ES2896224T3 - Composición farmacéutica que comprende arginina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de PolyQ - Google Patents
Composición farmacéutica que comprende arginina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de PolyQ Download PDFInfo
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Abstract
Una composición farmacéutica, que comprende: una seleccionada del grupo que consiste en arginina, una sal fisiológicamente aceptable de la misma, y un solvato de la misma, como principio activo, para su uso en el tratamiento o la prevención de las enfermedades de PolyQ y la enfermedad de PolyQ es una seleccionada del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálido- luisiana y atrofia muscular espinal y bulbar.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica que comprende arginina para su uso en el tratamiento de la enfermedad de PolyQ Sector de la técnica
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones adjuntas, eficaz como agente terapéutico para su uso en el tratamiento o la prevención de las enfermedades de poliglutamina (PolyQ) según se define en las reivindicaciones adjuntas, que son enfermedades neurodegenerativas seleccionadas del grupo que consiste en diversas ataxias espinocerebelosas heredadas (SCA, por sus siglas en inglés), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA, por sus siglas en inglés) y atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana, y se puede administrar con seguridad a los seres humanos.
Estado de la técnica
Junto con el envejecimiento de la población, las enfermedades neurodegenerativas que se desarrollan con el envejecimiento han ido aumentando de forma constante y se han convertido en un grave problema social debido a que no existe un tratamiento eficaz. Por este motivo, se requiere que se desarrollen agentes farmacéuticos eficaces para estas enfermedades neurodegenerativas.
Las enfermedades de PolyQ son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que se desarrollan con el envejecimiento. Las enfermedades de PolyQ son un término genérico para nueve enfermedades neurodegenerativas hereditarias, incluyendo la enfermedad de Huntington y diversas ataxias espinocerebelosas, que son causadas por una expansión anormal (>40 aminoácidos) del tramo de PolyQ en las proteínas causantes de la enfermedad. Las enfermedades de PolyQ son enfermedades intratables que aún no tienen un tratamiento eficaz, aunque se estima que entre 7.000 y 8.000 personas se ven afectadas en Japón. En las enfermedades de polyQ, la expansión del tramo de polyQ dentro de las proteínas causantes de la enfermedad desencadena el plegamiento incorrecto y la agregación de estas proteínas, lo que da como resultado la neurodegeneración.
Las chaperonas químicas estabilizan las proteínas en su conformación natural y ejercen propiedades antiagregantes al afectar a la velocidad o fidelidad de la reacción de plegamiento de proteínas. La arginina es una chaperona química y es uno de los aditivos más usados para prevenir la agregación y aumentar la solubilidad de diversas proteínas recombinantes expresadas en Escherichia coli (Documento no relacionado con patentes 1). Este efecto antiagregación inespecífico de la arginina indica la posibilidad de que la arginina pueda utilizarse para el tratamiento de enfermedades del plegamiento incorrecto de proteínas en general, incluidas la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. De hecho, se informa que la arginina previene la agregación de amiloide-p (beta) 1-42 (Documento no relacionado con patentes 2).
La arginina es uno de los aminoácidos que constituyen los organismos, incluidos los seres humanos, y puede administrarse de forma segura a animales tales como los seres humanos. La seguridad de la arginina se ha establecido en ensayos clínicos sobre enfermedades distintas de las enfermedades de PolyQ (Documentos no relacionados con patentes 3 y 4). Además, se sabe que la arginina atraviesa la barrera hematoencefálica (BHE) (Documento no relacionado con patentes 5).
Lista de citas
Bibliografía no relacionada con patentes
[Documento no relacionado con patentes 1] Arakawa et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, vol. 304(1), pág. 148-152.
[Documento no relacionado con patentes 2] Das et al., PLoS One, noviembre de 2007, Edición 11, e1176.
[Documento no relacionado con patentes 3] Koga et al., Neurology, 2002, vol. 58(5), pág. 827.
[Documento no relacionado con patentes 4] Boenzi et al., Journal of Inherited Metabolic Disease, 2012, vol.
35(4), pág. 647-653.
[Documento no relacionado con patentes 5] Pardridge, Physiological Reviews, 1983, vol. 63(4), pág. 1481-1535.
[Documento no relacionado con patentes 6] Nagai et al., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2000, vol.
275(14), pág. 10437-10442.
[Documento no relacionado con patentes 7] Nagai et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, vol. 14(4), pág. 332-340.
[Documento no relacionado con patentes 8] Jarrett y Lansbury, Cell, 1993, vol. 73(6), pág. 1055-1058.
[Documento no relacionado con patentes 9] Williams y Paulson, Trends in Neurosciences, 2008, vol. 31(10), pág.
521-528.
[Documento no relacionado con patentes 10] Takahashi et al., Human Molecular Genetics, 2008, vol. 17(3), pág.
345-356.
[Documento no relacionado con patentes 11] Takahashi et al., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2007, vol. 282(33), pág. 24039-24048.
[Documento no relacionado con patentes 12] Warrick et al., Cell, 1998, vol. 93(6), pág. 939-949. [Documento no relacionado con patentes 13] Nagai et al., Human Molecular Genetics, 2003, vol. 12(11), pág.
1253-1260.
[Documento no relacionado con patentes 14] Satyal et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, vol. 97(11), pág. 5750-5755.
[Documento no relacionado con patentes 15] Watase et al., Neuron, 2002, vol. 34(6), pág. 905-919.
[Documento no relacionado con patentes 16] Hamase et al., Journal of Chromatography A, 2010, vol. 1217(7), pág. 1056-1062.
[Documento no relacionado con patentes 17] Popiel et al., PLoS One, 2012, vol. 7(11), e51069.
[Documento no relacionado con patentes 18] Katsuno et al., Neuron, 2002, vol. 35(5), pág. 843-854.
[Documento no relacionado con patentes 19] Katsuno et al., Nature Medicine, 2003, vol. 9(6), pág. 768-773. [Documento no relacionado con patentes 20] Deckel et al. (Brain Research, 2000, 875, 187-195) se refiere específicamente al tratamiento de la enfermedad de Huntington.
[Documento de patente 21] El documento US 2004/152778 desvela el tratamiento de trastornos de poliglutamina mediante la administración de cantidades eficaces de L-metionina S-sulfoximina, L-etionina S-sulfoximina, glufosinato y/o alfa-cetoácidos de cadena ramificada.
[Documento no relacionado con patentes 22] Nakayama Izumi et al. (Bulletin of the Japanese Society for Neurochemistry, 2006, 45, 455-) desvela que la arginina inhibe la agregación de polyQ in vitro pero la administración oral de arginina en un modelo de ratón con enfermedad de Huntington no mostró ninguna mejora en el deterioro de las neuronas motoras y la pérdida de peso corporal.
Objeto de la invención
Problema técnico
El objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica administrable de forma segura a seres humanos y eficaz para el tratamiento de las enfermedades de PolyQ seleccionadas del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana y atrofia muscular espinal y bulbar.
Solución al problema
Los inventores de la presente invención han seleccionado compuestos inhibidores de la agregación de PolyQ usando un sistema de ensayo in vitro para desarrollar un agente terapéutico común dirigido al plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas desnaturalizadas, y han identificado la arginina como un compuesto inhibidor de la agregación de PolyQ con alta permeabilidad en la BHE y seguridad. Además, los inventores han encontrado que la arginina suprime la formación de agregados de PolyQ y la neurodegeneración no solo en modelos de células cultivadas sino también en modelos de Drosophila y ratones de ataxias espinocerebelosas (SCA1, SCA3) y atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA). Basándose en los hallazgos, se completó la presente invención.
La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención es el siguiente punto [1] a [2].
[1] Una composición farmacéutica que incluye: una seleccionada del grupo que consiste en arginina, una sal fisiológicamente aceptable de la misma, y un solvato de la misma, como principio activo, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad de PolyQ, en la que la enfermedad de PolyQ es una seleccionada del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálidoluisiana y atrofia muscular espinal y bulbar.
[2] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con el punto [1], en la que la enfermedad de PolyQ es una seleccionada del grupo que consiste en ataxia espinocerebelosa hereditaria de tipo 1, ataxia espinocerebelosa heredada de tipo 3 y atrofia muscular espinal y bulbar.
Efectos ventajosos de la invención
La arginina es una sustancia fisiológicamente activa que se ha confirmado que es segura en seres humanos y tiene una alta permeabilidad en la BHE. Por este motivo, la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención que contiene arginina como principio activo es muy eficaz para tratar las enfermedades de PolyQ seleccionadas del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana y atrofia muscular espinal y bulbar en diversos animales, incluidos los seres humanos.
Descripción de las figuras
La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la turbidez en el tiempo cuando la proteína Thio-Q62 se incubó durante 5 días en presencia (círculos de color negro) o ausencia (círculos de color blanco) de arginina en el Ejemplo 1.
La figura 2 es un gráfico que muestra la turbidez relativa (%) de cada solución después de incubar la proteína Thio-Q62 en presencia de arginina o prolina durante 5 días (la turbidez de la solución que contiene solo la proteína Thio-Q62 se considera como del 100 %) en Ejemplo 1.
La figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la turbidez en el tiempo de una solución que contiene solo la proteína Thio-Q62, una solución que contiene la proteína Thio-Q62 con adición de semilla en solitario, una solución que contiene la proteína Thio-Q62 con adición de semilla y arginina, y una solución que contiene la proteína Thio-Q62 con adición de semilla y prolina en el Ejemplo 1.
La figura 4 es un espectro de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés) de cada solución que contiene la proteína Thio-Q62 en solitario antes y después de la incubación durante 5 días en el Ejemplo 2.
La figura 5 es una imagen de gel PAGE nativo teñido con CBB de la proteína Thio-Q62 incubada durante 5 días en presencia o ausencia de arginina en el Ejemplo 2.
La figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de medir la relación de células positivas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) entre células que expresan simultáneamente Q56-CFP y Q56-YFP incubadas con o sin arginina en el Ejemplo 2.
La figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de medición de recuentos por partícula (CPP, por sus siglas en inglés) obtenidos mediante el análisis de espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS, por sus siglas en inglés) de lisados celulares de células que expresan Q45-GFP en el Ejemplo 2.
La figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de medición del tiempo de difusión de los componentes rápidos (DT1) obtenidos por análisis FCS de lisados celulares de células que expresan Q45-GFP en el Ejemplo 2. La figura 9 son imágenes microscópicas ópticas representativas de los ojos compuestos externos de las moscas de tipo silvestre y MJDtr-Q78(S) en el Ejemplo 3.
La figura 10 son imágenes de inmunotinción con un anticuerpo anti hemaglutinina de los discos oculares de larvas de moscas MJDtr-Q78(S) en el Ejemplo 3.
La figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de medición del movimiento de la cola por minuto (recuento/min) obtenidos de la prueba de movimiento rápido de la cola en la línea modelo de enfermedad de PolyQ de C. elegans en el Ejemplo 3.
La figura 12 es un gráfico que muestra la evolución temporal de la tasa de supervivencia de la línea modelo de enfermedad de PolyQ de C. elegans en el Ejemplo 3.
La figura 13 es una imagen SDD-AGE obtenida por inmunotransferencia de los lisados de nematodos del Ejemplo 3.
La figura 14 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la intensidad del frotis en la imagen SDD-AGE de la figura 13.
La figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de L-arginina en el cerebro de ratones SCA1 en el Ejemplo 4.
La figura 16 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de L-arginina en el suero de ratones SCA1 en el Ejemplo 4.
La figura 17 es un gráfico que muestra la evolución temporal del tiempo de marcha hasta que los ratones de tipo silvestre y los ratones SCA1 cayeron de la varilla giratoria (latencia) en la prueba de varilla giratoria del Ejemplo 4.
La figura 18 es un gráfico que muestra la evolución temporal de la ingesta diaria de agua de cada ratón en la prueba de varilla giratoria del Ejemplo 4.
La figura 19 es un gráfico que muestra la evolución temporal de la cantidad de tiempo para cruzar la barra de ratones de tipo silvestre y ratones SCA1 de 28 semanas de edad en la prueba de la barra de equilibrio del Ejemplo 4.
La figura 20 es un gráfico que muestra los resultados de medir el porcentaje de células con formación de cuerpos de inclusión en la corteza cerebral y el hipocampo de ratones SCA1 mediante análisis inmunohistoquímicos del Ejemplo 4.
La figura 21 es un gráfico que muestra la evolución temporal del tiempo de marcha hasta que los ratones de tipo silvestre y los ratones SCA1 cayeron de la varilla giratoria (latencia) en la prueba de varilla giratoria del Ejemplo 5.
La figura 22 es un gráfico que muestra los resultados de observación de la actividad horizontal de ratones de tipo silvestre y ratones SBMA en el Ejemplo 5.
La figura 23 es un gráfico que muestra los resultados de observación de la exploración vertical de ratones de tipo silvestre y ratones SBMA en el Ejemplo 5.
Descripción detallada de la invención
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es para su uso en el tratamiento o la prevención de las enfermedades de PolyQ seleccionadas del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana y atrofia muscular espinal y bulbar, y contiene arginina como principio activo. La arginina tiene un efecto inhibidor de la agregación de las proteínas causantes de enfermedad con un tramo de PolyQ anormalmente expandido. Este efecto suprime la formación de agregados de PolyQ y la neurodegeneración. Además, se ha confirmado que la arginina es segura en los seres humanos y tiene una alta permeabilidad en la BHE. Por lo tanto, la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede inhibir de forma segura y eficaz la formación de agregados de PolyQ y similares en el sistema nervioso central.
El principio activo contenido en la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser una sal fisiológicamente aceptable de arginina. La arginina es un aminoácido básico y las sales fisiológicamente aceptables de arginina incluyen, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido fosfórico; sales de ácidos orgánicos, tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido acético, propionato, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido málico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido glucurónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico y ácido salicílico; o sales de aminoácidos ácidos, tales como ácido aspártico y ácido glutámico.
El principio activo contenido en la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser un solvato de arginina o una sal fisiológicamente aceptable de la misma. Los ejemplos del disolvente que forma el solvato incluyen agua, etanol y similares.
El principio activo contenido en la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser solo una forma libre de arginina. El principio activo puede ser tanto una forma libre de arginina como su sal fisiológicamente aceptable. El principio activo puede ser tanto una forma libre de arginina como su solvato. El principio activo puede ser tanto una sal fisiológicamente aceptable de arginina como su solvato. El principio activo puede ser todo de una forma libre de arginina, una sal fisiológicamente aceptable de la misma y sus solvatos.
La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender solo el principio activo, que es arginina, su sal fisiológicamente aceptable o sus solvatos. Además del principio activo, la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede contener diversos aditivos siempre que no perjudiquen el efecto inhibidor de la agregación de PolyQ de la arginina. Los ejemplos de dichos aditivos incluyen excipientes, aglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, disolventes, agentes disgregantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes de isotonicidad, estabilizadores, tampones, conservantes, antioxidantes, agentes saporíferos y colorantes. Estos aditivos pueden seleccionarse apropiadamente de sustancias farmacéuticamente aceptables que se usan para la formulación farmacéutica.
La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención puede contener otros principios activos siempre que no altere el efecto inhibidor de la agregación de PolyQ de la arginina. Los ejemplos de dichos otros principios activos incluyen otros principios activos de agentes terapéuticos para las enfermedades de PolyQ. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención es extremadamente eficaz como componente de la medicina para el tratamiento contra las enfermedades de PolyQ seleccionadas del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana y atrofia muscular espinal y bulbar, es decir, enfermedades causadas por la agregación de proteínas con un tramo de PolyQ anormalmente expandido.
En la actualidad, las ataxias espinocerebelosas hereditarias (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA17), la atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA, por sus siglas en inglés) y la atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA, por sus siglas en inglés), son ocho enfermedades neurodegenerativas conocidas. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención es eficaz como agente terapéutico para cualquiera de estas ocho enfermedades y es particularmente útil como componente de la medicina para el tratamiento o la prevención de SCA1, SCA3 o SBMA.
Las ataxias espinocerebelosas es el nombre genérico de enfermedades neurodegenerativas hereditarias o esporádicas en las que el síntoma principal es la ataxia. Clínicamente, su síntoma principal es la ataxia cerebelosa o posterior o la paraparesia espástica. En la degeneración espinocerebelosa, a menudo se observa atrofia del cerebelo y del tronco encefálico y se pueden observar características tales como lesiones de los ganglios basales y atrofia cortical cerebral. La SBMA es una enfermedad hereditaria debido a la expansión de las repeticiones de CAG que codifican el tramo de PolyQ en el gen del receptor de andrógenos. En la SBMA, se observan hallazgos neurológicos tales como síntomas bulbares, signos de neuronas motoras inferiores, temblor y reducción de los reflejos de los tendones de las extremidades, y pueden observarse síntomas de deficiencia de andrógenos y cambios neurogénicos.
La arginina es una chaperona química que actúa sobre el plegamiento de proteínas. Por lo tanto, la composición farmacéutica desvelada en el presente documento es eficaz no solo contra las enfermedades de PolyQ sino que también es eficaz como componente de la medicina para el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas causadas por la agregación anormal de proteínas. Los ejemplos de dichas enfermedades neurodegenerativas incluyen la enfermedad de Alzheimer, en la que se produce la agregación de p-amiloide o tau, la enfermedad de Parkinson, en la que se produce la agregación de a (alfa)-sinucleína, la esclerosis lateral amiotrófica, en la que se produce la agregación de TDP-43 (proteína de unión al ADN TAR de 43 kD), y una degeneración lobular frontotemporal en la que se produce la agregación de TDP-43 o tau. De hecho, la arginina tiene un efecto inhibidor sobre la agregación de amiloide-p, que es una proteína causante de enfermedad de la enfermedad de Alzheimer.
La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención se administra preferentemente a seres humanos o animales no humanos. Los ejemplos de animales no humanos incluyen mamíferos tales como ganado bovino, cerdos, caballos, ovejas, cabras, monos, perros, gatos, conejos, ratones, ratas, hámsteres y
cobayas; aves tales como pollos, codornices y patos. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención también puede administrarse a invertebrados tales como moscas y nematodos, y puede administrarse a células cultivadas, levaduras, hongos filamentosos y similares.
El método para administrar la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención a un animal no está particularmente limitado, y la dosis de la misma tampoco está particularmente limitada. Los ejemplos de formas de dosificación adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas, polvos, comprimidos, gránulos, gránulos finos, emulsiones, jarabes, soluciones y suspensiones. Los ejemplos de formas farmacéuticas adecuadas para administración parenteral incluyen inhalantes, pulverizadores, agentes intrarrectales, inyecciones, infusiones por goteo, ungüentos, cremas, absorbentes transdérmicos, absorbentes transmucosos, colirios, gotas nasales, gotas óticas, esparadrapos y parches.
Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral, se pueden producir preparaciones sólidas tales como cápsulas, comprimidos, polvos y gránulos usando aditivos para la formulación tales como excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa y manitol; agentes disgregantes tales como almidón y alginato de sodio; lubricantes como estearato de magnesio y talco; aglutinantes tales como alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa y gelatina; tensioactivos tales como ésteres de ácidos grasos; plastificantes tales como glicerina. Pueden producirse preparaciones líquidas tales como emulsiones y jarabes usando aditivos para formulación tales como agua; sacáridos tales como sacarosa, sorbitol y fructosa; glicoles tales como polietilenglicol y propilenglicol; aceites tales como aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de soja; conservantes tales como ésteres de ácido p-hidroxibenzoico; y saporíferos tales como aroma de fresa y menta piperita.
Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral, pueden prepararse preparaciones líquidas tales como inyecciones, infusiones por goteo y colirios preferentemente como preparaciones líquidas isotónicas estériles. Por ejemplo, las preparaciones inyectables se pueden preparar usando un medio acuoso que consiste en una solución salina, una solución de dextrosa o una mezcla de medio acuoso de agua salada y una solución de dextrosa.
La dosis y el número de administraciones de la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención no están particularmente limitados y pueden determinarse apropiadamente de acuerdo con el tipo y nivel de expresión de la proteína causante de enfermedad con el tramo PolyQ anormalmente expandido, la especie, el sexo, la edad, el peso corporal y la presencia o ausencia de enfermedades subyacentes, la forma de administración y similares, de manera que el efecto inhibidor de la agregación de PolyQ de la arginina pueda exhibirse suficientemente. Por ejemplo, en el caso de la administración oral o intravenosa, la dosis diaria del principio activo para adultos es preferentemente de 0,1 a 10 g/kg (peso corporal) como arginina, más preferentemente de 0,25 a 5,0 g/kg (peso corporal) como arginina, incluso más preferentemente de 0,5 a 5,0 g/kg (peso corporal) como arginina, y aún más preferentemente de 1,0 a 5,0 g/kg (peso corporal) como arginina. Tal dosis se puede administrar una vez o en varias dosis divididas. Por ejemplo, una preparación administrada por vía oral que contiene arginina como principio activo se puede dividir en tres veces al día (por la mañana, al mediodía y por la noche) de manera que la dosis total de arginina a administrar al día sea de 0,25 a 5,0 g/kg (peso corporal).
Las enfermedades de PolyQ se desarrollan gradualmente y progresan lentamente. Al administrar la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención, se suprime la agregación de PolyQ, de manera que se retrasa la progresión de diversos síntomas derivados de las enfermedades de PolyQ. En otras palabras, con el fin de suprimir la progresión y la aparición de los síntomas, es necesario tomar de forma continua un inhibidor de la agregación de PolyQ. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención que contiene arginina como principio activo que es segura incluso cuando se administra de manera estable durante un largo período de tiempo es preferible como agente terapéutico para pacientes que tienen una enfermedad de PolyQ de acuerdo con la presente invención seleccionada del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas hereditarias, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana y atrofia muscular espinal y bulbar. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención es particularmente eficaz para el tratamiento de pacientes con una enfermedad de PolyQ de baja gravedad de acuerdo con la presente invención, es decir, pacientes con enfermedad de PolyQ temprana con una neurodegeneración menos avanzada debido a la agregación de PolyQ. La composición farmacéutica también es particularmente eficaz para la prevención antes de la aparición de la enfermedad de PolyQ de acuerdo con la presente invención en pacientes que tienen una expansión anormal de las repeticiones de cAg en el gen causante de la enfermedad de PolyQ pero que aún no han desarrollado síntomas (pacientes en la preaparición de la enfermedad de PolyQ). Al tomar continuamente la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención, la aparición de síntomas y la progresión de los síntomas pueden suprimirse eficazmente en pacientes con enfermedad de PolyQ relativamente leve de acuerdo con la presente invención y pacientes en la preaparición de la enfermedad de PolyQ de acuerdo con la presente invención y se puede mejorar su calidad de vida.
La gravedad de la ataxia espinocerebelosa, incluida la enfermedad de PolyQ, puede evaluarse mediante, por ejemplo, la escala de Rankin modificada (mRS, por sus siglas en inglés). La gravedad de la mRS se evalúa de la siguiente manera. Las afecciones sin ningún síntoma se evalúan como 0. Las afecciones que tienen algunos síntomas pero sin obstáculos obvios, más específicamente, las afecciones que tienen síntomas subjetivos y signos
objetivos sin impedimentos en la vida diaria se evalúan como 1. Las afecciones levemente debilitantes, más específicamente, afecciones en las que, aunque existen restricciones en el trabajo y las actividades que se han realizado antes de la aparición, la vida diaria se puede realizar de forma independiente, se evalúan como 2. Las afecciones moderadamente discapacitantes, más específicamente, afecciones en las que se requiere algún tipo de asistencia, pero no se requiere asistencia para caminar, las comidas y la excreción, se evalúan como 3. Las afecciones de discapacidad de moderada a grave, más específicamente, afecciones en las que no se requiere atención constante, pero las demandas físicas y para caminar requieren asistencia, se evalúan como 4. Las afecciones gravemente discapacitantes, más específicamente, afecciones que requieren atención de enfermería continua y una supervisión continua, tales como estar postrado en cama, se evalúan como 5. La muerte se evalúa como 6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención se administra preferentemente de forma continua por vía oral a un paciente con ataxia espinocerebelosa con una mRS de 2 o menos, preferentemente una mRS de 0 o 1.
La gravedad de la ataxia espinocerebelosa también se puede evaluar mediante, por ejemplo, la escala de evaluación y valoración de la ataxia (SARA, por sus siglas en inglés) (Schmitz-Hubsch, et al., Neurology, 2006, vol. 66(11), pág.
1717-1720). La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención se administra preferentemente de forma continua por vía oral a pacientes con ataxia espinocerebelosa con una SARA de 20 o menos, y más preferentemente de 15 o menos.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle mediante los siguientes ejemplos.
<Ensayo de turbidez de agregación de proteínas>
En los experimentos posteriores, el ensayo de turbidez de agregación de proteínas se realizó mediante el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 6. Específicamente, se realizó de la siguiente manera.
Se usó como muestra de medición una solución en la que se disolvieron proteínas anormalmente expandidas en solución salina de fosfato (PBS). La solución se incubó a 37 °C y se midió la turbidez a 405 nm cada 24 horas usando un lector de microplacas "Spectramax Plus plate reader" (Molecular Devices Inc.).
<Análisis estadísticos>
Los datos de turbidez, FRET y concentración de arginina en cerebro de ratón se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para evaluar diferencias significativas entre grupos individuales. Las mediciones de FCS, el movimiento de la cola en la prueba de movimiento rápido de la cola, la cantidad relativa de oligómeros en el modelo de C. elegans y el porcentaje de células con inclusiones de poliglutamina en cerebros de ratón con o sin tratamiento con arginina, se analizaron mediante la prueba de la t de Student. Los datos de ingesta diaria de agua o arginina al 6 %, varilla giratoria, actividad en campo abierto, cría y barra de equilibrio se analizaron mediante un ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los datos de supervivencia se analizaron mediante la prueba de rango logarítmico. Para los análisis entre dos grupos, se usó una prueba de la t de Student. Para todos los análisis, se consideró que p <0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. Para el análisis estadístico se usó el software "GraphPad Prism" (GraphPad Software Inc.).
<Experimentación con animales>
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Animal del Instituto Nacional de Neurociencia en el Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría, Japón. Los ratones se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con alimento y agua proporcionados a voluntad. Cada ratón se destetó a las 3 o 5 semanas de edad y se mantuvo en jaulas con botellas de agua que contenían agua, L-arginina al 2 % o al 6 %.
[Ejemplo 1]
Los presentes inventores establecieron un sistema de ensayo de cribado in vitro capaz de evaluar convenientemente la agregación de proteína PolyQ anormalmente expandida mediante el método de turbidez (Patente de EE.UU. N.° 6.632.616). Además, los presentes inventores cribaron compuestos inhibidores de la agregación de PolyQ usando este sistema de ensayo de agregación de proteínas PolyQ anormalmente expandidas y, como resultado, se encontró que la arginina tiene actividad inhibidora de la agregación de PolyQ.
Por lo tanto, se examinó con más detalle la actividad inhibidora de la agregación de PolyQ de la arginina. Como proteína PolyQ anormalmente expandida se usó una proteína de fusión tiorredoxina-Q62 (Thio-Q62) que consistía de tiorredoxina y un tramo de PolyQ con 62 glutaminas.
<Preparación de la proteína Thio-Q62>
La preparación de la proteína Thio-Q62 se realizó mediante el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 7. Específicamente, se realizó de la siguiente manera.
En primer lugar, la proteína Thio-Q62 se expresó en DH5a de Escherichia coli y se purificó usando una columna de níquel "columnas de resina ProBond quelantes de níquel" (Thermo Fisher Scientific). La proteína Thio-Q62 purificada se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico usando un aparato de HPLC "Ákta Explore HPLC" (GE Healthcare Life Sciences) equipado con una columna "HiTrap Q Sepharose column" (GE Healthcare Life Sciences). La concentración final de la proteína Thio-Q62 purificada se determinó mediante el método de Lowry usando un kit "DC protein assay kit" (Bio-Rad Laboratories). Esta proteína Thio-Q62 purificada se usó para los siguientes experimentos.
<Efecto de la arginina sobre la tasa de agregación de proteínas>
Se incubó la proteína Thio-Q62 8,2 pM a 37 °C con arginina 600 mM en PBS y se sometió a medición de turbidez cada 24 horas. Como control, se incubó la proteína Thio-Q62 en solitario de la misma manera y la turbidez se midió cada 24 horas. Los resultados de la medición se muestran en la figura 1. En la figura, los círculos de color blanco representan la turbidez de una solución que contiene proteína Thio-Q62 en solitario, y los círculos de color negro representan la turbidez de una solución que contiene proteína Thio-Q62 y arginina. Como muestran los resultados de las soluciones con proteína Thio-Q62 en solitario, la turbidez de la solución de thio-Q62 aumenta de una manera dependiente del tiempo con una fase de retardo corta seguida de una elevación rápida durante la fase de agregación y finalmente alcanza una meseta. Por el contrario, la incubación conjunta de thio-Q62 con arginina a un pH neutro alargó la fase de retardo y disminuyó la velocidad de agregación.
<Dependencia de la dosis del efecto inhibidor de la arginina sobre la agregación de polyQ>
Se incubó conjuntamente la proteína thio-Q62 10 pM a 37 °C con arginina 100, 200 o 400 mM en PBS y su turbidez se midió después de 5 días. Como controles, se incubaron una solución que contenía proteína Thio-Q62 en solitario y una solución que contenía proteína Thio-Q62 y prolina 400 mM de la misma manera, respectivamente, y la turbidez se midió después de 5 días. La prolina es una sustancia que se ha confirmado que no tiene ningún efecto inhibidor de la agregación de PolyQ en el ensayo de agregación de proteínas PolyQ anormalmente expandidas. Se midió la turbidez relativa (%) de cada solución. La turbidez de la solución que contenía la proteína Thio-Q62 en solitario se fijó en el 100 %. Los resultados de la medición se muestran en la figura 2. En la figura, los valores representan la media ± SEM (n = 3). "*" representa p <0,05, "***" representa p <0,001, "n.s." representa no significativo. La prolina no ejerció ningún efecto antiagregación, mientras que se encontró que, en la solución a la que se añadió arginina, la turbidez relativa fue menor a medida que la concentración de arginina fue mayor, y el efecto inhibidor de la agregación de PolyQ de la arginina aumentó de manera dependiente de la concentración.
<Efecto de la arginina sobre la agregación de polyQ inducida por semillas>
En proteínas amiloidogénicas tales como polyQ, se sabe que los agregados de proteínas preformados desencadenan la agregación de monómeros de proteínas solubles con una fase de retardo acortada, lo que se denomina efectos de siembra (Documentos no relacionados con patentes 7 y 8). Por lo tanto, se examinó el efecto de la arginina sobre los efectos de siembra.
(Preparación de semillas)
Los agregados de proteína thio-Q62 usados como semillas se prepararon de la siguiente manera. En primer lugar, la solución de Thio-Q62 purificada (10 pM) se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso. La Thio-Q62 congelada se descongeló rápidamente a 37 °C y se centrifugó a 15.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se incubó a 37 °C durante 6 días hasta que la turbidez alcanzó una meseta y a continuación se sometió a sonicación en hielo durante seis pulsos de 30 segundos cada uno seguido de un intervalo de 60 segundos. Como resultado, se formaron agregados de proteína Thio-Q62 a sembrar. La solución sonicada resultante se usó como solución de siembra para experimentos posteriores.
(Reacción de agregación de polyQ inducida por semillas)
Se añadieron semillas de agregados de proteína Thio-Q62, arginina y prolina a una solución de proteína Thio-Q62 soluble 10 pM como se muestra en la figura 3, se incubaron a 37 °C durante 7 días y se sometieron a medición de turbidez cada 24 horas. La adición de la semilla se realizó añadiendo 20 pl por 200 pl de la solución de proteína Thio-Q62 a la solución de semilla formada previamente como se ha descrito anteriormente. Se añadieron tanto arginina como prolina a una concentración final de 400 mM por 200 pl de solución de proteína Thio-Q62. Los cambios con el tiempo de turbidez de cada solución se muestran en la figura 3. Como resultado, en comparación con la solución que contenía proteína Thio-Q62 soluble en solitario ("Thio-Q62" en la figura), en la solución que contenía proteína Thio-Q62 con semilla añadida en solitario ("Thio-Q62+semillas" en el figura), la fase de retardo desapareció y se observó un aumento inmediato de la turbidez desde el día 1, lo que demuestra un efecto de siembra. Estos
resultados indican que se ha observado un efecto de semilla en la solución que contiene proteína Thio-Q62 con semilla añadida en solitario. En la solución que contenía proteína Thio-Q62 con semilla y arginina añadidas ("Thio-Q62+semilla+Arg" en la figura), el aumento de turbidez inducido por la semilla disminuyó notablemente, mientras que no se obtuvieron los efectos observados con la arginina en la solución que contenía la proteína Thio-Q62 con la semilla y prolina añadidas ("Thio-Q62+semilla+Pro" en la figura). Estos resultados indican que la arginina alivió la agregación de polyQ inducida por semillas y, por lo tanto, sugieren el potencial de la arginina para desacelerar la agregación adicional de proteína polyQ después del inicio del proceso de agregación.
[Ejemplo 2]
Las proteínas propensas a la agregación se someten a múltiples procesos antes de la formación de agregados insolubles tales como un plegamiento incorrecto y una transición de conformación de láminas beta del monómero de proteína y un ensamblaje de los monómeros en oligómeros. Estudios recientes han indicado que las proteínas propensas a la agregación, incluidas las proteínas con un tramo de polyQ expandido, ejercen una toxicidad celular antes de la formación de agregados insolubles, cuando las proteínas experimentan una transición de conformación a una estructura rica en láminas p y se ensamblan en oligómeros solubles (Documento no relacionado con patentes 9). Es decir, en el caso de proteínas propensas a la agregación, las especies de proteínas solubles con plegamiento incorrecto y oligomerizadas en lugar de los agregados insolubles exhiben toxicidad en las células y el cerebro.
Dado que la arginina alargó la fase de retardo de la solución de thio-Q62 (Ejemplo 1) y, por lo tanto, se sugirió que afectaba a estos procesos iniciales antes de la formación de agregados insolubles, se investigó si la arginina altera la formación de estas especies de proteínas solubles pero tóxicas. Específicamente, se investigó el efecto de la arginina sobre la transición conformacional de láminas p de la proteína polyQ y la formación de oligómeros.
<Análisis de CD (dicroísmo circular)>
La proteína thio-Q62 experimenta una transición conformacional de una estructura de hélice a a una estructura rica en láminas p en el estado monomérico y el monómero de láminas p de la proteína thio-Q62 ejerce toxicidad celular (Documento no relacionado con patentes 7). Esta transición conformacional de thio-Q62 se confirmó mediante análisis de dicroísmo circular. Específicamente, se incubó la proteína Thio-Q62 8,2 pM en PBS (pH 7,5) a 37 °C durante cinco días. Se midieron los espectros de CD de la proteína Thio-Q62 en PBS (pH 7,5) antes y después de la incubación, respectivamente, usando un espectropolarímetro Modelo J-820 (Jasco) como se describe en el Documento no relacionado con patentes 7. Los resultados de la medición se muestran en la figura 4. Los espectros de la figura 4 se presentan como un promedio de 10 barridos registrados a una velocidad de 50 nm/min y una resolución de 1 nm. Los datos se expresan como elipticidad del residuo molar (0). El espectro de CD de la proteína Thio-Q62 antes de la incubación tenía un valor máximo positivo grande alrededor de 196 nm, y tenía valores máximos negativos alrededor de 207 nm y alrededor de 222 nm, respectivamente ("Día 0" en la figura). A partir del espectro de CD, se confirmó que la proteína Thio-Q62 antes de la incubación formaba una estructura de hélice a. El espectro de CD de la proteína Thio-Q62 después de la incubación tuvo un valor máximo positivo alrededor de 197 nm y un valor máximo negativo alrededor de 216 nm. A partir del espectro de CD, se confirmó que la proteína Thio-Q62 después de la incubación formaba una estructura de láminas p.
<PAGE nativa y medición de turbidez
El efecto de la arginina sobre la transición conformacional de láminas p de la proteína polyQ se investigó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante nativa (PAGE). Específicamente, se incubó la proteína Thio-Q628,2 pM con o sin arginina 600 mM en PBS (pH 7,5) a 37 °C durante cinco días. El muestreo para la PAGE nativa y la medición de la turbidez se realizaron antes de la incubación y cada 24 horas después de la incubación. Como control, se incubó la proteína Thio-Q62 en solitario de la misma manera, y se realizaron el muestreo y la medición de la turbidez. Las soluciones de muestra se sometieron a PAGE al 10 % (p/v) sin SDS en condiciones no desnaturalizantes y se separaron las proteínas en las soluciones. Las proteínas separadas se tiñeron con azul brillante de Coomassie (CBB, por sus siglas en inglés).
Los resultados de la tinción con CBB se muestran en la figura 5. Como resultado, en ausencia de arginina, la banda correspondiente al monómero rico en láminas p apareció gradualmente tras la incubación, y la banda correspondiente al monómero rico en hélices a desapareció gradualmente. Por otro lado, en presencia de arginina, la banda correspondiente al monómero rico en láminas p no apareció ni siquiera cuando se incubó durante un período de tiempo suficiente, lo que sugiere que la arginina inhibió la transición conformacional de láminas p tóxica de Thio-Q62.
La incubación de Thio-Q62 sin arginina hizo que la turbidez aumentara bruscamente el día 2 desde el inicio de la incubación (figura 1). Por el contrario, aunque la banda de monómero rico en láminas p se confirmó el día 1 desde el inicio de la incubación, no hubo aumento de turbidez en este momento.
<Análisis FRET>
Se investigó el efecto de la arginina sobre la formación de oligómeros de polyQ en células cultivadas usando transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La proteína PolyQ fusionada con la proteína fluorescente CFP y la proteína PolyQ fusionada con la proteína fluorescente YFP se ensamblan en oligómeros solubles en células cultivadas y dan como resultado una señal FRET positiva surgida de la interacción directa entre tramos de polyQ. En otras palabras, la formación de oligómeros solubles se puede identificar en células vivas mediante una señal FRET positiva.
El cultivo celular y los análisis FRET se realizaron mediante el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 10. Específicamente, en primer lugar, se prepararon células COS-7 que coexpresan una proteína que tiene una repetición de PolyQ que consiste en 56 glutaminas fusionadas con CFP (Q56-CFP) y una proteína que tiene una repetición de PolyQ que consiste en 56 glutaminas fusionadas con YFP (Q56-YFP). Las células COS-7 expresaron estas proteínas PolyQ fusionadas con proteínas fluorescentes que se prepararon transfectando el vector de expresión para cada proteína usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se sometieron a análisis FRET.
Las células que expresaban Q56-CFP y Q56-YFP se incubaron en medio que contenía arginina 0-50 mM y se determinó la intensidad de señal FRET promedio después de 48 horas. Se calculó un punto de corte numérico sobre la base de la media y el intervalo de confianza del 95 % para las intensidades de señal FRET de las células COS-7 que coexpresaban Q56-CFP y Q56-YFP. Solo las células que mostraban intensidades de señal FRET por encima del valor de corte se consideraron células FRET positivas. Se analizó la intensidad de señal FRET media de 150 células. Para el análisis estadístico de los resultados se usaron un ANOVA y la prueba post hoc de Tukey. Los resultados se muestran en la figura 6. La incubación con arginina 20 o 50 mM disminuyó significativamente el porcentaje (%) de células positivas para FRET. La incubación con concentraciones más bajas de arginina no afectó a la proporción de células positivas para FRET. Estos resultados demuestran que la arginina inhibe la interacción entre las proteínas polyQ que se ensamblan en oligómeros en células cultivadas de una manera dependiente de la dosis.
<Análisis FCS>
Para confirmar los resultados de los análisis FRET, se evaluó cuantitativamente el efecto de la arginina sobre la formación de oligómeros de polyQ usando espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS, por sus siglas en inglés). Para la formación de oligómeros de polyQ, se usó como monómero la proteína fluorescente GFP fusionada con una proteína que tenía una repetición de PolyQ que consistía en 45 glutaminas (Q45-GFP). Se usaron dos índices obtenidos a partir de la medición de FCS para evaluar la propiedad de los oligómeros de polyQ; los recuentos por partícula (CPP) y el tiempo de difusión de los componentes rápidos (DT1) (Documento no relacionado con patentes 11). El CPP es la intensidad fluorescente promedio de las partículas fluorescentes medidas y, por lo tanto, refleja directamente el número de monómeros de Q45-GFP por oligómero. DT1 refleja el tamaño de los oligómeros de Q45-GFP.
El análisis FCS se realizó mediante el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 11. Específicamente, en primer lugar, las células COS-7 se transfectaron con vectores de expresión para la proteína Q45-GFP, se incubaron en medio con o sin arginina 25 mM y se lisaron 48 horas después de la transfección. Los lisados celulares se sometieron a sonicación suavemente y se centrifugaron para eliminar los cuerpos de inclusión de Q45-GFP insolubles. Los sobrenadantes resultantes que no contenían cuerpos de inclusión visibles se sometieron a mediciones de FCS. A partir de las mediciones, se calcularon el tiempo de difusión, que corresponde al tiempo promedio de difusión de partículas fluorescentes a través del área de detección, y el CPP, que refleja directamente el número de moléculas fluorescentes por partícula. Los resultados de CPP y DT1 se muestran en las figura 7 y 8, respectivamente. El CPP y DT1 en las células tratadas con arginina disminuyeron en comparación con las células no tratadas. Estos resultados también indican que la arginina inhibe la formación de oligómeros de la proteína polyQ en las células.
Para resumir los resultados del análisis FRET y el análisis FCS, estos resultados indican que la arginina inhibe la transición conformacional de láminas p tóxica y la formación de oligómeros de la proteína polyQ y, por lo tanto, sugieren que la arginina tiene la capacidad de interferir con los procesos iniciales de la agregación de proteínas polyQ en la que las proteínas polyQ con plegamiento incorrecto ejercen toxicidad neuronal.
[Ejemplo 3]
Se investigaron los efectos terapéuticos de la arginina en modelos animales de enfermedades de polyQ. Se usaron dos modelos bien establecidos en invertebrados, un modelo de Drosophila melanogaster y un modelo de Caenorhabditis elegans.
<Los efectos de la arginina en el modelo de Drosophila de las enfermedades de polyQ>
Se usaron moscas modelo de ataxia espinocerebelosa de tipo 3 (SCA3/MJD), que expresan la forma truncada de la proteína MJD con una repetición de polyQ anormalmente expandida que consistía en 78 glutaminas (MJDtr-Q78) en
el ojo compuesto (Documento no relacionado con patentes 12). La degeneración grave del ojo compuesto inducida por MJDtrQ78 puede detectarse fácilmente con el microscopio óptico.
El cultivo de moscas y los cruces se realizaron en condiciones estándar a 25 °C. Se usó la línea de mosca transgénica MJDtr-Q78(S) portadora del transgén UAS-MJDtr-Q78 para la expresión de MJDtr-Q78 descrita en el Documento no relacionado con patentes 12. La línea de mosca portadora del transgén gmr-GAL4 se obtuvo en el Drosophila Genetic Resource Center at Kyoto Institute of Technology, Japón. Se alimentó a las moscas con arginina cultivándolas en medio "Instant Drosophila Medium" (Carolina Biological Supply Company) que contenía arginina 1 100 mM. Para la evaluación de la degeneración del ojo compuesto, se tomaron imágenes de microscopio óptico del ojo compuesto usando un modelo de microscopio estereoscópico "SZX9" (Olympus). Para la detección de la proteína MJDtr-Q78 en discos imaginales oculares de larvas de tercer estadio, se realizó una inmunotinción con un anticuerpo anti hemaglutinina (clon 3F10, Roche) de acuerdo con el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 13. Se tomaron imágenes microscópicas de fluorescencia usando un microscopio de barrido láser confocal modelo "LSM510" (Carl Zeiss).
En la figura 9 se muestran imágenes de microscopía óptica representativas de los ojos compuestos externos de moscas de tipo silvestre y moscas MJDtr-Q78(S). En la figura, "WT" representa un ojo compuesto de una mosca de tipo silvestre y "Control" representa un ojo compuesto de una mosca MJDtr-Q78(S) sin administración de arginina, y "Arg" representa un ojo compuesto de una mosca MJDtr-Q78(S) con administración de arginina 100 mM. La degeneración del ojo compuesto observada en las moscas MJDtr-Q78(S) mejoró notablemente mediante la administración de alimentos que contenían arginina 25, 50 o 100 mM.
En la figura 10 se muestran imágenes de inmunotinción con anticuerpo anti hemaglutinina de los discos oculares de larvas de moscas MJDtr-Q78(S). Estas imágenes de inmunotinción se tomaron usando un microscopio confocal. La porción teñida con el anticuerpo anti hemaglutinina indicada por puntas de flecha de color blanco en la figura muestra los cuerpos de inclusión formados en los discos oculares. En la figura, "Control" representa un ojo compuesto de una mosca MJDtr-Q78(S) sin administración de arginina, y "Arg" representa un ojo compuesto de una mosca MJDtr-Q78(S) con administración de arginina 100 mM. El número de cuerpos de inclusión en los discos oculares de las larvas de moscas MJDtr-Q78(S) disminuyó mediante la administración de alimentos que contenían arginina. Estos resultados sugirieron que la administración de arginina suprime la formación de cuerpos de inclusión que contienen PolyQ.
<El efecto de la arginina en el modelo de C. elegans de las enfermedades de polyQ>
Como modelo de C. elegans de las enfermedades de polyQ, se usó una línea de nematodo que expresaba Q40-GFP (Documento no relacionado con patentes 14), que es una línea de C. elegans que expresa GFP que tiene una repetición de polyQ que consiste en 40 glutaminas (Q40-GFP). Los gusanos de esta línea exhiben disfunción motora según lo evaluado por la prueba de movimiento rápido de la cola y una supervivencia más corta.
Los nematodos se cultivaron a 20 °C en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM, por sus siglas en inglés) sembradas con OP50 de Escherichia coli. Para la generación de la línea de nematodo de expresión Q40-GFP, se inyectaron plásmidos que codificaban Q40-GFP en la cepa de tipo silvestre N2.
Se realizaron pruebas de movimiento rápido de la cola en gusanos de la línea de nematodo que expresa Q40-GFP para examinar el efecto de la arginina sobre la disfunción motora. Las pruebas de movimiento rápido de la cola se realizaron a 20 °C en nematodos sincronizados a los 6 días de edad. En primer lugar, cada nematodo se transfirió a una placa diferente. Se dejó caer una gota de solución S-basal sobre un nematodo y, después de esperar durante 5 minutos para que se recuperaran, se midió el número de movimientos de la cola del gusano durante 1 minuto. El número de movimientos de la cola se definió como el número de veces que se cambia la dirección de flexión de la parte media del cuerpo de un nematodo.
Los resultados de la medición de los movimientos de la cola por minuto (recuento/min) obtenidos de las pruebas de movimiento rápido de la cola se muestran en la figura 11. En la figura, "Control" representa los resultados de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP sin administración de arginina, y "Arg" representa los resultados de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP con administración de arginina 10 mM. Los valores representan la media ± SEM (n = 48) y "**" representa p <0,01. Los movimientos de la cola de los gusanos de la línea de nematodo que expresa Q40-GFP mejoraron significativamente mediante la administración de arginina 10 mM.
Para analizar el efecto de la arginina sobre la disminución de la supervivencia de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP se realizó un análisis de la esperanza de vida. Para el análisis de la esperanza de vida, los nematodos se cultivaron en bacterias OP50 y se examinaron diariamente en busca de signos de vida. Los gusanos que no se movieron después de una estimulación vigorosa se consideraron muertos. La evolución temporal de las tasas de supervivencia de los gusanos de la línea de nematodo que expresa Q40-GFP se muestra en la figura 12. En la figura, "Control" representa los resultados de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP sin administración de arginina, y "Arg" representa los resultados de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP con administración de arginina 10 mM (la prueba de rango logarítmico: P<0,01). La tasa de supervivencia de los
gusanos de la línea de nematodo que expresa Q40-GFP mejoró significativamente mediante la administración de arginina 10 mM.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa con detergente semidesnaturalizante (SDD-AGE, por sus siglas en inglés) en la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP para examinar el efecto de la arginina sobre la formación de oligómeros de la proteína polyQ. La SDD-AGE se realizó de la siguiente manera. En primer lugar, los nematodos se lisaron en tampón de lisis (SDS al 0,5 %, NP-40 al 0,5 %, Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, cóctel inhibidor de proteasa), el lisado resultante se analizó en un gel de agarosa al 1 % con SDS al 0,01 % en un tampón de migración de Tris-glicina que contenía SDS al 0,01 % y a continuación se transfirió durante una noche a una membrana de nitrocelulosa. Para el posterior análisis de transferencia de Western, la membrana se incubó con el anticuerpo anti GFP (MBL Life sciences) a una dilución de 10.000 como el anticuerpo primario a 4 °C durante una noche y a continuación con el anticuerpo anti IgG de conejo conjugado con HRP (m Bl Life sciences) a una dilución de 20.000 como anticuerpo secundario. Se obtuvieron imágenes de inmunotransferencias usando el sistema analizador de imágenes Lumino "ImageQuant LAS 4000" (GE Healthcare Life Sciences) y se analizaron usando "ImageQuantTL" (GE Healthcare Life Sciences).
La imagen de SDD-AGE obtenida por inmunotransferencia de lisados de nematodos se muestra en la figura 13, y los resultados de la medición de la intensidad del frotis en la imagen de SDD-AGE se muestran en la figura 14, respectivamente. En las figuras, "Control" representa los resultados de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP sin administración de arginina, y "Arg" representa los resultados de la línea de gusano nematodo que expresa Q40-GFP con administración de arginina 10 mM. En la figura 14, los valores representan la media ± SEM (n = 5) y "**" representa p <0,01. Mientras que los gusanos de la enfermedad de PolyQ (línea de nematodo que expresa Q40-GFP) sin arginina exhibieron frotis de oligómeros de Q40-GFP en la membrana, los gusanos de la enfermedad de PolyQ con arginina mostraron un frotis mucho más ligero y menos amplio (figura 13), la intensidad del frotis medida por análisis de imágenes también disminuyó. Estos resultados sugirieron que la administración oral de arginina podría suprimir la oligomerización de la proteína polyQ en los nematodos de la enfermedad de PolyQ. A partir de los resultados de la administración de arginina a moscas y nematodos del modelo de enfermedad de PolyQ, resulta evidente que la arginina ejerce efectos terapéuticos in vivo en modelos de invertebrados de enfermedades de polyQ a través de la inhibición de la oligomerización y agregación de la proteína polyQ.
[Ejemplo 4]
El ratón con inserción génica (knock-in) Scal154Q/2Q (en lo sucesivo en el presente documento, simplemente denominado "ratón SCA1") (Documento no relacionado con patentes 15), que es uno de los modelos de ratón de ataxia espinocerebelosa de tipo 1, se usó para confirmar el efecto terapéutico de la arginina en mamíferos. Los ratones SCA1 expresan la proteína polyQ anormalmente expandida (la proteína ataxina 1 mutante con repeticiones de polyQ que consisten en 154 glutaminas) a niveles endógenos y con patrones temporales y espaciales precisos, y replican numerosos aspectos de la enfermedad humana, incluido el déficit motor progresivo. Los ratones SCA1 usados en este experimento fueron una amable donación del Dr. Kei Watase (Tokyo Medical and Dental University, Japón).
<Permeabilidad en la BHE de la arginina>
Para confirmar la permeabilidad en la BHE de la arginina, arginina se administró por vía oral a ratones de tipo silvestre y ratones SCA1, y se midió la cantidad de arginina en el cerebro y el suero.
Específicamente, en primer lugar, a ratones WT o SCA1 se les administraron por vía oral una vez por hora 200 pl de agua, una solución acuosa de L-arginina al 5 % o al 15 % usando una aguja para sonda nasogástrica durante nueve horas. La cantidad total de L-arginina administrada durante este período fue igual a la cantidad total de la ingesta diaria de L-arginina por los ratones a los que se les administró una solución acuosa de L-arginina al 2 % o al 6 % a voluntad, respectivamente (datos no mostrados). Después de una hora desde la administración final, los ratones se anestesiaron con pentobarbital y se sacrificaron por exanguinación de la aorta abdominal. La sangre se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se centrifugó para obtener el suero. Los cerebros se extirparon después de la perfusión con 10 ml de solución salina y se disecaron en hemisferios cerebrales. El suero y el cerebro se ultracongelaron y se almacenaron a -80 °C hasta su uso, y se sometieron a detección de L-arginina. La detección de L-arginina se realizó usando un sistema de HPLC bidimensional, de acuerdo con el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 16.
Los resultados de la medición de la cantidad de L-arginina en el cerebro de ratones SCA1 se muestran en la figura 15, y los resultados de la medición de la cantidad de L-arginina en el suero de ratones SCA1 se muestran en la figura 16, respectivamente. En las figuras, "Agua" representa los resultados de los ratones a los que se les administró agua en solitario, "2 %" representa los resultados de los ratones a los que se les administró una solución acuosa de L-arginina al 5 % y "6 %" representa los resultados de los ratones a los que se les administró una solución acuosa de L-arginina al 15 %. En ambas figuras, los valores representan la media ± SEM (n = 3), "**" representa p <0,01, y "***" representa p <0,001, respectivamente. La cantidad de L-arginina en suero y cerebro en los ratones
aumentó dependiendo de la cantidad de L-arginina administrada por vía oral (figuras 15 y 16). Esto confirmó que la administración oral de arginina a ratones condujo a un aumento dependiente de la dosis en las concentraciones de arginina en suero y cerebro.
<Efecto de la arginina sobre la función de ratones SCA1>
Para examinar el efecto terapéutico de la arginina, a los ratones SCA1 se les administró continuamente un 6 % en peso de arginina en agua de bebida (tratada con arginina) a partir de las 3 semanas de edad y se sometieron a una prueba de varilla giratoria, análisis de barra equilibrada y análisis de cuerpos de inclusión de PolyQ en el cerebro. Como control, se administró agua sin arginina a ratones SCA1 como agua de bebida (sin tratar con arginina).
(1) Prueba de varilla giratoria
Las pruebas de varilla giratoria se han utilizado previamente para la evaluación de la función motora en ratones SCA1 (Documento no relacionado con patentes 15). Los ratones SCA1 mostraron un claro déficit a las 4 semanas de edad, que progresó de manera constante hasta las 36 semanas de edad cuando finalizó el análisis
Para el análisis de varilla giratoria, los ratones se evaluaron en un aparato de varilla giratoria aceleradora (Ugo Basile) y se realizó de acuerdo con el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 17. La evolución temporal de la cantidad de tiempo de marcha hasta que los ratones de tipo silvestre y los ratones SCA1 cayeron de la varilla giratoria (latencia) se muestra en la figura 17. En la figura, "WT Agua" representa los resultados de los ratones de tipo silvestre a los que se les administró agua sin arginina, "WT Arg" representa los resultados de los ratones de tipo silvestre a los que se les administró agua con arginina, y "SCA1 Agua" representa los resultados de los ratones SCA1 a los que se les administró agua sin arginina, "SCA1 Arg" representa los resultados de ratones SCA1 a los que se les administró agua con arginina. En la figura, los valores representan la media ± SEM (n = 16 18), "**" representa p <0,01, y "***" representa p <0,001, respectivamente.
Como se muestra en la figura 17, la función motora de los ratones SCA1 tratados con el 6 % en peso de arginina fue significativamente mejor que la de los ratones no tratados de 4 a 12 semanas de edad, y fue comparable a la de los ratones de control WT, mientras que la administración de arginina a los ratones WT no ejerció ningún efecto obvio. El efecto terapéutico de la arginina se mantuvo significativo hasta las 28 semanas de edad. Se confirmó que todos los grupos de ratones tenían una cantidad comparable de ingesta de líquido (figura 18), lo que sugiere que la adición de arginina en el agua de bebida no afectó a la actividad de bebida a voluntad de los ratones WT o SCA1.
(2) Análisis de barra de equilibrio
También se examinaron ratones SCA1 usando la prueba de la barra de equilibrio para evaluar la coordinación motora. Para el análisis de la barra de equilibrio, se evaluó el tiempo que tardaron los ratones en cruzar una barra con 1 m de largo y 15 mm de diámetro. La barra se colocó aproximadamente a 50 cm sobre el suelo con una luz brillante en el extremo inicial y una caja oscura en el extremo más alejado. Los ratones fueron entrenados inicialmente durante 3 días consecutivos, 2 ensayos cada uno, para que aprendieran a cruzar la barra sin caerse ni darse la vuelta. Los días de prueba, se registró el tiempo que tardaron los ratones en cruzar la barra. Si los ratones tardaban más de 60 segundos en cruzar, la puntuación se contaba como 60 segundos. Se realizaron dos ensayos para cada ratón y se usó un tiempo más rápido para el análisis.
En la figura 19 se muestra la evolución temporal de la cantidad de tiempo para cruzar la barra (latencia) de los ratones de tipo silvestre y ratones SCA1 a las 28 semanas de edad. En la figura, "WT Agua", "WT Arg", "SCA1 Agua" y "SCA1 Arg" representan lo mismo que en la figura 17. En la figura, los valores representan la media ± SEM (n = 16-18), "**" representa p <0,01, y "***" representa p <0,001, respectivamente. En ratones SCA1, se observó un déficit en la barra de equilibrio a una edad posterior en comparación con el déficit de la barra giratoria. A las 28 semanas de edad, los ratones SCA1 no tratados necesitaron más del doble de tiempo para cruzar la barra en comparación con los ratones WT no tratados. Los ratones SCA1 tratados con arginina pudieron cruzar la barra de equilibrio en un tiempo significativamente menor en comparación con los ratones SCA1 no tratados. A partir de estos resultados, se confirmó que la administración oral de arginina puede mejorar la disfunción motora de los animales con enfermedad de PolyQ.
(3) Efecto sobre la formación de cuerpos de inclusión
Se analizó el efecto de la arginina sobre la formación de cuerpos de inclusión en el cerebro de ratones SCA1. Se informó que los ratones SCA1 desarrollan cuerpos de inclusión de polyQ (agregados de proteínas PolyQ) en sus neuronas de la corteza cerebral y el hipocampo desde aproximadamente las 4 semanas de edad (Documento no relacionado con patentes 15).
Los cuerpos de inclusión de PolyQ en secciones de cerebro se detectaron usando análisis inmunohistoquímico. En primer lugar, se prepararon secciones congeladas de diez micrómetros de espesor de cerebros de ratón SCA1 de 12 semanas de edad de acuerdo con el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 17. Las
secciones se bloquearon en PBS que contenía suero de cabra al 5 % y Tritón X-100 al 0,1 % durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación se incubaron con un anticuerpo anti ubiquitina de conejo (clon FK2, 1:500) a 4 °C durante una noche, seguido de un anticuerpo anti IgG de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (1:1.000, Life Technologies) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se montaron con el reactivo antidesvanecimiento "Slowfade Gold antifade reagent with DAPI" (Life Technologies) y se examinaron usando un microscopio de barrido láser confocal "FV 1000" (Olympus).
Mediante microscopía de barrido láser confocal, se pueden visualizar los cuerpos de inclusión teñidos con el anticuerpo anti ubiquitina. Por lo tanto, las secciones se observaron usando un microscopio de barrido láser confocal, se contaron las células incluidas en el campo de visión y se midió el porcentaje (%) de las células en las que se formaron los cuerpos de inclusión con respecto al número total de células. En cada ratón, el recuento celular se promedió para 3 campos de visión, en los que se contaron más de 130 o 70 células en la corteza o el hipocampo, respectivamente. Los resultados de la medición se muestran en la figura 20. En la figura, "Agua" representa los resultados de ratones SCA1 a los que se les administró agua sin arginina, "Arg" representa los resultados de ratones SCA1 a los que se les administró agua con arginina. En la figura, los valores representan la media ± SEM (n = 3 o 4) y "*" representa p <0,05. Los análisis inmunohistoquímicos de las secciones del cerebro de ratones SCA1 de 12 semanas de edad confirmaron la formación de cuerpos de inclusión de PolyQ en la corteza cerebral y el hipocampo. En ratones tratados con arginina, el porcentaje de células con formación de cuerpos de inclusión en ambas regiones disminuyó significativamente.
Es decir, la administración oral de arginina a ratones SCA1 mejora la disfunción motora y suprime la formación de cuerpos de inclusión de PolyQ en el cerebro. A partir de estos resultados, resulta evidente que la arginina tiene un efecto terapéutico sobre las enfermedades de PolyQ.
[Ejemplo 5]
<Efecto de la arginina en ratones SCA1 después de la aparición de una enfermedad de disfunción motora>
Un factor importante a considerar en el desarrollo de tratamientos para enfermedades neurodegenerativas, incluyendo enfermedades de polyQ, es si el fármaco ejerce su efecto terapéutico en la fase sintomática cuando el proceso patológico ya ha avanzado. Hasta la fecha, se han administrado candidatos terapéuticos a ratones con enfermedad de PolyQ de forma profiláctica en la fase presintomática en la mayoría de los estudios preclínicos. Para probar si la administración de arginina también es eficaz en la fase sintomática, se administró arginina a ratones SCA1 a partir de las 5 semanas de edad, cuando estos ratones ya presentaban déficits neurológicos.
Específicamente, a los ratones SCA1 se les administró continuamente un 6 % en peso de arginina en agua de bebida a partir de las 5 semanas de edad, y se sometieron a la prueba de varilla giratoria para examinar el efecto terapéutico de la arginina. La prueba de varilla giratoria se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 4. La evolución temporal de la cantidad de tiempo de marcha hasta que los ratones de tipo silvestre y los ratones SCA1 cayeron de la varilla giratoria (latencia) se muestra en la figura 21. En la figura, "WT Agua", "WT Arg", "SCA1 Agua" y "SCA1 Arg" representan lo mismo que en la figura 17. En la figura, los valores representan la media ± SEM (n = 23-25), "*" representa p <0,05.
Como se muestra en la figura 21, se observó disfunción motora en ratones SCA1 de 5 semanas de edad antes del tratamiento con arginina, lo que demuestra un tiempo de marcha significativamente más corto sin caerse de la varilla giratoria en comparación con los ratones de tipo silvestre. Posteriormente, los ratones SCA1 tratados con arginina tuvieron un mayor tiempo de marcha sin caerse de la varilla giratoria que los ratones SCA1 no tratados desde las 7 semanas de edad hasta las 19 semanas de edad, lo que demuestra que se alivió la disfunción motora. De hecho, las diferencias en la función motora entre los ratones SCA1 tratados con arginina y los ratones SCA1 no tratados alcanzaron significación estadística a las 15 y 19 semanas de edad (figura 21). Estos resultados demuestran que la arginina ejerce efectos terapéuticos sobre los fenotipos neurológicos de las enfermedades de polyQ incluso cuando la administración se inicia después de la aparición de los síntomas motores, lo que indica que la arginina es muy prometedora no solo como agente preventivo sino también como agente terapéutico contra las enfermedades de PolyQ.
<Efecto de la arginina sobre la función de ratones SBMA>
Todas las enfermedades de PolyQ surgen de la expansión anormal de la cadena de PolyQ en cada proteína causante de la enfermedad y la arginina tiene un efecto inhibitorio sobre el propio tramo de PolyQ anormalmente expandido. A partir de estos hechos, se examinó si la arginina también es eficaz contra otro modelo de ratón de enfermedad de PolyQ.
Como otro modelo de ratón de enfermedad de PolyQ se usó el ratón SBMA (Documento no relacionado con patentes 18). El modelo de ratón SBMA, que es transgénico para la proteína de longitud completa del receptor de andrógenos humano que tiene un tramo de PolyQ expandido anormal que consiste en 97 glutaminas, muestra una disfunción motora progresiva. Esta disfunción motora se puede revertir con un tratamiento farmacológico
(Documento no relacionado con patentes 19). El ratón SBMA utilizado en este experimento fue una amable donación del Dr. Gen Sobue (Nagoya University, Japón).
La disfunción motora del ratón SBMA se puede controlar como disfunción motora espontánea, midiendo la actividad horizontal en campo abierto y la exploración vertical en la jaula (Documento no relacionado con patentes 18). Para examinar el efecto terapéutico de la arginina, a los ratones SBMA se les administró continuamente un 6 % en peso de arginina en agua de bebida (tratada con arginina) a partir de las 3 semanas de edad y, a las 12 semanas de edad, se analizaron la actividad horizontal en campo abierto y la exploración vertical. Como control, se administró agua sin arginina a ratones SBMA como agua de bebida (sin tratar con arginina).
La actividad horizontal en campo abierto y la exploración vertical se midieron usando un monitor de actividad locomotora espontánea "Supermex" (Muromachi Kikai) de acuerdo con el método descrito en el Documento no relacionado con patentes 18. Específicamente, se puso un ratón en una jaula de medición en la que se proyectaban haces infrarrojos en el interior y se le permitió moverse libremente. Cuando el ratón se mueve dentro de la jaula de medición, el haz infrarrojo se obstruye y el rayo infrarrojo no puede ser detectado por la parte receptora de luz (interrupción del haz). El número de interrupciones del haz por minuto se determinó midiendo el número de interrupciones del haz (recuentos/min). Para detectar movimientos en la dirección horizontal, se contó el número de interrupciones del haz de los haces infrarrojos proyectados en la dirección vertical. Para detectar movimientos en la dirección vertical (el movimiento de los ratones en pie sobre sus patas traseras), se proyectaron haces infrarrojos en la dirección horizontal a una altura en la que los haces infrarrojos no estaban obstruidos cuando el ratón estaba a cuatro patas, sino que se obstruían cuando el ratón se ponía sobre sus patas traseras, y se contó el número de interrupciones del haz.
Los resultados de la observación de la actividad horizontal y los resultados de la observación de la exploración vertical se muestran en la figura 22 y en la figura 23, respectivamente. En las figuras 22-23, "WT Agua" representa los resultados de los ratones de tipo silvestre a los que se les administró agua sin arginina", "WT Arg" representa los resultados de los ratones de tipo silvestre a los que se les administró agua con arginina, y "SCA1 Agua" representa los resultados de ratones SCA1 a los que se les administró agua sin arginina, y "SCA1 Arg" representa los resultados de los ratones SCA1 a los que se les administró agua con arginina. En la figura, los valores representan la media ± SEM (n = 23-25), y "**" representa p <0,01.
Como resultado, al tratar ratones SBMA con arginina, tanto la actividad horizontal como la exploración vertical mejoraron a niveles comparables a los de los ratones de tipo silvestre no tratados. El tratamiento con arginina en ratones de tipo silvestre tuvo efectos limitados. Estos resultados indicaron que la arginina es eficaz contra muchos modelos de ratón con enfermedad de PolyQ y, además, que la arginina es eficaz como molécula terapéutica contra las enfermedades de PolyQ en general.
Claims (2)
1. Una composición farmacéutica, que comprende:
una seleccionada del grupo que consiste en arginina, una sal fisiológicamente aceptable de la misma, y un solvato de la misma, como principio activo,
para su uso en el tratamiento o la prevención de las enfermedades de PolyQ y la enfermedad de PolyQ es una seleccionada del grupo que consiste en ataxias espinocerebelosas heredadas, atrofia dentato-rubro-pálidoluisiana y atrofia muscular espinal y bulbar.
2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que la enfermedad de PolyQ es una seleccionada del grupo que consiste en ataxia espinocerebelosa heredada de tipo 1, ataxia espinocerebelosa heredada de tipo 3 y atrofia muscular espinal y bulbar.
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