ES2897248T3

ES2897248T3 - Molécula de ácido nucleico con propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y organoprotectoras

Info

Publication number: ES2897248T3
Application number: ES18783424T
Authority: ES
Inventors: Luiza Anna Jedlina
Original assignee: APTAHEM AB
Current assignee: APTAHEM AB
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2018-10-03
Publication date: 2022-02-28
Anticipated expiration: 2038-10-03
Also published as: IL273759B1; PL3691655T3; IL273759A; JP7025537B2; BR112020005995A2; US20200268784A1; CN111386121A; CA3073364A1; WO2019068766A1; EP3691655B1; US11110115B2; JP2020536545A; EP3691655A1; KR20200061337A

Abstract

Molécula de ácido nucleico para su uso como medicamento a modo de medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector, en donde dicha molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO. 1 o 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Molécula de ácido nucleico con propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y organoprotectoras

Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico o a una composición que comprende dicha molécula para su uso como medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector. La invención también se refiere al uso de dicha molécula de ácido nucleico o de dicha composición para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar una enfermedad o una afección en la que hay inflamación y/o coagulación y/o daño orgánico o insuficiencia orgánica en un individuo. Finalmente, la invención se refiere además a un método para paliar uno o más síntomas y/o características y/o para mejorar un parámetro de una enfermedad o afección en la que se da inflamación y/o coagulación y/o daño orgánico o insuficiencia orgánica en un individuo, donde el método comprende administrar a dicho individuo dicha molécula de ácido nucleico o dicha composición.

Antecedentes de la invención

[0002] La coagulación intravascular diseminada (CID) se caracteriza por la activación sistémica de la coagulación causada por diversas enfermedades subyacentes, siendo la sepsis la principal causa (Gando S y col. 2008).

[0003] La sepsis y la CID son alteraciones comunes, graves y agudas que se producen cuando organismos infecciosos, cáncer, cirugías o traumatismos inducen respuestas inmunitarias excesivas del hospedador, y son una de las principales causas de muerte en pacientes hospitalizados (Clowes GH y col. 1970, Parrillo JE y col. al, 1990 y Lei mg y col., 2003). Como mecanismo de defensa, el sistema inmunitario inicia un rápido aumento de mediadores proinflamatorios y protrombóticos que causan un daño tisular sistémico letal y fallo multiorgánico o síndrome de disfunción multiorgánica.

Hoy en día, el sistema de atención sanitaria carece de un tratamiento eficaz para reducir el riesgo de daño o disfunción de los órganos hasta que la infección esté bajo control, y la necesidad clínica es elevada.

[0004] En la actualidad, se realizan enormes esfuerzos para desentrañar los mecanismos moleculares que provocan cambios en la inflamación y la coagulación.

[0005] Actualmente no existe ningún medicamento conocido eficaz que pueda usarse para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar específicamente una enfermedad o afección en la que se produce inflamación y/o coagulación y/o daño orgánico o insuficiencia orgánica.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de nuevos tratamientos de enfermedades o afecciones asociadas con la inflamación y/o coagulación y/o el daño orgánico o la insuficiencia orgánica.

Descripción de la invención

[0006] Sorprendentemente, se ha descubierto que una molécula de ácido nucleico como se define en este documento posee propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y organoprotectoras inesperadas.

[0007] En un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico para su uso como medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector, en donde dicha molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 2.

La SEQ ID NO. 1 es la siguiente secuencia de ácido nucleico:

5’ GGG AAUUCG AGC UCG GUA CCA ACA AUA CGA CUA CAC CAU CAA

AAG UAU UAU CUU GCA UCG AAG GUU GGC ACG UAG CAA GCU CUG

CAG UCG 3’

La SEQ ID NO. 2 es la siguiente secuencia de ácido nucleico:

5' GGG AAUfUfCfG AGCf UfCfG GUfA CfCfA ACfA AUfA CfGA CfUfA CfACf C^fAU^fCfAA AAG U^fAU^fU^fAU^fC^fU^fU^fGCfA U^fCfG AAG GUFUF GGCF ACfG UfAG CfAA GCfUf CfUfG CfAG UfCfG 3’

[0008] Cada C y U de la SEQ ID NO. 2 está fluorado/a (es decir, UF, CF) para aumentar la estabilidad de la molécula en el plasma.

[0009] En el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico puede ser una molécula sintética o natural o recombinante o modificada en comparación con la SEQ ID NO. 1 como se ha identificado anteriormente, en el sentido de que:

- Uno, 2, 3, 4 o 5 o al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o al menos 90 % o 100 % de sus nucleótidos se han eliminado o añadido en comparación con el nucleótido correspondiente presente en la molécula de origen natural, y/o

- Uno, 2, 3, 4 o 5 o al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o al menos 90 % o 100 % de sus nucleótidos, nucleósidos, nucleobases, porción conectora de nucleobase y/o cadena principal se ha reemplazado o sustituido con un nucleótido, nucleósido, nucleobase, porción conectora de nucleobase y/o cadena principal correspondiente que no se encuentra en la molécula de origen natural.

[0010] En el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico puede ser una molécula modificada en comparación con la SEQ ID NO. 2 como se ha identificado anteriormente en el sentido de que:

- Uno, 2, 3, 4 o 5 o al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o al menos 90 % o 100 % de sus nucleótidos se han eliminado o añadido en comparación con el nucleótido correspondiente presente en la molécula de origen natural, y/o

- Uno, 2, 3, 4 o 5 o al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o al menos 90 % o 100 % de sus nucleótidos, nucleósidos, nucleobases, porción conectora de nucleobase y/o parte de cadena principal se ha reemplazado o sustituido con un nucleótido, nucleósido, nucleobase, porción conectora de nucleobase y/o parte de cadena principal correspondiente que no se encuentra en la molécula de origen natural.

[0011] Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO. 1 o 2. Una molécula de ácido nucleico preferida es una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO. 1 o 2 y que tiene una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos más que la SEQ ID NO. 1 o 2.

[0012] La estructura química de los nucleótidos de una molécula de ácido nucleico se puede modificar, reemplazar, sustituir con respecto a la estructura de una molécula de ARN para aumentar su estabilidad, afinidad de unión y/o especificidad. Dicha molécula de ácido nucleico puede comprender o consistir en una molécula de ARN o, preferiblemente, una molécula de ARN modificada. Una molécula de ARN modificada preferida comprende un azúcar modificado. Un ejemplo de dicha modificación es la introducción de un grupo 2'-O-metilo o 2'-O-metoxietilo o un grupo halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo o yodo) en el ácido nucleico para mejorar la resistencia a las nucleasas y la afinidad de unión al ARN. Un halógeno preferido en este contexto es el flúor, como en la SEQ ID NO. 2. Otro ejemplo de tal modificación es la introducción de un puente de metileno que conecte el átomo 2'-O y el átomo 4'-C del ácido nucleico para bloquear la conformación (Ácido Nucleico Bloqueado (LNA)) para mejorar la afinidad por el ARN monocatenario complementario. Un tercer ejemplo es la introducción de un grupo fosforotioato como porción conectora entre los ácidos nucleicos de la cadena de ARN para mejorar la estabilidad frente a un ataque de nucleasas. La afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico puede modificarse adicionalmente para refinar sus propiedades de unión como se describe en Hasegawa H y col., que se incorpora al presente documento por referencia. Se proporciona información más detallada sobre otras modificaciones químicas en la parte general dedicada a las definiciones.

[0013] Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico preferida para su uso como se define en el presente documento es una molécula de ácido nucleico que es monocatenaria y/o en la que un nucleótido de esta molécula de ácido nucleico está modificado en comparación con un nucleótido presente en el ARN.

De acuerdo con una forma de realización más preferida, dicha molécula de ácido nucleico es tal que una de sus pirimidinas está fluorada y, preferiblemente, todas sus pirimidinas están fluoradas, como en la SEQ ID NO. 2.

[0014] La identidad puede ser al menos del 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. La identidad se evalúa preferiblemente en toda la SEQ ID NO como se identifica en el presente documento. Sin embargo, la identidad también puede evaluarse en parte de una SEQ ID NO. Parte puede significar al menos el 50 % de la longitud de la SEQ ID NO, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 %. Se proporciona información más detallada sobre la evaluación de la identidad en la parte general dedicada a las definiciones.

[0015] Una molécula de ácido nucleico de la invención se usa preferiblemente como medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector, ya que presenta propiedades o características antiinflamatorias y/o anticoagulantes y/o organoprotectoras, como se explica a continuación y como se demuestra en la parte experimental.

En una forma de realización, una molécula de ácido nucleico de la invención se usa como un medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector, ya que posee propiedades o características antiinflamatorias y/o anticoagulantes y/o organoprotectoras, como se explica a continuación y como se demuestra en la parte experimental.

[0016] En una forma de realización, una actividad preferida de una molécula de ácido nucleico de la invención es inducir una actividad antiinflamatoria detectable (es decir, una disminución de una actividad inflamatoria y/o un aumento de una actividad antiinflamatoria). Cualquier compuesto o parámetro que se sepa que está asociado al aumento o disminución de la inflamación puede usarse como lectura para evaluar la actividad de la molécula de ácido nucleico de la invención.

Una actividad antiinflamatoria puede evaluarse mediante la detección de un aumento del nivel de expresión de una citocina antiinflamatoria y/o la disminución del nivel de expresión de una citocina proinflamatoria. Algunos ejemplos de citocinas proinflamatorias son IL1beta, IL-6, TNFalfa y HMGB1. Un ejemplo de citocina antiinflamatoria es IL-10.

Otro parámetro ligado a la inflamación es la detección de infiltrados inflamatorios de leucocitos.

Otro parámetro ligado a la inflamación es la detección de la expresión del receptor proinflamatorio MAC-1 (CD11b/CD18) o P-selectina o CD36 o EPCR (receptor endotelial de la proteína C).

Otro parámetro ligado a la inflamación es la detección de la expresión de L-selectina, CD35, CD88, ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular 1) o PECAM-1 (molécula de adhesión de células endoteliales y plaquetas 1). Otro parámetro relacionado con la inflamación es la detección de fibrinógeno, que es una proteína de fase aguda positiva.

En el contexto de la invención, un parámetro relacionado con la inflamación se selecciona del grupo que consiste en: aumento del nivel de expresión de una citocina antiinflamatoria, disminución del nivel de expresión de una citocina proinflamatoria, IL1beta, IL-6, TNFalfa, HMGB1, IL10, infiltrados inflamatorios de leucocitos, MAC-1, P-selectina, CD36, EPCR, CD35, CD88, ICAM-1, PECAM-1 y fibrinógeno.

En otra forma de realización, otra actividad preferida de una molécula de ácido nucleico de la invención es inducir una actividad anticoagulante detectable. Cualquier compuesto o parámetro que se sepa que está asociado con un aumento o disminución de la coagulación puede usarse como lectura para evaluar la actividad de la molécula de ácido nucleico de la invención.

Un parámetro preferido relacionado con la coagulación y utilizado en este contexto es APTT (tiempo de tromboplastina parcial activada), densidad de los coágulos de fibrina, formación de trombina, tiempo de sangría, dímeros D, actividad fibrinolítica (tPA (activador del plasminógeno tisular), complejo entre PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeno-1) y tPA), expresión de proteína S anticoagulante y/o EPCR. Otro parámetro relacionado con la coagulación y utilizado en este contexto es el fibrinógeno (Factor I), el heparán sulfato o la expresión de trombomodulina, PECAM-1 o proteína C. Las concentraciones bajas de fibrinógeno a menudo están relacionadas con el consumo de fibrinógeno, como se puede ver con la cogulación intravascular diseminada (CID) y fibrinólisis anormal.

En el contexto de la invención, un parámetro asociado a la coagulación se selecciona del grupo formado por: TTPA, densidad de los coágulos de fibrina, formación de trombina, tiempo de sangría, dímeros D, actividad fibrinolítica (tPA, complejo entre PAI-1 y tPA), expresión de proteína S anticoagulante, expresión de EPCR, fibrinógeno, heparán sulfato, expresión de trombomodulina, expresión de PECAM-1 y expresión de proteína C.

[0017] En otra forma de realización, otra actividad preferida de una molécula de ácido nucleico de la invención es inducir una actividad organoprotectora detectable, preferiblemente para el daño o insuficiencia renal y/o hepática. Cualquier compuesto o parámetro que se sepa que está asociado con un aumento o disminución del daño o disfunción orgánico/a, preferiblemente del daño o insuficiencia renal y/o hepática, puede usarse como lectura para evaluar la actividad de la molécula de ácido nucleico de la invención.

Un parámetro preferido relacionado con el daño o la insuficiencia orgánico/a y que se usa en este contexto es la concentración en suero de AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), GGT (gammaglutamil transpeptidasa), ALP (fosfatasa alcalina), LDH (lactato deshidrogenasa) , creatina cinasa, BUN (nitrógeno ureico en sangre), albúmina, creatinina, glucosa, ácido biliar, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, fósforo, proteína total, colesterol LDL, colesterol HDL, colesterol y/o triglicéridos.

Un parámetro preferido relacionado con el daño o la insuficiencia hepática es la AST, ALT, GGT, ALP, LDH, albúmina, bilirrubina total de ácidos biliares, bilirrubina conjugada y/o fósforo.

Un parámetro preferido relacionado con el daño o la insuficiencia renal es la creatinina, el BUN y/o el fósforo.

[0018] Tal actividad o parámetro como se define en el presente documento puede evaluarse en un individuo, en un modelo animal, en una célula, preferiblemente de un modelo animal o de un individuo. La evaluación de la actividad se puede llevar a cabo utilizando técnicas conocidas por los expertos. Se proporcionan ejemplos de ensayos en la parte experimental.

La evaluación de la expresión de una citocina proinflamatoria o antiinflamatoria puede realizarse en el ARNm, preferiblemente usando RT-qPCR. La evaluación de la expresión de dicha citocina se puede llevar a cabo en las proteínas, preferiblemente usando ensayos que detecten la expresión de proteínas, tales como análisis de Western blot, ELISA, citometría de flujo, inmunohistoquímica o análisis de inmunofluorescencia de secciones y/o usando un ensayo como se define más adelante en este documento. La detección de infiltrados inflamatorios de leucocitos o del receptor proinflamatorio MAC-1 o P-selectina o de CD36 o de EPCR puede realizarse mediante inmunofluorescencia. La detección de L-selectina, CD35, CD88, ICAM-1 o PECAM-1 se puede llevar a cabo usando inmunofluorescencia.

La evaluación de APTT, densidad de coágulos de fibrina, formación de trombina, tiempo de sangría, actividad fibrinolítica (tPA, complejo entre PAI-1 y tPA), expresión de la proteína S anticoagulante y/o EPCR se realiza utilizando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente como se hace en la parte experimental. La evaluación del fibrinógeno, heparán sulfato, expresión de trombomodulina, PECAM-1 y/o proteína C se realiza utilizando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente como se hace en la parte experimental.

La evaluación de la concentración en suero de AST, ALT, GGT, ALP, LDH, creatina cinasa, BUN, albúmina, creatinina, glucosa, ácidos biliares, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, fósforo, proteína total, colesterol LDL, colesterol HDL, colesterol y/o triglicéridos se realiza usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente como se hace en la parte experimental. La evaluación se lleva a cabo preferiblemente en varios puntos temporales para un sujeto dado o en uno o varios puntos temporales para un sujeto dado y un control sano. La evaluación puede realizarse cada semana, cada mes.

[0019] La detección de la presencia de una molécula de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo utilizando cualquier técnica conocida por los expertos. La evaluación del nivel de expresión o de la presencia de dicha molécula se realiza preferiblemente mediante técnicas tradicionales de biología molecular como qPCR (en tiempo real), micromatrices de ADN o de esferas, análisis de protección de RNasa o análisis Northern. El experto entenderá que, alternativamente o en combinación con la cuantificación de dicha molécula, la cuantificación de un sustrato de una molécula correspondiente o de cualquier compuesto que se sepa que está asociado con una función de dicha molécula o la cuantificación de una función o actividad de dicha molécula utilizando un ensayo específico está incluida dentro del alcance de la invención.

[0020] Una molécula de ácido nucleico como se define en el presente documento puede usarse como una molécula desnuda, con o sin modificaciones químicas, o presente o formulada en una composición o conjugada a una porción. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en este documento destinada a usarse como se define en este documento, en donde la composición es preferiblemente una composición farmacéutica, donde dicha composición farmacéutica comprende un vehículo, adyuvante, sal, diluyente y/o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Una composición preferida comprende dicha molécula encapsulada en una partícula, preferiblemente una nanopartícula o una estructura liposómica. Se describen composiciones adicionales en la parte general dedicada a las definiciones.

[0021] En una forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico o una composición para usar como se define en este documento está destinada a la administración por vía intravenosa, oral, subcutánea o intramuscular. Si se quiere combatir la inflamación, se prefiere la administración oral o intramuscular. Si se quiere combatir la coagulación, se prefiere la administración intravenosa. Se obtuvieron muy buenos resultados para un efecto anticoagulante mediante la administración intravenosa. Si deben combatirse ambas, se prefiere la administración oral, intramuscular y/o intravenosa.

[0022] En el contexto de la invención, cualquier enfermedad o afección que conlleve o que esté asociada o donde se produzca inflamación y/o coagulación y/o daño o insuficiencia orgánico/a se puede prevenir, retardar, curar, hacer que remita y/o tratar con una molécula de ácido nucleico o con una composición que comprende dicha molécula como se define en el presente documento. En una enfermedad o afección como se define en el presente documento, la inflamación y/o la coagulación y/o el daño o disfunción orgánico/a pueden detectarse durante el desarrollo de dicha enfermedad o afección, es decir, después de la aparición de un síntoma de dicha enfermedad o afección. Alternativamente, se puede detectar la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a antes del desarrollo de dicha enfermedad o afección.

En una forma de realización, la enfermedad o afección en la que se produce la inflamación se selecciona de entre artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa, hepatitis, sepsis, enfermedad hepática alcohólica, esteatosis no alcohólica, sarcoidosis, diabetes autoinmune, diabetes mellitus, uveítis, esclerosis múltiple, control del rechazo del aloinjerto después de un trasplante de órgano, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), enfermedades pulmonares inflamatorias, incluyendo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lupus eritematoso sistémico (LES), sarcoidosis, dermatitis atópica y cáncer, o una complicación o un efecto de la progresión que está vinculada a una de estas enfermedades o afecciones.

[0023] En otra forma de realización, la enfermedad o afección en la que se produce la coagulación se selecciona de entre síndrome coronario agudo (SCA), trombosis, obstrucción de vasos periféricos, arteriosclerosis obstructiva, vasculitis, trastorno funcional producido tras una cirugía cardíaca, complicaciones causadas por un trasplante de órgano, angina de pecho, accidente isquémico transitorio, toxemia del embarazo (preeclampsia, eclampsia), diabetes, enfermedad venooclusiva hepática (EVO), trombosis venosa profunda (TVP), sepsis, choque séptico, sepsis grave, traumatismo, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y coagulación intravascular diseminada (CID), o una complicación o un efecto de la progresión relacionado con una de estas enfermedades o afecciones.

En otra forma de realización, la enfermedad o afección en la que se produce daño o disfunción orgánico/a se selecciona de entre infección, intoxicación, síndromes de aspiración, hipoperfusión o choque, enfermedad inducida por calor, isquemia, daño por isquemia-reperfusión (IRI), enfermedad autoinmune, traumatismo, hemorragia, pancreatitis, bacteriemia, quemaduras, sepsis, choque séptico, sepsis grave, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), toxemia del embarazo (preeclampsia), eclampsia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), coagulación intravascular diseminada (CID) y disfunción multiorgánica o síndrome de disfunción multiorgánica, o una complicación o un efecto de la progresión que esté relacionado con una de estas enfermedades o afecciones. El daño o insuficiencia orgánica es preferiblemente daño o insuficiencia hepática, daño o insuficiencia renal.

[0024] Actualmente no existe ningún medicamento eficaz conocido que pueda usarse para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar específicamente una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o la coagulación y/o el daño o disfunción orgánico/a.

[0025] La invención incluye aumentar una actividad o la concentración en equilibrio o el nivel de expresión o la cantidad de una molécula de ácido nucleico o de una composición que comprende dicha molécula como se define en el presente documento. Una actividad o una concentración en equilibrio de dicha molécula de ácido nucleico se incrementa en un sujeto, en una célula de dicho sujeto, en un tejido de dicho sujeto o en el fluido corporal de dicho sujeto.

Se aumenta una actividad o concentración en equilibrio o nivel de expresión o cantidad de dicha al menos una molécula de ácido nucleico para inducir una actividad antiinflamatoria y/o anticoagulante y/o protectora de un órgano detectable en un sujeto, preferiblemente en células de dicho sujeto.

[0026] La evaluación del nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico como se define en este documento se lleva a cabo preferiblemente en una biopsia o sección en varios puntos temporales para un sujeto dado o en uno o varios puntos temporales para un sujeto dado y un control sano. La evaluación puede llevarse a cabo a intervalos de tiempo regulares, por ejemplo, cada semana, cada mes. Por lo tanto, el aumento/disminución puede evaluarse con frecuencia, por ejemplo, cada semana, cada mes. Una disminución detectable de la inflamación y/o una disminución detectable de la coagulación y/o una disminución detectable del daño o disfunción orgánico/a se evalúa preferiblemente como se explica más adelante en este documento con el fin de definir un efecto antiinflamatorio y/o un efecto anticoagulante y/o un efecto organoprotector.

[0027] Un nivel de actividad o de concentración en equilibrio o nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico puede incrementarse en la propia molécula, por ejemplo al proporcionar dicha molécula a un sujeto, preferiblemente a una célula de un sujeto, o a un tejido de dicho sujeto, o a un órgano de dicho sujeto o a dicho sujeto, donde dicha molécula procede de una fuente exógena. Para proporcionar una molécula a partir de una fuente exógena, dicha molécula puede producirse convenientemente mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica dicha molécula o que codifica una fuente de dicha molécula en una célula hospedadora adecuada, como se describe a continuación, o como moléculas completamente sintéticas mediante síntesis química.

[0028] Un nivel de actividad o de concentración en equilibrio o nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico se incrementa regulando el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica dicha molécula. Preferiblemente, el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico se regula en una célula de dicho sujeto o en un tejido de dicho sujeto o en el sujeto. El nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico puede aumentarse mediante la introducción de dicha molécula o una construcción de expresión (o vector) en una célula, tejido, órgano o fluido corporal de dicho sujeto, o en el sujeto, donde un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que comprende dicha molécula, y donde una secuencia de nucleótidos está bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos en dicha célula, tejido, órgano o sujeto. El nivel de expresión de dicha molécula también puede aumentarse mediante la introducción de una construcción de expresión en una célula, tejido, órgano, sujeto, por lo que una construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un factor capaz de trans-activar una secuencia de nucleótidos endógena que codifica dicha molécula.

[0029] Una actividad o concentración en equilibrio o cantidad de dicha molécula de ácido nucleico puede aumentarse en un sujeto, en una célula de dicho sujeto, en un tejido de dicho sujeto o en el fluido corporal de dicho sujeto mediante el aumento de la concentración de dicha molécula de ácido nucleico en dicha célula, tejido o fluido corporal.

[0030] En la invención, una célula, un tejido, un órgano o fluido corporal es preferiblemente de un sujeto que se sospecha que tiene un alto riesgo de tener una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a a causa, por ejemplo, de su edad o su origen genético o su dieta. Alternativamente, en otra forma de realización preferida, la invención se aplica a una célula, tejido, órgano o fluido corporal de un sujeto a quien se le ha diagnosticado un riesgo predictivo de desarrollar posteriormente una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a. Alternativamente, se puede seleccionar una célula, un tejido u órgano que tratar en función del riesgo de progresión de la enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a. Dicho riesgo de progresión puede evaluarse utilizando criterios clínico-patológicos clásicos o un pronóstico basado en biomarcadores conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de una situación en la que puede producirse la coagulación es la CID, como se explica en detalle en los antecedentes de la invención. Las causas subyacentes de la CID pueden ser un organismo infeccioso, el cáncer, una cirugía o un traumatismo, u otras.

[0031] En la invención, una célula, un tejido, un órgano o un fluido corporal es preferiblemente de un sujeto del que se sospecha que tiene un alto riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o la coagulación y/o el daño o la insuficiencia orgánico/a y/o en el que un aumento/regulación al alza de un parámetro relacionado con la inflamación o la coagulación o el daño o disfunción orgánico/a se produce debido, por ejemplo, a su edad o sus antecedentes genéticos o a su dieta o al país en el que vive o a la CID. Alternativamente, en otra forma de realización preferida, la invención se aplica a una célula, tejido, órgano o fluido corporal de un sujeto al que se le ha diagnosticado un riesgo predictivo de desarrollar posteriormente una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño orgánico o insuficiencia y/o en el que un aumento/regulación al alza de un parámetro relacionado con la inflamación o coagulación o daño o disfunción orgánico/a se produce debido, por ejemplo, a su edad o sus antecedentes genéticos o a su dieta o al país en el que vive o a la CID.

[0032] Una molécula de ácido nucleico como se identifica en el presente documento tiene preferiblemente un nivel aceptable de actividad antiinflamatoria y/o anticoagulante y/o protectora de un órgano. Un nivel aceptable de actividad antiinflamatoria y/o anticoagulante y/o protectora de un órgano significa al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más de la actividad de la molécula representada por la SEQ ID NO. 1 o 2 medida en las mismas condiciones. Un nivel aceptable de actividad anticoagulante también puede ser equivalente a al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más de la actividad de rivaroxabán medida en las mismas condiciones.

[0033] La molécula de ácido nucleico o la composición de la invención se puede combinar con tratamientos estándar para la enfermedad o afección en la que se produce inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a, tales como rivaroxabán o warfarina como anticoagulante.

[0034] En el contexto de la invención, prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a puede significar que:

- se ha mejorado al menos un síntoma de esta enfermedad o afección, y/o

- se ha mejorado al menos un parámetro asociado con esta enfermedad o afección.

La mejora se puede medir durante al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, una semana, un mes, seis meses de tratamiento o más. Los parámetros preferidos asociados con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a ya se han definido en este documento.

[0035] En el contexto de la invención, la prevención, el tratamiento, la regresión, la curación y/o el retardo de una enfermedad o afección asociada con la inflamación y/o la coagulación y/o el daño o la insuficiencia orgánico/a puede reemplazarse logrando un efecto antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector. A menos que se indique lo contrario, un efecto antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector se evalúa o detecta preferiblemente antes del tratamiento y después de al menos una hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días , una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más en un sujeto tratado.

[0036] Un efecto antiinflamatorio se identifica preferiblemente en un sujeto como:

- una disminución detectable del nivel de expresión de una citocina proinflamatoria, preferiblemente IL1beta, IL-6, TNFalfa y/o HMGB1 y/o

- un aumento detectable del nivel de expresión de una citocina antiinflamatoria como IL-10, y/o

- una disminución en la detección del número de infiltrados inflamatorios de leucocitos y/o

- una disminución detectable de la expresión de un receptor proinflamatorio como M^aC-1, P-selectina, EPCR y/o de CD36 y/o

- una disminución detectable de la expresión de un receptor proinflamatorio como L-selectina, CD35, CD88, ICAM-1 y/o PECAM-1 y/o

- una disminución detectable de la concentración en suero de fibrinógeno, que es una proteína de fase aguda positiva y/o

- una prolongación de la supervivencia del paciente de al menos un mes, varios meses o más (en comparación con los no tratados o tratados con un control o en comparación con el sujeto al inicio del tratamiento).

En el contexto de la invención, un paciente puede sobrevivir y puede considerarse libre de enfermedad. Alternativamente, la enfermedad o afección puede haberse detenido, retardado o remitido.

[0037] Una disminución detectable del nivel de expresión de IL1beta, IL-6, HMGB1 y/o TNFalfa puede ser una disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. Esta disminución del nivel de expresión puede evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente según lo evaluado en la parte experimental. La expresión se puede evaluar en el ARN o proteínas. Tal disminución puede evaluarse al menos 3, 4, 5, 6, 7 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

Un aumento detectable del nivel de expresión de IL-10 puede ser un aumento de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. Este aumento del nivel de expresión puede evaluarse utilizando técnicas conocidas, preferiblemente según lo evaluado en la parte experimental. La expresión se puede evaluar en el ARN o proteínas. Dicho aumento puede evaluarse al menos 3, 4, 5, 6, 7 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico determinada.

Una disminución en la detección del número de infiltrados inflamatorios de leucocitos puede ser una disminución de al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o más. Dicho aumento puede evaluarse al menos 3, 4, 5, 6, 7 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico determinada. La detección de infiltrados inflamatorios de leucocitos puede evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente usando inmunofluorescencia por análisis FACS.

Una disminución de la expresión de un receptor proinflamatorio como MAC-1, P-selectina, EPCR y/o CD36 puede ser una disminución de al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, o más. La detección de tales receptores puede evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente usando inmunofluorescencia por análisis FACS. Dicho aumento puede evaluarse al menos 3, 4, 5, 6, 7 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico determinada. Una disminución de la expresión de un receptor proinflamatorio como L-selectina, CD35, CD88, ICAM-1 y/o PECAM-1 puede ser una disminución de al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o más. La detección de tales receptores puede evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente usando inmunofluorescencia por análisis FACS. Dicho aumento puede evaluarse al menos 3, 4, 5, 6, 7 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico determinada. Una disminución de la concentración en suero de fibrinógeno, que es una proteína de fase aguda positiva, puede ser una disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La detección de fibrinógeno puede evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente según lo evaluado en la parte experimental. Tal disminución puede evaluarse al menos 3, 4, 5, 6, 7 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

[0038] Un efecto anticoagulante se identifica preferiblemente en un sujeto como:

- se observa un aumento detectable del APTT y/o un aumento detectable de la proteína S anticoagulante y/o un aumento detectable del EPCR y/o

- se observa un aumento detectable de la trombomodulina y/o un aumento detectable de la proteína C y/o un aumento detectable de la PECAM-1 y/o

- se observa una disminución detectable de la densidad de los coágulos de fibrina y/o del tiempo de sangría, y/o

- una disminución de la formación de trombina y/o

- una disminución de los dímeros D y/o

- una disminución del heparán sulfato y/o

- una prolongación de la supervivencia del paciente de al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, un mes, varios meses o más (en comparación con los no tratados o tratados con un control o en comparación con el sujeto al inicio del tratamiento) y/o

- un aumento detectable de la actividad fibrinolítica (aumento del tPA, disminución del complejo entre PAI-1 y tPA) y/o

- una disminución detectable del fibrinógeno.

[0039] En el contexto de la invención, un paciente puede sobrevivir y puede considerarse libre de enfermedad. Alternativamente, la enfermedad o afección puede haberse detenido, retardado o retrocedido.

Un aumento detectable del APTT y/o de la proteína S anticoagulante y/o del EPCR puede ser un aumento de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. El APTT, la proteína S anticoagulante y el EPCR pueden evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente según lo evaluado en la parte experimental. Dicho aumento podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

Un aumento detectable de la trombomodulina y/o de la proteína C y/o de la PECAM-1 puede ser un aumento de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La trombomodulina, la proteína C y la PECAM-1 pueden evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente evaluadas en la parte experimental. Dicho aumento podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

[0040] Una disminución detectable de la densidad de los coágulos de fibrina y/o del tiempo de sangría puede ser una disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La densidad de los coágulos de fibrina y el tiempo de sangría pueden evaluarse utilizando técnicas conocidas, preferiblemente según lo evaluado en la parte experimental. Dicha disminución podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

Una disminución detectable de la formación de trombina puede ser una disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La formación de trombina se puede evaluar usando técnicas conocidas, preferiblemente como se evalúa en la parte experimental. Dicho aumento podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

Una disminución detectable de dímeros D y/o heparán sulfato puede ser una disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. Los dímeros D y/o el heparán sulfato pueden evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente según lo evaluado en la parte experimental. Dicho aumento podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

Un aumento detectable de la actividad fibrinolítica (aumento de tPA) puede ser un aumento de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La detección de TPA activo libre puede evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente evaluadas en la parte experimental. Dicho aumento podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

También puede evaluarse un aumento detectable de la actividad fibrinolítica mediante una disminución del complejo entre PAI-1 y tPA. Dicha disminución puede ser de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La detección de PAI-1 y tPA puede evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente evaluadas en la parte experimental. Dicha disminución podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

Un aumento detectable de la actividad fibrinolítica también puede evaluarse mediante una disminución del fibrinógeno. Dicha disminución puede ser de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La detección de fibrinógeno puede evaluarse usando técnicas conocidas, preferiblemente evaluadas en la parte experimental. Dicha disminución podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

[0041] Un efecto organoprotector se identifica preferiblemente en un sujeto como:

- una mejora detectable en un parámetro relacionado con el daño o la insuficiencia orgánico/a, como AST, a Lt , GGT, ALP, LDH, creatina cinasa, BUN, albúmina, creatinina, glucosa, ácido biliar, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, fósforo, proteína total, LDL colesterol, colestero1HDL, colesterol y/o triglicéridos. La mejora se define como un aumento o disminución del valor de un parámetro de modo que se acerque al rango normal en un sujeto sano.

- una prolongación de la supervivencia del paciente de al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, un mes, varios meses o más (en comparación con los no tratados o tratados con un control o en comparación con el sujeto al inicio del tratamiento).

[0042] Una mejora detectable en la AST y/o ALT y/o GGT y/o ALP y/o LDH y/o bilirrubina total y/o bilirrubina conjugada y/o BUN y/o creatina cinasa y/o creatinina y/o ácido biliar y/o fósforo y/o triglicéridos y/o colesterol LDL y/o colesterol HDL y/o colesterol puede ser una disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces o más. La AST, ALT, GGT, ALP, LDH, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, BUN, creatina cinasa, creatinina, ácido biliar, fósforo, triglicéridos, colesterol LDL, colesterol HDL y colesterol pueden evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente como se ha hecho en la parte experimental. Dicha disminución podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

[0043] Una mejora detectable en la albúmina y/o proteína total puede ser un aumento de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o más. La albúmina y la proteína total pueden evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos, preferiblemente como se hace en la parte experimental. Dicho aumento podrá evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una molécula de ácido nucleico dada.

[0044] Una mejora detectable en la glucosa puede ser un aumento o disminución de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 % o 10 veces o más. La glucosa puede evaluarse usando técnicas conocidas por los expertos. Dicho aumento o disminución puede evaluarse al menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas. horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas, 36 horas, 40 horas, 44 horas, 48 horas, 52 horas, 56 horas, 60 horas, 64 horas, 68 horas, 72 horas, 78 horas, 82 horas, 86 horas, 90 horas, 94 horas, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días tras la transfección con una determinada molécula de ácido nucleico.

[0045] Por lo tanto, en una forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento para su uso como medicamento se usa como medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector,

(a) en el que un parámetro asociado con la inflamación, como la concentración de una citocina proinflamatoria, la concentración de una integrina proinflamatoria y/o el número de infiltrados proinflamatorios, ha disminuido y/o

(b) en el que un parámetro asociado con la coagulación, como la formación de coágulos de fibrina y/o la concentración de trombina, ha disminuido y/o

(c) en el que un parámetro asociado con el daño o la insuficiencia orgánico/a, como AST, ALT, GGT, ALP, LDH, creatina cinasa, BUN, albúmina, creatinina, glucosa, ácido biliar, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, fósforo, proteína total, colesterol LDL, colesterol HDL, colesterol y/o triglicéridos, ha mejorado.

[0046] En una forma de realización preferida adicional, una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento para su uso como medicamento se utiliza como medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector,

(c) en el que un parámetro asociado con el daño o la insuficiencia orgánico/a, como AST, ALT, GGT, ALP, LDH, creatina cinasa, BUN, albúmina, creatinina, glucosa, ácido biliar, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, fósforo, proteína total, colesterol LDL, colesterol HDL, colesterol y/o triglicéridos ha mejorado y/o

(d) en el que un parámetro asociado con la inmunoestimulación ha aumentado.

[0047] Los parámetros asociados con la inmunoestimulación los conocen los expertos en la técnica, e incluyen la activación de células inmunes, preferiblemente linfocitos T, B y/o NK.

[0048] En un aspecto adicional, se proporciona una molécula de ácido nucleico para usar preferiblemente como se ha definido anteriormente en este documento, en donde dicho uso es como medicamento para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar una enfermedad o una afección en la que se da inflamación y/o coagulación y/o daño o insuficiencia orgánica, en el que dicha molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO. 1 o 2. Cada característica de este aspecto adicional ya se ha definido en este documento.

[0049] En este documento se describe el uso de un ácido nucleico o de una composición que comprende dicha molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar una enfermedad o una afección asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a. Cada característica de este aspecto adicional ya se ha descrito en este documento.

[0050] Se describe además el uso de una molécula de ácido nucleico para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar una afección o enfermedad asociada con la inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a en un sujeto que lo necesite. Cada característica de este aspecto adicional ya se ha descrito en este documento.

[0051] En una forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico para su uso o una composición para su uso como se define en este documento es para una enfermedad o afección en la que se produce inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a y que se selecciona preferiblemente de entre artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, hepatitis, sepsis, enfermedad hepática alcohólica, esteatosis no alcohólica, sarcoidosis, diabetes autoinmune, diabetes mellitus, uveítis, esclerosis múltiple, , control del rechazo del aloinjerto después de un trasplante de órgano, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), enfermedades pulmonares inflamatorias, incluyendo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lupus eritematoso sistémico (LES), sarcoidosis, dermatitis atópica y cáncer, síndrome coronario agudo (SCA), trombosis, obstrucción de vasos periféricos, arteriosclerosis obstructiva, vasculitis, aparición de trastornos funcionales después de una cirugía cardíaca, complicación causada por un trasplante de órgano, angina de pecho, accidente isquémico transitorio, toxemia del embarazo (preeclampsia, eclampsia), diabetes, enfermedad venooclusiva del hígado (EVO), trombosis venosa profunda (TVP), choque séptico, sepsis grave, traumatismo, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y coagulación intravascular diseminada (CID), o una complicación o un efecto de la progresión relacionado con una de estas enfermedades o afecciones.

[0052] En otra forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico para su uso, una composición para su uso, un uso o un método como se define en este documento es para una enfermedad o afección en la que se produce inflamación y/o coagulación y/o daño o disfunción orgánico/a y que se selecciona preferiblemente de entre infección, intoxicación, síndromes de aspiración, hipoperfusión o choque, enfermedad inducida por calor, isquemia, daño por isquemia-reperfusión (IRI), enfermedad autoinmune, hemorragia, pancreatitis, bacteriemia, quemaduras, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) y disfunción multiorgánica o síndrome de disfunción multiorgánica, o una complicación o un efecto de la progresión relacionado con una de estas enfermedades o afecciones.

[0053] Una afección preferida es la CID. El daño o disfunción orgánico/a es preferiblemente daño o insuficiencia hepática, daño o insuficiencia renal.

Definiciones generales y tecnologías generales a las que se hace referencia en este documento.

Ácidos nucleicos

[0054] El término "ácido nucleico" es ampliamente conocido en la técnica. Un "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, generalmente se referirá a una molécula (una o más cadenas) de ADN, ARN o un derivado o análogo del mismo, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina de origen natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C). El término "ácido nucleico" abarca los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido", cada uno como un subgénero del término "ácido nucleico".

[0055] Como se usa en el presente documento, se entiende que "hibridación", "híbrida" o "capaz de hibridar" significan la formación de una molécula bicatenaria o tricatenaria o una molécula con naturaleza bicatenaria o tricatenaria parcial mediante técnicas conocidas por los expertos, como procedimientos de transferencia de Southern. El término “combinar”, como se usa en este documento, es sinónimo de "hibridar". El término "hibridación", "hibrida(n)” o "capaz de hibridar" puede significar condiciones de hibridación con rigurosidad “baja", "media" o "alta”, como se define a continuación.

[0056] Condiciones de rigurosidad baja a media a alta significan prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 pg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 25 %, 35 % o 50 % con rigurosidades baja a media a alta, respectivamente. Posteriormente, la reacción de hibridación se lava tres veces durante 30 minutos cada una usando 2XSSC, SDS al 0,2 % y 55 °C, 65 °C o 75 °C para rigurosidades baja a media a alta.

[0057] Las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenderán, en algunas formas de realización, las de cualquiera de las descritas en la SEQ ID NO. 1 o 2. Se contempla que las secuencias de ácido nucleico de la invención derivadas de la SEQ ID NO. 1 o 2 pueden tener, tener al menos, o tener como máximo 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 nucleótidos contiguos de las SEQ ID NO. 1 o 2 (o cualquier intervalo derivado de las mismas). En otras formas de realización, los ácidos nucleicos son, son al menos, o son como máximo un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % idénticos a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 1 o 2.

Nucleobases (o bases)

[0058] Como se usa en este documento, una "nucleobase" se refiere a una base heterocíclica, como por ejemplo una nucleobase de origen natural (es decir, una A, T, G, C o U) que se encuentra en al menos un ácido nucleico de origen natural (es decir, ADN y ARN), y derivados y análogos de origen natural o no natural de tal nucleobase. Una nucleobase generalmente puede formar uno o más puentes de hidrógeno (“combinarse” o "hibridarse”) con al menos una nucleobase de origen natural de una manera que puede sustituir una interacción de nucleobases natural (por ejemplo, el puente de hidrógeno entre A y T, G y C, y A y U).

[0059] Las nucleobase(s) “purina” y/o “pirimidina” abarcan nucleobases de purina y/o pirimidina de origen natural y también derivados y análogos de las mismas, que incluyen, entre otros, una purina o pirimidina sustituida por uno o más de entre un alquilo, caboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, flúor, cloro, bromo o yodo), tiol o alquiltiol. Los alquilos preferidos (por ejemplo, alquilo, caboxialquilo, etc.) comprenden desde aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, hasta aproximadamente 6 átomos de carbono. Otros ejemplos no excluyentes de una purina o pirimidina incluyen una deazapurina, una 2,6-diaminopurina, un 5-fluorouracilo, una xantina, una hipoxantina, una 8-bromoguanina, una 8-cloroguanina, una bromotimina, una 8-aminoguanina, una 8-hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2-aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilcitosina, un 5-bromouracilo, un 5-etiluracilo, un 5-yodouracilo, un 5 -clorouracilo, un 5-propiluracilo, un tiouracilo, una 2-metiladenina, una metiltioadenina, una N, N-diemetiladenina, una azaadenina, una 8-bromoadenina, una 8-hidroxiadenina, una 6-hidroxiaminopurina, una 6-tiopurina, una 4-(6-aminohexil/citosina) y similares. Los expertos en la técnica conocen otros ejemplos.

[0060] Una nucleobase puede estar comprendida en un nucleósido o nucleótido, usando cualquier método de síntesis química o natural descrito en este documento o conocido por un experto en la técnica. Tal nucleobase puede estar marcada o puede formar parte de una molécula que está marcada y contiene la nucleobase.

Nucleósidos

[0061] Como se usa en este documento, un "nucleósido" se refiere a una unidad química individual que comprende una nucleobase unida covalentemente a una porción conectora de nucleobase. Un ejemplo no excluyente de una "porción conectora de nucleobase" es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un "azúcar de 5 carbonos"), incluyendo, entre otros, una desoxirribosa, una ribosa, una arabinosa o un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos. Los ejemplos no excluyentes de un derivado o un análogo de un azúcar de 5 carbonos incluyen una 2'-fluoro-2'-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico en el que un átomo de oxígeno sustituye a un carbono en el anillo de azúcar.

[0062] En la técnica se conocen diferentes tipos de unión(es) covalente(s) de una nucleobase a una porción conectora de nucleobase. A modo de ejemplo no excluyente, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G) o una nucleobase 7-deazapurina típicamente une covalentemente la posición 9 de una purina o una 7-deazapurina a la posición 1' de un azúcar de 5 carbonos. En otro ejemplo no excluyente, un nucleósido que comprende una nucleobase de pirimidina (es decir, C, T o U) típicamente une covalentemente una posición 1 de una pirimidina a una posición 1' de un azúcar de 5 carbonos (Kornberg y Baker, 1992).

Nucleótidos

[0063] Como se usa en el presente documento, un "nucleótido" se refiere a un nucleósido que comprende además una “porción de cadena principal". Una cadena principal por lo general une covalentemente un nucleótido a otra molécula que comprende un nucleótido, o a otro nucleótido para formar un ácido nucleico. La “porción de cadena principal" en los nucleótidos de origen natural comprende típicamente un fósforo, que está unido covalentemente a un azúcar de 5 carbonos. La unión de la porción de cadena principal se produce típicamente en la posición 3 'o 5' del azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, en la técnica se conocen otros tipos de uniones, particularmente cuando un nucleótido comprende derivados o análogos de un azúcar o fósforo de 5 carbonos de origen natural.

Análogos de ácido nucleico

[0064] Un ácido nucleico puede comprender, o estar compuesto en su totalidad por, un derivado o análogo de una nucleobase, una porción conectora de nucleobase y/o cadena principal que puede estar presente en un ácido nucleico de origen natural. El ARN con análogos de ácido nucleico también se puede marcar de acuerdo con los métodos de la invención. Como se usa en este documento, un "derivado" se refiere a una forma modificada o alterada químicamente de una molécula de origen natural, mientras que los términos “equivalente” o "análogo" se refieren a una molécula que puede o no parecerse estructuralmente a una molécula o porción natural, pero que posee funciones similares. Como se usa en este documento, una “porción” generalmente se refiere a un componente químico o molecular más pequeño de una estructura química o molecular más grande. Los análogos o derivados de nucleobases, nucleósidos y nucleótidos son ampliamente conocidos en la técnica y se han descrito (véase, por ejemplo, Scheit, 1980).

[0065] La molécula de ácido nucleico puede modificarse adicionalmente para obtener afinidades de unión optimizadas/adecuadas. La secuencia primaria puede modificarse. También es posible añadir una porción/porciones hidrófobas en la molécula de ácido nucleico para expandir su diversidad de interacción con las dianas. Todas estas posibilidades se han descrito en detalle en Hasegawa H y col.

[0066] Se puede usar el término "recombinante”, y generalmente se refiere a una molécula que ha sido manipulada in vitro o que es el producto replicado o expresado de dicha molécula.

Métodos recombinantes

[0067] Los expertos en la técnica conocen bien los métodos recombinantes para producir ácidos nucleicos en una célula. Estos incluyen el uso de vectores, plásmidos, cósmidos y otros vehículos para administrar un ácido nucleico a una célula, que puede ser la célula diana o simplemente una célula hospedadora (para producir grandes cantidades de la molécula de ARN deseada). Alternativamente, tales vehículos pueden usarse en el contexto de un sistema libre de células siempre que estén presentes los reactivos para generar la molécula de ARN. Dichos métodos incluyen los descritos en Sambrook, 2003, Sambrook, 2001 y Sambrook, 1989. En determinadas formas de realización, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que no son sintéticas. En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura química de un ácido nucleico de origen natural y una secuencia de un ácido nucleico de origen natural. Además del uso de tecnología recombinante, dichos ácidos nucleicos no sintéticos pueden generarse químicamente, por ejemplo, empleando tecnologías utilizadas para crear oligonucleótidos.

Células hospedadoras y células diana

[0068] Las células en las que se introduce una molécula de ácido nucleico de la invención o en las que se evalúa la presencia de dicha molécula pueden derivar de cualquier organismo o estar contenidas en cualquier organismo. Preferiblemente, la célula es una célula de vertebrado. Más preferiblemente, la célula es una célula de mamífero. Incluso más preferiblemente, la célula es una célula humana.

[0069] Una célula de mamífero puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o pluripotente, divisible o indivisible, inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede ser una célula indiferenciada, como una célula madre, o una célula diferenciada, como una célula de un órgano o tejido. Alternativamente, las células pueden calificarse como células epiteliales, cerebrales, mamarias, cervicales, del colon, del tubo digestivo, cardíacas, renales, del intestino grueso, hepáticas, pulmonares, ováricas, pancreáticas, cardíacas, prostáticas, vesicales, del intestino delgado, gástricas, testiculares o uterinas.

[0070] Como se usa en este documento, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se pueden usar indistintamente. Todos estos términos también incluyen su progenie, que es cualquiera y todas las generaciones posteriores formadas por división celular. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Una célula hospedadora puede ser "transfectada" o "transformada", lo cual se refiere a un proceso mediante el cual se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula sujeto primaria y su progenie. Como se usa en el presente documento, los términos células o células hospedadoras "modificadas genéticamente” y "recombinantes" están destinados a hacer referencia a una célula en la que se ha introducido una secuencia de ácido nucleico exógena, como, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o una construcción modelo que codifica un gen indicador. Por lo tanto, las células recombinantes se distinguen de las células de origen natural que no contienen un ácido nucleico introducido de forma recombinante.

[0071] Un tejido puede comprender una o varias células hospedadoras que se van a transformar o poner en contacto con una composición de administración de ácido nucleico y/o un agente adicional. El tejido puede formar parte de un organismo o estar separado de este. En determinadas formas de realización, un tejido y sus células constituyentes pueden comprender, pero no se limitan a, células cerebrales, células madre, células hepáticas, pulmonares, óseas, mamarias, cervicales, del colon, endometriales, epiteliales, esofágicas, células caliciformes, renales, ováricas, pancreáticas, prostáticas, vesicales, de la piel, del intestino delgado, gástricas, testiculares, cardíacas.

[0072] En determinadas formas de realización, la célula o el tejido hospedador puede estar comprendido/a en al menos un organismo. En determinadas formas de realización, el organismo puede ser un mamífero, un ser humano, un primate o un murino. Un experto en la técnica entenderá mejor las condiciones en las que incubar todas las células hospedadoras descritas anteriormente para mantenerlas y permitir su división para formar la progenie.

Métodos de administración

[0073] La presente invención implica, en algunas formas de realización, la administración de un ácido nucleico a una célula. Esto se puede hacer como parte de una aplicación terapéutica.

[0074] Las moléculas de ARN pueden estar codificadas por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término "vector" se utiliza para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para su introducción en una célula donde se puede replicar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es ajena a la célula en la que se está introduciendo el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedadora en la que la secuencia no se encuentra normalmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales, lentivirus y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la técnica sabría construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook y col., 1989 y Ausubel y col., 1996. Además de codificar un polipéptido modificado tal como gelonina modificada, un vector puede codificar secuencias polipeptídicas no modificadas, tales como una etiqueta o una molécula de direccionamiento. Una molécula de direccionamiento es aquella que dirige el ácido nucleico deseado a un órgano, tejido, célula u otra ubicación particular en el cuerpo de un sujeto.

[0075] El término "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico que se puede transcribir. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y que se describen.

Modos de administración y formulaciones

[0076] Una molécula de ácido nucleico de la invención puede estar presente en una composición, preferiblemente en una composición farmacéutica. La molécula de ácido nucleico de la invención se puede administrar a un sujeto sola o en forma de una composición o composición farmacéutica para el tratamiento de una afección o enfermedad como se define en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de las proteínas en preparaciones aptas para el uso farmacéutico. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida. Para la administración tópica, las proteínas de la invención se pueden formular como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, etc., como se conoce en la técnica. Las formulaciones sistémicas incluyen las diseñadas para la administración por inyección, por ejemplo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como las diseñadas para la administración transdérmica, transmucosa, inhalatoria, oral o pulmonar. Para la inyección, los ácidos nucleicos de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso. Para la administración por vía transmucosa, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se desea permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para la administración oral, los ácidos nucleicos se pueden formular fácilmente combinando las moléculas con vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico ampliamente conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular los ácidos nucleicos de la invención como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente que va a recibir el tratamiento. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados incluyen materiales de relleno tales como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes granulantes; y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una de sus sales, tal como el alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas pueden recubrirse con azúcar o recubrirse entéricamente usando técnicas estándar. Para las preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los vehículos, excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, se pueden añadir aromatizantes, conservantes, colorantes y similares. Para la administración bucal, las moléculas pueden adoptar la forma de comprimidos, grageas, etc. formuladas de manera convencional. Para la administración por inhalación, las moléculas para su uso de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de gelatina para usar en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo de los ácidos nucleicos y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

[0077] Además de las formulaciones descritas anteriormente, las moléculas también se pueden formular como preparación de liberación prolongada. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las moléculas pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite apto) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de administración farmacéutica.

[0078] Los liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos de administración que pueden usarse para administrar los ácidos nucleicos de la invención.

[0079] Un ácido nucleico de la invención se puede administrar en combinación con un vehículo o lípido para aumentar la captación celular. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se puede administrar en combinación con un lípido catiónico. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, lipofectina, DOTMA, DOPE y DOTAP. En la publicación WO0071096 se describen diferentes formulaciones, tales como DOTAP, colesterol o formulación de derivados del colesterol que se pueden utilizar de forma eficaz para la terapia génica. En otros documentos también se describen diferentes formulaciones de lípidos o liposomas que incluyen nanopartículas y métodos de administración; estos incluyen, pero no se limitan a, las publicaciones de patente de EE. UU. 20030203865, 20020150626, 20030032615, y 20040048787. Los métodos utilizados para formar partículas también se describen en las patentes de EE. UU. n.° 5,844,107, 5,877,302, 6,008,336, 6,077,835, 5,972,901,6,200,801, y 5,972,900. Los ácidos nucleicos también se pueden administrar en combinación con una amina catiónica, tal como la poli-L-lisina.

[0080] Los ácidos nucleicos también se pueden conjugar con una porción química, como transferrina y colesterilos. Además, los oligonucleótidos pueden dirigirse a ciertos orgánulos mediante la unión de grupos químicos específicos al oligonucleótido. Por ejemplo, la unión del oligonucleótido a una matriz adecuada de residuos de manosa dirigirá el oligonucleótido al hígado. Otros ligandos de direccionamiento se describen en Liu B., Brief Funct. Genomic Proteomic 6: 112-119, 2007. Otros ejemplos adicionales son los azúcares de carbohidratos, tales como la galactosa, N-la acetilgalactosamina, la manosa; vitaminas, como los folatos; moléculas pequeñas, incluyendo naproxeno, ibuprofeno u otras moléculas de unión a proteínas conocidas, ciclodextrina, que se dirige al receptor de transferrina (Hu-Lieskovan y col.., 2005), PEI (PEG-PEI dirigido a RGD, Schiffelers y col. 2004), anisamida, péptido RGD o análogos de RGD, poli-arginina, fragmento de anticuerpo monocatenario anti-TfR/TfRscFv, anexina A5 (dirigida a membranas que exponen la fosatidilserina, Garnier y col.., 2009, 11: 2114-22), WO 2009/126933, donde se describen composiciones y métodos para la administración a un sitio específico de ácidos nucleicos combinándolos con ligandos de direccionamiento y componentes endosomolíticos. La selección de ácidos nucleicos también se puede lograr mediante el uso de tecnología de aptámeros, como se describe en el documento WO2005/111238. Además, porciones de lípidos adicionales, como lípidos PEG, colesterol, lípidos auxiliares endosomolíticos o péptidos (WO2009/046220) o la morfología general de las nanopartículas generadas (caracterizadas por la carga y el tamaño de partícula) para los vehículos de administración mencionados anteriormente pueden conferir especificidad de actuación.

[0081] Además, las moléculas pueden administrarse usando un sistema de liberación sostenida, como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico. Existen varios materiales de liberación sostenida de uso extendido y ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar las moléculas durante unas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica de las moléculas quiméricas, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de las moléculas.

[0082] Alternativamente, las moléculas pueden administrarse utilizando un sistema de administración basado en la química de coordinación, como se describe en el documento WO2007011217.

[0083] Los ácidos nucleicos pueden incluirse en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como ácidos o bases libres o como sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Las sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico son aquellas sales que mantienen sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se preparan por reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y próticos que las correspondientes formas de base libre.

[0084] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de moléculas de ácido nucleico disueltas o dispersas en un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Las expresiones “aceptable desde el punto de vista farmacéutico o farmacológico” se refieren a entidades y composiciones moleculares que no producen, o que producen de forma aceptable, reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La aceptabilidad de los efectos adversos se determina en función de la gravedad de la enfermedad. Los expertos en la técnica conocerán la preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de ácido nucleico a la luz de la presente memoria, como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para la administración en animales (por ejemplo, humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la División de Estándares Biológicos (Office of Biological Standards) de la FDA.

[0085] Como se usa en el presente documento, "vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, desintegrantes, lubricantes, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, materiales similares y combinaciones de los mismos, que conocería un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company,1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas 0 farmacéuticas.

[0086] Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se van a administrar en forma sólida, líquida o en aerosol, y si han de ser estériles para vías de administración tales como la inyección. La presente invención se puede administrar por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada irrigando directamente las células en las que se desea actuar, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o mediante otro método o cualquier combinación de los anteriores, como sabrá un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990).

[0087] La dosis real de una composición de la presente invención administrada a un animal o paciente puede determinarse mediante factores físicos y fisiológicos tales como el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, las intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, la idiopatía del paciente y la vía de administración. El médico responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración de principio(s) activo(s) en una composición y la dosis apropiada para cada sujeto.

[0088] En determinadas formas de realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % de un compuesto activo. En otras formas de realización, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo que se pueda derivar entre estos. En otros ejemplos no excluyentes, una dosis también puede comprender menos de 1 microgramo/kg de peso corporal, o 1 microgramo/kg de peso corporal, de 5 microgramos/kg de peso corporal, 10 microgramos/kg de peso corporal, 50 microgramos/kg de peso corporal, 100 microgramos/kg de peso corporal, 200 microgramos/kg de peso corporal, 350 microgramos/kg de peso corporal, 500 microgramos/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, 50 mg/kg de peso corporal, 100 mg/kg de peso corporal, 200 mg/kg de peso corporal, 350 mg/kg de peso corporal o 500 mg/kg de peso corporal, a 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo que se pueda derivar entre estos. En ejemplos no excluyentes de un intervalo derivable de los números enumerados en este documento, se puede administrar un intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, 5 microgramos/kg de peso corporal a 500 miligramos/kg de peso corporal, etc. en función de los números descritos anteriormente.

En cualquier caso, la composición puede comprender varios antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Además, la prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluidos, entre otros, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de estos.

[0089] El compuesto se puede formular en una composición en forma de base libre, neutra o de sal. Las sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen las sales de adición de ácidos, por ejemplo, aquellas formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que están formadas con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, ácido tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.

[0090] En formas de realización en las que la composición está en forma líquida, un vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que comprende, entre otros, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, como lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido mediante la dispersión en vehículos tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante el uso de tensioactivos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de tales métodos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos como, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio o combinaciones de los mismos.

[0091] En otras formas de realización, en la presente invención se pueden usar gotas oftálmicas, soluciones o atomizadores nasales, aerosoles o inhalantes. Estas composiciones se diseñan generalmente para que sean compatibles con el tipo de tejido en el que se desea que actúen. En un ejemplo no excluyente, las soluciones nasales suelen ser soluciones acuosas diseñadas para administrarse en los conductos nasales en gotas o aerosoles. Las soluciones nasales se preparan para que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de modo que se mantenga la acción ciliar normal. Por tanto, en las formas de realización preferidas, las soluciones nasales acuosas suelen ser isotónicas o tener un pH regulado, para mantener un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5. Además, se pueden incluir en la formulación conservantes antimicrobianos similares a los utilizados en preparaciones oftálmicas, fármacos o estabilizadores de fármacos apropiados si es necesario. Por ejemplo, se conocen varias preparaciones nasales comerciales que incluyen fármacos como antibióticos o antihistamínicos. En determinadas formas de realización, las moléculas se preparan para la administración por vías tales como la ingestión oral. En estas formas de realización, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas (por ejemplo, cápsulas de gelatina duras o blandas), formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, comprimidos, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de las mismas. Las composiciones orales se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Los vehículos preferidos para la administración oral comprenden diluyentes inertes, vehículos comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral se puede preparar como un jarabe o elixir. Un jarabe o elixir puede comprender, por ejemplo, al menos un principio activo, un edulcorante, un conservante, un aromatizante, un colorante, un conservante o combinaciones de los mismos.

[0092] En determinadas formas de realización preferidas, una composición oral puede comprender uno o más aglutinantes, excipientes, desintegrantes, lubricantes, aromatizantes y combinaciones de los mismos. En determinadas formas de realización, una composición puede comprender uno o más de los siguientes: un aglutinante, tal como, por ejemplo, goma tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicálcico, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un desintegrante, tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante como, por ejemplo, estearato de magnesio; un edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un aromatizante, tal como, por ejemplo, menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza, aroma de naranja, etc. o combinaciones de los anteriores. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, vehículos tales como un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimiento o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, pastillas o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos.

[0093] La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse mínimamente a una concentración, por ejemplo, de menos de 0,5 ng/mg de proteína.

[0094] En formas de realización particulares, se puede lograr la absorción prolongada de una composición inyectable mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de estos.

[0095] También se puede emplear cualquier forma de realización mencionada anteriormente con respecto a la administración o el transporte a las células por lo que respecta a la implementación de la administración de los compuestos medicinales mencionados en esta sección.

Dosis eficaces

[0096] Las moléculas de la invención se usarán generalmente en una cantidad eficaz para lograr el propósito deseado. Para su uso para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, las moléculas de la invención, o sus composiciones farmacéuticas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los síntomas o parámetros asociados con la inflamación o la coagulación como se ha definido anteriormente en el presente documento, o para prolongar la supervivencia del paciente que está siendo tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

[0097] Para la administración sistémica, puede estimarse inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración circulante que incluya la CE50 determinada en cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

[0098] Las dosis iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podrá optimizar fácilmente la administración a seres humanos en función de los datos sobre animales.

[0099] La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar concentraciones plasmáticas de las moléculas que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosis habituales para el paciente para la administración por inyección varían de 0,01 a 0,1 mg/kg/día, o de 0,1 a 5 mg/kg/día, preferiblemente de 0,5 a 1 mg/kg/día o más. Pueden lograrse concentraciones en suero terapéuticamente eficaces administrando múltiples dosis cada día.

[0100] En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las proteínas puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar las dosis locales terapéuticamente eficaces sin experimentación innecesaria.

[0101] La cantidad de moléculas administradas dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, del peso del sujeto, de la gravedad de la afección, de la forma de administración y del criterio del médico que prescribe el tratamiento.

[0102] La terapia puede repetirse de forma intermitente mientras los síntomas sean detectables o incluso cuando no sean detectables. La terapia puede administrarse sola o en combinación con otros medicamentos o tratamientos (incluida la cirugía).

Toxicidad

[0103] Preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas descritas en este documento proporcionará un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad sustancial. La toxicidad de las moléculas descritas en este documento se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) o la DL100 (la dosis letal para el 100 % de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren las proteínas que poseen altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis que no sea tóxico para su uso en humanos. La dosis de las proteínas descritas en este documento se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Cada médico puede elegir la formulación, la vía de administración y la dosis exactas en vista del estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, p.1).

Grupos laterales

[0104] Un "grupo lateral" puede estar unido o conjugado al ácido nucleico. Los grupos laterales pueden aumentar la captación celular del ácido nucleico. Los grupos laterales se pueden unir a cualquier porción del ácido nucleico, pero comúnmente se unen al extremo o extremos de la cadena de oligonucleótidos. Los ejemplos de grupos laterales incluyen, pero no se limitan a: derivados de acridina (es decir, 2-metoxi-6-cloro-9-ammoacridina); reticulantes, tales como derivados de psoraleno, azidofenacilo, proflavina y azidoproflavina; endonucleasas artificiales; complejos metálicos tales como EDTA-Fe (II), o-fenantrolina-Cu (I) y porfirina-Fe (II); porciones alquilantes; nucleasas tales como nucleasa amino-1-hexanolstafilocócica y fosfatasa alcalina; transferasas terminales; abzimas; colesterilos; portadores lipofílicos; conjugados de péptidos; alcoholes de cadena larga; ésteres de fosfato; aminos; grupos mercapto; marcadores radiactivos; marcadores no radiactivos como tintes; y polilisina u otras poliaminas. En un ejemplo, el ácido nucleico se conjuga con un carbohidrato, carbohidrato sulfatado o glicano.

Identidad de secuencia

[0105] La "identidad de secuencia" se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico (nucleótidos, polinucleótidos, ARN, ADN), según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de ácido nucleico, según sea el caso, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. Y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

[0106] Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos de acceso al público. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, el paquete de programa GCG (Devereux, J., y col.., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, B^lA^{s t}N y FASTA (Altschul, S. F. y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa BlAst X está disponible al público en Nc Bi y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col.., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. y col., J. Mol. Biol.

215: 403-410 (1990). También se puede utilizar el conocido algoritmo de Smith-Waterman para determinar la identidad.

[0107] Los parámetros preferidos para la comparación de ácidos nucleicos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)); Matriz de comparación: coincidencias = 10, discordancia = 0; Penalización por hueco: 50; Penalización por longitug del hueco: 3. Disponible como el programa Gap de Genetics Computer Group, ubicada en Madison, Wisconsin. Los parámetros predeterminados para las comparaciones de ácidos nucleicos son los que se han indicado.

[0108] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usa en su sentido no excluyente para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero que los elementos no mencionados específicamente no se excluyen. Además, el verbo "consistir" puede ser reemplazado por "consistir esencialmente en" lo que significa que una molécula de ácido nucleico o composición que comprende dicha molécula de ácido nucleico como se define en este documento puede comprender componentes adicionales a los identificados específicamente, sin que dicho paso o pasos adicionales alteren la característica única de la invención. Además, el verbo "consistir" puede ser reemplazado por "consistir esencialmente en", lo que significa que un método como se define en este documento puede comprender pasos adicionales a los específicamente identificados, sin que dicho paso o pasos adicionales alteren la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y sólo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno/a”.

[0109] Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Descripción de las figuras

[0110]

FIG 1: Actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2 en la prueba del tiempo de sangría en la cola. Se inyectó por vía intravenosa a las ratas la SEQ ID NO. 2 a dosis de 5, 20 y 40 mg/kg de solución salina. Como control positivo, se utilizaron rivaroxabán y warfarina. El rivaroxabán se administró por sonda oral 1 hora antes de la prueba del tiempo de sangría. El tiempo de sangría se midió tanto en ratas macho (A) como hembras (B), 5 minutos después de la inyección o 1 hora después de la alimentación por sonda oral. Cada barra representa las medias ± SE (ANOVA unidireccional seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Dunnett; * p < 0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001).

FIG 2: Actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2 en la prueba de la derivación arteriovenosa. Se inyectó solución salina (vehículo) o solución de la SEQ ID NO. 2 a ratas macho por vía intravenosa, según su peso corporal. El rivaroxabán se administró por vía oral al grupo de control positivo. De 5 a 90 minutos después de la administración, se anestesió a las ratas con pentobarbital-na (50 mg/kg). La vena yugular izquierda y la arteria carótida derecha de las ratas anestesiadas se conectaron con dos catéteres. El peso del trombo formado en el hilo se calculó restando el peso medio del hilo de nailon rugoso (A). Se midieron los tiempos de protrombina (B) y se analizaron los tiempos de tromboplastina parcial activada (APTT) (C). Cada barra representa la media ± SEM (n = 8 para los grupos de vehículo y rivaroxabán, n = 3 para el grupo de la SEQ ID NO. 2), * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 frente al Vehículo.

FIG. 3: Actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2 en la prueba de trombosis arterial inducida por cloruro férrico. Antes de la trombosis arterial inducida por cloruro férrico, se trató a los ratones con 3 dosis de la SEQ ID NO. 2. A los ratones se les inyectó por vía intravenosa la SEQ ID NO. 2 a dosis de 5, 20 y 40 mg/kg, 5 minutos antes de la prueba de cloruro férrico. Se realizó la formación de trombos arteriales para medir tanto el peso (A) de los trombos formados como el tamaño (B). Cada barra representa la media - SE (análisis estadístico ANOVA bidireccional seguido de comparaciones post-hoc de Bonferroni; * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001).

FIG 4: Producción de citocinas antiinflamatorias inducida por inyección de LPS en ratones C57BL/6. A los ratones se les administró vehículo (control negativo), dexametasona (control positivo) o compuesto preparado (1 de 3 dosis), y luego 5 minutos más tarde se les inyectó LPS. Dos (2) horas después de la inyección de LPS se extrajo sangre de los ratones y se aisló el suero. La concentración de IL-10, TNF, IL-6 e IL-1P en suero se midió usando el kit Luminex de eBioscience. Cada barra representa la media ± SEM (n = 8 para los grupos de vehículo y rivaroxabán, n = 3 para el grupo de la SEQ ID NO. 2), * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 frente al Vehículo.

FIG 5: Efecto de la SEQ ID NO. 2 sobre las respuestas inmunitarias celulares provocadas por la inyección de LPS en ratones C57BL/6. Se inyectó a ratones C57BL/6 la SEQ ID NO. 2 a 5, 25 y 50 mg/kg 5 minutos antes de la inyección intravenosa de LPS. Dos horas después de la inyección de LPS, se tomaron muestras de sangre. Se prepararon muestras de sangre para análisis de citometría de flujo para determinar la expresión de CD11b y CD14. Se analizaron las cantidades de glóbulos blancos CD11b CD14 y CD11b CD14-. Cada barra representa la media ± SEM (n = 8 para los grupos de vehículo y rivaroxabán, n = 3 para el grupo de la SEQ ID NO. 2), * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 frente al Vehículo.

FIG 6: Efectos del tratamiento sobre la tasa de supervivencia después de la inyección de LPS en ratones C57BL/6. Se inyectó dos veces por vía intravenosa a ratones hembra C57BL/ la SEQ ID NO. 2 a 10, 25, 50 y 100 mg/kg. La primera inyección tuvo lugar 15 minutos después de la administración de LPS, la segunda 1 hora después de la inyección de LPS. El 6° grupo recibió dos inyecciones a los 60 minutos y 2 horas después de la administración de LPS. La incidencia de supervivencia se determinó 72 horas después de la inyección de LPS (A). La tasa de supervivencia porcentual se representó gráficamente por 4 horas en (B) (n = 20 ratones por grupo); La tasa de supervivencia se analizó mediante la prueba estándar de rangos logarítmicos de Mantel-Cox.

FIG 7: Efecto del tratamiento con la SEQ ID NO. 2 sobre el análisis de toxicología expandido de la mortalidad inducida por LPS en suero en ratones C57BL/6. Se inyectó dos veces por vía intravenosa a ratones hembra C57BL/6 la SEQ ID NO. 2 a 10, 25, 50 y 100 mg/kg. La primera inyección tuvo lugar 15 minutos después de la administración de LPS, la segunda 1 hora después de la inyección de LPS. El 7° grupo recibió dos inyecciones a los 60 minutos y 2 horas después de la administración de LPS. (A) Concentraciones séricas de AST, ALT, creatina cinasa, BUN y fósforo en cada grupo. Se recogió sangre después de 28 horas. (B) Concentraciones séricas de albúmina, creatinina, proteína total, colesterol y triglicéridos en cada grupo. Se recogió sangre después de 28 horas. Los valores p se calcularon mediante la prueba t. Los valores P del grupo 2 (vehículo) se dan en relación con el grupo 1 (vehículo, sin LPS). Los valores P de todos los demás grupos se determinan en relación con el grupo 2 (vehículo).

FIG 8: Efecto del tratamiento con la SEQ ID NO. 2 sobre el análisis de fibrinógeno y dímero D de la mortalidad inducida por LPS en suero en ratones C57BL/6. Se inyectó dos veces por vía intravenosa a ratones hembra C57BL/6 la SEQ ID NO. 2 a 10, 25, 50 y 100 mg/kg. La primera inyección tuvo lugar 15 minutos después de la administración de LPS, la segunda 1 hora después de la inyección de LPS. El 7° grupo recibió dos inyecciones a los 60 minutos y 2 horas después de la administración de LPS. Se muestran las concentraciones séricas de fibrinógeno y dímero D. Se recogió sangre después de 28 horas. Los valores p se calcularon mediante la prueba t. Los valores P del grupo 2 (vehículo) se dan en relación con el grupo 1 (vehículo, sin LPS). Los valores P de todos los demás grupos se determinan en relación con el grupo 2 (vehículo).

Ejemplos

Ensayo 1: Efecto anticoagulante de la SEQ ID NO.2

Ejemplo 1: Actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2. Prueba del tiempo de sangría en la cola Materiales y métodos

Ratas

[0111] Se utilizaron un total de 36 ratas Sprague-Dawley macho y hembra y se dividieron en seis grupos que comprendían 6 animales por grupo. El manejo de los animales se realizó de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de Salud (National Institute of Health) y la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio” (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care). Se alimentó a los animales ad libitum con una dieta comercial para roedores (Teklad Certified Global 18 % Protein Diet cat #: 2018SC). Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada (pH entre 2,5 y 3,5) obtenida del suministro municipal. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos y formulación

[0112] La SEQ ID NO. 2 (Biospring) (100 mg) se disolvió en 5 ml de solución salina para formar una solución madre de 20 mg/ml. Pharmaseed proporcionó el vehículo (solución salina) listo para usar para la administración intravenosa. La solución de dosificación de rivaroxabán (Bayer, Pharmaseed Ltd) se diluyó a 10 mg/kg (Grupo 2M). Se diluyó warfarina (Ceriliant, Pharmaseed Ltd) a 0,5 mg/kg (Grupo 3M). Tanto el rivaroxabán como la warfarina son estándares clínicos con actividad anticoagulante. Para obtener la solución de dosificación de la SEQ ID NO. 2 (2,5 mg/ml) para una concentración de dosis de 5 mg/kg y un volumen de dosis de 2 ml/kg para la inyección intravenosa, se diluyeron 0,375 ml de la solución madre de 20 mg/ml anterior con 2,625 ml de solución salina (Grupo 4M). Para obtener la solución de dosificación de la SEQ ID NO. 2 (10 mg/ml) para una concentración de dosis de 20 mg/kg y un volumen de dosis de 2 ml/kg para la inyección intravenosa, se diluyeron 1,5 ml de la solución madre de 20 mg/ml anterior con 1,5 ml de solución salina (Grupo 5M). Para obtener la solución de dosificación de la SEQ ID NO. 2 (20 mg/ml) para una concentración de dosis de 40 mg/kg y un volumen de dosis de 2 ml/kg para la inyección intravenosa, se utilizó la solución madre de 20 mg/ml anterior (Grupo 6).

Administración de compuestos

[0113] Las ratas recibieron la inyección por vía intravenosa cinco minutos antes de la prueba del tiempo de sangría. La cantidad de ratas por grupo se muestra en la Tabla 1. Tres grupos tratados recibieron la SEQ ID NO.

2 a dosis de 5, 20 y 40 mg/kg de solución salina. En cada género, los grupos de control recibieron vehículo salino. Un grupo de control positivo recibió rivaroxabán (10 mg/kg). El rivaroxabán se administró por sonda oral 1 hora antes de la prueba del tiempo de sangría. Un segundo grupo de control positivo recibió warfarina (0,5 mg/kg).

-

Mediciones del tiempo de sangría en la cola

[0114] Se anestesiaron ratas macho y hembra mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina. El tiempo de sangría se controló como se describe en Stupnisek. y col. (2012), hasta que el flujo sanguíneo se detuvo durante un intervalo completo de 30 segundos o hasta el final del período de 30 minutos. En ratas profundamente anestesiadas (colocadas en posición ventral) se seccionó la cola con un bisturí quirúrgico a 2 mm de la punta (y se sumergió en un tubo con 40 ml de solución salina a temperatura ambiente en posición vertical) y se midió la duración y cantidad del sangrado para evaluar el efecto hemostático de los agentes o de la administración de solución salina. Una vez completada la evaluación del tiempo de sangría, todas las ratas se sacrificaron inmediatamente mediante asfixia con CO2.

Análisis estadístico

[0115] Los resultados numéricos se expresaron como medias ± errores estándar. Si correspondía, el análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Dunnett. Se consideró significativa una probabilidad del 5 % (p < 0,05). En las figuras, el grado de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se ilustra como * p < 0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001.

Resultados y discusión

[0116] Se evaluó la actividad antitrombótica de la SEQ ID NO. 2 administrada por vía intravenosa a ratas en tres dosis diferentes. Como se muestra en la Figura 1, el tiempo de sangría medio del grupo aumentó significativamente en todos los grupos tratados tanto en Machos (Figura 1A) como en Hembras (Figura 1B) en comparación con el grupo de vehículo correspondiente (1M). Se midió un tiempo de sangría comparable entre los grupos de control positivo (rivaroxabán y warfarina) y todas las dosis de la SEQ ID NO. 2 analizadas tanto en ratas macho (Figura 1A) como hembra (Figura 1B). El tiempo de sangría en los grupos tratados correspondientes fue similar en las ratas macho y hembra. Se puede observar un efecto de respuesta a la dosis de la SEQ ID NO.

2 en las ratas macho pero no en las ratas hembra.

[0117] Se observó que la SEQ ID NO. 2 tiene un claro efecto anticoagulante sobre el tiempo de sangría en ambos géneros de animales (macho y hembra). Sin embargo, solo en ratas macho, se observó un efecto de anticoagulación de respuesta a la dosis de la SEQ ID NO. 2. La actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2 en todas las dosis fue equivalente a la actividad de los estándares clínicos (rivaroxabán y warfarina).

Ejemplo 2: Actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2. Prueba de derivación arteriovenosa

Materiales y métodos

Ratas

[0118] Este estudio se realizó en Shanghai WuXi AppTec Co., Ltd., y de acuerdo con los procedimientos animales estándar IACUC de WuXi junto con las pautas del IACUC que cumplen con la Ley de Bienestar Animal (Animal Welfare Act), la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals), y la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio (Office of Laboratory Animal Welfare, OLAW). Se alimentó a ratas macho Sprague-Dawley con un peso corporal que oscilaba entre 150-200 g (Vital River; Bejing, P.R. China) ad libitum con una dieta para roedores. Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos

[0119] Se disolvió rivaroxabán (10 mg/kg) en agua y se almacenó a 4 °C. Se disolvieron 20 mg de la SEQ ID NO.

2 (Biospring) en 3 ml de solución salina, se agitó con vórtex durante 5 min, se sonicó con un baño de agua ultrasónico durante 1 minuto para alcanzar 6,66 mg/ml de la SEQ ID NO. 2.

Administración de la SEQ ID NO. 2

[0120] Los animales se asignaron a 3 grupos de dosificación según el peso corporal (ver tabla 2). Los animales tratados con vehículo recibieron una inyección intravenosa de solución salina 90 min antes del ensayo de derivación. A los animales tratados con el control positivo se les administró por vía oral rivaroxabán 10 mg/kg a los 90 minutos antes del ensayo de derivación. La SEQ ID NO. 2 se inyectó por vía intravenosa 5 minutos antes del ensayo de derivación. Los volúmenes de dosis se muestran en la tabla 2.

Tabla 2 - régimen de tratamiento

Grupo ^{Número de animal}Tratamiento Vía Volumen de la _(M)dosis Vehículo 90 min 8 Salina intravenosa 5ml/kg Rivaroxabán-10 mg/kg 90

_min8 Rivaroxabán oral 5ml/kg Apta-1-33,3 mg/kg 5 min 3 Apta-1 intravenosa 5ml/kg Mediciones de trombos (prueba de derivación arteriovenosa)

[0121] Las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (vía intraperitoneal, 50 mg/kg, 20 mg/ml, 2,5 ml/kg) 60 min antes del ensayo de derivación. La vena yugular izquierda y la arteria carótida común derecha se separaron y se canularon con dos catéteres de PE-60 de 6 cm de largo llenos de solución salina. Los catéteres de polietileno (American Health and Medical Supply International Corp.) se conectaron con un tubo de polietileno PE-160 de 8 cm de largo que contenía un hilo de nailon rugoso de 6 cm de largo (tamaño: 3-0, peso de 3,5 mg) doblado en una cuerda doble. La circulación extracorpórea se mantuvo durante 15 min, el peso del trombo formado en el hilo se calculó restando el peso medio del hilo de nailon rugoso.

Mediciones de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT)

[0122] Se extrajeron muestras de sangre (2 ml) del catéter de la arteria carótida y se recogieron en tubos de plástico que contenían 1/10 del volumen de citrato trisódico al 3,2 % inmediatamente después de la extracción del trombo. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 7000 rpm durante 10 min a 4 °C para la recogida de plasma. Las muestras para el análisis APTT se analizaron por duplicado en Labmedicin Skáne utilizando un analizador de coagulación BCS-XP (Siemens Marburg, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los reactivos utilizados fueron el reactivo APTT Actin FSL (Siemens, Marburg, Alemania) y NaCl estéril al 0,9 %. Análisis estadístico

[0123] La significancia de la diferencia entre los grupos de control y tratados se analizó realizando un análisis de varianza (ANOVA) con el software de Office EXCEL. Se consideró estadísticamente significativo un valor p inferior a 0,05.

Resultados y discusión

[0124] Como se muestra en la Figura 2A, las ratas tratadas con la SEQ ID NO2 mostraron un peso del trombo significativamente menor en comparación con el grupo de vehículo (48,1 % menos que el grupo de vehículo). El grupo de control positivo, al que se administró rivaroxabán 90 minutos antes de la circulación extracorpórea, también formó un trombo significativamente reducido (26,5 % menos que el grupo de vehículo).

Como se muestra en la Figura 2B, el control positivo de rivaroxabán prolongó significativamente los tiempos de protrombina, mientras que el grupo de la SEQ ID NO. 2 no mostró ninguna diferencia significativa en comparación con el grupo de vehículo. Como se muestra en la Figura 2C, las ratas tratadas con la SEQ ID NO. 2 mostraron un aumento significativo en el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), mientras que el control positivo rivaroxabán no mostró ninguna diferencia en comparación con el grupo del vehículo. Este efecto positivo de la SEQ ID NO. 2 sobre el APTT se ha confirmado en ratones, perros, primates no humanos y humanos mediante estudios comparables ex vivo.

[0125] En el modelo de derivación arteriovenosa en ratas, la SEQ ID NO. 2 redujo significativamente el peso del trombo, demostrando su efecto antitrombótico. El compuesto positivo rivaroxabán también inhibe significativamente la formación de trombos, aunque el efecto no fue tan potente como el compuesto de la SEQ ID NO. 2.

Mientras que la SEQ ID NO. 2 no tuvo ningún efecto sobre el tiempo de protrombina, sí prolongó el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). Esto podría indicar que la inhibición de la formación de trombos por la SEQ ID NO. 2 se debería principalmente a la prolongación del tiempo de tromboplastina parcial activada, mientras que la del rivaroxabán se debió principalmente a la prolongación del tiempo de protrombina.

Ejemplo 3: Actividad anticoagulante de la SEQ ID NO. 2 en el modelo de trombosis arterial inducida por cloruro férrico

Materiales y métodos

Ratas

[0126] El manejo de los animales se realizó de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de Salud (National Health Institute, NIH) y la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, AAALAC). Un total de 36 ratas Sprague-Dawley (Envigo RMS) se dividieron en seis grupos que comprendían 6 animales por grupo (3 machos y 3 hembras). Las ratas macho Sprague-Dawley tenían un peso corporal promedio de 350 g al comienzo del estudio. Las ratas hembra tenían un peso corporal de 243 g. A ambos se les alimentó ad libitum con una dieta para roedores. Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos y formulación

[0127] La SEQ ID NO. 2 (Biospring) (100 mg) se disolvió en 5 ml de solución salina para formar una solución madre de 20 mg/ml. Vehículo (solución salina, Teva) listo para usar para administración intravenosa. La solución de dosificación de rivaroxabán (Bayer, Pharamseed Ltd) se diluyó a 10 mg/kg (Grupo 2M). Se diluyó warfarina (Ceriliant, Pharmaseed Ltd) a 0,5 mg/kg (Grupo 3M). Tanto el rivaroxabán como la warfarina son estándares clínicos con actividad anticoagulante. Para obtener la solución de dosificación de la SEQ ID NO. 2 (2,5 mg/ml) para una concentración de dosis de 5 mg/kg y un volumen de dosis de 2 ml/kg para la inyección intravenosa, se diluyeron 0,375 ml de la solución madre de 20 mg/ml anterior con 2,625 ml de solución salina (Grupo 4M). Para obtener la solución de dosificación de la SEQ ID NO. 2 (10 mg/ml) para una concentración de dosis de 20 mg/kg y un volumen de dosis de 2 ml/kg para la inyección intravenosa, se diluyeron 1,5 ml de la solución madre de 20 mg/ml anterior con 1,5 ml de solución salina (Grupo 5M). Para obtener la solución de dosificación de la SEQ ID NO. 2 (20 mg/ml) para una concentración de dosis de 40 mg/kg y un volumen de dosis de 2 ml/kg para la inyección intravenosa, se utilizó la solución madre de 20 mg/ml anterior (Grupo 6).

Administración de compuestos

[0128] Se asignaron al estudio seis grupos, cada uno compuesto por seis ratas por grupo (3 machos y 3 hembras). En cada género, a un grupo de control de 1 rata macho y 1 hembra se le inyectó por vía intravenosa (i.v.) el Vehículo. Un primer grupo de control positivo de 2 machos y 2 hembras se trató por vía oral con rivaroxabán (10 mg/kg), 1 hora antes del ensayo de cloruro férrico. A un segundo grupo de control positivo, que constaba de 3 ratas macho y 3 hembras, se le inyectó por vía intravenosa warfarina (0,5 mg/kg) 5 minutos antes del ensayo de cloruro férrico. Por último, se inyectó intravenosamente a tres grupos (que constaban de 4-6 M y 4-6 F) la SEQ ID NO. 2 a dosis de 5, 20 y 40 mg/kg, 5 minutos antes del ensayo de cloruro férrico.

Trombosis arterial inducida por cloruro férrico

[0129] Se anestesiaron ratas macho y hembra mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina. La formación de trombos arteriales se realizó como describen Lee J. y col. (2009). La arteria carótida derecha se aisló y diseccionó para liberarla del nervio vago y los tejidos circundantes. La formación de trombos arteriales se indujo envolviendo un Papel de filtro Whatman de Grado 1 de 2 mm2, saturado con cloruro férrico al 50 % (FeCl3; p/v, en agua destilada), en la arteria carótida derecha durante 10 min. Se midió el tiempo necesario para que ocurriera la oclusión durante un máximo de 60 minutos, y al tiempo de oclusión se le asignó un valor de 60 minutos para los vasos que se ocluyeron dentro de ese tiempo.

Medición de la formación de coágulos

[0130] Se observó la formación de coágulos durante 60 minutos después de la aplicación de FeCl3. Después de completar la evaluación del tiempo de coagulación, todas las ratas se sacrificaron inmediatamente por sobredosis de Pental. La pared de la arteria se seccionó longitudinalmente; se extrajo el coágulo, se pesó y se midió con un calibre.

Análisis estadístico

[0131] Los resultados numéricos se expresaron como medias ± SE. Según el caso, el análisis estadístico se llevó a cabo utilizando ANOVA bidireccional o unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni. Se consideró significativa una probabilidad del 5 % (p < 0,05). En las figuras, el grado de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se ilustra como * p < 0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001.

Resultados y discusión

[0132] Se observó la formación de coágulos durante 60 minutos después de la aplicación de FeCh. Se observó una reducción del peso (Figura 3A) y del tamaño (Figura 3B) del coágulo en todos los grupos tratados (controles positivos y SEQ ID NO. 2) en comparación con el grupo de control (Vehículo). Las ratas macho SEQ ID NO. 2 tratadas con la dosis más baja (5 mg/kg) mostraron diferencias estadísticamente significativas en el tamaño (FIG 3B) y el peso (FIG 3A) del coágulo en comparación con el control positivo de rivaroxabán y SEQ ID NO. 2 en dosis altas.

[0133] Estudio 2. Actividades antiinflamatorias de la SEQ ID NO. 2.

Ejemplo 4: Efectos del tratamiento sobre la liberación de citocinas después de la invección de LPS en ratones C57BL/6.

Materiales y métodos

Ratones

[0134] Los ratones hembra C57BL/6 (Taconic Biosciences) tenían 8 semanas de edad al comienzo del estudio. Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos

[0135] La SEQ ID NO. 2 (Biospring) (100 mg) se disolvió en 5 ml de solución salina para formar una solución madre de 20 mg/ml. El vehículo era solución salina.

[0136] Se preparó una solución madre de dexametasona mezclando dexametasona y beta-ciclodextrina en una proporción de 4:96, se solubilizó en PBS a 2 mg de dexametasona/ml y se almacenó a -20 °C. La solución de dosificación de dexametasona se preparó diluyendo la solución madre a 1 mg/ml con PBS. Se utilizó dexametasona administrada de 5 a 10 mg/kg por vía intraperitoneal como control positivo para la supresión de la respuesta inmunitaria.

Administración de compuestos

[0137] Se administró a los ratones dosis como se muestra en la tabla 3, cinco minutos antes de la inyección intravenosa de lipopolisacárido (LPS) (100 ng/200 |_il).

-

Mediciones de citocinas

[0138] Dos horas después de la inyección de LPS, se extrajo sangre de los ratones y se aisló el suero y se añadió a EDTA en tubos Gel Clot Activator. Se analizaron al menos 100 |_il. La concentración de IL-10, TNF, IL-6 e IL-1P en suero se midió usando el kit Luminex de eBioscience, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizó un único análisis en cada muestra.

Resultados

[0139] Para determinar la actividad antiinflamatoria de la SEQ ID NO. 2, los ratones se trataron con la SEQ ID NO. 2 antes de la estimulación con LPS. Se evaluaron múltiples citocinas proinflamatorias (TNF, IL-6 e IL-1P) y la citocina antiinflamatoria IL-10 en muestras de suero de ratones tratados.

La concentración sérica de IL-10 se muestra en la Figura 4A. Se observa un aumento de IL-10 en comparación con el grupo de vehículo para SEQ ID NO. 2, y las diferencias fueron significativas en los grupos a los que se les administraron dosis de 25 y 50 mg/kg.

Puede verse en las Figuras 4B, 4C y 4D que el grupo al que se le administró la SEQ ID NO. 2 a 5 mg/kg tenía concentraciones de citocinas en suero similares a las del grupo de vehículo.

Los grupos a los que se les administró la SEQ ID NO. 2 a 25 y 50 mg/kg tuvieron concentraciones más bajas de TNF, IL-6 e IL-1P en suero, pero solo la reducción en la concentración de IL-1P en el grupo con dosis de 50 mg/kg fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo de vehículo.

[0140] En conjunto, estos resultados indican que la SEQ ID NO. 2 tiene propiedades antiinflamatorias en el modelo de producción de citocinas inducida por LPS.

Ejemplo 5 : Efecto del tratamiento con la SEQ ID NO.2 sobre respuestas inmunes basadas en células después de la invección de LPS en ratones C57BL/6.

Materiales y métodos

Ratones

[0141] Los ratones hembra C57BL/6 (Taconic Biosciences) tenían 8 semanas de edad al comienzo del estudio. Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos

[0142] La SEQ ID NO. 2 (Biospring) (100 mg) se disolvió en 5 ml de solución salina para formar una solución madre de 20 mg/ml. El vehículo era solución salina.

[0143] Se preparó una solución madre de dexametasona mezclando dexametasona y beta-ciclodextrina en una proporción de 4:96, se solubilizó en PBS a 2 mg de dexametasona/ml y se almacenó a -20°C. La solución de dosificación de dexametasona se preparó diluyendo la solución madre a 1 mg/ml con PBS. Se utilizó dexametasona, administrada a entre 5 y 10 mg/kg por vía intraperitoneal como control positivo para la supresión de la respuesta inmunitaria.

Administración de compuestos

[0144] Los ratones recibieron dosis como se muestra en la tabla 4, cinco minutos antes de la inyección intravenosa de lipopolisacárido (LPS) (100 ng/200 |_il).

-

Citometría de flujo

[0145] Dos horas después de la inyección de LPS, se extrajo sangre de los ratones y se tomaron muestras de sangre. El estudio de citometría de flujo se realizó en BD FACSCalibur (láseres: 488 nm; 635 nm y UV). En nuestro estudio se midió la expresión de la integrina Mac-1 (CD11b/18) en leucocitos mediante citometría de flujo. La expresión de CD11b en todos los leucocitos, monocitos y granulocitos se evaluó mediante citometría de flujo usando tinción de fluorescencia doble (CD 45/CD 11b).

Resultados y discusión

[0146] La proporción de células CD11b+ CD14+ y la expresión de CD11b en los leucocitos se muestran en la Figura 5. El grupo de dexametasona tenía una expresión significativamente reducida de CD11b en las células CD11b+ en comparación con el grupo del vehículo, pero tenía una proporción similar de células CD11b+ CD14+ en leucocitos. El grupo al que se le administró la SEQ ID NO. 2 a 5 mg/kg tuvo una expresión similar de CD11b y una proporción similar de células CD11b+ CD14+ en leucocitos en comparación con el grupo de vehículo.

[0147] Los grupos a los que se les administró la SEQ ID NO. 2 a 25 y 50 mg/kg tenían una proporción significativamente menor de células CD11b+ CD14+ en leucocitos en comparación con el grupo de vehículo. De manera similar, estos grupos tenían una menor expresión de CD11b, siendo la diferencia estadísticamente significativa para el grupo que recibió una dosis de 50 mg/kg.

[0148] En conjunto, los resultados del estudio indican que la SEQ ID NO. 2 tiene propiedades antiinflamatorias en el modelo de producción de citocinas inducida por LPS.

Ejemplo 6: Efecto del tratamiento con la SEQ ID NO. 2 sobre la mortalidad inducida por LPS en ratones C57BL/6.

Material y métodos

Ratones

[0149] En este estudio, se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de 10-12 semanas de edad (Taconic Biosciences). Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos

[0150] Se diluyó lipopolisacárido (LPS) de E. coli (O111: B4) en PBS.

[0151] La SEQ ID NO. 2 se almacenó en forma de polvo a 4 °C hasta su uso. Se añadió polvo a solución salina y se agitó con vórtex en solución para preparar la solución madre de SEQ ID NO. 2.

Tratamiento

[0152] Los ratones se trataron como se muestra en la tabla 5. Un grupo de 20 ratones de control no recibió lipopolisacárido. Para todos los demás grupos, se inyectó LPS por vía intraperitoneal a 10 mg/kg. A los ratones se les inyectó, por vía intravenosa 15 minutos y 60 minutos después de la administración de LPS, la SEQ ID NO.

2 a concentraciones de 10, 25, 50 y 100 mg/kg. Excepto el grupo 6, que recibió la inyección por vía intravenosa una vez a los 15 minutos y una vez a los 120 minutos después de la administración de LPS.

Ensayo de supervivencia

[0153] Cuando se administran altas dosis de LPS, los animales sufren un choque inducido por LPS y se puede observar la mortalidad. Durante las 72 horas posteriores a la inyección de LPS, se comprobó la mortalidad de los ratones varias veces al día. Todos los ratones supervivientes se sacrificaron al final del estudio (día 3).

Resultados y discusión

[0154] Como se muestra en la Figura 6A y en el gráfico de supervivencia correspondiente (Figura 6B), la SEQ ID NO. 2 administrada a 25, 50 y 100 mg/kg mejoró significativamente la supervivencia en comparación con los ratones tratados con vehículo. Estos hallazgos sugieren que la administración intravenosa de la SEQ ID NO. 2 es eficaz en el tratamiento del choque inducido por LPS en este estudio.

Ejemplo 7: Efecto del tratamiento con la SEQ ID NO. 2 sobre el análisis de toxicología expandido de la mortalidad inducida por LPS en suero en ratones C57BL/6.

Materiales y métodos

Ratones

[0155] En este estudio, se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de 10-12 semanas de edad (Taconic Biosciences). Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos

[0156] Se diluyó lipopolisacárido (LPS) de E. coli (O111: B4) en PBS. La SEQ ID NO. 2 se almacenó en forma de polvo a 4 °C hasta su uso. Se añadió el polvo a la solución salina y se agitó con vórtex en solución para preparar la solución madre de la SEQ ID NO. 2.

Tratamiento

[0157] Los ratones se trataron como se muestra en la tabla 6. Un grupo de 20 ratones de control no recibió lipopolisacárido. Para todos los demás grupos, se inyectó LPS por vía intraperitoneal a 10 mg/kg. Se inyectó a los ratones, por vía intravenosa 15 minutos y 60 minutos después de la administración de LPS, la SEQ ID NO. 2 a concentraciones de 10, 25, 50 y 100 mg/kg. Excepto el grupo 7, que recibió la inyección por vía intravenosa una vez a los 15 minutos y una vez a los 120 minutos después de la administración de LPS.

Recogida y análisis de sangre

[0158] La sangre recogida en la hora 28 se analizó para el análisis toxicológico ampliado realizado por IDEXX Laboratories, Inc. (N. Grafton, MA). Se intentó recoger suficiente sangre para realizar cada análisis 5 veces para cada grupo.

Análisis toxicológico ampliado

[0159] Con el análisis toxicológico ampliado se midieron las concentraciones de AST, ALT, creatina cinasa, albúmina, proteína total, BUN, colesterol, glucosa, fósforo, triglicéridos, colestero1HDL, ácido biliar, colesterol LDL, bilirrubina total, GGT, bilirrubina conjugada y creatinina. En este documento, se muestran los resultados de AST, ALT, creatina cinasa, albúmina, proteína total, BUN, colesterol, fósforo, triglicéridos, colesterol y creatinina. Resultados y discusión

[0160] La Figura 7A muestra las concentraciones de AST, ALT, creatina cinasa, BUN y fósforo. Estos fueron los analitos que mostraron mejoras significativas en el estudio anterior de Hooke 20170510-2 (estudio de Aptahem APT1-17-PPD018), y también mostraron mejoras en este estudio, aunque las mejoras en ALT y creatina cinasa no tuvieron significancia estadística.

[0161] La Figura 7B muestra las concentraciones de albúmina, creatinina, proteína total, colesterol y triglicéridos. Los triglicéridos mostraron mejoras significativas en 50 mg/kg de la SEQ ID NO. 2 administrados 60 y 120 minutos después de la administración de LPS. La creatinina mostró mejoras significativas en 50 mg/kg de la SEQ ID NO. 2 administrados 15 y 60 min, así como 60 y 120 min después de la administración de LPS, respectivamente. El colesterol mostró mejoras significativas en 25 mg/kg de la SEQ ID NO. 2 y en 50 mg/kg de la SEQ ID NO. 2 administrados tras 15 y 60 min.

[0162] En general, las concentraciones séricas de AST, creatinina, BUN, fósforo, colesterol y triglicéridos mejoraron significativamente (con concentraciones más similares a las de los ratones sanos no sometidos previamente a experimentación) en los grupos tratados por vía intravenosa con la SEQ ID NO. 2, en comparación con el grupo tratado con vehículo.

[0163] Estos hallazgos sugieren que la administración intravenosa de la SEQ ID NO. 2 es eficaz para proteger contra el daño o disfunción orgánico/a, particularmente contra el daño o insuficiencia hepática y/o renal, durante el choque inducido por LPS.

Ejemplo 8: Efecto del tratamiento con la SEQ ID NO. 2 sobre el análisis de fibrinógeno y dímero D de la mortalidad inducida por LPS en suero en ratones C57BL/6.

Material y métodos

Ratones

[0164] En este estudio, se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de 10-12 semanas de edad (Taconic Biosciences). Los animales tenían acceso libre a agua potable esterilizada en autoclave y acidificada. Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio, con aire acondicionado y filtrado con un suministro de aire fresco adecuado. Los animales se mantuvieron en un ambiente de clima controlado.

Compuestos

[0165] Se diluyó lipopolisacárido (LPS) de E. coli (O111: B4) en PBS. La SEQ ID NO. 2 se almacenó en forma de polvo a 4°C hasta su uso. Se añadió el polvo a la solución salina y se agitó con vórtex en solución para preparar la solución madre de la SEQ ID NO. 2.

Tratamiento

[0166] Los ratones se trataron como se muestra en la tabla 7. Un grupo de 20 ratones de control no recibió lipopolisacárido. Para todos los demás grupos, se inyectó LPS por vía intraperitoneal a 10 mg/kg. A los ratones se les inyectó, por vía intravenosa 15 minutos y 60 minutos después de la administración de LPS, la SEQ ID NO.

2 a concentraciones de 10, 25, 50 y 100 mg/kg. Excepto el grupo 7, que recibió la inyección por vía intravenosa una vez 15 minutos y una vez 120 minutos después de la administración de LPS.

Recogida y análisis de sangre

[0167] La sangre recogida en la hora 28 se analizó para el análisis de fibrinógeno y dímero D de plasma citratado realizado por IDEXX Laboratories, Inc. (N. Grafton, MA). Hook Laboratories intentó recoger suficiente sangre para realizar cada análisis 5 veces para cada grupo, pero en un caso (plasma citratado para el dímero D, para el Grupo 4) solo se pudo recoger sangre suficiente para realizar el análisis 4 veces.

Resultados y discusión

[0168] En la figura 8 se muestran las concentraciones de fibrinógeno y dímeros D. No hubo diferencias significativas en las concentraciones de fibrinógeno en plasma entre los ratones tratados con la SEQ ID NO. 2 y los ratones tratados con vehículo. Las concentraciones de dímero D en plasma fueron significativamente más bajas en el grupo tratado con 100 mg/kg de la SEQ ID NO. 2 y el grupo tratado con 50 mg/kg de la SEQ ID NO. 2 a los 60 y 120 minutos en comparación con el grupo tratado con vehículo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácido nucleico para su uso como medicamento a modo de medicamento antiinflamatorio y/o anticoagulante y/u organoprotector, en donde dicha molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO. 1 o 2.

2. Molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1,

(a) en donde un parámetro asociado con la inflamación, como la concentración de una citocina proinflamatoria, la concentración de una integrina proinflamatoria y/o el número de infiltrados proinflamatorios, ha disminuido y/o

(b) en donde un parámetro asociado con la coagulación, como la formación de coágulos de fibrina y/o la concentración de trombina, ha disminuido y/o

(c) en donde un parámetro asociado con el daño o la insuficiencia orgánico/a, como AST, ALT, GGT, ALP, LDH, creatina cinasa, BUN, albúmina, creatinina, glucosa, ácido biliar, bilirrubina total, bilirrubina conjugada, fósforo, proteína total, colesterol LDL, colesterol HDL, colesterol y/o triglicéridos, se ha mejorado.

3. Molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho uso es como medicamento para prevenir, tratar, hacer que remita, curar y/o retardar una enfermedad o una afección en la que se produce inflamación y/o coagulación y/o daño o insuficiencia orgánico/a, en donde dicha molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO. 1 o 2.

4. Molécula de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de ácido nucleico es monocatenaria y/o un nucleótido de esta molécula de ácido nucleico está modificado en comparación con un nucleótido presente en el ARN.

5. Molécula de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 4, en donde una pirimidina de la molécula de ácido nucleico está fluorada y preferiblemente todas las pirimidinas de la molécula de ácido nucleico están fluoradas.

6. Composición que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es para utilizar como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición es preferiblemente una composición farmacéutica, donde dicha composición farmacéutica comprende un vehículo, adyuvante, sal, diluyente y/o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

7. Molécula de ácido nucleico o composición para su uso como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de ácido nucleico o la composición es para administración intravenosa.

8. Molécula de ácido nucleico para su uso o composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enfermedad o afección en la que se produce inflamación y/o coagulación y/o daño o insuficiencia orgánico/a se selecciona de entre síndrome coronario agudo (SCA), trombosis, obstrucción de vasos periféricos, arteriosclerosis obstructiva, vasculitis, trastorno funcional que se produce después de una cirugía cardíaca, complicación causada por el trasplante de un órgano, angina de pecho, accidente isquémico transitorio, toxemia del embarazo (preeclampsia, eclampsia), diabetes, enfermedad venooclusiva (EVO) hepática, trombosis venosa profunda (TVP), sepsis, choque séptico, sepsis grave, traumatismo, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), coagulación intravascular diseminada (CID), artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, hepatitis, sepsis, enfermedad hepática alcohólica, esteatosis no alcohólica, sarcoidosis, diabetes autoinmune, diabetes mellitus, uveítis, esclerosis múltiple, control del rechazo del aloinjerto después de un trasplante de órgano, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), enfermedades pulmonares inflamatorias, incluyendo asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), lupus eritematoso sistémico (LES), sarcoidosis, dermatitis atópica, cáncer, infección, intoxicación, síndromes de aspiración, hipoperfusión o choque, enfermedad inducida por calor, isquemia, daño por isquemia-reperfusión (IRI), enfermedad autoinmune, hemorragia, pancreatitis, bacteriemia, quemaduras, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y disfunción multiorgánica o síndrome de disfunción multiorgánica, o una complicación o un efecto de la progresión que se asocia con una de estas enfermedades o afecciones.