C 01, NC02, NC03 (FCNCBS1, FCNCBS2, FCNCBS3); BJN-hem19; BJN-Sciences/Tata Institute of hem20

Fundam ental Research, Bangalore

(India)

Reliance Life Sciences, Mumbai RL05, RL07, RL10, RL13, RL15, RL20, RL21 (RLS ES 05, RLS ES 07, (India) RLSES 10

(continuación)

Tabla 1: ^{Hum ano de referencia} Líneas de células ES

Institución (País) Nombre

National Institute fo r Research in KIND-1; KIND-2

R eproductive Health (India)

Tata Institute of Fundam ental FCNCBS1; FCNCBS2; FCNCBS3

Research (India)

Kaohsiung M edical University T 1 ; T2; T3; T4; T5

(Taiw an)

Central South University (China) chES C -3 (H3); chE S C -8;chESC -20; chESC-22; EBNA1+H 9

G radúate University o f Chínese hP E S -1 ; hPES-2

A cadem y of S ciences (China)

H uazhong U niversity o f Science hES-8; hES18

and Technology (China)

Peking U niversity Third Hospital B4; B7; PKU1; PKU2

(China)

Shanghai J iao Tong U niversity S H hE S I

School of M edicine (China)

Shanghei Second M edical SH1; SH2; SH4; SH7; SH28; SH35; SH35a; SH38; SH39; SH42

U n iversity (China)

Sun Yat-sen University (China) C H E S -1 ; SYSU-1; SYSU-2

Sun Yat-sen University Second CHE-1; CHE-2; CHE-3

A ffilia ted Hospital (China)

The Third A ffilia ted Hospita l of FY-hES-5; FY-hES-9; FY-hES-10; FY-hES-11

G uangzhou M edical College

(China)

Tabla 2: Listado de líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPS)____________________ Institución Línea celular

^{U n ivers ity o f W isconsin - M ad ison 1. IP S (P R E P U C IO )-1 (Norm al; 46XY; Yu, J.,} et al. ^{[Thom son]2007,} Science. (E E .U U .) 2007 318:1917-20.)

^{2. IP S (P R E P U C IO )-2 (Norm al; 46XY; Yu, J.,} et al. ^{c itado anterio rm ente). 3. IP S (P R E P U C IO )-3 (Norm al; 46 X Y Yu, J} .et al. ^{citado an terio rm ente). 4. IP S (P R E P U C IO )-4 (Norm al; 46XY; Yu, J} .et al. ^{citado an terio rm ente). 5. IPS(IM R 90)-1 (N orm al; 46XX; Yu, J} .et al. ^{citado an terio rm ente).}

^{6. IP S (IM R 90)-2 (N orm al; 46XX; Yu, J} .et al. ^{citado an terio rm ente).}

^{7. IP S (IM R 90)-3 (N orm al; 46XX; Yu, J} .et al. ^{citado an terio rm ente).}

^{8. IP S (IM R 90)-4 (N orm al; 46XX; Yu, J} .et al. ^{citado an terio rm ente).}

^{9. IP S -S M A -3.5 (N orm al; 46XY; A tro fia m uscu la r esp inal t ipo 1; Ebert} et al.

^2009, Nature. ^457:277-80)

^{10. IP S -S M A -3.6 (N orm al; 46XY; A tro fia m uscu la r esp inal tipo 1; Ebert} et al.

2009, c itado an te rio rm ente)

^{11. IP S -W T (Norm al; 46XX; A tro fia m uscu la r esp ina l t ipo 1; E bert} et al. ^2009, c itado an te rio rm ente)

^{U n ivers ity o f Ca liforn ia , Los 1. IPS-1 (K arum bayaram , S.} et al. ^{2009, S tem Cells 27 :806-811; Lowry,} et ^{Á nge les (E E .U U .)} al. ^2008, Proc Nati Acad Sel ^{EE.UU. 105:2883-8)}

^{2. IPS-2 (K arum bayaram ,} et al. ^{2009, c itado an terio rm ente, Low ry} et al. 2008, c itado an te rio rm ente)

^{3. IPS-5 (Low ry} et al. ^{2008, c itado an te rio rm ente)}

4. ^{IPS-7 (Low ry} et al. ^{2008, c itado an te rio rm ente)}

^{5. IPS-18 (K arum bayaram} et al. ^{2009, c itado an terio rm ente, Low ry} et al. 2008, c itado an te rio rm ente)

^{6. IPS-24 (Low ry} et al. ^{2008, c itado an te rio rm ente)}

^{7. IPS-29 (Low ry} et al. ^{2008, c itado an te rio rm ente)}

(con tinuación)

Tabla 2: Listado de líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPS)

Institución Línea celular

^{Mt. S inai Hospita l (Sam uel 1. (W oltjen} et al. 2009, Nature. ^458:766-70)

^{Lunenfe ld Research Institute; 2. 61 (W oltjen} et al. ^{2009, c itado an terio rm ente)}

^{EE.UU.) 3. 66 (W oltjen} et al. 2009, ^{citado an terio rm ente)}

^{4. 67 (W oltjen} etal. 2009, ^{citado an terio rm ente)}

^{5. H IP S C 117 (Kaji} et a!. 2009, Nature ^458:111-5)

^{6. HIPSC121 (Kaji} etal. ^{2009, c itado an terio rm ente)}

^{7. H IPSC 122 (Kaji} et al. ^{2009, c itado an terio rm ente)}

^{C h ild ren ’s Hospita l -B oston 1. 551-IPS8 (Park} et al. ^{2008, Nature 451:141-6).}

(EE .U U .) 2. A D A -IP S 2 ((A D A -S C ID ) Inm unodefic iencia com binada grave relacionada con la de fic iencia de adenosina desam inasa (G G G >AG G , exón 7, gen ADA); ^Park et al. ^2008, Stem Cells Cell ^134:877-86)

3. A D A -IP S 3 ((A D A -S C ID ) Inm unodefic iencia com binada grave relacionada con la de fic iencia de adenosina desam inasa (G G G >AG G , exón 7, gen ADA); ^{(P ark} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

^{4. BJ1-IPS1 (P ark} etal. ^{2008, c itado anteriorm ente)}

5. BMD-IPS1 (hom bre; (BM D) D istro fia m uscu la r de B ecker (m utación no ^{iden tificada en la d istrofina); (Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)} 6. BM D -IPS4 (Norm al; 46XY; (BM D) D istrofia m uscu la r de Becker (m utación no identificada en la distrofina);

^{(P ark} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

^{7. DH1CF16-IPS1 (Norm al; 46XY; (Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente) 8. D H 1C F32-IP S2 (hom bre; Park} etal. ^{2008, c itado an terio rm ente) 9. D H IF-IPS3-3(N orm al; 46XY; Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)} 10. DMD-IPS1 ((Normal; 46XY; DMD) D istrofia m uscu la r de D uchenne ^{(e lim inación del exón 45-52, gen de la distrofina; Park} et al. ^{2008, citado} an terio rm ente)

11. DM D -IPS2 (hombre; (D M D ) D istrofia m uscu la r de D uchenne (elim inación ^{del exón 45-52, gen de la distrofina; (Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente) 12. DS1-IPS4 (hom bre; S índrom e de Down (T risom ía 21); Park} etal. ^2008, c itado an terio rm ente)

^{13. DS2-IPS1 (hom bre; S índrom e de Down (T risom ía 21); (Park} etal. ^2008, c itado an terio rm ente)

^{14. DS2-IPS10 (hom bre; S índrom e de Down (T risom ía 21); Park} et al. ^2008, c itado an terio rm ente)

^{15. G D-IPSI (Hom bre; (GD) Enferm edad de G aucher tipo III (AAC >} AGC, ^{exón 9, Inserción G, nucleótido 84 del ADNc, gen GBA; Park} et al. ^2008, c itado an terio rm ente)

16. G D -IP S 3 (hom bre; (G D) Enferm edad de G aucher tipo III (AAC > AGC, ^{exón 9, Inserción G, nucleótido 84 del ADNc, gen GBA; Park} et al. ^2008, c itado an terio rm ente)

^{17. HFIB2-IPS2 (Park, I. H.,} et al. ^{2008. G eneration o f hum an-induced p luripoten t stem cells Nat Protoc. 3:1180-6; Park} et al. ^{2008, c itado} an terio rm ente)

^{18. HFIB2-IPS4 (Park, I. H.,} et al. ^{2008. G eneration o f hum an-induced p luripoten t stem cells Nat Protoc. 3:1180-6; Park} et al. ^{2008, c itado} an terio rm ente)

^{19. HFIB2-IPS5 (Park, I. H.,} et al. ^{2008. G eneration o f hum an-induced p luripoten t stem cells Nat Protoc. 3:1180-6; Park} et al. ^{2008, c itado} an terio rm ente)

20. JDM -IPS1 (Norm al, 46XX; D iabetes m ellitus juven il (m ultifactoria l); Park et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

21. JDM -IPS1 (Norm al, 46XX; D iabetes m ellitus juven il (m ultifactoria l); Park et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

^{22. JD M -IP S 2 (M ujer; D iabetes m ellitus juven il (m ultifactoria l); Park} et al. 2008, c itado an terio rm ente)

^{23. JD M -IP S 3 (M ujer; D iabetes m ellitus juven il (m ultifactoria l); Park} et al. 2008, c itado an terio rm ente)

24. LN SC -IPS2 (Mujer; S índrom e de Lesch-N yhan (portador,

^{heteroc igosidad de H P R T 1; Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente) 25. M R C 5-IP S 7 (hom bre; Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

^{26. M R C 5-IPS12 (Norm al; 46XY; Park} et al. ^{2008, c itado anterio rm ente)} (con tinuación)

Tabla 2: Listado de líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPS)

Institución Línea celular

^{27. M RC 5-IPS1 (hom bre; Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

^{28. PD-IPS1 (hom bre; E nfe rm edad de Parkinson (m ultifacto ria l); Park} et al.

2008, c itado an terio rm ente)

29. SBDS-IPS1 (hom bre; S índ rom e de S w achm an-B od ian-D iam ond (IV2 ^{2T>C y IV3 - 1G>A, gen SBDS; Park} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)} 30. SBD S -IP S 2

31. S B D S -IP S 3 (Norm al; 46XY; S índrom e de S w achm an-B od ian-D iam ond ^{(IV2 2T>C y IV3 - 1G>A, gen SBDS; Park} et al. ^{2008, c itado}

an terio rm ente)

Harvard U n ivers ity (E E .U U .) 1. A29a (46XX; (ALS) Escle ros is la teral am iotró fica (a le lo dom inante L144F [Leu l44 > Phe] del gen de la superóx ido d ism utasa (SO D1); Caucásico; ^{D im os} etal. ^2008, Science ^321:1218-21)

2. A29b (46XX; (ALS) Escle ros is la teral am iotró fica (a le lo dom inante L144F [Leu l44 > Phe] del gen de la superóx ido d ism utasa (SO D1); Caucásico; ^{D im os, J. T.,} et al. ^{2008, c itado anterio rm ente)}

3. A 29c (46XX; (ALS) E sclerosis la teral am iotró fica (a le lo dom inante L144F [Leu l44 > Phe] del gen de la superóx ido d ism utasa (SO D1); Caucásico; ^{D im os, J. T .e f} al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

^{S alk Institu te (EE .U U .) 1. HAIR-IPS1 (Aasen,} et al. ^{[Belm onte, J. C.] 2008,} Nat Biotechnol. ^26:1276-84)

^{2. H A IR -IPS2 (Aasen, T.,} et al. ^{2008, c itado an terio rm ente)}

Royan Institu te (Irán) 1. R.1.H.ÍPSC.1 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos)

2. BO M .1.H .ÍPSC . 1 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 3. FH C .1.H .ÍPSC .3 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 4. GSD.1 .H .iPSC .7 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 5. TYR. 1.H.ÍPSC.1 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 6. HER. 1.H.ÍPSC.1 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibrob lastos hum anos) 7. R .1.H .ÍPSC.4 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 8. R .1.H .ÍPSC.9 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 9. RP2.H .ÍPSC .3 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; cé lu las iPS)

10. LC A.1.H .ÍPSC.1 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; cé lu las iPS)

11. U S H .1.H .ÍPSC .6 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 12. RP.1.H .ÍPSC.2 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 13. A R M D .1.H .ÍP S C .2 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; F ibroblastos hum anos) 14. LH O N .1.H .ÍP S C .5 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; cé lu las iPS)

15. C N S .1.H .ÍP S C .10 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; cé lu las iPS)

16. C N S .2.H .iP S C .7 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; cé lu las iPS)

C entre o f R egenera tive M ed ic ine in 1. KÍPS4F-1 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; quera tinoc itos de prepucio hum ano; B arce lona (España) 46X Y )

2. K ÍPS3F-7 (OCT4, Sox2, KLF4); quera tinoc itos de prepucio hum ano) 3. K ÍPS4F-8 (OCT4, Sox2, KLF4, c -M yc quera tinocitos de prepucio hum ano; 46X Y )

4. cFA 404-K iP S 4F-1 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; Q uera tinocitos ep idérm icos; 46XY)

5. cF A 404-K iP S 4F-3 (OCT4, Sox2, KLF4, c-M yc; Q uera tinocitos ep idérm icos; 46XY)

U n ivers ité Paris-Sud 11 (Francia) 1. PB03 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; A m niocitos prim arios; 46XX; Lentiv irus)

2. PB04 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; A m niocitos prim arios; a fectado por B eta -ta lasem ia; 46XY; Lentiv irus)

3. PB05-1 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; A m nioc itos prim arios; a fec tado por B eta -ta lasem ia; 46XY; Lentiv irus)

4. PB05 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; A m niocitos prim arios; a fectado por B eta -ta lasem ia; 46XY; Lentiv irus)

5. PB06 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; A m niocitos prim arios; S índ rom e de Down; 47XY, 21; Lentiv irus)

6. PB06-1 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; A m nioc itos prim arios; S índ rom e de Down; 47XY, 21; Lentiv irus)

7. PB07 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; A m niocitos prim arios; 46XY;

R etro tiv irus)

8. PB08 (O CT4, Sox2, KLF4, c-M yc; A m niocitos prim arios; 46XY; (continuación)

Tabla 2: Listado de líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPS)

Institución Línea celular

Retrotivirus)

9. PB09 (Oct4, Sox2, Lin28, Nanog; Am niocitos primarios; 46XY; Lentivirus) 10. PB10 (Oct4, Sox2; A m niocitos prim arios 46XY, Lentivirus)

Kyoto University (Japón) 1.201 B1 (fibroblasto humano; 46XX)

2. 201B2 (fibroblasto humano; 46XX)

3. 201B3 (fibroblasto humano; 46XX)

4. 201B6 (fibroblasto humano; 46XX)

5. 201B7 (fibroblasto humano; 46XX)

6. 243H1 (fibroblasto humano)

7. 243H7 (fibroblasto humano)

8. 246B1 (Normal, 46XX)

9. 246B2 (Normal, 46XX)

10. 246B3 (Normal, 46XX)

11.246B4 (Normal, 46XX)

12. 246B5 (Normal, 46XX)

13. 246B6 (Normal, 46XX)

^{14. 246G1 (fibroblasto humano; Takahashi} et al. 2007, Cell ^{131:861-72) 15. 246G 3 (fibroblasto humano; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente) 16. 246G 4 (fibroblasto humano; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente) 17. 246G 5 (fibroblasto humano; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente) 18. 246G 6 (fibroblasto humano; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente) 19. 253F1 (Normal, 46XX; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente)}

^{20. 253F2 (Normal, 46XX; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente)}

^{21 .253F3 (Normal, 46XX; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente)}

^{22. 253F4 (Normal, 46XX; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente)}

^{23. 253F5 (Normal, 46XX; Takahashi} et al. ^{2007, citado anteriorm ente) Shanghai Institutes for Biological 1. HAFDC-IPS-6 (Li} et al. ^2009, Hum Mol Genet. ^{2009 18:4340-9)}

^{Sciences (China) 2. IPS-S (Liao} et al. ^2008, Cell Res. ^18:600-3)

Con respecto a las iPSC (células madre pluripotentes inducidas), el Solicitante ha descrito anteriormente en detalle la diferenciación en suspensión de agregados celulares en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 12/765.714 (Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2010-0272695), titulada CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, presentada el 22 de abril de 2010. La agregación de iPSC humana se describe con más detalle en el Ejemplo de Referencia 26. En la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2010-0272695 y en el Ejemplo de Referencia 26 del presente documento, se describe la inclusión de al menos una Rho cinasa o un inhibidor de ROCK en el medio de cultivo celular para mejorar, aumentar y/o promover el crecimiento, la supervivencia, la proliferación y la adhesión célula-célula de las células. Por ejemplo, cuando se emplea Y-27632, la concentración puede variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 pM, normalmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 pM y frecuentemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 50 pM y lo más a menudo de aproximadamente 5 a 20 pM. Cuando se usa Fasudil/HA1077, puede usarse en aproximadamente dos o tres veces la concentración de Y-27632 anteriormente mencionada. Cuando se usa H-1152, puede usarse a aproximadamente una fracción, por ejemplo, aproximadamente 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 o 1/60, de la cantidad de la concentración de Y-27632 anteriormente mencionada. La concentración de inhibidor de ROCK usada dependerá, en parte, de la bioactividad y fuerza del inhibidor y las condiciones en las que se usa. Además, el momento o la fase para el tratamiento con el inhibidor de ROCK no está particularmente limitado, siempre que se logren los efectos deseados tales como la mejora, el aumento y/o la promoción del crecimiento, la supervivencia, la proliferación y la adhesión célula-célula de las células.

Los agregados celulares descritos en el presente documento pueden suspenderse en cualquier medio fisiológicamente aceptable, normalmente elegido de acuerdo con el tipo o tipos de células implicadas. Los medios de cultivo tisular pueden comprender, por ejemplo, nutrientes básicos tales como azúcares y aminoácidos, factores de crecimiento, antibióticos (para minimizar la contaminación) y similares. De manera alternativa, las células diferenciables pueden cultivarse en suspensión, usando los medios celulares descritos en el presente documento. El término "suspensión" como se usa en el contexto del cultivo celular se usa tal como está en la técnica. Concretamente, las suspensiones de cultivo celular son ambientes de cultivo celular donde las células o agregados celulares no se adhieren a una superficie. Un experto en la materia estará familiarizado con las técnicas de cultivo en suspensión, incluyendo, pero sin limitación, el uso de equipos tales como campanas de flujo, incubadoras y/o equipos usados para mantener las células en constante movimiento, por ejemplo, plataformas giratorias, agitadores, etc., si fuera necesario. Como se usa en el presente documento, las células están "en movimiento" si se están moviendo, o si su entorno inmediato se está moviendo en relación con las células. Si las células se mantienen "en movimiento", el movimiento será, en una realización, un "movimiento suave" o una "agitación suave" que se diseña para impedir o prevenir la exposición de las células a la tensión de cizalla.

Se conocen en la técnica una diversidad de métodos para producir agregados celulares, tales como, por ejemplo, el método de "gota colgante" en donde las células en una gota invertida de medio de cultivo tisular se hunden hasta el fondo de la gota donde se agregan; agitación de suspensiones celulares en un matraz de laboratorio; y diversas modificaciones de estas técnicas. Véanse, por ejemplo, Timmins et al. 2004, Angiogenesis 7:97-103; Dai et al. 1996, Biotech Bioeng 50:349-56; Foty et al. 1996, Development 122:1611-20; Forgacs et al. 2001,.J. Biophys. 74, 2227­ 2234; Furukawa et al. 1998, Cell Transplantation 10:441-45; Glicklis et al. 2004. Biotech Bioeng 86:672-80; Carpenedo et al. 2007, Stem Cells 25:2224-34; y Korff et al. 2001, FASEB J. 15:447-57. Más recientemente, se han formado agregados de células raspando colonias con micropatrones en suspensión, centrifugando colonias de las placas de microtitulación y poniendo en suspensión o usando pipetas para desalojar y suspender las colonias que crecen en micropocillos con patrón (Ungrin et al. 2008 PLoS ONE 3:1-12; Bauwens et al, 2008 Stem Cells, Publicado en línea el 26 de junio de 2008). Aunque tales métodos pueden usarse para producir agregados celulares descritos en el presente documento, los agregados celulares producidos en el presente documento están optimizados para la diferenciación dirigida síncrona como se describe en D'Amour et al. 2006, citado anteriormente, Además, a diferencia de estos otros métodos, los métodos para producir los agregados celulares en suspensión descritos en el presente documento son susceptibles de fabricación a gran escala.

En general, las composiciones de medio celular desveladas en el presente documento pueden actualizarse al menos una vez al día, pero el medio puede cambiarse con mayor o menor frecuencia, dependiendo de las necesidades y circunstancias específicas del cultivo en suspensión. Las células in vitro habitualmente se cultivan en medios de cultivo en un modo discontinuo (es decir, se suministran por lotes) y se exponen a diversas condiciones del medio. Como se describe en el presente documento, las células existen en un cultivo en placa como cultivos adherentes o como agregados celulares en suspensión, y se mantienen en contacto con un medio de cultivo circundante; y el medio de desecho se reemplaza periódicamente. En general, el medio de cultivo puede renovarse cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas o cualquier fracción de las mismas. En ejemplos adicionales, el medio puede renovarse con menos frecuencia tal como, pero sin limitación, cada 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o cada 2 o más días, o en cualquier período de tiempo intermedio.

Pueden emplearse métodos de perfusión para prevenir la degradación de los factores de crecimiento y otros agentes que deben reemplazarse con frecuencia; o perfusión como un medio para agotar los productos de desecho de los medios de cultivo durante un período de tiempo. Por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.320.963 describe un biorreactor para cultivo de perfusión de células en suspensión. La Pat. de EE.UU. N.° 5.605.822 describe un sistema de biorreactor, que emplea células estromales para proporcionar factores de crecimiento, para el crecimiento de células HSC en cultivo por perfusión. La Pat. de EE.UU. N.° 5.646.043 describe el crecimiento de células HSC mediante perfusión continua y periódica que incluye composiciones de medios para el crecimiento de células HSC. La Pat. de EE.UU. N.° 5.155.035 describe un biorreactor para cultivo en suspensión de células mediante rotación de medios fluidos. T

En general, las células que se cultivan en suspensión en las composiciones de medio desveladas en el presente documento pueden "separarse" o "pasarse" cada semana aproximadamente, pero las células pueden separarse con mayor o menor frecuencia, dependiendo de las necesidades y circunstancias específicas del cultivo en suspensión. Por ejemplo, las células pueden separarse cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más días, o en cualquier período de tiempo intermedio. Como se usa en el presente documento, el término "separado" o "pasado" como se usa en el contexto del cultivo celular se usa tal como está en la técnica. Concretamente, la separación del cultivo celular, o la realización de pases, es la extracción de células de un cultivo anterior y la posterior transferencia de una menor cantidad de células extraídas (obtenidas) a un nuevo recipiente de cultivo celular. En general, el pase de células permite que las células continúen creciendo en un entorno de cultivo celular saludable. Un experto en la materia estará familiarizado con el proceso y los métodos de realización de pases de cultivos celulares, que pueden, pero no necesariamente, implicar el uso de métodos enzimáticos o no enzimáticos que pueden usarse para desagregar las células que se han agrupado durante su expansión de crecimiento.

En algunos casos, puede producirse un grado de muerte celular en las células cultivadas (suspendidas y adherentes) inmediatamente después del pase. Las células diferenciables pueden "recuperarse" de los pases, retrasando la renovación del medio celular durante más de 24 horas. En lo sucesivo, el medio celular puede cambiarse más frecuentemente. De manera alternativa, el medio de cultivo celular puede comprender además un inhibidor de la muerte celular. Por ejemplo, Wantanabe et al. desvelaron recientemente el uso de un inhibidor asociado de la Rho cinasa, Y27632, para proteger a las células ES humanas después de la disociación. Véase Wantanabe et al. Nat. Biotechnol., 25:681-686 2007. De manera alternativa, el medio de cultivo celular puede comprender inhibidores de caspasa, factores de crecimiento u otros factores tróficos para prevenir o atenuar la muerte celular inmediatamente después del pase. Los ejemplos específicos de compuestos que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, HA 1077, Diclorhidrato, Hidroxifasudilo, Inhibidor de Rho cinasa, Inhibidor de Rho cinasa II, Inhibidor de Rho cinasa III, Inhibidor de cinasa IV e Y27632, todos los cuales están disponibles en el mercado. Los compuestos o factores usados para prevenir o atenuar la muerte celular durante o inmediatamente después del pase de células pueden retirarse del medio de cultivo celular después de que las células se hayan recuperado del proceso de pases. De manera alternativa, las células ES indiferenciadas pueden añadirse eficazmente a un medio base convencional y pueden no requerir Y27632 u otras intervenciones para mantener la viabilidad durante la disociación y agregación.

Las composiciones y métodos también pueden comprender la presencia o el uso de tensioactivos. Las composiciones y métodos pueden comprender al menos un tensioactivo en el contexto de un cultivo en suspensión. Los tensioactivos son bien conocidos en la técnica y, en términos generales, son de naturaleza anfífila. Las composiciones y métodos pueden comprender el uso de al menos un tensioactivo que sea cualquiera de aniónico, catiónico, no iónico o zwitteriónico. La concentración del tensioactivo usado en las composiciones y métodos es una cuestión de selección y optimización de rutina. Por ejemplo, Owen et al. informaron del uso de tensioactivos en técnicas de cultivo celular para células HeLa y células amnióticas humanas. Véase Owen et al. J. Cell. Sci., 32:363-376 (1978). Los ejemplos de tensioactivos que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, Dodecil sulfato sódico (SDS), lauril sulfato de amonio y otras sales de alquil sulfato, Lauret sulfato sódico (SLES), Alquilbencenosulfonato, Jabones o sales de ácidos grasos, Bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) (bromuro de hexadecil trimetil amonio) y otras sales de alquiltrimetilamonio, Cloruro de cetilpiridinio (CPC), Sebo amina polietoxilada (POEA), Cloruro de benzalconio (BAC), Cloruro de bencetonio (BZT), Dodecil betaína, Óxido de odecil dimetilamina, Cocamidopropil betaína, Cocoanfoglicinato, Alquil poli(óxido de etileno), Copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de propileno) tales como Pluronic F68, Alquil poliglucósidos, tales como, pero sin limitación, Octil glucósido, Decil maltósido, Alcoholes grasos, Alcohol cetílico, Alcohol oleílico, Cocamida MEA, cocamida DEA y cocamida TEA y/o Monolaurato de polioxietilen-sorbitano (Tween)

Las realizaciones descritas en el presente documento proporcionan métodos para la fabricación a gran escala de hESC proliferantes y/o diferenciadas manteniendo un entorno de baja cizalla manteniendo de esta manera la densidad de células operativas en el sistema y minimizando las tensiones de cizalla del fluido. En particular, en el presente documento se desvelan métodos para mantener un entorno de baja cizalla en un sistema de fabricación escalado de células eucariotas cultivando una suspensión celular en una placa de 60 mm, placa de 6 pocillos, una frasco rodante, un biorreactor (por ejemplo, matraces giratorios), un recipiente y similares. De manera alternativa, los sistemas de perfusión continua para el cultivo de células requieren agitación o movimiento en el biorreactor o recipiente para proporcionar suspensión de las células, oxigenación y suministro de nutrientes frescos, por ejemplo, para el crecimiento y/o diferenciación. Para obtener la suspensión celular, los recipientes de biorreactores usan normalmente uno o más dispositivos móviles de agitación mecánica que también son una posible fuente de tensión de cizalla.

Establecer y mantener una velocidad de cizalla constante con agitación optimizada es importante para mantener el crecimiento y la viabilidad celular. Por ejemplo, el aumento de la velocidad de cizalla es perjudicial en los siguientes aspectos: (1) la cizalla excesiva aumenta el consumo de energía, (2) la cizalla excesiva interfiere con la difusión en la superficie de la membrana, (3) la cizalla excesiva puede privar a determinados compuestos de sus bioactividades y (4) la cizalla excesiva puede deformar las membranas celulares más allá del umbral de tensión de ruptura que conduce a la lisis celular. Es por lo tanto deseable mantener la cizalla dentro de un intervalo óptimo de 5 a 500 s-1, dependiendo del diámetro del agregado celular y la sensibilidad de la línea celular particular a la disociación y cizalla de una sola célula. En el Ejemplo de Referencia 17, se muestran velocidades de cizalla ilustrativas producidas por configuraciones útiles en los métodos de la invención para diámetros de agregados entre 100-200 pm y velocidades de giro entre 60-140 rpm para una placa de 6 pocillos. Estos valores estiman la tensión de cizalla promediada en el momento en que se produce en el fluido a granel durante la rotación. Sin embargo, se espera que la tensión de cizalla en la pared del recipiente sea más alta debido a los efectos de los límites. Usando el método de Ley et al. citado anteriormente, la tensión de cizalla de la pared se calculó para velocidades de giro que variaban de 60 rpm a 140 rpm y se muestra en los Ejemplos de Referencia 17-19.

Aun así, existen otros ejemplos de medios o dispositivos para generar una suspensión celular suavemente agitada y son bien conocidos por los expertos en la materia incluyendo impulsores, tales como propulsores, u otros medios mecánicos, vejigas, medios basados en flujo de fluido o gas, generadores ultrasónicos de onda estacionaria, plataformas oscilantes o giratorias o combinaciones de las mismas que producirán una suspensión celular. En los métodos desvelados en el presente documento, una plataforma giratoria es un medio ilustrativo para suspender las células en el medio cuando las células están en placas de 6 pocillos, generando una velocidad de cizalla de menos de 400 s-1. Independientemente del tipo de rotor o mecanismo para generar suspensiones de fluidos mixtos agitados, la velocidad de cizalla y la tensión de cizalla estimados promediados en tiempo en el fluido a granel proporcionan un factor de normalización mediante el cual pueden relacionarse todos los dispositivos de mezcla de fluidos. Aunque los regímenes de flujo entre los dispositivos pueden variar en su perfil y extensión de flujo laminar o turbulento, los cálculos de cizalla proporcionan una base para igualar el flujo en dispositivos que producen mezcla mediante diferentes mecanismos. Por ejemplo, para un matraz giratorio de 125 ml con un diámetro del impulsor de 4 cm, una anchura de recipiente de 6,4 cm, un ángulo de impulsor de 90 grados y una anchura de impulsor de 0,1 cm, una velocidad de giro del impulsor de 135 rpm generará la misma velocidad de cizalla promediada en tiempo y la misma tensión de cizalla en el fluido a granel que una placa de 6 pocillos con 5 ml de medio girando a 100 rpm para agregados de 100 pm de diámetro.

Los métodos también pueden usarse para mantener un entorno de baja cizalla en un sistema de fabricación escalado durante períodos de tiempo que varían de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 días, a más de 40 días, a más de 50 días. Un tiempo de funcionamiento ilustrativo es de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 días a más de 40 días, a más de 50 días.

Se contempla que las células diferenciabas puedan hacerse pases usando métodos de disociación enzimáticos, no enzimáticos o manuales antes y/o después del contacto con el medio definido de la invención. Los ejemplos no limitativos de métodos de disociación enzimática incluyen el uso de proteasas tales como tripsina, colagenasa, dispasa y ACCUTASE™. Por ejemplo, ACCUTASE™ puede usarse para hacer pases de las células en contacto. Cuando se usan métodos de pase enzimático, el cultivo resultante puede comprender una mezcla de singletes, dobletes, tripletes y agrupaciones de células que varían en tamaño dependiendo de la enzima usada. Un ejemplo no limitante de un método de disociación no enzimática es un tampón de dispersión celular. En el campo técnico, se han descrito bien técnicas de pase manual, tal como en Schulz et al. 2004 Stem Cells, 22:1218-38. La elección del método de pase está influenciada por la elección de la matriz extracelular, si está presente, y puede determinarla fácilmente un experto en la materia.

Los métodos de cultivo de células diferenciables pueden comprender proporcionar una solución de disociación a una capa de células diferenciables que están contenidas en una cámara de cultivo antes de la disociación, donde la disociación rompe la capa de células en células individuales. Después de la disociación, las células individuales se colocan en una nueva cámara de cultivo tisular con una solución de cultivo de células madre, en donde la solución de células madre comprende una solución nutritiva de sal basal y un ligando ErbB3. Una vez cultivadas, las células madre individuales se colocan en condiciones que permitan el crecimiento y la división de las células individuales. De manera alternativa, los métodos de cultivo de células diferenciables pueden comprender proporcionar una solución de disociación a una agregación de células diferenciables que están contenidas en una cámara de cultivo antes, donde la disociación rompe los agregados de células en células individuales o en agregados de células más pequeños.

La solución de desagregación usada en los métodos puede ser cualquier solución de desagregación capaz de separar o desagregar las células en células individuales, sin provocar una gran toxicidad a las células. Los ejemplos de soluciones de desagregación incluyen, pero sin limitación, tripsina, ACCUTASE™, tripsina/EDTA al 0,25 %, TrypLE o VERSENE™ (EDTA) y tripsina. Los métodos no tienen por qué dar como resultado que cada célula de la capa confluente o suspensión se desagregue en células individuales, siempre que al menos algunas células individuales estén desagregadas y puedan volver a cultivarse.

Ya sea al comienzo del cultivo, o después de los pases, las células diferenciables pueden sembrarse a cualquier densidad, incluyendo una sola célula en una cámara de cultivo. La densidad celular de las células sembradas puede ajustarse dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo, pero sin limitación, el uso de cultivos adherentes o en suspensión, la receta específica de los medios de cultivo celular usados, las condiciones de crecimiento y el uso contemplado de las células cultivadas. Los ejemplos de densidades de cultivos celulares incluyen, pero sin limitación, 0,01 x 105 células/ml, 0,05 x 105 células/ml, 0,1 x 105 células/ml, 0,5 x 105 células/ml, 1,0 x 105 células/ml, 1,2 x 105 células/ml, 1,4 x 105 células/ml, 1,6 x 105 células/ml, 1,8 x 105 células/ml, 2,0 x 105 células/ml, 3,0 x 105 células/ml, 4,0 x 105 células/ml, 5,0 x 105 células/ml, 6,0 x 105 células/ml, 7,0 x 105 células/ml, 8,0 x 105 células/ml, 9,0 x 105 células/ml o 10,0 x 105 células/ml o más, por ejemplo, hasta 5 x 107 células/ml se han cultivado con buena supervivencia celular, o cualquier valor intermedio.

Además de lo anterior, como se usa en el presente documento, la expresión "densidad celular operativa" o "densidad celular operacional" o sus equivalentes se refiere a la densidad celular a la que se operará un proceso o sistema de fabricación para obtener la producción de un cultivo de células hES en proliferación o diferenciación. Tales densidades celulares son aquellas en las cuales los nutrientes tales como vitaminas, minerales, aminoácidos o metabolitos, así como las condiciones ambientales tales como tensión de oxígeno, que se suministran al sistema son suficientes para mantener la viabilidad celular. De manera alternativa, tales densidades de células son aquellas a las que los productos de desecho pueden retirarse del sistema a una velocidad suficiente para mantener la viabilidad celular. Tales densidades celulares pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia.

Las densidades de célula operativa que pueden mantenerse son aquellas de al menos aproximadamente 0,5 x 106 células/ml. En un sistema típico de escalado, las densidades de las células operativas pueden estar entre aproximadamente 0,5 x 106 células/ml y aproximadamente 25 x 106 células/ml. Las densidades ilustrativas pueden estar entre aproximadamente 2,5 x 106 células/ml, 22 x 106 células/ml y hasta 5 x 107 células/ml. En el método desvelado en el presente documento, la viabilidad celular puede ser de al menos aproximadamente el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % y hasta aproximadamente el 100 %. Los expertos en la materia reconocerán otras densidades de células operativas del sistema de escalado y niveles de viabilidad celular aceptables y pueden determinarse mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, configuraciones por lotes (alimentación por lotes), discontinua y continua, las densidades celulares pueden estar entre aproximadamente 0,5 x 106 células/ml y 15 x 106 células/ml.

Las células diferenciables también pueden usarse para buscar moléculas o factores que influyan en su plasticidad u otras características. Por ejemplo, las células diferenciables podrían usarse para identificar agentes que inducen la apoptosis, diferenciación o proliferación, así como efectos similares en linajes diferenciados que se han generado a partir de células diferenciables.

Debido a que las composiciones y métodos desvelados en el presente documento permiten el pase de células individuales, las células diferenciabas se han cultivado con éxito en entornos de alto rendimiento, tales como, pero sin limitación, placas de 96 pocillos y placas de 384 pocillos. La Figura 16 muestra la morfología y la tinción con fosfatasa alcalina de células BG02 que se cultivaron en DC-HAIF tanto en placas de 96 pocillos como de 384 pocillos, usando los métodos descritos en el presente documento. Brevemente, las células hESC que se dividieron, usando ACCUTASE™, y se sembraron en placas de 96 y 384 pocillos y se cultivaron mostraron una eficiencia de siembra en placa similar a la que se observa usando otras placas de cultivo. Además, las células formaron colonias y se expandieron con éxito durante 5 días en los ambientes más pequeños. Estos cultivos más pequeños permanecieron morfológicamente indiferenciados y se tiñeron uniformemente positivos para fosfatasa alcalina, un marcador de células indiferenciadas. Adicionalmente, las hESC también pueden cultivarse en dispositivos de cultivo de 96 pocillos (no se muestran) que proporcionan mediciones de impedancia en tiempo real, que pueden usarse para medir la proliferación y la viabilidad celular usando los métodos RT-CES™ de ACEA Biosciences, Inc. (www.aceabio.com). Dicho enfoque permitiría una identificación y cuantificación sin etiquetas de efectos sutiles o inmediatos en células diferenciables, así como medidas de proliferación, apoptosis y cambios en la morfología, en tiempo real.

Las composiciones y métodos pueden contener prácticamente cualquier combinación de los componentes establecidos anteriormente o descritos en otra parte en el presente documento, siempre que las composiciones y los métodos comprendan una solución nutritiva de sal basal y un medio para estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2. Como reconocerá un experto en la materia, los componentes de las composiciones y los métodos variarán de acuerdo con el diseño del protocolo. En consecuencia, las células diferenciables pueden cultivarse en placas de 96 pocillos y/o placas de 384 pocillos. De hecho, usando los métodos y composiciones desvelados en el presente documento, la cámara de cultivo celular, es decir, la placa de cultivo, ya no se limita a dimensiones específicas. Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento no se limitan de ninguna manera a dimensiones específicas de la cámara de cultivo y/o medios y dispositivos para generar células hES.

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento tienen varias características útiles. Por ejemplo, las composiciones y métodos descritos en el presente documento son útiles para modelar las primeras etapas del desarrollo humano. Adicionalmente, las composiciones y métodos descritos en el presente documento también pueden servir para la intervención terapéutica en patologías, tales como trastornos neurodegenerativos, diabetes mellitus o insuficiencia renal, tal como desarrollando un tejido puro o un tipo de célula.

Los tipos de células que se diferencian de las células diferenciables tienen varios usos en diversos campos de la investigación y el desarrollo, incluyendo pero sin limitación, el descubrimiento de fármacos, el desarrollo y ensayo de fármacos, la toxicología, la producción de células con fines terapéuticos así como la investigación científica básica. Estos tipos de células expresan moléculas que son de interés en una amplia gama de campos de investigación. Estos incluyen las moléculas que se sabe que son necesarias para el funcionamiento de los diversos tipos de células como se describe en los textos de referencia convencionales. Estas moléculas incluyen, pero sin limitación, citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocinas, matriz extracelular, factores de transcripción, polipéptidos secretados y otras moléculas, y receptores de factores de crecimiento.

Se contempla que las células diferenciables desveladas en el presente documento puedan diferenciarse a través del contacto con un entorno de diferenciación celular. Como se usa en el presente documento, la expresión "entorno de diferenciación celular" se refiere a una condición de cultivo celular en donde las células diferenciables se inducen a diferenciarse, o se inducen a convertirse en un cultivo de células humanas enriquecido en células diferenciadas. Preferentemente, el linaje celular diferenciado inducido por el factor de crecimiento será de naturaleza homogénea. El término "homogéneo", se refiere a una población que contiene más de aproximadamente el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % del linaje celular deseado.

Para diferenciar parcial, terminal o reversiblemente las células diferenciables de la presente invención, puede usarse un medio o un ambiente de diferenciación celular. El medio del ambiente de diferenciación celular puede contener una diversidad de componentes que incluyen, por ejemplo, medio KODMEM (Medio de Eagle modificado de Dulbecco de Inactivación génica), DMEM, medio F12 de Ham, FBS (suero bovino fetal), FGF2 (factor de crecimiento de fibroblastos 2), KSR o hLIF (factor inhibidor de la leucemia humana). El ambiente de diferenciación celular también puede contener suplementos tales como L-Glutamina, NEAA (aminoácidos no esenciales), P/S (penicilina/estreptomicina), N2, B27 y p-mercaptoetanol (p-ME). Se contempla que puedan añadirse factores adicionales al ambiente de diferenciación celular, incluyendo, pero sin limitación, fibronectina, laminina, heparina, sulfato de heparina, ácido retinoico, miembros de la familia de factores de crecimiento epidérmico (EGF), miembros de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) incluyendo FGF2, FGF7, FGF8 y/o FGF10, miembros de la familia de factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), antagonistas de la familia del factor del factor de crecimiento transformante (TGF)/proteína morfogenética ósea (BMP)/factor de crecimiento y diferenciación (GDF) incluyendo, pero sin limitación, noggina, folistatina, cordina, gremlina, proteínas de la familia cerberus/DAN, ventropina, alta dosis de activina y amniosless o variantes o fragmentos funcionales de las mismas. También podrían añadirse antagonistas de TGF/BMP/GDF en forma de quimeras del receptor Fc de TGF/BMP/GDF. Otros factores que pueden añadirse incluyen moléculas que pueden activar o desactivar la señalización a través de la familia de receptores Notch, incluyendo, pero sin limitación, proteínas de las familias tipo Delta y Jagged así como inhibidores del procesamiento o escisión de Notch, o variantes o fragmentos funcionales de los mismos. Otros factores de crecimiento pueden incluir miembros de la familia de factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), insulina, la familia de factores relacionados con wingless (WNT) y la familia de factores hedgehog o variantes o fragmentos funcionales de los mismos. Pueden añadirse factores adicionales para promover la proliferación y supervivencia de células madre/progenitoras del mesoendodermo, células madre/progenitoras del endodermo, células madre/progenitoras del mesodermo o células madre/progenitoras del endodermo definitivo así como la supervivencia y diferenciación de derivados de estas células progenitoras.

Las composiciones descritas en el presente documento son útiles para la detección de compuestos de prueba para determinar si un compuesto de prueba modula la pluripotencia, proliferación y/o diferenciación de células diferenciables. La pluripotencia, proliferación y/o diferenciación de células diferenciables puede determinarla fácilmente un experto en la materia. Los métodos no limitativos incluyen examinar la morfología celular, la expresión de diversos marcadores, formación de teratoma, recuentos de células y medidas de impedancia.

La progresión de las células diferenciables al linaje celular deseado, o su mantenimiento en un estado indiferenciado, puede monitorizarse cuantificando la expresión de genes marcadores característicos del linaje celular deseado, así como la falta de expresión de genes marcadores característicos de tipos de células diferenciables. Un método para cuantificar la expresión génica de tales genes marcadores es mediante el uso de PCR cuantitativa (Q-PCR). En la técnica se conocen bien métodos para realizar Q-PCR. También pueden usarse otros métodos que se conocen en la técnica para cuantificar la expresión del gen marcador. La expresión del gen marcador puede detectarse mediante el uso de anticuerpos específicos para el gen marcador de interés.

El método de detección puede abarcar métodos para identificar un compuesto capaz de modular la pluripotencia, proliferación y/o diferenciación de una célula diferenciable, que comprende (a) proporcionar una célula diferenciable; (b) cultivar la célula en una composición que comprende una solución nutritiva de sal basal y un ligando ErbB3, en donde la composición está esencialmente exenta de suero; (c) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y determinar si un aumento o disminución de la pluripotencia, proliferación y/o diferenciación se produce en la célula en contacto con el compuesto, siendo dicho aumento una indicación de que el compuesto modula la pluripotencia, proliferación y/o diferenciación celular. El ligando ErbB3 puede ser HRG-p. De manera alternativa, el ligando ErbB3 puede sustituirse con un compuesto de prueba, para determinar los efectos del compuesto de prueba. Por ejemplo, los efectos sobre la pluripotencia, proliferación y/o diferenciación que se produce con el compuesto de prueba pueden compararse con los efectos sobre la pluripotencia, proliferación y/o diferenciación que se produce con el ligando ErbB3 para determinar los efectos del compuesto de prueba sobre las células diferenciables. Se contempla que cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento pueda usarse en los métodos de detección desvelados en el presente documento.

Las células pueden cultivarse en ausencia de un ligando ErbB3 (actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2) para determinar los efectos de la ausencia de un ligando ErbB3 (actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2) sobre las células.

Usando los métodos descritos en el presente documento, pueden producirse composiciones que comprendan el linaje celular deseado que estén sustancialmente exentas de otros tipos de células. De manera alternativa, también pueden producirse composiciones que comprenden mezclas de las células diferenciables y el linaje celular deseado. Las células del linaje celular deseado pueden aislarse usando una etiqueta de afinidad que sea específica para tales células. Un ejemplo de una etiqueta de afinidad específica para una célula diana es un anticuerpo que es específico para un polipéptido marcador que está presente en la superficie celular de la célula diana pero que no está sustancialmente presente en otros tipos de células que se encontrarían en un cultivo celular producido por los métodos descritos en el presente documento.

En el presente documento se desvelan kits, donde el kit comprende una solución nutritiva de sal basal y al menos un compuesto capaz de estimular la actividad tirosina cinasa dirigida por ErbB2. Los kits pueden comprender al menos un ligando ErbB3, como se describe en el presente documento. Los kits pueden comprender más de un ligando ErbB3. De manera alternativa, los kits pueden comprender al menos uno de TGF-p o un miembro de la familia de TGF-p o una variante o fragmento funcional del mismo como se describe en el presente documento. Los kits pueden comprender más de uno de TGF-p o un miembro de la familia de TGF-p o una variante o fragmento funcional del mismo. Además, los kits pueden comprender al menos un factor de crecimiento de fibroblastos o una variante o fragmento funcional del mismo. Los kits pueden comprender más de un factor de crecimiento de fibroblastos o variante o fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, los kits pueden comprender al menos uno de FGF-7, FGF-8, FGF-10, FGF-22 o variantes o fragmentos funcionales de los mismos. De manera alternativa, los kits pueden comprender seroalbúmina. Los kits pueden comprender suero y/o al menos un sustrato insoluble como se describe en el presente documento y/o al menos una solución de desagregación.

Los kits pueden contener prácticamente cualquier combinación de los componentes establecidos anteriormente o descritos en otra parte en el presente documento. Como reconocerá un experto en la materia, los componentes suministrados con los kits de la invención variarán con el uso previsto para los kits. Por lo tanto, los kits pueden diseñarse para realizar diversas funciones establecidas en esta solicitud y los componentes de dichos kits variarán en consecuencia.

Ejemplos

La línea de células madre embrionarias humanas de referencia BG01v (BresaGen, Inc., Atenas, GA) se usó en algunos de los Ejemplos de Referencia descritos en el presente documento. La línea BG01v hESC es una línea celular cariotípicamente variante, que exhibe un cariotipo estable que contiene trisomías específicas (cariotipo: 49, XXY,+12,+17). Los cultivos parentales se mantuvieron como se describió anteriormente (Schulz et al. 2003, BMC Neurosa., 4:27; Schulz et al. 2004, Stem Cells 22:1218-38; Rosier et al. 2004, Dev. Dynamics, 229:259-274; Brimble et al. 2004 Stem Cells Dev. 13:585-596). Brevemente, las células se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL™ o fibronectina, en medios acondicionados de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (MEF-CM) que comprenden DMEM: F12 con 20 % de KSR, 8 ng/ml de FGF2, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x, penicilina 0,5 U/ml, estreptomicina 0,5 U/ml, p-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.), con pase de colagenasa.

El medio de cultivo definido (DC) probado en el presente documento comprendía DMEM/F12, glutamax 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x, penicilina 0,5 U/ml, estreptomicina 0,5 U/ml, transferrina 10|jg/ml (todos de Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) p-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma), fracción V de Cohn sin ácidos grasos al 0,2 % BSA (Serologicals), 1x mezclas de Elementos Traza A, B y C (Cellgro) y ácido ascórbico 50 jg/ml (Sigma). Se usaron niveles variables de factores de crecimiento recombinantes, incluyendo FGF2 (Sigma), LongR3-IGF1 (JRH Biosciences), Dominio EGF de herregulina-p (HRGp, Peprotech), TGFp (R&D systems), nodal (R&D systems), LIF (R&D systems), EGF (R&D systems), TGFa (R&D systems), HRGa (R&D systems), BMp4 (R&D systems) y Activina A (R&D Systems). LongR3-IGF1 es una versión modificada de IGF 1 que tiene una afinidad reducida por las proteínas de unión de IGF1, algunos de los cuales se expresan en hESC. DC-HAIF es el medio de cultivo definido como anteriormente, que contiene 10 ng/ml de HRG-p, 10 ng/ml de Activina A, 200 ng/ml de LR-IGF1 y 8 ng/ml de FGF2. DC-HAI se define como medio de cultivo como anteriormente que contiene 10 ng/ml de HRG-p, 10 ng/ml de Activina A y 200 ng/ml de LR-IGF1. Tanto en DC-HAIF como en D^c -HAI, el componente LR-IGF¹ puede, por supuesto, reemplazarse por IFG1.

Las placas recubiertas con MATRIGEL™ se prepararon diluyendo la matriz BD MATRIGEL™ reducida en factor de crecimiento (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) a un intervalo de concentración final de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:1000 en DMEM/F-12 frío. En una realización, la concentración de MATRIGEL™ es aproximadamente 1:200. Se usó una placa de 1 ml/35 mm para revestir las placas durante 1­ 2 horas a temperatura ambiente o al menos durante la noche a 4 °C. Las placas se almacenaron hasta una semana a 4 °C. La solución MATRIGEL™ se retiró inmediatamente antes de su uso.

Para las condiciones probadas, los cultivos parentales se sembraron en placas de 6 pocillos para comparar múltiples condiciones. Normalmente, los cultivos se sembraron en placa directamente en las condiciones de prueba. Los cultivos se evaluaron todos los días y se clasificaron según criterios morfológicos 4 a 5 días después de la siembra en placa. La escala de clasificación de 1 a 5 implicó examinar todo el cultivo y evaluar la proporción general de colonias indiferenciadas, su tamaño relativo y la proporción de colonias o partes de colonias que exhiben una diferenciación obvia. El grado 5 indica cultivos "ideales", con grandes colonias indiferenciadas y diferenciación insignificante. El grado 4 indica un muy buen cultivo, pero con alguna diferenciación obvia. El grado 3 indica un cultivo aceptable, pero alrededor de la mitad de las colonias exhibiendo una diferenciación obvia. Los cultivos de grado 2 están predominantemente diferenciados, con supuestas células indiferenciadas ocasionales. Los cultivos de grado 1 contienen colonias diferenciadas o los cultivos no se adhirieron o no sobrevivieron. Se realizaron pases de los cultivos que exhibieron una buena expansión de células indiferenciadas para evaluar el cultivo prolongado en estas condiciones.

Ejemplo de Referencia 1 - Expresión de ErbB1-3, Nrg1 y ADAM19 en células BG01v

Se usó RT-PCR en tiempo real para demostrar la expresión de ErbB1-3, Neurregulina y ADAM-19 en células BG01v (Figura 1). Se obtuvieron células BG01v cultivadas en medio DC, como se ha descrito anteriormente, que contenía 100 ng/ml de LongR3-IGF1 (LR-IGF1), 8 ng/ml de FGF2 y 1 ng/ml de Activina A y se preparó ARN usando el mini kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de la primera cadena se preparó usando el kit iScript (Biorad) y la PCR en tiempo real se llevó a cabo usando un termociclador MJ Research Opticon.

Se usaron ensayos TaqMan a demanda (Applied Biosystems) para ADAM19 (Hs00224960_m1), EGFR (Hs00193306_m1), ErbB2 (Hs00170433_m1), ErbB3 (Hs00176538_m1), NRG1 (Hs00247620_m1), OCT4 (Hs00742896_s1) y GAPDH control con PCR TaqMan universal (Applied Biosystems). En la Figura 1 se muestran los gráficos de amplificación en tiempo real, demostrando la expresión de estos transcritos en células BG01v indiferenciadas.

Ejemplo de Referencia 2 - la inhibición de ErbB2 ralentiza la proliferación de células BG01v

La familia de ligandos del dominio EGF se une a la familia ErbB de tirosina cinasas receptoras. Para examinar el efecto de inhibidores conocidos de tirosina cinasas ErbB en hESC, las células BG01v se sembraron en bandejas de 6 pocillos en MATRIGEL™ diluido a 1:1000, en medio de cultivo definido (DC) que contiene 100 ng/ml de LongR3-IGF1, 8 ng/ml de FGF2 y 1 ng/ml de Activina A. El día siguiente, DMSO (control de vehículo), AG147850 nM-20 pM (un inhibidor de ErbBl) o AG879 100 nM-20 pM (un inhibidor de ErbB2) se añadió con medio reciente. Las células se cultivaron durante 5 días adicionales, con cambios diarios de medio. Los cultivos se fijaron después y se tiñeron para determinar la actividad de fosfatasa alcalina.

Se observaron colonias subconfluentes de células AP+ BG01v (Figuras 2A y B) en células control y AG1478 cultivadas, lo que indica que ni DMSO ni AG1478 (50 nM-20 pM) tuvieron un efecto aparente sobre la proliferación celular. AG879, sin embargo, inhibió sustancialmente el crecimiento celular a 5 pM (Figura 2C) y provocó la muerte celular a 20 pM (no mostrado). Los cultivos desarrollados en AG879 no parecieron diferenciarse y parecieron mantener una morfología pluripotente y actividad de fosfatasa alcalina, lo que indica que AG879 pareció inhibir la proliferación sin inducir la diferenciación, lo que sugiere que las células BG01v dependen de la señalización de ErbB2 para la supervivencia celular. A la inversa, las células BG01v cultivadas en condiciones similares a las anteriores no parecen depender de la señal de ErbB1 para la proliferación.

Ejemplo de Referencia 3 - las células BG01v se mantienen en medio definido que contiene herregulina La expresión de ErbB2 y ErbB3 y la inhibición de la proliferación con AG879 sugirieron que las células BG01v tienen señalización de ErbB endógena activa y que también pueden responder a HRG-p exógena. Las células BG01v se cultivaron en medio DC que contenía 10 ng/ml de HRG-p, 200 ng/ml de LongR3-IGF1, 8 ng/ml de FGF2 y 10 ng/ml de Activina A, sobre MATRIGEL™ diluido 1:1000 (Figuras 3A y B). Estas células se cultivaron durante 4 pases, o >20 días, exhibieron morfología indiferenciada y no mostraron diferenciación espontánea elevada.

Adicionalmente, las células BG01v también se mantuvieron durante 2 pases, o >13 días, en medio DC que comprende 10 ng/ml de HRGp, 200 ng/ml de LongR3-IGF1 y 10 ng/ml de Activina A. Estos cultivos proliferaron normalmente y exhibieron una diferenciación espontánea muy baja, demostrando que las células BG01v podrían mantenerse en condiciones definidas con HRGp en ausencia de FGF2.

Ejemplo de Referencia 4 -e l papel de la tirosina cinasa dirigida por ErbB2 en las células ES

La RT-PCR demostró que las mESC expresan ADAM19, Neurregulina1 (Nrg1) y ErbB1-4 (Figura 4A). En las mESC, ErbB2 y 3 parecían expresarse a niveles más altos que ErbB1, detectándose niveles bajos de ErbB4. Estos datos sugieren que la HRG-p endógena podría estar implicada en el impulso de la autorrenovación de mESC.

También se examinó la expresión de los transcritos del receptor ErbB en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (Figura 4B). Los MEF son una población heterogénea de células derivadas de vísceras E12.5-13.5 que se han usado históricamente para mantener células EC y células ES de ratón y humanas. La expresión de Nrg1 y Adam19 en esta población sugiere que el ectodominio HRG-p también está presente en medios acondicionados con MEF y puede ejercer efectos significativos sobre la pluripotencia.

Se usaron AG1478 y AG879 para examinar el papel de la señalización de HRG/ErbB en células ES de ratón. Las células ES de ratón R1 se mantuvieron en condiciones convencionales en DMEM, FBS al 10%, KSR al 10%, penicilina 0,5 U/ml, estreptomicina 0,5 U/ml, 1xNEAA, piruvato sódico 1 mM, LIF 1000 U/ml (ESGRO), p-ME 0,1 mM y se realizaron pases con tripsina al 0,5%/EDTA. Se sembraron 2x105células en bandejas de 6 pocillos en MATRIGEL™ diluido a 1:1000. El día después de la siembra en placa, DMSO (control de vehículo), se añadió 1­ 50 pM de AG1478 o 1-50 pM de AG879 con medio reciente. Las células se cultivaron unos 8 días adicionales, con cambios diarios de medio. Los cultivos se fijaron después y se tiñeron para determinar la actividad de fosfatasa alcalina.

DMSO y AG1478 1-50 pM no tuvieron ningún efecto aparente sobre la proliferación celular, con colonias subconfluentes de mESC positivas para fosfatasa alcalina observadas (Figuras 5A-C). Sin embargo, AG879 inhibió sustancialmente el crecimiento celular a 50 pM (comparar las Figuras 5D y 5F) y puede haber ralentizado la proliferación a 20 pM (Figura 5E). Las mESC cultivadas en AG879 no parecieron diferenciarse y mantuvieron una morfología pluripotente y actividad de fosfatasa alcalina.

Los resultados indican que AG879 pareció inhibir la proliferación, sin inducir diferenciación, de mESC, lo que sugiere que las mESC requieren la señalización de ErbB2 para la proliferación. A la inversa, las mESC no parecen depender de una señal de ErbB1 para la proliferación. La concentración de AG879 requerida para inhibir la proliferación fue ~10x más alta para las mESC que para las células BG01v cultivadas en condiciones definidas, lo que indica que el suero usado en las condiciones de mESC puede haber interferido con la actividad del fármaco, que AG879 tiene una afinidad menor por la tirosina cinasa ErbB2 de ratón que por la tirosina cinasa ErbB2 humana, o que ErbB2 puede desempeñar papeles ligeramente diferentes con las diferentes especies de células ES.

Otro inhibidor altamente selectivo de la tirosina cinasa ErbB2, tirfostina AG825 (Murillo, et al. 2001, Cáncer Res 61:7408-12), se usó para investigar el papel de ErbB2 en ESC humanas. AG825 inhibió significativamente la proliferación de hESC que crecían en medio acondicionado (CM) (Figura 6A). AG825 inhibió la proliferación sin una muerte celular generalizada y las hESC viables pudieron mantenerse durante >5 días (no mostrado). La transferencia Western mostró que AG825 inhibió la autofosforilación de ErbB2 en la tirosina-1248 en hESC privadas/pulsadas con herregulina (HRG) que crecían en DC-HAIF (Figura 6B). Por lo tanto, la alteración de la señalización de ErbB2 inhibió gravemente la proliferación de hESC. Para establecer las hESC en condiciones de crecimiento definidas, los cultivos se pudieron pasar directamente de las condiciones de CM a DC-HAIF y exhibieron una diferenciación espontánea mínima (Figura 6C). Los ensayos de recuento de colonias y células confirmaron que LongR3-IGF1 y HRG desempeñaron los papeles principales en la autorrenovación y la proliferación en el contexto de una de las realizaciones de la presente invención (Figura 6D, 6E). La fosforilación de IGF1R, IR, FGF2a, ErbB2 y ErbB3 también se observó en ambos cultivos de DC-HAIF en estado estacionario y en cultivos privados que se pulsaron con DC-HAIF (Figura 6F).

Ejemplo de Referencia 5 - cultivo de células ES de ratón en condiciones definidas

Para examinar adicionalmente el papel de la señalización de HRG/ErbB2 en las células ES de ratón, se examinó la proliferación de células ES R1 en medio DC usando una combinación de factores de crecimiento.

1x105células/pocillo se sembraron en bandejas de 6 pocillos, recubiertos con gelatina al 0,2 %, en DC que contienen combinaciones de 10 ng/ml de HRG-p, 100 ng/ml de LongR3-IGF1, 1 ng/ml de Activina A, 1000 U/ml de LIF de ratón o 10 ng/ml de BMP4 (Tabla 3, a continuación). Se observó proliferación durante 8 días.

Las colonias viables solo crecieron en condiciones que contenían al menos LIF/HRG-p o LIF/BMP4 (Tabla 3). No se observó ningún beneficio obvio adicional cuando se añadieron LongR3-IGF1 o Activina a estas combinaciones. Se observó una proliferación normal en un cultivo parental de control y no se observaron colonias viables en medios definidos sin factores de crecimiento.

Tabla 3

Se realizó un ensayo cuantitativo sembrando 2x105 células/pocillo en bandejas de 6 pocillos en MATRIGEL™ 1:1000, en combinaciones seleccionadas de 10 o 50 ng/ml de HRG-p, 10 ng/ml de EGF, 1000 U/ml de LIF o 10 ng/ml de BMP4. Los cultivos se hicieron crecer durante 8 días, se fijaron y se contó el número de colonias de fosfatasa alcalina (Figura 7A). No se observaron colonias en condiciones definidas sin factores de crecimiento, y se observaron <45 colonias con combinaciones de HRG-p, HRG-p/EGF y HRG-p/BMP. Aunque se observaron 1358 colonias solo en LIF, se observaron 4114 y 3734 colonias en las combinaciones de 10 ng/ml de HRG-p/LIF y 50 ng/ml de HRG-p/LIF, respectivamente. Esto indicó que en condiciones definidas, LIF solo proporcionó una señal de pluripotencia sustancial, y HRG-p exhibió un gran efecto sinérgico con LIF, más del doble del número de colonias de mESC en proliferación en este ensayo. Las imágenes de bajo aumento de este ensayo también indican este efecto proliferativo sinérgico (Figuras 7B-G).

Ejemplo de Referencia 6 - Caracterización de la pluripotencia de células madre embrionarias humanas (hESC) mantenidas en DC-HAIF

Se usaron múltiples enfoques para confirmar el mantenimiento de la plasticidad de las hESC en DC-HAIF. Las células BG02 cultivadas en dC-HAIF durante 6 meses (25 pases) mantuvieron el potencial de formar teratomas complejos (Figura 8A) y representantes de las tres capas germinales in vitro (Figura 8B). Se usaron análisis transcripcionales para comparar la expresión global en células hESC (Liu et al. 2006, BMC Dev Biol 6:20) mantenidas en CM y DC-HAIF. Se detectaron más de 11.600 transcritos en células BG02 cultivadas en DC-HAIF durante 10 y 32 pases y células BG02 cultivadas en CM durante 64 pases. Había aproximadamente 10.364 transcritos comunes a todas las poblaciones (Figura 8C), incluyendo marcadores de hESC conocidos como CD9, DNMT3, NANOG, OCT4, TERT y UTF1 (no mostrado). Se observaron altos coeficientes de correlación en comparaciones de cultivos CM y DC-HAIF (R selec. = 0,928), así como en células de pases tempranos y tardíos (R selec. = 0,959) (Figura 8D). El análisis de agrupamiento jerárquico demostró que las células ^bG02 mantenidas en DC-HAIF se agruparon firmemente y mantuvieron una estrecha similitud con las células BG02 y BG03 mantenidas en CM (Figura 8E). Estos datos están en consonancia con análisis anteriores que muestran que las hESC indiferenciadas se agruparon firmemente en comparación con los cuerpos embrioides o fibroblastos (Liu et al. 2006, BMC Dev Biol 6:20). Por lo tanto, las células mantenidas en las composiciones desveladas en el presente documento son capaces de mantener marcadores clave de pluripotencia. En consecuencia, las composiciones desveladas en el presente documento pueden usarse como un medio sencillo para soportar la autorrenovación de células diferenciables.

Ejemplo de Referencia 7 - mantenimiento de células madre embrionarias humanas (hESC) en matrices extracelulares humanizadas (ECM) en DC-HAIF

Para investigar el papel de la señalización de ErbB2 y desarrollar un medio definido para las hESC, los cultivos de DC-HAIF se expandieron inicialmente en placas de cultivo recubiertas con MATRIGEF™ reducido en factor de crecimiento 1:30, pero también podrían mantenerse a largo plazo satisfactoriamente en este sustrato diluido 1:200 (Figura 9A) o 1:1000. Las hESC BG02 y CyT49 también podrían mantenerse durante >5 pases en placas de cultivo tisular recubiertas con suero humano (Figura 9B); fibronectina humana (Figura 9C); o VITROGRO™ (Figura 9D), que es una ECM humanizada patentada.

Ejemplo de Referencia 8 - Pase de células individuales de células madre embrionarias humanas (hESC) Múltiples grupos de investigación han demostrado que determinadas triploidías, en particular de hChrl2 y 17, se acumulan en hESC en determinadas condiciones de cultivo subóptimas (Baker et al. 2007, Nat. Biotech.25:207-15). La aparición de triploidías parece estar más directamente relacionada con la escasa supervivencia celular cuando los cultivos se separan en células individuales al hacer los pases, proporcionando una supuesta ventaja de crecimiento selectivo fuerte para las células que albergan estas aneuploidías. A la inversa, las hESC que crecen en una realización de la presente invención, DC-HAIF, mantuvieron una alta viabilidad en la siembra en placa después de separarse en células individuales (Figuras 10A-D). Las células BG01 y BG02 mantuvieron un cariotipo normal (Figura 10E) después de los pases con ACCUTASE™ durante >18 y 19 pases respectivamente. El mantenimiento del cariotipo normal en las células demostró que la desagregación de cultivos de hESC en células individuales no conducía intrínsecamente a la acumulación de estas trisomías en hESC mantenidas en DC-HAIF. También se realizaron pases de cultivos de BG01 y BG02 mediante desagregación a células individuales con múltiples agentes de realización de pases (Figura 11). Los cultivos se dividieron con ACCUTASE™, tripsina/EDTA al 0,25 %, TrypLE o VERSENE™ (EDTA) durante 5 pases y se determinó el cariotipo. Los datos demuestran que el cultivo y el pase de hESC en las composiciones desveladas en el presente documento mantuvieron un cariotipo normal en al menos dos líneas de células embrionarias humanas, usando una diversidad de reactivos de desagregación celular.

También es posible la expansión a gran escala de hESC indiferenciadas, usando las composiciones desveladas en el presente documento. Se expandió un cultivo confluente inicial de células BG02 en una placa de 60 mm en DC-HAIF a través de 4 pases para generar >1,12 x 1010 células en 20 días en un solo experimento. Los cultivos se mantuvieron indiferenciados, como lo demuestra >85 % de las células en el lote que mantienen la expresión de marcadores de pluripotencia como OCT4, CD9, SSEA-4, TRA-1-81 cuando se examina mediante citometría de flujo (Figura 12A). La expresión de otros marcadores de pluripotencia también se observó mediante análisis de RT-PCR, mientras que los marcadores de linajes diferenciados a-fetoproteína, MSX1 y HAND1 no se detectaron (Figura 12B). El análisis de hibridación in situ con fluorescencia demostró que las células cultivadas y pasadas en DC-HAIF mantuvieron los números de copia esperados para hChrl2 (98 % 2 copias), hChrl7 (98 % 2 copias), hChrX (95 % 1 copia) y hChrY (98% 1 copia) (Figura 12C). El análisis de cariotipo también demostró que en estas células se mantenía un contenido cromosómico euploide normal y un perfil de bandas.

Ejemplo de Referencia 9 -L a insulina y el IGF1 ejercen diferentes efectos sobre las hESC cuando se aplican a concentraciones fisiológicas

Esencialmente todas las condiciones de cultivo indicadas para las hESC hasta ahora incluyen niveles suprafisiológicos de insulina, que pueden estimular tanto a IR como a IGF1R. Para distinguir las actividades que ejercen la insulina y los sustitutos de la insulina, en comparación con IGF1, las hESC se cultivan en condiciones de medio definidas en niveles fisiológicos de estos factores de crecimiento. Las concentraciones de insulina e IGF1 se valoran de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 200 ng/ml y se controla la proliferación celular contando las células después de 5 días. Los cultivos que se expanden con éxito se pasan en serie 5 veces. Los niveles fisiológicos de IGF1 soportan la expansión de cultivos de hESC, mientras que los niveles fisiológicos de insulina no lo hacen, indicando que la actividad de la insulina o los sustitutos de la insulina no puede reemplazar al IGF1, y que el IGF1 y la insulina (o los sustitutos de la insulina) representan clases separadas de actividades biológicas con respecto a la acción sobre las hESC.

Ejemplo de Referencia 10 - Métodos para detectar los efectos de los suplementos

Para examinar inicialmente los efectos de la Vitamina B¹² y la Vitamina B6, sobre el crecimiento o diferenciación de las hESC que crecen a una densidad intermedia, las células BG02 se separan usando ACCUTASE™ y 1 x 105 células/pocillo se cultivan en placas en bandejas de 6 pocillos en medio de cultivo definido (DC). El medio DC contiene 10 ng/ml de HRG-p, 200 ng/ml de LongR3-IGF1 y 10 ng/ml de FGF10. Vitamina B6, (0,5 ^j M) y/o Vitamina B¹² (0,5 ^|j M) se añaden a los pocilios experimentales. Los números de células en cada condición se cuentan después de 7 días. El recuento celular y el recuento de colonias de los pocillos experimentales y de control proporcionarán información sobre los efectos de la Vitamina B6 y la Vitamina B¹² sobre el crecimiento celular.

Además, los marcadores de diferenciación, tales como OCT4 pueden ensayarse en el pocillo experimental para determinar los efectos de los aditivos y suplementos en el estado de diferenciación de las células diferenciables. Ejemplo de Referencia 11 - Cultivo de hESC en ausencia de FGF2

Las células BG02 se mantuvieron a largo plazo en DC-HAI, durante 20 pases (Figura 13A) y también se realizaron pases sucesivos de células BG01 en DC-HAI, ambas en ausencia de FGF2. Los cultivos no se deterioraron ni exhibieron una diferenciación manifiesta y exhibieron una expansión normal de colonias indiferenciadas a lo largo del período de cultivo. El mantenimiento de un cariotipo masculino normal en un cultivo de BG02 se demostró después de 6 pases en DC-HAI (Figura 13B, extensiones de metafase normal 20/20).

Se usaron análisis transcripcionales para comparar la expresión global en células hESC mantenidas en DC-HAIF y DC-HAI. Se aisló el ARN celular total de las hESC usando Trizol (Invitrogen) y se trató con DNasa I (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. La amplificación de la muestra se realizó con 100 ng de ARN total usando el kit Illumina RNA Amplification y el marcaje se logró mediante la incorporación de biotina-16-UTP (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences) en una proporción de 1:1 con UTP sin marcar. El material marcado y amplificado (700 ng por matriz) se hibridó con Sentrix Human-6 Expression Beadchips que contenía 47.296 sondas de transcritos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina, Inc.). Las matrices se escanearon con un escáner confocal de Illumina Bead Array Reader y el procesamiento de datos primarios, la sustracción de fondo y el análisis de datos se realizaron utilizando el software Illumina BeadStudio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una puntuación de confianza de detección mínima de 0,99 (un valor de corte calculado que indica que la señal de la secuencia diana se podía distinguir de los controles negativos) para discriminar la presencia o ausencia de expresión de transcritos. El análisis de datos se realizó usando enfoques paralelos descritos para otras muestras de hESC (Liu et al. 2006, BMC Dev Biol 6:20). La agrupación jerárquica se realizó como se describió anteriormente (Liu et al. 2005, BMC Dev Biol 6:20) y se basó en el enlace promedio y las distancias euclidianas como la métrica de similitud usando genes expresados diferencialmente identificados por ANOVA (p<0,05). Las descripciones detalladas de las pruebas de sensibilidad y control de calidad usadas en la fabricación de matrices y los algoritmos utilizados en el software Bead Studio están disponibles en Illumina, Inc (San Diego, CA). La mayoría de los transcritos detectados se expresaron en cultivos de DC-HAIF y DC-HAI BG02, incluyendo marcadores de hESC conocidos como CD9, Dn Mt 3, NANOG, OCT4, TERT y Ut F1 (no mostrado). Se observaron altos coeficientes de correlación en las comparaciones de cultivos DC-HAIF y DC-HAI (R2 selec. = 0,961) (Figura 14). El análisis de agrupamiento jerárquico demostró que las células BG02 mantenidas en DC-HAI se agruparon firmemente y mantuvieron una gran similitud con las células mantenidas en DC-HAIF, así como BG02 y otras líneas de hESC en múltiples formatos de cultivo (Figura 15). Estos datos están en consonancia con análisis anteriores que muestran que las hESC indiferenciadas se agruparon firmemente en comparación con los cuerpos embrioides o fibroblastos (Liu et al. 2006, BMC Dev Biol 6:20).

Adicionalmente, células BG02 mantenidas en DC-HAI diferenciadas a representantes del mesodermo, endodermo y ectodermo en teratomas complejos formadas en ratones SCID de color beis (no mostrado), demostrando formalmente el mantenimiento de la pluripotencia en cultivos desarrollados en ausencia de FGF2 exógeno.

Para examinar si se requería FGF2 exógeno en el contexto del pase de células individuales, se realizaron pases de las células BG01 con ACCUTASE™ y se cultivaron en condiciones definidas que contenían solo 10 ng/ml de HRG-p y 200 ng/ml de LongR3-IGF1 (DC-HI). Estos cultivos de DC-HI se mantuvieron durante 10 pases y no mostraron una diferenciación manifiesta o una desaceleración de la proliferación.

Estos estudios demostraron claramente que la provisión de FGF2 exógeno no es necesaria cuando las hESC se mantienen en medios definidos que contienen mínimamente herregulina e IGF1. Adicionalmente los cultivos sin FGF2 mantuvieron propiedades clave de pluripotencia, incluyendo el perfil transcripcional y la diferenciación en mesodermo, endodermo y ectodermo in vivo.

Ejemplo de Referencia 12 - Cultivos en suspensión

Los cultivos iniciales de células BG02 se mantuvieron en medio DC-HAIF en placas recubiertas con matrigel 1:200, como se describe en el presente documento y se dividieron haciendo pases con ACCUTASE™. Para iniciar el cultivo en suspensión, las células BG02 se desagregaron con ACCUTASE™ y se colocaron en bandejas de 6 pocillos de baja adherencia a una densidad de 1,6, 3 o 6 x105 células/ml (0,5, 1 o 2 x106 células en volúmenes de 3 ml) en medio DC-HAIF. Las bandejas se colocaron en una plataforma giratoria a 80-100 rpm en una incubadora humidificada con 5 % de CO2. En estas condiciones, las hESC se fusionaron en pequeñas esferas de células morfológicamente viables en 24 horas.

El medio de los pocillos se cambió el segundo día y todos los días a partir de entonces. Los agregados de suspensión continuaron proliferando, creciendo con el tiempo sin signos evidentes de diferenciación (Figura 17). Algunas de las esferas continuaron agregándose a lo largo del cultivo, ya que algunos agregados se volvieron mucho más grandes que la mayoría. Además, pudieron observarse agregados no esféricos en proceso de fusión durante los primeros días del cultivo. Para limitar esta agregación continua, se incluyeron 38 pg/ml de DNasa l en algunos cultivos en suspensión durante las primeras 24 horas. Este enfoque pareció conducir a la agregación inicial, con agregados relativamente más grandes, pero menos, formados en presencia de DNasa I. Sin embargo, no está claro, si el tratamiento con DNasa l redujo la fusión posterior de las esferas y la exposición a DNasa l hizo que estos agregados fueran más difíciles de romper al dividirse.

Los cultivos en suspensión se desagregaron con ACCUTASE™ aproximadamente cada 7 días y se establecieron nuevas esferas. Aunque las densidades variaron en diferentes experimentos, las esferas establecidas dentro de este intervalo de densidades (1,6-6 x105 células/ml) podrían mantenerse en cultivo durante más de 12 pases, u >80 días, sin signos morfológicos de diferenciación. También se realizaron análisis FISH de hESC en suspensión con pases en serie para evaluar el número de cromosomas de aneuplodías comunes. Las células BG02 que se habían cultivado en suspensión durante 6 pases mostraron recuentos normales de hChr 12 (96% dos copias, n = 788), hChr 17 (97 % dos copias, n = 587), hChr X (97 % una copia, n = 724) y hChr Y (98 % una copia, n = 689).

Ejemplo de Referencia 13 - expansión de células diferenciables en cultivo en suspensión

A diferencia del cultivo de cuerpos embrioides en presencia de suero o inductores de diferenciación, los agregados en suspensión de hESC en DC-HAIF no parecieron diferenciarse. No se observó endodermo visceral obvio, tampoco lo fue la formación de estructuras que se asemejan a cavidades proamnióticas, ambos signos clásicos de diferenciación del cuerpo embrioide. Para examinar la falta de diferenciación más de cerca, los cultivos se sembraron de nuevo en condiciones adherentes en MATRIGEL™ diluido 1:200 y se cultivaron en DC-HAIF. Estos cultivos también fueron principalmente indiferenciados y no exhibieron signos morfológicos obvios de mayor diferenciación tal como la presencia de células de mayor tamaño, aplanadas o regiones estructuradas.

Se usó el recuento celular para evaluar las tasas de crecimiento relativas de las células en suspensión en comparación con el cultivo adherente. En este experimento, se pasó un cultivo adherente de células BG02 con ACCUTASE™ y aproximadamente 1x106 las células se colocaron en suspensión paralela o en pocillos de cultivo adherentes. Los días 1-6, se realizó el recuento de los pocillos individuales y se representó gráficamente en una escala logarítmica (Figura 18). Mientras que una mayor proporción inicial de hESC fueron viables después de 24 horas en cultivo adherente (~90 % vs ~14 %), las tasas de crecimiento fueron comparables a partir de entonces. Esto indicó que las hESC podrían proliferar tan rápidamente en cultivo en suspensión como en cultivo adherente tradicional. Los recuentos de células realizados durante el pase permiten medir la cantidad de expansión posible en este sencillo sistema de suspensión. En varios cultivos sembrados con 5x105 células, aproximadamente 107 células o más, se generaron después de 7 días. La expansión después de 7 días en cultivo en suspensión equivalía a aproximadamente una expansión de 20 veces o más, siendo la mayor expansión observada ~24x el número de células de entrada.

Ejemplo de Referencia 14 - características de células diferenciables expandidas en cultivo en suspensión Se usó RT-PCR cuantitativa (qPCR) para comparar la expresión génica en hESC cultivadas en suspensión y cultivo adherente en DC-HAIF. Los niveles comparables de OCT4, un marcador de células pluripotentes, se observaron en ambos formatos de cultivo, confirmando que los cultivos mantenidos en suspensión eran principalmente indiferenciados. SOX17, un marcador de endodermo definitivo, no se expresó en ninguna de las poblaciones de hESC. El análisis de qPCR también examinó el potencial de las hESC en suspensión para diferenciarse en endodermo definitivo, como agregados en suspensión. Las hESC adherentes y en suspensión se diferenciaron usando condiciones paralelas. Los cultivos de hESC se trataron con RPMI que contenía 2 % de BSA, 100 ng/ml de Activina A, 8 ng/ml de FGF2 y 25 ng/ml de Wnt3A durante 24 horas, seguido de 2 días en el mismo medio sin Wnt3A. La expresión de OCT4 se reguló negativamente y la expresión de SOX17 se reguló positivamente de manera similar en ambas muestras de endodermo definitivas en comparación con las hESC indiferenciadas. Este análisis de diferenciación confirmó que las hESC cultivadas en suspensión en DC-HAIF mantuvieron su potencial de diferenciación, como se evidencia por la probable formación de endodermo definitivo.

Ejemplo de Referencia 15 - adición de un inhibidor de la apoptosis en cultivo en suspensión

Para atenuar la pérdida de células después del pase inicial en suspensión, se añadió al medio un inhibidor de la apoptosis. Se realizaron pases de las células como en el Ejemplo de Referencia 12, excepto que Y-27632, un inhibidor de cinasa superhélice asociada a p160-Rho (ROCK), se añadió al medio.

Se formaron agregados en suspensión de células BG02 sembrando 2x106 células individuales en placas de 6 pocillos en 3 ml de medio DC-HAIF, a 100 rpm en una plataforma giratoria en una incubadora (Tabla 4, Experimento A). Se añadió inhibidor de ROCK Y27632 10 pM a los pocillos de ensayo durante el transcurso del experimento y los cultivos se observaron diariamente y se contaron después de 24 horas (día 1) y después de 4 o 5 días. Como se muestra en la Figura 20, la adición de Y27632 tuvo un efecto profundo en la fase de agregación inicial del cultivo en suspensión. En comparación con las células agregadas en medio sin inhibidor, se formaron agregados mucho más grandes en presencia de Y27632 (Figura 20). El recuento de células confirmó que estaban presentes más células viables en presencia de inhibidor (Tabla 4, Experimento A). Esta diferencia en el número de células persistió durante el transcurso del período de cultivo, con más células también observadas en el día 4, en comparación con cultivos sin inhibidor. Al igual que con los experimentos de cultivo en suspensión anteriores, las células expuestas a Y27632 también podrían pasarse en serie y mantenerse en un estado indiferenciado (no mostrado). Cuando los agregados se volvieron a separar, se observaron casi el doble de células con el tratamiento con Y27632 (Tabla 4 Experimento A). El análisis de RT-PCR demostró que las células BG02 cultivadas en cultivo en suspensión en presencia de Y27632 permanecían indiferenciadas (Figura 21).

Como los experimentos anteriores habían demostrado que las tasas de crecimiento de las células en suspensión y el cultivo adherente eran similares después de las primeras 24 horas, se realizó un experimento donde se retiró Y27632 después de este período inicial (Tabla 4, Experimento B). Consistente con estas observaciones anteriores, Y27632 mejoró la supervivencia inicial y la agregación de hESC después del pase inicial, pero la retirada del inhibidor después de 24 horas no afectó negativamente al número y al recuento de viabilidad de las células analizadas el día 5. Se generaron 1,4x107 (+Y27632) y 1,8x107 (+/-Y27632) células viables cuando el inhibidor estaba presente en comparación con 3,9x106 células en cultivos no tratados. Este análisis confirmó que Y27632 tuvo el mayor impacto durante las primeras 24 horas de cultivo de hESC en suspensión.

Debido a la supervivencia mejorada y la agregación observadas en presencia de Y27632, se realizó un experimento para examinar si era posible reducir el número de células usadas para sembrar cultivos en suspensión (Tabla 4, Experimento C). Los experimentos anteriores habían indicado que la siembra de células madre embrionarias a una baja densidad de aproximadamente 5x105 células por 3 ml de DC-HAIF, o menos, no funcionó bien. Para determinar si la adición de un inhibidor de ROCK permitiría la siembra celular a densidades más bajas, un intervalo de concentraciones celulares (de aproximadamente 2x106 células totales a aproximadamente 1x105 células totales se usó para sembrar cultivos en suspensión en bandejas de células de 6 pocillos en 3 ml de DC-HAIF. Se añadió Y27632 10 pM a todas las condiciones y se evaluó el número de células y la viabilidad el día 5. Se observó agregación y expansión exitosas incluso a bajas densidades de siembra. Se observó una expansión de aproximadamente 13 veces de células viables incluso en cultivos que solo se sembraron con 1x105células. La inhibición de ROCK con Y27632 facilitó por lo tanto la supervivencia inicial de hESC a densidades mucho más bajas en este sistema de suspensión.

Tabla 4 - Cultivos en sus ensión con sin un inhibidor de la a o tosis

Expt. = Experimento; p0=pase 0, p1=pase 1; N/D=no disponible; Los recuentos y porcentajes de células están redondeados a 1 y 0 decimales, respectivamente.

Ejemplo de Referencia 16 - cultivos en suspensión en diversos medios

Para determinar si las suspensiones de células ES podrían cultivarse en ausencia de FGF2 y/o Activina A, Las células ES se cultivaron en una diversidad de medios, con y sin estos factores. La Tabla 5 muestra los resultados del recuento celular de los cultivos en suspensión e indica que los cultivos en suspensión podrían expandirse con éxito en ausencia de FGF2 exógeno (condiciones HAI), así como sin FGF2 o Activina A exógenos (condiciones HI). La adición de Y27632 aumentó el rendimiento de células generadas el día 5 en todas las condiciones. Además, se realizaron pases satisfactorios de las células en cada medio sin signos morfológicos de diferenciación.

Tabla 5 - Cultivos en sus ensión en diversos medios

Ejemplo de Referencia 17: La velocidad de cizalla optimizada da como resultado una supervivencia aumentada, densidad y tamaño uniformes de los agregados de células en suspensión

Se contempla que cualquier línea celular que pueda mantenerse en un cultivo celular en suspensión se beneficiará y podrá utilizarse de acuerdo con los sistemas, métodos y equipos desvelados en el presente documento. Las células incluyen, pero sin limitación, células de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, líneas celulares humanas CyT49, CyT203, Cyt25, BG01 y BG02, líneas de células madre de ratón, de perro y de primates no humanos, así como otras.

Los resultados proporcionados en el presente documento indican que la proliferación y diferenciación celular pueden mantenerse a niveles de control o atenuarse, dependiendo de los parámetros operativos del equipo reactor, particularmente la tasa de flujo de cultivo y la fuerza de cizalla proporcionada. La fuerza de cizalla ejercida sobre el cultivo celular puede tener efectos significativos sobre la proliferación celular. Un sistema simétrico, tal como una plataforma giratoria empleada en el presente documento, proporciona una tensión de cizalla uniforme, principalmente laminar, alrededor del recipiente, mientras que un sistema y montaje asimétrico, tal como un biorreactor de tanque agitado, tiene regiones de flujo turbulento que se caracterizan por una tensión de cizalla localmente alta. Como tal, si el biorreactor o el equipo de cultivo celular no es un sistema simétrico, la dirección del flujo de cultivo afecta tanto a la naturaleza como al grado de una tensión de cizalla resultante de la rotación.

Por supuesto, las velocidades de rotación óptimas son específicas del cultivo y pueden variar dependiendo del recuento de células en el cultivo celular, la viscosidad de los medios de cultivo, el tipo de medio, la fortaleza de las células particulares en suspensión (algunas células pueden soportar un nivel más alto de fuerzas de cizalla que otras), etc. Las velocidades de rotación óptimas se determinan fácilmente para el conjunto particular de condiciones en cuestión. En particular, las velocidades de rotación descritas y contempladas en el presente documento son útiles para mantener las condiciones de flujo laminar. Por lo tanto, los experimentos descritos en el presente documento se realizaron en condiciones donde: 1) la proliferación y diferenciación celular se mantuvo en o cerca de los niveles de control; y 2) condiciones en las cuales se atenuó la proliferación y diferenciación celular. El siguiente es un método general que funciona bien para mantener cultivos agregados de células hES o cultivos agregados de células hES diferenciadas. Un experto en la materia puede optimizar el tamaño y la forma de los agregados de células basándose en la descripción proporcionada en el presente documento.

La Tabla 6 a continuación describe la velocidad y el esfuerzo de cizalla en relación con el diámetro (pm) de los agregados de células. Las células ES humanas se agregaron durante 1, 2, 3 y/o 4 días a diversas velocidades de giro usando un rotador orbital (Bamstead Lab Line Multipurpose Rotator): 60 rpm, 80 rpm, 100 rpm, 120 rpm, 130 rpm, 140 rpm, 150 rpm y 160 rpm. La Tabla 6 también demuestra que la velocidad de cizalla eficaz experimentada por los agregados de células depende del diámetro de ese agregado de células.

Tabla 6 - El tamaño de los a re ados celulares de ende de la velocidad de cizalla de la tensión de cizalla

con tinuación

Para determinar cómo la velocidad de giro controla el diámetro de los agregados de ES, los presentes inventores generaron agregados de ES por rotación a 100 rpm, 120 rpm o 140 rpm. Los diámetros de los agregados se cuantificaron a partir de imágenes de contraste de fase 5X tomadas después de 2 días en cultivo de rotación. Para el cultivo de 100 rpm, el diámetro promedio /- SD fue de 198 pm /- 21 pm. Para el cultivo de 120 rpm, el diámetro promedio /- SD fue de 225 pm /- 28 pm. Para el cultivo de 140 rpm, el diámetro promedio /- SD fue de 85 pm /-15 pm. Cada distribución de diámetro es estadísticamente significativa (p<0,001) usando ANOVA y la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. Como se muestra en la Tabla 6, la velocidad de cizalla aumenta exponencialmente de 60 rpm a 140 rpm, por ejemplo, la velocidad de cizalla para un agregado de 100 pm de diámetro fue aproximadamente 30 s-1 a 100 rpm y aproximadamente 80 s-1 a 140 rpm, que es aproximadamente un aumento de 3 veces. Normalmente, las velocidades de giro superiores a 140 rpm dieron como resultado agregados de células hES más grandes, menos uniformes. Los cultivos de agregados celulares también pueden cultivarse inicialmente a velocidades de giro reducidas, por ejemplo, de 60 rpm a 80 rpm durante aproximadamente 1 día y después se cultivan a una velocidad de giro más alta en lo sucesivo (por ejemplo, 100 rpm-140 rpm o más) sin causar ningún efecto negativo sobre el tamaño y/o la forma de los agregados celulares.

Es importante tener en cuenta, que aunque los diámetros de los agregados de células variaron de acuerdo con la velocidad de cizalla, no hubo efectos pronunciados en la expresión génica entre las diversas condiciones, es decir, diferentes velocidades de giro y/o agregados de células de diferente tamaño y forma. Esto es, los marcadores de firma observados para la hESC pluripotente o para los tipos de células derivadas de hES (por ejemplo, células de endodermo definitivo, de endodermo del intestino anterior, de endodermo PDX1, de endodermo pancreático y endocrinas) estaban en consonancia con lo descrito en D'Amour et al. citado anteriormente y solicitudes relacionadas.

Para determinar el efecto de la velocidad de giro, la velocidad de cizalla y la tensión de cizalla sobre la supervivencia celular o la viabilidad celular, se demostró que la supervivencia mejoró en un solo día a velocidades reducidas (por ejemplo, 60 rpm a 80 rpm). Por ejemplo, la supervivencia celular fue al menos del 60 % o superior a velocidades de giro entre 60 rpm y 140 rpm. Además, el número de agregados celulares fue mayor en d1, d2 y d3 en los cultivos de velocidad de giro reducida en comparación con velocidades de giro más altas (por ejemplo, 100 rpm o más). También hubo una alteración y desagregación significativa cuando los agregados celulares se cultivaron a velocidades de giro más altas (por ejemplo, 140 rpm o más). Tomados en conjunto, estos datos indicaron que la supervivencia celular aumenta cuando los agregados celulares se cultivan por primera vez durante al menos un día a una velocidad de giro reducida, sin embargo, no hubo una caída significativa en la supervivencia celular cuando las velocidades de giro se aumentaron de 100 rpm a 140 rpm; aunque, se prefiere la diferenciación a velocidades de giro inferiores a 140 rpm.

Además, el volumen del cultivo afecta a la velocidad de cizalla y a la tensión de cizalla que a su vez, como se ha indicado anteriormente, afecta a la uniformidad de tamaño y a la forma de los agregados celulares. Por ejemplo, cuando los cultivos en suspensión de células individuales se inician para formar agregados de células en 6 ml en comparación con los iniciados en 4 ml, se obtienen agregados de células de tamaño y forma más uniformes. Véase la FIGURA 23, por lo que los diámetros de los agregados celulares variaron de menos de 50 micrómetros a más de 250 micrómetros cuando se cultivaron usando 4 ml, mientras que cuando se cultivaron en 6 ml, los diámetros tenían un intervalo más estrecho y variaron de más de 50 micrómetros a menos de 200 micrómetros. Aunque los agregados celulares descritos se iniciaron a partir de cultivos en suspensión unicelulares elaborados a partir de cultivos de células hES adherentes, se esperaría que los cultivos en suspensión de agregados celulares iniciados a partir de cultivos en placa adherentes derivados de hES se comporten de manera similar. Por lo tanto, el volumen del medio es probablemente independiente de la etapa por la que se inician los cultivos en suspensión de agregados celulares.

Además, los agregados de células hES pueden cultivarse en una diversidad de condiciones de medio diferentes. Por ejemplo, los cultivos de agregados de células hES pueden mantenerse en medios que contienen StemPro®, en medios que contienen DMEM/F12; o DMEM/F12 que contiene un 20 % de medios de reemplazo de suero de inactivación génica (KSR, Invitrogen); o bien los medios StemPro® y DMEM/F12 que contienen además 20 ng/ml de FGF (R&D Systems) y 20 ng/ml de Activina A (R&D Systems); o medios StemPro® y DMEM/F12 que contienen además 10 ng/ml de Herregulina B. Alternativamente, cualquiera de los medios mencionados en el presente documento y los disponibles en el mercado también pueden complementarse con KSR exento de xeno (Invitrogen). Por último, también se produjeron y se cultivaron agregados celulares en cualquiera de los medios anteriores y además no contenían LGL exógeno.

Ejemplo de referencia 18 - los agregados de células hES en suspensión pueden diferenciarse en células de tipo de linaje endodermo

Las células madre embrionarias humanas (hES) se mantuvieron y se diferenciaron in vitro a endodermo definitivo (fase 1), endodermo del intestino anterior y endodermo PDX1 sustancialmente como se describe en D'Amour et al.

2006, citado anteriormente, y las Publicaciones de Patente de EE.UU. Números 2005/0266554, 2005/0158853, 2006/0003313, 2006/0148081,2007/0122905 y 2007/0259421.

Brevemente, las células adherentes de hES pluripotentes indiferenciadas (placa) se mantuvieron en capas alimentadoras de fibroblastos de embriones de ratón (Millipore, anteriormente Chemicon o Specialty Media) o en placas de 60 mm recubiertas con suero humano (concentración final del 0,1 al 20%; Valley Biomedical) en DMEM/F12 (Mediatech) suplementado con un 20% de reemplazo de suero de inactivación génica (Invitrogen/Gibco), aminoácidos no esenciales 1 mM (Invitrogen/Gibco), Glutamax (Invitrogen/Gibco), penicilina/estreptomicina (Invitrogen/Gibco), 0,55 mM de 2-mercaptoetanol (Invitrogen/Gibco) y 4 ng/ml a 20 ng/ml de FGF2 humano recombinante (R&D Systems). De manera alternativa, los medios anteriores pueden suplementarse con suero humano y KSR exento de Xeno (Gibco). Además, se ha añadido suero humano al cultivo después de que las hESC se hayan sembrado en placas de cultivo sin revestir. Se añadieron dosis bajas de Activina A (2-25 ng/ml, R&D Systems) al medio de cultivo de crecimiento para ayudar a mantener un crecimiento indiferenciado. La hESC pluripotente adherente en el día 0 (d0) expresa niveles altos de marcador proteico pluripotente, OCT 4. Véase la FIGURA 1, panel A, controles de placa en d0.

De nuevo, se realizaron pases de las células de forma manual o enzimática sustancialmente como se describe en D'Amour et al. 2006, citado anteriormente. Los cultivos en suspensión se disociaron y se transfirieron a un tubo cónico y se centrifugaron a 1000 rpm durante aproximadamente 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se realizó un recuento de células convencional usando un analizador de células ViCell. Los números típicos de células de una placa de 60 mm varían de 3x106 a 12x106 células, dependiendo de la línea celular y del número de días en cultivo antes del pase. Una vez que se determinó el número de células en la suspensión de células primarias, la suspensión se diluyó adicionalmente con StemPro® o medio que contenía KSR exento de xeno como se describió anteriormente hasta un volumen final de 1 x 106 células/ml. Este volumen puede aumentarse a > 4 x 106 células/ml pero puede requerir un suministro más frecuente. Se añadió el inhibidor de ROCK Y27632 (Axxora) a la suspensión celular hasta una concentración final de aproximadamente 1-15 pM, normalmente 10 pM y el tubo se mezcló mediante inversión suave. En algunos casos, no se añadió Y27632 a la suspensión para controlar la velocidad de formación de agregados. Las células resuspendidas se distribuyeron después por igual en cada pocillo de una placa de 6 pocillos de baja unión (aproximadamente 5 ml de suspensión celular por pocillo) y se colocaron en la plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm durante aproximadamente 1-4 días antes de la diferenciación.

Durante este período de cultivo, se formaron agregados de células hES y los cultivos se suministraron al menos 1­ 2 veces al día reemplazando 4 ml de medio con 4 ml de medio StemPro® reciente menos Y27632, o cualquiera de los medios descritos suplementados con KSR exento de xeno. Los intercambios de medios ("suministro") deben realizarse lo más rápidamente posible para interrumpir o impedir cualquier aglomeración y romper la tensión superficial que puede provocar que los agregados floten durante la rotación. Además, para optimizar el crecimiento y la uniformidad del tamaño y la forma de los agregados celulares, los agregados celulares no deben retirarse de la plataforma o equipo giratorio durante un largo período de tiempo. Por lo tanto, los agregados de células hES pueden producirse a partir de cultivos adherentes a células hES que han sido bien establecidos en la técnica.

Los agregados células hES ahora pueden diferenciarse directamente como agregados en suspensión y sustancialmente como se describe en D'Amour et al. 2006, citado anteriormente. Brevemente, el medio StemPro® (menos Y27632) o cualquiera de los medios descritos suplementados con KSR exento de xeno se retiró de los pocilios (por ejemplo aspirado) y los agregados de células hES se lavaron con 5 ml de RMPI sin suero (Cat. 15-040-CV; Mediatech), Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen) y Glutamax (Invitrogen) (también denominados medios RMPI, Pen/Strep y Glutamax), FBS al 0 %, PenStrep al 1 %, Glutamax al 1 %. A continuación, se volvió a colocar la placa de 6 pocillos en la plataforma giratoria durante 1-2 minutos antes de retirar el medio de lavado. Esto se repitió al menos dos veces o hasta que la insulina y/o el IGF-I se hayan retirado lo suficiente, porque aunque son necesarios para el mantenimiento de la pluripotencia y la autorrenovación de ES, los mismos factores son perjudiciales para la diferenciación controlada, sincrónica y dirigida por el linaje. La diferenciación de todos los linajes de endodermo mediante la adición y retirada de diversos mitógenos exógenos se realizó a 100 rpm sustancialmente como describen D'Amour et al. 2006, citado anteriormente, y se describe con más detalle a continuación.

Diferenciación a endodermo definitivo (fase 1)

Los agregados de células ES humanas se diferenciaron en RPMI, 100ng/ml de activina A y concentraciones variables de FBS (FBS definido US HyClone, n.° de catálogo SH30070.03) y 25 ng/ml - 75 ng/ml de Wnt3a para el primer día, y en RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax, que además contiene 100 ng/ml de activina A y concentraciones variables de FBS (HyClone) durante el segundo y tercer días (d0 a d2). En la mayoría de los experimentos de diferenciación, las concentraciones de FBS fueron del 0 % durante las primeras 24 horas (d1), el 0,2 % durante las segundas 24 horas (d2) y el 0,2 % durante las terceras 24 horas (d3), si se usó o se deseaba un protocolo de fase 1 de tres días. Preferentemente se realizó un protocolo de fase 1 de dos días.

El análisis de QPCR de agregados celulares derivados de hES en cultivo en suspensión al final de un protocolo de fase 1 de 2 días, indicó una diferenciación dirigida altamente eficiente de agregados de hES al endodermo definitivo en comparación con los controles de placa adherente. Los agregados celulares se formaron a 100 rpm, 120 rpm y 140 rpm. En algunos experimentos, los agregados derivados de hES se transfirieron a biorreactores (matraces giratorios) antes de la diferenciación. Se usaron cultivos de células hES adherentes así como cultivos de células hES diferenciadas a células de endodermo definitivo como controles. Se observaron niveles aumentados de expresión de SOX17 y FOXA2 en los agregados celulares en suspensión y el cultivo adherente y en comparación con los agregados de células hES indiferenciadas y los controles de placa adherente. Véase la FIGURA 22, paneles C (SOX17) y D (FOXA2) en la fase 1 (d2). Además, los niveles de expresión de SOX7, un gen asociado al endodermo visceral y extraembrionario contaminante, se redujeron significativamente en los agregados de células del endodermo definitivo en comparación con los controles de placa adherente del endodermo definitivo. Véase la FIGURA 22, panel L en la fase 1 (d2).

Los análisis de citometría de flujo usando la proteína CXCR4 y HNF3beta (FoxA2) indicaron que la diferenciación dirigida de agregados derivados de células ES dio como resultado agregados que eran al menos el 97 % CXCR4 positivos, al menos el 97 % HNF3beta positivos y al menos el 95 % CXCR4/HNF3beta copositivos.

Para evaluar adicionalmente la eficiencia de la diferenciación de agregados de células hES, las criosecciones de agregados de células derivadas de ES se examinaron para determinar la expresión de SOX17 y HNF3beta usando inmunocitoquímica y microscopía confocal. El análisis de imágenes de las criosecciones teñidas demostró que más del ~ 90 % de todas las células al final de la fase 1 (células endodérmicas definitivas) expresaban HNF3beta y/o SOX17.

Todos estos datos indican que puede lograrse una diferenciación altamente eficiente de las células ES como agregados celulares y, basándose en los niveles de expresión de los marcadores de endodermo definitivos, los métodos para producir endodermo definitivo como se describen en el presente documento son más eficientes en comparación con la diferenciación de cultivos en placa adherentes.

Diferenciación a células del endodermo del intestino anterior PDX1 negativas (fase 2)

Los agregados de células del endodermo humano definitivo de fase 1, se lavaron brevemente en PBS+/+ y después se diferenciaron en RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax, que contiene además 2 % de FBS y 25 ng - 50 ng/ml de KGF (R&D Systems) durante otros 2 o 3 días. En algunos experimentos se añadió SB4315425 pM (Sigma Aldrich, Inc.) o inhibidor IV de TGF-beta 2,5 pM (Calbiochem) durante el primer día de la fase 2; y alternativamente con RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax/FBS al 0,2 %/ITS (insulina/transferrina/selenio).

El análisis de QPCR se realizó sustancialmente como se ha indicado anteriormente. Se observaron niveles de expresión aumentados de HNFlbeta y HNF4alfa en los cultivos de agregados celulares en comparación con los controles de placa adherente. Véase la FIGURA 22, paneles E (HNF1B) y panel O (HNF4alfa) en la fase 2 (d5). Los métodos para producir hES de fase específica 0, 1, 2 y 5 o agregados celulares derivados de hES (o "dAggs" para agregados diferenciados) se modificaron ligeramente en el panel O. Los agregados celulares diferenciados en este contexto se refieren a cultivos de agregados celulares de hES diferenciadas o derivados de hES que se iniciaron a partir de cultivos de control de placa adherentes, de la fase correspondiente, del cual derivaron. Por ejemplo, en la fase 1, los cultivos en suspensión de agregados de células diferenciadas ("dAggs") se iniciaron a partir de una placa adherente de fase 0 y se incubaron en cualquiera de los medios descritos en el presente documento durante aproximadamente 24 h en una plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm. Estos agregados de células diferenciadas después se diferenciaron adicionalmente a las células del endodermo definitivo de la etapa 1 con los controles de placa adherentes correspondientes. La Figura 22, panel O, muestra que no hay expresión significativa de HNF4alfa (HNF4A) ni en los agregados de células diferenciadas de la fase 1 ni en los controles de placa adherente. Por el contrario, se llevó a cabo un método similar para las muestras de la fase 2 y produjo un nivel de expresión aumentada de HNF4A. La expresión de HNF4A también es fuerte para muestras de fase 5.

Además, los niveles de expresión de genes asociados al endodermo extraembrionario (SOX7) se redujeron significativamente en los cultivos de agregados de células derivadas de hES en comparación con los controles de placa. Véase la FIGURA 22, panel L en la fase 2 (d5). Por lo tanto, se demuestra que la diferenciación dirigida de las células de endodermo del intestino anterior PDX1 negativas por medio de agregados celulares en un cultivo en suspensión elimina los contaminantes del endodermo extraembrionario.

Tomados en conjunto, todos estos datos indican que la diferenciación dirigida de los agregados de células hES es altamente eficiente y basándose en los niveles de expresión de los marcadores del endodermo del intestino anterior PDX1 negativo, los métodos para producir células de endodermo del intestino anterior se mejoran en comparación con la diferenciación con cultivos en placa adherentes.

Diferenciación a células del endodermo del intestino anterior PDX1 positivas (fase 3)

Las células del endodermo del intestino anterior de la fase 2 se diferenciaron aún más en RMPI sin suero, Glutamax (Invitrogen) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen), más suplemento 0,5X de B27 (Invitrogen/Gibco) y ácido retinoico de 1 |^jM a 2 ^j M (RA, Sigma) y KAAD-ciclopamina 0,25 nM (Toronto Research Chemicals) durante 1 a 3 días; o ácido retinoico de 1 ^j M a 2 ^j M, KAAD-ciclopamina 0,25 nM más 50 ng/ml de noggina (R&D systems). De manera alternativa, se añadieron RA 0,2 ^j M a 0,5 ^j M y KAAD-ciclopamina 0,25 nM al medio durante un día. Aun así, en algunos experimentos no se añadió RA o KAAD-ciclopamina a los cultivos de agregados celulares. En otras realizaciones más, se añadieron concentraciones eficaces de 0,1 - 0,2 % de BSA.

Se observaron niveles aumentados de expresión de PDX1 en agregados de células derivadas de hES en comparación con los controles de placa adherente. Véase la FIGURA 22, panel F (PDX1) en fase 3 (d8). Además, los niveles de expresión de genes asociados al endodermo extraembrionario (SOX7) y al endodermo visceral (AFP) se redujeron significativamente en los cultivos de agregados de células derivadas de hES en comparación con los controles de placa. Véase la FIGURA 22, panel F (SOX7) y panel N (AFP) en fase 3 (d8). Por lo tanto, se demuestra que la diferenciación dirigida para producir células de endodermo del intestino anterior PDX1 positivas por medio de agregados celulares en un cultivo en suspensión elimina los contaminantes del endodermo extraembrionario.

Tomados en conjunto, estos datos indican que la diferenciación dirigida de los agregados de células hES es altamente eficiente y basándose en los niveles de expresión de los marcadores del endodermo del intestino anterior PDX1 positivo, los métodos para producir endodermo PDX1 positivo se mejoran en comparación con los controles de cultivo adherente en comparación con los controles de placa adherente.

Diferenciación a endodermo pancreático o células progenitoras endocrinas pancreáticas (fase 4)

En la fase 4, RA se retira de los cultivos de fase 3, los cultivos se lavaron una vez con DMEM más B27 (1:100 Gibco) y después el lavado se reemplazó con suplemento DMEM+1XB27 solo o con cualquier combinación de cualquiera o todos los siguientes factores: Noggina (50 ng/ml), FGF10 (50 ng/ml), KGF (25-50 ng/ml), EGF (25-50 ng/ml), FBS al 1-5 % durante 4-8 días. En los casos donde no se añadió RA, se añadió noggina a 30-100 ng/ml (R&D systems) al medio durante 1-9 días. Además, en algunos experimentos también se añadió FGF10 a 25 ng/ml.

Se observaron niveles aumentados de expresión de NKX6.1 y PDX-1 y PTF1A en los agregados derivados de células ES y los controles de placa adherentes correspondientes. Véase la FIGURA 22, panel F (PDX1), panel G (NKX6.1) y panel P (PTFA1) en fase 4 (d11). En la FIGURA 22, panel P, el gráfico de barras muestra los resultados de los métodos para determinar si hES y/o agregados de células derivadas de hES en suspensión se vieron afectados por el número de células en un cultivo de placa adherente del que derivaron. Aunque el Panel P solo muestra resultados para 1 x 107 células, los cultivos en suspensión de agregados celulares se iniciaron a partir de diversos recuentos de semillas, por ejemplo, de 1 x 106 a 2 x 107 células. Todos fueron sustancialmente similares y produjeron cultivos de agregados celulares que tenían buena viabilidad y poca muerte celular. Por ejemplo, en la fase 4, los cultivos en suspensión de agregados ("dAggs") de células diferenciadas se iniciaron a partir de una placa adherente d5 (fase 2) y se incubaron de nuevo en cualquiera de los medios descritos en el presente documento durante aproximadamente 24 h en una plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm. Estos agregados de células diferenciadas se diferenciaron a continuación en células de tipo endodermo pancreático en fase 4 que expresan PTF1A (panel P). En comparación con los correspondientes controles de placa adherente en fase 4, hubo un aumento de la expresión de PTF1A.

Además, los niveles de expresión de AFP se redujeron significativamente en los agregados de células derivadas de hES en comparación con los controles de placa adherente. Véase la FIGURA 22, panel L en fase 4 (d11). Por lo tanto, se demuestra que la diferenciación dirigida para producir células del endodermo pancreático PDX1 positivas por medio de agregados celulares en un cultivo en suspensión elimina los contaminantes del endodermo visceral. El análisis de citometría de flujo con NKX6.1, proteína HNF3beta y Cromogranina (CHG) indicó que la diferenciación dirigida de los agregados de células derivadas de hES dio como resultado agregados de células que eran al menos el 53 % de CHG positivas, al menos el 40 % de NKX6.1 y CHG copositivas y una pequeña cantidad de HNF3beta y otros tipos de células.

Se examinaron las criosecciones de agregados derivados de hES para la expresión de NKX6.1, PDX1 y NKX2.2 mediante inmunocitoquímica y microscopía confocal al final de la fase 4. El análisis de imágenes indicó una diferenciación altamente eficiente de células agregadas al endodermo pancreático (o endodermo pancreático PDX1 positivo), expresando casi todas las células PDX1 y una gran población de células expresando NKX6.1 (aproximadamente el 40 % de las células) y/o NKX2.2 (aproximadamente el 40 % de las células).

Diferenciación a células endocrinas que expresan hormonas (fase 5)

Para la diferenciación de la fase 5, los agregados de células diferenciadas de la fase 4 continuaron en cualquiera de CMRL (Invitrogen/Gibco) o RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax, y suplemento de B27 0,5X. En algunos experimentos, los medios también se suplementaron con suero humano (Valley Biomedical) o suero bovino fetal en concentraciones que variaban del 0,2-5 % durante la fase 5.

De nuevo, similar a los tipos de células de las fases 2-4, se observó una expresión aumentada de genes asociados al tipo específico de célula en comparación con los controles de placa adherente. Por ejemplo, se observó el aumento de los niveles de expresión de las hormonas insulina (INS), glucagón (GCG) y somatostatina (SST). Véase la FIGURA 22, panel I (INS), panel J (GCG) y panel K (SST) en fase 5 (d15). Además, los niveles de expresión de AFP y ZIC1, un gen asociado al ectodermo, se redujeron significativamente en los agregados de células derivadas de hES en comparación con los controles de placa adherente. Véase la FIGURA 22, panel M (ZIC1) y panel N (AFP) en fase 5 (d15). Por lo tanto, se demuestra que la diferenciación dirigida para producir células endocrinas pancreáticas por medio de agregados celulares en cultivo en suspensión retira los contaminantes del ectodermo y del endodermo visceral.

La producción de células agregadas endocrinas que expresan hormona derivada de hES se confirmó mediante análisis de citometría de flujo el Día 23 del protocolo descrito. Los agregados se formaron inicialmente a 140 rpm en 5 ml de DMEM/F12, que comprende alternativamente reemplazo de suero de inactivación génica (KSR; Gibco/Invitrogen comparar 0063 en cuanto a consistencia) o KSR exento de xeno (Invitrogen) y luego se diferencian a 100 rpm. El análisis de la expresión de proteínas NKX6.1, Cromogranina A, insulina, glucagón y somatostatina indica que los agregados derivados de células ME están compuestos por un -20 % de epitelio pancreático NKX6.1+/Cromogranina A- y un -74% de tejido endocrino de Cromogranina A+. Además, el 11 % de las células expresan insulina, el 14% expresa glucagón y el 11 % expresa somatostatina. De estos, el 68% de las células insulina+ son positivas únicas, el 70 % de las células glucagón+ son positivas únicas y el 52 % de las células somatostatina positivas son positivas únicas. Este grado de positividad de una sola hormona excede los valores descritos para cultivos adherentes que eran en su mayoría células polihormonales.

Para evaluar más a fondo la eficiencia de la diferenciación de agregados a células endocrinas que expresan hormonas, se examinaron las criosecciones de agregados derivados de ES para la expresión de glucagón, insulina y somatostatina mediante inmunocitoquímica y microscopía confocal durante la fase 5. El análisis de imágenes de criosecciones a 20X indica una diferenciación altamente eficiente de células agregadas a positividad hormonal, expresando casi todas las células glucagón, somatostatina o insulina. Además, a diferencia de los experimentos de cultivos adherentes previos, la mayoría de las células en el agregado parecen expresar una sola hormona, como se produce in vivo durante el desarrollo.

Ejemplo de Referencia 19 - los cultivos adherentes de diversas fases pueden formar agregados celulares y diferenciarse en células de tipo endodermo pancreático

Lo siguiente demuestra que la producción de agregados de células derivadas de hES puede iniciarse no solo a partir de hESC pluripotente, sino que los agregados celulares pueden iniciarse directamente en un medio de diferenciación (agregados de células del día 0), así como a partir de células diferenciadas o derivadas de hES, por ejemplo, los agregados celulares pueden producirse a partir de las fases 1,2, 4 y 5 o células derivadas de hES.

Agregados celulares del día 0

Agregados celulares producidos el primer día (d0) de la fase 1: Se cultivaron hESC pluripotentes adherentes, se realizaron pases manual o enzimáticamente, se disociaron, se contaron, se sedimentaron y el sedimento se resuspendió a un volumen final de aproximadamente 1 x 106 células/ml a 4 x 106 células/ml en medios de diferenciación base que contienen RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax, y además contienen 100 ng/ml de activina A y 25 ng/ml - 75 ng/ml de Wnt3a, FBS al 0,2 % (Hyclone). Este volumen puede aumentarse a > 4 x 106 células/ml pero puede requerir un suministro más frecuente. A veces, se incluyó DNasa a una concentración de 10-50 ng/ml.

En algunos casos, se añadió el inhibidor de ROCK Y27632 (Axxora) a la suspensión celular hasta una concentración final de 1-15 ^j M, normalmente 10 ^j M. En otros casos más, se añadió a los cultivos aproximadamente 1:2000 a 1:5000 de ITS (insulina/transferrina/selenio, Gibco). Se añadieron tanto el inhibidor de Rho-cinasa como ITS para soportar la supervivencia celular. Las células resuspendidas se distribuyeron por igual en cada pocillo de una placa de 6 pocillos de baja unión, sustancialmente como se describió anteriormente, y se colocaron en la plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm durante la noche. Durante este período de cultivo, se formaron agregados celulares de tamaño y forma uniformes. En consecuencia, los cultivos de densidad más alta se enriquecieron eficazmente o se enriquecieron sustancialmente para el endodermo pancreático PDX1 positivo o las células de tipo progenitor pancreático PDX positivo. Los detalles adicionales se proporcionan en Ejemplo de Referencia 21.

Los agregados celulares producidos en d0 de la fase 1, después se suministraron hasta 1-2X al día con más medios de diferenciación que contenían RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax y que contenían además 100 ng/ml de activina A y FBS al 0,2 % (HyClone) durante los siguientes 2-3 días. Las etapas posteriores (fases 2-5) del protocolo son sustancialmente como se describió anteriormente para los agregados de ES.

Fase 1 - día 2 al día 3

Agregados celulares producidos en d2-d3 de la fase 1: Las hESC adherentes se cultivaron y se realizaron pases sustancialmente como se describe anteriormente y después se diferenciaron a la fase 1 sustancialmente como se describe en D'Amour et al. 2006, citado anteriormente.

Los cultivos adherentes al final de la fase 1 (aproximadamente d2 o d3 en el protocolo de diferenciación; células de tipo endodermo definitivo) se lavaron 1x con PBS-/- y se disociaron en células individuales con 2 ml de Accutase precalentado durante aproximadamente 2-5 minutos a 37 °C usando una pipeta de 1 ml o 5 ml. Después se añadieron 4 ml de FBS al 10 % en RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax y la suspensión de células individuales se filtró a través de un filtro azul de 40 micrómetros (BD Biosciences) en un tubo cónico de 50 ml. Las células se contaron y se sedimentaron (centrifugaron) sustancialmente como se describió anteriormente.

A continuación, el sedimento celular se resuspendió en RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax, que contiene además FBS al 2%, más DNasa (50-100 jg/ml, Roche Diagnostics) y 100 ng/ml de activina A. Alternativamente, el sedimento celular se resuspendió en RMPI, medio Pen/Strep y Glutamax, más FBS al 2 % y DNasa (50-100 jg/ml), 25 ng - 50 ng/ml de KGF (R&D Systems). En algunos experimentos se incluyó SB4315425 ^j M (Sigma Aldrich, Inc.) o inhibidor IV de TGF-beta 2,5 ^j M (Calbiochem) con el KGF). En algunos experimentos se incluyó Y27332 (10 ^j M). Las células resuspendidas se distribuyeron por igual en cada pocillo de una placa de 6 pocillos de baja unión, sustancialmente como se describió anteriormente, y se colocaron en la plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm durante la noche, durante ese tiempo se formaron agregados celulares de tamaño y forma uniformes.

Los agregados celulares producidos al final de la fase 1 después se diferenciaron adicionalmente. Las etapas posteriores (fases 2-5) del protocolo son sustancialmente como se describió anteriormente para los agregados de ES en los Ejemplos de Referencia 17 y 18.

Fase 2 - día 5 al día 6

Agregados celulares producidos en d5-d6 en la fase 2: Las hESC adherentes se cultivaron y se realizaron pases sustancialmente como se describe anteriormente y después se diferenciaron a la fase 2 sustancialmente como se describe en D'Amour et al. 2006, citado anteriormente. Para la fase 2, las células adherentes de la fase 1 se lavaron brevemente en PBS+/+ y después se diferenciaron adicionalmente en RPMI suplementado con FBS al 2%, Glutamax, penicilina/estreptomicina y 25 ng - 50 ng/ml de KGF (R&D Systems) durante 3 días. En algunos experimentos se añadió SB431542 5 ^j M (Sigma Aldrich, Inc.) o inhibidor IV de TGF-beta 2,5 ^j M (Calbiochem) durante el primer día de la fase 2.

Los cultivos adherentes al final de la fase 2 (aproximadamente d5 o d6 en el protocolo de diferenciación; células de tipo intestino anterior) se disociaron en células individuales, se contaron y se sedimentaron sustancialmente como se describió anteriormente. A continuación, se resuspendió el sedimento celular en un medio de diferenciación que contenía DMEM, medio Pen/Strep y Glutamax, que contenía además 1X suplemento B27 y DNasa (50 - 100 jg/ml, Roche Diagnostics) y sin FBS o FBS al 1-2 % o 0,5 %-10 % de suero humano (hS) y ácido retinoico de 1 ^j M a 2 ^j M (RA, Sigma) y KAAD-ciclopamina 0,25 nM (Toronto Research Chemicals); o ácido retinoico de 1 j M a 2 j M, KAAD-ciclopamina 0,25 nM más 50 ng/ml de noggina (R&D systems); o KAAD-ciclopamina 0,25 nM más 100 ng/ml de noggina; o 100 ng/ml de noggina; o de 0,2 ^j M a 0,5 ^j M de RA y KAAD-ciclopamina 0,25 nM; o de 0,2 ^j M a 0,5 ^j M de RA y KAAD-ciclopamina 0,25 nM de más 50 ng/ml de noggina. En algunos experimentos se incluyó Y27332 (10 jM).

Las células resuspendidas se distribuyeron por igual en cada pocillo y se colocaron en la plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm durante la noche, durante ese tiempo se formaron agregados celulares de tamaño y forma uniformes.

Los agregados celulares producidos al final de la fase 2 se diferenciaron adicionalmente en la plataforma giratoria y se suministraron 1-2X al día durante 0-2 días adicionales con DMEM, medio Pen/Strep y Glutamax, que contiene además 1X suplemento B27, ácido retinoico 1 pM a 2 pM (RA, Sigma) y KAAD-ciclopamina 0,25 nM (Toronto Research Chemicals); o ácido retinoico de 1 pM a 2 pM, KAAD-ciclopamina 0,25 nM más 5o ng/ml de noggina (R&D systems); o KAAD-ciclopamina 0,25 nM más 100 ng/ml de noggina; o 100 ng/ml de noggina; o de 0,2 pM a 0,5 pM de RA y KAAD-ciclopamina 0,25 nM; o de 0,2 pM a 0,5 pM de RA y KAAD-ciclopamina 0,25 nM de más 50 ng/ml de noggina.

Los agregados celulares producidos al final de la fase 2 después se diferenciaron adicionalmente a las fases 3, 4 y 5 sustancialmente como se describió anteriormente.

Fases 4 y 5 -día 10 al día 30

Agregados celulares producidos en d10-d14 en la fase 4: De nuevo, las hESC adherentes se cultivaron y se realizaron pases sustancialmente como se describe anteriormente y después se diferenciaron a la fase 2 sustancialmente como se describe anteriormente y en D'Amour et al. 2006, citado anteriormente.

Para la fase 3, las células adherentes de la fase 2 se diferenciaron adicionalmente en DMEM, medio Pen/Strep y Glutamax, que contiene además 1X suplemento B27 y RA 1 pM a 2 pM y KAAD-ciclopamina 0,25 nM durante 1 a 3 días. En otros casos, se añadieron 50 ng/ml de noggina junto con ^rA y KAAD-ciclopamina. De manera alternativa, se añadieron 0,2 pM a 0,5 pM de RA y 0,25 nM de KAAD-ciclopamina al medio durante solo un día. Aun así, en otros experimentos no se añadió RA o KAAD-ciclopamina en ningún día. En la fase 4, las células se suministraron 1-2X al día con DMEM suplementado con Glutamax, penicilina/estreptomicina y 1X suplemento B27. Las células de fase 4 pueden diferenciarse adicionalmente a células de fase 5 como ya se describió en los Ejemplos de Referencia 17 y 18.

Los cultivos adherentes en cualquiera de fase 4 (aproximadamente d10 - d14 en el protocolo de diferenciación; células epiteliales pancreáticas y de tipo endocrino) o fase 5 (aproximadamente día 16 al día 30 en el protocolo de diferenciación; precursores endocrinos y células endocrinas) se disociaron de manera similar en células individuales, se contaron y se sedimentaron. El sedimento celular se resuspendió después en DMEM CMRL suplementado con Pen/Strep y Glutamax, y 1X suplemento B27 y DNasa (50-100 pg/ml, Roche Diagnostics) y FBS al 0-2%. En algunos experimentos se incluyó Y27332 (10 pM) que soportó la supervivencia celular. Las células se distribuyeron por igual en placas de 6 pocillos y se colocaron en una plataforma giratoria de 100 rpm a 140 rpm de 4 horas a toda la noche, sustancialmente como se describió anteriormente.

Adicionalmente, los agregados celulares producidos en la fase 2 y en la fase 5 como en los Ejemplos de Referencia 17-19 se enriquecieron eficazmente para los tipos de células pancreáticas en comparación con los cultivos en placa adherentes de los que derivaron. Por ejemplo, en un experimento típico, los agregados celulares producidos en la fase 2 y analizados por citometría de flujo en la fase 4 consistieron en al menos el 98 % de tipos de células pancreáticas (el 73 % de células endocrinas Cromogranina A positivas y el 25 % de endodermo pancreático (PE) Nkx6.1 positivo) y el 2 % de tipos de células no pancreáticas; mientras que los cultivos en placa adherentes de los que derivaron los agregados celulares consistieron en aproximadamente el 73 % de tipos de células pancreáticas (el 33% de células endocrinas Cromogranina A positivas y el 40% de PE Nkx6.1 positivas) y el 27% de tipos de células no pancreáticas. Por lo tanto, la agregación en la fase 2 puede enriquecer eficazmente los progenitores que dan lugar a tipos de células pancreáticas y agotarse para los tipos de células no pancreáticas. De forma similar, en un experimento típico, los agregados celulares producidos en la fase 5 y analizados por citometría de flujo consistieron en al menos el 75 % de tipos de células endocrinas positivas para Cromogranina A, mientras que el cultivo en placa adherente del que derivaron los agregados celulares consistió en aproximadamente el 25 % de tipos de células endocrinas positivas para Cromogranina A. Por tanto, la agregación en la fase 5 puede enriquecer eficazmente las células endocrinas pancreáticas.

Los métodos descritos en el presente documento, por lo tanto, proporcionan métodos para mejorar no solo la eficiencia de la diferenciación dirigida de hESC en suspensiones de agregados celulares, sino que también proporciona métodos para reducir los tipos de células pancreáticas derivadas de hES (o agregados) que tienen poblaciones contaminantes (por ejemplo, ectodermo, trofoectodermo, endodermo visceral y endodermo extraembrionario) y al mismo tiempo el enriquecimiento de los tipos de células pancreáticas (por ejemplo, endodermo pancreático y células endocrinas).

Ejemplo de Referencia 20 - La densidad celular afecta al resultado de la diferenciación celular de hES Lo siguiente demuestra que las variaciones en las densidades celulares afectan a los resultados de la diferenciación dentro de un medio y una condición de factor de crecimiento dados. Los resultados de la eficiencia de diferenciación que resultan de los ajustes en la densidad celular reflejan concentraciones variables de moléculas de señalización producidas endógenamente y el efecto dependiente de la concentración de estas moléculas para influir en la diferenciación celular.

Los agregados de células ES humanas y agregados de células derivadas de hES, incluyendo agregados de células d0 producidos directamente en medios de diferenciación, se generaron sustancialmente como se describió anteriormente. Después de aproximadamente cinco (5) días de diferenciación a través de las fases 1 y 2, los agregados de células diferenciadoras se combinaron y se volvieron a dividir en alícuotas en pocillos individuales a diferentes densidades de siembra, por ejemplo, se sembró una suspensión de 28 ml de suspensión de agregados celulares en fase de endodermo del intestino anterior o se volvieron a tomar alícuotas de 4, 6, 8 o 10 ml por pocillo (un intervalo de densidades celulares de 2,5 veces). Esta distribución celular se llevó a cabo por duplicado y un conjunto de pocillos se suministró con un medio de fase 3 (DMEM/PenStrep/Glutamax suplemento B27 al 1 % (vol/vol) KAAD-ciclopamina 0,25 uM TTNPB 3 nM) que contenía noggina a 50 ng/ml y el otro conjunto de pocillos contenían noggina a 25 ng/ml. La fase 3 continuó durante 3 días con intercambio de medios diario. Se tomaron muestras de células por duplicado para el análisis de QPCR en tiempo real al final de los tres días de la fase 3 (o aproximadamente el día 8) y nuevamente después de la fase 4 (o aproximadamente el día 14).

La densidad celular y la concentración de noggina usadas durante la fase 3 tuvieron efectos diferentes sobre la expresión de aquellos genes que son indicativos de progenitores del endodermo pancreático y/o progenitores o precursores endocrinos. Brevemente, existe una relación lineal entre el aumento de la densidad celular y el correspondiente aumento de los tipos de células progenitoras pancreáticas (por ejemplo, endodermo pancreático, epitelio pancreático, endodermo pancreático PDX1 positivo). Por ejemplo, después de la fase 3 (o el día 8), un aumento en la densidad celular tuvo un aumento correspondiente en el número de células de los progenitores pancreáticos como lo indica la expresión génica mejorada de PDX1 y NKX6-1. Véanse las FIGURAS 24A y 24B. Por el contrario, hubo una relación inversa entre el aumento de la densidad celular y la correspondiente reducción de los tipos de células progenitoras endocrinas después de la fase 4 (o el día 14). Por ejemplo, a medida que disminuía la densidad celular, se reducía la expresión de al menos NGN3 y NKX2-2 después de la fase 3 (o el día 8). Véanse las FIGURAS 24C y 24D.

No obstante, las concentraciones más bajas de noggina (por ejemplo, 25 ng/ml) a cualquier densidad celular dada dieron como resultado tipos de células progenitoras endocrinas reducidos como se indica por la expresión reducida de NGN3 y NKX2-2. Véanse las FIGURAS 24C y 24D. Este efecto independiente de la densidad celular de la noggina en los cultivos celulares sugiere que las señales de BMP producidas de forma endógena de las células son antagonizadas por la noggina añadida exógenamente. Es probable que el impacto de las señales producidas de forma endógena en el resultado de la diferenciación no se limite solo a las BMP, sino que otros factores de crecimiento y/o agentes secretados por las células al medio pueden tener efectos similares o contrastantes, solos o en combinación con factores y/o agentes de crecimiento exógenos.

Ejemplo de referencia 21 - Optimización de cultivos en suspensión de agregados celulares para generar endodermo pancreático enriquecido o tipos de células endocrinas

La composición celular de las poblaciones de agregados de células derivadas de hES se optimiza para determinados tipos de células controlando la concentración de diversos factores y/o agentes de crecimiento. Las composiciones de células pancreáticas descritas en el presente documento fueron suspensiones de agregados de células derivadas de hES que se prepararon a partir de cultivos en suspensión de células individuales, que derivaron de cultivos adherentes de células hES, agregados de células d0 (agregados de células iniciados a partir de cultivos adherentes a hES pero directamente en un medio de diferenciación y no un medio de células madre pluripotentes), o de cultivos adherentes a células derivadas de hES en diversas fases de diferenciación sustancialmente como se describe en los ejemplos anteriores. Durante la fase 4, los agregados celulares se expusieron a diferentes concentraciones de los factores: NOGGINA (N), KGF (K), FGF10 (F) y EGF (E). La composición celular de los agregados de células hES diferenciadas se evaluó mediante análisis de citometría de flujo usando un panel de marcadores que incluía CHGA, NKX6.1 y PDX1. El porcentaje total de células endocrinas, células del endodermo pancreático, células del endodermo PDX1+ y células no pancreáticas en cualquier población celular se muestran en la Tabla 6.

Los datos de la Tabla 6 demuestran que al controlar la concentración y las proporciones de determinados factores de crecimiento, la composición resultante puede optimizarse para determinados tipos de células. Por ejemplo, el porcentaje de células de tipo endodermo pancreático aumentó en comparación con las células de tipo endocrino disminuyendo la concentración de KGF y EGF (por ejemplo, K(25)E(10) y el 71 % frente al 22,1 %). Por el contrario, altas concentraciones de KGF y EGF y la inclusión de Noggina y FGF10 (por ejemplo, N(50)F(50)K(50)E(50)) disminuyeron el número de células de tipo endodermo pancreático, siendo el número total comparable al de las células de tipo endocrino (por ejemplo, el 39,6 % frente al 40,1 %). Noggina y KGF en concentraciones más altas (por ejemplo, N(50)K(50)) o sin añadir factor de crecimiento aumentaron la población de células de tipo endocrino en la población resultante en comparación con los tipos de células de endodermo pancreático. Además, el porcentaje de tipos de células no pancreáticas (es decir, células de tipo no PDX1 positivas) puede reducirse significativamente reduciendo los niveles de KGF y EGF (por ejemplo, K(25)E(10); 1,51 %) o sin añadir factor de crecimiento (1,53 %). Por lo tanto, la Tabla 7 demuestra claramente que al menos variar las concentraciones de diferentes factores de crecimiento en el medio de cultivo en determinadas fases de diferenciación (por ejemplo, fase 4) aumenta significativamente y/o disminuye determinadas poblaciones de endodermo pancreático, endocrino, endodermo PDX1 positivo o tipos de células no pancreáticas.

Tabla 7 - Los efectos de los factores de crecimiento sobre la com osición celular

Aún existen otros métodos para enriquecer o purificar en tipos particulares de células derivadas de hES como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. 12/107.020, titulada METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HESC, presentada el 8 de abril de 2008. Esta solicitud describe métodos para enriquecer diversos tipos de células hES incluyendo todos los tipos de células que resultan en cada una de las fases 1, 2, 3, 4 y 5 como se describe en D'Amour. et al. 2005, citado anteriormente y 2006, citado anteriormente. La solicitud usa diversos anticuerpos que incluyen pero no se limitan a CD30, CD49a, CD49e, CD55, CD98, CD99, CD142, CD165, CD200, CD318, CD334 y CD340.

Los métodos para enriquecer las células derivadas de hES o los agregados celulares no se limitan a métodos que emplean medios de afinidad de anticuerpos, sino que pueden incluir cualquier método que esté disponible o sea bien conocido por un experto en la materia que permita el enriquecimiento de un cierto tipo de célula. El enriquecimiento puede lograrse agotando o separando un tipo de célula de otro tipo de célula o cultivo.

Ejemplo de Referencia 22 - Suspensiones de agregados celulares de endodermo pancreático maduran in vivo y responden a la insulina

Para demostrar que los métodos para preparar y fabricar suspensiones de agregados celulares como se describe en el presente documento, células progenitoras pancreáticas que funcionan in vivo, los agregados de células derivadas de hES anteriores en los Ejemplos de Referencia 17-21 (por ejemplo, endodermo PDX1 positivo, endodermo pancreático, epitelio pancreático, precursores endocrinos, células endocrinas y similares) se han trasplantado a animales. Los métodos de trasplante en animales normales e inducidos con diabetes, la determinación de sensibilidad a la glucosa in vivo de los animales y, por lo tanto, la producción de insulina de las células maduras trasplantadas in vivo, se realizaron sustancialmente como se describe en Kroon et al. 2008, citado anteriormente y la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 11/773.944, titulada METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, presentada el 5 de julio de 2007. Se observaron niveles sustancialmente similares de péptido C humano en el suero de estos animales en períodos de tiempo similares como se indica en Kroon. et al. 2008, citado anteriormente y la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 11/773.944, citado anteriormente.

Los métodos, las composiciones y los dispositivos descritos en el presente documento son actualmente representativos de métodos, composiciones y dispositivos preferidos y son ilustrativos y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención. Los cambios, alternativas, modificaciones y variaciones en los mismos y otros usos se les ocurrirá a aquellos expertos en la materia.

Se aprecia que determinadas características desveladas en el presente documento, que son, para mayor claridad, descritas en el contexto de los ejemplos separados, también pueden proporcionarse en combinación en un ejemplo único. Por ejemplo, pueden generarse y optimizarse métodos para fabricar agregados de células derivadas de hES en suspensión para producir cualquier tipo de célula de linaje de endodermo, por ejemplo, una célula de tipo de linaje pancreático, una célula de tipo de linaje hepático, una célula de tipo de linaje epitelial, una célula de linaje de tiroides y una célula de linaje de timo y, por lo tanto, no se limita a los tipos de células derivadas de hES descritos específicamente en las mismas. A la inversa, diversas características desveladas en el presente documento, que son, por brevedad, descritas en el contexto de un ejemplo único, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Por ejemplo, es evidente para un experto en la materia que los métodos descritos para generar hES y agregados celulares derivados de hES a partir de cultivos en placa adherentes o de suspensión, de cultivos en placa adherentes indiferenciados o de suspensión, y de cultivos en placa adherentes diferenciados o de agregados celulares en suspensión son solo ejemplos, pero también puede emplearse una combinación de los métodos.

Ejemplo de Referencia 23 - Criopreservación y banco de células madre pluripotentes humanas y células progenitoras pancreáticas

Los cultivos de células hES adherentes se obtuvieron de acuerdo con el protocolo de pase descrito en el Ejemplo de Referencia 24, se agruparon y se contaron. Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de cultivo de hESC al 50 % precalentado (sin factores de crecimiento) / suero humano al 50 %. Se añadió gota a gota un volumen igual de aproximadamente 80 % de medio de cultivo de hESC (sin factores de crecimiento) / 20 % de DMSO, con agitación en remolinos. Se distribuyó 1 ml de células en crioviales de 1,8 ml para congelar a -80 °C en recipientes Nalgene Mr.Frosty durante aproximadamente 24 horas, antes de transferir N² líquido. Se llevaron a cabo métodos sustancialmente similares en GMPc.

Los métodos anteriores describen la criopreservación de células madre pluripotentes o diferenciables. La criopreservación de células diferenciadas de células madre pluripotentes, por ejemplo, células progenitoras pancreáticas, se describió anteriormente en detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 12/618.659, titulada ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS, presentada el 13 de noviembre de 2009.

Ejemplo de Referencia 24 - Cultivo adherente, Pase y expansión de células madre pluripotentes humanas indiferenciadas en diversos recipientes de cultivo, incluyendo frascos rodantes

Un cuello de botella importante para la fabricación de un producto de terapia celular basado en agregados celulares, en particular uno derivado de células madre pluripotentes humanas, es la formación del agregado celular tridimensional en suspensión. Específicamente, el cuello de botella es tomar células madre pluripotentes adherentes a monocapa y convertirlas en agregados de células madre pluripotentes, es decir, cultivos de agregados en suspensión. Como se ha descrito anteriormente, pueden formarse agregados de células hES en bandejas de 6 pocillos, por ejemplo, y posteriormente diferenciarlos en bandejas de 6 pocillos u otros formatos de recipientes de cultivo, por ejemplo, biorreactores, frascos y similares. Las realizaciones de la invención descritas en los siguientes Ejemplos, proporciona métodos para el crecimiento, el pase y la expansión de células madre pluripotentes como agregados celulares en suspensión, así como para diferenciar los agregados celulares en frascos rodantes. Véase el Ejemplo de Referencia 25.

Cultivo y expansión de células madre pluripotentes humanas. Tras descongelar, o en pases regulares, las hESC disociadas se sembraron en placas a 50.000 o 33.000 células/cm2 para ciclos de crecimiento de tres y cuatro días, respectivamente, en diferentes recipientes de cultivo celular. El medio de crecimiento de hESC (XF HA) consistía en DMEM/F12 que contenía GlutaMAX, suplementado con 10 % v/v de reemplazo de suero de inactivación génica exento de Xeno, aminoácidos no esenciales al 1 % v/v, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, penicilina/estreptomicina al 1 % v/v, herregulina-1p 10 ng/ml y activina A 10 ng/ml. Solo el día de la siembra en placa (tratamiento de un día), la unión celular se facilitó al incluir aproximadamente un 10% (vol/vol) de suero AB humano no inactivado por calor (Valley Biomedical) simultáneamente con la adición de medio de cultivo exento de xeno como se describió anteriormente. Se usó un volumen de siembra en placa estandarizado de 0,2 ml/cm2 para diferentes placas de cultivo tisular, frascos en T y fábricas de células como se describe al menos en la Tabla 8 a continuación. El volumen de medio de cultivo utilizado se aumentó por cada día adicional de suministro y también se indica en la Tabla 8.

Tabla 8: Cultivo y expansión de cultivos de células hES adherentes Tipo de recipiente 60 mm T75 T175 Triple T175 2 pilas 5 pilas

S.A. 19,6 cm2 80 cm2 175 cm2 525 cm2 1272 cm2 3180 cm2 S ie m bra en p laca 4 16 35 105 260 650

d1 5,5 22 50 150 350 875

d2 7 28 60 180 450 1100

d3 8,5 35 80 240 550 1350

V o lú m e n e s en ml; SA: á rea de la superfic ie .

Pase de células madre pluripotentes humanas. El día del pase, los cultivos se suministraron con medio de crecimiento reciente y se cultivaron durante 4-8 horas antes de la disociación. Los cultivos se lavaron con PBS (Life Technologies) y se disociaron durante 6 minutos a aproximadamente 37 °C usando ACCUTASE precalentado (Innovative Cell Technologies). En algunos experimentos se añadió ACCUTASE y después se aspiró inmediatamente (es decir, menos de 4-6 minutos), de tal manera que se logró la disociación celular en el reactivo residual, a un volumen de trabajo mínimo, que se prefiere cuando se trabaja con determinados recipientes de cultivo, incluyendo fábricas de células, para minimizar el número de etapas de intercambio de medios. Después de la exposición a ACCUTASE, se añadió un volumen 3x de medio hESC frío (sin herregulina o activina) y las células se disociaron y recogieron. Las células disociadas se recogieron suavemente usando 3x el volumen de medio hESC frío (sin herregulina ni activina), se contaron usando un contador celular automático ViCell (BD Biosciences) o un hemocitómetro, se centrifugaron durante 5 minutos a 200 x g y el sedimento celular se resuspendió en medio de crecimiento reciente a 1-10 x 106 células/ml para la posterior siembra en placa en las mismas condiciones de cultivo.

La Tabla 8 describe una diversidad de recipientes de cultivo y volúmenes de medios que se han usado, sin embargo, el experto en la materia apreciará que, para el crecimiento, la realización de pases y la expansión de células madre pluripotentes humanas, pueden usarse otros recipientes de cultivo no descritos específicamente, basándose en las descripciones detalladas descritas en el presente documento. Por ejemplo, véase el Ejemplo de Referencia 25 en cuanto a métodos de diferenciación de la suspensión en un frasco rodante.

En algunos estudios, las hESC de pases se añadieron a recipientes de cultivo en bandeja de 6 pocillos nuevos y no revestidos, sin fijación celular y se hicieron girar para formar agregados, como se describió anteriormente. Normalmente, se usó medio StemPro® hESC SFM (Life Technologies) suplementado con herregulina-1p 10 ng/ml y activina A 10 ng/ml o medio XF-HA, para el cultivo en suspensión de hESC. El cultivo celular se realizó en incubadoras humidificadas a 37 °C y de CO2 al 8 %.

Para probar la agregación de células madre pluripotentes en un formato de frasco rodante, las suspensiones unicelulares de 106 hESC/ml se prepararon sustancialmente como se describe anteriormente para la agregación de hESC de cultivos de hESC adherentes o directamente a partir de viales de células congeladas que se descongelaron, se lavaron y se suspendieron en medio de cultivo, se colocaron en diferentes recipientes, cada uno con una forma tubular que podía girarse mientras se colocaba de lado. Se colocaron tubos de 50 ml que contenían 10 ml de suspensión celular y frascos de 150 ml que contenían 30 ml o 120 ml de suspensión celular en un horno de hibridación a aproximadamente 37 °C y se hicieron girar a aproximadamente 5 rpm. La rotación se logró usando un rotador mecánico de frascos incorporado de velocidad variable. En los estudios iniciales, los hornos no fueron gaseados con CO2. Para fines de control de agregación celular, se realizaron estudios simultáneos usando bandejas de 6 pocillos. Basándose en el diámetro y la morfología del agregado, los agregados de células madre pluripotentes se formaron con éxito en el formato de frasco rodante y en el formato de bandeja de control de 6 pocillos. También se formaron agregados de células madre pluripotentes en experimentos previos usando botes de plástico. Estos estudios demostraron que la agregación podría proceder de manera eficaz en un formato de recipiente que era completamente diferente al cultivo rotacional en bandejas de 6 pocillos, con respecto a la velocidad, forma de los recipientes y dinámica de fluidos. Adicionalmente, este formato de frasco rodante probablemente sería escalable sin una optimización sustancial de los métodos descritos en el presente documento, para evitar un área crítica de cuello de botella.

Ejemplo de Referencia 25 - Agregación y diferenciación de células madre pluripotentes en frascos rodantes

Las células madre embrionarias humanas (Ejemplo de Referencia 24) se agregaron en frascos de 150 ml y se diferenciaron en progenitores pancreáticos (o ^p E^c ) usando el protocolo de diferenciación de las fases 1-4 del solicitante, como se describió anteriormente. Se sembraron frascos rodantes de 150 ml con 120 ml de suspensión celular de densidades celulares de 1 x 106 células/ml o 2 x 106 células/ml en medio StemPro® hESC SFM o medio XF HA; véase la Tabla 9. Las condiciones de los medios de las fases 1-4 fueron sustancialmente como las descritas previamente (véase Schulz et al. (2012) citado anteriormente), que se resumen en la Tabla 9. Las velocidades de rotación de aproximadamente 5 rpm, 8 rpm, 10 rpm o 12 rpm se probaron a lo largo de la agregación de hESC y no se incorporó en la incubadora la diferenciación de las fases 1-4 y la gasificación con CO2. La gasificación con CO2 puede depender de las tapas que se usen con los frascos rodantes, por ejemplo, tapas de tapón, tapas ventiladas o no ventiladas. La Figura 25 muestra el tamaño promedio del diámetro de los agregados de células formados durante la agregación y diferenciación en frascos rodantes. Cada diagrama de caja muestra el mínimo, el máximo, el 2° y el 3er cuartil y la mediana de los agregados celulares iniciales indiferenciados (d0) y diferenciadores (d2, d5, d8 y d12). Se midieron los diámetros de agregados celulares para ambas condiciones. El diámetro promedio de los agregados celulares inicialmente formados fue mayor cuando los cultivos se sembraron a aproximadamente 1 x 106 células/ml en comparación con 2 x 106 células/ml. Sin embargo, en fases posteriores de diferenciación (por ejemplo, Fases 3-4) los tamaños de diámetro eran comparables e indistinguibles. La Figura 25 también muestra que no hubo diferencias sustanciales entre los agregados de células diferenciadas que se formaron en los frascos rodantes y los que se formaron durante los experimentos previos de diferenciación de suspensión realizados en bandejas de 6 pocillos. La diferenciación en los frascos rodantes también mostró la típica expansión y contracción del diámetro del agregado como se observó previamente en cultivos realizados en bandejas de 6 pocillos, biorreactores y similares (FIGURA 25). El diámetro agregado era independiente de la densidad celular inicial e independiente de la hESC inicial o de la composición del medio de crecimiento celular indiferenciado. Brevemente, los agregados celulares se expandieron durante las fases 1 y 2 (FIGURA 25, d0 y d2), se contrajeron durante la etapa 3 (FIGURA 25, d5) y se expandieron nuevamente durante la fase 4 (FIGURA 25, d8 y d15). A lo largo de la diferenciación, los agregados celulares no mostraron aglomeración manifiesta (por ejemplo, agregados grandes de 300 micrómetros o más) o destrucción por cizalla.

Tabla 9: Condiciones del medio para la diferenciación de fases 1 -4 en bandejas de 6 pocilios y frasco rodante

P unto de Fase (1-4) C ond ic ión del m ed io V e loc idad del frasco V e loc idad de la bandeja de tiem p o (día) rodan te (rpm ) 6 pocilios (rpm ) d(-1 ) A gregac ión de XF HA, SP 5, 8, 10 o 12 95

hESC

^dO 1 ^{r0.2FB S -ITS 1 :5000} 5, 8, 10 o 12 95

A 100

d1 r0.2FB S -ITS 1 :5000 5, 8, 10 o 12 95

A 100

^d2 2 ^{r0.2FB S -ITS 1 :1000} 5, 8, 10 o 12 95

K25

d3 r0.2FB S -ITS 1 :1000 5, 8, 10 o 12 95

K25

d4 r0.2FB S -ITS 1 :1000 5, 8, 10 o 12 105

K25

^d5 3 ^{db-C TT3 N50 5, 8, 10 o 12 105}

d6 db-C TT3 N50 5, 8, 10 o 12 105

d7 db-C TT3 N50 5, 8, 10 o 12 105

^d8 4 ^{db-N 50 K50 E50 5, 8, 10 o 12 105}

d9 db-N 50 K50 E50 5, 8, 10 o 12 95

d 10 db-N 50 K50 E50 5, 8, 10 o 12 95

d 11 db-N 50 K50 E50 5, 8, 10 o 12 95

d12 db-N 50 K50 E50 5, 8, 10 o 12 95

XF HA, ^{D M EM /F12 que con tiene G lutaM A X, sup lem en tado con 10 % v /v de reem plazo de sue ro de inactivac ión} gén ica exento de Xeno, am inoác idos no esenc ia les al 1 % v/v, 2-m ercap toe tano l 0,1 mM, pen ic ilina /estrep tom ic ina al ^{1 % v/v (todos de Life T echnolog ies), h e rre g u lin a -ip 10 ng/m l (P eprotech) y activ ina A 10 ng/m l (R & D S ystem s);} SP, ^{S tem P ro® hES C SFM (Life T echnolog ies);} r0.2FBS: ^{RPMI 1640 (M ed iatech); FBS al 0,2 % (H yclone), 1x G lu taM A X -1 (L ife T echnolog ies), pen ic ilina /estrep tom ic ina al 1 % v/v;} ITS: ^{Insu lina-T ransfe rrina -S e len io (L ife Techno log ies) d ilu ido 1:5000 o 1:1000;} A100: ^{100 ng/m l de activ ina A hum ana recom binan te (R &D System s);} W50: ^{50 ng/m l de W n t3A de ratón recom binan te (R & D S ystem s);} K25: ^{25 ng/m l de KG F hum ano recom binan te (R &D System s);} IV:

^{Inh ib idor IV de Rl c inasa TG F-p 2,5 pM (EM D B ioscience);} db: ^{DM EM Hl G lucosa (H yC lone) sup lem en tado con 0 ,5x S up lem ento B-27 (Life T echnolog ies), 1x G lutaM A X-1 y pen ic ilina /estrep tom ic ina al 1 % v/v;} CTT3: ^{KAAD-c ic lopam ina 0,25 pM (Toron to R esearch C hem ica ls) y TTN PB 3 nM (S igm a-A ld rich );} N50: ^{50 ng/m l de Noggina hum ana recom binan te (R&D System s);} K50: ^{50 ng/m l de KGF hum ano recom binan te (R & D S ystem s);} E50: ^{50 ng/m l} de EGF hum ano recom binan te (R &D S ystem s); se rea liza ron ve loc idades de g iro de 5, 8, 10, 12 rpm en cua lqu ie ra de la agregación de hESC, en las fases 1-4 de d ife renciac ión o en am bas.

Para examinar la expresión génica a lo largo de las fases 1-4, se usó Q-PCR para analizar las diferenciaciones realizadas con densidades celulares de partida de 1 x 106 células/ml frente a 2 x 106 células/ml (Figura 26). Aunque solo se muestran determinados genes en la Figura 26, el solicitante ha descrito anteriormente la expresión y no expresión de muchos genes en cada una de las fases 1-4 con gran detalle. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.211.699, METHODS FOR CULTURING PLURIPOTENT STEM CELLS IN SUSPENSION USING ERBB3 LIGANDS, publicada el 3 de julio de 2012; 7.958.585, PREPRIMITIVE STREAK AND MESENDODERM CELLS, publicada el 26 de julio de 2011; 7.510.876, DEFINITIVE ENDODERM (CYTHERA.045A), publicada el 31 de marzo de 2009; 7.541.185, METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM, publicada el 2 de junio de 2009; 7.625.753, EXPANSION OF DEFINITIVE ENDODERM, publicada el 1 de diciembre de 2009; 7.695.963, METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTION, publicada el 13 de abril de 2010; 7.704.738, DEFINITIVE ENDODERM, publicada el 27 de abril de 2010; 7.993.916, METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTION, publicada el 9 de agosto de 2011;

8.008.075, STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF, publicada el 30 de agosto de 2011; 8.178.878, COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS, publicada el 29 de mayo de 2012;

8.216.836, METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM, publicada el 10 de julio de 2012; 7.534.608, METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, publicada el 19 de mayo de 2009; 7.695.965, METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, publicada el 13 de abril de 2010; 7.993.920 METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES, publicada el 9 de agosto de 2011;

8.129.182, ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONEEXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION, publicada el 6 de marzo de 2012; las Solicitudes de Patente de EE.UU. N.° 11/875.057, METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM, presentada el 19 de octubre de 2007; 12/618.659, ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS, presentada el 13 de noviembre de 2009. Solo después de obtener un alto grado de confianza en los métodos de diferenciación, el Solicitante seleccionó un conjunto más pequeño de marcadores como marcadores de firma para indicar e identificar las diversas poblaciones de células de las fases 1-4 como se muestra en la Figura 26.

La Figura 26 muestra que los agregados celulares diferenciados en formatos de frasco rodante expresaron los marcadores de firma típicos esperados en cada fase de diferenciación, de acuerdo con los estudios de diferenciación realizados simultáneamente en bandejas de 6 pocillos (control, FIGURA 26). De forma similar, se observó ausencia de expresión de marcadores de firma donde se esperaba. Por ejemplo, los marcadores de células madre pluripotentes como OCT4 y Nanog estaban presentes en d0 para todas las condiciones de cultivo (FIGURA 26A). De forma similar, hubo una regulación positiva transitoria de los marcadores mesendodérmicos MIXL1 y Eomes tanto en las diferenciaciones en frasco rodante como en las diferenciaciones en bandeja de 6 pocillos (FIGURA 26, comparar la barra negra, la barra rayada ennegrecida, las barras grises, respectivamente). Las células de la fase 2 produjeron endodermo definitivo, que expresa SOX17 y HNF3p [FOXA2], de manera similar a lo observado para las células de tipo fase 2 diferenciadas en bandejas de 6 pocillos. Las células de tipo fase 4 expresaron PDX1 y NKX6.1 de manera similar a la observada para cultivos diferenciados en bandejas de 6 pocillos (FIGURA 26, comparar la barra negra, la barra rayada ennegrecida, las barras grises, respectivamente). Por último, la expresión de marcadores para linajes inespecíficos no fue sustancialmente diferente en cultivos diferenciados en bandejas de 6 pocillos y frascos rodantes de 150 ml, lo que indica que el control de la diferenciación se mantuvo estricto en el formato rodante. Estos marcadores incluyeron ZICl (linaje de ectodermo), PAX6 de expresión temprana (linaje neuronal), SOX7 (endodermo extraembrionario), CDX2 (trofoectodermo) y expresión temprana de AFP (saco vitelino).

Tabla 10a: Diferenciación de pPSC en frascos rodantes más grandes

Tapas,

V olum en Á rea de la V o lum en de V en tilada (V); vo lum en de % de D iám etro del del frasco superfic ie del agregación No ven tilada sed im ento dO incorporación agregado frasco dO (pm )

(NV)

1200 ml 490 cm 2 275 ml V 1050 pl 79,6 177±23 1200 ml 490 cm 2 275 ml NV 1090 pl 78 167±21 2275 ml 850 cm 2 580 ml V 2300 pl 76 171±26 bandeja de - 33 m l/bandeja - -105 p l/bande ja -75 136±15 6 pocillos

Una vez que se demostró que las pPSC podían agregarse en un formato de frasco rodante a pequeña escala (Ejemplo de Referencia 25), se prepararon cultivos más grandes para demostrar la escalabilidad práctica de agregar y diferenciar hESC a PEC en frascos rodantes. Los experimentos que usan hESC CyT49 se realizaron como se indica en la Tabla 10. Las ESC humanas se agregaron en medio StemPro® hESC SFM, Otros medios de células madre pluripotentes, por ejemplo, medios XF HA con y sin seroalbúmina humana (HAS, human serum albumin), se usaron en otros experimentos (datos no mostrados). Los agregados de hESC del día 0 (d0) se formaron eficazmente en cada condición. Los cultivos experimentales resumidos en la Tabla 10 se hicieron girar a 8rpm. En otros experimentos, se usó agregación a 5, 10 y 12 rpm y se formaron agregados de hESC con morfología y diámetros similares a aquellos observados en bandejas de 6 pocillos y frascos rodantes a 8 rpm (datos no mostrados). En algunos casos donde la agregación de hESC se realizó en el intervalo más bajo de velocidad de giro, por ejemplo, 5, 6 y 7 rpm o con medios StemPro® hESC SFM (Life Technologies), se observó un aumento en la aglomeración de los agregados celulares (es decir, estructuras mayores de 300 pm; datos no mostrados). Algunos experimentos se realizaron usando tapas de frascos ventiladas (V) mientras que otros no tenían tapas de frascos ventiladas (NV). La ventilación no supuso una diferencia sustancial en el proceso de diferenciación, tampoco pareció afectar a la correcta especificación de las hESC, según lo determinado mediante el análisis de expresión génica por qPCR (FIGURA 26). En resumen, la agregación de hESC en frascos rodantes puede lograrse en un intervalo de velocidades de giro, (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 12 rpm), con diversos medios de cultivo de células madre pluripotentes y en tapas de frascos ventiladas o no, y en incubadoras con CO2 gaseado o sin gas. Estos diferentes factores no parecen cambiar sustancialmente la morfología, forma y tamaño medio del diámetro de los agregados.

Ejemplo de Referencia 26 - Diferenciación a escala de agregados de células madre en frascos rodantes

La agregación de ESC humana se realizó nuevamente usando frascos rodantes de 1200 ml o 490 cm2 sustancialmente como se describió anteriormente en el Ejemplo de Referencia 25. Dado que los agregados de hESC en cada agregación de frasco rodante parecían consistentes y similares (por ejemplo, morfología y tamaño de diámetro), los agregados se agruparon, se sedimentaron y el sedimento de agregados se distribuyó entre frascos rodantes de 1200 ml o 490 cm2 para su diferenciación de acuerdo con la Tabla 11. El volumen total del sedimento agregado de hESC fue de aproximadamente 4400 pl y se redistribuyó en 4 frascos de 1200 ml (490 cm2) para la diferenciación de acuerdo con la Tabla 11. La diferenciación se realizó como se describe anteriormente en la Tabla 9. Los cultivos diferenciadores exhibieron morfologías similares, excepto que se observaron pequeñas cantidades de aglomeración en los frascos, que se hicieron girar a las velocidades de giro más bajas (datos no mostrados). Sin embargo, los volúmenes de sedimentos agregados para el día 12 (Fase 4) fueron similares en todas las condiciones ensayadas y todos los sedimentos celulares recuperados tuvieron un rendimiento de aproximadamente 1:1 en comparación con el volumen de sedimentos inicial en cada frasco (~1100 |jl). Véase la Tabla 11.

La agregación de pPSC no se limita a hESC. Las iPSC humanas se probaron de una manera sustancialmente similar a la descrita anteriormente para las hESC, en las condiciones enumeradas en la Tabla 11. Se agregaron iPSC-482c7 humanas (Cellular Dynamics International Inc. Madison, Wisconsin, EE.UU.) en un frasco rodante de 490 cm2 El volumen de partida total de las hiPSCs fue solo de aproximadamente 25 ml a 1 x 106 células/ml. La plataforma de agregación es lo suficientemente fuerte como para funcionar bien en un intervalo de volúmenes celulares e incluso cuando hay una mayor disparidad entre el volumen inicial y el del el frasco rodante más grande de 490 cm2. Los agregados de células iPSC humanas parecían morfológicamente similares a las hESC agregadas en bandejas de 6 pocillos o en frascos rodantes como se describió anteriormente, es decir, los tamaños de los agregados de iPSC varían de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 micrómetros sin aglomeración aparente. Además, como se describe anteriormente en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 12/765.714, titulada CELL COMPOSITIONS DERIVED FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS, presentada el 22 de abril de 2010, el uso de inhibidores de Rho cinasa mejoró la diferenciación de agregados de pPSC; sin embargo, dado que la solicitud '714 no mostró agregación de hESC (solo diferenciación), esa solicitud no mostró que el uso de, por ejemplo, Y-2763210 jM en el cultivo de pPSC de partida también mejoraría la agregación de pPSC. Debido a que la agregación de hESC puede realizarse en un frasco rodante, la diferenciación de agregados celulares en frascos rodantes puede realizarse también y sustancialmente como se describe en detalle en la solicitud '714 o solicitud relacionada, o sustancialmente como se describe en el presente documento y de acuerdo con la Tabla 9. Adicionalmente, para demostrar la integridad de los agregados de hESC, los agregados de hESC se formaron primero en frascos rodantes y después se diferenciaron posteriormente en bandejas de 6 pocillos. Esto se realizó usando agregados de hESC formados primero en frascos rodantes en una diversidad de condiciones, por ejemplo, a diferentes velocidades de giro y con diferentes medios de células madre pluripotentes. La diferenciación de los agregados de hESC de frascos rodantes en bandejas de 6 pocillos fue comparable en la forma y el diámetro de los agregados, y la morfología celular a la observada cuando los agregados de hESC se formaron por primera vez en las bandejas de 6 pocillos (control; datos no mostrados). Por tanto, la integridad de los agregados de hESC en frascos rodantes se mantiene sustancialmente sin cambios debido al cambio de formato.

Para demostrar que el escalamiento con frascos rodantes no compromete la incorporación de células en los agregados, el recuento celular de las células vivas, no incorporadas después de la formación de agregados se realizó en d0 (es decir, 18-24 horas después del inicio de las agregaciones), confirmando que aproximadamente el 75-80 % de las células de entrada se incorporaron en los agregados de hESC indiferenciados, que es comparable o mejor que la observada en bandejas de 6 pocillos (aproximadamente el 75 %). Véase Schulz et al. 2012, citado anteriormente, FIGURA S4, S6. El porcentaje de incorporación puede variar dependiendo del medio de cultivo madre pluripotente usado, ya que los estudios que usaron medios XF HA proporcionaron un intervalo de incorporación de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 77 % (datos no mostrados).

El análisis mediante Q-PCR del proceso de diferenciación de acuerdo con las Tablas 11 y 9, demostró que se produjo una especificación de linaje adecuada en cada fase hasta la formación de PEC. Véase la FIGURA 27A-D. Cada uno de los cuatro cultivos enumerados en la Tabla 11 exhibió una regulación negativa de los marcadores de pluripotencia (por ejemplo, OCT4, Nanog) y regulación positiva transitoria de marcadores de mesoendodermo (por ejemplo, MixL1, Eomes). Véase la FIGURA 27A. Los marcadores del endodermo definitivo (por ejemplo, SOX17 y HNF3B) se expresaron desde el día 2 como se esperaba, seguido de otros marcadores endodérmicos y pancreáticos (por ejemplo, HNF1B, PDX1, NKX6-1, PTF1A, NGN3 y NKX2-2). Véase la FIGURA 27B. Cabe destacar que, los marcadores indicativos de linajes inespecíficos (linajes no endodérmicos o no pancreáticos) no se elevaron en comparación con la diferenciación de control de bandeja de 6 pocillos (por ejemplo, PAX6, SOX7, CDX2, AFP y ZIC1), por lo tanto, se mantuvo un control estricto de la especificación pancreática en estos experimentos de diferenciación escalada. Véase la FIGURA 27C. Por ejemplo, la expresión de ARN, que normalmente indica la presencia de una población inespecífica minoritaria que se produce esporádicamente en algunas diferenciaciones, fue baja en el control de bandeja de 6 pocillos. Véanse la FIGURA 27D y Schulz et al.

2012, citado anteriormente. La expresión de AFP fue incluso menor en los cultivos en frascos rodantes, indicando posiblemente una reducción en esta población minoritaria en los agregados d12. Véase la FIGURA 27D.

Para evaluar las composiciones celulares de cultivos de células pancreáticas diferenciadas de hESC con el protocolo de múltiples etapas (Fases 1-4), el análisis de citometría de flujo basado en una combinación de cotinción se usó sustancialmente como el descrito anteriormente en Kelly et al. 2011, Nature Biotech 29:750-56; D'Amour et al. 2005, citado anteriormente; Kroon et al. 2008 citado anteriormente, Schulz et al. 2012, citado anteriormente. Schulz et al.

2012, citado anteriormente, por ejemplo, mostraron un análisis de citometría de flujo extenso y una composición celular de PEC para al menos 37 ciclos de diferenciación (FIGURA 2). Schulz et al. describieron la composición celular de PEC consistiendo en: Aproximadamente el 26-36 % CHGA- / NKX6-1 / PDX1+/-, aproximadamente el 46­ 56 % CHGA+ /NKX6-1+/- / PDX1+/-(células endocrinas polihormonales), aproximadamente el 10-15 % CHGA'/ NKX6-1- / PDX1+ (células de endodermo solo PDX1) y menos del 3 % CHGA- / NKX6-1- /PDX1-(células residuales o triple negativas). Véase Schulz et al. 2012, citado anteriormente, FIGURA 2C.

De forma similar, el análisis de citometría de flujo se realizó en la fase 4 (día 12), cultivos de PEC diferenciados en frascos rodantes como se indica en la Tabla 11. La composición de PEC estaba en consonancia con la descrita anteriormente en Schulz et al. y los porcentajes exactos, así como el promedio de las condiciones de los cuatro frascos rodantes se muestran en la Tabla 12. Las PEC de estas diferenciaciones en frascos rodantes a escala mostró aproximadamente el 40 % de CHGA- / NKX6-1 / PDX1+/-, aproximadamente el 43 % CHGA+ / NKX6-1+/- / PDX1+/-(o células endocrinas polihormonales), aproximadamente el 10 % CHGA- / NKX6-1- / PDX1+ (o células de endodermo solo PDX1) y aproximadamente el 2 % CHGA-/ NKX6-1- /PDX1-(o células residuales; o células triple negativas). El análisis de citometría de flujo de la composición de PEC también indica que ni las diferentes velocidades de giro de 5 y 8 rpm ni el tipo de tapas de frasco ventiladas o no ventiladas tuvieron un efecto aparente sobre la composición de las células PEC. Como se describió anteriormente y según el análisis Q-PCE, estas condiciones tampoco parecieron afectar la especificación del linaje de las células de las Fases 1-4 en ruta a PEC (FIGURA 26). Por lo tanto, los estudios y análisis anteriores confirmaron la eficacia de la agregación y diferenciación de hESC a PEC en formato de frasco rodante escalable.

Tabla 11: Agregación de pPSC en frascos rodantes más grandes

Tabla 12: Composición de células PEC del frasco rodante después de la diferenciación de fases 1-4

Á rea de la superfic ie del V o lum en de Tapas, V entilada (V); _{V e locidad} Fase 4, Volum en de frasco (1200 m i) agregación No ven tilada (NV) sed im ento del día 12 490 cm 2 275 mi V 5 rpm 1000 pl

490 cm 2 275 mi NV 5 rpm 1100 pl

490 cm 2 275 mi V 8 rpm 800 pl

490 cm 2 275 mi NV 8 rpm 1200 pl

CH G A+ CHG A-N KX6 A -N K X 6.1- C H G A -N K X 6.1-PDX1 -(endocrina (R esidua l-T rip le po lihorm onal) PDX1+ o (solo PDX) Negativo) RB- A 490 cm 2 V 8 rpm 40,2 41,0 16,8 1,92

RB- B 490 cm 2 NV 8 rpm 45,5 41,5 11,6 1,36

RB- C 490 cm 2 V 5 rpm 43,6 35,0 20,1 1,34

RB- D 490 cm 2 NV 5 rpm 43,8 42,9

9,71 3,65 Promedio, RB A-D

43,25

40,1 14,55

2,07

* V, ventilado; NV, no ventilado;

Se apreciará que los métodos y composiciones descritos anteriormente se refieren a células cultivadas in vitro. Sin embargo, las composiciones celulares diferenciadas in vitro anteriormente descritas pueden usarse para aplicaciones in vivo. El uso de las composiciones descritas en el presente documento se ha descrito en detalle en al menos las Patentes de EE.UU. N.° 7.534.608; 7.695.965; y 7.993.920; tituladas METHODS FOR PRODUCING PANCREATIC HORMONES, que se presentaron el 19 de mayo de 2009, el 13 de abril de 2010 y el 9 de agosto de 2011, respectivamente; y 8.278.106, titulada ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS. El Solicitante también ha informado sobre el uso y la función de las composiciones descritas en el presente documento en publicaciones anteriores no de patente incluyendo Kroon et al. 2008 citado anteriormente y Schulz et al. 2012, citado anteriormente.

Como se ha descrito anteriormente, los frascos rodantes pueden tener diversos tamaños, formas y posiblemente incluso pueden usarse aquellos recipientes que no tienen forma cilíndrica pero cuyos métodos simulan el mismo movimiento que el de los frascos rodantes. Además, está claro a partir de la descripción anterior que el uso de diferentes tipos de medios de pPSC, tales como los medios XF HA o StemPro® hESC SFM y otros tipos de medios están totalmente anticipados, por ejemplo, medios mTeSR™, Essential™ 8 o cualquier otro medio pPSC comúnmente empleado en la industria para el crecimiento y cultivo de pPSC o células similares.

Por ejemplo, el hecho de que la agregación y/o la diferenciación requieran gasificación (por ejemplo, CO2 y otros gases) pueden depender en parte del tipo de tapas de frascos rodantes que se utilicen (por ejemplo, ventiladas o no ventiladas). El CO2 puede incorporarse fácilmente a las condiciones de cultivo en incubadoras convencionales de cultivo tisular. Sin embargo, la agregación y/o la diferenciación sin CO2 externo (sin gas) puede aportar determinadas ventajas a la fabricación en escalado: más volumen/frasco y, por lo tanto, menos frascos por gran ciclo de fabricación. Además, grandes conjuntos de frascos podrían funcionar en una sala con calor en comparación con una incubadora, por ejemplo, simplificando enormemente la incorporación de robótica y automatización en el proceso de escalado.

En el presente documento se han descrito determinados recipientes de cultivo (por ejemplo, bandejas de 6 pocillos, biorreactores, matraces de Erlenmeyer, frascos rodantes y similares), sin embargo, se contemplan otros recipientes de cultivo similares, por ejemplo, los que tienen un tamaño, forma, dimensión y función similares. Los frascos rodantes comerciales, tales como los frascos rodantes de plástico y vidrio de Corning, varían en cuanto a tamaños: 490 cm2 (mantienen de 100 a 150 ml); 850 cm2 (mantienen de 170 a 255 ml); 1700 cm2 (mantienen de 340 a 510 ml); 1750 cm2 (mantienen de 350 a 525 ml); 670-680 cm2 (mantienen de 135 a 200 ml); 840 cm2 (mantienen de 170 a 255 ml); 1170 cm2 (mantienen de 235 a 350 ml); 1330 cm2 (mantienen de 265 a 400 ml); 1585 cm2 (315 a 475 ml); y 1585 cm2 (mantienen de 315 a 475 ml).

Los matraces de Erlenmeyer tienen forma cónica, cuerpo ahusado y cuello estrecho. La forma, que se distingue de un vaso de precipitados, permite agitar o remover el contenido con un dispositivo mecánico externo o manualmente, mientras que el cuello estrecho impide que el contenido se derrame y reduce las pérdidas por evaporación en comparación con un vaso de precipitados, mientras que el fondo plano del matraz cónico lo hace estable. Las divulgaciones del presente documento contemplan otros recipientes que tienen formas similares.

Las divulgaciones del presente documento también contemplan el uso de biorreactores o cualquier dispositivo o sistema fabricado o diseñado que soporte un entorno biológicamente activo. Dichos biorreactores suelen ser cilíndricos, variando en cuanto tamaño desde litros a metros cúbicos. En el comercio se dispone de muchos biorreactores y un experto en la materia puede recibir indicaciones para seleccionar el recipiente adecuado para su proceso dada la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

Por tanto, basándose en la presente descripción y en las recomendaciones de fabricación, el experto en la materia puede elegir fácilmente el tamaño apropiado del frasco rodante según las necesidades de cultivo escalado.

Como se usa más adelante en las reivindicaciones y a lo largo de esta divulgación, la expresión "consiste esencialmente en" significa que incluye cualquier elemento enumerado después de la expresión y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación de los elementos enumerados. Por lo tanto, la expresión "consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que lo demás elementos son opcionales y pueden estar o no presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de frasco rodante que comprende, un frasco rodante y medios para hacer girar el frasco rodante, en donde el frasco rodante comprende un cultivo de agregados de células madre pluripotentes de primate (pPSC) o agregados derivados de pPSC en suspensión en un medio fisiológicamente aceptable, en donde dichos agregados son agregados homocelulares o heterocelulares distintos de los cuerpos embrionarios y en donde los medios para hacer girar el frasco rodante son adecuados para hacer girar el frasco rodante a una velocidad de giro de 3 rpm a 30 rpm.

2. El sistema de frasco rodante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las pPSC están en un ambiente exento de alimentador, matriz y cultivo de crecimiento adherente.

3. El sistema de frasco rodante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde los agregados de pPSC tienen un diámetro de 100 a 300 micrómetros.

4. El sistema de frasco rodante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde los agregados de pPSC expresan al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en OCT4, NANOG, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-81 y Tra-1-60.

5. El sistema de frasco rodante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde los agregados de pPSC se seleccionan del grupo que consiste en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes humanas inducidas (iPSC).

6. Un método para generar un cultivo de agregados de células madre pluripotentes de primate (pPSC) suspendidos en un medio fisiológicamente aceptable en un frasco rodante, que comprende:

a. proporcionar un cultivo de pPSC indiferenciadas;

b. sembrar un frasco rodante con las pPSC indiferenciadas en un medio de cultivo que soporta el crecimiento indiferenciado de las pPSC; y

c. agitar la suspensión unicelular a una velocidad de giro de 3 rpm a 30 rpm en un frasco rodante para formar agregados de células pPSC,

generando de esta manera un cultivo de agregados de pPSC suspendidos en un medio fisiológicamente aceptable en un frasco rodante.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la velocidad de giro es de 3 rpm a 20 rpm.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde los agregados de pPSC tienen un diámetro de 100 a 300 micrómetros.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde las pPSC están en un ambiente exento de alimentador, matriz y cultivo de crecimiento adherente.

10. Un método para diferenciar las células madre pluripotentes de primate (pPSC) en un frasco rodante que comprende:

a. proporcionar un cultivo de pPSC indiferenciadas;

b. agitar las pPSC en un medio fisiológicamente aceptable en un frasco rodante a una velocidad de giro de 3 rpm a 30 rpm para formar agregados de pPSC; y

poner en contacto los agregados de pPSC en el frasco rodante con un medio de cultivo que diferencie las pPSC para formar agregados de células diferenciadas,

diferenciando de esta manera las pPSC en un frasco rodante.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde las pPSC se diferencian en un ambiente exento de alimentador, matriz y cultivo de crecimiento adherente.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la velocidad de giro es de 3 rpm a 20 rpm.