ES2899913T3

ES2899913T3 - Virus tumorales oncolíticos y métodos de uso

Info

Publication number: ES2899913T3
Application number: ES15843893T
Authority: ES
Inventors: Clodagh O'shea; Shigeki Miyake-Stoner
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2035-09-23
Also published as: WO2016049201A1; EP3198009A1; DK3198009T3; JP7416423B2; EP3198009A4; JP2021007392A; JP2017534263A; US20170202893A1; AU2015320665B2; AU2022203504A1; KR102608590B1; AU2015320665A1; KR20170063801A; PL3198009T3; EP3198009B1; KR20230165385A; EP4043021A3; JP6764859B2; JP2024038030A; EP4043021A2

Abstract

Un adenovirus recombinante, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, y el genoma codifica además al menos una característica seleccionada del grupo: (i) un ligando de direccionamiento fusionado a una proteína de unión a FK506 (FKBP), y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína de unión FKBP-rapamicina de tipo salvaje (FRB) o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L, (ii) una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDα/RIDβ y E3-14.7k, (iii) una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende opcionalmente una sustitución E451Q, (v) una proteína de fibra quimérica en donde la proteína de fibra quimérica comprende opcionalmente un eje de fibra de un primer serotipo de adenovirus y un botón de fibra de un segundo serotipo de adenovirus, (vi) una proteína pentona modificada en donde la proteína pentona modificada comprende opcionalmente una mutación en el motivo RGD de unión a integrina, (vii) una proteína de fibra modificada para incluir un péptido RGD, y (viii) un adenovirus quimérico de cápside intercambiada, en donde la proteína E1A modificada comprende una mutación que interrumpe la unión de E1A a la proteína del retinoblastoma (Rb) y la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación que elimina o altera la unión a E2F o elimina o altera la señal de localización nuclear de E4orf6/7, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en células normales en comparación con las células tumorales.

Description

DESCRIPCIÓN

Virus tumorales oncolíticos y métodos de uso

Campo

Esta descripción se refiere a adenovirus recombinantes que comprenden una o más modificaciones en E1A, E4orf1 y/o E4orf6/7, como se define en las reivindicaciones, que experimentan selectivamente replicación lítica en las células tumorales. Los adenovirus recombinantes tienen opcionalmente una o más modificaciones en las proteínas de fibra, hexona o de la cápside para permitir la administración y captación sistémicas en las células tumorales. Antecedentes

El cáncer es una enfermedad compleja y debilitante que causa más de medio millón de muertes cada año. Existe una profunda necesidad de tratamientos más efectivos, selectivos y seguros para el cáncer. Los tratamientos existentes para esta enfermedad generalizada y potencialmente mortal, tales como la quimioterapia y la cirugía, rara vez eliminan todas las células malignas y, a menudo, exhiben efectos secundarios perjudiciales que pueden superar los beneficios terapéuticos.

Un enfoque que tiene el potencial de abordar muchas de las deficiencias de los tratamientos actuales contra el cáncer es la terapia adenoviral oncolítica (Pesonen y otros, Molecular Pharmaceutics 8(1): 12-28, 2010). El adenovirus (Ad) es una máquina biológica autorreplicante. Consiste en un genoma de ADN lineal bicatenario de 36 kb enfundado en una capa de proteína. Los adenovirus invaden y secuestran la maquinaria de replicación celular para reproducirse y, al ensamblarse, inducen la muerte de las células líticas para propagarse a las células circundantes. A estos mismos controles celulares están dirigidas las mutaciones en el cáncer. Este conocimiento se puede explotar para crear virus sintéticos que actúan como misiles guiados, al infectar y replicarse específicamente en las células tumorales, y al lisar las células para liberar miles de progenie del virus que pueden buscar y destruir metástasis distantes, mientras superan posibles resistencias. Por lo tanto, el objetivo del diseño de virus oncolíticos es generar un virus que se replica específicamente en las células cancerosas, pero no daña a las células normales. Sin embargo, ha habido desafíos importantes en el diseño de un virus que pueda replicarse selectivamente en las células cancerosas. Por tanto, existe una necesidad de virus adicionales que se repliquen selectivamente en las células cancerosas.

El documento US2003/138405 describe un adenovirus selectivo de tumores con una modificación de E1A y que muestra una replicación preferencial en células que tienen una proteína de retinoblastoma defectuosa. La presente descripción se refiere a un adenovirus modificado que tiene una replicación diferencial mejorada en las células tumorales en comparación con las células normales. Esto se obtiene mediante modificaciones de las proteínas adenovirales E1A y E4orf6/7.

Resumen

Se describen adenovirus recombinantes que se replican selectivamente en las células tumorales desreguladas por E2F. Los adenovirus recombinantes tienen un genoma que codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, de modo que los adenovirus recombinantes exhiben defectos de replicación en las células normales en comparación con las células tumorales. El genoma de los adenovirus recombinantes codifica opcionalmente además modificaciones adicionales que dirigen los adenovirus recombinantes a tipos celulares específicos, desvían los virus del hígado, inhiben la replicación viral en el hígado y/o evaden los anticuerpos neutralizantes preexistentes.

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo a título informativo.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus recombinante, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, y el genoma codifica además al menos una característica seleccionada del grupo:

(i) un ligando dirigido fusionado a una proteína de unión a FK506 (FKBP), y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína de unión a rapamicina de FKBP de tipo salvaje (FRB) o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución de T2098L,

(ii) una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k,

(iii) una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende opcionalmente una sustitución E451Q,

(v) una proteína de fibra quimérica en donde la proteína de fibra quimérica comprende opcionalmente un eje de fibra de un primer serotipo del adenovirus y un botón de fibra de un segundo serotipo del adenovirus, (vi) una proteína pentona modificada en donde la proteína pentona modificada comprende opcionalmente una mutación en el motivo RGD de unión a integrina,

(vii) una proteína de fibra modificada para incluir un péptido RGD, y

(viii) un adenovirus quimérico de cápside intercambiada,

en donde la proteína E1A modificada comprende una mutación que interrumpe la unión de E1A a la proteína del retinoblastoma (Rb) y la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación que

elimina o altera la unión a E2F o elimina o altera la señal de localización nuclear de E4orf6/7, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en las células normales en comparación con las células tumorales

En una modalidad preferida de la invención, dicho genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada, en donde la proteína E4orf1 modificada comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ o una sustitución que elimina la actividad de unión a PDZ, en donde dichas sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en: mutaciones puntuales del S126 altamente conservado del Ad5 E4orf1 a residuos hidrófobos grandes tales como V, L o I y la mutación puntual de V128 del Ad5 E4orf1 a residuos polares tales como D, E, H, K o R. En una modalidad preferida de la invención dicho genoma codifica:

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada; una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G y una proteína E4orf6/7 eliminada; una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11 y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada; una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada; o

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada.

En una modalidad preferida de la invención, dicho ligando de direccionamiento es un anticuerpo de dominio único. En una modalidad preferida de la invención, dicho genoma comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado, por ejemplo, el microARN específico del hígado es miR-122.

En una modalidad preferida de la invención, dicho primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11, Ad12, Ad34 o Ad37 o en donde el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11 o Ad34.

En una modalidad preferida de la invención, dichas regiones E1, E3 y E4 del genoma se derivan de un primer serotipo del adenovirus y las regiones E2B, L1, L2, L3, E2A y L4 del genoma se derivan de un segundo serotipo del adenovirus.

En una modalidad preferida de la invención,

la región E1 del primer serotipo del adenovirus se modifica para codificar una proteína pIX del segundo serotipo del adenovirus; y/o

la región E3 del primer serotipo del adenovirus se modifica para codificar proteínas Uexon y de fibra del segundo serotipo del adenovirus.

En una modalidad preferida de la invención dicho genoma del adenovirus recombinante codifica:

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE;

una proteína E4orf6/7 eliminada;

un ligando de direccionamiento fusionado a una FKBP y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína FRB de tipo salvaje o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L;

una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k; y

una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende una sustitución E451Q. En una modalidad preferida de la invención dicho genoma del adenovirus recombinante codifica:

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE;

una proteína E4orf6/7 eliminada; y

una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k.

En una modalidad preferida adicional de la invención, dicho genoma del adenovirus recombinante que codifica una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE; una proteína E4orf6/7 eliminada; y una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k, codifica además

una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende una sustitución E451Q; y una proteína de fibra quimérica en donde la proteína de fibra quimérica comprende opcionalmente un eje de fibra de un primer serotipo del adenovirus y un botón de fibra de un segundo serotipo del adenovirus, en donde el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11, Ad12, Ad34 o Ad37.

En una modalidad preferida adicional de la invención, dicho genoma del adenovirus recombinante que codifica una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE; una proteína E4orf6/7 eliminada; y una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k, codifica además un adenovirus quimérico de cápside intercambiada.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende el adenovirus recombinante de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un adenovirus recombinante para su uso en el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus recombinante de acuerdo con la invención y rapamicina, o un análogo de la misma, para su uso en el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus recombinante para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, y el genoma codifica además:

una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L,

en donde la proteína E1A modificada comprende una mutación que interrumpe la unión de E1A a la proteína del retinoblastoma (Rb) y la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación que elimina o altera la unión a E2F o elimina o altera la señal de localización nuclear de E4orf6/7, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en células normales en comparación con las células tumorales. En una modalidad preferida de la invención, dicho genoma codifica además una proteína hexona modificada que comprende una sustitución E451Q.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 25, 26, 30, 31, 82-87 y 92-97.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una célula transgénica que comprende el vector de acuerdo con la invención.

En la presente descripción se proporciona un adenovirus recombinante, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en las células normales en comparación con las células tumorales. En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada.

En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus recombinante codifica además modificaciones para el redireccionamiento inducible. Por ejemplo, el genoma codifica opcionalmente un ligando dirigido fusionado a una proteína de unión a FK506 (FKBP) y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína de unión a rapamicina FKBP (FRB) de tipo salvaje o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L.

En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus recombinante codifica además modificaciones que desvían el adenovirus del hígado. En algunos ejemplos, el genoma codifica una modificación de la proteína hexona y/o incluye uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado.

En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína de fibra quimérica para redirigir el virus a receptores celulares alternativos.

En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus recombinante codifica un adenovirus de cápside intercambiada para evadir los anticuerpos neutralizantes preexistentes. En algunos ejemplos, las regiones E1, E3 y E4 del genoma se derivan de un primer serotipo del adenovirus y las regiones E2B, L1, L2, L3, E2A y L4 del genoma se derivan de un segundo serotipo del adenovirus.

Se proporcionan además vectores de expresión génica del adenovirus reportero recombinante, en donde el genoma del adenovirus recombinante comprende una eliminación de E1 y codifica una proteína de fusión GFP-luciferasa dirigida por el promotor EF1a. En algunos ejemplos, los vectores de expresión del adenovirus incluyen además sitios de unión de microARN específicos del hígado en el 3'-UTR.

También se proporcionan en la presente descripción composiciones que comprenden los adenovirus recombinantes descritos. Además, se proporcionan moléculas de ácido nucleico recombinantes y vectores que comprenden la secuencia de los genomas del adenovirus recombinantes.

Los métodos para inhibir la viabilidad de las células tumorales, inhibir la progresión del tumor, reducir el volumen tumoral y tratar a un sujeto con cáncer mediante la administración de un adenovirus recombinante (o composición del mismo) descritos en la presente descripción se proporcionan además en la presente descripción.

Lo anterior y otros objetos y características de la descripción resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1B son inmunotransferencias de lisados celulares que muestran la expresión de la E1A del adenovirus a partir de células infectadas con adenovirus recombinante. Las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con AdSyn-C0102 (tipo salvaje), AdSyn-CO181 (E1A ALXCXE/AE4orf6/7), AdSyn-CO189 (E1A ALXCXE) u ONYX-838 (E1A Ac R2). Para la Figura 1A, las células epiteliales primarias pequeñas de las vías respiratorias (SAEC) humanas quiescentes se infectaron con MOI 10 y los lisados se analizaron para determinar la expresión de E1A. En las células infectadas con AdSyn-CO102, hubo una disminución en los niveles de E1A en tiempos posteriores durante la infección. De manera similar, en las células infectadas con AdSyn-CO189 u ONYX-838, hubo una disminución en los niveles de E1A en tiempos posteriores durante la infección; sin embargo, en el punto de tiempo anterior, la expresión de E1A es mayor que la expresión de E1A en las células infectadas con AdSyn-CO102. A diferencia, las células infectadas con AdSyn-CO181 exhiben una expresión más fuerte y continua de E1A a lo largo de la infección, lo que indica una falla en el progreso del ciclo de vida del adenovirus. Para la Figura 1B, se infectaron células de adenocarcinoma de pulmón confluentes (A549) con MOI 30 y se analizaron los lisados para determinar la expresión de E1A. Todas las infecciones condujeron a una disminución de los niveles de E1A en tiempos posteriores durante la infección, lo que indica una progresión típica del ciclo de vida del adenovirus.

Las Figuras 2A-2B son inmunotransferencias de lisados celulares que muestran la expresión de ciclinas celulares y proteínas tardías del adenovirus en células primarias y tumorales infectadas. Las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con AdSyn-COl02 (tipo salvaje), AdSyn-CO181 (E1A ALXCXE/AE4orf6/7), AdSyn-CO189 (E1A ALXCXE), AdSyn-CO210 (AE4orf6/7) o ONYX-838 (E1A ACR2). Para la Figura 2A, SAEC se infectaron con MOI 10. A diferencia de los virus de tipo salvaje y los virus con mutaciones E1A solas, AdSyn-CO181 no pudo activar las dianas del ciclo celular dependientes de E2F, las ciclinas de la fase S, la ciclina A y la ciclina B. Además, AdSyn-CO181 y AdSyn-CO210, que tienen mutaciones E4orf6/7, fueron defectuosos para la expresión y replicación de proteínas tardías. Ambos defectos fueron evidentes en menor grado con AdSyn-CO210. Para la Figura 2B, se infectaron células A549 con MOI 30. A diferencia de las células primarias infectadas, no hubo defectos evidentes en la expresión de proteínas estructurales tardías, y la ciclina A y la ciclina B permanecieron presentes en todas las muestras de A549 infectadas.

Las Figuras 3A-3B son histogramas FACS que cuantifican el ADN celular en células SAEC y A549 infectadas, respectivamente. Las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con AdSyn-CO102 (tipo salvaje), AdSyn-CO181 (E1A ALXCXE/AE4orf6/7), AdSyn-CO189 (E1A ALXCXE) o AdSyn-CO210 (AE4orf6/7), y se recolectaron 48 horas después de la infección. El contenido de ADN de las células no infectadas se muestra en el perfil de fondo. El eje Y es la abundancia relativa de las células y el eje X es la fluorescencia del yoduro de propidio (PI) en la célula, que es proporcional a la cantidad de ADN. Para la Figura 3A, las SAEc quiescentes se infectaron con MOI 10. La infección por AdSyn-CO181 exhibió un fuerte defecto de replicación del ADN en SAEC en relación con AdSyn-CO102, que está relacionado con una disminución de la replicación del virus. En este momento, también fue evidente un defecto modesto en las SAEC infectadas con AdSyn-CO210. Para la Figura 3B, se infectaron células A549 con MOI 30. No fue evidente ningún defecto de replicación del ADN con cualquier infección por virus mutante en estas células. Las Figuras 4A-4B son gráficos que muestran estallidos de adenovirus de células SAEC y A549 infectadas, respectivamente. Las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con AdSyn-CO102 (tipo salvaje), AdSyn-CO181 (E1A ALXCXE/AE4orf6/7), AdSyn-CO189 (E1A ALXCXE), AdSyn-CO210 (AE4orf6/7) o ONYX-838 (E1A ACR2) y el medio se recolectó 48 y 72 horas después de la infección. Las partículas de virus infecciosas en el medio se cuantificaron mediante ELISA. Para la Figura 4A, las SAEC quiescentes se infectaron con MOI 10. Tanto la infección por AdSyn-CO181 como por AdSyn-CO210 revelaron fuertes defectos de replicación en SAEC en relación con AdSyn-CO102. Para la Figura 4B, se infectaron células A549 con MOI 30. Con la excepción de AdSyn-CO210, no se observó ningún defecto en la replicación del virus en estas células.

Las Figuras 5A-5B son gráficos que muestran la viabilidad celular de las células SAEC y A549 infectadas, respectivamente, después de 7 días de infección. Las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con una dilución en serie de AdSyn-CO102 (tipo salvaje), AdSyn-CO181 (E1A ALXCXE/AE4orf6/7), AdSyn-C0189 (E1A ALXCXE), AdSyn-CO210 (AE4orf6/7) o ONYX-838 (E1A ACR2) y la actividad metabólica celular se cuantificó mediante el ensayo WST-1. Como se muestra en la Figura 5A, en comparación con AdSyn-C0102, AdSyn-CO181 exhibió una capacidad de muerte celular disminuida en SAEC. Como se muestra en la Figura 5B, de los virus mutantes probados, no hubo defecto en la muerte celular en relación con el virus de tipo salvaje.

La Figura 6A es una inmunotransferencia de lisados celulares. Los astrocitos humanos normales (NHA) infectados con MOI 10 se sometieron a inmunotransferencia para detectar la expresión de proteínas estructurales tardía del adenovirus y la inducción de ciclina celular. AdSyn-CO181 no induce ciclina A y demostró una expresión de proteínas virales tardías retrasada y disminuida en relación con AdSyn-CO102, que son indicativos de deficiencia de replicación.

Las Figuras 6B-6C son gráficos que muestran que AdSyn-CO181 exhibe una infección atenuada en NHA. Para la Figura 6B, NHA fueron infectadas por el panel de virus, y el número de partículas infecciosas en el medio se cuantificó 48 y 72 horas después de la infección. AdSyn-CO181 y AdSyn-CO189 demostraron un defecto de replicación en NHA en relación con AdSyn-CO102. Para la Figura 6C, se cuantificó la replicación del ADN en NHA infectadas con MOI 1048 horas después de la infección mediante PI FACS. El contenido de ADN de las células no infectadas se muestra en el perfil de fondo de los histogramas. El eje Y es la abundancia relativa de células y el eje X es la fluorescencia del PI en la célula, que es proporcional a la cantidad de ácido nucleico. AdSyn-CO181 exhibió una menor inducción de la replicación del ^aDⁿen relación con AdSyn-CO102, que está relacionada con una replicación del virus disminuida.

La Figura 7A es una inmunotransferencia de lisados celulares de células U87 del glioblastoma infectadas. Las células U87 infectadas con MOI 20 se sometieron a inmunotransferencia para detectar la expresión de las proteínas estructurales tardías del adenovirus y la inducción de ciclina celular.

Las Figuras 7B-7C son gráficos que muestran que los adenovirus recombinantes no tienen defectos de replicación en las células U87 del glioblastoma. Para la Figura 7B, las células U87 fueron infectadas por el panel de virus y el número de partículas infecciosas en el medio se cuantificó 48 y 72 horas después de la infección. Para la Figura 7C, se cuantificó la replicación del ADN en células U87 infectadas con MOI 2048 horas después de la infección mediante PI FACS. El contenido de ADN de las células no infectadas se muestra en el perfil de fondo de los histogramas. El eje Y es la abundancia relativa de células y el eje X es la fluorescencia del PI en la célula, que es proporcional a la cantidad de ácido nucleico.

La Figura 8A es una inmunotransferencia de lisados celulares de células U118 del glioblastoma infectadas. Las células U118 infectadas con MOI 20 se sometieron a inmunotransferencia para detectar la expresión de proteínas estructurales tardías del adenovirus y la inducción de ciclina celular.

Las Figuras 8B-8C son gráficos que muestran que los adenovirus recombinantes no tienen defectos de replicación en las células U118 del glioblastoma. Para la Figura 8B, las células U118 fueron infectadas por el panel de virus y el número de partículas infecciosas en el medio se cuantificó 48 y 72 horas después de la infección. Para la Figura 8C, se cuantificó la replicación del ADN en células U118 infectadas con MOI 2048 horas después de la infección mediante PI FACS. El contenido de ADN de las células no infectadas se muestra en el perfil de fondo de los histogramas. El eje Y es la abundancia relativa de células y el eje X es la fluorescencia del PI en la célula, que es proporcional a la cantidad de ácido nucleico.

La Figura 9A es una inmunotransferencia de lisados celulares de fibroblastos humanos infectados (células IMR90). Los fibroblastos infectados con MOI 10 se sometieron a inmunotransferencia para detectar la expresión de las proteínas estructurales tardías. AdSyn-CO181 exhibió una expresión de proteínas virales tardías retrasada y disminuida en relación con AdSyn-CO102, lo que es indicativo de deficiencia de replicación.

Las Figuras 9B-9C son gráficos que muestran que AdSyn-CO181 tiene defectos de replicación modestos en las células IMR90. Para la Figura 9B, los fibroblastos fueron infectados por el panel de virus y el número de partículas infecciosas en el medio se cuantificó 48 y 72 horas después de la infección. Con este ensayo en estos puntos de tiempo, no hubo una diferencia clara en la capacidad de replicación de los adenovirus modificados. Para la Figura 9C, se cuantificó la replicación del ADN en fibroblastos infectados con MOI 2048 horas después de la infección mediante PI FACS. El contenido de ADN de las células no infectadas se muestra en el perfil de fondo de los histogramas. El eje Y es la abundancia relativa de células y el eje X es la fluorescencia del PI en la célula, que es proporcional a la cantidad de ácido nucleico. AdSyn-CO181 exhibió una menor inducción de la replicación del ^aDⁿen relación con AdSyn-CO102, que está relacionada con una replicación del virus disminuida.

La Figura 10 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células NHA primarias infectadas después de 10 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie del virus mutante o de tipo salvaje. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1. Con tres y diez partículas infecciosas por célula, fueron evidentes dos grupos de virus, marcados en el gráfico como "menos muerte" y "más muerte". Los virus que indujeron menos muerte celular portan tanto una E1A con una mutación en la unión a Rb como una eliminación de E4orf6/7. Los virus que indujeron más muertes tienen una E1 de tipo salvaje o una E4 de tipo salvaje.

La Figura 11 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células SAEC-hTERT quiescentes infectadas después de 9 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie del virus mutante o de tipo salvaje. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1. Con tres y diez partículas infecciosas por célula, fueron evidentes dos grupos de virus, marcados en el gráfico como "menos muerte" y "más muerte". Los virus que indujeron menos muerte celular portan tanto una E1A con una mutación en la unión a Rb como una eliminación de E4orf6/7. Los virus que indujeron más muerte celular tienen una E1 de tipo salvaje o una E4 de tipo salvaje.

La Figura 12 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células SAEC-hTERT proliferantes infectadas después de 9 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie del virus mutante o de tipo salvaje. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1. Con tres y diez partículas infecciosas por célula, fueron evidentes dos grupos de virus, marcados en el gráfico como "menos muerte" y "más muerte". Los virus que indujeron menos muerte celular portan tanto una E1A con una mutación en la unión a Rb como una eliminación de E4orf6/7. Los virus que indujeron más muerte celular tienen una E1 de tipo salvaje o una E4 de tipo salvaje.

La Figura 13 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células A549 infectadas después de 7 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie del virus de tipo salvaje o modificado. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1.

La Figura 14 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células cancerosas de mama humanas infectadas (MDA MB 231) después de 7 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie del virus de tipo salvaje o modificado. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1. La Figura 15 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células de glioblastoma (U87) infectadas después de 7 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie del virus de tipo salvaje o modificado. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1.

La Figura 16 es una tabla que muestra la cuantificación de los ensayos de viabilidad celular para células NHA primarias infectadas, SAEC-hTERT (quiescentes), SAEC-hTERT (en proliferación), A549, MDA MB 231 y U87 mostradas en las Figuras 10-15.

La Figura 17 es una tabla que muestra la cuantificación de los ensayos de viabilidad celular para células U2OS infectadas (que tienen p53 y Rb funcionales) y células SaOS2 (que tienen p53 y Rb no funcionales). Las células se infectaron con una dilución en serie del virus de tipo salvaje o modificado. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1.

La Figura 18A es un gráfico que muestra la interfaz de unión del dominio FRB con rapamicina y FKBP12. Se induce un dominio FRB mutado (FRB*; residuo de mTOR T2098L) para formar un heterodímero FRB/FKBP12 con rapamicina o con el homólogo de rapamicina AP21967. La Figura 18B es un gráfico que muestra que el virus dirigido a EGFR con fibra FRB (AdSyn-CO205; SEQ ID NO: 88) ha mejorado la transducción de células cancerosas de mama MDA MB 453 en presencia de rapamicina, pero no de AP21967. El virus dirigido a EGFR con la fibra FRB* (AdSyn-CO220; SEQ ID NO: 98) ha mejorado la transducción de células MDA MB 453 en presencia de rapamicina o AP21967. La Figura 18C es una inmunotransferencia que muestra la actividad del inhibidor de mTOR rapamicina que bloquea la fosforilación de su diana p70 S6K. El homólogo de rapamicina AP21967 no inhibe mTOR a concentraciones de direccionamiento. La Figura 18D es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células cancerosas de mama metastásicas HS578T infectadas después de 9 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie de AdSyn-CO312. A las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, se añadió rapamicina fresca o AP21967 a 50 nM. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1 y se normalizó a las células no infectadas con un tratamiento farmacológico coincidente. AdSyn-CO312 porta las mutaciones oncolíticas de E1A ALXCXE, AE4orf6/7, AE3-RIDa/p, AE3-14.7k, y expresa los genes EGFRVHH-FKBP y fibra FRB* dirigidos a EGFR dependientes de rapamicina o AP21967. Hay una muerte potenciada de las células infectadas con el virus oncolítico dirigido a EGFR que reciben rapamicina o AP21967 en comparación con las que no están dirigidas.

La Figura 18E es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células cancerosas de mama metastásicas HS578T infectadas después de 9 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie de AdSyn-CO313. A las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, se añadió rapamicina fresca a 50 nM. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1 y se normalizó a las células no infectadas con un tratamiento farmacológico coincidente. AdSyn-CO313 porta las mutaciones oncolíticas de E1A ALXCXE, AE4orf6/7, AE3-RIDa/p, AE3-14.7k, y expresa el gen EGFRVHH-FKBP dirigido a EGFR dependiente de rapamicina y fibra FRB. Hay una muerte potenciada de las células infectadas con el virus oncolítico dirigido a EGFR que reciben rapamicina sin dirigirse.

La Figura 19 es un gráfico que muestra el volumen tumoral medio de xenoinjertos subcutáneos de HS578T en ratones tratados. Los ratones con tumores establecidos recibieron una inyección intratumoral de AdSyn-CO313, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal periódica de 8 mg/kg de rapamicina (n = 5) o un control de vehículo (n = 4), o recibieron un control de vehículo intratumoral y posteriormente recibieron una inyección intraperitoneal periódica de 8 mg/kg de rapamicina (n = 5) o control de vehículo (n = 4). La infección se repitió en los mismos grupos tres veces más cada 4 días y se inició 19 días después de la infección inicial. AdSyn-CO313 porta las mutaciones oncolíticas de E1A a Lx CXE, AE4orf6/7, AE3-RIDa/p, AE3-14.7k, y expresa los genes EGFRVHH-FKBP y fibra FRB dirigidos a EGFR dependientes de rapamicina. Los tumores en ratones que recibieron el virus oncolítico dirigido a EGFR con rapamicina exhibieron la mejor respuesta.

La Figura 20 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de células cancerosas de mama metastásicas HS578T infectadas después de 9 días de infección. Las células se infectaron con una dilución en serie de AdSyn-CO335. A las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, se añadió rapamicina fresca o AP21967 a 50 nM. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1 y se normalizó a las células no infectadas con un tratamiento farmacológico coincidente. AdSyn-CO335 porta las mutaciones oncolíticas de E1A ALXCXE, AE4orf6/7, AE3-RIDa/p, AE3-14.7k; la mutación E451Q de la hexona de desvío al hígado; y expresa los genes EGFRVHH-FKBP y fibra FRB* dirigidos a EGFR dependientes de rapamicina o AP21967. Hay una muerte potenciada de las células infectadas con el virus oncolítico dirigido a EGFR que reciben rapamicina o AP21967 en comparación con las que no están dirigidas.

Las Figuras 21A-21B son gráficos que muestran los volúmenes medios de xenoinjertos subcutáneos de HS578T en ratones tratados. Las Figuras 21C-21D son gráficos que muestran el cambio en veces en los volúmenes de xenoinjertos subcutáneos de HS578T en ratones tratados. Los ratones con tumores establecidos recibieron tres inyecciones intratumorales cada 4 días de AdSyn-CO335, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal de 2 o 8 mg/kg (n = 8 y n = 8, respectivamente) de rapamicina cada dos días siguientes o control de vehículo (n = 6) cada dos días siguientes; o recibieron tres inyecciones intratumorales cada 4 días de AdSyn-CO442, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal de 2 o 8 mg/kg (n = 6 y n = 6, respectivamente) de rapamicina cada dos días siguientes; o recibieron tres inyecciones intratumorales cada 4 días de control de vehículo, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal de 2 o 8 mg/kg (n = 6 y n = 6, respectivamente) de rapamicina cada dos días siguientes. Los tumores en ratones que recibieron el virus oncolítico dirigido a EGFR con 8 mg/kg de rapamicina muestran la mejor respuesta.

Las Figuras 22A-22C muestran la eliminación de la expresión génica mediada por adenovirus en el hígado y el desvío de la infección por adenovirus al hígado. Como se muestra en la Figura 22A, AdSyn-C0199, un vector del adenovirus que carece de la región E1, expresa luciferasa en niveles altos exclusivamente en el hígado después de una infección sistémica. Como se muestra en la Figura 22B, la señal de luciferasa se pierde cuando los ratones se infectan sistémicamente con AdSyn-CO200, un virus que coincide con AdSyn-C0199, excepto que el microARN específico del hígado miR122 elimina la expresión de luciferasa. Como se muestra en la Figura 22C, la expresión de luciferasa se puede detectar en el bazo cuando los ratones se infectan sistémicamente con AdSyn-CO171, un virus que coincide con AdSyn-CO200, excepto que la proteína hexona del adenovirus porta la mutación E451Q, que la desvía del hígado.

Las Figuras 23A-23E incluyen una ilustración de la estructura de la proteína de fibra y una serie de gráficos e imágenes que caracterizan los adenovirus recombinantes generados al combinar módulos de dos serotipos del adenovirus para crear virus con proteínas de fibra quiméricas que transducen mejor una variedad de tipos de células.

La Figura 24A es una ilustración que muestra modificaciones de módulo para crear virus quiméricos de cápside intercambiada. La Figura 24B es una tabla que enumera los virus mutantes específicos y sus modificaciones en los módulos E1, núcleo, E3 y E4.

Las Figuras 25A-25E son una serie de inmunotransferencias que muestran el contenido de proteínas y la expresión de los virus de cápside intercambiada.

Las Figuras 26A-26C son una serie de gráficos que muestran que los virus de cápside intercambiada no son neutralizados por suero humano que contiene anticuerpos anti-Ad5.

La Figura 27 muestra un alineamiento de secuencias E1A de especies de adenovirus humanos, que incluyen la especie A (Ad12; SEQ ID NO: 47), la especie B (Ad7; SEQ ID NO: 48), la especie C (Ad2 y Ad5; SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, respectivamente), la especie D (Ad9; SEQ ID NO: 51), la especie E (Ad4; SEQ ID NO: 52), la especie F (Ad40; SEQ ID NO: 53) y la especie G (Ad52; SEQ ID NO: 54). Se describe Y47, un sitio de mutación que se encuentra en las composiciones de adenovirus oncolíticos descritas en la presente descripción. Destacado en el cuadro gris está el motivo LXCXE que contiene C124, que es necesario para una fuerte interacción E1A-Rb.

La Figura 28 muestra un alineamiento de secuencias E4orf1 de especies de adenovirus humanos, que incluyen la especie A (Ad12; SEQ ID NO: 55), la especie B (Ad7; SEQ ID NO: 56), la especie C (Ad2 y Ad5; SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, respectivamente), la especie D (Ad9; SEQ ID No : 59), la especie E (Ad4; SEQ ID NO: 60) y la especie G (Ad52; SEQ ID NO: 61). Destacado en el cuadro gris está el motivo de unión a PDZ a través del cual E4orf1 regula a la alta PI3K y previene la regulación negativa de la proliferación celular.

La Figura 29 muestra una inmunotransferencia de expresión de proteínas de células 293-E4 infectadas con adenovirus sintéticos que portan componentes dirigidos a EGFR dependientes de rapamicina. Las células 293-E4 se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 10, ya sea por el Ad de tipo salvaje Adsembly (AdSyn-CO170), el AdSyn-CO205 modificado-dirigido o virus de control AdSyn-CO206 o AdSyn-CO207. Para el virus AdSyn-CO205 dirigido a EGFR controlado por rapamicina, se fusionó un reportero de GFP a E1A como un marcador de infección. El transcripto de E3B se modificó al eliminar RIDa, RIDp y 14.7k, y se usó para expresar EGFRVHH-FKBP. AdSyn-CO206 contiene todas las modificaciones de AdSyn-CO205, pero conserva una fibra de tipo salvaje y, por lo tanto, no tiene un dominio FRB. AdSyn-CO207 tiene todas las modificaciones de AdSyn-CO206, pero conserva una región E3 de tipo salvaje y, por lo tanto, no tiene el gen de fusión FKBP. El cambio en la migración de la fibra muestra la inserción del dominio FRB de 90 aminoácidos en AdSyn-CO207 y AdSyn-CO205. La expresión de la proteína de fusión EGFRVHH-FKBP se detectó mediante el sondeo para FKBP12. El transcurso del tiempo de la expresión de proteínas tardías muestra que no hay un defecto pronunciado en la replicación del mutante de la cápside o de los virus que expresan EGFRVHH-FKBP con reporteros de GFP-E1A en comparación con Ad de tipo salvaje Adsembly. La Figura 30 es un diagrama en cascada que muestra la respuesta del tumor del xenoinjerto de HS578T 28 días después de tres inyecciones intratumorales de vehículo (no infectado), virus de control (AdSyn-CO442) o adenovirus oncolítico (AdSyn-CO335), y 3 semanas de coadministración intraperitoneal de rapamicina (0, 2 o 8 mg/kg) cada dos días. De izquierda a derecha se muestran (a) no infectados, sin rapamicina; (b) no infectados, 2 mg/kg de rapamicina; (c) no infectados, 8 mg/kg de rapamicina; (d) AdSyn-CO335, sin rapamicina; (e) AdSyn-CO335, 2 mg/kg de rapamicina; (f) AdSyn-CO335, 8 mg/kg de rapamicina; (g) AdSyn-CO442, 2 mg/kg de rapamicina; y (h) AdSyn-CO442, 8 mg/kg de rapamicina. N = número de tumores en cada grupo. Cada columna representa un tumor individual, con datos expresados en relación con su volumen tumoral previo al tratamiento.

La Figura 31 muestra la tinción por inmunohistoquímica (IHC) de tejido de xenoinjerto de HS578T. Los ratones con tumores subcutáneos de xenoinjerto de HS578T se trataron mediante inyección intraperitoneal de 100 |^jL de vehículo, 2 mg/kg de rapamicina o 8 mg/kg de rapamicina. Una hora después de la inyección, se recolectaron tejidos de xenoinjerto, se fijaron en formalina al 10 % y se seccionaron para tinción por IHC con un anticuerpo que reconoce la forma fosfo-T378 de P70S6K. Se muestran micropictografías de secciones de tejido de xenoinjerto de HS578T teñidas para P70S6K fosforilada en la treonina 389 (P70S6K p-T389). La fosforilación de P70S6K en T389 es un sello distintivo de la actividad de mTOR. En los tejidos sin tratamiento o con la dosis efectiva baja del adenovirus dirigido a EGFR (2 mg/kg), la actividad de mTOR no se inhibe, como lo demuestra la tinción de P70S6K p-T389. A la dosis efectiva más alta del adenovirus dirigido a EGFR (8 mg/kg), se inhibe la actividad de mTOR, marcada por una pérdida de la tinción de P70S6K p-T389.

Listado de secuencias

Las secuencias de aminoácidos y nucleicas enumeradas en el listado de secuencias adjunto se muestran mediante el uso de abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos y código de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Sólo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. El listado de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII, creado el 23 de septiembre de 2015. En el listado de secuencias adjunto:

SEQ ID NO: 1-31 y 68-98 son secuencias de nucleótidos de adenovirus recombinantes (ver las Tablas 1-5; Ejemplo 6 y Ejemplo 7).

SEQ ID NO: 32 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E1A.

SEQ ID NO: 33 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E1A ALXCXE.

SEQ ID NO: 34 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E1A C124G.

SEQ ID NO: 35 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E1A A2-11.

SEQ ID NO: 36 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E1A Y47H C124G.

SEQ ID NO: 37 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E1A A2-11 Y47H C124G.

SEQ ID NO: 38 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E4orf1.

SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E4orf1 APDZb.

SEQ ID NO: 40 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E4orf6/7.

SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoácidos de la fibra del Ad5.

SEQ ID NO: 42 es la secuencia de aminoácidos de la fibra FRB del Ad5.

SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoácidos de la fibra FRB* del Ad5.

SEQ ID NO: 44 es la secuencia de aminoácidos de EGFRVHH-GS-FKBP.

SEQ ID NO: 45 es la secuencia de aminoácidos de la hexona del Ad5.

SEQ ID NO: 46 es la secuencia de aminoácidos de la hexona E451Q del Ad5.

SEQ ID NO: 47 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie A (Ad12).

SEQ ID NO: 48 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie B (Ad7)

SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie C (Ad2).

SEQ ID NO: 50 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie C (Ad5).

SEQ ID NO: 51 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie D (Ad9).

SEQ ID NO: 52 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie E (Ad4).

SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie F (Ad40).

SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos de E1A de la especie G (Ad52).

SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie A (Ad12).

SEQ ID NO: 56 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie B (Ad7).

SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie C (Ad2).

SEQ ID NO: 58 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie C (Ad5).

SEQ ID NO: 59 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie D (Ad9).

SEQ ID NO: 60 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie E (Ad4).

SEQ ID NO: 61 es la secuencia de aminoácidos de E4orf1 de la especie G (Ad52).

SEQ ID NO: 62 es la secuencia de nucleótidos de Ad2.

SEQ ID NO: 63 es la secuencia de nucleótidos del Ad5.

SEQ ID NO: 64 es la secuencia de aminoácidos de Ad2 E4orf6/7.

SEQ ID NO: 65 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E3-RIDa.

SEQ ID NO: 66 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E3-RIDp.

SEQ ID NO: 67 es la secuencia de aminoácidos del Ad5 E3-14.7k.

Descripción detallada

I. Abreviaturas

Ad adenovirus

CAR receptor del adenovirus coxsackie

CPE efecto citopático

EGFR receptor del factor de crecimiento epidérmico

ELISA ensayo inmunoabsorbente de unión a enzimas

FACS clasificación de células activadas por fluorescencia

FKBP proteína de unión a FK 506

FRB unión FKBP-rapamicina

hTERT transcriptasa inversa de la telomerasa humana

HuVEC células endoteliales vasculares humanas

MAV-1 adenovirus 1 de ratón

miR microARN

MOI multiplicidad de infección

mTOR diana de la rapamicina de mamíferos

NHA astrocitos humanos normales

PET topografía de emisión de positrones

PI yoduro de propidio

PRP sonda reportera de PET

Rb retinoblastoma

SAEC células epiteliales pequeñas de las vías respiratorias

WT tipo salvaje

II. Términos y Métodos

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en

Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y otros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar la revisión de las diversas modalidades de la descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

Adenovirus: virus sin envoltura con un revestimiento, genoma de ADN bicatenario y cápside icosaédrica. Actualmente se conocen 68 serotipos de adenovirus humanos, que se dividen en siete especies (especies A, B, C, D, E, F y G). Los diferentes serotipos de adenovirus se asocian con diferentes tipos de enfermedad, con algunos serotipos que causan enfermedad respiratoria (principalmente especies B y C), conjuntivitis (especies B y D) y/o gastroenteritis (especies F y G).

Administración: Para proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un agente terapéutico (porejemplo, un virus recombinante), por cualquier vía efectiva. Las vías de administración ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, vías de inyección (tales como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), oral, intraductal, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y de inhalación.

Anticuerpo: Un ligando polipeptídico que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera y/o cadena pesada que reconoce y se une (tal como reconoce específicamente y se une específicamente) a un epítopo de un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulinas están compuestas por una cadena pesada y una ligera, cada una de las cuales tiene una región variable, denominada la región variable pesada (V^h) y la región variable ligera (V^l). Juntas, la región V^hy la región V^lson responsables de unir el antígeno reconocido por el anticuerpo.

Los anticuerpos incluyen inmunoglobulinas intactas y las variantes y porciones (fragmentos) de anticuerpos bien conocidos en la técnica, tales como anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio VH o anticuerpos VHH), fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'², proteínas Fv monocatenarias ("scFv") y proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv"). Una proteína scFv es una proteína de fusión en la que una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina están unidas por un enlazador, mientras que en dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. El término "anticuerpo" también incluye formas modificadas por ingeniería genética tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos). Ver también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.

Agente quimioterapéutico: cualquier agente químico con utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular anormal. Tales enfermedades incluyen tumores, neoplasias y cáncer, así como enfermedades caracterizadas por un crecimiento hiperplásico, tal como la psoriasis. En un ejemplo, un agente quimioterapéutico es un compuesto radiactivo. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente un agente quimioterapéutico de uso (ver, por ejemplo, Slapak y Kufe, Principles of Cancer Therapy, Capítulo 86 en Harrison's Principles of Internal Medicine, 14a edición; Perry y otros, Chemotherapy, Ch. 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2a ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer, L., Berkery, R. (eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). La quimioterapia combinada es la administración de más de un agente para tratar el cáncer.

Quimérico: Compuesto por al menos dos partes que tienen diferentes orígenes. En el contexto de la presente descripción, un "adenovirus quimérico" es un adenovirus que tiene material genético y/o proteínas derivadas de al menos dos serotipos diferentes (tales como del Ad5 y un segundo serotipo del adenovirus). En este contexto, un adenovirus "de cápside intercambiada" se refiere a un adenovirus quimérico en el que las proteínas de la cápside se derivan de un serotipo del adenovirus y las proteínas restantes se derivan de otro serotipo del adenovirus. De manera similar, una "fibra quimérica" es una proteína de fibra que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de al menos dos serotipos diferentes de adenovirus. Por ejemplo, una fibra quimérica puede estar compuesta por un eje de fibra del Ad5 y un botón de fibra de un segundo serotipo del adenovirus (ver Figura 23A).

Contacto: Colocación en asociación física directa; incluye tanto en forma sólida como líquida.

Variante degenerada: en el contexto de la presente descripción, una "variante degenerada" se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido que incluye una secuencia que está degenerada como resultado del código genético. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un péptido están incluidas siempre que la secuencia de aminoácidos del péptido codificado por la secuencia de nucleótidos no cambie.

Eliminado: Un genoma del adenovirus que codifica una proteína E4orf1 o E4orf6/7 "eliminada" se refiere a un adenovirus que tiene una eliminación completa de la secuencia codificante de E4orf1 o E4orf6/7, o una eliminación parcial que da como resultado la ausencia de la expresión de las proteínas E4orf1 o E4orf6/7.

Desregulación de E2F: Se refiere a un aumento en la actividad del factor de transcripción E2F y genes diana corriente abajo, que ocurre en casi todos los tipos de cáncer humano. La desregulación de la actividad y la transcripción de la vía E2F puede resultar de una variedad de mutaciones diferentes en cualquier componente corriente arriba de la vía, tal como mutaciones con pérdida de función y deleciones en los supresores tumorales Rb, p107 y p130. Rb fue el primer supresor de tumores en ser identificado y está ausente o mutado en al menos un tercio de los tumores humanos. Además, las mutaciones de p16 y/o el silenciamiento epigenético pueden activar E2F en células tumorales. Las mutaciones de ciclina D y CDK4, las amplificaciones de genes o la sobreexpresión también pueden dar como resultado la actividad de E2F desregulada en tumores humanos. Además, E2F se activa mediante mutaciones en las vías de receptores de factores de crecimiento que incluyen EGFR, RTK, RAS, RAF, PI-3K, PTEN, RAF, MYC. Las mutaciones en la vía p16INK4a -Ciclina D: cdk4/6-RB-E2F generalmente ocurren de manera mutuamente excluyente, de modo que una 'diana' (por ejemplo, p16) no está acompañada por otras (por ejemplo, mutación de Rb o sobreexpresión de ciclina D:cdk). Sin embargo, la mayoría de las quimioterapias actuales son venenos proliferativos que inhiben las dianas transcripcionales de E2F, pero también son tóxicos para las células normales y a menudo tienen complicaciones iatrogénicas devastadoras. Como se describe en la presente descripción, un enfoque terapéutico alternativo es usar un virus que sufre una replicación lítica selectiva en lesiones de células cancerosas que han desregulado la vía p16-ciclina D: cdk4-RB-E2F.

E1A: El gen de la región temprana 1A (E1A) del adenovirus y los polipéptidos expresados a partir del gen. La proteína E1A juega un papel en la replicación del genoma viral al conducir las células al ciclo celular. Como se usa en la presente descripción, el término "proteína E1A" se refiere a las proteínas expresadas a partir del gen E1A y el término incluye proteínas E1A producidas por cualquier serotipo de adenovirus. A modo de ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína E1A del Ad5 de tipo salvaje se establece en la presente descripción como la SEQ ID NO: 32, y las secuencias de E1A del Ad5 modificadas se proporcionan en la presente descripción como las SEQ ID NO: 33-37. Además, las secuencias de la proteína E1A de tipo salvaje de una variedad de diferentes serotipos de adenovirus se establecen en la presente descripción como las SEQ ID NO: 47-54. En algunos ejemplos, una proteína E1A modificada incluye una proteína que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 32-37 o SEQ ID NO: 47-54. Las proteínas E1A modificadas contempladas en la presente descripción son aquellas que contribuyen a los defectos de replicación de un adenovirus recombinante en células normales en comparación con células tumorales. Las proteínas E1A modificadas descritas en la presente descripción son proteínas E1A del Ad5. Sin embargo, las modificaciones correspondientes se pueden realizar en cualquier serotipo deseado y, por tanto, están incluidas en la presente descripción. Por ejemplo, todas las especies de adenovirus humanos contienen el motivo LXCXE, que en Ad5 corresponde a LTCHE (residuos 122-126 de la SEQ ID NO: 32). De manera similar, la eliminación de los residuos 2-11 y las sustituciones Y47H y C124G se enumeran con referencia a Ad5, pero se pueden introducir en cualquier otro serotipo (ver Figura 27, que proporciona un alineamiento de E1A de todas las especies de adenovirus humanos).

E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k: Proteínas de expresión temprana producidas a partir del gen E3. Las proteínas E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k forman el complejo de internalización y degradación del receptor (RID), que se localiza en la membrana nuclear y causa la endocitosis y degradación de una variedad de receptores, que incluyen CD95 (receptor FasL) y TNFR1 y 2 (receptores TNF/TRAIL) para proteger las células infectadas de las respuestas antivirales del huésped. Las secuencias codificantes de E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k están una al lado de la otra, en este orden. En algunos ejemplos de la presente descripción, del codón de inicio de E3-RIDa al codón de terminación de E3-14.7k se eliminó y se reemplazó con la secuencia codificante de la proteína de fusión FKBP (ver, por ejemplo, AdSyn-CO312, AdSyn-CO313, AdSyn-CO335 y AdSyn-CO440). Las secuencias de aminoácidos del Ad5 E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k se establecen en la presente descripción como las SEQ ID NO: 65-67.

E4orf1: Una proteína del adenovirus producida a partir del gen E4. El término "proteína E4orf1" incluye proteínas E4orf1 producidas por el gen E4 de cualquier serotipo de adenovirus. A modo de ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína E4orf1 del Ad5 de tipo salvaje se establece en la presente descripción como la SEQ ID NO: 38, y una proteína E4orf1 del Ad5 modificada que tiene una eliminación del motivo de unión a PDZ se proporciona en la presente descripción como la SEQ ID NO: 39. Además, las secuencias de la proteína E4orf1 de tipo salvaje de una variedad de diferentes serotipos de adenovirus se establecen en la presente descripción como las SEQ ID NO: 55-61. En algunos ejemplos, una proteína E4orf1 modificada incluye una proteína que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 38, 39 y 55-61. Las proteínas E4orf1 modificadas contempladas en la presente descripción son aquellas que contribuyen a los defectos de replicación de un adenovirus recombinante en células normales en comparación con células tumorales. Las proteínas E4orf1 modificadas descritas en la presente descripción son proteínas E4orf1 del Ad5. Sin embargo, las modificaciones correspondientes se pueden realizar en cualquier serotipo deseado y, por tanto, están incluidas en la presente descripción. Como se indica en el alineamiento de E4orf1 mostrada en la Figura 28, los tres residuos C-terminales de E4orf1 constituyen el motivo de unión a PDZ en las especies de adenovirus A, B, C, D, E y G. En algunos ejemplos en la presente descripción, el adenovirus recombinante codifica una eliminación completa de E4orf1.

E4orf6/7: una proteína codificada por el gen E4 del adenovirus. El término "proteína E4orf6/7" incluye proteínas E4orf6/7 producidas por el gen ^e4 de cualquier serotipo de adenovirus. A modo de ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína E4orf6/7 del Ad5 de tipo salvaje se establece en la presente descripción como la SEQ ID NO: 40, y la secuencia de aminoácidos de la proteína E4orf6/7 de Ad2 de tipo salvaje se establece en la presente descripción como la SEQ ID NO: 64. En algunos ejemplos, una proteína E4orf6/7 incluye una proteína que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 64. Las proteínas E4orf6/7 modificadas contempladas en la presente descripción son aquellas que contribuyen a los defectos de replicación de un adenovirus recombinante en células normales en comparación con células tumorales. En algunos ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación (tal como una eliminación) que anula o altera su sitio de unión a E2F y/o altera las interacciones de E2F. En otros ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una modificación que elimina o altera la señal de localización nuclear, que es requerida para la translocación eficiente de E2F4. Las modificaciones ilustrativas de E4orf6/7 se analizan con más detalle en las secciones siguientes.

Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR): El receptor de la superficie celular para miembros de la familia EGF de ligandos de proteínas extracelulares. EGFR también se conoce como ErbB-1 y HER1. Muchos tipos de cáncer contienen mutaciones que conducen a la sobreexpresión de EGFR.

Fibra: La proteína de fibra del adenovirus es una proteína trimérica que media la unión a los receptores de la superficie celular. La proteína de fibra está compuesta por un eje N-terminal largo y un botón globular C-terminal (ver Figura 23A).

Proteína de unión a FK506 (FKBP): Una familia de proteínas expresadas en eucariotas que funcionan como chaperonas de plegamiento de proteínas. La FKBP es conocida por su capacidad para unirse a rapamicina. Una secuencia de FKBP ilustrativa se establece en la presente descripción como residuos 132-238 de la SEQ ID NO: 44.

Unión FKBP-rapamicina (FRB): un dominio de la diana de rapamicina (mTOR) en mamíferos que se une a rapamicina. Una secuencia ilustrativa para FRB se establece en la presente descripción como residuos 547-636 de la SEQ ID NO: 42. Una forma mutante de FRB (denominada en la presente descripción como "FRB*") que es capaz de unirse tanto a rapamicina como a rapalog (también conocido como AP21967) se establece en la presente descripción como residuos 547-636 de la SEQ ID NO: 43. FRB* contiene una sustitución de treonina por leucina (T2098L) en la posición 2098 de mTOR humano, que corresponde al residuo 620 de la SEQ ID NO: 43.

Proteína de fusión: Una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos dos proteínas o péptidos diferentes (heterólogos). Las proteínas de fusión se pueden generar, por ejemplo, mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico diseñada a partir de secuencias de ácido nucleico que codifican al menos una porción de dos proteínas diferentes (heterólogas). Para crear una proteína de fusión, las secuencias de ácido nucleico deben estar en el mismo marco de lectura y no contener codones de parada internos. Las proteínas de fusión, en particular las proteínas de fusión cortas, también se pueden generar mediante síntesis química.

Heterólogo: Una proteína o polipéptido heterólogo se refiere a una proteína o polipéptido derivado de una fuente o especie diferente.

Hexona: Una de las principales proteínas de la cápside del adenovirus. Una secuencia de hexona del Ad5 ilustrativa se establece en la presente descripción como la SEQ ID NO: 45. Una secuencia de hexona mutante que comprende una sustitución E451Q se establece en la presente descripción como la SEQ ID NO: 46.

Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, una proteína, un virus o una célula) que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula o tejido del organismo, o del propio organismo, en el que el componente se produce naturalmente, tal como otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y células. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han "aislado" incluyen las purificadas mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca moléculas de ácido nucleico y proteínas preparadas mediante la expresión recombinante en una célula huésped, así como moléculas de ácido nucleico y proteínas sintetizadas químicamente.

MicroARN (miARN o miR): Molécula de ARN monocatenario que regula la expresión génica en plantas, animales y virus. Un gen que codifica un microARN se transcribe para formar un microARN de transcripción primaria (primiARN), que se procesa para formar una molécula corta de tallo-lazo, denominada un microARN precursor (premiARN), seguida de una escisión endonucleolítica para formar el microARN maduro. Los microARN maduros tienen aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud y son parcialmente complementarios a la 3'UTR de uno o más ARN mensajeros diana (ARNm). Los microARN modulan la expresión génica al promover la escisión de los ARNm diana o al bloquear la traducción del transcripto celular. En el contexto de la presente descripción, un "microARN específico del hígado" es un microARN que se expresa preferencialmente en el hígado, tal como un microARN que se expresa solo en el hígado, o un microARN que se expresa significativamente más en el hígado en comparación con otros órganos o tipos de tejidos.

Modificación: Un cambio en la secuencia de una secuencia de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen, por ejemplo, sustituciones, inserciones y deleciones, o combinaciones de las mismas. Las inserciones incluyen fusiones terminales amino y/o carboxilo así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de proteínas. En algunos ejemplos, la modificación (tal como una sustitución, inserción o eliminación) da como resultado un cambio en la función, tal como una reducción o potenciación de una actividad particular de una proteína. Como se usa en la presente descripción, "A" o "delta" se refieren a una eliminación. Por ejemplo, E1AALXCXE se refiere a un polipéptido E1A que tiene una eliminación del motivo LXCXE. Las modificaciones sustitutivas son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos, pero pueden ocurrir en varios lugares diferentes a la vez. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se pueden combinar para llegar a una secuencia mutante final. Estas modificaciones se pueden preparar mediante la modificación de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, lo que produce así el ADN que codifica la modificación. Las técnicas para realizar mutaciones de inserción, eliminación y sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas en la técnica. Una proteína, ácido nucleico o virus "modificado" es uno que tiene una o más modificaciones como se indica anteriormente.

Neoplasia, malignidad, cáncer y tumor: una neoplasia es un crecimiento anormal de tejido o células que resulta de una división celular excesiva. El crecimiento neoplásico puede producir un tumor. La cantidad de un tumor en un individuo es la "carga tumoral" que se puede medir como el número, el volumen o el peso del tumor. Un tumor que no hace metástasis se denomina "benigno". Un tumor que invade el tejido circundante y/o puede hacer metástasis se denomina "maligno". Los tumores malignos también se conocen como "cáncer".

Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o la médula ósea. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, que incluyen leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónica (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia. En algunos casos, los linfomas se consideran tumores sólidos.

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que generalmente no contienen quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran por el tipo de células que los forman (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia maligna linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, neoplasias por infección del virus del papiloma humano (HPV), adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (tales como un glioma (tales como glioma del tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, craneofarogioma Schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebral).

Virus oncolítico: Un virus que mata selectivamente células de un trastorno proliferativo, por ejemplo, células cancerosas/ tumorales. La destrucción de las células cancerosas puede detectarse mediante cualquier método establecido en la técnica, tales como determinar el recuento de células viables o detectar el efecto citopático, la apoptosis o la síntesis de proteínas virales en las células cancerosas (por ejemplo, mediante marcaje metabólico, inmunotransferencia o RT-PCR de genes virales necesarios para la replicación), o reducción del tamaño de un tumor.

Unido operativamente: Una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o la expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

Vehículo farmacéuticamente aceptable: Los vehículos farmacéuticamente aceptables (vehículos) útiles en esta descripción son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos (por ejemplo, un virus recombinante descrito en la presente descripción).

En general, la naturaleza del vehículo dependerá del modo particular de administración que se utilice. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden generalmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, en forma de polvo, píldora, tableta o cápsula), los vehículos sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los vehículos biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Polipéptido, péptido o proteína: Un polímero en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que se unen mediante enlaces amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, se puede usar el isómero óptico L o el isómero óptico D. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción. Estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. El término "residuo" o "residuo de aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido.

Una sustitución conservativa en un polipéptido es una sustitución de un residuo de aminoácido en una secuencia de proteína por un residuo de aminoácido diferente que tiene propiedades bioquímicas similares. Típicamente, las sustituciones conservativas tienen poco o ningún impacto sobre la actividad de un polipéptido resultante. Por ejemplo, una proteína o péptido que incluye una o más sustituciones conservativas (por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones) retiene la estructura y función de la proteína o péptido de tipo salvaje. Puede producirse un polipéptido para que contenga una o más sustituciones conservativas mediante la manipulación de la secuencia de nucleótidos que codifica ese polipéptido mediante el uso, por ejemplo, de procedimientos estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio o PCR. En un ejemplo, tales variantes pueden seleccionarse fácilmente al probar la reactividad cruzada del anticuerpo o su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria. A continuación se muestran ejemplos de sustituciones conservativas.

Residuo original Sustituciones conservativas

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln, His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

His Asn; Gln

Ile Leu, Val

Leu Ile; Val

Lys Arg; Gln; Glu

Met Leu; Ile

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val Ile; Leu

Las sustituciones conservativas generalmente mantienen (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.

Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de las proteínas serán no conservativas, por ejemplo, cambios en los que (a) un residuo hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histadilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad: "Prevenir" una enfermedad se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad. "Tratar" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. "Mejorar" se refiere a la reducción en el número o la gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad.

Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen). Un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción. Típicamente, los promotores se localizan cerca de los genes que transcriben. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales que pueden localizarse hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un "promotor constitutivo" es un promotor que está continuamente activo y no está sujeto a regulación por señales o moléculas externas. A diferencia, la actividad de un "promotor inducible" está regulada por una señal o molécula externa (por ejemplo, un factor de transcripción o tetraciclina). Proteína IX (pIX): Un componente menor de la cápside del adenovirus que se asocia con la proteína hexona.

Purificado: El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende que sea un término relativo. Así, por ejemplo, un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo purificado es uno que se aísla total o parcialmente de proteínas y otros contaminantes asociados de forma natural. En determinados ejemplos, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo celular u otra preparación cruda y se ha sometido a fraccionamiento para eliminar varios componentes de la preparación inicial, tales como proteínas, restos celulares y otros componentes.

Rapamicina: Una molécula pequeña con propiedades inmunosupresoras y antiproliferativas conocidas. La rapamicina, también conocida como sirolimus, es un macrólido que se descubrió por primera vez como un producto de la bacteria Streptomyces hygroscopicus. La rapamicina se une e inhibe la actividad de mTOR.

Célula deficiente en Rb: Una célula (tal como una célula tumoral) en la que el nivel del supresor de tumores Rb se reduce en comparación con el nivel de Rb en una célula normal o de control, o una célula en la que la vía de Rb está interrumpida o inactiva. Los términos "vía de Rb" o "vía de señalización de Rb" se refieren, al menos en parte, a moléculas que afectan la actividad de pRb, que incluyen los complejos pRb/p107, E2F-1/-2/-3 y ciclina G1/cdk. Se apreciará que las moléculas que no se conocen actualmente también pueden entrar dentro de esta definición.

Rb/p16/Ciclina D: replicación de cdk4/E2F alterada o deficiente de adenovirus: Un adenovirus (tal como un adenovirus modificado/recombinante) que tras la infección de una célula, exhibe una replicación parcial o totalmente atenuada en presencia de niveles normales de Rb/p107/p130/p16/Ciclina:proteínas de la vía CDK/E2F celulares funcionales, que incluyen los puntos de control Rb/p107/p130/p16/E2F/CDK-ciclina. Por ejemplo, si la célula infectada tiene la vía Rb/p16 alterada o deficiente (es decir, la célula infectada no expresa niveles normales de Rb u otras proteínas en la vía Rb/p16 completamente funcional), la replicación de la vía Rb/p16/E2F la replicación alterada del adenovirus procederá normalmente. Por el contrario, si una célula expresa niveles normales de Rb funcional (por ejemplo, Rb con actividad normal, también denominada en la presente descripción "célula que expresa Rb"), se atenúa o previene la replicación del adenovirus deficiente o alterado en la replicación de Rb. Una célula puede tener Rb alterado o deficiente al no expresar niveles normales de Rb (por ejemplo, una mutación en la región reguladora del gen Rb) o al expresar Rb mutado que tiene una actividad de Rb por debajo de lo normal. Los niveles normales de Rb y los niveles normales de actividad de Rb se encuentran en células sanas y no enfermas del mismo tipo. Por tanto, la célula alterada en Rb incluye un gen Rb mutado. Opcionalmente, la célula alterada en Rb incluye un genoma en donde el gen Rb está total o parcialmente eliminado. La célula alterada en Rb puede ser una célula cancerosa/tumoral. Otras lesiones genómicas que pueden provocar la pérdida de la función normal de Rb incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de CDK, mutaciones y amplificaciones de ciclina, mutaciones de p16 y/o silenciamiento epigenético, mutaciones de p107, mutaciones de p130 y mutaciones de las vías de receptores de factores de crecimiento.

Vía supresora de tumores Rb/p16 o vía Rb/p16: Se refiere a la vía de señalización completa que incluye la proteína del retinoblastoma (Rb) y otras familias de proteínas/proteínas en la vía, que incluyen, pero no se limitan a, Cdk, E2F, proteína cinasa C atípica y Skp2. El término "vía supresora de tumores Rb/p16 alterada o deficiente" significa que una o más moléculas en la vía de señalización están alteradas o deficientes, por ejemplo, al no expresar niveles normales o una proteína o al expresar proteínas mutadas que tienen una actividad por debajo de lo normal, de manera que la vía funciona de manera anormal. Tales defectos dan como resultado altos niveles de expresión de E2F libre y alta actividad del promotor de E2F. Por tanto, una célula puede tener la vía Rb/p16 alterada o deficiente al no expresar niveles normales de una proteína o al expresar proteínas mutadas que tienen una actividad por debajo de lo normal en la vía supresora de tumores Rb/p16.

Recombinante: Una molécula de ácido nucleico, una proteína o un virus recombinante es uno que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial puede lograrse mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácido nucleico, tales como mediante técnicas de ingeniería genética. El término "recombinante" también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que se han alterado únicamente mediante la adición, sustitución o eliminación de una porción de la molécula de ácido nucleico, proteína o virus natural.

Defectos de replicación: Un adenovirus que exhibe "defectos de replicación" en una célula no tumoral (en comparación con una célula tumoral) se refiere a un adenovirus que exhibe una replicación viral reducida en células normales en comparación con las células tumorales. Los defectos de replicación se evidencian, por ejemplo, por una falta de expresión de proteínas virales tardías, una reducción en la síntesis de ADN viral, una capacidad reducida para inducir genes diana E2F (por ejemplo, ciclina A y B), una capacidad reducida para provocar la entrada en la fase S y/o una capacidad reducida para inducir la muerte celular en células normales en comparación con las células tumorales.

Virus de replicación deficiente: Un virus que inhibe preferencialmente la proliferación celular, causa lisis celular o induce apoptosis (considerada colectivamente como muerte) en una población celular predeterminada con un fenotipo dado (por ejemplo, células tumorales con una vía E2F desregulada). Tales virus no pueden o tienen una capacidad limitada para reducir o inhibir la proliferación celular, causar lisis celular, inducir apoptosis o replicarse de otro modo en células que no tienen el fenotipo celular predeterminado (tales como células normales, no tumorales).

Identidad de secuencia: La identidad o similitud entre dos o más secuencias de ácido nucleico, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia se puede medir en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor es el porcentaje, más idénticas son las secuencias. La similitud de secuencia se puede medir en términos de porcentaje de similitud (que tiene en cuenta las sustituciones conservativas de aminoácidos); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean mediante el uso de métodos estándar. Esta homología es más significativa cuando las proteínas ortólogas o los ADNc se derivan de especies que están más estrechamente relacionadas (tales como las secuencias humanas y de ratón), en comparación con las especies relacionadas más distantes (tales como las secuencias humanas y de C. elegans).

Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineamiento se describen en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet y otros, Nuc. Acids Res.

16:10881-90, 1988; Huang y otros. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson y otros, Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencias y de los cálculos de homología.

La herramienta de búsqueda de alineamiento local básica de NCBI (BLAST) (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible en varias fuentes, que incluyen el Centro Nacional de Información Biológica (NCBI) y en internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede encontrar información adicional en el sitio web de NCBI.

Serotipo: Un grupo de microorganismos estrechamente relacionados (tales como virus) que se distingue por un conjunto característico de antígenos.

Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos.

Sintético: Producido por medios artificiales en un laboratorio, por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína sintético se puede sintetizar químicamente en un laboratorio.

Ligando de direccionamiento: En el contexto de la presente descripción, un "ligando de direccionamiento" es una proteína que dirige un adenovirus recombinante a un tipo celular específico que expresa un receptor o proteína de unión específica para el ligando de direccionamiento. En algunos ejemplos, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo específico para una proteína de la superficie celular sobreexpresada en tumores (por ejemplo, EGFR). Agente terapéutico: Un compuesto químico, molécula pequeña, virus recombinante u otra composición, tales como un compuesto antisentido, anticuerpo, péptido o molécula de ácido nucleico capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra adecuadamente a un sujeto. Por ejemplo, los agentes terapéuticos para el cáncer incluyen agentes que previenen o inhiben el desarrollo o la metástasis del cáncer.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Una cantidad de un agente farmacéutico o terapéutico especificado (por ejemplo, un virus recombinante) suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula, que se trata con el agente. La cantidad efectiva del agente puede depender de varios factores, que incluyen, pero no se limitan a, el sujeto o las células que se tratan y la forma de administración de la composición terapéutica.

Uexon: Un marco de lectura abierto localizado en la / cadena (transcripción hacia la izquierda) entre la región E3 temprana y el gen de la fibra (Tollefson y otros, J Virol 81(23): 12918-12926).

Vector: Un vector es una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin interrumpir la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula huésped. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permitan replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y la traducción del gen o los genes insertados.

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. "Que comprende A o B" significa que incluye A, o B, o A y B. Además, debe entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción en la práctica o ensayo de la presente descripción, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, que incluye las explicaciones de los términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

111. Adenovirus recombinantes

La presente descripción proporciona adenovirus recombinantes capaces de replicarse selectivamente en células tumorales desreguladas por E2F. Los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción tienen un genoma que codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas. Como resultado de las mutaciones de E1A y E4orf6/7, los adenovirus recombinantes exhiben defectos de replicación en células normales (es decir, no tumorales), mientras retienen la capacidad de replicarse en células tumorales y lisarlas. En un ejemplo, los adenovirus recombinantes tienen una replicación disminuida en una célula normal (es decir, no tumoral), en relación con una célula tumoral del mismo tipo de célula (por ejemplo, célula cancerosa de mama frente a célula de mama normal), tal como una disminución de al menos 20 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 %, por ejemplo, según se determina al comparar el número de partículas infecciosas en células normales infectadas y células tumorales infectadas.

Los adenovirus recombinantes proporcionados en la presente descripción incluyen opcionalmente modificaciones adicionales, tales como para dirigirse a tipos celulares específicos, para inhibir el direccionamiento y la replicación en el hígado, y para evadir anticuerpos neutralizantes preexistentes para serotipos de adenovirus comunes. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican los adenovirus oncolíticos.

También se proporcionan en la presente descripción vectores de expresión de genes de adenovirus reporteros recombinantes que expresan GFP-luciferasa bajo el control del promotor EF1a. En algunos casos, los adenovirus reporteros descritos incluyen una o más modificaciones para inhibir el direccionamiento y la replicación en el hígado. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican los adenovirus reporteros recombinantes.

A. Modificaciones oncolíticas

Las modificaciones oncolíticas específicas descritas en la presente descripción se describen con referencia a la secuencia del genoma del adenovirus 5 (Ad5). Sin embargo, se podrían realizar las mismas modificaciones y deleciones en cualquier serotipo de adenovirus humano. En un ejemplo, el adenovirus recombinante es Ad34. En otros ejemplos específicos, el adenovirus recombinante es Ad11 o Ad37. Las Figuras 27 y 28 ilustran la similitud de secuencia en las regiones E1A y E4orf1 entre especies de adenovirus humanos.

La región CR1 de E1A tiene una secuencia y homología estructural con la de E2F celular y compite con las interacciones E2F-Rb. Los residuos hidrófobos de E1A conservados L43, L46 y Y47 sirven como anclajes hidrófobos para la interacción con Rb. La mutación de L43, L46 y/o Y47 a un aminoácido polar tal como D, E, H, K o R eliminaría esta interacción E1A-Rb. En algunos ejemplos de la presente descripción, el adenovirus recombinante incluye una mutación Y74H en E1A para interrumpir la interacción E1A-Rb.

E1A interactúa fuertemente con Rb a través de su motivo LXCXE. Dado que las cadenas laterales de la primera leucina y la cisteína central se unen en una pequeña hendidura hidrófoba del motivo de la caja B de Rb, las deleciones o mutaciones de estos residuos en aminoácidos pequeños (tales como G) o polares (tales como D, E, H, K o R) eliminarían esta interacción E1A-Rb. Por tanto, en algunos ejemplos, el adenovirus recombinante incluye una eliminación del motivo LXCXE (ALXCXE) o una sustitución C124G en E1A.

Ambos residuos de E1A, C124 e Y47, son críticos para la unión e inactivación de Rb. Por tanto, en algunos ejemplos, el adenovirus recombinante codifica el doble mutante Y/F47H y C124G, pero se cree que cualquier mutación realizada en estos residuos o regiones (como se describió anteriormente) dará como resultado interacciones E1A-Rb debilitadas. Por consiguiente, en la presente descripción se contemplan mutaciones o deleciones de cualquier residuo que interrumpa la interacción Rb-E1A.

La eliminación de los residuos 2-11 de E1A elimina una interacción p300/CBP e interrumpe la interacción DP-1, lo que reduce aún más la capacidad de E1A para regular a la alta las dianas de E2F. También se contemplan en la presente descripción mutaciones puntuales en los residuos 2-11 de E1A, tales como mutaciones de glicina o alanina de los residuos R2 o H3 conservados, o mutaciones de residuos polares (por ejemplo, D, E, H, K o R) de las I/L/V4 hidrófobas de diferentes serotipos de adenovirus (ver alineamiento de E1A mostrado en la Figura 27) para eliminar esta interacción.

E4orf1 interactúa con proteínas celulares que contienen motivos PDZ a través del motivo de unión a PDZ en su extremo C-terminal. En la presente descripción describimos que los tres últimos aminoácidos de E4orf1 se eliminan para eliminar su motivo de unión a PDZ. También se describen en la presente descripción mutaciones puntuales del S126 altamente conservado de E4orf1 del Ad5 en grandes residuos hidrófobos tales como V, L o I; o la mutación puntual de V128 de E4orf1 del Ad5 en residuos polares tales como D, E, H, K o R. Se cree que estas sustituciones eliminan la actividad de unión a PDZ de E4orf1 y eliminan esta función transformadora de E4orf1. Se pueden producir las mismas deleciones y/o mutaciones en E4orf1 en otros serotipos de adenovirus, tales como Ad34. También se pueden introducir deleciones completas de E4orf1.

En la presente descripción se proporciona un adenovirus recombinante, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en las células normales en comparación con las células tumorales.

En algunos ejemplos, el genoma codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 eliminada. En otros ejemplos más, el genoma codifica una proteína E1A modificada, una proteína E4orf1 modificada o eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada.

En algunos ejemplos, la proteína E1A modificada del adenovirus recombinante comprende una eliminación del motivo LXCXE; una eliminación de los residuos 2-11; una sustitución C124G; una sustitución Y47H; una sustitución Y47H y una sustitución C124G; o una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2 11. Estas mutaciones se describen con referencia a E1A del Ad5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; sin embargo, se pueden realizar las mutaciones correspondientes en cualquier otro adenovirus humano ya que las secuencias de E1A están muy conservadas (ver la Figura 27).

Describimos que la proteína E4orf1 modificada comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ. En otros ejemplos, describimos que la proteína E4orf1 comprende una eliminación de los 10 aminoácidos o 20 aminoácidos C-terminales, o una mutación de D68 a A, K, R, P, F, G o L.

En algunos ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación (tal como una eliminación) que anula o altera su sitio de unión a E2F y/o altera las interacciones de E2F. En otros ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una modificación que elimina o altera la señal de localización nuclear, que es requerida para la translocación eficiente de E2F4.

En ejemplos no limitantes particulares, el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO181, AdSyn-CO312, AdSyn-CO313, AdSyn-CO335, AdSyn-CO442);

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO285);

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO286);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124^gy una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO287);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO288);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO289);

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11 y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO290);

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO291);

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO292);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO293);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO294);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO295);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO296);

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO297); o

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada (ver, por ejemplo, AdSyn-CO298).

En ejemplos específicos, el genoma del adenovirus recombinante es al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO: 6-8, 10-12, 14, 15, 18-20, 22-26, 30, 31 y 82-87, o el genoma del adenovirus recombinante comprende o consiste en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-8, 10-12, 14, 15, 18-20, 22-26, 30, 31, 82-87 y 92-97 y ha disminuido la replicación en una célula normal (es decir, no tumoral), en relación con una célula tumoral del mismo tipo de célula (por ejemplo, célula cancerosa de mama frente a célula de mama normal), tal como una disminución de al menos el 20 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, por ejemplo, según se determina al comparar el número de partículas infecciosas en células normales y tumorales.

Describimos que el genoma del adenovirus recombinante comprende una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k.

B. Modificaciones de desvío del hígado

Los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción pueden incluir además modificaciones que desvíen el virus del hígado. La hexona del Ad5 puede unirse al factor X en la sangre, lo que puede conducir a su absorción por las células de Kuppfer en el hígado que previenen la diseminación sistémica y limitan la inflamación. Para superar esto, se diseñaron adenovirus recombinantes para incluir modificaciones genómicas adicionales en el E1 y los módulos del núcleo que previenen la captación y la expresión en el hígado.

Para probar módulos genómicos que incluyen estas modificaciones adicionales, y para crear vectores de expresión del Ad5 para su uso in vivo y el suministro de genes, los genes E1A/E1 se eliminaron y reemplazaron con una fusión de luciferasa-GFP dirigida por EF1a. Cuando se inyectó por vía intravenosa, AdSyn-CO199 se acumuló principalmente en el hígado como lo demuestra la bioluminiscencia de luciferasa (ver la Figura 22).

Para prevenir la expresión fuera de la diana en el hígado, los virus se diseñaron para incluir sitios de unión en el 3'UTR de E1A para microARN que se expresan específicamente en el hígado. En ejemplos particulares, se seleccionó miR122 como el microARN específico del hígado ya que su expresión y sitios de unión se conservan en células hepáticas tanto humanas como de ratón. En algunos ejemplos, se insertaron dos sitios de unión de microARN para miR122 específico de hígado en el 3'UTR de E1A para prevenir cualquier captación de virus residual en el hígado que induzca la expresión génica viral y las respuestas inflamatorias celulares. A diferencia de Adsyn-CO199, AdSyn-CO200 (ver la Figura 22 y el Ejemplo 2 a continuación) no dirige la expresión de luciferasa en el hígado.

Para prevenir la captación y el secuestro del virus en el hígado a través de la unión de la hexona del Ad5 al factor X, los virus se diseñaron con una mutación adicional en la hexona (E451Q) que previene la captación del hígado. A diferencia de AdSyn199 y Adsyn200, AdSyn-CO171 no se acumula en el hígado y en su lugar puede dirigirse a otros órganos, en este caso el bazo y los ganglios linfáticos, ya que estos eran animales que no portaban tumores (Figura 22).

Para permitir la administración sistémica de virus selectivos a E2F con una o más mutaciones en E1A, E4orf1 y/o E4orf6/7, se diseñaron adenovirus recombinantes para incluir aún más la modificación E451Q de desvío del hígado en la hexona (ver, por ejemplo, AdSyn-C0335 y AdSyn-CO442; ver las Figuras 20 y 21 y el Ejemplo 2).

En la presente descripción se contemplan otras mutaciones en el gen de la hexona del adenovirus para prevenir la acumulación de adenovirus en el hígado. Por ejemplo, un adenovirus recombinante se podría desviar del hígado al reemplazar las nueve regiones hipervariables de la hexona con las de diferentes serotipos.

En la presente descripción se proporcionan adenovirus recombinantes, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y codifica además una proteína hexona modificada, en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en células normales en comparación con las células tumorales (ver, por ejemplo, AdSyn-CO335). En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada.

Por ejemplo, la proteína hexona modificada comprende una sustitución E451Q. En ejemplos específicos, el genoma del adenovirus recombinante es al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO; 97, o el genoma comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO; 97.

En la presente descripción se proporcionan además adenovirus recombinantes, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y además comprende uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado, en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en las células normales en comparación con las células tumorales. En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada.

Por ejemplo, uno o más sitios de unión para el microARN específico del hígado están localizados en el 3'-UTR de E1A. En algunos ejemplos, el microARN específico del hígado es miR-122, miR-30 o miR-192.

C. Modificaciones para el redireccionamiento inducible

Los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción pueden modificarse además para un redireccionamiento inducible in vivo a receptores de células tumorales. Los vectores de Ad2/5 usados de forma ubicua dependen del receptor del adenovirus coxsackie (CAR) para la infección, que está presente en las células epiteliales, pero ausente en la mayoría de los cánceres metastásicos. "RapAD" permite el direccionamiento inducible por rapamicina/rapalog de la infección adenoviral a cualquier receptor de células tumorales (o cualquier tipo de célula) a través de proteínas de fusión (ver Publicación PCT No. WO 2013/138505). El uso de un sistema de adaptador flexible no interfiere con el ensamblaje de las cápsides virales. Una proteína de fusión de redireccionamiento ideal es un anticuerpo que tiene una fuerte afinidad por una molécula específica de la superficie de la célula cancerosa. Los camélidos y los tiburones codifican anticuerpos de dominio único (sdAbs) que reconocen sus epítopos a través de un único dominio VHH variable de 10 kDa. Mediante el uso de la biología sintética, se pueden crear VHH que reconozcan moléculas específicas, tales como EGFR y CEACAM5, que están altamente reguladas a la alta en el cáncer de pulmón. Se ha demostrado que la rapamicina redirecciona la infección por adenovirus sintéticos a EGFR en células tumorales metastásicas en las que CAR está regulado a la baja.

Los adenovirus modificados también pueden dirigirse con el rapalog AP21967 biológicamente ortogonal. Aunque la rapamicina es una combinación racional con la terapia adenoviral oncolítica, puede haber casos en los que sería deseable evitar los efectos celulares y a nivel de organismo de la rapamicina. Por tanto, como otra opción para el redireccionamiento de los adenovirus, se puede usar el homólogo estructural de rapamicina AP21967. AP21967 es capaz de formar heterodímeros estables con FKBP y un dominio FRB* mutante (mutación de mTOR T2098L), pero no con el dominio FRB de tipo salvaje. A diferencia de la rapamicina, AP21967 no inactiva la señalización de mTOR como lo demuestra la fosforilación de p70S6quinasa, un sustrato canónico corriente abajo. Sin embargo, AP21967 todavía es capaz de inducir el redireccionamiento de virus que expresan la fibra FRB* (pero no la fibra FRB) a las células tumorales a través de las fusiones FKBP-VHH (Figura 18).

Cuando el adenovirus dirigido a EGFR se modifica con el dominio FRB mutante (FRB*), puede inducirse a infectar células mediante EGFR tanto con rapamicina como con AP21967 (ver las Figuras 18-21 y el Ejemplo 2 a continuación).

En la presente descripción se proporcionan adenovirus recombinantes, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y codifica además un ligando de direccionamiento fusionado a una proteína FKBP y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína FRB de tipo salvaje o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L. En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada.

En algunos ejemplos, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo VHH de camélido. En ejemplos particulares, el anticuerpo de dominio único es específico para EGFR, u otra molécula que está regulada a la alta en células tumorales. En ejemplos no limitantes, el genoma del adenovirus recombinante es al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 88, o comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 88 (ver, por ejemplo, AdSyn-CO312, AdSyn-CO313 y AdSyn-CO205).

En algunos ejemplos, las proteínas de fusión del ligando que se dirige a FKBP se alojan en el genoma del adenovirus mediante la eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k. Sin embargo, se contemplan localizaciones alternativas en el genoma del adenovirus. Por ejemplo, la proteína de fusión ligando de direccionamiento-FKBP también podría insertarse como una fusión N-terminal a E3-ADP, con una secuencia enlazadora P2A autoescindible (ver, por ejemplo, AdSyn-CO440; SEQ ID NO: 68) o una fusión C-terminal a E1B-55k, con una secuencia P2A autoescindible.

Se proporcionan además adenovirus recombinantes, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y codifica además una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína FRB mutante que comprende una sustitución de T2098L. En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína hexona modificada que comprende una sustitución E451Q. En ejemplos específicos, el genoma del adenovirus recombinante es al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 31, o comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 31 (ver, por ejemplo, AdSyn-CO336). En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada.

Los adenovirus recombinantes redireccionados induciblemente descritos anteriormente pueden incluir además modificaciones de redireccionamiento hepático, tales como una proteína hexona mutante (por ejemplo, una sustitución E451Q). Alternativamente, o además, el genoma del adenovirus recombinante puede incluir uno o más sitios de unión para un microARN específico de hígado (como se describió anteriormente).

D. Proteínas de fibra quiméricas para redireccionamiento

Si bien se ha demostrado que las proteínas de fibra del Ad5 y muchos otros serotipos se unen al receptor del adenovirus coxsackie (CAR) para la unión celular, se ha demostrado que otros serotipos usan CD46, desmogleína 2, ácido siálico u otros. Por tanto, en la presente descripción se proporcionan adenovirus recombinantes que tienen un genoma que codifica una proteína de fibra quimérica, que dirige así los virus recombinantes a diferentes receptores celulares (ver las Figuras 23A-23E y el Ejemplo 3 a continuación).

En la presente descripción se proporcionan adenovirus recombinantes, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y codifica además una proteína de fibra quimérica. En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada.

En algunos ejemplos, la proteína de fibra quimérica comprende un eje de fibra de un primer serotipo del adenovirus y un botón de fibra de un segundo serotipo del adenovirus. En algunos ejemplos, el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11, Ad12, Ad34 o Ad37. En un ejemplo no limitante, el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad34.

En ejemplos particulares, el genoma del adenovirus recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84.

Los adenovirus oncolíticos recombinantes que expresan una fibra quimérica pueden incluir además modificaciones de direccionamiento inducible y/o de redireccionamiento hepático como se discutió anteriormente.

E. Cápsides intercambiadas para evadir anticuerpos neutralizantes

La presente descripción contempla además la explotación de la modularidad de los adenovirus naturales para crear virus quiméricos capaces de evadir los anticuerpos neutralizantes existentes. En particular, en la presente descripción se describen virus basados en el Ad5 que tienen intercambios completos de módulos de "cápside" (casi el 60 % del genoma), que los hacen "invisibles" para los anticuerpos preexistentes y permiten inoculaciones repetidas. Los adenovirus recombinantes de cápside intercambiada se describen además en el Ejemplo 4 (ver también las Figuras 24-26).

En la presente descripción se proporcionan adenovirus recombinantes, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, o cualquier combinación de las mismas, y en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica un adenovirus quimérico de cápside intercambiada. En algunos ejemplos, el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada. En algunos ejemplos, las regiones E1, E3 y E4 del genoma se derivan de un primer serotipo del adenovirus y las regiones E2B, L1, L2, L3, E2A y L4 del genoma se derivan de un segundo serotipo del adenovirus. En algunos ejemplos, la región E1 del primer serotipo del adenovirus se modifica para codificar una proteína pIX del segundo serotipo del adenovirus; y/o la región e3 del primer serotipo del adenovirus se modifica para codificar proteínas Uexon y de fibra del segundo serotipo del adenovirus. En ejemplos particulares, el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11, Ad34 o Ad37.

En ejemplos particulares, el genoma del adenovirus recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 85, o cualquiera de las SEQ ID NO: 92-97.

Los adenovirus recombinantes oncolíticos de cápside intercambiada pueden incluir además la fibra quimérica, las modificaciones de direccionamiento inducible y/o de redireccionamiento hepático como se discutió anteriormente. F. Otras modificaciones

Los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción también pueden incluir modificaciones adicionales, tales como potenciar el tumor selectivamente, dirigir la infección a tipos celulares específicos y evadir los anticuerpos neutralizantes existentes.

En un ejemplo, el adenovirus recombinante es un adenovirus oncolítico dirigido a EGFR con mutaciones E1, E3 y E4 junto con la proteína de la cápside pentona que porta una mutación en el motivo RGD de unión a integrina a RGE (por ejemplo, AdSyn-CO511; SEQ ID NO: 86). Se ha demostrado que esta mutación de la pentona reduce la captación del virus en el bazo y atenúa la respuesta inflamatoria antiviral.

En otro ejemplo, el adenovirus oncolítico recombinante comprende mutaciones E1 y E4 junto con una inserción de un péptido RGD en la proteína de la fibra (por ejemplo, AdSyn-CO512; SEQ ID NO: 87). Se ha demostrado que la inserción de RGD en la proteína de la fibra aumenta drásticamente la infección en una variedad más amplia de tipos de células, que incluyen las células endoteliales vasculares.

G. Adenovirus reporteros recombinantes

También se proporcionan en la presente descripción adenovirus reporteros recombinantes. En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus recombinante comprende una eliminación de E1A y codifica EF1a-luciferasa (ver, por ejemplo, AdSyn-CO199, AdSyn-CO200 y AdSyn-CO171).

En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus recombinante comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico del hígado y/o codifica una proteína hexona modificada. En algunos ejemplos, uno o más sitios de unión para el microARN específico del hígado están localizados en el 3'-UTR de E1A. En ejemplos específicos no limitantes, el microARN específico del hígado es miR-122. En algunos ejemplos, la proteína hexona modificada comprende una sustitución E45lQ.

En ejemplos específicos no limitantes, el genoma del adenovirus recombinante es al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a, o comprende o consiste en, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 (AdSyn-CO199), SEQ ID NO: 28 (AdSyn-CO200) o SEQ ID NO: 29 (AdSyn-CO171).

IV. Secuencias de virus mutantes y de tipo salvaje

Además, la presente descripción proporciona genomas de adenovirus recombinantes de los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción. En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31 y 68-98. En ejemplos específicos, el ácido nucleico recombinante comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31 y 68-98.

También se proporcionan vectores que comprenden los genomas de adenovirus recombinantes. En algunos ejemplos, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31 y 68 98. En algunos ejemplos, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-31 y 68-98.

A continuación se proporcionan secuencias de proteínas de adenovirus mutantes y de tipo salvaje expresadas por los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción.

Mutantes E1A

En las secuencias de E1A siguientes, el motivo LXCXE se indica mediante subrayado. Este motivo está presente en los aminoácidos 122-126 de E1A del Ad5 (SEQ ID NO: 32). Las sustituciones Y47H y C124G se muestran en negrita.

E1A del Ad5

MRHIICHGGVITEEM AASLLDQLIEEVL ADNLPPP SHFEPPTLHELYDLD VT APEDPNEE

AVSQIFPDSVMLAVQEGIDLLTFPPAPGSPEPPHLSRQPEQPEQRALGPVSMPNLVPEVID

LTCHEAGFPPSDDEDEEGEEFVLDYVEHPGHGCRSCHYHRRNTGDPDIMCSLCYMRTC

GMF VY SP V SEPEPEPEPEPEP ARPTRRPKM AP AILRRPT SP V SRECN S STD SCD SGP SNTPP

EIHPVVPLCPIKPVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP (SEQ ID NO: 32)

ALXCXE de E1A del Ad5

MRHIICHGGYITEEMAASLLDQLIEEVLADNLPPPSHFEPPTLHELYDLDYT APEDPNEE

AVSQIFPDSVMLAVQEGIDLLTFPPAPGSPEPPHLSRQPEQPEQRALGPVSMPNLVPEVID

AGFPPSDDEDEEGEEFVLDYVEHPGHGCRSCHYHRRNTGDPDIMCSLCYMRTCGMFVY

SP V SEPEPEPEPEPEP ARPTRRPKM AP AILRRPT SP V SRECN S S TD S CD S GP SNTPPEIHP V

VPLCPIKPVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP (SEQ ID NO: 33)

C124G de E1A del Ad5

MRHIICHGGVITEEM AASLLDQLIEEVL ADNLPPP SHFEPPTLHELYDLD VT APEDPNEE

AVSQIFPDSVMLAVQEGIDLLTFPPAPGSPEPPHLSRQPEQPEQRALGPVSMPNLVPEVID

LTGHEAGFPPSDDEDEEGEEFVLDYVEHPGHGCRSCHYHRRNTGDPDIMCSLCYMRTC

GMF VY SP V SEPEPEPEPEPEP ARPTRRPKM AP AILRRPT SPV SRECN S STD SCD SGP SNTPP

EIHPVVPLCPIKPVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP (SEQ ID NO: 34)

A2-11 de E1A del Ad5

MEEMAASLLDQLIEEVLADNLPPPSHFEPPTLHELYDLDVTAPEDPNEEAVSQIFPDSVM

L AV OEGIDLLTFPP APGSPEPPHL SROPEOPEORALGP V SMPNL VPE VIDLT CHE AGFPP S

DDEDEEGEEF VLD YVEHPGHGCRSCHYHRRNT GDPDIMC SLC YMRTCGMF VY SPV SEP

EPEPEPEPEPARPTRRPKMAP AILRRPT SPV SRECN S STD SCD SGP SNTPPEIHP VVPLCPIK

PVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP (SEQ ID NO: 35)

Y47H C124G de E1A del Ad5

MRHIICHGGVITEEM AASLLDQLIEEVL ADNLPPP SHFEPPTLHELHDLD VT APEDPNEE

AVSQIFPDSVMLAVQEGIDLLTFPPAPGSPEPPHLSRQPEQPEQRALGPVSMPNLVPEVID

LTGHEAGFPPSDDEDEEGEEFVLDYVEHPGHGCRSCHYHRRNTGDPDIMCSLCYMRTC

GMF VY SPV SEPEPEPEPEPEP ARPTRRPKMAP AILRRPT SPV SRECN S STD SCD SGP SNTPP

EIHPVVPLCPIKPVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP (SEQ ID NO: 36) A2-11 Y47H C124G de E1A del Ad5

MEEMAASLLDQLIEEVLADNLPPPSHFEPPTLHELHDLDVTAPEDPNEEAVSQIFPDSVM

L AY OEGIDLLTFPP APGSPEPPHL SROPEOPEORALGP V SMPNL YPE VIDLT GHE AGFPP S

DDEDEEGEEF VLD Y VEHPGHGCRSCHYHRRNT GDPDIMC SLC YMRTCGMF VY SP V SEP

EPEPEPEPEP ARPTRRPKMAP AILRRPTSP V SRECN S STDSCD SGPSNTPPEIHPVVPLCPIK

PVAVRVGGRRQAVECIEDLLNEPGQPLDLSCKRPRP (SEQ ID NO: 37)

E4orfl y E4orf6/7 del Ad5

El motivo de unión a PDZ en el extremo C-terminal de E4orf1 del Ad5 (residuos 126-128 de la SEQ ID NO: 38) está subrayado.

E4orfl del Ad5

MAAAVEAL YVVLEREGAILPRQEGF SGVYVFF SPINF VIPPMGAVMLSLRLRVCIPPGYF GRFLALTDVNQPDVFTESYIMTPDMTEELSVVLFNHGDQFFYGHAGMAVVRLMLIRVV FPVVROASNV (SEQ ID NO: 38)

E4orfl APDZb del Ad5

MAAAVEAL YVVLEREGAILPRQEGF SGVYVFF SPINF VIPPMGAVMLSLRLRVCIPPGYF GRFLALTDVNQPDVFTESYIMTPDMTEELSVVLFNHGDQFFYGHAGMAVVRLMLIRVV FPVVRQA (SEQ ID NO: 39)

E4orf6/7 del Ad5

MTTSGVPF GMTLRPTRSRLSRRTP Y SRDRLPPFETETRATILEDHPLLPECNTLTMHNAW

TSPSPPVKQPQVGQQPVAQQLDSDMNLSELPGEFINITDERLARQETVWNITPKNMSVT

HDMMLFKASRGERTVYSVCWEGGGRLNTRVL (SEQ ID NO: 40)

En la presente descripción se contemplan adenovirus recombinantes que tienen un genoma que codifica una proteína E4orf6/7 modificada que elimina o altera la unión a E2F, o elimina o altera la señal de localización nuclear. En algunos ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una eliminación de aproximadamente 60, aproximadamente 50, aproximadamente 40, aproximadamente 30, aproximadamente 20 o

aproximadamente 10 aminoácidos en el extremo C-terminal para eliminar/alterar el sitio de unión de E2F. En otros ejemplos, la proteína E4orf6/7 comprende una eliminación, un desplazamiento del marco de lectura o una inserción en los 10 aminoácidos C-terminales, o una eliminación de 33 aminoácidos del tercio C-terminal de la proteína que elimina o deteriora la unión a E2F. En algunos ejemplos, las mutaciones comprenden los aminoácidos 81-91 que alteran las interacciones de E2F.

En otros ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una eliminación N-terminal de 58 aminoácidos para abolir la secuencia de localización nuclear, que es requerida para la translocación eficiente de E2F4. Hay ocho residuos de arginina localizados entre los aminoácidos 13 y 38 de E4orf6/7 del Ad2 y del Ad5, lo que equivale a un contenido de arginina superior al 25 % para esta región. La agrupación global de residuos de arginina en el extremo N-terminal de E4orf6 se mantiene en otros serotipos de adenovirus. Se contemplan mutaciones que sustituyen los residuos de arginina 16, 18, 21, 22, 27 y/o 29 por alanina (u otros residuos apropiados para abolir la localización nuclear a través de esta región).

En otros ejemplos, la proteína E4orf6/7 modificada comprende una o más modificaciones para eliminar o inhibir la capacidad de E4orf6/7 para inducir la ocupación de doble sitio de E2F. Los ejemplos específicos no limitantes incluyen una mutación de F125 en prolina, alanina, lisina, ácido aspártico o ácido glutámico; o una mutación de D121 a P, A, K, R, G, F.

Otras mutaciones de E4orf6/7 incluyen: T133A, R101A, Q105P o cualquier mutación que previene la ocupación de sitio único de E2F; M84N o P, G, K, L, H y/o E93A, o K, P, G, R, L, M que interrumpen una hélice alfa y previenen la unión a E2F. Otras mutaciones contempladas incluyen T133Q o A, K, G, P, L, H; G141L, P, K H, F, A; o V149N, K, P, H, G, E, D.

Secuencias de fibras

En las secuencias de fibras recombinantes siguientes, la secuencia de FRB está subrayada. La mutación presente en FRB* se muestra en negrita.

Fibra del Ad5

MKRARPSEDTFNPVYPYDTETGPPTVPFLTPPFVSPNGFQESPPGVLSLRLSEPLVTSNG ML ALKMGN GL SLDE AGNLT S QN YTT V SPPLKKTK SNINLEIS APLT VT SE ALT Y A A A AP LMVAGNTLTMQSQAPLTVHDSKLSIATQGPLTVSEGKLALQTSGPLTTTDSSTLTITASP PLTT AT GSLGIDLKEPIYT QN GKLGLK Y GAPLH VTDDLNTLT V AT GPGVTFNÍNT SLQ TK VTGALGFDSQGNMQLNVAGGLRID SQNRRLILD V S YPFD AQNQLNLRLGQGPLFIN S AH NLDINYNKGL YLF T ASNN SKKLE VNL S T AKGLMFD AT AI AIN AGDGLEF GSPNAPNTNP LKTKIGHGLEFD SNKAMVPKLGT GLSFD STGAIT V GNKNNDKLTLWTTP AP SPNCRLNA EKDAKLTLVLTKCGSQILATVSVLAVKGSLAPISGTVQSAHLIIRFDENGVLLNNSFLDP E YWNFRN GDLTEGT A YTN A V GFMPNL S A YPKSHGKT AK SNIV S Q VYLN GDKTKP VTL TITLN GT QET GD TTP S A Y SM SF S WD W S GHN YFNEIF AT S S YTF S YIAQE (SEQ ID NO: 41)

Fibra FRB del Ad5

MKRARPSEDTFNPVYPYDTETGPPTVPFLTPPFVSPNGFQESPPGVLSLRLSEPLVTSNG ML ALKMGN GL SLDE AGNLT S QN VTT V SPPLKKTK SNINLEI S APLT VT SE ALT V A A A AP LMVAGNTLTMQ SQ APLT VHD SKL SI ATQGPLT V SEGKL ALQT SGPLTTTD S STLTIT ASP PLTTATGSLGIDLKEPIYTQNGKLGLKYGAPLHVTDDLNTLTVATGPGVTINNTSLQTK VTGALGFDSQGNMQLNVAGGLRIDSQNRRLLDVSYPFDAQNQLNLRLGQGPLFINSAH NLDINYNKGL YLF T ASNN SKKLE VNL S T AKGLMFD AT AI AIN AGDGLEF GSPNAPNTNP LKTKIGHGLEFD SNKAMVPKLGT GL SFD STGAIT V GNKNNDKLTLWTTP APSPNCRLNA EKDAKLTLVLTKCGSQILATVSVLAVKGSLAPISGTVQSAHLIIRFDENGVLLNNSFLDP EYWNFRNGDLTEGTAYTNAVGFMPNLSAYPKSHGKTAKSNIVSQVYLNGDKTKPVTL TITLNGTOETGDTTEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPOTLKET SFN O A Y GRDLME AOEW CRK YMK S GNVKDLT O AWDL YYHVFRRISKOP S A Y SMSF S W DWSGHNYINEIFATSSYTFSYIAQE (SEQ ID NO: 42)

Fibra FRB* del Ad5

MKRARP SEDTFNP VYP YDTETGPPT VPFLTPPF V SPNGF QE SPPGVLSLRL SEPLVT SNG ML ALKMGN GL SLDE AGNLT S QN VTT V SPPLKKTK SNINLEIS APLT VT SE ALT V A A A AP LMVAGNTLTMQSQAPLTVHDSKLSIATQGPLTVSEGKLALQTSGPLTTTDSSTLTITASP PLTTATGSLGIDLKEPIYTQNGKLGLKYGAPLHVTDDLNTLTVATGPGVTINNTSLQTK VTGALGFDSQGNMQLNVAGGLRIDSQNRRLILDVSYPFDAQNQLNLRLGQGPLFINSAH NLDINYNKGL YLF T ASNN SKKLE VNL S T AKGLMFD AT AI AIN AGDGLEF GSPNAPNTNP LKTKIGHGLEFD SNKAMVPKLGT GLSFD STGAIT V GNKNNDKLTLWTTP AP SPNCRLNA EKD AKLTL VLTKC GS QIL AT V S VL A VKGSL API S GT V Q S AHLIIRFDEN GVLLNN SFLDP EYWNFRNGDLTEGTAYTNAVGFMPNLSAYPKSHGKTAKSNIVSQVYLNGDKTKPVTL TITLNGTOETGDTTEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPOTLKET SFNO AY GRDLME AOEW CRKYMKSGNVKDLLO AWDL YYHVFRRISKOPS AY SMSF SW DWSGHNYINEIFATSSYTFSYIAQE (SEQ ID NO: 43)

Secuencias de ligandos de direccionamiento

EGFRVHH-GS-FKBP

MAVQLVESGGGSVQAGGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSG1SWRGD

STGYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLRPEDTAIYYCAAAAGSTWYGTLYEYDY

WGOGTOVTVSSGSGSGSTGYOYETISPGDGRTFPKRGOTCYYHYTGMLEDGKKFDSSR

PRNKPFKFMLGKOEVIRGWEEGVAOMSVGORAKLT1SPPYAYGATGHPG1IPPHATLVF

DYELLKL (SEQ 10 NO: 44, La secuencia de FKBP12 está subrayada)

Secuencias de hexona

Hexona del Ad5

MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTT DRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYS GTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPY SGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCY GSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVD IETPD THIS YMPTIKEGN SRELMGQQ SMPNRPN YIAFRDNFIGLMYYN S T GNMGVL AGQ ASOT NAVVni QDRNTF1SYQ1JI DSTGDRTRYFSMWNOAVDSYDPDVRTTENHGTEDE LPNY CFPLGGVINTETLTKVKPKT GQEN GWEKD ATEF SDKNEIRV GNNF AMEINLNANL WRNFL Y SNI AL YLPDKLK Y SP SNVKISDNPNT YD YMNKR V VAPGL VDC YINLGARW SL DYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWN

FRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQS

FND YL S A ANML YPIP ANATNVPISIP SRNW A AFRGW AF TRLKTKETP SLGS GYDP Y YT Y

SGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCN

MTKDWFL VQML ANYNIGY QGF YIPE S YKDRMY SFFRNF QPMSRQ VVDDTKYKD Y QQ

VGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPF

SSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPH

RGVIETVYLRTPFSAGNATT (SEQ ID NO: 45)

E451Q de la hexona del Ad5

MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTI

DRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYS

GTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPY

SG1NITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINEIAAGRVIKKTTPMKPCY

GS Y AKPTNENGGQGIL VKQQNGK LE SQ VEMQFFSTTE AT AGNGDNLTPK V VLY SED VD

IETPDTHISYMPT1K.EGNSRELMGQQSMPMRPNY1AFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQ

ASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDS1GDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDE

LPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNQIRVGNNFAMEINLNAN

lwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrwapglvdcyinlgarws ldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyew

NFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQ

SFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYT

ysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqc

NMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQ

QVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIP

fssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrp 1IRGVIETVYLRTPFSAGNATT (SEQ ÍD NO 46; La sustitución E451Q se muestra en negrita subrayada)

Secuencias E3

E3-RIDa del Ad5

MIPRVFILLTL VALFC AC STLAAV SHIEVDCIPAFTVYLLY GF VTLTLIC SLIT VVIAFIQCI DWVCVRFAYLRHHPQYRDRTIAELLRIL (SEQ ID NO: 65)

E3-RIDp del Ad5

MKFTVTFLLIICTLSAFCSPTSKPQRHISCRFTRIWNIPSCYNEKSDLSEAWLYAIISVMVF

CSTILALAIYPYLDIGWNAIDAMNHPTFPAPAMLPLQQVVAGGFVPANQPRPPSPTPTEIS

YFNLTGGDD (SEQ ID NO: 66)

E3-14.7k del Ad5

MTDTLDLEMDGIITEQRLLERRRAAAEQQRMNQELQDMVNLHQCKRGIFCLVKQAKV

TYDSNTTGHRLSYKLPTKRQKLVVMVGEKPITITQHSVETEGCIHSPCQGPEDLCTLIKT

LCGLKDLIPFN (SEQ ID NO: 67)

V. Composiciones farmacéuticas

En la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden un adenovirus recombinante (o uno o más ácidos nucleicos o vectores que codifican los adenovirus recombinantes). Las composiciones son, opcionalmente, adecuadas para formulación y administración in vitro o in vivo. Opcionalmente, las composiciones comprenden uno o más de los agentes proporcionados y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición, Loyd V. Allen y otros, editores, Pharmaceutical Press (2012). Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen materiales que no son biológicamente o de otro modo indeseables, es decir, el material se administra a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. Si se administra a un sujeto, el vehículo se selecciona opcionalmente para minimizar la degradación del ingrediente activo y minimizar los efectos secundarios adversos en el sujeto.

Los virus recombinantes (o uno o más ácidos nucleicos o vectores que codifican los adenovirus recombinantes) se administran de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, intratumoral o inhalatoria. La administración puede ser local o sistémica. Las composiciones se pueden administrar mediante cualquiera de varias vías de administración, que incluyen tópica, oral, parenteral, intravenosa, intraarticular, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria, transdérmica, intrahepática, intracraneal, nebulización/inhalación o por instalación mediante broncoscopía. Por tanto, las composiciones se administran de varias formas en dependencia de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar.

En algunos ejemplos, las composiciones para la administración incluirán un adenovirus recombinante (o genoma recombinante) como se describe en la presente descripción disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materias indeseables. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración del agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente basado en los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto.

Las formulaciones farmacéuticas, particularmente, de los virus recombinantes se pueden preparar mediante la mezcla de los adenovirus recombinantes (o uno o más ácidos nucleicos que codifican los adenovirus recombinantes) que tienen el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales. Tales formulaciones pueden ser formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones usadas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables pueden ser acetato, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico) conservantes, polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como seroalbúmina o gelatina, o polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; y aminoácidos, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes; y tensioactivos iónicos y no iónicos (por ejemplo, polisorbato); contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos. Los adenovirus recombinantes (o uno o más ácidos nucleicos que codifican los adenovirus recombinantes) se puede formular en cualquier concentración de unidades infecciosas apropiada.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva de los adenovirus recombinantes suspendidos en diluyentes, tales como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sobres o tabletas, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de tabletas pueden incluir una o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, celulosa microcristalina, gelatina, dióxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, rellenos, aglutinantes, diluyentes, agentes tamponadores, agentes humectantes, conservantes, agentes saborizantes, colorantes, agentes desintegrantes y vehículos farmacéuticamente compatibles. Las formas de pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, por ejemplo, sacarosa, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tales como gelatina y glicerina o emulsiones, geles y similares de sacarosa y acacia que contienen, además del ingrediente activo, vehículos conocidos en la técnica.

Los adenovirus recombinantes (o uno o más ácidos nucleicos que codifican los adenovirus recombinantes), solo o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden preparar en formulaciones de aerosol (es decir, se pueden "nebulizar") para ser administrados mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones inyectables isotónicas estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. En los métodos proporcionados, las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, por vía oral, tópica, intraperitoneal, intravesical intratumoral o intratecal. La administración parenteral, la administración intratumoral y la administración intravenosa son los métodos de administración preferidos. Las formulaciones de compuestos se pueden presentar en contenedores sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales.

Las soluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito previamente. Las células transducidas o infectadas por adenovirus o transfectadas con ácidos nucleicos para terapia ex vivo también pueden administrarse por vía intravenosa o parenteral como se describió anteriormente.

La preparación farmacéutica está preferiblemente en forma de dosificación unitaria. En tal forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. Por tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria en dependencia del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, tabletas, píldoras, cápsulas y pastillas.

En algunos ejemplos, las composiciones incluyen al menos dos adenovirus recombinantes diferentes, tales como adenovirus recombinantes que se unen a diferentes receptores celulares. Por ejemplo, al menos uno de los adenovirus recombinantes en la composición podría expresar una proteína de fibra quimérica. Alternativamente, los adenovirus recombinantes podrían dirigirse a diferentes receptores celulares al codificar proteínas de fusión ligando de direccionamiento-FKBP en las que el ligando de direccionamiento difiere entre los virus en la composición. En algunos ejemplos, la composición incluye dos, tres, cuatro, cinco o seis adenovirus recombinantes diferentes.

VI. Métodos de tratamiento

Las composiciones de adenovirus recombinantes descritas en la presente descripción se pueden administrar para tratamiento terapéutico o profiláctico. En particular, se proporcionan métodos para inhibir la viabilidad de las células tumorales en un sujeto, inhibir la progresión del tumor en un sujeto, reducir el volumen tumoral en un sujeto y/o tratar el cáncer en un sujeto. Los métodos incluyen administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante (o composición del mismo) al sujeto. Como se describe en todo el documento, el adenovirus o la composición farmacéutica se administra de diversas formas que incluyen, pero no se limitan a, por vía intravenosa, intravascular, intratecal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal u oral. Opcionalmente, el método comprende además administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos ejemplos, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico. En otros ejemplos, el agente terapéutico es un inmunomodulador. En otros ejemplos más, el agente terapéutico es un inhibidor de CDK, tal como un inhibidor de CDK 4.

En algunos ejemplos, el cáncer o tumor es un cáncer o tumor de pulmón, próstata, colorrectal, mama, tiroides, riñón o hígado, o es un tipo de leucemia. En algunos casos, el cáncer es metastásico. En algunos ejemplos, el tumor es un tumor de la glándula mamaria, pituitaria, tiroidea o prostática; un tumor del cerebro, hígado, meninges, hueso, ovario, útero o cuello uterino; leucemia monocítica o mielógena; adenocarcinoma, adenoma, astrocitoma, tumor de vejiga, tumor cerebral, linfoma de Burkitt, carcinoma de mama, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma de riñón, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, carcinoma de recto, carcinoma de piel, carcinoma de estómago, carcinoma de testículo, carcinoma de tiroides, condrosarcoma, coriocarcinoma, fibroma, fibrosarcoma, glioblastoma, glioma, hepatoma, histiocitoma, leiomioblastoma, leiomiosarcoma, linfoma, célula de liposarcoma, tumor mamario, meduloblastoma, mieloma, plasmacitoma, neuroblastoma, neuroglioma, sarcoma osteogénico, tumor de páncreas, tumor pituitario, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, tumor testicular, timoma o tumor de Wilms. Los tumores incluyen tumores sólidos primarios y metastásicos, que incluyen carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (que incluyen riñón, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (que incluyen cuello uterino, útero y ovarios, así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (que incluyen próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de células germinales), glándulas endocrinas (que incluyen glándulas tiroides, suprarrenales y pituitarias) y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (que incluyen los que surgen de huesos y tejidos blandos, así como el sarcoma de Kaposi) y tumores del cerebro, nervios, ojos y meninges (que incluyen astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas y meningiomas). Se pueden tratar los tumores sólidos que surgen de neoplasias malignas hematopoyéticas tales como leucemias (es decir, cloromas, plasmacitomas y las placas y tumores de micosis fungoide y linfoma/leucemia cutánea de células T), así como en el tratamiento de linfomas (tanto linfomas de Hodgkin como de no Hodgkin). Además, los tratamientos pueden ser útiles en la prevención de metástasis de los tumores descritos en la presente descripción.

En aplicaciones terapéuticas, los adenovirus recombinantes o composiciones de los mismos se administran a un sujeto en una cantidad o dosis terapéuticamente efectiva. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Pueden administrarse administraciones únicas o múltiples de las composiciones en dependencia de la dosis y frecuencia según lo requiera y tolere el paciente. Un "paciente" o "sujeto" incluye tanto a seres humanos como a otros animales, particularmente mamíferos. Por tanto, los métodos son aplicables tanto a la terapia humana como a las aplicaciones veterinarias.

La cantidad efectiva de un adenovirus que tiene una secuencia modificada se determina de forma individual y se basa, al menos en parte, en el adenovirus recombinante particular usado; el tamaño, la edad, el sexo del individuo; y el tamaño y otras características de las células en proliferación. Por ejemplo, para el tratamiento de un ser humano, al menos 103 unidades formadoras de placa (PFU) de un virus recombinante se usa, tal como al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109, al menos 1010, al menos 1011 o al menos 1012 PFU, por ejemplo aproximadamente de 103 a 1012 PFU de un virus recombinante se usa, en dependencia del tipo, tamaño y número de células en proliferación o neoplasias presentes. La cantidad efectiva puede ser de aproximadamente 1,0 pfu/kg de peso corporal a aproximadamente 1015 pfu/kg de peso corporal (por ejemplo, de aproximadamente 102 pfu/kg de peso corporal a aproximadamente 1013 pfu/kg de peso corporal). Un adenovirus recombinante se administra en una dosis única o en múltiples dosis (por ejemplo, dos, tres, cuatro, seis o más dosis). Se pueden administrar múltiples dosis de forma simultánea o consecutiva (por ejemplo, durante un período de días o semanas).

En algunos ejemplos, los métodos proporcionados incluyen administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente anticancerígeno u otro tratamiento terapéutico (tal como la resección quirúrgica del tumor). Los agentes anticancerígenos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, tales como, por ejemplo, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes de supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas (por ejemplo, anti-andrógenos), agentes anti-angiogénesis e inhibidores de CDK. Otros tratamientos anticancerígenos incluyen la radioterapia y otros anticuerpos que se dirigen específicamente a las células cancerosas.

Los ejemplos no limitantes de agentes alquilantes incluyen mostazas nitrogenadas (tales como mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, mostaza uracilo o clorambucilo), alquilsulfonatos (tales como busulfán), nitrosoureas (tales como carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina o dacarbazina).

Los ejemplos no limitantes de antimetabolitos incluyen análogos de ácido fólico (tales como metotrexato), análogos de pirimidina (tales como 5-FU o citarabina) y análogos de purina, tales como mercaptopurina o tioguanina.

Los ejemplos no limitantes de productos naturales incluyen alcaloides de la vinca (tales como vinblastina, vincristina o vindesina), epipodofilotoxinas (tales como etopósido o tenipósido), antibióticos (tales como dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina o mitomicina C) y enzimas (tales como L-asparaginasa).

Los ejemplos no limitantes de agentes diversos incluyen complejos de coordinación de platino (tales como cisdiamina-dicloroplatino II también conocido como cisplatino), ureas sustituidas (tales como hidroxiurea), derivados de metilhidrazina (tales como procarbazina) y supresores adrenocróticos (tales como mitotano y aminoglutetimida). Los ejemplos no limitantes de hormonas y antagonistas incluyen adrenocorticosteroides (tales como prednisona), progestinas (tales como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol), estrógenos (tales como dietilestilbestrol y etinilestradiol), antiestrógenos (tales como tamoxifeno) y andrógenos (tales como propionato de testosterona y fluoximesterona).

Los ejemplos de los fármacos de quimioterapia más comúnmente usados incluyen Adriamicina, Alkeran, Ara-C, BiCNU, Busulfán, CCNU, Carboplatino, Cisplatino, Citoxano, Daunorrubicina, DTIC, 5-FU, Fludarabina, Hidrea, Idarrubicina, Ifosfamida, Metotrexato, Mitramicina, Mitomicina, Mitoxantrona, Mostaza nitrogenada, Taxol (u otros taxanos, tales como docetaxel), Velban, Vincristina, VP-16, mientras que algunos fármacos más nuevos incluyen Gemcitabina (Gemzar), Herceptina, Irinotecán (Camptosar, CPT-11), Leustatina, Navelbina, Rituxán STI-571, Taxotere, Topotecán (Hycamtin), Xeloda (Capecitabina), Zevelin y calcitriol.

Los ejemplos no limitantes de inmunomoduladores que pueden usarse incluyen AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimina (Upjohn), interferón gamma (Genentech), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; Instituto de Genética), IL-2 (Cetus o Hoffman-LaRoche), inmunoglobulina humana (Cutter Biological), IMREG (de Imreg de Nueva Orleans, Luisiana), SK&F 106528 y TNF (factor de necrosis tumoral; Genentech).

Otro tratamiento común para algunos tipos de cáncer es el tratamiento quirúrgico, por ejemplo, la resección quirúrgica del cáncer o una parte del mismo. Otro ejemplo de tratamiento es la radioterapia, por ejemplo, la administración de material o energía radiactiva (tal como la terapia de haz externo) al sitio del tumor para ayudar a erradicar el tumor o reducir su tamaño antes de la resección quirúrgica.

Los inhibidores de CDK (cinasa dependiente de ciclina) son agentes que inhiben la función de las CDK. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de CDK para su uso en los métodos proporcionados incluyen AG-024322, AT7519, AZD5438, flavopiridol, indisulam, P1446A-05, PD-0332991 y P276-00 (ver por ejemplo, Lapenna y otros, Nature Reviews, 8:547-566, 2009). Otros inhibidores de CDK incluyen LY2835219, Palbociclib, LEE011 (Novartis), inhibidor de pan-CDK AT7519, seliciclib, CYC065, butirolactona I, himenialdisina, SU9516, CINK4, PD0183812 o fascaplisina.

En algunos ejemplos, el inhibidor de CDK es un inhibidor de amplio intervalo (tal como flavopiridol, olomucina, roscovitina, kenpaulona, SNS-032, AT7519, AG-024322, (S)-Roscovitina o R547). En otros ejemplos, el inhibidor de CDK es un inhibidor específico (tal como fascaplisina, riuvidina, purvalanol A, NU2058, BML-259, SU 9516, PD0332991 o P-276-00).

La elección del agente y la dosis puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica basado en la enfermedad dada que se trata. Las combinaciones de agentes o composiciones se pueden administrar ya sea de forma concomitante (por ejemplo, tal como una mezcla), por separado pero simultáneamente (por ejemplo, a través de líneas intravenosas separadas) o secuencialmente (por ejemplo, un agente se administra primero seguido por la administración del segundo agente). Por tanto, el término combinación se usa para referirse a la administración concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes o composiciones.

De acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, al sujeto se le administra una cantidad efectiva de uno o más de los agentes proporcionados en la presente descripción. La cantidad efectiva se define como cualquier cantidad necesaria para producir una respuesta fisiológica deseada (por ejemplo, muerte de una célula cancerosa). Los agentes terapéuticos se administran típicamente a la dosis inicial de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg diariamente. Se puede usar un intervalo de dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Sin embargo, las dosis pueden variar en dependencia de los requisitos del sujeto, la gravedad de la afección que se trata y el compuesto que se emplea. Por ejemplo, las dosis se pueden determinar empíricamente al considerar el tipo y la etapa del cáncer diagnosticado en un sujeto particular. La dosis administrada a un sujeto, en el contexto de los métodos proporcionados, debería ser suficiente para afectar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. La determinación de la dosis adecuada para una situación particular está dentro de la habilidad del médico. Por tanto, un experto en la técnica puede determinar empíricamente cantidades y programas efectivos para administrar el agente. La dosis no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos sustanciales, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en caso de contraindicaciones. Se puede encontrar orientación en la literatura para las dosis apropiadas para determinadas clases de productos farmacéuticos.

En la presente descripción se proporciona un método para inhibir la viabilidad de las células tumorales al poner en contacto la célula tumoral con un adenovirus recombinante, o una composición del mismo, como se describe en la presente descripción. En algunos ejemplos, el método es un método in vitro. En otros ejemplos, el método es un método in vivo y poner en contacto la célula tumoral comprende administrar el adenovirus recombinante o la composición a un sujeto con un tumor.

Se proporciona además un método para inhibir la progresión del tumor o reducir el volumen tumoral en un sujeto, mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante (o composición del mismo) descrito en la presente descripción.

También se proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto, al administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante (o composición del mismo) descrito en la presente descripción.

Se proporciona además un método para reducir el volumen tumoral en un sujeto al administrar al sujeto (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante redireccionado inducible por rapamicina/rapalog; y (ii) rapamicina o un análogo de la misma. También se proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto al administrar al sujeto (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante redireccionado inducible por rapamicina/rapalog; y (ii) rapamicina o un análogo de la misma.

En algunos ejemplos, la rapamicina o el análogo de rapamicina se administra a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2,0 mg/kg. En otros ejemplos, la rapamicina se administra a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg. En algunos ejemplos, la rapamicina se administra a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg o 2,0 mg/kg.

En algunos ejemplos, la rapamicina o el análogo de rapamicina se administra a una dosis de aproximadamente 1 a 15 mg/m2, tal como aproximadamente de 3 a 12 mg/m2, o aproximadamente de 5 a 10 mg/m2 En algunos ejemplos, la rapamicina o el análogo de rapamicina se administra a una dosis de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14 o aproximadamente 15 mg/m2.

En algunos ejemplos, la rapamicina o el análogo de rapamicina se administra a una dosis que no causa inmunosupresión sustancial en el sujeto. La administración de rapamicina o un análogo de la misma "a una dosis que no causa inmunosupresión sustancial" se refiere a la dosis que es menor o equivalente a la concentración efectiva 25 (EC²⁵) para un sujeto particular. Un experto en la técnica es capaz de determinar una dosis de rapamicina o un análogo de la misma que no causa inmunosupresión sustancial en un sujeto (ver, por ejemplo, Schubert y otros, Am J Transplant 4:767-773, 2004). En algunos ejemplos, la EC²⁵es de aproximadamente 1 ng/mL a aproximadamente 15 ng/mL, tal como de aproximadamente 3 ng/mL a aproximadamente 10 ng/mL. En ejemplos no limitantes, la EC²⁵es aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2 ng/mL, aproximadamente 3 ng/mL, aproximadamente 4 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 6 ng/mL, aproximadamente 7 ng/mL, aproximadamente 8 ng/mL, aproximadamente 9 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 11 ng/mL, aproximadamente 12 ng/mL, aproximadamente 13 ng/mL, aproximadamente 14 ng/mL o aproximadamente 15 ng/mL.

En algunos ejemplos, el genoma del adenovirus redireccionado codifica un ligando de direccionamiento fusionado a una FKBP, y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína de unión a FKBP-rapamicina de tipo salvaje (FRB) o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L. En algunos ejemplos, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo de dominio único específico para EGFR. En ejemplos no limitantes particulares, el genoma del adenovirus recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de AdSyn-CO335 (SEQ ID NO: 30), AdSyn-C0335B-K (SEQ ID NO: 92) o AdSyn-C0335B-TK (SEQ ID NO: NO: 97).

En algunos ejemplos de los métodos, el tumor o cáncer se caracteriza por la desregulación de la vía de E2F. En algunos ejemplos, el tumor o cáncer es un tumor o cáncer de pulmón, próstata, colorrectal, mama, tiroides, renal o hepático, o una leucemia.

En algunos ejemplos, los métodos incluyen además tratar al sujeto con un agente terapéutico adicional, tal como un agente quimioterapéutico, un inmunomodulador o un inhibidor de CDK, por ejemplo un inhibidor de CDK4.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas características y/o modalidades particulares. No se debe interpretar que estos ejemplos limitan la descripción a las características o modalidades particulares descritas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Adenovirus oncolíticos que se replican selectivamente en células tumorales con actividad E2F desregulada

Los adenovirus modificados se fabricaron con los componentes a los que se hace referencia a continuación, de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación PCT No. WO 2012/024351. Se emplearon vectores de entrada pDONR. A partir del ADN del Ad5 humano, se obtuvo el módulo E1 mediante PCR y se insertó en el vector pDONR P1P4 mediante el uso de SLIC. El esqueleto del vector pDONR P1P4, que incluye los sitios de recombinación attL1 y attL4, se amplificó mediante el uso de PCR y se combinó con el módulo E1 del Ad5 mediante SLIC. El módulo E3 se obtuvo mediante PCR para generar un producto flanqueado por los sitios de recombinación attB5 y attB3r. El producto se insertó en el vector pDONR P5P3r mediante la reacción de entrada BP. El módulo E4 se obtuvo mediante PCR para generar un producto flanqueado por los sitios de recombinación attB3 y attB2. El producto se insertó en el vector pDONR P3P2 mediante la reacción de entrada BP. El fragmento attR5-ccdB-Cm(r)-attR2 del vector pDONR P5P2 se amplificó mediante PCR y se insertó en el vector Adsembly DEST (ver "MultiSite Gateway® Pro Plus", No. de cat. 12537-100; y Sone y otros, J Biotechnol 136(3-4): 113-121, 2008). El método Adsembly se describe en la Publicación PCT No. WO 2012/024351.

La estructura del vector para el vector Adsembly DEST se compone de partes de tres fuentes diferentes. El casete Amp(r) y el gen lacZ se amplificaron a partir del plásmido pUC19. Esto se combinó con el origen de replicación p15A, obtenido del plásmido pSB3K5-I52002, parte de la distribución de partes de BioBricksiGEM 2007. El p15A ori, que mantiene los plásmidos en un número de copias más bajo (10-12), es necesario para reducir la toxicidad de E1. Por último, con el fin de crear un virus autoescindible, se amplificó por PCR el casete de expresión en mamíferos para la enzima ISceI a partir del plásmido pAdZ5-CV5-E3+. Este casete se clonó en la estructura del vector para crear el vector llamado p15A-SceI. Este es el vector usado para iniciar el ensamblaje del genoma. Todos los módulos de genes se obtuvieron a partir del ADN purificado del virus Ad5 de tipo salvaje o del plásmido pAd/CMV/V5/DEST (Invitrogen).

Con respecto al vector DEST para el Ad5 humano, los módulos E2 y L3 se insertaron en el plásmido p15A-SceI mediante SLIC de 3 fragmentos. El marcador de contraselección que expresa ccdB y Chlor(r) flanqueado por los sitios attR5 y attR2 se obtuvo mediante PCR a partir del plásmido pDONR P5P2. El segundo marcador de contraselección se obtuvo mediante PCR a partir del vector pDONR P1P4. Los dos marcadores de contraselección se insertaron en los lados derecho e izquierdo de p15A-SceI E2-L4 mediante SLIC después de cortar con enzimas de restricción únicas diseñadas en los extremos de los módulos E2 y L4 para crear el vector DEST.

Con respecto al casete Amp(r): plásmido pUC19, el p15A ori: plásmido pSB3K5-I52002 fue parte de la distribución de partes de BioBricksiGEM 2007. Con respecto a los módulos de genes adenovirales, el ADN se purificó a partir de partículas del Ad5 o el plásmido pAd/CMV/V5/DEST (Invitrogen). Los vectores DONR pDONR P¹P⁴, P5P2, P5P3R, P3P2 se obtuvieron de Invitrogen.

Todos los ensayos de PCR se realizaron mediante el uso de la enzima Phusion (NEB). Los ensayos de PCR para obtener los módulos de GENES ADENOVIRALES del Ad5 se realizaron con tampón HF 1x, cada dNTP a 200 pM, cada cebador a 0,5 pM y 10 ng de molde. Para el módulo E2-L2, también se añadió DMSO al 3 %. El molde fue el plásmido pAd/PL-DEST (Invitrogen; para los módulos E2-L2, L3-L4 y E4) o ADN genómico del Ad5 (para los módulos E1 y E3). Las condiciones de PCR fueron las siguientes:

E2-L2 y L3-L4: 98 °C 30 segundos - 10 ciclos de 98 °C 10 segundos, 65 °C 30 segundos (disminuir la temperatura 1 °C cada 2 ciclos), 72 °C 7 minutos - 29 ciclos de 98 °C 10 segundos, 60 °C 30 segundos, 72 °C 8 minutos - 72 °C 10 minutos - mantener a 4 °C.

E3: 98 °C 30 segundos -10 ciclos de 98 °C 10 segundos, 70 °C 30 segundos (disminuir la temperatura 0,5 °C cada ciclo), 72 °C 2 minutos 30 segundos - 25 ciclos de 98 °C 10 segundos, 68 °C 30 segundos, 72 °C 2 minutos 30 segundos - 72 °C 10 minutos - mantener a 4 °C.

E4: 98 °C 30 segundos - 6 ciclos de 98 °C 10 segundos, 63 °C 30 segundos (disminuir la temperatura 0,5 °C cada ciclo), 72 °C 2 minutos - 29 ciclos de 98 °C 10 segundos, 60 °C 30 segundos, 72 °C 2 minutos - 72 °C 5 minutos - mantener a 4 °C.

Para obtener ADN genómico viral a partir del virus purificado, se añadieron hasta 100 pL del virus purificado a 300 pL de tampón de lisis que contenía Tris 10 mM pH 8, EDTA 5 mM, NaCl 200 mM y SdS al 0,2 %. La mezcla se incubó a 60 °C durante 5 min, seguido de la adición de 5 pL de solución madre de proteinasa K (~ 20 mg/mL) y se incubó además a 60 °C durante 1 hora. A continuación, las muestras se colocaron en hielo durante 5 min, seguido de un centrifugado a 15 K x g durante 15 min. Se eliminó el sobrenadante y se añadió a un volumen igual de isopropanol, se mezcló bien y se centrifugó a 15 K x g durante 15 min a 4 °C. El sedimento se lavó con etanol al 70 % y se volvió a centrifugar durante 15 min a 4 °C. El sedimento se secó y se resuspendió para su uso.

Con respecto a SLIC, los fragmentos lineales se trataron con exonucleasa durante 20 min a temperatura ambiente en la siguiente reacción de 20 pl: Tris 50 mM pH8, MgCh 10 mM, BSA 50 pg/mL, urea 200 mM, DTT 5 mM y 0,5 pL de ADN polimerasa de T4. La reacción se detuvo mediante la adición de 1 pL de EDTA 0,5 M, seguido de incubación a 75 °C durante 20 min. A continuación, se mezcló una cantidad igual de ADN tratados con T4 hasta aproximadamente 20 pL de volumen en un tubo nuevo. Para el SLIC que combina 2 fragmentos, se usaron 10 pL de cada reacción. Para el SLIC que combina 3 fragmentos, se usaron 7 pL de cada reacción. Los fragmentos se hibridaron mediante calentamiento a 65 °C durante 10 min, seguido de un enfriamiento lento que disminuyó la temperatura 0,5 °C cada 5 segundos hasta 25 °C. Después de la hibridación, se transformaron 5 pL de la reacción y se seleccionaron los clones.

Con respecto a AdSlicR, se realizó una reacción SLIC de 3 fragmentos mediante el uso de 100 ng de p15A-SceI tratado con T4 (linealizado mediante PCR) y 300 ng de cada uno de los módulos E2 y L3 (obtenidos mediante PCR a partir de sus respectivos vectores de entrada). Este vector creado p15A-SceI E2-L4. Se cortaron cinco pg de p15A-SceI E2-L4 con SwaI y se purificaron en gel mediante el uso de Qiagen QiaexIl. Los módulos E3 y E4 se obtuvieron mediante PCR a partir de sus respectivos vectores de entrada. Cada uno de los vectores linealizados (450 ng) y los productos de PCR (200 ng) se trataron con ADN polimerasa de T4 y se realizó SLIC como de costumbre, mediante el uso de 150-200 ng del vector y ~100 ng de cada módulo de PCR. Después del aislamiento de los clones positivos, se cortaron 5 pg del nuevo vector con PacI y se purificaron en gel, luego se combinaron con un producto de PCR E1 (100 ng de tratado con T4) en una nueva reacción SLIC. Esto completó el ensamblaje del genoma y el plásmido estuvo listo para la transfección para reconstituir el virus.

Para construir las regiones mutantes E1 y E4, se llevó a cabo la manipulación en los vectores de entrada del módulo individual. El módulo E1 con la estructura del vector se amplificó por PCR con cebadores para generar un producto que carecía de la secuencia LTCHE (residuos 122-126 de la SEQ ID NO: 32), luego se circularizó mediante el uso de SLIC para generar pENTR-E1-E1A-ALXCXE.

Alternativamente, el módulo E1 con la estructura del vector se amplificó por PCR con cebadores para generar productos con cambios de codón en E1A para mutar Y47 a H, C124 a G, o para eliminar los residuos 2-11 para generar pENTR-E1-E1A-Y47H, pENTR-E1-E1A-C124G o pENTR-E1-E1A-A2-11, respectivamente. Estos productos se usaron como molde para mutaciones adicionales por PCR para generar combinaciones de estas mutaciones: pENTR-E1-E1A-Y47H-C124G y pENTR-E1-E1A-Y47H-C124G-A2-11. El módulo E4 con la estructura del vector se amplificó por PCR con cebadores para generar un producto que carecía de la secuencia del exón específica de E4orf6/7 (297 pb) corriente abajo del codón de terminación de E4orf6 para generar pENTR-E4-AE4orf6/7. Este producto también se usó como molde para PCR con cebadores para generar productos que carecían del motivo de unión a PDZ de E4orf1 o de la secuencia completa de E4orf1 (pENTR-E4-AE4orf6/7-E4orf1APDZb y pENTR-E4-AE4orf6/7-AE4orf1, respectivamente).

Para generar genomas de virus completos que portan las mutaciones, se realizó AdSlicR mediante el uso de p15A-SceI E2-L4 en combinación con el módulo E3 de tipo salvaje y el módulo E4 de tipo salvaje o un módulo E4 mutante, luego con el E1 de tipo salvaje o el E1 mutante. Los adenovirus de AdSlicR de tipo salvaje se designan en la Tabla 1 que se muestra a continuación.

Tabla 1. Adenovirus con modificaciones en E1 y E4

Con respecto a la producción, concentración y purificación del virus, se infectaron células 293 E4 con partículas infecciosas, y aproximadamente 48 horas después de la infección cuando el CPE fue evidente, las células se recolectaron y aislaron mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Las células se lisaron en tampón TMN (TrisCl 10 mM, pH 7,5, MgCh 1 mM, NaCl 150 mM) mediante congelación/descongelación 3x, y los restos celulares se eliminaron mediante dos rondas de centrifugación a 3000 x g y 3500 x g durante 15 minutos. Se usó un gradiente de cloruro de cesio (0,5 g/mL) para agrupar las partículas virales mediante ultracentrifugación a 37000 x g durante 18-24 horas. La banda se recolectó y se dializó en un casete de diálisis Slide-A-Lyzer® de 10.000 MWCO (Thermo Scientific) en TMN con glicerol al 10 % durante la noche (12-18 h) a 4 °C, luego se almacenó a -80 °C. El título del virus purificado se determinó frente a un estándar de tipo salvaje titulado mediante un ELISA de infección por dilución en serie basado en células con anticuerpo primario anti-adenovirus tipo 5 (ab6982, Abcam) y anticuerpo secundario de fosfatasa alcalina anti-conejo ImmunoPure (Thermo Scientific).

Para evaluar la expresión de las proteínas de los adenovirus durante la infección de células epiteliales primarias humanas pequeñas de las vías respiratorias (SAEC), se infectaron SAEC quiescentes en placas de 12 pocillos con adenovirus con MOI 30 y el medio se reemplazó en las células 4 horas después de la infección. A las 24, 36 y 48 horas después de la infección, las células se lavaron con PBS frío, se recolectaron en 500 pL de PBS frío, se sedimentaron a 5000 rpm durante 5 min a 4 °C, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C. Los sedimentos celulares se lisaron en tampón RIPA (Tris 100 mM pH 7,4, NaCl 300 mM, EDTA 2 mM, Triton X al 2 %, desoxicolato al 2 %, NaF 2 mM, NavO⁴0,2 mM, DTT 2 mM) durante 1 hora a 4 °C, incluida la sonicación en un sonicador de copa (pulsos de 2 x 60 s a una amplitud de 60 a 4 °C). Los restos celulares se sedimentaron mediante centrifugación a 13000 rpm durante 20 min a 4 °C. La concentración de proteínas se determinó mediante el uso del Ensayo de proteínas DC™ de Bio-Rad y se normalizaron las concentraciones de proteínas de las muestras. La electroforesis en gel se realizó mediante el uso de geles Life Technologies Novex® NuPAGE® SDS-PAGE, según el protocolo del fabricante. Las proteínas se detectaron mediante Transferencia Western. Los anticuerpos primarios usados para detectar las proteínas fueron los siguientes: E1A (ab28305, Abcam), p-actina (A5441, Sigma), proteínas tardías del Ad5 (ab6982, Abcam), ciclina A (Ab-66E6, NeoMarkers), ciclina B (Ab-3 GNS1, NeoMarkers). Se usaron anticuerpos Alexa Fluor® (Life Technologies) como anticuerpos secundarios, y la señal se detectó mediante el uso de un instrumento LI-COR ODYSSEY®. Para evaluar la expresión de las proteínas de los adenovirus durante la infección de células de adenocarcinoma de pulmón A549 y células de astrocitos humanos normales (NHA), se infectaron células confluentes en placas de 12 pocillos con adenovirus con MOI 10 y se procesaron de manera similar como se describe para SAEC. Para evaluar la expresión de las proteínas de los adenovirus durante la infección de células de glioblastoma U87, células de glioblastoma U118, células endoteliales vasculares humanas (HuVEC) o fibroblastos humanos, se infectaron células confluentes en placas de 12 pocillos con adenovirus con MOI 20 y se procesaron de manera similar como se describe para SAEC.

Para realizar el análisis del ciclo celular, las células se infectaron con la misma MOI que para la expresión de proteínas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, las células se tripsinizaron de la placa y se lavaron con PBS frío. Las células se resuspendieron en 500 pL de PBS frío y se fijaron con 3 mL de EtOH frío al 70 %/glicina 15 mM, pH 2,8. Las muestras se mantuvieron a 4 °C, y antes del FACS, las células se sedimentaron, se lavaron en PBS frío y se resuspendieron en una solución de yoduro de propidio (PI)/RNasa A, luego se incubaron a 37 °C durante 1 h. FACS recopiló al menos 10000 eventos para cada muestra.

Para evaluar las ráfagas de adenovirus de la infección, se infectaron células quiescentes en placas de 12 pocillos con adenovirus con MOI 1 o MOI 10, y el medio se reemplazó en las células cuatro horas después de la infección. Los medios de los pocillos se recolectaron 48 y 72 horas después de la infección, se congelaron instantáneamente y se descongelaron una vez, y se centrifugaron a 7000 rpm a 4 °C durante 5 min para sedimentar los restos celulares. Se midió el volumen del medio, se congeló instantáneamente y se almacenó a -80 °C. El título del virus en el medio se determinó frente a un estándar de tipo salvaje titulado mediante un ELISA de infección por dilución en serie basado en células con anticuerpo primario anti-adenovirus tipo 5 (ab6982, Abcam) y anticuerpo secundario de fosfatasa alcalina anti-conejo ImmunoPure (Thermo Scientific).

Con respecto a los ensayos de viabilidad celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se infectaron por triplicado en diluciones seriadas con MOI 30. Después de la infección a los 7-10 días cuando había CPE completo en los pocillos infectados con MOI 10, se midió la actividad metabólica mediante el uso del reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche) según las especificaciones del fabricante.

Como se discutió anteriormente, el cáncer es una enfermedad problemática que necesita tratamientos terapéuticos adicionales. Uno de tales tratamientos incluye virus oncolíticos. Los adenovirus son uno de los virus que se exploran para su uso como virus oncolíticos. La función de la vía supresora de tumores del retinoblastoma (Rb) se pierde en casi todos los cánceres humanos, ya sea por la mutación directa de Rb, por la pérdida de la función del inhibidor de CDK p16 (por ejemplo, debido a mutación/metilación) o por la amplificación de CDK/ciclinas. En células normales que no se dividen, Rb permanece hipofosforilado y se une al factor de transcripción E2F en sus promotores diana, suprime la transcripción mediante el enmascaramiento del dominio de transactivación de E2F así como el reclutamiento de complejos de remodelación de la cromatina y actividades de modificación de histonas. Durante la transición G1-S del ciclo celular, las CDK fosforilan Rb, lo que alivia la supresión de E2F. Los adenovirus expresan oncoproteínas virales tempranas que inactivan la vía supresora de tumores Rb para obligar a las células a replicarse y reproducir concomitantemente el genoma viral. La ^e1^ade los adenovirus se une a Rb, en parte, a través de un motivo LXCXE, que desregula sus actividades supresoras de tumores. Por tanto, se propuso que la eliminación del motivo LXCXE en E1A eliminaría la inactivación de Rb y produciría un virus de replicación selectiva (ONYX-838). Sin embargo, Johnson y otros (Cancer Cell, 1(4):325-337, 2002) proporcionaron evidencia de que la mutación LXCXE de la E1A de los adenovirus no era suficiente para prevenir la entrada en la fase S, la replicación del ADN viral y la expresión de proteínas tardías, consistente con los resultados de los experimentos descritos en la presente descripción. Aunque la selectividad de Rb del mutante E1A es controvertida, esta mutación se ha llevado adelante como la base de un virus oncolítico (DNX-2401) que ha entrado en ensayos clínicos de fase II para tumores cerebrales malignos. En un intento por lograr una mayor selectividad de Rb, se generaron adenovirus que reemplazaron los promotores de las regiones E1 y E4 de los adenovirus con promotores de E2F y combinado con el motivo ALXCXE de E1A para generar ONYX-411 (Johnson y otros, Cancer Cell, 1(4):325-337, 2002; y Dubensky y otros, Cancer Cell, 1(4):307-309, 2002). Para probar estos virus, se infectaron células tumorales y humanas primarias con virus de tipo salvaje, ONYX-838 (ALXCXE de E1A) u ONYX-411 y se recolectaron en varios puntos de tiempo después de la infección. ONYX-838 se replicó indiscriminadamente en células epiteliales tumorales y pulmonares primarias. ONYX-411, que combina la ALXCXE de E1A con el control celular de E2F de las regiones E1A, E1B y E4 de los adenovirus, demostró replicación selectiva en células tumorales frente a células normales (Johnson y otros, Cancer Cell 1(4):325-337, 2002). Sin embargo, los promotores de E2F dan como resultado la recombinación y también la replicación limitada a niveles del virus de tipo salvaje en células tumorales.

Como se describe en la presente descripción, independientemente de la liberación de E2F a partir de la supresión de Rb por E1A, existe otra proteína Ad, E4orf6/7, que estabiliza además las proteínas E2F en los promotores celulares y de Ad. Juntas, E1A y E4orf6/7 conducen la transcripción mediada por E2F, lo que causa el inicio de la fase S y propaga concomitantemente el genoma del ADN viral. Por lo tanto, en la presente descripción se proporcionan adenovirus recombinantes que portan modificaciones de E1A, modificaciones de E4orf1 y/o modificaciones de E4orf6/7 que son una terapia viral oncolítica selectiva para las células tumorales que carecen de Rb funcional. Específicamente, se diseñaron mutaciones compuestas en E1A/E40rf1/E40rf6/7 para determinar si se replican selectivamente en células tumorales, pero no en células primarias. Se propone que la combinación de estas mutaciones da como resultado una terapia efectiva y autoamplificadora para el cáncer.

Para probar estos virus en células normales (no tumorales) y células tumorales, las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con AdSyn-CO102 (tipo salvaje), AdSyn-CO181 (ALXCXE/AE4orf6/7 de E1A), AdSyn-CO189 (ALXCXE de E1A) u ONYX-838 (ACR2 de E1A). ONYX-838 también carece de ALXCXE que está en el dominio CR2 de E1A. Se infectaron células epiteliales primarias humanas pequeñas quiescentes de las vías respiratorias (SAEC) (células no tumorales) con MOI 10. AdSyn-CO102 exhibió la disminución esperada de los niveles de E1A en tiempos posteriores durante la infección (Figura 1A). De manera similar, en las células infectadas con AdSyn-CO189 u ONYX-838, hay una disminución en los niveles de E1A en tiempos posteriores durante la infección; sin embargo, en el punto de tiempo anterior, la expresión de E1A es mayor que la expresión de E1A en células infectadas con AdSyn-CO102. A diferencia, AdSyn-CO181 exhibió una expresión más fuerte y continua de E1A a lo largo de la infección, lo que es indicativo de un fallo en el progreso del ciclo de vida de los adenovirus. Se infectaron células de adenocarcinoma de pulmón confluentes (A549) (células tumorales) con MOI 30. Todas las infecciones dieron como resultado la disminución esperada de los niveles de E1A en tiempos posteriores durante la infección, lo que indica la progresión típica del ciclo de vida de los adenovirus (Figura 1B).

La expresión de proteínas adenovirales tardías y de la proteína ciclina celular después de la infección de células SAEC o A549 con adenovirus mutantes se muestra en la Figura 2A (SAEC) y en la Figura 2B (células A549). A diferencia de los virus de tipo salvaje y los virus con mutaciones E1A solas, AdSyn-CO181 no pudo activar las dianas del ciclo celular dependientes de E2F, la fase S, la ciclina A y la ciclina B en SAEC. Además, AdSyn-CO181 y AdSyn-C0210, que tienen mutaciones E4orf6/7, fueron defectuosos para la expresión de proteínas tardías y la replicación en SAEC. Ambos defectos fueron evidentes en menor grado con AdSyn-CO210. A diferencia de las células primarias infectadas, no hubo defectos evidentes en la expresión de proteínas estructurales tardías en las células A549, y la ciclina A y la ciclina B permanecen presentes en todas las muestras de A549 infectadas.

La replicación del ADN de las células SAEC y A549 infectadas se muestra en las Figuras 3A y 3B. La infección por AdSyn-CO181 exhibió un fuerte defecto de replicación del ADN en SAEC en relación con AdSyn-CO102, que está relacionado con una disminución de la replicación del virus. En este momento, también fue evidente un defecto modesto en las SAEC infectadas con AdSyn-CO210. En las células A549, no fue evidente ningún defecto de replicación del ADN con ninguna infección por virus mutantes.

Las Figuras 4A-4B muestran ráfagas de adenovirus de células SAEC y A549 infectadas. Tanto la infección por AdSyn-CO181 como por AdSyn-CO210 revelaron fuertes defectos de replicación en SAEC en relación con AdSyn-CO102 (Figura 4A). Con la excepción de AdSyn-CO210, no hubo defecto en la replicación del virus en las células A549 (Figura 4B).

Las Figuras 5A-5B muestran la viabilidad celular de SAEC y A549 infectadas después de 7 días de infección. En comparación con AdSyn-CO102, AdSyn-CO181 exhibió una capacidad de muerte celular disminuida en SAEC. Como se muestra en la Figura 5B, de los virus mutantes probados, no hubo ningún defecto en la muerte celular en relación con el virus de tipo salvaje en las células A549.

También se probaron virus recombinantes en astrocitos humanos normales (NHA) (Figuras 6A-6C), células de glioblastoma U87 (Figuras 7A-7C), células de glioblastoma U87 (Figuras 8A-8C) y células IMR90 (Figuras 9A-9C). En NHA, AdSyn-CO181 no indujo ciclina A, y demostró una expresión de proteínas virales tardías retardada y disminuida en relación con AdSyn-CO102, que son indicativos de deficiencia en la replicación (Figura 6A). Además, medido por el número de partículas infecciosas (Figura 6B) y el contenido de ADN (Figura 6C), AdSyn-CO181 exhibió una infección atenuada en NHA, en comparación con AdSyn-CO102 de tipo salvaje. A diferencia de las células NHA, los adenovirus mutantes no demostraron un defecto de replicación en células de glioblastoma U87 (Figuras 7A-7C) o en células de glioblastoma U118 (Figuras 8A-8C). AdSyn-CO181 exhibió defectos de replicación modestos en células IMR90 (Figuras 9A-9C).

Por lo tanto, los datos descritos anteriormente indican que, a diferencia de los virus de tipo salvaje y E1AACR2, los virus E1AACR2/AE4orf6/7 y también AE4orf6/7 se replican pobremente en las células primarias, como lo evidencia la falta de expresión de la proteína de la cápside, el fallo para inducir los genes diana de E2F (ciclina A y B), el fallo para provocar la entrada en la fase S y la replicación viral. A diferencia, estos virus se replican a niveles de los virus de tipo salvaje en células A549 y un panel de líneas celulares tumorales. Por lo tanto, los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción son agentes terapéuticos selectivos contra el cáncer.

Los resultados de la especificidad de replicación de un conjunto más grande de adenovirus mutantes, que incluyen las mutaciones en E4orf1 (ver Tabla 1), se muestran en las Figuras 10-15 y se resumen en la Figura l6. La Figura 10 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de astrocitos humanos normales primarios infectados (NHA) después de 10 días de infección. La Figura 11 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células epiteliales pequeñas normales quiescentes de las vías respiratorias infectadas (SAEC-hTERT) después de 9 días de infección. La Figura 12 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células SAEC-hTERT proliferantes infectadas después de 10 días de infección. La Figura 13 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células de adenocarcinoma de pulmón humanas infectadas (A549) después de 7 días de infección. La Figura 14 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células cancerosas de mama humanas infectadas (MDA MB 231) después de 7 días de infección. La Figura 15 es un gráfico que muestra la viabilidad celular de las células de glioblastoma infectadas (U87) después de 7 días de infección. La Figura 16 es una tabla de mapa de calor que muestra la cuantificación de los ensayos de viabilidad celular para las células NHA primarias, SAEC-hTERT (quiescente), SAEC-hTERT (en proliferación), A549, MDA MB 231 y U87 infectadas después de 7 días de infección. Además, la Figura 17 proporciona una tabla que muestra la cuantificación de los ensayos de viabilidad celular para las células U2OS y SaOS2 infectadas. Tanto las células U2OS como las SaOS2 son células de osteocarcinoma; sin embargo, p53 y Rb son funcionales en las células U2OS y mutadas en las células SaOS2. Los resultados demuestran que los virus mutantes se replican selectivamente en las células tumorales defectuosas en Rb.

Estos datos muestran que la combinación de varias modificaciones de E1A, E4orf1 y/o E4orf6/7 da como resultado un adenovirus oncolítico selectivo que se replica específicamente en células cancerosas con una vía supresora de tumores de Rb defectuosa.

Ejemplo 2: Adenovirus oncolíticos con modificaciones en E1, L3, E3 y/o E4

Este ejemplo describe adenovirus recombinantes adicionales con selectividad tumoral. Los virus recombinantes ejemplares se enumeran en la Tabla 2 y las secuencias del genoma de estos virus se establecen como las SEQ ID NO: 25-31.

Tabla 2. Adenovirus con modificaciones en E1, L3, E3 y/o E4

AdSyn-CO312, AdSyn-CO313 y AdSyn-CO335 son virus dirigidos a EFGR dependientes de rapamicina y/o rapalog (AP21967) (ver Publicación PCT No. WO 2013/138505, para una descripción de este método de direccionamiento). Cada uno de estos virus recombinantes incluye una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/p y E3-14.7k, y una inserción de una proteína de fusión EGFRVHH-FKBP y una fibra FRB* (fibra del Ad5 fusionada al FRB mutante, que puede unirse a rapamicina o rapalog) o la fibra FRB (fibra del Ad5 fusionada al FRB de tipo salvaje, que solo puede unirse a rapamicina). AdSyn-CO442 se puede usar como un virus de control experimental ya que expresa la fibra FRB*, pero no una proteína de fusión FKBP, que sería requerida para el redireccionamiento dependiente de rapamicina/rapalog. AdSyn-CO335 y AdSyn-CO442 también incluyen una mutación E451Q en la proteína hexona. Esta mutación desvía el virus recombinante del hígado.

La Figura 18A muestra la interfaz de unión del dominio FRB con rapamicina y FKBP12. La Figura 18B es un gráfico que muestra que el virus dirigido a EGFR con la fibra FRB (AdSyn-CO205; SEQ ID NO: 88) ha mejorado la transducción de las células cancerosas de mama MDA MB 453 en la presencia de rapamicina, pero no de AP21967, mientras que el virus dirigido a EGFR con la fibra FRB* (AdSyn-CO220; SEQ ID NO: 98) ha mejorado la transducción de las células MDA MB 453 en la presencia de rapamicina o AP21967. La Figura 18C es una inmunotransferencia que muestra la actividad del inhibidor de mTOR rapamicina que bloquea la fosforilación de su diana p70 S6K. El homólogo de rapamicina AP21967 no inhibe mTOR a concentraciones de direccionamiento.

AdSyn-CO312 se probó en células cancerosas de mama metastásicas HS578T. A las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, se añadió rapamicina fresca o AP21967 a 50 nM. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1 y se normalizó a las células no infectadas con un tratamiento farmacológico coincidente. Como se muestra en la Figura 18D, la infección con AdSyn-CO312 dio como resultado una muerte celular potenciada de las células infectadas con el virus oncolítico dirigido a EGFR que recibieron rapamicina o AP21967 en comparación con la ausencia de direccionamiento. La viabilidad celular de las células cancerosas de mama metastásicas HS578T infectadas con AdSyn-C0313 después de 9 días de infección se muestra en la Figura 18E. Las células se infectaron con una dilución en serie de AdSyn-CO313. A las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, se añadió rapamicina fresca a 50 nM. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1 y se normalizó a las células no infectadas con un tratamiento farmacológico coincidente. AdSyn-CO313 porta las mutaciones oncolíticas de E1A ALXCXE, AE4orf6/7, AE3-RIDa/p, AE3-14.7k, y expresa el gen dirigido a eGfR dependiente de rapamicina EGFRVHH-FKBP y la fibra FRB. Hay una muerte potenciada de las células infectadas con el virus oncolítico dirigido a EGFR que reciben rapamicina sin direccionamiento.

Se evaluó AdSyn-CO313 en ratones con xenoinjertos subcutáneos HS578T. Los ratones con tumores establecidos recibieron una inyección intratumoral de AdSyn-CO313, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal periódica de 8 mg/kg de rapamicina (n = 5) o de control de vehículo (n = 4), o recibieron control de vehículo intratumoral y posteriormente recibieron una inyección intraperitoneal periódica de 8 mg/kg de rapamicina (n = 5) o de control de vehículo (n = 4). La infección se repitió en los mismos grupos tres veces más cada 4 días y se inició 19 días después de la infección inicial. Como se muestra en la Figura 19, los tumores en ratones que recibieron el virus oncolítico dirigido a EGFR con rapamicina exhibieron la mejor respuesta.

AdSyn-CO335 es un virus oncolítico que presenta una cápside que evita la captación hepática por la mutación E451Q de la hexona y puede dirigirse para infectar células a través de EGFR en la presencia de rapamicina o rapalog AP21967. La actividad oncolítica de AdSyn-CO335 se probó in vitro e in vivo. Se infectaron células HS578T con una dilución en serie de AdSyn-CO335. A las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección, se añadió rapamicina fresca o AP21967 a 50 nM. La actividad metabólica se cuantificó mediante el ensayo WST-1 y se normalizó a las células no infectadas con un tratamiento farmacológico coincidente. Como se muestra en la Figura 20, hay una muerte potenciada de las células infectadas con el virus oncolítico dirigido a EGFR que reciben rapamicina o AP21967, en comparación con las células infectadas sin direccionamiento. Para evaluar AdSyn-CO335 in vivo, se establecieron xenoinjertos subcutáneos HS578T en ratones. Los ratones con tumores establecidos recibieron tres inyecciones intratumorales cada 4 días de AdSyn-CO335, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal de 2 u 8 mg/kg de rapamicina (n = 8 y n = 8, respectivamente) cada dos días siguientes o control de vehículo (n = 6) cada dos días siguientes; o recibieron tres inyecciones intratumorales cada 4 días de AdSyn-CO442, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal de 2 u 8 mg/kg de rapamicina (n = 6 n = 6, respectivamente) cada dos días siguientes; o recibieron tres inyecciones intratumorales cada 4 días de control de vehículo, luego recibieron posteriormente una inyección intraperitoneal de 2 u 8 mg/kg de rapamicina (n = 6 y n = 6, respectivamente) cada dos días siguientes. Como se indica en las Figuras 21A-21D, los tumores en ratones que recibieron el virus oncolítico dirigido a EGFR con 8 mg/kg de rapamicina muestran la respuesta más significativa.

AdSyn-CO199, AdSyn-CO200 y AdSyn-CO171 son virus reporteros recombinantes que tienen una eliminación de E1A y codifican la luciferasa conducido por el promotor EF1a (EF1a-luciferasa). AdSyn-CO200 y AdSyn-CO171 también incluyen dos sitios de unión para miR-122 (un microARN específico del hígado) en el 3'-UTr de E1A, para inhibir la expresión génica viral en el hígado. AdSyn-CO171 codifica además la mutación E451Q de desvío del hígado en la proteína hexona.

Las Figuras 22A-22C muestran la eliminación de la expresión génica mediada por adenovirus en el hígado y el desvío de la infección por adenovirus al hígado. AdSyn-CO199 expresó la luciferasa a niveles altos exclusivamente en el hígado después de una infección sistémica (Figura 22A). Como se muestra en la Figura 22B, la señal de la luciferasa se pierde cuando los ratones se infectan sistémicamente con AdSyn-CO200, un virus que coincide con AdSyn-CO199, excepto que el microARN específico del hígado miR122 elimina la expresión de la luciferasa. Como se muestra en la Figura 22C, la expresión de la luciferasa se puede detectar en el bazo cuando los ratones se infectan sistémicamente con AdSyn-CO171, un virus que coincide con AdSyn-CO200, excepto que la proteína hexona del adenovirus porta la mutación E451Q, que la desvía del hígado. Estos datos validan el uso de esta modificación del módulo genómico para prevenir la expresión hepática de los genes E1 del Ad y, por definición, la replicación en las células hepáticas.

Ejemplo 3: Adenovirus recombinantes que expresan proteínas de fibra quiméricas

Este ejemplo describe adenovirus recombinantes que expresan proteínas de fibra quiméricas para dirigir la infección a tipos celulares específicos.

Si bien se ha mostrado que las proteínas de fibra del Ad5 y muchos otros serotipos se unen al receptor del adenovirus coxsackie (CAR) para la unión celular, se ha demostrado que otros serotipos usan CD46, desmogleína 2, ácido siálico u otros. Desde que Adsembly/AdSLIC (ver la Publicación PCT No. WO 2012/024351) permite la creación rápida de virus quiméricos, se generó un panel inicial de seis virus quiméricos de fibra con el fin de examinar las capacidades alternativas de direccionamiento celular de varios serotipos. Dado que el botón globular en el extremo C-terminal de la proteína de la fibra es típicamente responsable de la unión al receptor, las quimeras se crearon al reemplazar el botón de la fibra del Ad5 con el botón de la fibra del Ad3, Ad9, Ad11, Ad12 o Ad34 (Figuras 23A23C; Tabla 3). Cada virus se creó con el mismo módulo E1 que contiene una eliminación E1A/E1B y una fusión luciferasa-GFP conducidas por un promotor EF1a. El panel se usó para transducir 17 líneas de células tumorales diferentes, células primarias de las vías respiratorias y la línea de células madre H9, y se midió la expresión de la luciferasa en cada tipo celular (Figura 23D). En comparación con las fibras del Ad5, se observó una expresión de luciferasa-GFP significativamente mayor en casi todas las células cuando se usaron quimeras con Ad3, Ad11 o Ad34 (Figuras 23D y 23E). Por el contrario, la expresión de luciferasa-GFP fue casi universalmente menor en las células transducidas con las quimeras de fibra del Ad9 o Ad12. Estos datos demuestran un uso poderoso de poder combinar partes modificadas de otros serotipos con el fin de mejorar los vectores basados en el Ad5 y optimizar los virus recombinantes para su entrada en tipos celulares específicos.

Tabla 3. Adenovirus recombinantes con proteínas de fibra quiméricas

Ejemplo 4: Adenovirus recombinantes de cápside intercambiada

Este ejemplo describe modificaciones del módulo para crear adenovirus quiméricos de cápside intercambiada. Los adenovirus recombinantes descritos en este ejemplo están diseñados para evadir los anticuerpos neutralizantes existentes.

Los virus basados en el Ad5 que tienen intercambios completos de módulos de 'cápside' (casi el 60 % del genoma), que los hacen 'invisibles' para los anticuerpos preexistentes en poblaciones humanas y permiten inoculaciones repetidas Adsembly/AdSLlC, se diseñaron para tomar ventaja de la modularidad que existe en los genomas de adenovirus. La prueba más sólida de esta modularidad sería combinar módulos completos de un serotipo con módulos completos de otro serotipo. Esta posibilidad se examinó al combinar los módulos E1, E3 y E4 del Ad5 con los módulos de núcleo (es decir, E2B, L1, L2, L3, E2A y L4; ver la Figura 24A) de otros serotipos. Esto produce virus que pueden evadir los anticuerpos neutralizantes del Ad5, pero mantienen los genes no estructurales del Ad5 bien caracterizados que con frecuencia mutan para crear virus oncolíticos. Se usó AdSLIC para generar virus que contenían un módulo de núcleo del Ad3, Ad9, Ad11, Ad12, Ad34 o adenovirus 1 de ratón (MAV-1) con los módulos E1, E3 y E4 del Ad5 (Figura 24B y Tabla 4). Además, el módulo E1 del Ad5 se alteró para reemplazar la región codificante pIX del Ad5 con la del serotipo del núcleo coincidente; y el módulo E3 del Ad5 se alteró para reemplazar el Uexon y la región codificante de la fibra con la del serotipo del núcleo coincidente. Por tanto, todos los componentes de la cápside fueron de un serotipo, mientras que las regiones E1, E3 y E4 del genoma fueron del Ad5. Cuatro de las seis quimeras que se crearon pudieron producir virus viables en las células 293-E4. Las quimeras entre Ad5 y Ad3, Ad9, Ad11 o Ad34 se replicaron todas, mientras que las quimeras Ad5/Ad12 o Ad5/MAV-1 no se replicaron incluso después de ser modificadas para incluir las ITR y la secuencia de empaquetamiento ('+') del serotipo del núcleo (Figura 24B). Por tanto, la capacidad para generar estas quimeras de adenovirus "de cápside intercambiada" varía en dependencia del serotipo.

Tabla 4. Adenovirus recombinantes de cápside intercambiada

Posteriormente se analizó la replicación y expresión génica de virus quiméricos de cápside intercambiada viables. Las partículas de cápside intercambiada purificadas mostraron el mismo contenido de proteínas totales que el serotipo del adenovirus de tipo salvaje con módulo de núcleo coincidente (Figura 25A). La proteína hexona, la diana de la mayoría de los anticuerpos neutralizantes, no fue reconocida en otros serotipos o en los virus de cápside intercambiada por un antisuero policlonal de conejo generado contra las partículas del Ad5 (Figura 25A). Otras proteínas estructurales que se encuentran en el interior de la cápside, tales como V y VI, mostraron alguna reactividad cruzada (Figura 25A). El análisis de transferencia Western de las células infectadas mostró que para las quimeras Ad5/Ad3, Ad5/Ad11 y Ad5/Ad34, la expresión de proteínas tardías de reacción cruzada y l0OK fue equivalente al Ad3, Ad11 y Ad34 de tipo salvaje en las células A549, mientras que ligeramente superior en las células U2OS (Figuras 25B, 25D y 25E). La expresión de E1A, que se deriva del Ad5 en todos los virus, fue significativamente mayor que la del Ad5 de tipo salvaje en estas tres quimeras, posiblemente debido a la entrada celular mejorada sobre el Ad5 (Figuras 25B, 25D y 25E y Figura 23D). Por el contrario, la quimera de cápside intercambiada Ad5/Ad9 mostró una expresión génica deficiente con este MOI, ligeramente peor que el Ad9 de tipo salvaje (para proteínas tardías) y peor que el Ad5 de tipo salvaje (para E1A) (Figura 25C).

A continuación, se probó si los virus quiméricos de cápside intercambiada podrían evitar la neutralización de anticuerpos en muestras de suero humano que contienen anticuerpos neutralizantes del Ad5. Se identificaron muestras de suero humano que fueron capaces de neutralizar la muerte de las células A549 por el Ad5, según se midió mediante el uso de ensayos de viabilidad celular WST-1. Tras la incubación de estas muestras de suero con el Ad5 o con una quimera de cápside intercambiada, se inhibió la muerte celular por el Ad5, mientras que la muerte por los virus de cápside intercambiada no se vio afectada (Figuras 26A-26C). Estos datos demuestran que los virus quiméricos de cápside intercambiada son capaces de evadir los anticuerpos del Ad5 preexistentes que se encuentran comúnmente en muestras humanas, y son capaces de replicarse con la expresión de componentes no estructurales del Ad5 y componentes estructurales que no son del Ad5. Por tanto, la modularidad natural observada dentro de los genomas de adenovirus puede explotarse mediante el uso de Adsembly/AdSLIC para crear nuevos virus con propiedades útiles.

Como se discutió anteriormente, un porcentaje significativo de la población humana tiene anticuerpos preexistentes contra el Ad5 y algunos otros serotipos de adenovirus comunes. Un análisis de 16 muestras de suero humano demostró que 9 de 16 muestras contenían anticuerpos neutralizantes contra el Ad5. Por lo tanto, se desarrollaron virus oncolíticos de cápside intercambiada para permitir la evasión de anticuerpos neutralizantes preexistentes. Se generaron cuatro adenovirus recombinantes de cápside intercambiada que incluyen mutaciones oncolíticas en E1A (ALXCXE) y E4 (AE4orf6/7). Estas mutaciones son las mismas mutaciones oncolíticas presentes en AdSyn-CO181. AdSyn-CO 159X (SEQ ID NO: 93), AdSyn-CO-167X (SEQ ID NO: 94), AdSyn-CO201X (SEQ ID NO: 95) y AdSyn-CO202X (SEQ ID NO: 96) contienen las proteínas estructurales del Ad11, Ad9, Ad3 y Ad34, respectivamente.

Ejemplo 5: Adenovirus oncolíticos recombinantes que combinan proteínas de fibra modificadas o quiméricas, o mutaciones de la cápside o intercambios de serotipos

Este ejemplo describe adenovirus recombinantes adicionales con selectividad tumoral y/o que expresan proteínas de fibra mutantes o quiméricas para dirigir la infección a tipos celulares específicos, y/o adenovirus quiméricos de cápside intercambiada o modificada diseñados para evadir los anticuerpos neutralizantes existentes. Los virus recombinantes ilustrativos se enumeran en la Tabla 5 y las secuencias del genoma de estos virus se establecen como las SEQ ID NO: 82-87.

Tabla 5. Adenovirus oncolíticos recombinantes que combinan proteínas de fibra modificadas o quiméricas, o mutaciones de la cápside o intercambios de serotipos

Cada uno de los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción (ver las Tablas 1-4) porta modificaciones que pueden ser ventajosas para dirigir la infección a tipos celulares específicos y para evadir los anticuerpos neutralizantes existentes. Las mutaciones E1 y E4 descritas en el Ejemplo 1 se pueden combinar con otros módulos para potenciar la eficacia de la terapia con virus oncolíticos.

Los ejemplos de adenovirus oncolíticos recombinantes con mutaciones E1, del núcleo y E4 junto con fibras quiméricas son AdSyn-CO507, AdSyn-CO508 y AdSyn-CO509, que usan el dominio de botón de las proteínas de fibra del Ad34, Ad11 y Ad37, respectivamente.

Un ejemplo de un adenovirus oncolítico recombinante con mutaciones E1 y E4 junto con una cápside intercambiada del Ad34 es AdSyn-CO510.

Un ejemplo de un adenovirus oncolítico dirigido a EGFR inducido por rapamicina/rapalog con mutaciones E1, E3 y E4 junto con la proteína de la cápside pentona que porta una mutación en el motivo RGD de unión a integrina a RGE es AdSyn-CO511. Se ha mostrado que esta mutación de la pentona reduce la captación del virus en el bazo y atenúa la respuesta inflamatoria antiviral.

Un ejemplo de un adenovirus oncolítico recombinante con mutaciones E1 y E4 junto con una inserción de un péptido RGD en la proteína de la fibra es AdSyn-C0512. Se ha mostrado que la inserción de RGD en la proteína de la fibra aumenta drásticamente la infección en una variedad más amplia de tipos celulares, que incluyen las células endoteliales vasculares.

Ejemplo 6: Adenovirus oncolíticos derivados del Ad5 y otros serotipos de adenovirus

Los adenovirus oncolíticos descritos en la presente descripción (ver las Tablas 1-5) se desarrollaron mediante el uso de vectores del Ad5. Sin embargo, varias regiones genómicas (y la proteína codificada por estas regiones) que son importantes para la replicación adenoviral están muy conservadas entre los serotipos de adenovirus. Por tanto, los adenovirus recombinantes descritos en la presente descripción se pueden generar mediante el uso de una secuencia genómica de cualquier serotipo de adenovirus deseado. En particular, las proteínas E1A y E4orf6/7 se conservan entre todas las especies humanas de adenovirus. La Figura 27 muestra un alineamiento de proteínas E1A de adenovirus de la especie A (Ad12, especie B (Ad7), especie C (Ad2 y Ad5), especie D (Ad9), especie E (Ad4), especie F (Ad40) y especie G (Ad52). De manera similar, la Figura 28 muestra un alineamiento de proteínas E4orf6/7 de adenovirus de la especie A (Ad12, especie B (Ad7), especie C (Ad2 y Ad5), especie D (Ad9), especie E (Ad4) y especie G (Ad52). Mediante el uso de las secuencias mostradas en las Figuras 27 y 28, o cualquier otra secuencia de adenovirus disponible en bases de datos públicas, se podrían usar fácilmente secuencias de E1A y/o E4orf6/7 de cualquier serotipo de adenovirus en la generación de un adenovirus oncolítico.

Ejemplo 7: Caracterización de adenovirus recombinantes que portan componentes dirigidos a EGFR Este ejemplo describe un adenovirus sintético dirigido a células que expresan EGFR y confirma que el virus recombinante no tiene alteración de la replicación en las células 293-E4 como resultado de las modificaciones. Los siguientes adenovirus sintéticos se generaron y usaron en este estudio:

AdSyn-CO170 (SEQ ID NO: 91)

Un adenovirus de tipo salvaje construido mediante el uso de "Adsembly", una reacción de recombinación Gateway® LR de múltiples sitios a partir de módulos de genoma de adenovirus. Tres sitios de recombinación permanecen en el genoma entre los módulos de adenovirus: un sitio de recombinación attB4 entre los genes E1B-55K y pIX; un sitio attB5 entre los genes L4-33K y pVIII; y un sitio attB3 entre el gen de Fibra y E4. Este adenovirus recombinante sirvió como un virus de control.

AdSyn-CO205 (SEQ ID NO: 88)

Un adenovirus recombinante creado mediante Adsembly que corresponde a AdSyn-CO170, pero con características adicionales que permiten el direccionamiento dependiente de rapamicina para infectar las células que expresan EGFR. Se inserta una secuencia que codifica el dominio FRB de mTOR en el lazo HI en el dominio de botón la fibra del adenovirus. Los genes E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k se eliminaron y se reemplazaron con un gen que codifica un anticuerpo de dominio único de unión a EGFr (EGFRVHH) fusionado a FKBP12. En la presencia de rapamicina, la proteína de fusión EGFRVHH-FKBP soluble forma un heterodímero con el dominio FRB en la fibra y permite que las partículas de adenovirus maduras se unan al EGFR en nuevas células e infecten a través de este nuevo receptor.

AdSyn-CO206 (SEQ ID NO: 89)

Este adenovirus recombinante es idéntico al AdSyn-CO205, excepto que tiene una fibra de tipo salvaje y, por lo tanto, carece del dominio FRB. Este virus presenta la eliminación de los genes E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k, y el reemplazo por un gen que codifica un anticuerpo de dominio único de unión a EGFR (EGFRVHH) fusionado a FKBP12, como se describe para AdSyn-CO205.

AdSyn-CO207 (SEQ ID NO: 90)

Este adenovirus recombinante es idéntico a AdSyn-CO205, excepto que tiene una región E3 de tipo salvaje y, por lo tanto, carece de la fusión EGFRVHH-FKBP. Cuenta con la inserción de FRB en la fibra, como se describe para AdSyn-CO205.

AdSyn-CO220 (SEQ ID NO: 98)

Este adenovirus recombinante es idéntico a AdSyn-CO205, excepto que porta la mutación T2098L en el dominio FRB (FRB*), que permite el direccionamiento a EGFR con rapamicina o AP21967.

El virus AdSyn-CO205 dirigido a EGFR controlado con rapamicina contiene un reportero de GFP fusionado a E1A como un marcador de infección. El transcripto de E3B se modificó al eliminar RIDa, RIDp y 14.7k, y se usó para expresar EGFRVHH-FKBP. AdSyn-CO206 tiene todas las modificaciones de AdSyn-CO205, pero conserva una fibra de tipo salvaje y, por lo tanto, no tiene un dominio FRB. AdSyn-CO207 tiene todas las modificaciones de AdSyn-CO206, pero conserva una región E3 de tipo salvaje y, por lo tanto, no tiene el gen de fusión a FKBP.

Para evaluar la expresión de proteínas tardías del Ad5 mediante los virus recombinantes, se infectaron células 293-E4 con el virus de control "de tipo salvaje" AdSyn-CO170, el virus modificado AdSyn-CO205 dirigido a EGFR dependiente de rapamicina o los virus de control AdSyn-CO206 o AdSyn-CO207 con un MOI de 10. La Figura 29 muestra una inmunotransferencia de expresión de proteínas a partir de lisados de las células 293-E4 infectadas. El cambio en la migración de la fibra muestra la inserción del dominio FRB de 90 aminoácidos en AdSyn-CO207 y AdSyn-CO205. La expresión de la proteína de fusión EGFRVHH-FKBP se detectó mediante el sondeo para FKBP12. El transcurso del tiempo de la expresión de proteínas tardías muestra que no hay un defecto pronunciado en la replicación de los virus que expresan el mutante de la cápside o EGFRVHH-FKBP con reporteros GFP-E1A en comparación con AdSyn-CO170 de tipo salvaje Adsembly.

Ejemplo 8: El direccionamiento a EGFR inducido por rapamicina de AdSyn-CO335 aumenta la eficacia de la terapia oncolítica de xenoinjertos HS578T en ratones

Este ejemplo describe el hallazgo de que el direccionamiento de EGFR dependiente de rapamicina de adenovirus recombinantes reduce significativamente el volumen tumoral de xenoinjertos tumorales que expresan EGFR.

Ratones y tumores

Se cultivaron células cancerosas de mama HS578T (ATCC-HTB-126; American Type Culture Collection, Manassas, CA) según lo recomendado por el proveedor. Se alojaron ratones atímicos hembras de 5 semanas de edad (J:NU #007850; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) bajo protocolos aprobados. Los xenoinjertos se iniciaron al inyectar subcutáneamente células HS578T (células 5E6 suspendidas en 0,2 mL de Matriz BD Matrigel; BD Biosciences, Bedford, MA) en el flanco izquierdo y derecho bajo anestesia (isoflurano).

Se midieron semanalmente dos diámetros tumorales perpendiculares (l y w) para seguir la progresión del tumor. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante el uso de la fórmula elipsoide modificada donde vol = 1/2 (l * w2) (Euhus y otros, J Surg Oncol 31(4):229-2341986; Tomayko y otros, Cancer Chemother Pharmacol 24(3): 148-154, 1989).

Dos meses después de la implantación, se incluyeron en el estudio 48 ratones con 86 tumores con un volumen de 270 ± 17 mm3 (media ± SEM) y se asignaron al azar en grupos de tratamiento con tumores de tamaño medio similar (n = 6 a 8). No todas las inyecciones de HS578T establecieron tumores con éxito. En los días 0, 3 y 6, los ratones se inyectaron por vía intratumoral con 2 x 108 PFU de adenovirus diluidas en 50 pL de PBS. AdSyn-CO335 es un adenovirus oncolítico que expresa una proteína de fibra con una secuencia FRB insertada y expresa FKBP fusionada a un nanocuerpo que reconoce EGFR (EGFRVHH). AdSyn-CO442 tiene todas las características de AdSyn-CO335, pero no expresa EGFRVHH. Se administró rapamicina (lote ASC-127; LC Laboratories, Woburn, MA) diluida en 100 pL de Tween 80 al 5 %/PEG400 al 5 % mediante inyección intraperitoneal los días 1, 4, 7 y, posteriormente, en días alternos a 2 u 8 mg/kg de dosis. Se controló el peso corporal para determinar la toxicidad y se midieron los tamaños de los tumores mientras se desconocían los grupos de tratamiento. Los ratones se sacrificaron si los tumores fueron mayores de 20 mm en cualquier dimensión o mostraban otros signos de una carga tumoral significativa.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso del software R Statistical 3.2.0 (The R Foundation, Viena, Austria) con la guía del manual electrónico de métodos estadísticos de NIST/SEMATECH. Los valores atípicos se identificaron mediante el procedimiento de desviación estudentizada extrema con un intervalo de confianza del 95 %, al asumir una distribución normal verificada visualmente mediante una gráfica Q-Q. Se usó el análisis de varianza (ANOVA) para probar las diferencias significativas entre los volúmenes tumorales medios de los grupos de tratamiento en cada momento en el que se recopilaron los datos.

Resultados

Para probar la eficacia de la administración dirigida de la progenie de adenovirus a través de EGFR para tratar tumores in vivo, se establecieron xenoinjertos HS578T subcutáneos en ambos flancos de ratones nu/nu. Cuando los tumores alcanzaron 264 ± 16 mm3 (media ± SEM), los ratones se asignaron al azar en grupos de tratamiento con tumores de tamaño medio similar. Los ratones recibieron inyecciones intratumorales de forma simulada (solo vehículo), AdSyn-CO335 o AdSyn-CO442. AdSyn-CO442 es un virus de control que porta las características de AdSyn-CO335, pero no expresa EGFRVHH-FKBP. La rapamicina (rap) se coadministró en días alternos durante el curso de la terapia para permitir que la progenie del virus se dirija a EGFR. Los resultados se muestran en la Figura 30.

Con el tratamiento de forma simulada (n = 8 tumores) y sin rapamicina, los tumores crecieron sin control, con un volumen tumoral medio de 1300 ± 448 mm3 a los 28 días después del inicio del tratamiento de forma simulada, después de lo cual se sacrificaron los ratones debido a las grandes dimensiones de los tumores. A modo de comparación, los datos que se describen a continuación son de este momento de la terapia.

Primero se probó una dosis de 8 mg/kg de rapamicina en días alternos en combinación con la administración de adenovirus, pero la alta concentración de rapamicina enmascaró el efecto de la infección por el virus. La administración de 8 mg/kg de rapamicina sola (sin infección por virus) fue suficiente para ralentizar el crecimiento del tumor en comparación con ningún tratamiento (P = 4,50 x 10-2), lo que dio como resultado un volumen tumoral medio de 229 ± 49 mm3 La administración de 2 mg/kg de rapamicina sola (n = 8) no fue suficiente para bloquear el crecimiento de los tumores (P = 0,144).

El AdSyn-C0335 oncolítico solo (n = 11) no afectó significativamente la tasa de crecimiento tumoral en comparación con ningún tratamiento, lo que resultó en un volumen tumoral medio de 948 ± 207 mm3. Esto probablemente se deba a la limitación de la infección por HS578T mediante la progenie de AdSyn-CO335 no dirigida. Cuando se administraron conjuntamente AdSyn-CO335 y 2 mg/kg de rapamicina (n = 11), hubo una reducción dramática y significativa en el volumen tumoral en comparación con el virus solo (P = 8,54 x 10-4) o el tratamiento con 2 mg/kg de rapamicina (P = 1,49 x 10-2) sola, lo que dio como resultado un volumen tumoral medio reducido de 133 ± 22 mm3. Estos datos sugieren que esta reducción en el volumen tumoral depende del direccionamiento a EGFR inducido por rapamicina de la progenie del virus, ya que el tratamiento con 2 mg/kg de rapamicina y el virus de control AdSyn-CO442 (n = 9) dio como resultado un volumen tumoral medio de 401 ± 89 mm3, que no presentó una diferencia significativa (P = 0,449) en el volumen medio del tumor en comparación con el tratamiento con 2 mg/kg de rapamicina sola, y resultó en tumores significativamente más grandes (P = 4,92 x 10-3) que la coadministración de 2 mg/kg de rapamicina y AdSyn-CO335.

Se midieron diferencias significativas entre el tratamiento con 2 mg/kg de rapamicina y la coadministración de 2 mg/kg de rapamicina y AdSyn-C0335 tan pronto como 14 días después del inicio del tratamiento (P = 2,25 x 10-2). En este punto de tiempo, los tumores tratados con rapamicina infectados con AdSyn-CO442 superaron de forma mensurable a los tumores infectados con AdSyn-CO335 (P = 1,54 x 10-2).

Se realizó un estudio para evaluar si las dosis de rapamicina que son suficientes para el redireccionamiento de los adenovirus también son inmunosupresoras. Los ratones con tumores de xenoinjertos HS578T subcutáneos se trataron mediante inyección intraperitoneal de 100 pL de vehículo, 2 mg/kg de rapamicina u 8 mg/kg de rapamicina. Una hora después de la inyección, se recolectaron los tejidos de xenoinjerto, se fijaron en formalina al 10 % y se seccionaron para tinción IHC con un anticuerpo que reconoce la forma fosfo-T378 de P70S6K. Como se muestra en la Figura 31 son micropictografías de secciones de tejido de xenoinjerto HS578T teñidas para P70S6K fosforilada en treonina 389 (P70S6K p-T389). La fosforilación de p70S6K en T389 es un sello distintivo de la actividad de mTOR. En los tejidos sin tratamiento o con la dosis efectiva baja de adenovirus dirigido a EGFR (2 mg/kg), la actividad de mTOR no se inhibe, como lo demuestra la tinción de P70S6K p-T389. A la dosis efectiva más alta de adenovirus dirigido a EGFR (8 mg/kg), se inhibe la actividad de mTOR, marcada por una pérdida de tinción de P70S6K p-T389. Estos resultados demuestran que la dosis de rapamicina que es suficiente para el direccionamiento a EGFR de adenovirus recombinantes in vivo no inhibe mTOR (y por lo tanto no es sustancialmente inmunosupresor).

Ejemplo 9: adenovirus oncolíticos recombinantes con una cápside Ad34

AdSyn-CO335B-K (SEQ ID NO: 92), un adenovirus construido mediante AdSLIC, es idéntico a AdSyn-CO335 (SEQ ID NO: 30), excepto que todas las proteínas estructurales del Ad5 se reemplazan con proteínas estructurales del Ad34. Este virus tiene la misma cápside intercambiada como AdSyn-CO202. Esto permite que el virus retenga la selectividad oncolítica de AdSyn-CO335, pero evita los anticuerpos neutralizantes del Ad5. El dominio del botón de fibra del Ad34 se ha reemplazado por el botón de fibra del Ad5 y porta una secuencia que codifica el dominio FRB de mTOR insertado en el lazo HI en el dominio del botón. Los genes E3-RIDa, E3-RIDp y E3-14.7k se eliminaron y se reemplazaron con un gen que codifica un anticuerpo de dominio único de unión a EGFR (EGFRVHH) fusionado a FKBP12. En la presencia de rapamicina, la proteína de fusión EGFRVHH-FKBP soluble forma un heterodímero con el dominio FRB en la fibra y permite que las partículas de adenovirus maduras se unan al EGFR en nuevas células e infecten a través de este nuevo receptor. AdSyn-CO335B-TK (SEQ ID NO: 97) es un adenovirus recombinante idéntico a AdSyn-CO335B-K, excepto que los dominios del eje de la fibra del Ad34 se reemplazan por el eje del Ad5. En vista de las muchas modalidades posibles a las que se pueden aplicar los principios de la descripción, debe reconocerse que las modalidades ilustradas son solo ejemplos de la descripción y no deben tomarse como limitantes del alcance de la descripción. Más bien, el alcance de la descripción se define mediante las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

Un adenovirus recombinante, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, y el genoma codifica además al menos una característica seleccionada del grupo:

(i) un ligando de direccionamiento fusionado a una proteína de unión a FK506 (FKBP), y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína de unión FKBP-rapamicina de tipo salvaje (FRB) o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L,

(ii) una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k,

(iii) una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende opcionalmente una sustitución E451Q,

(v) una proteína de fibra quimérica en donde la proteína de fibra quimérica comprende opcionalmente un eje de fibra de un primer serotipo de adenovirus y un botón de fibra de un segundo serotipo de adenovirus,

(vi) una proteína pentona modificada en donde la proteína pentona modificada comprende opcionalmente una mutación en el motivo RGD de unión a integrina,

(vii) una proteína de fibra modificada para incluir un péptido RGD, y

(viii) un adenovirus quimérico de cápside intercambiada,

en donde la proteína E1A modificada comprende una mutación que interrumpe la unión de E1A a la proteína del retinoblastoma (Rb) y la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación que elimina o altera la unión a E2F o elimina o altera la señal de localización nuclear de E4orf6/7, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en células normales en comparación con las células tumorales.

El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en donde el genoma codifica además una proteína E4orf1 modificada o eliminada, en donde la proteína E4orf1 modificada comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ o una sustitución que elimina la actividad de unión a PDZ, en donde dichas sustituciones se seleccionan del grupo que consiste de: mutaciones puntuales del S126 altamente conservado de E4orf1 del Ad5 a residuos hidrófobos grandes tales como V, L o I y mutación puntual de V128 de E4orf1 del Ad5 a residuos polares tales como D, E, H, K o R.

El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en donde el genoma codifica:

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada; una proteína E1A modificada que comprende una sustitución C124G, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11 y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H y una sustitución C124G, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, y una proteína E4orf6/7 eliminada;

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 modificada que comprende una eliminación del motivo de unión a PDZ y una proteína E4orf6/7 eliminada; o

una proteína E1A modificada que comprende una sustitución Y47H, una sustitución C124G y una eliminación de los residuos 2-11, una proteína E4orf1 eliminada y una proteína E4orf6/7 eliminada. 4. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1(i), en donde el ligando de direccionamiento es un anticuerpo de dominio único.

5. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en donde el genoma comprende además uno o más sitios de unión para un microARN específico de hígado, por ejemplo, el microARN específico de hígado es miR-122.

6. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1(v), en donde el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11, Ad12, Ad34 o Ad37 o en donde el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11 o Ad34.

7. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1(viii), en donde las regiones E1, E3 y E4 del genoma se derivan de un primer serotipo del adenovirus y las regiones E2B, L1, L2, L3, E2A y L4 del genoma se derivan de un segundo serotipo del adenovirus.

8. El adenovirus recombinante de la reivindicación 7, en donde:

la región E1 del primer serotipo del adenovirus se modifica para codificar una proteína pIX del segundo serotipo del adenovirus; y/o

la región E3 del primer serotipo del adenovirus se modifica para codificar proteínas Uexon y de fibra del segundo serotipo del adenovirus.

9. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica:

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE;

una proteína E4orf6/7 eliminada;

un ligando de direccionamiento fusionado a una FKBP y una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína FRB de tipo salvaje o una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L;

una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k; y

una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende una sustitución E451Q.

10. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica:

una proteína E1A modificada que comprende una eliminación del motivo LXCXE;

una proteína E4orf6/7 eliminada; y

una eliminación de las secuencias codificantes de E3-RIDa/RIDp y E3-14.7k.

11. El adenovirus recombinante de la reivindicación 10, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica además:

una proteína hexona modificada en donde la proteína hexona modificada comprende una sustitución E451Q; y

una proteína de fibra quimérica en donde la proteína de fibra quimérica comprende opcionalmente un eje de fibra de un primer serotipo del adenovirus y un botón de fibra de un segundo serotipo del adenovirus, en donde el primer serotipo del adenovirus es Ad5 y el segundo serotipo del adenovirus es Ad3, Ad9, Ad11, Ad12, Ad34 o Ad37.

12. El adenovirus recombinante de la reivindicación 10, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica además un adenovirus quimérico de cápside intercambiada.

13. Una composición que comprende el adenovirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento del cáncer.

15. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento del cáncer.

16. Una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus recombinante de la reivindicación 1(i) o la reivindicación 9 y rapamicina o un análogo de la misma para su uso en el tratamiento del cáncer.

17. Un adenovirus recombinante para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el genoma del adenovirus recombinante codifica una proteína E1A modificada y una proteína E4orf6/7 modificada o eliminada, y el genoma codifica además:

una proteína de fibra del adenovirus fusionada a una proteína FRB mutante que comprende una sustitución T2098L,

en donde la proteína E1A modificada comprende una mutación que interrumpe la unión de E1A a la proteína del retinoblastoma (Rb) y la proteína E4orf6/7 modificada comprende una mutación que elimina o altera la unión a E2F o elimina o altera la señal de localización nuclear de E4orf6/7, y en donde el adenovirus recombinante exhibe defectos de replicación en células normales en comparación con las células tumorales.

18. El adenovirus recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, y en donde el genoma codifica además una proteína hexona modificada que comprende una sustitución E451Q.

19. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 25, 26, 30, 31, 82-87 y 92-97.

20. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Una célula transgénica que comprende el vector de la reivindicación 20.