ES2904269T3 - Método para la purificación y la activación de la neurotoxina botulínica - Google Patents

Abstract

Una molécula que comprende un polipéptido no hemaglutinina no tóxica (NTNHA) unido covalentemente a un resto de afinidad heterólogo para su uso en el aislamiento y purificación de una proteína de neurotoxina botulínica (BoNT), o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de BoNT, a partir de una disolución, en la que: la molécula se une además a una diana de unión a través del resto de afinidad; y el polipéptido de NTNHA está en un complejo con una neurotoxina botulínica (BoNT) compatible, o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la purificación y la activación de la neurotoxina botulínica

Listado de secuencias

La presente memoria descriptiva hace referencia a un listado de secuencias (enviado electrónicamente como un archivo .txt llamado "0342941-0584_SL.TXT" el 16 de mayo de 2017). El archivo .txt se generó el 16 de mayo de 2017 y tiene un tamaño de 96.153 bytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas y métodos para el aislamiento y la purificación de neurotoxinas.

Antecedentes de la invención

Las neurotoxinas botulínicas (“botulinum neurotoxins”, BoNT) son las sustancias más tóxicas conocidas por los seres humanos. Se han identificado siete serotipos de BoNT (A-G), con muchos subtipos dentro de cada serotipo. Las BoNT son proteínas de ~ 150 kDa producidas por diferentes cepas de la bacteria Clostridium botulinum (Montal 2010). Estas toxinas provocan botulismo en animales, una enfermedad neurológica grave que se manifiesta en una parálisis flácida extrema y posible muerte. La base molecular de esta toxicidad radica en la capacidad de las BoNT para unirse y entrar en las neuronas motoras y liberar su dominio enzimático en el citosol, que rompe la maquinaria celular responsable de la fusión de vesículas sinápticas en las uniones neuromusculares (“neuromuscular junctions”, NMJ) e inhibe la neurotransmisión al bloquear la liberación de acetilcolina. .

Se ha explorado la función neuroinhibidora de las BoNT como una estrategia de tratamiento para muchos trastornos musculares que varían desde el estrabismo hasta la gestión de distonías múltiples (Masuyer et al., 2014), sin mencionar el fuerte aumento en los usos cosméticos de las BoNT (A) para inducir una parálisis flácida en los músculos faciales para suavizar las arrugas. El mercado de la BoNT se acerca a los 2 mil millones de dólares y sigue creciendo a un ritmo acelerado.

Actualmente existen varios desafíos en las producciones de BoNT. Las BoNT deben producirse en bacterias y aislarse de lisados bacterianos. Las BoNT terapéuticas actuales todavía se producen y aíslan utilizando metodologías antiguas similares a las que se originaron hace más de cincuenta años cuando se describió el primer lote de BoNT/A preparada en laboratorio (Bonventre y Kempe, 1959; Pickett, 2014). Estos métodos implican típicamente una incubación/fermentación prolongada de las cepas bacterianas naturales que producen estas toxinas (cepas de clostridium formadoras de esporas) y muchas etapas posteriores de cromatografía muy laboriosas. Aparte de los desafíos de ingeniería y contención, estos procesos también pueden comprometer el rendimiento final, la eficacia y la reproducibilidad de las preparaciones de BoNT.

En los últimos años, se ha explorado la expresión de BoNT de forma recombinante a partir de sistemas hospedantes comunes utilizados para la producción de proteínas en la industria, tales como E. co liy células de insecto. Un marcador de afinidad, tal como His-6 (SEQ ID NO:1) o GST, normalmente se fusiona con las BoNT para facilitar la purificación mediante una purificación por afinidad. Aunque el aislamiento de BoNT recombinante con marcadores de afinidad simplifica las etapas de purificación, presenta nuevos problemas. El marcador puede afectar negativamente a la actividad biológica de la toxina y/o tener una antigenicidad no deseada. Como resultado, el marcador debe retirarse después de la purificación, lo que implica etapas de tratamiento enzimático y de purificación adicionales. Además, a menudo quedan restos adicionales unidos a la toxina del marcador escindido, creando un extremo N- o C-terminal no nativo que puede afectar a la actividad o promover consecuencias inmunitarias en un paciente.

Se prefiere en gran medida el aislamiento de formas naturales de BoNT, pero sigue siendo un proceso que requiere mucho tiempo y trabajo.

Las BoNT purificadas deben activarse mediante proteólisis limitada antes de su uso. Las BoNT recombinantes generalmente se activan después de la purificación mediante incubación con una endoproteinasa, tal como la tripsina. Tal activación puede causar una degradación inespecífica y requiere una etapa de purificación adicional para eliminar la endoproteinasa de activación, las cuales comprometen la actividad y el rendimiento de la toxina.

El documento JP 2010-37253 A describe un método para purificar la toxina nerviosa botulínica usando cromatografía de afinidad cargando una disolución que contiene toxina botulínica en una columna de anticuerpos con un anticuerpo anti-NTNHA unido a un portador a pH 6, uniendo el complejo de toxina botulínica a la columna y eluyendo la toxina nerviosa botulínica a pH 8.

Sumario de la invención

Como resultará evidente para los expertos en la técnica que lean la presente descripción, la presente invención incluye el reconocimiento de un problema con composiciones y métodos para la producción, la purificación y/o la activación de neurotoxinas botulínicas (BoNT), o porciones o fragmentos de las mismas. Entre otras cosas, la presente invención identifica los desafíos para proporcionar materiales y procedimientos que faciliten la producción, la purificación y/o la activación de BoNT con las características deseadas (por ejemplo, actividad biológica relativamente no comprometida; introducción limitada de antigenicidad no deseada; contaminantes limitados, tales como endoproteinasas no deseadas y/o productos de degradación; y alta calidad, potencia y/o reproducibilidad de la BoNT deseada), al tiempo que se reducen las limitaciones de las estrategias anteriores (por ejemplo, eficacia limitada de producción, etapas laboriosas y/o largas y/o condiciones duras).

Un aspecto de la invención se refiere a una molécula que comprende un polipéptido no hemaglutinina no tóxica (“nontoxic non-hemagglutinin”, NTNHA) unido covalentemente a un resto de afinidad heterólogo para su uso en el aislamiento y la purificación de una proteína de neurotoxina botulínica (BoNT), o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de BoNT, de una disolución, en la que: la molécula se une además a una diana de unión a través del resto de afinidad; y el polipéptido de NTNHA está en un complejo con una neurotoxina botulínica compatible (BoNT) o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de la misma. En una realización, el complejo está intacto en disolución a pH 6 y escindido en disolución a pH 8. En una realización, la BoNT compatible, o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de BoNT, puede activarse tras su exposición a una proteasa mientras permanece en complejo con el polipéptido de NTNHA. En una realización, la NTNHA y el resto de afinidad se expresan como una proteína de fusión. En una realización de las composiciones descritas en este documento, el resto de afinidad se encuentra en una posición seleccionada del grupo que consiste en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de NTNHA, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de NTNHA, e interno en la secuencia de aminoácidos de NTNHA. En una realización de las composiciones descritas en este documento, el resto de afinidad se une eficazmente a una diana de unión en condiciones de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8. En una realización de las composiciones descritas en este documento, el resto de afinidad se selecciona del grupo que consiste en glutatión-S -transferasa (GST), marcador C-myc, dominio de unión a quitina, proteína de unión a estreptavidina (SBP), dominio de unión a celulosa, péptido de unión a calmodulina, marcador S, Strep-tag II, FLA, proteína A, proteína G, marcador de afinidad de histidina (HAT), poli-His y proteína de unión a maltosa (MBP). En una realización de las composiciones descritas en este documento, la NTNHA es de serotipo A, B, C1, D, E, F o G. En una realización de las composiciones descritas en este documento, la NTNHA es de serotipo B. En una realización de la En las composiciones descritas en el presente documento, la BoNT o el polipéptido comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B botulínico clostridial (B-Hc). En una realización de las composiciones descritas en el presente documento, la diana de unión se une de forma estable a una matriz.

Otro aspecto de la invención se refiere a una disolución acuosa que comprende una de las moléculas descritas en este documento.

En el presente documento se describe un ácido nucleico que codifica una de las proteínas de fusión del resto de afinidad y NTNHA funcional descritas en el presente documento.

En el presente documento se describe un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica una de las proteínas de fusión del resto de afinidad y NTNHA funcional descritas en el presente documento.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica una de las proteínas de fusión del resto de afinidad y NTNHA funcional descritas en el presente documento, y que además expresa una neurotoxina botulínica compatible (BoNT); dicha célula es procariota o eucariota o es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de anfibio. En una realización de las células huésped descritas en el presente documento, la BoNT comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B botulínico clostridial (B-Hc).

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la purificación de la neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende poner en contacto la BoNT con una molécula que comprende un polipéptido no tóxico no hemaglutinina (NTNHA) compatible unido covalentemente a un resto de afinidad heteróloga, en condiciones apropiadas para la unión de la NTNHA a la BoNT para formar de ese modo un complejo de NTNHA-BoNT, en el que la BoNT está en disolución, y la molécula está unida a una matriz, por lo que la disolución se pone en contacto con la matriz para así poner en contacto la BoNT con la NTNHA. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el método comprende además lavar la matriz para eliminar así los materiales no unidos y eluir la BoNT de la matriz poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT. En una realización alternativa de los métodos descritos en este documento, después de poner en contacto la disolución de BoNT con la matriz, el método comprende además lavar la matriz para eliminar así los materiales no unidos, poner en contacto la matriz con una proteasa en condiciones que conservan el complejo de NTNHA-BoNT y son apropiadas para la escisión de la BoNT dentro del complejo de NTNHA-BoNT, lavar la matriz para eliminar así la proteasa y los materiales no unidos, y eluir la BoNT escindida de la matriz poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia la BoNT escindida del complejo de la NTNHA-BoNT. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la matriz se une a una diana de unión del resto de afinidad, y la molécula se une de forma no covalente a la matriz a través de interacciones del resto de afinidad y la diana de unión. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la BoNT comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B botulínico clostridial (B-Hc). En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la disolución acuosa que disocia la BoNT escindida del complejo de NTNHA-BoNT tiene un pH de > 7,5. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la disolución que comprende la BoNT es un extracto de células aclarado procedente de células que expresan BoNT. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el extracto celular aclarado comprende además 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). En una realización de los métodos descritos en este documento, las condiciones apropiadas para la unión comprenden poner en contacto la BoNT en el contexto de un tampón de unión que tiene una fuerza iónica fisiológica y un pH de <7,5. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el lavado se realiza con un tampón de lavado de fuerza iónica fisiológica con un pH <7,5. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el tampón de unión y/o el tampón de lavado contiene KCl o NaCl 100-200 mM. En una realización de los métodos descritos en este documento, el tampón de unión y/o el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 6. En una realización de los métodos descritos en este documento, el tampón de unión y/o el tampón de lavado comprende MES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la disolución acuosa que disocia la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT es un tampón de elución de aproximadamente Tris 50 mM, NaCl 150 mM. En una realización de los métodos descritos en este documento, la disolución acuosa es un tampón de elución de aproximadamente pH 8. En una realización de los métodos descritos en este documento, el resto de afinidad se selecciona del grupo que consiste en glutatión-S-transferasa (GST), marcador C-myc, dominio de unión a quitina, proteína de unión a estreptavidina (SBP), dominio de unión a celulosa, péptido de unión a calmodulina, marcador S, Strep-tag II, FLA, proteína A, proteína G, marcador de afinidad de histidina (HAT), poli-His y proteína de unión a maltosa (MBP).

En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el resto de afinidad es GST y la diana de unión es el glutatión.

Tal como se describe en el presente documento, la NTNHA puede estar presente en una proporción molar entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 10:1 con respecto a la BoNT, por ejemplo, aproximadamente 2:1, 3:1,4:1 o 5:1 con respecto a la BoNT. Tal como se describe en el presente documento, la BoNT y la NTNHA pueden coexpresarse en la misma célula huésped, por ejemplo E. coli. Tal como se describe en el presente documento, la BoNT y la NTNHA pueden expresarse en diferentes células huésped. Tal como se describe en el presente documento, la BoNT se puede producir de manera recombinante en una célula huésped heteróloga, tal como E. coli. Tal como se describe en el presente documento, la BoNT puede producirse en su célula clostridial nativa. Tal como se describe en el presente documento, la NTNHA se puede producir de manera recombinante en una célula huésped heteróloga, como E. coli. Tal como se describe en el presente documento, la NTNHA se puede producir en su célula clostridial nativa.

Tal como se describe en el presente documento, la proteasa puede seleccionarse de tripsina, pepsina, Lys-C endoproteinasa, Lys-N endoproteinasa, arginil endopeptidasa, plasmina, omptina y una proteasa clostridial como se describe en el documento EP2524963. En una realización preferida, la proteasa es tripsina o Lys-C endoproteinasa. Tal como se describe en el presente documento, la proteasa puede ser una proteasa que escinde un sitio de escisión no nativo (es decir, exógeno) de BoNT. En tales toxinas clostridiales, el sitio de escisión por proteasa nativa (también conocido como sitio de activación) se modifica o reemplaza por un sitio de escisión por proteasa que no es nativo de esa toxina clostridial. Las proteasas no nativas que pueden emplearse incluyen enteroquinasa (DDDDK| (SEQ ID NO:2)), factor Xa (IEGR| (SEQ ID NO:3)/IDGR| (SEQ ID NO:4)), TEV (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQ|G (SEQ ID NO:5)), trombina (LVPR|GS (SEQ ID NO:6)) y PreScission (LEVLFQ|GP (SEQ ID NO:7)).

En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la proteasa se añade a una proporción molar de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1000 con respecto a la NTNHA, preferiblemente de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:100 con respecto la NTNHA, por ejemplo aproximadamente 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 o 1:50. Tal como se describe en el presente documento, la proteasa se puede añadir a una proporción molar de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1000 con respecto la BoNT, preferiblemente de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:100 con respecto a la BoNT, por ejemplo aproximadamente 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 o 1:50. Los expertos en la técnica determinarán las condiciones apropiadas para la proteasa específica utilizada. El tiempo de exposición a la proteasa también variará con la proteasa, la concentración utilizada y la temperatura. Tal como se describe en el presente documento, la proteasa puede ponerse en contacto con la matriz a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C, por ejemplo 4°C, 16° C, 20°C o 37°C. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la proteasa se pone en contacto con la matriz a temperatura ambiente (aproximadamente 20-22°C). En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la proteasa se pone en contacto con la matriz de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 18 horas, preferiblemente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 5 horas, por ejemplo, aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas o 5 horas. Tal como se describe en este documento, la proteasa puede ponerse en contacto con la matriz a un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5, preferiblemente de aproximadamente 6 a 8, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6, 7 u 8. Como se describe en este documento, la proteasa puede seleccionarse de las proteasas: tripsina y Lys-C endoproteinasa, y puede ponerse en contacto con la matriz a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas a un pH entre 6 y 7.

Tal como se describe en el presente documento, la proteasa se puede añadir en una proporción molar de aproximadamente 1:10 con respecto a la NTNHA. Tal como se describe en el presente documento, la proteasa puede entrar en contacto con la matriz a temperatura ambiente. Tal como se describe en el presente documento, la proteasa puede ponerse en contacto con la matriz durante aproximadamente 30 minutos a 12 horas.

En una realización alternativa de los métodos descritos en el presente documento, la molécula se une a una matriz revestida de glutatión y el resto de afinidad es glutatión-S-transferasa; y la etapa de poner en contacto comprende poner en contacto un extracto celular aclarado que comprende la BoNT con la matriz en un tampón de unión con un pH de aproximadamente 6 para formar de ese modo el complejo de NTNHA-BoNT; y en el que además el método comprende las etapas de lavar la matriz con un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6 para eliminar de ese modo los materiales no unidos; y eluir la BoNT de la matriz poniendo en contacto la matriz con un tampón de elución que tiene un pH de > 7,5 para disociar de ese modo la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT.

En una realización alternativa de los métodos descritos en el presente documento, la molécula se une a una matriz revestida de glutatión y el resto de afinidad es glutatión-S-transferasa; y la etapa de poner en contacto comprende poner en contacto un extracto celular aclarado que comprende la BoNT con la matriz en un tampón de unión con un pH de aproximadamente 6 para formar así un complejo de NTNHA-BoNT, y además en el que el método comprende las etapas de lavar la matriz con un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6 para eliminar así los materiales no unidos, poner en contacto la matriz con una proteasa en un tampón con un pH de aproximadamente 6 para escindir así la BoNT dentro del complejo de NTNHA-BoNT, lavar la matriz con un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6 para eliminar de ese modo la proteasa y los materiales no unidos, y eluir la BoNT de la matriz poniendo en contacto la matriz con un tampón de elución que tiene un pH de > 7,5 para disociar así la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la BoNT comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B botulínico clostridial (B-Hc). En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el tampón de unión y/o el tampón de lavado comprenden MES 50 mM, NaCl 150 mM. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el tampón de unión comprende además fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. En una realización de los métodos descritos en este documento, el tampón de elución comprende Tris 50 mM, NaCl 150 mM y tiene un pH de aproximadamente 8. En una realización de los métodos descritos en este documento, la matriz revestida de glutatión son esferas de agarosa unidas a glutatión. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la matriz revestida de glutatión es una columna. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la matriz revestida de glutatión tiene aproximadamente 5 mg/ml de NTNHA unida. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la proteasa es tripsina o Lys-C endoproteinasa.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para purificar un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor (polipéptido Hc) de la neurotoxina botulínica, que comprende las etapas de poner en contacto una disolución que comprende el polipéptido Hc con una matriz que lleva unida un polipéptido no hemaglutinina no tóxico (NTNHA) compatible, en condiciones apropiadas para la unión de la NTNHA al polipéptido Hc para formar así un complejo de polipéptido Hc-NTNHA, lavar la matriz para eliminar así los materiales no unidos y eluir el polipéptido Hc de la matriz poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia el polipéptido Hc del complejo de polipéptido Hc-NTNHA. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el dominio de unión al receptor del polipéptido Hc es un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B botulínico clostridial (B-Hc). En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el polipéptido Hc es un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT). En una realización de los métodos descritos en el presente documento, el polipéptido Hc es un polipéptido quimérico de neurotoxina botulínica (BoNT).

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una molécula descrita en el presente documento en un método para purificar un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A y la figura 1B son una ilustración de una realización de un principio y protocolo de purificación para BoNT como se describe en el presente documento. Figura 1A) Ilustración esquemática de la formación de un complejo bimolecular dependiente del pH de BoNT y NTNHA. LC: cadena ligera, HN: dominio de translocación, HCN, HCC: segmentos N-terminal y C-terminal del dominio de unión al receptor, respectivamente. La NTNHA tiene el mismo contenido de dominios que las BoNT, y se muestra como una proteína fusionada con GST (glutatión-S-transferasa) inmovilizada sobre una resina de glutatión-agarosa. Figura 1B) Un diagrama de flujo que describe un protocolo completo de purificación, activación y elución de BoNT utilizando su compañero de unión natural NTNHA.

La figura 2A y la figura 2B son imágenes de proteínas fraccionadas en gel. Los resultados experimentales indican la purificación satisfactoria de BoNT/B utilizando NTNHA/B como complejo modelo para las BoNT. Figura 2A) Se usa un anticuerpo monoclonal contra BoNT/B para controlar la presencia de BoNT/B a lo largo de cada etapa de purificación descrita en la figura 1B (excepto que las muestras en este caso no se trataron con tripsina). Figura 2B) Un gel SDS-PAGE de muestras seleccionadas teñidas con Coomassie muestra la pureza de BoNT/B purificada como se describe en el panel A. Se observa una banda principal (~150 kDa) correspondiente a BoNT/B en la fracción de elución.

La figura 3A y la figura 3B son imágenes de dos conjuntos de proteínas fraccionadas en gel. Los resultados experimentales indican que BoNT/B se activa eficazmente en los complejos de NTNHA/B^BoNT/B. Figura 3A) Inmunotransferencia representativa de la activación de BoNT/B unida a NTNHA por tripsina, que separa BoNT/B en dos fragmentos (100 kDa y 50 kDa, respectivamente). Los dos fragmentos de BoNT/B permanecen unidos entre sí por un solo enlace disulfuro. Se separan entre sí cuando se agrega DTT para reducir el enlace disulfuro. Figura 3B) La fracción de elución teñida con Coomassie muestra las bandas de toxina correspondientes a los fragmentos de toxina escindidos (a 100 y 50 kDa, respectivamente). La banda de 150 kDa es la parte de la toxina de longitud completa que queda por escindir.

La figura 4 es una imagen de proteínas fraccionadas en gel. Los resultados experimentales establecen una purificación satisfactoria de la toxina BoNT/A1B quimérica utilizando NTNHA/B. Se usó un anticuerpo policlonal contra BoNT/A para rastrear las etapas de purificación de una toxina quimérica BoNT/A1 B, que está formada por una cadena ligera de BoNT/A1 y un dominio de translocación, con el dominio de unión al receptor de BoNT/B. La BoNT/A1 B de longitud completa (la banda de 150 kDa en la fracción de elución) se purificó y eluyó con éxito usando NTNHA/B. Los inventores observaron que la banda sobresaliente a 100 kDa es un producto de degradación de esta toxina quimérica, probablemente cortada por proteasas endógenas en E. coli.

Las figuras 5A-5I (SEQ ID NO: 22-30) son una lista de las secuencias de aminoácidos de diversos serotipos de NTNHA y variantes de los mismos.

Las figuras 6A-6C son una ilustración de una realización de un principio y protocolo de purificación para BoNT, tal como se describe en el presente documento. Figura 6A) Ilustración esquemática de una formación de un complejo bimolecular dependiente del pH de BoNT y NTNHA. LC: cadena ligera, Hⁿ : dominio de translocación, H^cn, H^cc: segmentos N-terminal y C-terminal del dominio de unión al receptor, respectivamente. La NTNHA tiene el mismo contenido de dominios que las BoNT y se muestra como una proteína fusionada con GST (glutatión-s-transferasa) que puede inmovilizarse sobre una resina de glutatión-agarosa. La interacción entre BoNT y NTNHA en condiciones ligeramente ácidas (por ejemplo, aproximadamente pH 6), se puede interrumpir manipulando las condiciones del tampón hacia un pH neutro-alcalino. Figura 6B) Protocolo de activación y aislamiento de BoNT. Un diagrama de flujo que describe una estrategia para la purificación, la activación y la elución de BoNT marcadas y no marcadas de lisados brutos usando NTNHA. Figura 6C) Análisis de SDS-PAGE de un aislamiento típico de una BoNT inactiva (BoNT/B(^ry)) a partir de un lisado de E. coli aclarado usando GST-NTNHA/B inmovilizada sobre esferas de glutatión-agarosa. Las etapas de unión y lavado se realizaron a pH 6 y se eluyeron intercambiando el tampón a pH 8.

La figura 7A y la figura 7B demuestran que la BoNT/B aislada que usa NTNHA inmovilizada es pura y se une a su receptor neuronal canónico. Figura 7A) El análisis de SDS-PAGE (izquierda) muestra tres fracciones de elución que se reúnen y se concentran (carril 5). Se usa un anticuerpo monoclonal contra BoNT/B para detectar la toxina en todas las etapas (WB, derecha). Las fracciones eluidas contienen BoNT/B no activada como banda principal a ~ 150 kDa correspondiente a una toxina BoNT/B(^ry) monocatenaria. Figura 7B) Unión detectada por anisotropía: la toxina de longitud completa eluida muestra una afinidad similar por un fragmento marcado con FITC de su receptor de vesículas sinápticas canónico sinaptotagmina 1 (Syt 1) que su dominio su He recombinante; BoNT/A He no se une a Syt. Las barras de error representan la media MEE de 3 muestras.

Las figuras 8A-8C demuestran que la BoNT complejada se activa eficazmente, pero está protegida de la escisión inespecífica. Figura 8A) La activación (escisión) mediada por tripsina de BoNT/B(^ry) se visualiza en una SDS al 8%-PAGE. El desarrollo de la escisión de la toxina monocatenaria (“single chain”, SC) da como resultado dos fragmentos: la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) unidas por un solo enlace disulfuro. Figura 8B) El análisis de WB demuestra que la activación de BoNT/B mientras forma un complejo con NTNHA/B la protege de la tripsinización inespecífica al tiempo que permite un lavado y eliminación eficaces de endoproteinasa. Figura 8C) La Lys-C endoproteinasa también se puede usar como un activador específico para producir toxinas bicatenarias activas usando este método.

La figura 9 muestra el aislamiento de la toxina BoNT/A1B1 quimérica usando NTNHA/B. Se usa un anticuerpo policlonal contra BoNT/A para rastrear la purificación de una toxina quimérica compuesta por BoNT/A (LC(^ry), Hⁿ) fusionada al dominio He de BoNT/B. Las fracciones eluidas contienen proteína BoNT/A1B1 no activada a aproximadamente 150 kDa. La banda sobresaliente a aproximadamente 70 kDa es probablemente un fragmento de NTNHA/B que es reconocido por el anticuerpo policlonal.

Descripción detallada de ciertas realizaciones de la invención

Las neurotoxinas botulínicas (BoNT) son toxinas proteicas muy potentes producidas por Clostridium botulinum en fase de esporulación. En las últimas décadas, estos agentes mortales han sido útiles en el tratamiento de numerosos trastornos neuromusculares y en aplicaciones estéticas al bloquear la liberación de neurotransmisores en los músculos inyectados. Siendo, en la actualidad, agentes terapéuticos establecidos, las BoNT son producidas ampliamente a gran escala por varios fabricantes en todo el mundo. Los datos disponibles sugieren que los procedimientos de fabricación se basan en metodologías de décadas de antigüedad que utilizan cepas esporulantes, y el aislamiento de toxinas se logra mediante muchas etapas laboriosas e ineficaces de purificación en masa. Se necesita un método mejorado para la purificación y la activación directas de las BoNT terapéuticas.

Las neurotoxinas botulínicas (BoNT) son las sustancias más tóxicas conocidas por el ser humano. Se han identificado siete serotipos de proteínas BoNT (A-G) como productos de aproximadamente 150 kDa de diferentes cepas de la bacteria Clostridium botulinum (Montal, 2010). Estas toxinas provocan botulismo en animales, una enfermedad neuromuscular grave que se manifiesta en una parálisis flácida extrema. La base molecular de esta toxicidad reside en la capacidad de las toxinas para unirse potentemente a los receptores de las neuronas motoras en la unión neuromuscular (“neuromuscular junction”, NMJ), internalizarse por endocitosis y atravesar la membrana endosomal para liberar su cadena enzimática en el citosol. La proteasa liberada luego rompe la maquinaria celular (proteínas SNARE) responsable de la fusión de vesículas sinápticas en la NMJ, inhibiendo así la neurotransmisión al bloquear la liberación de acetilcolina (Blasi et al., 1993; Borden Lacy et al., 1998; Rossetto et al., 2014).

Las neurotoxinas botulínicas (BoNT) también se pueden utilizar como herramientas para controlar localmente las actividades musculares, especialmente las actividades no controladas o anomalías debidas a la espasticidad muscular (Masuyer et al., 2014). Esta función neuroinhibidora de las BoNT se exploró como una estrategia de tratamiento para muchos trastornos musculares, incluido el estrabismo y la gestión de múltiples distonías y disfunciones del tracto urinario inferior (“lower urinary tract dysfunctions”, LUTD) (Jankovic y Brin, 1991; Truong y Jost, 2006; Visco et al., 2012; Jiang et al., 2015). Como agente terapéutico y/o cosmético, las BoNT se pueden utilizar para paralizar los músculos faciales con el fin de suavizar las arrugas (Hexsel et al., 2011). Las aplicaciones adicionales de las toxinas tienen como objetivo aliviar la depresión y el tratamiento profiláctico de las migrañas (Finzi y Rosenthal, 2014; Jackson et al., 2012). Los usos clínicos de la toxina han despertado mucho interés público (Sifferlin, 2017).

Las neurotoxinas botulínicas (BoNT) pueden aislarse a partir de un crecimiento de una cepa de clostridium formadora de esporas y luego purificarse para obtener un producto final (Pickett ,2014). Los datos disponibles sobre procesos de producción y aislamiento de BoNT sugieren que los productores utilizan metodologías de cultivo y condiciones de crecimiento en cepas nativas similares a las que surgieron hace décadas (Pickett y Perrow, 2009; Snipe y Sommer, 1928; Duff, Wright, et al., 1957; Duff, Klerer et al., 1957; Bonventre y Kempe, 1959; Schantz y Johnson, 1992; Pickett, 2014). Tales métodos están limitados por la eficacia con la que la cepa nativa de clostridium puede producir la toxina y típicamente implican largos períodos de fermentación de la fuente natural de la toxina (cepas de clostridium productoras de esporas), seguidas de laboriosos procedimientos de aislamiento de toxinas a menudo bajo condiciones severas que implican varias precipitaciones de ácido/alcohol, cristalizaciones y/o etapas cromatográficas múltiples (DasGupta y Boroff, 1967; Tse et al., 1982; Schantz y Johnson, 1992; Malizio et al., 2000).

La producción de BoNT marcadas de forma recombinante es factible con la inclusión de un marcador de afinidad (por ejemplo, His6X o fusión con GST) para ayudar a la purificación de la toxina usando cromatografías de afinidad. Sin embargo, tales estrategias tienen desventajas, por ejemplo, en el uso de las BoNT como productos biológicos terapéuticos. Por ejemplo, los marcadores de afinidad pueden afectar negativamente a la actividad biológica de la toxina y/o tener una antigenicidad no deseada. La eliminación del marcador después de la purificación también requiere etapas enzimáticos y de purificación adicionales y se producen extremos N- o C-terminales no nativos en el producto final. Además, las BoNT recombinantes deben activarse después de la purificación mediante una endoproteinasa para obtener toxinas bicatenarias funcionales y potentes. Esta etapa proteolítica conduce a degradaciones inespecíficas que requieren etapas de purificación adicionales para eliminar las endoproteinasas yo los productos de degradación. Además de los desafíos de ingeniería y contención para la producción de toxinas a partir de cepas formadoras de esporas y purificaciones posteriores (Malizio et al., 2000; Pickett, 2014), estas estrategias recombinantes pueden comprometer la mayoría de las propiedades en el producto final, que van desde la calidad y la potencia hasta una reproducibilidad eficiente. Una nueva estrategia para aislar de manera segura y eficaz las BoNT terapéuticas activas sería beneficiosa para la producción a gran escala y el aislamiento fácil de las BoNT.

Los estudios sobre las propiedades bioquímicas y los mecanismos celulares por los cuales las neurotoxinas clostridiales ingresan al citosol neuronal han proporcionado cierta comprensión de las funciones estructurales, moleculares y mecánicas de las neurotoxinas clostridiales (Blasi et al., 1993; Borden Lacy et al., 1998; Dong et al., 2006; Rossetto et al., 2014). Los botulismos transmitidos por los alimentos requieren el paso de las toxinas intactas y otros productos de la bacteria a través del tracto gastrointestinal del huésped. La base molecular y estructural de esta capacidad para evitar la degradación fue un misterio hasta hace poco, cuando los complejos más grandes llamados "complejos de toxinas progenitoras" (“progenitor toxin complexes”, PTC) se caracterizaron para constituir el agente tóxico completo al que se enfrenta un organismo diana. Además de la toxina proteolíticamente activa, estos complejos de múltiples proteínas se componen típicamente de una proteína no hemaglutinina no tóxica (NTNHA) específica de serotipo y tres proteínas de hemaglutinina (HA) (Lee et al., 2014). Anteriormente se consideraba que ayudaban a las funciones de las toxinas (Schantz y Johnson, 1992), y ahora se sabe que los PTC escudan físicamente y protegen a las BoNT del entorno gastrointestinal hostil para llegar de manera segura a sus destinos: primero a las barreras epiteliales y luego a las NMJ, en donde se pueden internalizar en el citosol a través de mecanismos de reciclaje de vesículas sinápticas. En un estudio estructural (Gu et al., 2012), Gu y sus colaboradores identificaron en detalles atómicos un PTC mínimamente efectivo (m-PTC) en un complejo no covalente de BoNT/A:NTNHA/A. La estructura de cocristal del complejo toxina:NTNHA indicó una formación de complejo dependiente del pH. Se indicó que BoNT/A y NTNHA/A pueden formar un complejo compacto con afinidad de nivel nanomolar en condiciones ligeramente ácidas (aproximadamente pH 6). Sin embargo, se dijo que dicha formación de complejo no se producía a pH neutro-alcalino.

En el presente documento se describen composiciones y métodos relacionados con la purificación de BoNT que utilizan la afinidad natural de la molécula de BoNT por la proteína no hemaglutinina no tóxica (NTNHA). La BoNT forma naturalmente un complejo dímero con la proteína chaperona NTNHA y se protege frente a la degradación ácida y por proteasas en el tracto gastrointestinal. La unión es reversible y depende del pH, se une a un pH <7 y se disocia a un pH> 7,4. La proteína NTNHA se agrega a una mezcla que contiene BoNT a un pH que estimula la unión. El complejo de BoNT:NTNHA se aísla de otros componentes de la mezcla por inmovilización de la NTNHA dentro del complejo. Después del lavado, la BoNT se libera del complejo elevando el pH para estimular la disociación. Dado que este método no se basa en una modificación de la afinidad de la BoNT, se pueden purificar las formas no marcadas de la toxina.

Los métodos de purificación descritos en el presente documento también hacen posible la activación de la BoNT mientras se encuentra en el complejo de BoNT:NTNHA. Después de la activación, la BoNT puede liberarse del complejo generando así una forma purificada y activada de la toxina.

Los aspectos de la descripción se relacionan con un método para purificar una BoNT. Normalmente, la BoNT se encuentra en el contexto de una disolución acuosa que contiene componentes contaminantes, tales como un extracto celular. El método comprende combinar la disolución con la molécula de NTNHA en condiciones apropiadas para la unión de la BoNT a la NTNHA. En la práctica, esto puede implicar la combinación de la molécula de NTNHA con la disolución acuosa (por ejemplo, extracto celular o un extracto celular aclarado). La BoNT se puede aislar en virtud de la molécula de NTNHA. Generalmente, esto se logra mediante la inmovilización de la NTNHA sobre una matriz. Los materiales no unidos se retiran del complejo, por ejemplo, lavando la matriz (por ejemplo, usando una cantidad de tampón de lavado de 3-4 volúmenes de la matriz). Después del lavado, la BoNT se libera del complejo, por ejemplo, por elución de la NTNHA unida a la matriz, para producir un polipéptido purificado.

La BoNT puede activarse antes de liberarse del complejo mediante digestión con una proteasa. Esto se puede lograr poniendo en contacto el complejo unido a la matriz con una proteasa en condiciones apropiadas para la escisión de la BoNT que, por lo demás, no escindan el complejo (por ejemplo, que conserven el pH requerido). La proteasa se elimina junto con otros materiales no unidos lavando la matriz (por ejemplo, con un tampón de lavado). La BoNT activada y purificada después se puede eluir poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia la BoNT del complejo de NTNHA (por ejemplo, con un tampón de elución). En algunas realizaciones, no se requiere ni se desea la activación del polipéptido.

La NTNHA utilizada en el método debe ser compatible con la BoNT. El término compatible, cuando se usa en referencia a la NTNHA y la BoNT, se refiere a que las moléculas pueden formar un complejo compacto y estable entre sí. En una realización, la BoNT y la NTNHA son componentes del mismo complejo de proteínas del serotipo de la BoNT que se encuentra en la naturaleza. Esto ocurre cuando las secuencias codificadoras de BoNT y NTNHA son del mismo operón. Como el término "serotipo" se usa en este documento para describir la molécula de NTNHA, ser "de un serotipo" se refiere a una molécula de NTNHA derivada de un operón que codifica un serotipo específico de BoNT. Compatible también puede referirse a una BoNT o polipéptido quimérico que tiene una región (por ejemplo, la región Hc) que es compatible con la NTNHA. En una realización, la NTNHA y la región Hc de la BoNT se derivan ambas del mismo complejo de serotipo de la BoNT de origen natural.

La inmovilización de la NTNHA a la matriz puede producirse antes o después de la unión de la BoNT. En una realización, la NTNHA se une a una matriz y se añade una disolución que comprende la BoNT a la matriz para así poner en contacto el polipéptido Hc con la NTNHA y estimular la formación del complejo. En una realización, la NTNHA y la BoNT están en un complejo antes de la unión de la NTNHA a la matriz.

En una realización, se introduce un resto de afinidad en la proteína NTNHA (por ejemplo, mediante expresión como una proteína de fusión) y la proteína marcada se usa para unir y aislar la BoNT en condiciones que estimulan la unión de BoNT:NTNHA. El complejo de BoNT:NTNHA se aísla mediante purificación por afinidad de la NTNHA dentro del complejo.

Los tampones de unión, los tampones de incubación, los tampones de lavado y los tampones de digestión de proteasas estimulan las condiciones adecuadas para la formación y la conservación del complejo de Hc-NTNHA. Esto incluye, sin limitación, tener un pH que estimula la formación de complejos. Normalmente, este será un pH de menos de 7,5, por ejemplo, menos de 6. En una realización, el pH del tampón es de 2-8. En una realización, el pH del tampón es de 5-7. En una realización, el pH es aproximadamente 5, aproximadamente 6 o aproximadamente 7. Los tampones de unión, los tampones de incubación y los tampones de lavado pueden ser todos muy similares o iguales. Los tampones pueden contener además componentes adicionales distintos de los especificados en este documento. En una realización, el tampón contiene además un agente estabilizante para el polipéptido de BoNT (por ejemplo, albúmina sérica, polisacárido, trehalosa o tensioactivo). El pH de los tampones se puede optimizar para los diversos componentes dentro de los intervalos especificados. Los expertos en la técnica apreciarán que el pH del tampón debe conservar la estructura de la proteína general, evitando un pH que se aproxime al PI de la proteína que puede precipitar la proteína.

Los tampones preferiblemente tendrán fuerza iónica fisiológica (por ejemplo, dentro del intervalo de KCl o NaCl 100­ 200 mM). Hay una diversidad de sales disponibles para crear la fuerza iónica requerida. Las concentraciones de sales demasiado altas pueden alterar las interacciones debido a la interferencia polar/iónica. En una realización, la concentración de sales es 400 mM o menos. También se espera que las condiciones de bajo contenido de sales sean suficientes para la actuación. En una realización, la concentración de sales es 150 mM. En una realización, el tampón comprende MES 50 mM, NaCl 150 mM y tiene pH 6. En una realización, el tampón en el que se produce la unión (tampón de unión) comprende además uno o más inhibidores de proteasa (por ejemplo, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)). En una realización, el tampón de unión comprende PMSF a una concentración de aproximadamente 0,1 a 1 mM. En una realización, el PMFS es de aproximadamente 1 mM.

El lavado se puede realizar, por ejemplo, utilizando un tampón de lavado. Una cantidad típica de lavado es de 3-4 volúmenes de matriz.

La molécula de BoNT contiene varios dominios y se une a la molécula de NTNHA a través de su dominio de unión al receptor (también denominado dominio Hc). Como tales, los métodos descritos en el presente documento son aplicables a la purificación de cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión al receptor (polipéptido Hc) de la neurotoxina botulínica (por ejemplo, BoNT de longitud completa o un fragmento de la misma que comprenda el polipéptido Hc, o un polipéptido quimérico que comprenda el dominio Hc) .

En una realización de los métodos descritos en este documento, la NTNHA está presente en una proporción molar entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 10:1 con respecto a la BoNT o el dominio de unión al receptor de la misma, por ejemplo, aproximadamente 2:1,3:1,4:1 o 5:1 con respecto a la BoNT o al dominio de unión al receptor de la misma.

La activación de la BoNT unida, o un fragmento de la misma, se logra poniendo en contacto el complejo de BoNT :NTNHA (por ejemplo, cuando está unido a la matriz) con una proteasa apropiada. En una realización, la proteasa escinde una proteína después de un resto lisina. En una realización, las proteasas son, sin limitación, tripsina, pepsina, Lys-C endoproteasa, Lys-N endoproteinasa, arginil endopeptidasa, plasmina, omptina o la proteasa clostridial como se describe en el documento EP2524963. Las condiciones preferidas no darán como resultado una degradación sustancial de la NTNHA, de cualquier resto de afinidad asociado o de su diana de unión. Las condiciones apropiadas para la escisión incluyen la concentración apropiada de proteasa y las condiciones apropiadas para la actividad de la proteasa (por ejemplo, temperatura, tiempo de incubación, componentes del tampón, etc.). Estas condiciones se pueden lograr mediante el uso de un tampón de digestión de proteasa apropiado. La cantidad de proteasa usada puede determinarse por la cantidad de molécula de NTNHA o por la cantidad de molécula de BoNT. En una realización, la proteasa está presente en una proporción molar de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1000 con respecto a la molécula de NTNHA. En una realización, la proteasa está presente en una proporción molar de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:100 con respecto a la molécula de NTNHA, por ejemplo, aproximadamente 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 o 1:50. En una realización de los métodos descritos en el presente documento, la proteasa se añade en una proporción molar de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1000 con respecto a la BoNT (por ejemplo, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:100 con respecto a la BoNT), o aproximadamente 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 o 1:50.

Los expertos en la técnica determinarán las condiciones apropiadas para la proteasa específica utilizada. El tiempo de exposición a la proteasa también variará con la proteasa, la concentración utilizada y la temperatura. En una realización, la proteasa se pone en contacto a una temperatura entre 2°C y 40°C, preferiblemente entre 4°C y 37°C, (por ejemplo, 4°C, 16°C, 20°C o 37°C) . En una realización, la proteasa se pone en contacto a temperatura ambiente (aproximadamente 20-22°C).

En una realización, la proteasa se pone en contacto durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 18 horas, preferiblemente entre 30 minutos y 5 horas (por ejemplo, aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 2, 3, 4 o 5 horas). En una realización, la proteasa se pone en contacto durante aproximadamente 4 horas. En una realización, la proteasa es Lys-C endoproteasa y el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos.

En una realización, la proteasa se pone en contacto con la matriz a un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5. En una realización, la proteasa se pone en contacto con la matriz a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 6, 7 u 8).

En una realización, la proteasa se selecciona de las proteasas tripsina y Lys-C endoproteinasa, y se pone en contacto con la matriz a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas a un pH entre 6 y 7.

La elución de la BoNT del complejo de BoNT-NTNHA se logra usando una disolución acuosa con un pH que estimula la disociación del complejo (denominada en el presente documento tampón de elución). Preferiblemente, el tampón de elución escinde el complejo de BoNT-NTNHA al tener el pH apropiado, al mismo tiempo que conserva sustancialmente la integridad del polipéptido Hc y conserva sustancialmente la inmovilización de la NTNHA (por ejemplo, conservando la unión de la NTNHA a una matriz). Además, el tampón de elución tendrá preferiblemente fuerza iónica fisiológica. Una diversidad de tampones disponibles son apropiados para su uso (por ejemplo, Tris, MOPS, HEPES, tampón fosfato, etc.). En una realización, el tampón de elución es el mismo que el tampón de unión y/o de lavado, difiriendo solo en el pH. En una realización, el tampón de elución es Tris aproximadamente 50 mM, NaCl 150 mM con un pH apropiado analizado en este documento (por ejemplo, pH 8).

El tampón de elución usado (por ejemplo, los descritos en este documento) puede tener un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente un pH de 11. En una realización, el pH es de 7,5 o mayor. En una realización, el pH es aproximadamente 8. El tampón de elución puede contener además componentes adicionales distintos de los especificados en este documento. El pH del tampón de elución se puede optimizar para los diversos componentes que contiene.

Normalmente, la BoNT se purifica a partir de un extracto celular. En una realización, el extracto celular es un extracto celular aclarado. El término “extracto celular aclarado” se refiere a que el extracto está sustancialmente libre de todo material en partículas, como cuando este se elimina por centrifugación y/o filtración.

La BoNT y la NTNHA pueden coexpresarse en la misma célula huésped, por ejemplo, E. coli. El método puede utilizar la NTNHA expresada en la misma con la BoNT. Como alternativa, la BoNT y la NTNHA se pueden expresar en diferentes células huésped. Los extractos de células respectivos pueden usarse para producir/aislar las proteínas respectivas. La BoNT se puede producir de manera recombinante en una célula huésped heteróloga, tal como E. coli, o producirse en su célula clostridial nativa. La NTNHA se puede producir de manera recombinante en una célula huésped heteróloga, tal como E. coli, o en su célula clostridial nativa.

“Purificación” o “purificado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una BoNT, o un fragmento de la misma, que es “sustancialmente pura” con respecto a otros componentes de una preparación (por ejemplo, otros polipéptidos). Puede referirse a una BoNT o fragmento que es al menos aproximadamente 50%, 60%, 70% o 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% pura, con respecto a otros componentes. Dicho de otro modo, las expresiones “sustancialmente puro” o “esencialmente purificado”, con respecto a una BoNT o fragmento, se refieren a una preparación que contiene menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 15%, 10%, 8%, 7% , lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos de 1% de uno o más de otros componentes (por ejemplo, otros polipéptidos o componentes celulares).

Otros aspectos de la descripción se refieren a los componentes usados en los métodos descritos en este documento. Un aspecto de la descripción se refiere al polipéptido de NTNHA usado para unirse a la BoNT. El polipéptido de NTNHA puede ser NTNHA de longitud completa o un fragmento funcional del mismo. Se considera que un fragmento funcional de NTNHA conserva la propiedad de unión al dominio Hc de BoNT compatible y protege la BoNT de la degradación, al tiempo que permite la activación. El polipéptido de NTNHA puede comprender además aminoácidos heterólogos adicionales. Tal como se usa el término en este documento, heterólogo se refiere a una molécula de un origen diferente. Por ejemplo, un resto de afinidad heterólogo difiere de cualquier resto de afinidad interno presente en la naturaleza en la molécula de NTNHA.

Las secuencias heterólogas se pueden unir covalentemente a la NTNHA (por ejemplo, mediante expresión como una proteína de fusión o mediante modificación postraduccional de la molécula de NTNHA). En una realización, las secuencias de aminoácidos heterólogas adicionales son un resto de afinidad heteróloga.

Las secuencias de aminoácidos heterólogas pueden estar presentes en el extremo N-terminal, C-terminal o internamente. Dichas secuencias, cuando estén presentes, deberían diseñarse para conservar la interacción de la NTNHA con el dominio Hc de la BoNT. En una realización, la secuencia heteróloga es un resto de afinidad y no existe una secuencia intermedia entre el resto de afinidad y la secuencia de NTNHA. En una realización, los aminoácidos heterólogos están ubicados en el extremo N-terminal de la NTNHA.

En una realización, los aminoácidos heterólogos carecen de un sitio de escisión de proteína funcional como los que se usan típicamente para retirar un marcador de afinidad de una proteína de fusión. En una realización, la descripción excluye un polipéptido de NTNHA que comprende un marcador myc fusionado al extremo N, por ejemplo, NTNHA-A1 (Gu et al., Science, 335: 977-981 (2012)).

En un aspecto de la descripción, el polipéptido de NTNHA está unido de forma estable a una matriz. La unión estable se refiere a la unión que no se ve alterada por las condiciones de los diversos tampones descritos en este documento. La unión a la matriz puede ser mediante interacciones covalentes o no covalentes. En una realización, la unión a la matriz es a través de la interacción de un resto de afinidad heterólogo en el polipéptido de NTNHA con un resto de unión correspondiente sobre la matriz (por ejemplo, un resto de afinidad por GST en NTNHA con glutatión presente en la matriz).

En una realización, el polipéptido de NTNHA en las diversas formas descritas en este documento (por ejemplo, unido a un resto de afinidad y/o unido de forma estable a una matriz) está además en un complejo con una BoNT compatible o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor (Hc) de la misma. En una realización, la BoNT o Hc es una proteína nativa. En una realización, la BoNT o Hc es un dominio de unión al receptor modificado genéticamente (por ejemplo, con unión aumentada para un receptor específico).

En una realización, el polipéptido de NTNHA que comprende el resto de afinidad se une además a una diana de unión mediante la unión del resto de afinidad. Además, la diana de unión se puede unir de forma estable a una matriz.

Otro aspecto de la descripción se refiere a una disolución acuosa que contiene el polipéptido de NTNHA descrito en el presente documento. El polipéptido de NTNHA dentro de la disolución puede tener cualquier forma descrita en el presente documento, tal como unido a un resto de afinidad, unido de manera estable a una matriz y/o unido a una diana de unión a través de un resto de afinidad, cualquiera de los cuales puede estar unido adicionalmente a una BoNT compatible.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican la NTNHA y la proteína de fusión del resto de afinidad descritas en el presente documento también están incluidas en la descripción. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas se pueden optimizar para la expresión en E. coli. En una realización, las secuencias de ácido nucleico están en el contexto de un vector (por ejemplo, un vector de expresión). Los vectores deben ser compatibles con las células huésped en las que se pretende propagar y/o expresar los ácidos nucleicos.

NTNHA

La NTNHA es una proteína de 140 kDa sintetizada por Clostridium botulinum. Los genes NTNHA se encuentran dentro de los operones que codifican una proteína BoNT de serotipo concreto. La BoNT y la NTNHA producidas a partir del mismo operón son componentes del mismo complejo de proteína BoNT de origen natural y forman un complejo compacto y estable entre sí. La NTNHA se une a la BoNT con una K^d de aproximadamente 30,8 nM, con una estequiometría de 1:1 (Shenyan et al., Science, 335: 977-981 (2012)). Preferiblemente, la NTNHA se deriva de la misma cepa de Clostridium botulinum que produce ese serotipo (y subtipo) de BoNT o fragmento Hc que se está purificando (A, A1, A2, A3, A4-A, A4-B, tipos B, C, C1, D, E, F o G). Se puede esperar cierto solapamiento de unión entre serotipos. Las secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas NTNHA están disponibles para los expertos en la técnica, al igual que las secuencias de ácidos nucleicos codificadoras, tales como las proteínas NTNHA derivadas de operones que codifican los serotipos de BoNT: A1 (YP_001253341.1), A2 (WP_012704905), B (WP_003404192.1), C1 (YP_398515.1), D (BAA75083.1), E (WP_003409842), F (YP_001390122.1) y G (CAA61228.1). En una realización, la descripción excluye el uso de la molécula de NTNHA/A (NTNHA/A1) y los ácidos nucleicos codificadores.

BoNT

Se conocen en la técnica diferentes serotipos de neurotoxinas botulínicas (A-G) y también existen muchos subtipos (A1, A2, A3, A4-A, A4-B). Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para purificar la BoNT nativa (producida por bacterias clostridiales) o una proteína recombinante. La BoNT recombinante se puede producir en cualquier otro tipo de huésped, tales como otras células procariotas, células eucariotas, tejidos u organismos.

También se pueden aislar variantes mutadas de BoNT (por ejemplo, resultantes de sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos). En una realización, la variante tiene una mayor toxicidad (por ejemplo, al tener una mayor unión a los receptores celulares). Tales variantes mutadas pueden comprender un “dominio de unión al receptor modificado” o “H^c modificada”. Una Hc modificada, tal como se usa la expresión en este documento, tiene una o más mutaciones de sustitución de origen no natural que mejoran la unión de la molécula de la neurotoxina de C. botulinum en la que está comprendida, a un receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada en la superficie de una célula diana. Una molécula de este tipo se genera típicamente mediante tecnología de recombinación genética. La H^c modificada tiene una actividad de unión para el receptor de la neurotoxina de C. botulinum que es más fuerte que su homólogo de tipo salvaje. Se describen ejemplos de dominios de unión al receptor modificados en la solicitud de EE. UU. 2015/166972. La invención es además útil para aislar cualquier molécula que posea o que conserve la actividad biológica de la toxina botulínica, tal como una proteína de fusión (o quimérica), una proteína truncada, un fragmento de proteína o una variante mutada de la toxina botulínica, tal como una proteína que tenga uno o más aminoácidos añadidos, delecionados o reemplazados.

En una realización, la BoNT aislada mediante los métodos descritos en este documento tiene actividad tóxica. La actividad de la BoNT se puede determinar midiendo la actividad proteolítica en el sustrato apropiado. La toxina botulínica de los tipos A y E escinde la proteína SNAP-25. La toxina botulínica de los tipos B, D, F y G escinde la proteína de membrana asociada a vesículas (“vesicle-associated membrane protein”, VAMP, llamada sinaptobrevina). La toxina botulínica de tipo C1 escinde tanto SNAP25 como también la proteína sintaxina. Los ensayos que pueden usarse para determinar esta actividad son conocidos en la técnica, tales como los descritos en el documento WO 95/33850.

Restos de afinidad

La NTNHA se puede unir a un resto de afinidad. El resto de afinidad se une específicamente a una diana de unión en las condiciones de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8). Se conocen en la técnica una diversidad de restos de afinidad y están disponibles para su uso en la invención. Un resto de afinidad puede ser miembro de una pareja de unión específica, tal como un epítopo que es específicamente reconocido por un anticuerpo. Cuando se usa un epítopo como resto de afinidad, el anticuerpo se usa como diana de unión. Muchas de estas combinaciones de restos de afinidad:anticuerpos son conocidas en la técnica y están disponibles en el mercado. Los ejemplos incluyen, sin limitación, c-myc (Roth et al. (1991), J. Cell Biol., 115:587-596), myc (EQKLISEEDL (SEQ ID NO:8); Evan G. I. et al. (1985), Mol. Cell Biol., 5:3610-3616; Munro S. y Pelham H. R. B. (1987), Cell, 48:899-907; Borjigin J. y Nathans J. (1994), 269:14715-14727; Smith D. J. (1997), BioTechniques, 23:116-120), FlAG.RTM. (patentes de Ee . UU. n.os 4.703.004; 4.851.341 y 5.011.912), HA, derivada de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson I. A., et al. (1984), Cell, 37:767; Field J. et al., Mol. Cell Biol. (1988), 8:2159-2165; Xu Y. et al. (2000), Mol. Cell Biol., 20:2138-2146), IRS (RYIRS (SEQ ID NO:9); Liang T. C. et al. (1996), 329:208-214; Luo W. et al. (1996), Arch. Biochem. Biophys., 329:215-220), AU1 y AU5 ((DTYRYI (SEQ ID NO:10) y TDFLYK (SEQ ID NO:11)); Lim P. S. et al. (1990), J. Infect. Dis., 162:1263-1269; Goldstein D. J. et al. (1992), 190:889-893; Koralnik I. J. et al. (1993), J. Virol., 67:2360-2366), glu-glu (un epítopo de 9 aminoácidos del antígeno T intermedio del virus del polioma (EEEEYMPME (SEQ ID NO:12)); Grussenmeyer, T. etal. (1985), PNAS. EE.UU. 82:7952-7954; Rubinfeld. B. et al. (1991), Cell, 65:1033-1042), KT3 (un epítopo de 11 aminoácidos del antígeno T grande de SV40 (KPPTPPPEPET (SEQ ID NO:13)); MacArthur H. y Walter G. (1984), J. Virol., 52:483-491; Martin G. A. et al. (1990), 63:843-849; Di Paolo G. et al. (1997), 272:5175-5182), T7 (un péptido conductor de 11 aminoácidos de la proteína de la cápsida principal de T7 (MASMt Gg QQMG (SEQ ID nO:14))), S-TAG, HSV (un péptido de 11 aminoácidos de la glicoproteína D del virus del herpes simplex (QPELAPEDPEDC (SeQ ID NO:15))), VSV-G (un epítopo de 11 aminoácidos del carboxilo terminal de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO:16)); Kreis T. (1986), EMBO J. 5:931-941; Turner J. R. et al. (1996), 271:7738-7744), Anti-Xpress (epítopo de 8 aminoácidos (DLYDDDK (SEQ ID NO:17))), y VS (un epítopo de 14 aminoácidos del paramoxivirus SV5, (GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO:18))).

Otro epítopo usado habitualmente como un resto de afinidad es el FLAG.RTM. Esta secuencia consiste típicamente en DYKDDDDK (SEQ ID NO:19), pero cualquier combinación de 3 a 6 restos ácido aspártico o glutámico también se considera una secuencia FLAG.RTM. El marcador de afinidad FLAG.RTM se ha utilizado eficazmente en diversos sistemas de expresión para la purificación de proteínas de fusión recombinantes (Brizzard et al. (1994), BioTechniques, 16:730-735; Lee et al. (1994), Nature, 372:739-746.; Xu et al. (1993), Development, 117:1223-1237; Dent et al. (1995), Mol. Cell Biol., 15:4125-4135; Ritchie et al. (1999), BioChem Journal, 338: 305-10).

También hay muchos restos de afinidad que no están basados en epítopos, y estos también se pueden usar en la invención. GST (glutatión-S-transferasa) es un resto de afinidad previsto para su uso en la presente invención (patentes de EE. UU. n.os 5.654.176; 6.303.128 y 6.013.462). El resto de afinidad de polihistidina es una secuencia consecutiva no natural de restos aminoácidos de histidina que incluye cualquier péptido correspondiente descrito en las patentes de EE. UU. n.os 5.284.933 y 5.310.663. Normalmente, tales secuencias comprenden de cuatro a diez restos histidina (SEQ ID NO:20).

En una realización, el resto de afinidad es glutatión-S-transferasa (GST), marcador C-myc, dominio de unión a quitina, proteína de unión a estreptavidina (SBP), dominio de unión a celulosa, péptido de unión a calmodulina, marcador S, Strep-tag II, FLA, proteína A, proteína G, marcador de afinidad de histidina (HAT), poli-his o proteína de unión a maltosa (MBP). En una realización, el resto de afinidad no es GST, marcador C-myc, dominio de unión a quitina, SBP, dominio de unión a celulosa, péptido de unión a calmodulina, marcador S, Strep-tag II, FLA, proteína A, proteína G, HAT, poli-His o MBP. En una realización, el resto de afinidad es AviTag™, V5, Myc, T7, FLAG, HSV, VSV-G, poli-His (típicamente His6 (SEQ ID NO:1)), biotina o STREP (WSHPQFEK (SEQ ID NO:21)). En una realización, el resto de afinidad no es AviTag™, V5, Myc, T7, FLAG, HSV, VSV-G, poli-His, biotina o STREP.

Los miembros de la pareja de unión que interactúan con el cuerpo de un mamífero (ser humano) o que se encuentran naturalmente en él, tales como los anticuerpos que se unen naturalmente a la NTNHA, o las moléculas reconocidas por transportadores en el hígado y/o el riñón, se excluyen de las composiciones descritas en el presente documento.

Dianas de unión para restos afinidad

Las dianas de unión se utilizan para inmovilizar el polipéptido de NTNHA mediante la unión del resto de afinidad. La diana de unión típicamente será específica para un resto de afinidad concreto. Las dianas de unión se unen a la matriz de manera que se conserva su afinidad de unión por el resto de afinidad. Por ejemplo, la diana de unión para un marcador de epítopo es un anticuerpo que se une específicamente al marcador de epítopo. La diana de unión de GST es el glutatión. La diana de unión de la biotina es la avidina o la estreptavidina. La diana de unión para STREP es Strep-Tactin. La diana de unión de poli-His son los iones bivalentes de níquel o cobalto. La diana de unión de la proteína G es la porción Fc de IgG. La diana de unión de la proteína A es la porción Fc de inmunoglobulina de diversas especies.

Matriz

Se pueden usar como matriz en la invención diversas sustancias inertes que se usan típicamente para inmovilizar una molécula a través de una unión física. La matriz, también denominada sustrato, puede estar formada por una amplia diversidad de materiales y puede tener una diversidad de formas. Los materiales incluyen, sin limitación, metal, aleación de metal, polímero, plástico, papel, vidrio, tela, material de envasado, material biológico, tal como células, tejidos, hidrogeles, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y cualquier combinación de los mismos. Las formas que puede tener la matriz incluyen, sin limitación, esferas (incluidas microesferas de polímero, microesferas magnéticas y similares), filtros, fibras, tamices, mallas, tubos, fibras huecas, andamiajes, placas, canales y cualquier combinación de los mismos. Otros ejemplos de matrices de sustrato conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a andamiajes de ácidos nucleicos, andamiajes de proteínas, andamiajes de lípidos, dendrímeros, micropartículas o microesferas, nanotubos y placas de microtitulación. En una realización, los componentes de la matriz tienen forma de columna.

En una realización, el polipéptido de NTNHA se une a la matriz mediante el acoplamiento de un resto de afinidad presente en la NTNHA a una diana de unión presente en la superficie de la matriz. Están disponibles para su uso diversos restos de afinidad y dianas de unión, ejemplos de los cuales se analizan en el presente documento. En una realización, la matriz se reviste con glutatión como diana de unión (por ejemplo, esferas de agarosa unidas a glutatión). En una realización, la matriz revestida de glutatión tiene forma de columna.

En una realización, el polipéptido de NTNHA se conjuga directamente a la superficie de una matriz a través de una interacción covalente o no covalente. Esto puede producirse a través del N-terminal, el C-terminal o internamente a la molécula. Además, puede ser útil incluir un conector en el polipéptido de NTNHA para facilitar la unión al sustrato.

La conjugación con el sustrato se puede lograr usando una diversidad de métodos en la técnica. Los ejemplos de unión covalente incluyen, sin limitación, acoplamiento de silano (Weetall, 15, Adv. Mol. Cell Bio., 161 (2008); Weetall, 44, Meths. Enzymol., 134 (1976)), y el uso de una reacción de NHS o un agente de conjugación. La unión no covalente puede basarse en interacciones iónicas, interacciones de Van der Waals, interacciones dipolo-dipolo, enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas y/o interacciones de reconocimiento de forma. Sin limitaciones, la conjugación puede incluir un enlace o agente de conjugación estable o lábil. Los ejemplos de conjugaciones incluyen, pero no se limitan a un enlace covalente, un enlace amida, adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono, cicloadición de Huisgen de alquino azida, reacción de Diels-Alder, enlace disulfuro, enlace éster, adiciones de Michael, enlace silano, uretano, reacciones de apertura de un anillo nucleofílicas: epóxidos, química de carbonilo no aldólico, reacciones de cicloadición: cicloadición 1,3-dipolar, sensible a la temperatura, agente de unión o de conjugación sensible a la radiación (IR, IR cercano, UV), enlace o agente de conjugación sensible al pH, enlaces no covalentes (por ejemplo, formación de complejos de carga iónica, enlaces de hidrógeno, interacciones pi-pi, interacción ciclodextrina/adamantilo del huésped) y similares. Tal como se usa en este documento, la expresión “agente de conjugación” significa un resto orgánico que conecta dos partes de un compuesto. Los conectores comprenden típicamente un enlace directo o un átomo, tal como oxígeno o azufre, una unidad, tal como NR1, C(O), C(O) NH, SO, SO2, SO2NH o una cadena de átomos, en los que uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por O, S, S(O), SO2, NH, C(O)N(R1 )2, C(O), un grupo de enlace escindible, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocíclico sustituido o no sustituido; en los que R1 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido.

Se encuentra disponible una diversidad de químicas de conjugación para conjugar dos moléculas y se puede usar para unir el polipéptido de NTNHA a una matriz. Los ejemplos de moléculas de acoplamiento y/o grupos funcionales para conjugar al menos una molécula dirigida a microbios modificada a un sustrato incluyen, pero no se limitan a un polietilenglicol (PEG, NH2-PEGX-COOH que puede tener un brazo espaciador de PEG de varias longitudes X, siendo 1 <X <100, por ejemplo, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K y similares), un agente de conjugación de maleimida, PASilación, HESilación, un agente de conjugación de suberato de bis(sulfosuccinimidilo), un agente de conjugación de ADN, un agente de conjugación de péptidos, un agente de conjugación de silano, un agente de conjugación de polisacárido, un agente de conjugación hidrolizable y cualquier combinación de los mismos.

Los expertos en la técnica pueden determinar y optimizar la cantidad de NTNHA unida a la matriz. En una realización, la matriz tiene aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de NTNHA. En una realización, la matriz tiene aproximadamente 5 mg/ml de polipéptido o aproximadamente 2 mg/ml de polipéptido.

Proteasas

Cualquier proteasa que escinda a la BoNT puede usarse en los métodos descritos en el presente documento. Dichas proteasas incluyen, sin limitación, tripsina, pepsina, Lys-C endoproteinasa, Lys-N endoproteinasa, arginil endopeptidasa, plasmina, omptina y una proteasa clostridial como se describe en el documento EP2524963. En una realización, la proteasa es tripsina o Lys-C endoproteinasa. En una realización, la proteasa es una proteasa que escinde un sitio de escisión no nativo (es decir, exógeno) de BoNT. En tales toxinas clostridiales, el sitio de escisión por proteasa nativa (también conocido como sitio de activación) se modifica o reemplaza por un sitio de escisión por proteasa que no es nativo de esa toxina clostridial. Las proteasas no nativas que pueden emplearse incluyen enteroquinasa (DDDDK| (SEQ ID NO: 2)), factor Xa (IEGRJ, (SEQ ID NO:3)/IDGR| (SEQ ID NO:4)), TEV (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQ|G (SEQ ID NO:5)), trombina (LVPR|GS (SEQ ID NO:6)) y PreScission (LEVLSEQ|GP (SEQ ID NO:7)) (j. denota el sitio de escisión).

Vectores de ácido nucleico

Otro aspecto de la descripción se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de NTNHA descrito en el presente documento. El vector puede ser un vector únicamente para la propagación de una secuencia de ácido nucleico en un organismo o célula o también puede ser para la expresión de la secuencia de ácido nucleico como un polipéptido en ese organismo o célula.

En una realización, el vector es un vector de expresión. Dicho vector de expresión se denomina en el presente documento una construcción de expresión y comprende una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento unida operativamente al vector de expresión útil para expresar la molécula de ácido nucleico en una célula o extracto libre de células. Puede emplearse una amplia diversidad de vectores de expresión para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de NTNHA descrito en este documento, que incluye, sin limitación, un vector de expresión viral (por ejemplo, retrovirus, virus de vaccinia, virus adenoasociado, virus del herpes o virus del papiloma bovino), un vector de expresión procariota, un vector de expresión eucariota, tal como, por ejemplo, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto, un vector de expresión de mamífero y un vector de expresión de extracto libre de células. En una realización, el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, el vector de expresión de a Dnc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) o pSPORT1 (Invitrogen) o vectores derivados de baculovirus. Se pueden usar vectores de expresión derivados de virus para el transporte de los ácidos nucleicos de la descripción a una población de células diana. Se encuentran disponibles en la técnica varios vectores de expresión para producir fusiones con restos de afinidad tales como los descritos en el presente documento. La selección, la fabricación y el uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos habituales realizados por los expertos en la técnica.

Células huésped

Otro aspecto de la descripción se refiere a una célula en la que se propaga y/o expresa una o más de las moléculas descritas en este documento (por ejemplo, el polipéptido de NTNHA y/o el polipéptido de BoNT). Tal célula se denomina célula huésped. Las células huésped pueden modificarse genéticamente para expresar las moléculas descritas en el presente documento, tal como por transfección con un vector que codifica las proteínas y/o pueden expresar una o más de las moléculas (por ejemplo, la BoNT) de forma natural. En una realización, la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de NTNHA (por ejemplo, en el contexto de un vector). En una realización, la célula huésped expresa el ácido nucleico (por ejemplo, procedente de un vector de expresión). En algunas realizaciones, las células utilizadas según la presente divulgación incluyen células procariotas y células eucariotas. Los ejemplos no limitantes de células procariotas son células de Escherichia coli, células de Clostridium botulinum, células de Clostridium tetani, células de Clostridium beratti, células de Clostridium butyricum, o células de Clostridium perfringens. Los ejemplos no limitantes de células eucariotas son células de insecto, células de levadura, células de anfibio, células de mamífero, células vegetales. Los ejemplos no limitantes de células de insecto son células de Spodoptera frugiperda, células de Aedes albopictus, células de Trichoplusia ni, células de Estigmene acrea, células de Bombyx mori y células de Drosophila melanogaster. Los ejemplos no limitantes de células de levadura son células de Saccharomyces cerevisiae, células de Schizosaccharomyces pombe, células de Pichia pastoris, células de Hansenula polymorpha, células de Kluyveromyces lactis y células de Yarrowia lipolytica.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, las expresiones y los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que entienden habitualmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos, etc., concretos descritos en este documento y, así, pueden variar. La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en este documento están modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente”, cuando se utiliza para describir la presente invención en relación con los porcentajes, puede significar ± 1 %, ± 5% o ± 10%.

En un aspecto, la presente invención se refiere a las composiciones, los métodos y el/los componente(s) respectivo(s) de los mismos descritos en el presente documento, como fundamentales para la invención, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, fundamentales o no (“que comprende”). En algunas realizaciones, otros elementos a incluir en la descripción de la composición, el método o el componente respectivo de los mismos se limitan a aquellos que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención (“que consiste esencialmente en”). Esto se aplica igualmente a las etapas dentro de un método descrito, así como a las composiciones y los componentes de las mismas. En otras realizaciones, las invenciones, las composiciones, los métodos y los componentes respectivos de los mismos, descritos en el presente documento, pretenden ser exclusivos de cualquier elemento que no se considere un elemento fundamental del componente, composición o método (“que consiste en”).

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones identificadas tienen expresamente el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones que podrían usarse en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a preceder a dicha descripción en virtud de una invención anterior o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o la representación en cuanto al contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

La invención se ilustra más a fondo mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Un nuevo método para purificar y activar las BoNT

En el presente documento se propone un nuevo método para purificar y activar formas naturales no marcadas de BoNT a través de sencillas etapas de purificación por afinidad. Este método se basa en una característica exclusiva de las BoNT: estas toxinas forman naturalmente un complejo dímero con su proteína chaperona, conocida como NTNHA. El propósito biológico de este dímero es proteger a las toxinas de las proteasas y el ambiente ácido severo en el tracto gastrointestinal (GI). Las interacciones entre BoNT y NTNHA dependen del pH: se unen a pH <7 y se disocian entre sí a pH >7,4. Por lo tanto, la introducción de un marcador de afinidad en la NTNHA se puede utilizar para aislar las formas naturales de BoNT en disoluciones con pH <7. Las BoNT unidas pueden liberarse luego simplemente elevando el pH de la disolución a >pH 7,4. En otras palabras, en lugar de introducir un marcador de afinidad en las BoNT, se puede marcar a su compañero de unión. Esto permite la producción de formas naturales de BoNT a través del conveniente método de purificación por afinidad.

Además de la purificación, las BoNT deben activarse mediante proteólisis limitada. Las BoNT recombinantes generalmente se activan después de la purificación con una endoproteinasa (tal como la tripsina). Este método tiene varios inconvenientes: 1) existen posibilidades de corte inespecífico por la endoproteinasa, lo que compromete la actividad y el rendimiento de la toxina; 2) la endoproteinasa debe eliminarse una vez completada la reacción, lo que requiere una etapa de separación adicional que compromete el rendimiento y la actividad de las toxinas.

El sitio de activación de las BoNT todavía está expuesto en la superficie del complejo de BoNT-NTNHA, mientras que otros sitios susceptibles de las BoNT a menudo están protegidos en el complejo. Esto brinda la oportunidad de tratar las toxinas con la endoproteinasa mientras la toxina todavía está en el complejo con NTNHA. Esta estrategia aborda ambos problemas en los métodos anteriores: 1) la NTNHA protegerá a las toxinas del corte no específico por parte de la endoproteinasa; 2) la endoproteinasa se puede eliminar fácilmente en una sola etapa de lavado junto con todas las demás proteínas no pertenecientes a la toxina que no se unen a NTNHA.

Resultados

Cada BoNT de origen natural tiene su propio compañero de NTNHA de origen natural. Se utilizaron BoNT/B y NTNHA/B como prototipos para establecer la viabilidad de la estrategia de los inventores. Brevemente, la NTNHA/B se expresó como una proteína de fusión con el marcador GST utilizado habitualmente (glutatión-S-transferasa). La GST-NTNHA/B se purificó, se inmovilizó sobre esferas de glutatión y posteriormente se equilibró con el tampón de unión a la toxina (pH = 6). A continuación, esta resina se añadió a un lisado de células de E. co lique contiene BoNT/B expresada de forma recombinante y se incubó durante 1 hora a 4°C para permitir la formación del complejo en condiciones de pH 6. Posteriormente, el complejo unido a las esferas se lavó con el tampón de unión para eliminar los contaminantes no específicos y las proteínas no unidas. La BoNT/B unida se eluyó de las esferas usando un tampón de elución de pH 8 o se sometió a un tratamiento con tripsina para su activación.

El principio y las etapas de purificación se ilustran esquemáticamente en la figura 1A y la figura 1B. Los resultados indicaron que la BoNT/B se puede purificar eficazmente a partir de lisados bacterianos brutos usando este método (figura 2A), con alto rendimiento y pureza de la proteína final (figura 2B). Una fracción de la resina que contiene el complejo de NTNHA/B:BoNT/B se sometió a escisión mediada por tripsina. Los resultados, mostrados en la figura 3A y la figura 3B, indican que la BoNT puede activarse eficazmente en unas pocas horas sobre las esferas del complejo y puede eluirse posteriormente de las esferas para producir una toxina activa nativa.

Se exploró si NTNHA, que es específica para un serotipo, puede usarse para purificar toxinas quiméricas que contienen un segmento de esa toxina, en particular el dominio de unión al receptor. El dominio de unión al receptor media en la mayoría de interacciones entre NTNHA y BoNT. Los resultados, mostrados en la figura 4, indican el uso satisfactorio de NTNHA/B para purificar una toxina híbrida (BoNT/A1B) que contiene el dominio de unión al receptor de BoNT/B.

Estos resultados experimentales sirven como prueba de concepto de un método que se puede utilizar para purificar la toxina terapéutica ampliamente utilizada: BoNT/A (con NTNHA/A) y BoNT/B (con NTNHA/B), purificar otros serotipos de BoNT (con NTNHA), purificar las BoNT recombinantes que contienen mutaciones, purificar las BoNT quiméricas (con NTNHA que se une al dominio de unión al receptor o proteínas NTNHA quiméricas diseñadas específicamente). Las ventajas de este método son 1) la capacidad de purificar las BoNT con N- y C-terminales naturales que se expresan de manera recombinante, a través de una conveniente purificación por afinidad, 2) las condiciones de tampón suaves (pH 6-8) minimizan cualquier daño potencial a las toxinas, 3) la elución y la unión dependientes de un pH específico producen toxinas altamente puras de manera conveniente, lo que reduce la necesidad de una purificación adicional, 4) la protección de NTNHA reduce el corte inespecífico por la proteasa activadora durante la etapa de activación, y 5) la activación por proteasa antes de la elución de toxinas suprime la necesidad de eliminar por separado la proteasa.

Materiales y métodos

Expresión y purificación de proteínas. La NTNHA/B se expresó en E. coli como una proteína de fusión con glutatión-S-transferasa (GST-NTNHA/B) con la GST fusionada al extremo N-terminal de la proteína NTNHA/B; la BoNT/B se expresó en E. coli con un marcador His6 C-terminal (SEQ ID NO:1). Se cultivaron cultivos bacterianos (1 L) a 37°C y se indujo la expresión de proteínas con la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (250 pM) cuando la densidad óptica del cultivo a 600 nm (DO⁶⁰⁰) alcanzó aproximadamente 0,6 AU. A continuación, los cultivos se transfirieron a una incubadora con agitación a 20°C para la expresión durante la noche (~16 horas). Las bacterias se recolectaron por centrifugación a 5500 xg y los sedimentos resultantes se congelaron hasta su purificación.

Los sedimentos de BoNT/B se descongelaron y solubilizaron en tampón de unión (MES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6) con 5 ml/gramo de sedimento bacteriano seco; los sedimentos de NTNHA/B se descongelaron y solubilizaron en un tampón de unión diferente (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8). Se añadió 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) antes de la lisis mediante sonicación en hielo (Branson Sonifier 250) durante 15 min (3 X 5 min, 50% de potencia). El lisado bruto se aclaró luego por centrifugación (30.000 xg, 15 min) y el sobrenadante se filtró usando filtros de jeringa de 0,45 pm (Nalgene).

Purificación de GST-NTNHA/B. Se añadieron 600 pl de esferas de glutatión-agarosa Pierce (suspensión al 50%; termo) equilibradas con tampón de unión a aproximadamente 20 ml de sobrenadante de GST-NTNHA/B y se dejó que se unieran de modo discontinuo durante 1 hora a 4°C. Las esferas se recuperaron por centrifugación (700 xg) y se lavaron dos veces con 3 volúmenes de lecho de resina de tampón de unión (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8). La concentración estimada de GST-NTNHA/B purificada fue de aproximadamente 0,6 mg/ml (ensayo BCA y análisis de SDS-PAGE).

Formación de complejos dependiente del pH; activación por proteasa; y elución de la BoNT purificada. Las esferas de agarosa que contienen GST-NTNHA/B se agregaron a aproximadamente 5 ml de lisado aclarado de E. coli de BoNT/B para la unión discontinua durante 2 horas a 4°C en un tubo cónico oscilante. Las esferas se recogieron (700 xg) y se lavaron dos veces con 3X volúmenes de lecho de resina de tampón de unión (MES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6).

Se añadió tripsina o Lys-C endoproteinasa (Sigma-Aldrich) en una proporción molar de 1:10 a pH 6 (sobre esferas) para activar la toxina unida a NTNHA en un volumen final de 500 pl. La reacción procedió en una plataforma giratoria a temperatura ambiente y se controló durante 4 horas tomando pequeñas muestras de partes alícuotas para su análisis posterior. La resina se lavó dos veces con tampón de unión para eliminar las proteasas y las impurezas no unidas. La BoNT purificada y activada se eluyó con dos volúmenes de resina de tampón de pH alto (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8).

Análisis de SDS-PAGE y WB. Se aplicaron 10 pl de todas las muestras (con o sin el agente reductor DTT) a geles de SDS al 9%-PAGE. Después de la separación, el gel se tiñó con tinción de Coomassie o se sometió a análisis de inmunotransferencia convencionales. Se usó un anticuerpo monoclonal humano para detectar la BoNT/B y se usó un anticuerpo policlonal de conejo para detectar la toxina quimérica BoNT/A1 B.

Ejemplo 2

Aislamiento sencillo y directo de BoNT recombinantes a partir de lisados bacterianos brutos

La asociación entre BoNT y NTNHA se ve facilitada por numerosos detectores de pH en las dos moléculas que forman un reconocimiento de superficie específico (Gu et al., 2012). Este complejo entrelazado protege a la toxina activa del duro ambiente ácido que debe atravesar para llegar a sus destinos celulares.

El presente ejemplo confirma la viabilidad de aislar una BoNT recombinante de longitud completa (BoNT/B inactiva, en lo sucesivo denominada BoNT/B{^ry}) que se expresa en E. coli, como se describe en este documento. El compañero de complejo que facilita el aislamiento de la toxina es un serotipo compatible marcado con GST de su compañero de complejo recombinante, NTNHA/B. La molécula de NTNHA-B marcada con GST y la BONT/B{^ry} se expresaron por separado en huéspedes de E. coli y se logró la producción de proteínas se logró mediante métodos de autoinducción convencionales (Studier, 2005). Para el aislamiento de GST-NTNHA-B, se realizó una purificación discontinua en una etapa con esferas de agarosa-glutatión como se describe en los métodos. La GST-NTNHA-B inmovilizada se mantuvo estable durante una conservación a corto o medio plazo a 4°C durante aproximadamente una semana, aunque la conservación a más largo plazo condujo a posibles mellas espontáneas como se informó anteriormente (Sagane et al., 2002; Gu et al., 2012). Este reactivo se utilizó posteriormente para aislar la BoNT/B^ry y la B^oNT/A1{^ry}B1 quimérica en un flujo de trabajo simple (figura 6B), en el que las esferas de agarosa fueron el cebo para extraer las toxinas recombinantes de los lisados brutos en condiciones favorables (por ejemplo, pH 6,0, NaCl 150 mM). El análisis de SDS-Page de las fracciones pertinentes del esquema de purificación se muestra en la figura 6C. La GST-NTNHA/B regenerada después de la elución puede usarse fácilmente en otro ciclo de purificación para aislar más toxinas compatibles de extractos frescos o alternativos. La toxina de longitud completa eluida se libera selectivamente del complejo tras el intercambio de tampón en las esferas y se puede visualizar con SDS-PAGE o mediante análisis de transferencia Western (WB) (figura 7A). Además, es más probable que estas condiciones suaves para aislar toxinas de longitud completa (FL) conserven su actividad proteasa y sus funciones funcionales en la unión de sus dianas celulares. Como receptor neuronal canónico para la BoNT/B, se demuestra que un péptido marcado derivado de sinaptotagmina interactúa con la toxina de longitud completa aislada en un ensayo de unión de anisotropía de fluorescencia in vitro (figura 7B).

La toxina complejada se activa eficazmente mediante proteasas exógenas

Como toxinas bicatenarias (AB), las BoNT se expresan como una única cadena polipeptídica que se activa para generar una molécula funcional unida por un puente disulfuro entre las cadenas pesada y ligera. La “mella” por proteasas exógenas o endógenas que escinde la cadena polipeptídica entre dos cisteínas conservadas que mantienen un puente covalente entre LC y HC puede mejorar la potencia y puede ser necesario para la máxima potencia (figura 6A). El presente ejemplo documenta que la adición de tales proteasas (por ejemplo, específicamente de una proteasa exógena) puede incorporarse en los flujos de trabajo del protocolo de purificación como se describe en este documento y, en algunas realizaciones, puede ayudar a maximizar la recuperación de toxinas activas. Por ejemplo, el complejo de GST-NTNHA/B:BoNT/B{^ry} se puede escindir mediante cantidades catalíticas de tripsina o Lys-C endoproteinasa en condiciones suaves a temperatura ambiente y la toxina mellada se puede liberar selectivamente en un tampón de pH más alto. Las figuras 8A-8C muestran el desarrollo en el tiempo de la activación de la BoNT//B{^ry} monocatenaria complejada para liberar el dominio de proteasa de ~50 kDa (LC) y la HC de aproximadamente 100 kDa en muestras que contienen ditiotreitol (DTT). Las condiciones de unión de pH más bajo y la actividad más baja de las proteasas (Kasserra y Laidler, 1969; Jekel et al., 1983) desempeñan un papel protector frente a la degradación inespecífica/excesiva de la toxina y/o NTNHA (figura 8B). La pureza y el grado de las mellas de la toxina se pueden visualizar en gel de SDS-PAGE o detectarse mediante análisis WB (figura 8A y figura 8C).

Las toxinas recombinantes quiméricas se pueden aislar utilizando un serotipo de NTNHA común

El presente ejemplo confirma que una neurotoxina botulínica recombinante quimérica se puede purificar usando un protocolo de purificación basado en complejos como se describe en el presente documento usando varias dianas que pueden actuar como esqueletos terapéuticos para productos biológicos futuros. El dominio de unión al receptor de las BoNT media en la mayoría de los contactos polares con NTNHA (Gu et al., 2012). El presente ejemplo confirma que la neurotoxina botulínica recombinante se puede purificar mediante la formación de complejos con NTNHA. Una proteína recombinante quimérica (BoNT/A1{^ry}B1) que se construye a partir de BoNT/A LC inactiva, BoNT/A Hⁿ BoNT/B HC se utilizó como prueba de concepto. Usando la misma GST-NTNHA/B recombinante anterior, se pudo detectar la formación de complejos y el enriquecimiento de la toxina quimérica sobre las esferas de NTNHA a pesar de los bajos niveles de expresión de la toxina (figura 9). El lisado aclarado para la toxina quimérica contenía productos de degradación y grandes impurezas que a menudo impiden una formación de complejos eficaz con la NTNHA inmovilizada. Por lo tanto, el lisado de BoNT/A1{^ry}B1 se hizo pasar una vez más y se eluyó de una resina de Ni-NTA antes de la exposición a la NTNHA inmovilizada sobre la resina de agarosa. Los perfiles de activación posteriores con esta toxina quimérica pueden ser similares a los de BoNT/B{^ry}, probablemente con diferentes eficacias.

Análisis

Este ejemplo demuestra el aislamiento de las BoNT expresadas de forma recombinante usando una NTNHA/B como compañero del complejo progenitor no covalente. Ambos BoNT/B{^ry} y NTNHA/B se sobreexpresaron por separado en huéspedes de E. coli. La NTNHA/B se expresó como una proteína de fusión con un marcador GST unido a su extremo N-terminal como resto de afinidad hacia la resina sólida de agarosa-glutatión. La BoNT/B{^ry} (y la B0NT/A1{^ry}B1 quimérica) se expresaron como secuencias de tipo salvaje a excepción de las mutaciones de inactivación y un marcador His6X C-terminal. La lisis bacteriana en un tampón de pH bajo liberó estas toxinas en un lisado que se incubó con las esferas de agarosa que portaban GST-NTNHA/B. Después de la formación del complejo, el medio sólido se lavó a fondo para eliminar las impurezas, tras lo cual las toxinas pueden eluirse mediante intercambio de tampón de pH alto o activarse mediante una etapa adicional en la que se aplica una endoproteasa exógena al complejo unido a la resina.

Según lo confirmado por los hallazgos documentados en el presente ejemplo, la presente descripción proporciona una solución para aislar eficazmente las BoNT terapéuticas activas de diversas fuentes en condiciones suaves. La metodología mejorada para aislar, activar y eluir las BoNT purificadas puede ser inmensamente útil, tal como en la producción a gran escala de BoNT terapéuticas. Los beneficios potenciales incluyen los siguientes: 1) aislamiento eficaz de BoNT recombinantes a partir de lisados brutos en condiciones suaves, a diferencia de las prácticas actuales (Malizio et al., 2000; Donovan, 2007); 2) se pueden producir toxinas activadas de alta pureza usando un solo esquema de purificación, ya que permite un lavado a fondo de contaminantes y evita múltiples etapas de cromatografía; 3) la NTNHA inmovilizada puede proteger adecuadamente a la toxina de la escisión inespecífica en la etapa de activación, que puede incorporarse fácilmente en el protocolo de purificación (a diferencia de la activación común posterior a la purificación). Esto puede aumentar los rendimientos finales y la homogeneidad de la toxina activada final; y 4) la GST-NTNHA inmovilizada puede servir para múltiples purificaciones secuenciales, puesto que se regenera al final de cada ciclo con poca pérdida; y 5) tal metodología puede expandirse para aislar toxinas terapéuticas quiméricas con dominios de unión al receptor compatibles.

Expresión y purificación de proteínas

La NTNHA/B se expresó como una proteína de fusión con glutatión-S-transferasa (GST-NTNHA/B) en un vector pGEX; BoNT/B{^ry} y BoNT/A1{^ry}B1 se expresaron con un marcador C-terminal (His6x) en un vector pET32-a en E. coli (BL21DE3). Se cultivaron cultivos celulares (típicamente 300 ml) en medio de autoinducción (Formedium™, Reino Unido) en matraces de 2 l con hendiduras a 37°C con agitación vigorosa (> 250 RPM). Cuando los cultivos alcanzaron una DO de aproximadamente 0,6, los cultivos celulares se transfirieron a una incubadora con agitación a 20°C para la expresión durante la noche (~16 horas). Las células se recolectaron por centrifugación a 5500 xg y los sedimentos resultantes se congelaron a -20°C hasta su purificación.

Los sedimentos celulares de BoNT/B{^ry} se descongelaron y se solubilizaron en tampón de unión (MES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6) con 5 ml/gramo de sedimento celular seco. Se descongelaron las células GST-NTNHA/B y se solubilizaron en tampón de unión TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8). Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a las células solubilizadas a una concentración final de 0,1 mM antes de la lisis mediante sonicación en hielo (Branson Sonifier 250) durante 15 min (3 X 5 min); 30% de potencia. A continuación, los lisados brutos se aclararon mediante centrifugación (30.000 xg, 15 min) y el sobrenadante se filtró usando filtros de jeringa de 0,45 gm (Nalgene).

Purificación de GST-NTNHA/B

Se equilibraron 600 gL de esferas de glutatión-agarosa Pierce (suspensión al 50%; Thermo) con tampón de unión y se añadieron a aproximadamente 20 ml de sobrenadante de GST-NTNHA/B y se dejaron unir de modo discontinuo durante 1 hora a 4°C en una plataforma de basculación suave. Las esferas se recuperaron por centrifugación (700 xg) y se lavaron dos veces con 3X volúmenes de lecho de resina de tampón de unión (1X TBS). La concentración estimada de la GST-NTNHA/B purificada fue típicamente aproximadamente 0,5 mg/ml (ensayo BCA y análisis de SDS-PAGE).

Unión, activación y elución de BoNT purificadas

Las esferas de agarosa que portaban GST-NTNHA/B se agregaron a 10-25 ml de tampón de lisados aclarados de BoNT/B{^ry} o BoNT/A1{^ry}B1 (en MES, pH 6) y se permitió que se realizara la unión de modo discontinuo durante 2 horas a 4°C en un tubo cónico de 50 ml sobre una plataforma basculante. Las esferas se recogieron (700 xg) y se lavaron dos veces con 3X volúmenes de lecho de resina de tampón de unión (MES, pH 6). Si no se desea activación, las toxinas purificadas unidas pueden eluirse en esta etapa como se describe a continuación.

Se añadió tripsina o Lys-C endoproteinasa (Sigma-Aldrich) en una proporción molar de 1:10 endoproteinasa:GST-NTNHA/B a pH 6 (sobre esferas) para activar la toxina unida en un volumen final de 500-1000 uL. La reacción se desarrolló en una plataforma giratoria (volteadora) a temperatura ambiente y se controló (de 2 a 4 horas como en la figura 8A y figura 8C; o durante la noche a 4°C como en la figura 8B) tomando pequeñas muestras de partes alícuotas para el análisis posterior. La resina se lavó dos veces con tampón de unión para eliminar las proteasas y las impurezas. La BoNT/B{^ry} purificada y activada se eluyó en fracciones de dos volúmenes de resina de tampón de pH alto (TBS: Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8).

Análisis de SDS-PAGE y WB

Se aplicaron 10 gl de todas las muestras (con o sin los agentes reductores DTT o pME) a geles de SDS al 8-12%-PAGE. Después de la separación, los geles se tiñeron con tinción de Coomassie o se sometieron a un procedimiento de transferencia Western convencional. Se utilizó un anticuerpo monoclonal de conejo (1:5000) para detectar la BoNT/B{^ry} y se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo (1:2000) generado contra BoNT/A para detectar la BoNT/A1 {^ry}B1.

Anisotropía de fluorescencia

El péptido derivado de la sinaptotagmina 1 humana (Syt 1) (AA 33-53) se sintetizó con un marcador FITC N-terminal (GenScript, Piscataway NJ) y se utilizó como receptor en el experimento de unión a 50-100 nM. Las toxinas de longitud completa eluidas se concentraron en unidades de filtración Vivaspin 6 (MWCO (valor de corte de peso molecular) 10K, GE). Los experimentos de unión (50 ul) se midieron en una placa negra de 96 pocillos (Corning) usando un lector de placas con filtro (excitación/emisión de 485/520 nm). La BoNT/A y la BoNT/B Hc se expresaron y se purificaron por separado y sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente.

Referencias

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Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1 Una molécula que comprende un polipéptido no hemaglutinina no tóxica (NTNHA) unido covalentemente a un resto de afinidad heterólogo para su uso en el aislamiento y purificación de una proteína de neurotoxina botulínica (BoNT), o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de BoNT, a partir de una disolución, en la que: la molécula se une además a una diana de unión a través del resto de afinidad; y

   el polipéptido de NTNHA está en un complejo con una neurotoxina botulínica (BoNT) compatible, o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de la misma.
2. 2. - La molécula de la reivindicación 1, en la que el complejo está intacto en disolución a pH 6 y alterado en disolución a pH 8.
3. 3. - La molécula de la reivindicación 1, en la que la BoNT compatible, o un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor de la BoNT, puede activarse tras la exposición a una proteasa mientras permanece en complejo con el polipéptido de NTNHA.
4. 4. - La molécula de la reivindicación 1, en la que la NTNHA y el resto de afinidad se expresan como una proteína de fusión.
5. 5. - La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que:

   i) el resto de afinidad está ubicado en una posición seleccionada del grupo que consiste en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de NTNHA, el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de NTNHA e interno a la secuencia de aminoácidos de NTNHA;

   ii) el resto de afinidad se une eficazmente a una diana de unión en condiciones de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8; y/o

   iii) el resto de afinidad se selecciona del grupo que consiste en glutatión-S-transferasa (GST), marcador C-myc, dominio de unión a quitina, proteína de unión a estreptavidina (SBP), dominio de unión a celulosa, péptido de unión a calmodulina, marcador S, Strep-tag II, FLA, proteína A, proteína G, marcador de afinidad de histidina (HAT), poli-His y proteína de unión a maltosa (MBP).
6. 6. - La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en la que:

   i) la NTNHA es del serotipo B, A, C1, D, E, F o G; y/o

   ii) la NTNHA es del serotipo B.
7. 7. - La molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la diana de unión está unida de forma estable a una matriz.
8. 8. - Una disolución acuosa que comprende la molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7.
9. 9. - Una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la NTNHA funcional y la proteína de fusión del resto de afinidad de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 y que además expresa una neurotoxina botulínica (BoNT) compatible; dicha célula:

   i) es procariota o eucariota; o

   ii) es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de anfibio.
10. 10. - Un método para purificar la neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende las etapas de:

    a) poner en contacto la BoNT con una molécula que comprende un polipéptido no hemaglutinina no tóxica (NTNHA) compatible unido covalentemente a un resto de afinidad heterólogo, en condiciones apropiadas para la unión de la NTNHA a la BoNT para formar de ese modo un complejo de NTNHA-BoNT;

    en el que la BoNT está en disolución, y la molécula está unida a una matriz, por lo que la disolución se pone en contacto con la matriz para de ese modo poner en contacto la BoNT con la NTNHA.
11. 11. - El método de la reivindicación 10, que comprende además:

    b) lavar la matriz para eliminar así los materiales no unidos; y

    c) eluir la BoNT de la matriz poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT.
12. 12. - El método de la reivindicación 10, que comprende además:

    b) lavar la matriz para eliminar así los materiales no unidos;

    c) poner en contacto la matriz con una proteasa en condiciones que conservan el complejo de NTNHA-BoNT y que son apropiadas para la escisión de la BoNT dentro del complejo de NTNHA-BoNT;

    d) lavar la matriz para eliminar de ese modo la proteasa y los materiales no unidos; y

    e) eluir la BoNT escindida de la matriz poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia la BoNT escindida del complejo de NTNHA-BoNT.
13. 13. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la matriz se une a una diana de unión del resto de afinidad, y la molécula se une de forma no covalente a la matriz a través de interacciones del resto de afinidad y la diana de unión.
14. 14. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la disolución acuosa tiene un pH > 7,5.
15. 15. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que:

    i) la disolución que comprende la BoNT es un extracto de células aclarado procedente de células que expresan BoNT; o

    ii) la disolución que comprende la BoNT es un extracto de células aclarado procedente de células que expresan BoNT y el extracto de células aclarado comprende además 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF).
16. 16. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que las condiciones apropiadas para la unión comprenden poner en contacto la BoNT en el contexto de un tampón de unión que tiene una fuerza iónica fisiológica y un pH de <7,5.
17. 17. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en el que el lavado se realiza con un tampón de lavado de fuerza iónica fisiológica con un pH <7,5.
18. 18. - El método de la reivindicación 16 o 17, en el que:

    i) el tampón de unión y/o el tampón de lavado está entre 100-200 mM de KCl o NaCl;

    ii) el tampón de unión y/o el tampón de lavado tiene un pH de aproximadamente 6;

    iii) el tampón de unión y/o el tampón de lavado comprende MES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6;

    iv) la disolución acuosa es un tampón de elución de aproximadamente Tris 50 mM, NaCl 150 mM; y/o

    v) la disolución acuosa es un tampón de elución de aproximadamente pH 8.
19. 19. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en el que:

    i) el resto de afinidad se selecciona del grupo que consiste en glutatión-S-transferasa (GST), marcador C-myc, dominio de unión a quitina, proteína de unión a estreptavidina (SBP), dominio de unión a celulosa, péptido de unión a calmodulina, marcador S, Strep-tag II, FLA, proteína A, proteína G, marcador de afinidad de histidina (HAT), poli-His y proteína de unión a maltosa (MBP); y/o

    ii) el resto de afinidad es GST y la diana de unión es glutatión.
20. 20. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en el que:

    i) la proteasa es tripsina o Lys-C endoproteinasa;

    ii) la proteasa se añade en una proporción molar de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:1000 con respecto a la NTNHA;

    iii) la proteasa se pone en contacto con la matriz a temperatura ambiente; y/o

    iv) la proteasa se pone en contacto con la matriz durante aproximadamente 10 minutos a 18 horas.
21. 21. - El método de la reivindicación 10, en el que:

    la molécula está unida a una matriz revestida de glutatión y el resto de afinidad es glutatión-S-transferasa; y la etapa (a) de poner en contacto comprende poner en contacto un extracto celular aclarado que comprende la BoNT con la matriz en un tampón de unión con un pH de aproximadamente 6 para formar de ese modo el complejo de NTNHA-BoNT ; y además en el que el método comprende las etapas de:

    b) lavar la matriz con un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6 para eliminar así los materiales no unidos; y

    c) eluir la BoNT de la matriz poniendo en contacto la matriz con un tampón de elución que tiene un pH de > 7,5 para disociar de ese modo la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT.
22. 22. - El método de la reivindicación 10, en el que:

    la molécula está unida a una matriz revestida de glutatión y el resto de afinidad es glutatión-S-transferasa; y la etapa (a) de poner en contacto comprende poner en contacto un extracto celular aclarado que comprende la BoNT con la matriz en un tampón de unión con un pH de aproximadamente 6 para formar de ese modo un complejo de NTNHA-BoNT ; y además en el que el método comprende las etapas de:

    b) lavar la matriz con un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6 para eliminar así los materiales no unidos;

    c) poner en contacto la matriz con una proteasa en un tampón con un pH de aproximadamente 6 para escindir de ese modo la BoNT dentro del complejo de NTNHA-BoNT;

    d) lavar la matriz con un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6 para eliminar así la proteasa y los materiales no unidos; y

    e) eluir la BoNT de la matriz poniendo en contacto la matriz con un tampón de elución que tiene un pH de > 7,5 para disociar de ese modo la BoNT del complejo de NTNHA-BoNT.
23. 23. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, en el que:

    i) el tampón de unión y/o el tampón de lavado comprende MES 50 mM, NaCl 150 mM;

    ii) el tampón de unión y/o el tampón de lavado comprende MES 50 mM, NaCl 150 mM y el tampón de unión comprende además fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM;

    iii) el tampón de elución comprende Tris 50 mM, NaCl 150 mM y tiene un pH de aproximadamente 8;

    iv) la matriz revestida de glutatión son esferas de agarosa unidas a glutatión o la matriz revestida de glutatión es una columna;

    v) la matriz revestida de glutatión tiene aproximadamente 5 mg/ml de NTNHA unida; y/o

    vi) la proteasa es tripsina o Lys-C endoproteinasa.
24. 24. - Un método para purificar un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor (polipéptido Hc) de la neurotoxina botulínica, que comprende las etapas de:

    a) poner en contacto una disolución que comprende el polipéptido Hc con una matriz a la que se ha unido la proteína no hemaglutinina no tóxica (NTNHA) compatible, en condiciones apropiadas para la unión de la NTNHA al polipéptido Hc para formar de ese modo un complejo de polipéptido Hc-NTNHA;

    b) lavar la matriz para eliminar así los materiales no unidos;

    c) eluir el polipéptido Hc de la matriz poniendo en contacto la matriz con una disolución acuosa que disocia el polipéptido Hc del complejo de polipéptido Hc-NTNHA.
25. 25. - El método de la reivindicación 24, en el que el polipéptido Hc es un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) o el polipéptido Hc es un polipéptido quimérico de neurotoxina botulínica (BoNT).
26. 26. - La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la célula huésped de la reivindicación 9, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-25, en los que la BoNT o el polipéptido comprende un dominio de unión al receptor modificado de serotipo B botulínico clostridial (B-Hc).
27. 27. - El uso de una molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en un método para purificar un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT).