ES2899639T3 - Betaína para la prevención de la obesidad - Google Patents

Abstract

Un compuesto de betaína para su uso en la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores en un sujeto, en el que la prevención comprende administrar el compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia.

Description

DESCRIPCIÓN

Betaína para la prevención de la obesidad

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea EP17382270.1 presentada el 12.05.2017.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al campo de la nutrición y la enfermedad, más particularmente con la prevención y el tratamiento de la obesidad y las enfermedades relacionadas.

Estado de la técnica

La obesidad está ampliamente reconocida como una enfermedad crónica asociada a muchos problemas de salud graves, como la diabetes de tipo 2, las enfermedades cardiovasculares, la hipertensión y al menos una docena de tipos de cáncer. En las últimas tres décadas, la prevalencia de la obesidad y el sobrepeso ha aumentado considerablemente y afecta a más de 600 millones de personas en todo el mundo. Las autoridades de todo el mundo la consideran uno de los problemas de salud pública más graves del siglo XXI.

El aumento excesivo de peso está influido por un amplio abanico de factores, como la predisposición genética, la alimentación inadecuada, el comportamiento individual y los factores ambientales y sociales. El papel de los nutrientes de la dieta en la obesidad se ha debatido durante mucho tiempo y se han realizado numerosos estudios para encontrar compuestos útiles en la prevención y el tratamiento de la obesidad, con un éxito limitado. A pesar de la intensa investigación sobre terapias y suplementos dietéticos, el estándar de oro para la prevención y el tratamiento de la obesidad es la dieta y el ejercicio físico. Sin embargo, los programas de dietas suelen producir una pérdida de peso a corto plazo, pero el mantenimiento de esta pérdida de peso es difícil, ya que a menudo requiere un ejercicio continuo y una dieta permanente de menor energía alimentaria. El incumplimiento de este régimen y el consiguiente aumento de peso es especialmente elevado en la población obesa y con sobrepeso.

Las intervenciones quirúrgicas son eficaces para el tratamiento de la obesidad y se realizan de forma rutinaria en algunos países en pacientes con obesidad grave. Los tipos de procedimientos incluyen la banda gástrica ajustable por laparoscopia, el bypass gástrico en Y de Roux, la gastrectomía de manga vertical y la derivación biliopancreática. La cirugía para la obesidad grave se asocia con la pérdida de peso a largo plazo, la mejora de las enfermedades relacionadas con la obesidad y la disminución de la mortalidad general. Sin embargo, los costes asociados para la sanidad pública son elevados y se producen complicaciones en aproximadamente el 17% de los casos (la re-operación es necesaria en el 7% de los casos). Debido a su coste y sus riesgos, los investigadores están buscando otros tratamientos eficaces y menos invasivos para esta enfermedad.

La obesidad infantil no ha dejado de aumentar en los países desarrollados y se ha convertido en una de las principales preocupaciones de la población. Los gobiernos de todo el mundo diseñan planes estratégicos y lanzan programas de publicidad oficial para concienciar sobre este problema. Pero la obesidad infantil no es fácil de tratar, ya que las dietas constantes son difíciles de observar por los niños y las intervenciones quirúrgicas no están indicadas. Se están haciendo grandes esfuerzos en las estrategias de prevención, pero a menudo fracasan ante el estilo de vida y los hábitos alimentarios.

Existe un consenso generalizado sobre la necesidad de hacer especial hincapié en las estrategias de prevención para la población con riesgo de desarrollar obesidad infantil. Entre los factores de riesgo, el sobrepeso materno provoca un crecimiento acelerado y es un importante factor de predicción de la obesidad infantil. Esto tiene consecuencias críticas para la epidemia de obesidad, ya que el sobrepeso en la infancia a menudo se traslada a la vida adulta, dando lugar a un ciclo obesogénico que perpetúa la obesidad y el riesgo metabólico en las siguientes generaciones. También se ha descrito que la nutrición postnatal desempeña un papel importante en la determinación del crecimiento y el riesgo de obesidad. En comparación con la lactancia materna, el uso de leche artificial se ha asociado sistemáticamente con el sobrepeso infantil, y su composición influye en el riesgo de obesidad. La duración de la lactancia materna se asocia inversamente con el riesgo de obesidad, y las diferencias en la composición de la leche, incluida la diversidad de oligosacáridos y los niveles hormonales, se correlacionan con el crecimiento infantil, la adiposidad y la composición de la microbiota. Sin embargo, aunque algunos informes han identificado alteraciones en la composición de la leche inducidas por la obesidad materna (mayor cantidad de leptina, insulina, IL-6, TNF-a), éstas no están relacionadas con el aumento de peso acelerado del lactante, e incluso se ha sugerido que son factores de protección. Por lo tanto, no se sabe muy bien cómo contribuyen los componentes específicos de la leche a la transmisión del riesgo de obesidad de la madre al niño.

El documento EP2143341 describe una composición para ser administrada a un bebé para prevenir la obesidad futura, dicha composición comprende oligosacáridos. CN101322698 describe que la betaína es eficaz en el tratamiento para prevenir o tratar la obesidad. FR2710245 y US2014/050810 describen composiciones para tratar la obesidad que comprenden betaína. Linde van Lee, et al (The American Journal of Clinical Nutrition, volumen 104, número 5, noviembre de 2016, páginas 1327-1333) divulgan que un estado materno alto en betaína se asocia generalmente con un tamaño menor del bebé al nacer y una menor masa grasa abdominal.

Debido a la elevada prevalencia de la obesidad y sus consecuencias para la salud, se necesitan estrategias eficaces para reducir la incidencia de la obesidad y, en particular, para poner fin al ciclo obesogénico que perpetúa esta condición poco saludable a lo largo de las generaciones en los individuos de riesgo.

Resumen de la invención

Los inventores han descubierto sorprendentemente que la administración de betaína a los bebés reduce la incidencia de la obesidad y trastornos asociados no sólo mientras se realiza la suplementación, sino también más adelante en la vida de dichos bebés, mucho después de que se haya interrumpido la suplementación con betaína. Este sorprendente efecto se demuestra en los ejemplos que siguen. Como se muestra en los ejemplos, los inventores han encontrado una fuerte asociación entre un menor contenido de betaína en la leche y un crecimiento temprano acelerado en los bebés con riesgo de obesidad. Además, los experimentos de suplementación materna en ratones han demostrado que el aumento de la ingesta de betaína durante la lactancia disminuía la adiposidad y mejoraba el metabolismo sistémico durante la edad adulta.

Así, un primer aspecto de la invención proporciona un compuesto de betaína para su uso en la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores en un sujeto, en el que la prevención comprende la administración del compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia.

El aspecto anterior puede reformularse como el uso de un compuesto de betaína para la preparación de una composición para la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o trastornos metabólicos asociados con cualquiera de los anteriores en un sujeto, donde la prevención comprende la administración del compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. La invención también se refiere a un método para la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o trastornos metabólicos asociados con cualquiera de los anteriores en un sujeto que comprende la administración de una cantidad eficaz del compuesto de betaína junto con excipientes y/o vehículos farmacéutica o comestiblemente aceptables directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de betaína junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente o comestiblemente aceptables para su uso como se ha definido anteriormente. La composición puede ser una composición farmacéutica (es decir, un medicamento) o una composición no farmacéutica, como una composición comestible, por ejemplo un producto alimenticio o un suplemento dietético.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: A) Niveles relativos de betaína en unidades arbitrarias. B) Composición de macronutrientes de la leche en g/100 mL (n=5/grupo); Ch, carbohidratos; Prot, proteínas. C) Contenido energético de la leche en Kcal/mL (n=5/grupo). D) Niveles de betaína en plasma en unidades arbitrarias en machos de 2 semanas (n=6/grupo). E) Peso corporal de las crías durante la lactancia (el gráfico de la izquierda representa a los machos, n=18; el gráfico de la derecha representa a las hembras, n=12); el eje Y representa el peso corporal en g; el eje X representa las semanas de vida. F) Ingesta de leche a la semana de edad expresada en % de peso corporal (n=4 camadas/grupo). Los datos son media±sem. *, test-t p<0,05; **, p<0,0001. Para todas las figuras de barras: las barras blancas representan la leche de las madres control (n=8), y las barras negras representan la leche de las madres tratadas con betaína (n=8).

FIG. 2: A) Masa grasa expresada en g (derecha) y % (izquierda) en ratones macho de 6 semanas de edad procedentes de madres control (barras blancas, n=7) o tratadas con betaína (negras, n=9). B) Peso corporal de las crías macho de madres obesas de control (MO-C, n=19) o tratadas con betaína (MO-B, n=21); el eje Y representa el peso corporal (g); el eje X representa las semanas de edad. C) Ingesta de leche a la semana de edad (n=3 camadas/grupo) expresada en % del peso corporal. D) Masa grasa expresada en g en ratones macho de 6 semanas de edad (n=8/grupo). Los datos son media±sem. *, prueba t p<0,05; **, p<0,0001.

FIG. 3. Abundancia relativa (%) de géneros diferencialmente enriquecidos identificados por LEfSe en crías macho de madres tratadas con betaína (B, n=10) o de control (C, n=10) a las 2 semanas de edad (A) y a las 6 semanas de edad (B).

FIG: 4: A) Número de células caliciformes expresado como células caliciformes/100 |jm en secciones del íleon a las 6 semanas de vida (n=16/grupo). B) Expresión relativa del ARNm de los marcadores inflamatorios Ccl2m Tlr4 y Cd11c en el eWAT de ratones macho de 6 semanas de edad (n=8-10/grupo). C) Niveles circulantes de los marcadores inflamatorios MCP1, IL-6 y Pai-1 expresados en pg/mL en ratones macho de 6 semanas (n=10/grupo). D) Niveles relativos de ARNm ileal de Muc2 a las 6 semanas de vida (n=8/grupo). Los datos son media±sem. *, test-t p<0,05; #, test U de Mann-Whitney p<0,05. Para todas las figuras: las barras blancas representan los ratones de control (C, n=10) y las barras negras representan los ratones tratados con betaína (B, n=10).

FIG. 5: A) Las crías macho del control (barras blancas/círculos, n=16) o de las madres tratadas con betaína (barras negras/círculos, n=16) fueron alimentadas con una dieta chow después del destete y el peso corporal (expresado en g; eje Y) fue monitorizado hasta las 24 semanas de edad (semanas de edad en el eje X). B) Peso del hígado (L) y del eWAT expresado en g tras el sacrificio; el eje Y representa el peso del tejido en g. C) Tolerancia a la glucosa en la semana 20; el eje Y representa la concentración de glucosa en mg/dL; el eje X representa el tiempo en minutos. D) Niveles de insulina a los tiempos 0 y 15 minutos después de la carga de glucosa; el eje Y representa la concentración de insulina en pmol/L. E) Las crías macho de las madres obesas de control (MO-C, n=11) y de las tratadas con betaína (MO-B, n=13) se mantuvieron con una dieta de chow después del destete y se controló el peso corporal (expresado en g; eje Y) hasta las 24 semanas de edad (semanas de edad en el eje X). F) Peso del hígado (L) y del eWAT tras el sacrificio; el eje Y representa el peso del tejido en g. G) Tolerancia a la glucosa en la semana 20; el eje Y representa la concentración de glucosa en mg/dL; el eje X representa el tiempo en minutos. H) Niveles de insulina a los 0 y 15 minutos después de la carga de glucosa; el eje Y representa la concentración de insulina en pmol/L. Los datos son media±sem. *, test-t p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.

FIG. 6: A) Ratones de seis semanas de edad nacidos de madres de control (barras blancas/círculos) y tratadas con betaína (barras negras/círculos) fueron alimentados con una dieta alta en calorías (HFD) durante 4 meses (machos (M) : n=14 y n=20 para HF-C y HF-B; hembras (F): n=14/grupo); se calculó el aumento de peso corporal (expresado en g; eje Y) durante la alimentación con alto contenido en grasa. B) Tolerancia a la glucosa en ratones macho a las 18 semanas de vida; el eje Y representa la concentración de glucosa en mg/dL; el eje X representa el tiempo en minutos. C) Niveles de insulina en ratones macho a las 18 semanas de vida a los tiempos 0 y 15 minutos después de la carga de glucosa; el eje Y representa la concentración de insulina en pmol/L. D) Niveles de triglicéridos hepáticos en ratones macho (n=8/grupo); el eje Y representa jg de TAG/mg de proteína. Los datos son media±sem. *, test-t p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.

FIG. 7: Se analizaron las crías macho de las madres tratadas con betaína (grupo B, círculos/barras negras), antibióticos (grupo AB, triángulos blancos/barras punteadas), antibióticos y betaína (grupo AB-B, triángulo negro/barras punteadas), o sin suplemento (grupo C, círculos/barras blancas) (n=12 de 3 camadas/grupo). A) El peso corporal se controló hasta las 24 semanas de edad; el eje Y representa el peso corporal en g; el eje X representa la edad en semanas. B) Peso del hígado (L) y del depósito de eWAT tras el sacrificio; el eje Y representa el peso del tejido en g. C) Tolerancia a la glucosa a las 22 semanas de edad; el eje Y representa la concentración de glucosa en mg/dL; el eje X representa el tiempo en minutos. D) Expresión relativa del ARNm de los marcadores inflamatorios Ccl2m y Cd11c en eWAT (n=8-12/grupo). Los datos son media±sem. *, ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Tukey p<0,05 en comparación con los controles.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está relacionada con la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y trastornos asociados mediante la administración de un compuesto de betaína a los bebés.

"La obesidad" es una condición en la que la reserva natural de energía, almacenada en el tejido graso de los animales, en particular de los humanos y otros mamíferos, aumenta hasta un punto en el que se asocia con ciertas condiciones de salud o con un aumento de la mortalidad. La expresión "acumulación excesiva de grasa" se entiende como tener más grasa corporal de la que es óptima para la salud. La "acumulación excesiva de grasa" también puede denominarse "sobrepeso". La obesidad y la acumulación excesiva de grasa suelen definirse por el índice de masa corporal de un individuo. "Índice de masa corporal" o "IMC" significa la relación entre el peso en kg dividido por la altura en metros, al cuadrado. "Obesidad" se define generalmente para un adulto humano como tener un IMC superior a 30. "Sobrepeso" se considera generalmente para los adultos humanos como un IMC de 25 a 30. En el caso de los niños de más de 2 años, el IMC se representa en un gráfico de crecimiento del IMC en función de la edad (tanto para las niñas como para los niños) para obtener una clasificación percentil. En el caso de los niños menores de 2 años (bebés), lo que se representa es el peso por la longitud en lugar del IMC. Los percentiles y las puntuaciones z son los indicadores más utilizados para evaluar el tamaño y los patrones de crecimiento de cada niño. El percentil indica la posición relativa del IMC o del peso para la talla del niño en una población de individuos del mismo sexo y edad. La puntuación z indica el número de desviaciones estándar (SDS) que un individuo se desvía de la media de una población con el mismo sexo y edad. Los niños humanos se consideran con sobrepeso si su IMC o percentil de peso por talla se sitúa entre el percentil 85 y el 95, o la puntuación z entre 1 y 2 SDS. Los niños humanos se consideran obesos si su IMC o percentil de peso por longitud se sitúa en el percentil 95 o por encima de él, o la puntuación z es igual o superior a 2 SDS.

El término "desnutrición", también denominado "subalimentación", se entiende como la falta de nutrición adecuada resultante de una alimentación insuficiente, una dieta desequilibrada o una asimilación defectuosa. La desnutrición también puede producirse como resultado de ciertas enfermedades o condiciones genéticas. Los bebés humanos suelen denominarse desnutridos si su IMC o peso por talla se sitúa en el percentil 10 o por debajo de él. La desnutrición grave en los bebés humanos suele considerarse si el IMC o el peso por talla se sitúan en el percentil 3 o por debajo de él.

Los trastornos metabólicos asociados al sobrepeso, la obesidad y/o la acumulación excesiva de grasa son bien conocidos por los expertos. Por ejemplo, estos trastornos incluyen enfermedades cardiovasculares como la cardiopatía coronaria, la resistencia a la insulina, la diabetes de tipo 2, la hipertensión, la apnea del sueño, los problemas respiratorios y/o la dislipidemia, pero también algunos cánceres como el de endometrio, de mama y/o de colon, los accidentes cerebrovasculares, las enfermedades del hígado y de la vesícula biliar, la artrosis y/o los problemas ginecológicos. En particular, en las realizaciones de la invención, los trastornos metabólicos que se asocian a la obesidad y/o a la acumulación excesiva de grasa se seleccionan entre la cardiopatía coronaria, la resistencia a la insulina, la diabetes de tipo 2, la hipertensión, la dislipidemia y la apnea del sueño, más particularmente con la cardiopatía coronaria, la hipertensión, la dislipidemia y la apnea del sueño.

En el sentido de la presente invención, el término "infancia" se entiende como el periodo de tiempo en el que un sujeto tiene una edad para la que se recomienda la lactancia materna, ya sea como único medio de alimentación o combinada con fórmulas infantiles y/o alimentos sólidos. En los seres humanos, la infancia suele considerarse desde los 0 hasta los 2 años de edad aproximadamente, es decir, desde el nacimiento hasta los 2 años de edad aproximadamente. Sin embargo, el experto entenderá que el término "infancia", al igual que los términos "niñez", "adolescencia" y "edad adulta", no es un término absoluto, ya que depende de la maduración de cada individuo. Así, cada uno de estos términos se asocia a una franja de edad media, más que a una franja de edad exacta.

Por "niñez" se entiende, en el sentido de la presente invención, el período comprendido entre la infancia y el comienzo de la pubertad. "Pubertad" se define generalmente como el proceso de cambios físicos a través del cual el cuerpo de un niño madura hasta convertirse en un cuerpo adulto capaz de reproducirse sexualmente. Los términos "pubertad" y "adolescencia" se utilizan indistintamente. Por término medio, las niñas comienzan la pubertad alrededor de los 10-11 años y los niños alrededor de los 11-12 años. Por lo tanto, para los humanos, la "infancia" se expande en promedio desde los 3 hasta los 12 años de edad. La "pubertad" se extiende en los seres humanos, por término medio, desde los 13 hasta los 18 años.

"La edad adulta" se define generalmente como el periodo que comienza a partir del final de la pubertad, cuando el individuo está en pleno crecimiento y madurez sexual. En el contexto humano, el término adulto tiene además significados asociados a conceptos sociales y legales. En el sentido de la presente invención, el término "edad adulta" se refiere preferentemente a la edad adulta biológica, que en los seres humanos comienza alrededor de los 18 años hasta la muerte del individuo.

"Prevención" se entiende en el sentido de evitar el desarrollo de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores, así como de reducir la probabilidad de desarrollar la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores.

En el sentido de la presente invención, "madre" es la mujer que amamanta al sujeto cuando es un bebé. La madre suele ser, aunque no necesariamente, la progenitora del sujeto.

Por "infección" se entiende la invasión de los tejidos corporales de un organismo por agentes causantes de enfermedades (a menudo llamados patógenos), su multiplicación y la reacción de los tejidos del huésped a estos organismos y a las toxinas que producen. Las infecciones son la causa de un gran número de enfermedades.

La expresión "cantidad eficaz", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en cierta medida, uno o más de los síntomas de la condición que se aborda. La dosis particular del compuesto administrado de acuerdo con esta invención se determinará, por supuesto, por las circunstancias particulares que rodean el caso, incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, la condición particular que se está tratando, y consideraciones similares. Cuando la composición de la invención es una composición farmacéutica, la "cantidad efectiva" es una "cantidad terapéuticamente efectiva".

La expresión "excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición farmacéutica. También debe ser adecuado para su uso en contacto con el tejido u órgano de los seres humanos y los animales sin una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. Del mismo modo, la expresión "excipientes y/o vehículos comestibles aceptables" se refiere a los ingredientes, materiales, composiciones o vehículos que son aceptables para las composiciones comestibles, como los productos alimentarios, nutracéuticos o suplementos dietéticos. Los "excipientes y/o vehículos comestibles aceptables" deben ser ingredientes de grado alimentario. Cada componente debe ser comestiblemente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición comestible. También debe ser adecuado para su uso cuando se ingiere sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones acordes con una relación beneficio/riesgo razonable.

Los términos "suplemento dietético", "suplemento alimenticio" o "suplemento nutricional" o "nutracéutico", tal y como se utilizan en este documento, se refieren indistintamente a un preparado destinado a complementar la dieta y a proporcionar nutrientes que pueden faltar o que no se consumen en cantidad suficiente en la dieta de una persona. Por "fórmula infantil" se entiende, en general, un alimento manufacturado diseñado y comercializado para alimentar a los bebés y, por lo general, preparado para la alimentación con biberón o taza a partir de polvo (mezclado con agua) o líquido (con o sin agua adicional).

"Compuesto de betaína" en el sentido de la presente invención se entiende como compuestos zwitteriónicos como la glicina betaína (también llamada N,N,N-trimetilamonioacetato o N,N,N-trimetilglicina) y compuestos similares a la glicina betaína derivados de otros aminoácidos.

En una realización, el compuesto de betaína tiene la fórmula (I):

en la que:

X es N o As;

R1 y R2 son independientemente (C1-C6)alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; y R3 y R4 forman un anillo de 5 a 6 miembros junto con los átomos a los que están unidos que está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, halógeno y (C1-C3)alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; o alternativamente

R3 es (C1-C6)alquilo; y

R4 es H o (1H-indol-3-il)metilo.

El término "(C1-Cn)-alquilo", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una cadena lateral de hidrocarburo saturada, ramificada o lineal, con 1 a n átomos de carbono.

En particular, el compuesto de betaína se selecciona entre la glicina betaína, la arsenobetaína, la prolina betaína, la 4-hidroxiprolina betaína y el triptófano betaína, representados, respectivamente, por las fórmulas II a VI:

Fórmula II (glicina betaína)

Fórmula IV (prolina betaína)

Fórmula V (betaína 4-hidroxiprolina)

En otra realización particular, el compuesto de betaína se selecciona entre la glicina betaína, la arsenobetaína y la prolina betaína. En otra realización, el compuesto de betaína es glicina betaína.

La presente invención tiene aplicación en mamíferos, en el ámbito veterinario o medicinal. La invención es útil en particular en los campos de la salud de los animales domésticos, la salud del ganado y la salud humana. Preferentemente, la presente invención encuentra aplicación en la salud humana. Así, en una realización preferida del primer aspecto de la invención, el compuesto de betaína es para su administración a los seres humanos.

En realizaciones preferidas del primer aspecto de la invención, el compuesto de betaína es para la prevención de la obesidad.

Curiosamente, los inventores han encontrado consecuencias metabólicas beneficiosas duraderas, incluida la reducción de la acumulación de grasa, cuando se administra el compuesto de betaína sólo durante la infancia. Los datos experimentales indican claramente que una mayor exposición al compuesto de betaína durante los primeros años de vida (la infancia) podría ser suficiente para reducir la adiposidad y mejorar la salud metabólica más adelante. Este hallazgo es ventajoso para proporcionar finalmente una estrategia largamente buscada para la prevención de la obesidad y los trastornos asociados, en particular para la prevención de la obesidad infantil. Por lo tanto, en una realización de la presente invención la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores comprende la prevención después de la infancia, es decir, en la niñez del sujeto, en la adolescencia del sujeto y/o en la edad adulta del sujeto. En otra realización, la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados con cualquiera de los anteriores comprende la prevención a partir de los 3 años de edad, a partir de los 13 años de edad y/o a partir de los 18 años de edad.

Algunos sujetos tienen un mayor riesgo de desarrollar obesidad, acumulación excesiva de grasa y/o trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores. Las intervenciones para reducir la probabilidad de desarrollar estas condiciones en dicha población de riesgo son particularmente beneficiosas. Así, en una realización particular del primer aspecto de la invención, los sujetos están en riesgo de padecer obesidad, acumulación excesiva de grasa y/o trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores.

Algunos factores de las primeras etapas de la vida se han asociado claramente con el sobrepeso, la obesidad y los trastornos asociados más adelante, es decir, durante la infancia, la adolescencia y/o la edad adulta. Entre ellos, son especialmente representativos la obesidad y la diabetes maternas, la desnutrición del feto, el aumento excesivo de peso durante la gestación, la falta de lactancia materna, el tabaquismo de la madre y el rápido crecimiento del bebé. Estos factores de riesgo pueden deberse al estilo de vida o a razones genéticas. Aunque la asociación puede ser modesta para cada uno de los factores de riesgo, se puede conseguir un gran efecto cuando se actúa sobre un riesgo atribuible pequeño si el factor de riesgo es muy prevalente en una población. Además, algunos posibles determinantes pueden ser más importantes que otros porque son más fáciles de abordar mediante la aplicación de una intervención eficaz. En una realización particular del primer aspecto de la invención, los sujetos tienen una condición seleccionada entre haber nacido de madres obesas, haber sufrido un retraso en el crecimiento intrauterino, tener bajo peso al nacer (en particular un peso para la talla situado en el percentil 3 o por debajo de él), tener un rápido aumento de peso después del nacimiento, y combinaciones de las mismas.

Según los hallazgos de los inventores, el aumento de la ingesta de betaína durante la lactancia disminuyó la adiposidad y mejoró el metabolismo sistémico durante la edad adulta. Por lo tanto, una estrategia eficaz para prevenir la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos asociados puede ser alimentar a las madres lactantes con un compuesto de betaína. En una realización particular del primer aspecto de la invención, el compuesto de betaína se administra a la madre del sujeto durante la lactancia. Sin embargo, esta estrategia no siempre es posible, ya que algunos bebés son alimentados principalmente o únicamente con fórmulas infantiles. Además, los bebés alimentados con fórmula tienen un mayor riesgo de crecimiento acelerado y obesidad. La prevención de la obesidad mediante la administración del compuesto de betaína a estos bebés es deseable. Así, en otra realización del primer aspecto de la invención, el compuesto de betaína se administra directamente al sujeto durante la infancia. La administración directa al sujeto durante la infancia puede lograrse, por ejemplo, mediante la inclusión del compuesto de betaína en la fórmula infantil, la comida para bebés o los suplementos dietéticos para bebés. La administración directa a los sujetos durante la infancia también puede ser en forma de una solución que contenga el compuesto de betaína y excipientes y/o vehículos apropiados para la administración oral, por ejemplo, con una jeringa o con un gotero. En otra realización del primer aspecto de la invención, el compuesto de betaína se administra a un sujeto humano masculino durante la infancia. En otra realización del primer aspecto de la invención, el compuesto de betaína se administra a un sujeto humano femenino durante la infancia.

Los inventores han encontrado que la cantidad de compuesto de betaína que se necesita para obtener el efecto de prevenir la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores está muy por encima de lo que se puede obtener con la dieta natural, y también está muy por encima de lo que se podría obtener aumentando la ingestión de fuentes naturales de betaína. En general, los inventores han encontrado que la cantidad de compuesto de betaína que necesita ser administrada directamente al sujeto durante la infancia para lograr el efecto buscado puede ser de 2 a 500 mg/Kg/día, en particular de 4 a 100 mg/Kg/día, más particularmente de 4 a 50 mg/Kg/día. Así, otra realización de la invención se refiere a un compuesto de betaína para su uso como se ha definido anteriormente, en el que la prevención y/o el tratamiento comprende la administración directa al sujeto durante la infancia de 4 a 100 mg de compuesto de betaína/Kg/día. Esto también se denomina generalmente "dosis diaria". Cuando el compuesto de betaína se administra a la madre del sujeto durante la lactancia, la dosis diaria a administrar a la madre puede ser de 500 mg a 20 g por día, en particular de 1 a 10 g/día, más particularmente de 2 a 6 g/día. Así, otra realización de la invención se refiere a un compuesto de betaína para su uso como se ha definido anteriormente, en el que la prevención y/o el tratamiento comprende la administración de 1 a 10 g de compuesto de betaína/día a la madre del sujeto durante la lactancia.

La presente invención contempla la administración del compuesto de betaína como un compuesto de betaína puro, por ejemplo, en forma de polvo para ser ingerido directamente o disuelto en líquidos. La invención, sin embargo, contempla adicionalmente la formulación del compuesto de betaína como composición que comprende una cantidad efectiva de compuesto de betaína junto con otros ingredientes, tales como excipientes y/o vehículos.

Un segundo aspecto de la invención proporciona, por tanto, una composición que comprende una cantidad efectiva de compuesto de betaína junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente o comestibles aceptables para su uso, tal como se ha definido anteriormente. La cantidad efectiva en la composición puede ser determinada por el experto teniendo en cuenta el compuesto administrado, la dosis diaria, la vía de administración, la edad del sujeto, el peso del sujeto y otras consideraciones. La composición de la invención puede administrarse una vez al día, una vez a la semana, varios días a la semana o varias veces al día.

En una realización del segundo aspecto de la invención, la composición para su uso como se ha definido anteriormente es una composición farmacéutica y los excipientes son excipientes farmacéuticamente aceptables. En otra realización, la composición para el uso definido anteriormente es un suplemento dietético y los excipientes son excipientes comestibles. En particular, la composición es un suplemento dietético para mujeres en periodo de lactancia. En otra realización particular, la composición es un suplemento dietético para bebés.

Las composiciones farmacéuticas y los suplementos dietéticos de la invención pueden formularse en varias formas que incluyen, pero no se limitan a, soluciones, comprimidos, cápsulas, gránulos, suspensiones, dispersiones, polvos, pastillas, caramelos masticables, barras de caramelo, concentrados, gotas, elixir, emulsión, película, gel, gránulo, goma de mascar, jalea, aceite, pasta, pastilla, gránulo, jarabe, forma de gelatina masticable o comprimido masticable. La selección de los excipientes y los métodos más apropiados para la formulación en vista del propósito particular de la composición está dentro del alcance de las personas expertas en la materia. Por ejemplo, las gotas, las soluciones, los jarabes y las suspensiones pueden ser más apropiados para la administración del compuesto de betaína directamente a los bebés, mientras que el polvo, los comprimidos y las cápsulas pueden ser más apropiados para la administración del compuesto de betaína a la madre lactante. En general, se prefieren las composiciones farmacéuticas y los suplementos dietéticos de administración oral.

Otras realizaciones del segundo aspecto de la invención proporcionan la composición que comprende una cantidad efectiva de compuesto de betaína junto con excipientes y/o vehículos comestibles aceptables para su uso como se ha definido anteriormente, donde la composición es un producto comestible. En una realización particular, la composición es un producto infantil comestible. En otra realización, la composición comestible es una fórmula infantil.

Los ejemplos que se presentan a continuación demuestran que una mayor ingesta de betaína durante la lactancia disminuyó la adiposidad y mejoró el metabolismo sistémico más adelante en la vida. Sin querer ceñirse a la teoría, los inventores piensan que las mejoras inducidas por la betaína en la salud metabólica de la descendencia pueden estar mediadas por la modulación de la microbiota intestinal del lactante. Esta teoría está respaldada por las pruebas obtenidas en relación con la capacidad de la betaína para promover el crecimiento de ciertas comunidades bacterianas intestinales beneficiosas y por la disrupción de los efectos de la betaína a consecuencia del tratamiento continuado con antibióticos.

La microbiota intestinal desempeña un papel importante en la salud y la enfermedad. Ejerce importantes actividades metabólicas extrayendo energía de polisacáridos dietéticos que de otro modo serían indigeribles, como el almidón resistente y las fibras dietéticas. Estas actividades metabólicas también conducen a la producción de nutrientes importantes, como los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), las vitaminas (por ejemplo, la vitamina K, la vitamina B12 y el ácido fólico) y los aminoácidos, que los seres humanos no pueden producir por sí mismos. Además, la microbiota intestinal participa en la defensa contra los patógenos mediante mecanismos como la resistencia a la colonización y la producción de compuestos antimicrobianos. Además, la microbiota intestinal participa en el desarrollo, la maduración y el mantenimiento de las funciones sensoriales y motoras gastrointestinales, la barrera intestinal y el sistema inmunitario de la mucosa. Cada vez hay más pruebas de que la disbiosis de la microbiota intestinal está asociada a la patogénesis de trastornos tanto intestinales como extraintestinales. "Disbiosis" es un término que designa el desequilibrio o la mala adaptación de la microbiota intestinal.

La modulación beneficiosa de la microbiota intestinal proporcionada por la suplementación con betaína puede, por tanto, dar lugar a beneficios adicionales. La presente divulgación también se refiere a un compuesto de betaína para su uso en la modulación beneficiosa de la microbiota intestinal. Por modulación beneficiosa se entiende el aumento del crecimiento de las comunidades microbianas intestinales beneficiosas. La presente descripción también se refiere a un compuesto de betaína para su uso en la prevención y/o el tratamiento de trastornos asociados a la disbiosis de la microbiota intestinal en un sujeto, donde la prevención y/o el tratamiento comprenden la administración del compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. Esto puede reformularse como el uso de un compuesto de betaína para la preparación de una composición para la prevención y/o el tratamiento de trastornos asociados a la disbiosis de la microbiota intestinal en un sujeto, donde la composición se administra directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. La divulgación también se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de trastornos asociados a la disbiosis de la microbiota intestinal que comprende la administración directa a un sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia, de una cantidad eficaz de un compuesto de betaína, junto con excipientes y/o vehículos farmacéutica o comestiblemente aceptables. Dichos trastornos incluyen la desnutrición, las infecciones, la enfermedad inflamatoria intestinal, el síndrome del intestino irritable (SII), la enfermedad celíaca, la alergia, el asma, así como la obesidad y los trastornos asociados, como las enfermedades cardiovasculares, la resistencia a la insulina, la diabetes de tipo 2; la hipertensión, la apnea del sueño, los problemas respiratorios, la dislipidemia y el cáncer.

En el contexto de los beneficios proporcionados por la suplementación con betaína, los inventores también han descubierto que la betaína promueve la integridad de la barrera intestinal (véase el ejemplo 2.4 y la figura 4). La presente divulgación también se refiere a un compuesto de betaína para su uso en el mantenimiento o mejora de la función de barrera intestinal en un sujeto, en el que el mantenimiento o mejora de la función de barrera intestinal comprende la administración del compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. Esto puede reformularse como el uso de un compuesto de betaína para la preparación de una composición para mantener o mejorar la función de barrera intestinal en un sujeto, en la que la composición se administra directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. La divulgación también se refiere a un método para mantener o mejorar la función de barrera intestinal en un sujeto que comprende la administración directa al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia, de una cantidad eficaz de un compuesto de betaína, junto con excipientes y/o vehículos farmacéuticos o comestibles aceptables. En una realización particular, el sujeto es un ser humano. En otra realización particular, el sujeto es un animal.

La desnutrición infantil provoca una disbiosis intestinal y un deterioro de la función de la barrera intestinal, lo que tiene múltiples consecuencias para el niño, como la mala absorción de nutrientes, el deterioro del crecimiento y el desarrollo cognitivo, la translocación de bacterias (endotoxemia) y la inflamación sistémica. Esto puede tener consecuencias críticas, desde el retraso en el crecimiento hasta la peritonitis. Por lo tanto, mejorar o mantener la función de la barrera intestinal en los bebés desnutridos podría afectar potencialmente a la absorción y el metabolismo de aminoácidos, proteínas, lípidos, carbohidratos y otros nutrientes.

El mantenimiento o la mejora de la función de barrera intestinal no sólo contribuye a mejorar la salud metabólica de la descendencia, sino que tiene otros beneficios, en particular, en la prevención de la endotoxemia y las infecciones. Esto es especialmente relevante para los bebés con riesgo de sufrir infecciones frecuentes, como los bebés desnutridos.

La presente divulgación se refiere además a un compuesto de betaína para su uso en la prevención de infecciones en un sujeto, donde la prevención comprende la administración del compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. Esto puede reformularse como el uso de un compuesto de betaína para la preparación de una composición para la prevención de infecciones en un sujeto, en la que la composición se administra directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia. La divulgación también se refiere a un método de prevención de infecciones en un sujeto que comprende la administración directa al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia, de una cantidad eficaz de un compuesto de betaína, junto con excipientes y/o vehículos farmacéutica o comestiblemente aceptables. En una realización particular, el sujeto es un ser humano. En otra realización particular, el sujeto es un animal.

Todas las realizaciones descritas anteriormente para la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores también se aplican a la prevención y/o el tratamiento de los trastornos asociados a la disbiosis de la microbiota intestinal, al mantenimiento o la mejora de la función de barrera intestinal y a la prevención de las infecciones. El compuesto de betaína, como se ha definido anteriormente, se selecciona preferentemente de entre la glicina betaína, la arsenobetaína, la prolina betaína, la 4-hidroxiprolina betaína y el triptófano betaína, más preferentemente de entre la glicina betaína, la arsenobetaína y la prolina betaína, y aún más preferentemente es la glicina betaína.

Como se ha descrito anteriormente, el compuesto de betaína puede administrarse al lactante a través de la leche materna, es decir, alimentando con el compuesto de betaína a la madre del sujeto durante la lactancia, o, alternativamente, puede administrarse directamente al sujeto durante la infancia, por ejemplo, como suplemento dietético o incluido en la fórmula o la comida para lactantes. La dosis diaria del compuesto de betaína que debe administrarse directamente al lactante para obtener los beneficios mencionados puede ser de 2 a 500 mg/Kg/día, en particular de 4 a 100 mg/Kg/día, más particularmente de 4 a 50 mg/Kg/día. Cuando el compuesto de betaína se administra a la madre del sujeto, la dosis diaria puede ser de 500 mg a 20 g por día, en particular de 1 a 10 g/día, más particularmente de 2 a 6 g/día

La dosis diaria eficaz del compuesto de betaína según la presente divulgación puede administrarse mediante la ingestión directa del compuesto de betaína puro, por ejemplo en forma de polvo para ser ingerido directamente o disuelto en líquidos. Sin embargo, la presente divulgación también está relacionada con una composición que comprende una cantidad eficaz de compuesto de betaína junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéutica o comestiblemente aceptables para su uso en la prevención y/o tratamiento de trastornos asociados a la disbiosis de la microbiota intestinal, para mantener o mejorar la función de barrera intestinal y para prevenir infecciones, como se ha definido anteriormente. La composición puede ser una composición farmacéutica con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables o, alternativamente, un suplemento dietético con excipientes y/o vehículos comestibles aceptables o, alternativamente, un producto comestible con excipientes y/o vehículos comestibles. Cuando la composición es un producto comestible puede ser, por ejemplo, una fórmula infantil.

Al considerar la prevención de las infecciones, éstas son, en particular, infecciones intestinales, por ejemplo, infecciones que causan gastroenteritis, como los enteropatógenos. Además, la prevención de infecciones, preferentemente intestinales, puede comprender la prevención durante la infancia y/o la niñez. La presente divulgación también contempla que los sujetos pueden ser sujetos con riesgo de padecer infecciones, en particular por padecer desnutrición y/o por ser objeto de tratamientos antibióticos.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" abarca el caso de "consistente en". Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención se harán evidentes para los expertos en la materia tras el examen de la descripción o podrán aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden ser limitativos de la presente invención. Además, la presente invención abarca todas las combinaciones posibles de las realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos

La betaína en todos los ejemplos es glicina betaína.

1. Materiales y métodos

1.1. Diseño del estudio en humanos

Brevemente, las madres con lactancia materna exclusiva y los bebés llegaron entre las 8:00 y las 10:00 de la mañana al campus de la Universidad de Ciencias de la Salud de Oklahoma (Oklahoma City, Ok, EE.UU.). Se animó a la madre a vaciar todo el pecho utilizando un sacaleches de uso hospitalario. Nuestra principal variable de resultado para el presente estudio fue la puntuación z de peso por longitud (WLZ) al mes de edad, ajustada por el WLZ de nacimiento (y otras covariables). Esto es algebraicamente idéntico a la diferencia de WLZ entre el nacimiento y el primer mes de vida ajustado por el WLZ del nacimiento, y por lo tanto refleja el cambio en el WLZ durante el primer mes de vida.

1.2. Análisis de la metabolómica de la leche

Los metabolitos de un carbono s-adenosilmetionina (SAM), s-adenosilhomocisteína (SAH), metionina, cistationina, colina y betaína, se determinaron por LC-MS/MS como se describió anteriormente (M. Inoue-Choi, et al, One-carbon metabolism nutrient status and plasma s-adenosylmethionine concentrations in middle-aged and older Chinese in Singapore. Int J Mol Epidemiol Genet 3, 160-173 (2012)). El 5-metiltetrahidrofolato se midió por LC-MS/MS como se describió previamente (E. Arning, et al, Quantitation of 5-methyltetrahydrofolate in cerebrospinal fluid using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Methods Mol Biol 1378, 175-182 (2016)). La homocisteína total se midió por LC-MS/MS.

Para este análisis, las muestras se prepararon añadiendo 10 pl de leche materna o estándares a 120 pl de solución de estándar interno (que contenía d4-homocisteína en 4 mM de ditiotreitol disuelto en agua destilada). Tras la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, las muestras se desproteinizaron con 200 pl de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1%, y se centrifugaron a 1.400 rpm durante

5 minutos. Las muestras se analizaron tras la inyección de 10 pL de extracto en un Synergi Hydro 4p 150x3mm (Phenomenex), mantenido a 30 °C, y eluyendo en un gradiente con tampón A (100% agua, 0,5% ácido fórmico y 0,25% ácido heptafluorobutírico) y tampón B (100% acetonitrilo, 0,5% ácido fórmico 0,25% ácido heptafluorobutírico). La velocidad de flujo fue de 0,5 mL/min, con un gradiente por pasos durante un tiempo total de ejecución de 10 minutos. La espectrometría de masas se realizó en un 4000 QTrap (Sciex, Framingham, MA) y los valores observados (m/z) de los iones de fragmento fueron homocisteína (m/z 136^ 90) y d4-homocisteína (m/z 140^ 94). Todos los datos se recogieron y procesaron con el software Analyst v1.4.2 (Sciex, Framingham, MA).

1.3. Cuidados y tratamientos de los animales

Todos los protocolos de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Barcelona (España). Los ratones se alojaron en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas con libre acceso a comida y agua. Se aparearon ratones ICR-CD1 (Envigo) machos y hembras para obtener la progenie. Para minimizar la variabilidad del crecimiento, las camadas se ajustaron a 8 crías por madre al nacer, eliminando los ratones más pesados y los más ligeros. Se administró glicina betaína (1% p/vol), ampicilina (1 g/L) y neomicina (0,5 g/L) (Sigma-Aldrich) en el agua durante la lactancia. Tras el destete, los ratones se alojaron en 4 por jaula y fueron alimentados con la dieta Teklad 2014 (Envigo). Para la obesidad inducida por la dieta, se suministró una dieta alta en grasas (HFD, 45% kcal de grasa) (D12451, Research Diets). Para los estudios de obesidad materna, se alimentó a las hembras de 6 semanas de edad con una HFD durante 8 semanas antes del apareamiento; esta misma dieta se mantuvo durante la gestación y la lactancia. Para evaluar la ingesta de leche, se separó a las crías de las madres durante 2 horas y se las devolvió a sus jaulas durante 1 hora; la diferencia de peso corporal antes y después de la alimentación se expresó como gramos por peso corporal inicial por hora. Para la recogida de leche, se tomaron muestras manualmente bajo anestesia (pentobarbital, 40 mg/kg) el día 14 después del nacimiento; las madres y las crías fueron sacrificadas después de la recogida de leche, y se obtuvo el contenido cecal para los estudios del microbioma. La composición corporal se determinó mediante un sistema de resonancia magnética Bruker Biospect de 7,0 T (Bruker Medical Gmbh, Alemania). Se midió la calorimetría indirecta en jaulas metabólicas (PhenoMaster/LabMaster, TSE Systems GmbH, Alemania); se monitorizaron el O² , el CO² , la ingesta de alimentos y la actividad locomotora durante 48 horas, y los datos se analizaron mediante ANOVA de 2 vías para medidas repetidas. Se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (1,5 g/kg) y a la insulina (0,6 U/kg) tras un ayuno de 16 o 4 horas, respectivamente. Los ratones fueron anestesiados (pentobarbital intraperitoneal, 50 mg/kg) y sacrificados entre las 9 y las 11 horas.

1.4. Análisis bioquímicos

Las muestras de leche de ratón se diluyeron 1:3 antes del análisis de macronutrientes mediante espectroscopia de infrarrojo medio en un analizador Miris (Miris AB). Las concentraciones relativas de betaína se determinaron por cromatografía líquida (columna Acquity UPLC BEH HILIC, Waters) acoplada a espectrometría de masas (QqQ/MS 6490, Agilent). La insulina plasmática se determinó mediante ELISA (Millipore). La MCP-1, IL-6 y PAI-1 plasmáticas se midieron mediante Milliplex Map (EMD Millipore, Merck). Los triglicéridos hepáticos y fecales se cuantificaron en extractos de cloroformo-metanol de hígado o heces (50 mg) utilizando el kit de ensayo de triglicéridos (Sigma-Aldrich).

1.5. Análisis de la expresión génica

El ARN total de los tejidos se aisló con el reactivo TRI (Sigma-Aldrich) y el ADNc se obtuvo con el kit de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La qPCR se realizó con SybrGreen (Takara Bio), utilizando Hprt como gen de mantenimiento. Las secuencias de los cebadores son las siguientes

Ccl2 forward: 5'-CAAGATGATCCCAATGAGTAG-3' (SEQ ID NO: 1)

Ccl2 reverso: 5'-TTGGTGACAAAAACTACAGC-3' (SEQ ID NO: 2)

Tlr4 forward: 5'-GCCTCCCTGGCTCCTGGCTA-3' (SEQ ID NO: 3)

Tlr4 reverso: 5'-CAGGGACTTTGCTGAGTTTCTGATCCA-3' (SEQ ID NO: 4)

Cd11c forward: 5'-AGTCTGTTGGTTCTGTAAG-3' (SEQ ID NO: 5)

Cd11c reverso: 5'-ACAGTTCTGTTATGACATGC-3' (SEQ ID NO: 6)

Hprt forward: 5'-GCCCCAAAATGGTTAAGGTTG-3' (SEQ ID NO: 7)

Hprt reverso: 5'-GTCAAGGGCATATCCAACAAC-3' (SEQ ID NO: 8)

Muc2 forward: 5'-CTGACCAAGAGCGAACACAA-3' (SEQ ID NO: 9)

Muc2 reverso: 5'-CATGACTGGAAGCAACTGGA-3' (SEQ ID NO: 10)

1.6. Análisis histológico

Los tejidos se fijaron por inmersión en formol, se incluyeron en parafina y se tiñeron las secciones con hematoxilina/eosina. Para el WAT, se midió el área de adipocitos en 30 campos microscópicos aleatorios por animal (10-20 células/campo). Para el íleon, los cortes transversales se tiñeron con el método de ácido periódico-Schiff (PAS). Se analizaron diez vellosidades por ratón de 5-6 secciones. Se determinó el número de células caliciformes por vellosidad y se expresó como número de células por 100 pm. Los análisis se realizaron con ImageJ por un investigador que no conocía la identificación de la muestra.

1.7. Análisis del microbioma intestinal

Se recogió el contenido cecal de ratones machos de 2 y 6 semanas de edad procedentes de madres magras de control y tratadas con betaína y se almacenó a -80°C hasta que se aisló el ADN bacteriano utilizando el kit de aislamiento de ADN PowerSoil® (MOBIO Laboratories). La composición microbiana se analizó utilizando el sistema Illumina MiSeq para secuenciar la región V3-V4 del gen 16S rRNA. Las lecturas pareadas se procesaron con QIIME v1.9 y se asignaron a los niveles de filo, clase, orden, familia, género y especie. La diversidad dentro de la muestra se estimó con una profundidad de rarefacción de 4827 lecturas por muestra, y la diversidad filogenética se expresó en función de la profundidad de la secuencia. Se utilizaron distancias UniFrac no ponderadas para realizar el análisis de coordenadas principales (PCoA). Las diferencias en la abundancia relativa se determinaron utilizando LEfSe (N. Segata, et al, Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol 12, R60 (2011)).

1.8. Análisis estadístico

A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± sem. Los datos de los metabolitos de la leche humana se transformaron en logaritmos y se aplicó una regresión multivariante en

SPSS 19.0 (Armonk, NY: IBM Corp.). Para determinar la significación estadística se aplicó la prueba t de

dos colas, la prueba U de Mann-Whitney para datos con distribución no normal, o el ANOVA de una vía

con la prueba post-hoc de Tukey para más de dos grupos. P<0,05 se consideró significativo para todos

los análisis.

2. Resultados

2.1. Los niveles de betaína en la leche materna están inversamente relacionados con el crecimiento temprano del bebé en los seres humanos

Para determinar si los metabolitos del carbono de la leche estaban asociados con el sobrepeso materno y el crecimiento del lactante, se estudiaron 34 díadas madre-lactante en un rango de IMC materno (18,5-47,2 kg/m2), que fueron alimentadas exclusivamente con leche materna (Tabla 1). El sobrepeso u obesidad materna (OWO) dio lugar a una mayor puntuación z de peso para la longitud (WLZ), masa grasa y masa magra del lactante al mes en comparación con las madres de peso normal (NW) (Tabla 1).

Tabla 1. Características demográficas y metabólicas de los participantes.

Todo NW OWO

n=34 n=15 n=19 Valor p MADRE

Edad (años) 29,1 (5,1) 27,7 (5,5) 30,1 (4,7) 0,182 IMC antes del embarazo (kg/m2) 27,3 (7,1) 21,6 (1,8) 31,8 (6,4) <0,001 INFANTE

Nacimiento

Sexo (femenino/masculino) 19/15 9 / 6 10/9 0,668 Edad gestacional (semanas) 39,6 (1,2) 39,4 (1,1) 39,8 (1,2) 0,295 Peso (kg) 3,53 (0,48) 3,39 (0,51) 3,64 (0,45) 0,148 Longitud (cm) 51,6 (2,3) 51,6 (2,3) 51,6 (2,3) 0,989 WLZ -0,59 (1,20) -1,07 (1,30) -0,21 (1,00) 0,035 1 mes

Peso (kg) 4,67 (0,71) 4,45 (0,63) 4,84 (0,73) 0,115 Longitud (cm) 55,8 (2,1) 55,8 (2,1) 55,8 (2,2) 0,955 WLZ -0,36 (1,04) -0,87 (0,91) 0,05 (0,98) 0,008 Perímetro cefálico (cm) 38,3 (1,3) 38,4 (1,4) 38,2 (1,3) 0,676 Masa de grasa DXA (%) 24,1 (2,8) 22,9 (3,0) 25,0 (2,4) 0,027 Masa de grasa DXA (kg) 1,19 (0,29) 1,06 (0,27) 1,30 (0,26) 0,013 Masa magra DXA (kg) 3,64 (0,50) 3,45 (0,46) 3,78 (0,48) 0,050 LECHE MATERNA

Colina (pmol/L) 96,8 (49,0) 96,3 (61,4) 97,1 (38,2) 0,541 Betaína (pmol/L) 3,12 (2,65) 3,34 (3,30) 2,95 (2,09) 0,951 Todo NW OWO

n=34 n=15 n=19 Valor p Metionina (pmol/L) 4,39 (2,69) 4,70 (3,51) 4,15 (1,89) 0,732 SAM (nmol/L) 1469 (436) 1427 (483) 1503 (406) 0,542 SAH (nmol/L) 216 (81) 201 (83) 227 (80) 0,279 Cistationina (nmol/L) 44,9 (34,3) 44,0 (35,4) 45,7 (34,3) 0,896 5-metiltetrahidrofolato (nmol/L) 29,5 (15,9) 27,0 (16,5) 31,5 (15,6) 0,420 Homocisteína (nmol/L) 207 (68) 215 (55) 201 (77) 0,529 Los valores representan la media (DE). La letra negrita indica p<0,05. a Prueba t de dos colas entre los grupos NW y OWO para las variables continuas; prueba chi-cuadrado de Pearson para las variables categóricas (género). NW: peso normal; OWO: sobrepeso u obesidad; WLZ: puntuación z de peso por longitud.

Se analizaron muestras de leche al mes del nacimiento para cuantificar colina, betaína, metionina, SAM, SAH, cistationina, 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) y homocisteína total (tHcy), y se encontraron correlaciones significativas entre los metabolitos. Una comparación categórica entre las madres NW y OWO no reveló diferencias en los niveles de metabolitos de la leche (Tabla 1). A continuación, examinamos las posibles asociaciones entre los analitos de la leche y la ZLT del lactante. Entre todos los metabolitos, la betaína fue la única variable significativamente correlacionada con el WLZ al mes de vida (r=-0,40, p=0,018), y sólo se observó una tendencia para la SAH y la cistationina (Tabla 2).

Tabla 2. Correlaciones multivariadas entre los metabolitos de la leche y la ZLT del lactante al mes de vida.

Todos los sujetos Peso normal

Sin ajustar Ajustada Sin ajustar Ajustada

r p val Ustd p val r p val Ustd p val

CHO -0,09 0,593 -0,07 0,666 0,01 0,981 0,05 0,890

BET -0,40 0,018 -0,37 0,041 -0,09 0,759 0,07 0,904

MET 0,08 0,649 0,15 0,441 0,16 0,557 0,11 0,760

SAM 0,04 0,822 -0,06 0,755 -0,10 0,716 0,16 0,720

SAH -0,29 0,094 -0,31 0,068 -0,14 0,609 0,07 0,854

CYSTA -0,34 0,050 -0,33 0,062 -0,34 0,216 -0,15 0,693

5-MTHF 0,13 0,449 0,10 0,568 0,32 0,248 0,17 0,614

tHCY -0,00 0,996 0,09 0,629 0,13 0,643 0,15 0,650

Sobrepeso y obesidad

Sin ajustar Ajustada

r p val Ustd p val

CHO -0,35 0,142 -0,38 0,200

BET -0,78 <0,001 -0,80 <0,001

MET 0,09 0,718 0,18 0,664

SAM 0,07 0,772 0,09 0,776

SAH -0,66 0,002 -0,83 0,001

CYSTA -0,43 0,070 -0,64 0,042

Los niveles de los metabolitos se transformaron en logaritmos y se evaluó la correlación con la WLZ de 1 mes. La letra negrita indica p<0,05. IJstd: coeficiente beta estandarizado del modelo de regresión; CHO: colina; BET: betaína; MET: metionina; SAM: s-adenosilmetionina; SAH: s-adenosilhomocisteína; CYSTA: cistationina; 5-MTHF: 5-metiltetrahidrofolato; tHCY: homocisteína total. aModelo ajustado por la edad materna, el IMC pregestacional, la edad gestacional y el WLZ al nacer.

El ajuste por edad materna, IMC pregestacional, edad gestacional y WLZ al nacer no modificó sustancialmente las estimaciones no ajustadas (Gstd=-0,37, p=0,041, Tabla 2). La correlación entre betaína y WLZ fue particularmente fuerte en los bebés de madres OWO (Gstd=-0,80, p<0,001), mientras que no se observó ninguna asociación en las madres NW (I3std=0,07, p=0,904; Tabla 2). Se observó un efecto similar dependiente de la obesidad para la HSA (Tabla 2). El contenido de betaína en la leche también se correlacionó con otros parámetros de crecimiento, incluido el índice ponderal, y no se observó ninguna correlación con el perímetro cefálico o las medidas de composición corporal (datos no mostrados).

En conjunto, estos resultados indican que los bebés nacidos de madres con obesidad pero expuestos a un mayor contenido de betaína en la leche mostraron un menor crecimiento al mes, en comparación con los bebés con una menor exposición a la betaína.

2.2. La betaína dietética se transfiere a la leche materna y disminuye la adiposidad de las crías en ratones Para estudiar si la betaína de la leche modula el crecimiento y el riesgo de obesidad, realizamos experimentos de suplementación materna en ratones exclusivamente durante la lactancia. Las madres fueron asignadas aleatoriamente a grupos de control (C) o de tratamiento (B, 1% de betaína en agua) el primer día después del parto. Se recogieron muestras de leche en el día 14 después del parto de un subconjunto de madres para determinar los niveles de betaína. La suplementación aumentó el contenido de betaína en la leche en 5 veces (p<0,0001, Figura 1A) sin alterar la composición de macronutrientes o el contenido energético (Figuras 1B-2C). Las crías de catorce días mostraron un aumento de la betaína en plasma (1,8 veces, p<0,05, Figura 1D). La suplementación no moduló los patrones de crecimiento de las crías durante la lactancia (Figura 1E) ni el consumo de leche (Figura 1F). Sin embargo, el análisis de la composición corporal a las 6 semanas de edad reveló una disminución de la masa grasa en los ratones macho tratados con betaína en comparación con los de control (p<0,05, Figura 2A). Otros parámetros metabólicos, como la tolerancia a la glucosa, la ingesta de alimentos, el gasto energético, el índice de intercambio respiratorio y los niveles de actividad, no difirieron entre los grupos de ratones jóvenes (datos no mostrados).

Para comprobar si la betaína interactúa con la obesidad materna, se administró un suplemento de betaína durante la lactancia en un modelo de ratón de obesidad materna. Las madres fueron alimentadas con una dieta alta en grasas (HFD) durante 8 semanas antes del apareamiento, y asignadas aleatoriamente a los grupos de control (MO-C) o de tratamiento con betaína (MO-B) en el momento del parto. La suplementación se realizó como se ha descrito anteriormente. La obesidad materna dio lugar a un aumento de peso de las crías durante la lactancia, en comparación con las crías de madres delgadas (compárense las figuras 1E y 2B). En este contexto, la suplementación con betaína moderó el crecimiento de las crías en comparación con los controles (Figura 2B), sin diferencias en la ingesta de leche (Figura 2C), e indujo una tendencia hacia una menor masa grasa a las 6 semanas de edad (Figura 2D).

Los cambios inducidos por la betaína materna en los ratones jóvenes se tradujeron en efectos metabólicos a largo plazo en las crías macho, y también protegieron contra la obesidad inducida por la dieta tanto en los ratones machos como en las hembras. Estos datos indican que una mayor exposición a la betaína durante los primeros años de vida podría ser suficiente para reducir la adiposidad. El tratamiento también protegió contra la acumulación de lípidos en el hígado tras una alimentación rica en grasas.

2.3. La suplementación materna con betaína modula la microbiota intestinal de los hijos en los primeros años de vida

Dado que el microbioma intestinal está influenciado por la nutrición postnatal, se consideró si las alteraciones del microbioma pueden mediar los efectos de la betaína. Se analizó el contenido cecal de ratones machos de 2 y 6 semanas de edad procedentes de madres magras de control y tratadas con betaína. Para tener en cuenta la variabilidad entre camadas, se analizaron 8 y 6 camadas por grupo a las 2 y 6 semanas de vida, respectivamente. El análisis de coordenadas principales de las distancias UniFrac no ponderadas mostró que la betaína materna modulaba la composición de la comunidad microbiana a las 2 semanas de edad, sin que se observaran diferencias a las 6 semanas. La diversidad filogenética no difirió entre los grupos. El análisis del tamaño del efecto del análisis lineal discriminante (LEfSe) identificó varios grupos bacterianos que diferían significativamente entre los grupos, incluyendo Actinobacteria spp., Akkermansia spp. y Pseudomonas spp. a las 2 semanas, y Akkermansia spp., Odoribacter spp., Oscillospiraceae spp. y Roseburia spp. a las 6 semanas (Figura 3A-3B). Entre estos grupos bacterianos, sólo las diferencias en los niveles de Akkermansia spp. soportaron un análisis bioinformático más estricto recortando las lecturas de secuencia de muy baja abundancia antes de la LEfSe.

Roseburia spp. son conocidos productores de butirato, que pueden inducir efectos metabólicos beneficiosos en el huésped. En particular, Akkermansia muciniphila fue la única especie alterada tanto a las 2 como a las 6 semanas de edad, y el único grupo bacteriano que soportó un análisis bioinformático más estricto. Varios estudios han informado de una asociación entre Akkermansia muciniphila y una mejor salud metabólica. Curiosamente, el aumento de la población de Akkermansia spp. se ha asociado recientemente con un aumento de peso más lento en un modelo de ratón de desnutrición postnatal. Además, estudios anteriores de Akkermansia muciniphila demuestran que la administración a ratones adultos aumenta el número de células caliciformes ileales y mejora la función de barrera intestinal, lo que conduce a una disminución de la inflamación sistémica y a una mejora de la salud metabólica.

No se encontraron diferencias en los ácidos grasos de cadena corta cecales a las 6 semanas de edad. Además, la suplementación con betaína no modificó el microbioma intestinal materno.

2.4. La suplementación materna con betaína mejora la función del epitelio intestinal, la inflamación sistémica de bajo grado y la disfunción metabólica.

Las crías de seis semanas de edad de las madres tratadas con betaína no mostraron diferencias en la longitud de las vellosidades ileales, pero tenían un mayor número de células caliciformes (1,3 veces, p<0,05, figura 4A) y expresión de ARNm de Muc2 (figura 4D). Estos cambios iban acompañados de una disminución de los niveles de ARNm de los marcadores inflamatorios (Ccl2, Tlr4, Cd11c) en el tejido adiposo blanco epididimario (eWAT, figura 4B). La expresión de Ccl2 (o de la proteína quimioatrayente de monocitos 1, MCP-1) también disminuyó en el tejido adiposo marrón, el hígado y el músculo esquelético. Además, la suplementación disminuyó los niveles circulantes del marcador proinflamatorio interleucina-6 (IL-6, p<0,05), mientras que la MCP-1 y el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) sólo mostraron una disminución numérica (p=0,08 y p=0,25, respectivamente, Figura 4C).

2.5. La suplementación materna con betaína mejora la salud metabólica de la descendencia durante la edad adulta.

También se investigó si los cambios mencionados durante los primeros años de vida se traducían en mejoras metabólicas a largo plazo. Se mantuvo a las crías con una dieta de comida después del destete y se las controló hasta las 24 semanas de edad. Los ratones machos nacidos de madres tratadas con betaína mostraron una menor ganancia de peso corporal durante la edad adulta y una disminución del peso eWAT (Figuras 5A-B), pero no se observó ningún efecto en las hembras. En consonancia con una menor adiposidad, el tamaño de los adipocitos y los marcadores inflamatorios disminuyeron en las crías macho de las madres tratadas con betaína. Los ratones machos mostraron una notable mejora en la tolerancia a la glucosa (Figura 5C), sin efecto en las crías hembras. Además, los niveles de insulina basal disminuyeron en un 40% en el grupo tratado en comparación con el grupo de control (p<0,05, Figura 5D). Las pruebas de tolerancia a la insulina revelaron una glucosa en sangre significativamente menor en cada punto temporal en los machos del grupo de tratamiento, pero ninguna diferencia en la respuesta a la administración de insulina. La suplementación no tuvo un efecto significativo sobre la acumulación de triglicéridos en el hígado. Se observó un fenotipo similar en el modelo de ratón con obesidad materna, en el que las crías macho adultas mostraron un menor peso corporal y adiposidad (Figuras 5E-4F), una mejor tolerancia a la glucosa (Figura 5G) y una disminución de los niveles de insulina basal (Figura 5H) en el grupo tratado con betaína en comparación con el grupo de control.

A continuación se comprobó si esta intervención en las primeras etapas de la vida protegía contra la obesidad inducida por la dieta. Para ello, las crías de 6 semanas de edad de las madres magras de control o tratadas con betaína fueron alimentadas con una HFD durante 16 semanas (grupos HF-C y HF-B, respectivamente). Cuando se les administró una HFD, tanto las crías macho como las hembras del grupo tratado con betaína mostraron un menor aumento de peso corporal en comparación con el grupo de control (Figura 6A). Se observó una modesta disminución numérica en la ingesta acumulada de alimentos, que no alcanzó significación estadística, y no hubo diferencias en el contenido de lípidos fecales. La suplementación mejoró la tolerancia a la glucosa (Figura 6B), y disminuyó la glucosa en ayunas (Tiempo 0, Figura 6B) y los niveles de insulina (Figura 6C). La acumulación hepática de triglicéridos se redujo en un 30% en el grupo h F-B (p<0,05, Figura 6D).

2.6. La coadministración de antibióticos durante la lactancia reduce los efectos metabólicos a largo plazo de la betaína

La administración materna de antibióticos durante los primeros años de vida altera la composición de la microbiota intestinal de las crías. Anteriormente se había observado que la administración materna de ampicilina y neomicina aumenta el peso del ciego y disminuye el contenido bacteriano cecal en las crías de dos semanas. Para comprobar si el microbioma intestinal en las primeras etapas de la vida contribuye a los efectos metabólicos beneficiosos a largo

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de betaína para su uso en la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores en un sujeto, en el que la prevención comprende administrar el compuesto de betaína directamente al sujeto durante la infancia o, alternativamente, a la madre del sujeto durante la lactancia.

2. El compuesto de betaína para su uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto de betaína

tiene la fórmula (I):

en la que:

X es N o As;

R1 y R2 son independientemente (C1-C6)alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; y R3 y R4 forman un anillo de 5 a 6 miembros junto con los átomos a los que están unidos que está opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados entre OH, halógeno y (C1-C3)alquilo opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; o alternativamente

R3 es (C1-C6)alquilo; y

R4 es H o (1H-indol-3-il)metilo.

3. El compuesto de betaína para su uso según la reivindicación 2, en el que el compuesto de betaína es glicina betaína.

4. El compuesto de betaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es para la prevención de la obesidad.

5. El compuesto de betaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la prevención de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores comprende la prevención en la infancia del sujeto, en la adolescencia del sujeto y/o en la edad adulta del sujeto.

6. El compuesto de betaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que los sujetos están en riesgo de padecer obesidad, acumulación excesiva de grasa y/o trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores.

7. El compuesto de betaína para su uso según la reivindicación 6, en el que los sujetos tienen madres obesas.

8. El compuesto de betaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el compuesto de betaína se administra a la madre del sujeto durante la lactancia.

9. El compuesto de betaína para su uso según la reivindicación 8, en el que la cantidad de compuesto de betaína administrado a la madre es de 1 a 10 g/día.

10. El compuesto de betaína para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el compuesto de betaína se administra directamente al sujeto durante la lactancia.

11. El compuesto de betaína para su uso según la reivindicación 10, en el que la cantidad de compuesto de betaína administrado directamente al sujeto durante la infancia es de 4 a 100 mg/Kg/día.

12. Una composición que comprende una cantidad eficaz de compuesto de betaína junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéutica o comestiblemente aceptables para su uso en la prevención y/o tratamiento de la obesidad, la acumulación excesiva de grasa y/o los trastornos metabólicos asociados a cualquiera de los anteriores, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. La composición para el uso según la reivindicación 12, que es una composición farmacéutica y en la que los excipientes son excipientes farmacéuticamente aceptables.

14. La composición para el uso según la reivindicación 12, que es un suplemento dietético y en la que los excipientes son excipientes comestibles aceptables.

15. La composición para el uso según la reivindicación 12, que es una fórmula infantil.