ES2895653T3 - Composiciones frente a infecciones por cándida - Google Patents

Composiciones frente a infecciones por cándida Download PDF

Info

Publication number
ES2895653T3
ES2895653T3 ES18745504T ES18745504T ES2895653T3 ES 2895653 T3 ES2895653 T3 ES 2895653T3 ES 18745504 T ES18745504 T ES 18745504T ES 18745504 T ES18745504 T ES 18745504T ES 2895653 T3 ES2895653 T3 ES 2895653T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
miconazole
treatment
composition according
infection
bromide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18745504T
Other languages
English (en)
Inventor
Bruno Cammue
Karin Thevissen
Cremer Kaat De
Paul Cos
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Katholieke Universiteit Leuven
Universiteit Antwerpen
Original Assignee
Katholieke Universiteit Leuven
Universiteit Antwerpen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1711512.2A external-priority patent/GB201711512D0/en
Application filed by Katholieke Universiteit Leuven, Universiteit Antwerpen filed Critical Katholieke Universiteit Leuven
Application granted granted Critical
Publication of ES2895653T3 publication Critical patent/ES2895653T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Una composición para uso tópico que comprende miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno como ingredientes activos para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones frente a infecciones por cándida
Campo de la invención.
La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de miconazol y sales de amonio cuaternario frente a infecciones por cándida, en particular candidosis vaginal recidivante.
Resumen
Las infecciones fúngicas relacionadas con la biopelícula de las mucosas son muy frecuentes y la incidencia de candidosis oral y vulvovaginal recidivante es significativa.
Se han descrito diversos compuestos antifúngicos para combatir infecciones por cándida. Una composición bien conocida para el tratamiento de candidosis vulvovaginal comprende nitrato de miconazol como ingrediente activo y se vende con el nombre comercial Gyno Daktarin. La composición comprende estearato de glicol de polietilenglicol (PEG-6 y PEG-32), glicéridos de oleoilmacrogol, vaselina líquida, butilhidroxianisol, ácido benzoico.
El documento EP0832649 describe un efecto sinérgico de miconazoles y sales de amonio cuaternario en cultivos de Candida albicans, Staphylococcus aureus y una serie de especies de Trichopython.
El documento US4091090 divulga el efecto antifúngico tópico de bromuro de domifeno.
Las infecciones recidivantes con cándida están incrementando y se desean composiciones farmacéuticas más eficaces alternativas.
Sumario de la invención
La presente invención identificó combinaciones novedosas de miconazol (MC) y la sal de amonio cuaternario bromuro de domifeno que es particularmente eficaz frente a Candida sp. y esto tanto en cultivos in vitro como en un entorno experimental usando modelo de rata con una infección por cándida vaginal.
La presente invención ilustra que bromuro de domifeno y miconazol presentan una actividad antibiopelícula sinérgica, en base a la determinación de los índices de concentración inhibidora fraccionaria. El uso de tinción con yoduro de propidio ultrarrápida, bromuro de domifeno combinado con miconazol, da como resultado la destrucción de células de la biopelícula ya después de 2 h de tratamiento y proporciona una reducción de > 3 unidades LOG de ufc (unidades formadoras de colonias) en las biopelículas tratadas después de 24 h.
La invención se resume en las siguientes afirmaciones:
1. Una composición para uso tópico que comprende miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno como ingredientes activos para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica.
2. La composición de acuerdo con la afirmación 1, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en la que la infección fúngica es una infección con Candida sp.
3. La composición de acuerdo con la afirmación 1 o 2, para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección fúngica, en la que la infección fúngica es una infección con Candida albicans o Candida glabrata.
4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de una biopelícula formada por Candida sp.
5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección vulvovaginal.
6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que se formula como una crema.
7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que comprende además un mucoadhesivo.
8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en la que el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en la que la concentración de miconazol y su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
10. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en la que el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
11. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 10, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en la que la concentración de nitrato de miconazol es de aproximadamente un 2 % (p/p) y el exceso molar de nitrato de miconazol sobre bromuro de domifeno es de aproximadamente 3.
12. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 1 a 11, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en la que la composición se aplica durante un período de 14 días.
13. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y que comprende como ingredientes antifúngicos activos una mezcla de miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno.
14. La composición de acuerdo con la afirmación 13, que comprende nitrato de miconazol.
15. La composición de acuerdo con la afirmación 13 o 14, que es una crema con una viscosidad de entre 300 cp y 300 cp a 180 rmp.
16. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 12 a 15, que tiene un pH entre 2,7 y 3,5. 17. La composición de acuerdo con cualquiera de las afirmaciones 12 a 16, en la que el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
18. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 12 a 17, en la que la concentración de miconazol y su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
19. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 12 a 18, que comprende además un mucoadhesivo.
20. La composición de acuerdo con una cualquiera de las afirmaciones 12 a 19, que se envasa en un aplicador para suministro vaginal.
21. Un procedimiento para tratar o prevenir una infección fúngica que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno.
22. El procedimiento de acuerdo con la afirmación 21, en el que la infección fúngica es una infección con Candida sp.
23. El procedimiento de acuerdo con la afirmación 21 o 21, en el que la infección fúngica es una infección vulvovaginal. Descripción detallada de la invención
Breves descripciones de las figuras.
Las abreviaturas usadas en las figuras son: MCZ: miconazol; DM: bromuro de domifeno; BKC: cloruro de benzalconio; DC: bromuro de decualinio; TB; bromuro de tetraetilamonio; BTC: cloruro de becetonio.
Figura 1. El tratamiento con bromuro de domifeno - miconazol combinado reduce la actividad metabólica de células de biopelícula de C. albicans. Los valores representan la actividad metabólica media de 4 réplicas biológicas independientes, determinada por tinción de viabilidad de CTB.
Figura 2. Actividad metabólica de células de biopelícula de C. albicans después del tratamiento de combinación de miconazol con compuestos de amonio cuaternario. Los valores representan la actividad metabólica media de 4 réplicas biológicas independientes, determinada por tinción de viabilidad de CTB.
2A: miconazol (MCZ) y cloruro de benzalconio (BKC)
2B: miconazol (MCZ) y bromuro de tetraetilamonio (TB)
2C: miconazol (MCZ) y cloruro de decualinio (DC)
Figura 3. Fluorescencia PI en células de biopelícula de C. albicans después del tratamiento de combinación con miconazol y compuestos de amonio cuaternario. La fluorescencia PI se midió cada 15 minutos durante 17 h en células de biopelícula de C. albicans después del tratamiento con miconazol y bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio o cloruro de decualinio.
3A: miconazol y cloruro de benzalconio
3B: miconazol y bromuro de domifeno
3C: miconazol y cloruro de becetonio
3D : cloruro de miconazol y decualinio
Figura 4. Supervivencia de células de biopelícula de C. albicans después del tratamiento de combinación con miconazol y compuestos de amonio cuaternario. Los valores de log UFC medios ± DE se muestran para al menos 4 réplicas biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre tratamiento individual con bromuro de tetraetilamonio (50 pM), cloruro de becetonio (50 pM), cloruro de decualinio (12,5 pM), cloruro de benzalconio (50 pM) y bromuro de domifeno (50 pM) o bien combinaciones con miconazol. Se aplicaron un ANOVA bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Sidak y se muestran valores de p significativos.
Figura 5. Carga fúngica intravaginal de todos los grupos en diferentes momentos p.i.
La carga se muestra como el logaritmo de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. G: grupo de tratamiento.
Figura 6: Carga fúngica intravaginal de todos los grupos.
La carga se muestra como el área bajo la curva (ABC) en comparación con el grupo de control (G1) (= 100 %). Mostrado como el log de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. G: grupo de tratamiento.
La figura 7 muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos en diferentes días p.i.
La figura 8 muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos. La carga se muestra como el área bajo la curva (ABC).
La figura 9 resume el resultado de la carga intravaginal de diferentes formulaciones el día 4, 9 y 14 postinfección. La figura 10 muestra la supervivencia de células de biopelícula de C. glabrata después de un tratamiento individual o de combinación con MCZ y DB.
La figura 11 muestra la supervivencia de células de biopelícula de C. albicans después de un tratamiento individual o de combinación con un antimicótico y bromuro de domifeno.
La figura 12 muestra que el tratamiento de MCZ-DB combinado reduce el valor de MIC en comparación con monotratamiento de MCZ frente a cultivos planctónicos de C. glabrata.
Definiciones:
Aproximadamente se usa para describir una desviación de un 10 % por debajo y por encima de un determinado valor. Así, por ejemplo, "aproximadamente 10" significa entre 9 y 11, "aproximadamente 50" significa entre 45 y 55.
Miconazol (((RS)-1-[2-(2,4-diclorofenil)-2-[(2,4-diclorofenil)metoxi]etil]imidazol) es un compuesto antifúngico que interfiere con el metabolismo de ergosterol, un componente de la membrana celular de levaduras. El compuesto se formula típicamente como su nitrato.
Bromuro de domifeno [bromuro de N,N-dimetil-N-(2-fenoxietilo)] es una sal de amonio cuaternario con propiedades antisépticas.
Viscosidad en el contexto de la presente invención se refiere a la resistencia a la deformación gradual por tensión de cizallamiento. La viscosidad se puede medir, por ejemplo, por un viscosímetro Brookfield HA.
Infección fúngica se refiere a una enfermedad provocada por uno o más seleccionados de la lista que comprende Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Pneumocystis spp., Zygomyces spp., Dermatofitos, Blastomyces spp., Histoplasma spp., Coccidoides spp., Sporothrix spp. Microsporidia spp., Malassezia spp. y basidiomicetos. Típicamente, la infección está provocada por Candida sp. tal como Candida albicans y Candida glabrata.
Biopelícula se refiere a un modo de crecimiento microbiano que comprende células sésiles, normalmente dentro de una matriz compleja y altamente heterogénea de polímeros extracelulares, y caracterizada por una sensibilidad reducida a agentes antifúngicos. Las biopelículas pueden contener microorganismos de especies individuales (por ejemplo, un hongo/levadura tal como C. albicans) o de múltiples especies (tales como C. albicans, C. glabrata y otros microorganismos, preferentemente levaduras y/u hongos o incluso procariotas). En un modo de realización preferente, dicha biopelícula es una biopelícula fúngica, más preferentemente una biopelícula de especie Candida, que comprende una o más de C. albicans, C. glabrata, y/o C. cruse. Las biopelículas también pueden comprender o consistir en una biopelícula de especie Aspergillus (por ejemplo, A. flavus, A. fumigatus, A. clavatus) o una especie Fusarium (por ejemplo, F. oxysporum, F. culmorum). En el contexto de la presente invención, biopelícula se refiere típicamente a una biopelícula de Candida albicans.
Las composiciones de la presente invención generalmente comprenden miconazol y bromuro de domifeno en concentraciones que proporcionan un efecto sinérgico. La sinergia se produce cuando se encuentran valores de FICI de 0,5 o menos (menos de 0,45 o menos de 0,4). La medición de valores FICI se explica en la sección de ejemplos.
Las composiciones de la presente invención se pueden aplicar como geles o crema.
Las cremas se encuentran ahora en la técnica como emulsiones de aceite en agua (g/a) o agua en aceite (a/g). Típicamente contienen un emulsionante y un espesante.
Los geles son conocidos en la técnica como preparaciones transparentes que contienen éteres de celulosa o carbómero en agua o una mezcla de agua-alcohol.
Tratamiento en el contexto de la presente invención se refiere a una reducción completa o parcial de la levadura y/o una reducción en los síntomas de una infección fúngica tales como prurito, ardor al orinar y flujo vaginal.
Estas formulaciones permiten, por un lado, la fácil retirada de la composición de un tubo o jeringa y, por otro lado, garantizan que la composición permanezca fijada en el sitio de aplicación.
Las composiciones de la presente invención son en general para uso tópico y se formulan para ser compatibles con el sitio de aplicación específico (piel, uñas, cabello). Para aplicaciones vulvovaginales, la composición se formula como una composición ácida a un pH de entre 2,75 y 3,5. El uso de ácido benzoico es bien conocido en la técnica. Otros tampones adecuados que se pueden usar en composiciones farmacéuticas para obtener un pH ácido son, por ejemplo, HCl y ácido láctico.
Puesto que el bromuro de domifeno es altamente soluble en agua y miconazol y sus sales son insolubles en agua, las composiciones de la presente invención son preferentemente una crema con un agente emulsionante, puesto que miconazol y nitrato de miconazol son insolubles en agua y bromuro de domifeno es altamente soluble en agua.
Diversas emulsiones de aceite en agua son conocidas en la técnica. En las formulaciones de la presente invención se usan típicamente vaselina líquida y glicéridos de lauroilmacrogol-6 como fase oleosa.
Para estabilizar la emulsión se pueden usar emulsionantes tales como, por ejemplo, una mezcla de polietilenglicol-6, palmitoestearato, estearato de etilenglicol y estearato de PEG-32.
Para incrementar la viscosidad de la emulsión, se pueden usar agentes espesantes tales como cetoestearilo.
Para una fijación óptima en el sitio de aplicación las formulaciones pueden comprender además un mucoadhesivo. Los mucoadhesivos adecuados para aplicación vulvovaginal incluyen polímeros que pueden formar hidrogeles tales como policarbofilo sintético, quitosano, derivados de celulosa (hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa), pectina, derivados de ácido hialurónico, poliacrilatos, tragacanto, alginato de carragenina y de sodio, polímeros tiolados.
Las aplicaciones farmacéuticas se pueden usar como profilácticas, pero se usan típicamente tras signos de infecciones fúngicas. La aplicación de la composición farmacéutica en la región infectada se puede realizar, por ejemplo, cada dos días, diariamente o dos veces tres veces al día durante un período de, por ejemplo, al menos 7, 14 o 21 días, o hasta que los signos de infección hayan desaparecido.
Las composiciones de la presente invención son igualmente adecuadas para el tratamiento de candidosis vulvovaginal recidivante (es decir, se producen al menos cuatro episodios específicos en un año o se producen al menos tres episodios no relacionados con tratamiento antibiótico en un año). Las composiciones de la presente invención son adecuadas para la infección recidivante con C. albicans y específicamente adecuadas para infecciones recidivantes con C. tropicalis o C. glabrata, que son menos sensibles a monoterapias con miconazol.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden entre aproximadamente un 1 % (p/p) a aproximadamente un 5 % (p/p/) de miconazol o una sal del mismo (típicamente nitrato). Los modos de realización específicos se refieren a aproximadamente un 1 % (p/p/), aproximadamente un 1,5 % (p/p), aproximadamente un 2 % (p/p/) aproximadamente un 2,5 % (p/p), aproximadamente un 3 % (p/p/), aproximadamente un 4 % o aproximadamente un 5 % (p/p/) de nitrato de miconazol.
La cantidad de miconazol o su sal en las composiciones farmacéuticas de la presente está en un exceso molar de aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5 o aproximadamente 4, sobre la cantidad de bromuro de domifeno.
Así, por ejemplo, una composición farmacéutica con un exceso molar de 3 veces que comprende un bromuro de domifeno 10 milimolar contiene nitrato de miconazol 30 milimolar.
Cualquier combinación de las concentraciones mencionadas anteriormente de miconazol o sal y los valores mencionados anteriormente de exceso molar se divulgan aquí. Los modos de realización específicos se refieren a composiciones farmacéuticas con aproximadamente un 2 % (p/p) de nitrato de miconazol con un exceso molar de 3 veces sobre bromuro de domifeno.
Ejemplos
Ejemplo 1: materiales y procedimientos
Cepas y productos químicos. La cepa SC5314 de C. albicans se cultivó de forma rutinaria en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 % (International Medical Products, Bélgica) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich) en DMSO (VWR International, Bélgica). Se adquirió medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se adquirió bromuro de domifeno de Selleck Chemicals y cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio y cloruro de tetraetilamonio de TCI Europe (Bélgica).
Ensayo de detección de antibiopelícula. Se diluyó un cultivo durante la noche de C. albicans SC5314, cultivado en YPD, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI y se añadieron 100 gl de esta suspensión a los pocillos de una microplaca de fondo redondo (TPP Techno Plastic Products AG, Suiza) (30, 31). Después de 1 h de adhesión a 37 °C, se aspiró el medio y se lavaron las biopelículas con 100 gl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para retirar células inadherentes, seguido de la adición de 100 gl de medio RPMI 1640. Se dejó que las biopelículas crecieran durante 24 h a 37 °C. Posteriormente, se añadieron 10 gM de miconazol en combinación con 25 gM de un compuesto de la colección Pharmakon 1600 (solución madre 2 mM en DMSO) en RPMI, dando como resultado un fondo de DMSO al 1,1 %. Las biopelículas se incubaron durante 24 h adicionales a 37 °C. Finalmente, las biopelículas se lavaron y cuantificaron con Cell-Titre Blue (CTB; Promega, EE. UU.) (32) añadiendo 100 gl de CTB diluido 1/10 en PBS a cada pocillo. Después de 1 h de incubación en la oscuridad a 37 °C, se midió la fluorescencia con un espectrómetro de fluorescencia (lector de microplacas multimodo Synergy Mx, BioTek, EE. UU.) a Aex 535 nm y Aem 590 nm. Los valores de fluorescencia de las muestras se corrigieron restando el valor de fluorescencia promedio de CTB de los pocillos sin inocular (blanco). Se calculó el porcentaje de células de biopelícula metabólicamente activas en relación con el tratamiento de control (DMSO al 1,1 %). Se consideró volver a someter a prueba los compuestos cuando su aplicación en presencia de miconazol 10 gM dio como resultado menos de un 60 % de actividad metabólica residual de células de biopelícula de C. albicans en comparación con el control de miconazol. Este experimento de confirmación se realizó dos veces y se incluyeron controles de solo compuesto.
Ensayo de tablero de ajedrez de biopelícula. Para determinar las posibles interacciones sinérgicas entre agentes antifúngicos por un lado y los potenciadores identificados por el otro, se usó un ensayo de tablero de ajedrez. Se añadió una combinación de compuesto antifúngico (miconazol, fluconazol, caspofungina o anfotericina B) y potenciador, diluidos dos veces en filas y columnas de una microplaca respectivamente, a biopelículas de C. albicans cultivadas como se describe anteriormente (fondo de DMSO al 0,6 %). Después de 24 h de incubación a 37 °C, las biopelículas se cuantificaron con el procedimiento CTB como se describe anteriormente. El sinergismo se determinó por cálculos de FICI (índice de concentración inhibidora fraccionaria).
El FICI se calculó por la fórmula FICI=[C(BEC-2a)/BEC-2a]+[C(BEC-2b)/BEC-2b], en la que C(BEC-2a ) y C(BEC-2b) son los valores de BEC-2 de los fármacos antifúngicos en combinación, y BEC-2a y BEC-2b son los valores de BEC-2 de los fármacos antifúngicos A y B solos. BEC-2 significa concentración de erradicación de biopelícula 2, que es la concentración mínima de un compuesto que provoca una disminución de dos veces de la actividad metabólica de biopelícula.
La interacción se definió como sinérgica para un valor de FICI<0,5, indiferente para 0,5<FICI<4 y antagonista para FICI>4.
Ensayo de PI y determinación de UFC. Se cultivaron biopelículas como se describe anteriormente y se trataron con dosis seleccionadas de miconazol y bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio, cloruro de decualinio o bien bromuro de tetraetilamonio. Para obtener una lectura cinética de PI, se incubaron biopelículas, en presencia de PI al 3 %, en un lector multimodo (Syngergy MX, Biotek) que mide la fluorescencia cada 15 min durante 17 h (longitud de onda de emisión: 535 nm y longitud de onda de excitación: 617 nm). La determinación de UFC se realizó en biopelículas 24 h después del tratamiento. Con este fin, las biopelículas se lavaron con PBS y se rasparon completamente del fondo de la placa. Se plaquearon diluciones en serie en placas de agar YPD y se incubaron durante 48 h a 30 °C antes del recuento de colonias.
Ejemplo 2: detección para potenciadores de miconazol frente a biopelículas de C. albicans
Se sometió a prueba bromuro de domifeno (DB) para determinar su capacidad para reducir la actividad metabólica de biopelícula de C. albicans con más de un 50 % en combinación con una dosis de miconazol subinhibidora y su perfil de toxicidad en células humanas.
Ejemplo 3: los compuestos de amonio cuaternario actúan sinérgicamente con miconazol frente a biopelículas de C. albicans
Para determinar si el bromuro de domifeno actúa sinérgicamente con miconazol frente a biopelículas de C. albicans se realizaron experimentos de tablero de ajedrez (figura 1) y cálculos de FICI (tabla 1). Los datos del tablero de ajedrez muestran que, en presencia de bromuro de domifeno, se pueden usar concentraciones menores de miconazol para reducir la actividad metabólica de biopelículas de C. albicans, indicativo de una disminución en la supervivencia de las células de biopelícula (figura 1). A continuación, se deriva la concentración tanto de miconazol como de bromuro de domifeno necesaria para erradicar la biopelícula de C. albicans con un 50 % o 2 veces (concentración de erradicación de biopelícula 2, BEC-2), para permitir los cálculos de FICI (tabla 1).
Tabla 1. Combinaciones sinérgicas de miconazol - bromuro de domifeno frente a biopelículas de C. albicans
Figure imgf000007_0001
Para el interés de los inventores, se detectaron previamente otros compuestos de amonio cuaternario como potenciales potenciadores de miconazol, a saber, cloruro de benzalconio (BKC) y cloruro de becetonio (BTC) (datos no publicados). Sin embargo, su actividad en combinación con miconazol nunca se evaluó en análisis de tablero de ajedrez. Por lo tanto, en este estudio, se evaluaron las potenciales interacciones sinérgicas entre miconazol y diversos compuestos de amonio cuaternario, incluyendo cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio, cloruro de decualinio (DC) y bromuro de tetraetilamonio (TB) (figura 2).
Se descubrió que cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio y cloruro de decualinio actúan sinérgicamente con miconazol (FICI<0,5), mientras que este no es el caso para bromuro de tetraetilamonio (FICI>0,5). Estos datos sugieren que la acción sinérgica con miconazol es una característica de diversos compuestos de amonio cuaternario, lo que implica que la actividad se atribuye probablemente a la estructura química central de esta familia.
Ejemplo 4: las combinaciones de bromuro de domifeno - miconazol y cloruro de benzalconio - miconazol muestran una actividad fungicida destacada frente a biopelículas de C. albicans
Una reducción en la actividad metabólica, como se observa en los experimentos previos, no significa necesariamente que las células de biopelícula en investigación estén muertas. Bien podría ser que su metabolismo celular se atenúe en presencia de los compuestos, pero que revivan cuando se retira la tensión. Para evaluar cuánto daño se provoca realmente a las células y en qué marco temporal, se realizó un experimento de curso temporal en biopelículas de C. albicans tratadas con una combinación de bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio o cloruro de decualinio (25 pM o 50 pM) y miconazol (75 pM o 150 pM) (dando como resultado una proporción de 1/3) o compuestos individuales, en presencia de yoduro de propidio (PI) (figura 3). Las concentraciones de los compuestos se eligieron en base a la observación en la figura 1 de que el bromuro de domifeno 25 pM en combinación con miconazol 500, 250, 125 o 62,5 pM dio como resultado una reducción de la actividad metabólica de biopelícula de C. albicans por debajo de un 25 % (caja en la figura 1).
Es conocido que PI penetra a través de la membrana de células dañadas y su absorción es una indicación de muerte celular. Se observó solo un ligero incremento en la fluorescencia de PI cuando las células se trataron con miconazol 150 pM después de 16 h de tratamiento. Entre los tratamientos individuales con los compuestos de amonio cuaternario, solo bromuro de domifeno y cloruro de benzalconio mostraron un ligero incremento en la fluorescencia de PI 5-10 h después del tratamiento a 50 pM. Sin embargo, el efecto más rápido se observa para las combinaciones de miconazol con bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio o bien cloruro de becetonio 50 pM, con valores de PI que comienzan a incrementar ya 2-3 h después del tratamiento. Sorprendentemente, no se pudo observar ningún incremento adicional en la fluorescencia de PI para las combinaciones de miconazol y cloruro de decualinio (figura 3). Sorprendentemente, no se observó ningún incremento para cloruro de decualinio, pero faltan combinaciones con 50 pM.
La capacidad de destrucción de los compuestos de amonio cuaternario en presencia o ausencia de miconazol se confirmó además por el recuento de UFC para dosis seleccionadas de los compuestos (figura 4).
Solo se observaron reducciones terapéuticamente interesantes en UFC (> 3 unidades log) para combinaciones de miconazol 150 pM con cloruro de benzalconio 50 pM y bromuro de domifeno 50 pM (figura 4). Curiosamente, en unos pocos casos, se observó esterilidad completa de la superficie después del tratamiento con estas combinaciones.
Ejemplo 5: la sinergia observada entre compuestos de amonio cuaternario y miconazol es específica de miconazol.
Se evaluó si el compuesto de amonio cuaternario también podría incrementar la actividad del fluconazol frente a biopelículas de C. albicans. El fluconazol no mostró actividad antibiopelícula significativa por sí solo ni en combinación con bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio o cloruro de decualinio 25 pM (BEC-2 > 500 pM) (datos no mostrados).
Ejemplo 6: formulaciones para aplicación vulvovaginal
El ejemplo ilustra la preparación de diferentes composiciones farmacéuticas que comprenden bromuro de domifeno y/o miconazol.
Tabla 2 : formulación de composiciones de bromuro de domifeno y/o miconazol.
Figure imgf000008_0001
En F5, nitrato de miconazol está en un exceso molar de 3 veces sobre bromuro de domifeno
Ejemplo 7: modelo animal para infección vaginal por cándida
La formulación F5 anterior es una preparación de nitrato de miconazol - bromuro de domifeno con efecto sinérgico in vitro (exceso molar de 3 veces de bromuro de domifeno sobre nitrato de miconazol) se somete a prueba en un modelo de rata.
F1 a F4 son controles sin ingrediente activo (F1) nitrato de miconazol (F2 y F3) y bromuro de domifeno (F4) Se mantienen ratas Wistar hembras (180-200 g) en grupos de 4 animales. La comida y el agua están disponibles a demanda. Las condiciones de cría son: temperatura ambiente 22 °C, humedad al 60 % y un ciclo día-noche de 12 h de luz/12 h de oscuridad.
Preacondicionamiento
Las ratas se someten a ovariectomía de 2 a 3 semanas antes de infección bajo anestesia por inhalación con isoflurano. Durante la recuperación, las ratas se colocan bajo una lámpara IR durante aproximadamente 30 minutos. Tres días antes de la infección, los animales reciben 1 mg de benzoato de estradiol en 0,1 ml de PEG400 SC y 200 pg de progesterona en 0,1 ml de PBS SC para inducir el estro artificial (dado como 1 inyección). Esta inyección se repite dos veces durante el experimento.
Preparación del inóculo y procedimiento de infección.
Se usa una crioreserva de Candida albicans B2630 para la infección. Cada vial contiene 1 ml de RPMI con glicerol al 10 % con un tamaño de inóculo de 5,108 ufc/ml. Se realiza una dilución de 1/5 en agua esterilizada antes de la infección. Los animales se infectan con 1,107 ufc en 100 pl usando una micropipeta con puntas desechables. El extremo de la punta se inserta en la vagina y la rata se sostiene ligeramente hacia arriba por la cola durante aproximadamente un minuto después de la instilación.
Grupos de tratamiento
Se inicia tratamiento b.i.d. tópico la mañana después de la infección (D1) durante 4 días (200 pl/animal, aplicado insertando la punta de una jeringa de 1 ml en la vagina). Se han usado las siguientes formulaciones. (Los detalles de estas formulaciones se muestran anteriormente en la tabla 2).
G1a: formulación 1a o control infectado tratado con vehículo (VICa): b.i.d. (200 gl) (n.° 2)
G1b: formulación 1b o control infectado tratado con vehículo (VICb): b.i.d. (200 gl) (n.° 2)
G2: formulación 2 (nitrato de miconazol): b.i.d. 2 % superior durante 4 días (200 gl) (n.° 4)
G3: formulación 3 (nitrato de miconazol): b.i.d. 4 % superior durante 4 días (200 gl) (n.° 4)
G4: formulación 4 (bromuro de domifeno): b.i.d. superior durante 4 días (200 gl) (n.° 4)
G5: formulación 5 (nitrato de miconazol/bromuro de domifeno): b.i.d. 4 días (200 gl) (n.° 4)
Parámetros de evaluación
Control del estro: los días 4, 9 y 14, se toman frotis vaginales con un hisopo húmedo y se tiñen con Giemsa para comprobar el estro artificial (recuento microscópico de células epiteliales queratinizadas). Los días 2 y 7, se repiten las inyecciones de hormonas para mantener un estro continuo.
Peso corporal: seguimiento del peso corporal (BW) y cálculo del porcentaje de ganancia o pérdida en comparación con el BW antes de la infección (día 0).
Cargas de levaduras vaginales: se recogen muestras vaginales los días 4, 9 y 14. Se humedece un hisopo estéril en agua esterilizada, se inserta en la vagina y se gira dos veces. A continuación, se lleva el hisopo a un tubo con 1 ml de agua esterilizada y se coloca en el agitador de vórtice durante 40 segundos. Se preparan diluciones de diez veces de esta solución y se siembran en un agar Sabouraud. Después de 24-48 h de incubación a 37 °C, se cuentan las colonias y se calcula el número de ufc/ml como una medida de la carga intravaginal total. Los resultados se expresan como una función LOG del número de ufc que se encontraron en el hisopo (excepto cuando no hay colonias, donde el resultado = 0).
Resultados
Como no existieron diferencias entre ambos grupos de control de vehículo 1a y 1b, ambos grupos se combinaron y se muestran como grupo 1.
Control del estro
Se observaron niveles altos de células epiteliales queratinizadas durante todo el experimento (tabla 3), confirmando el estro permanente.
Tabla 3: porcentajes de células epiteliales queratinizadas observados durante todo el experimento en varios días p.i. G: grupo de tratamiento, R: número de animales.
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Peso corporal
La desviación estándar del peso corporal promedio por animal permaneció constante durante el curso de la infección (tabla 4), indicando que no se produjo pérdida de peso grave.
Tabla 4: evolución del peso corporal vivo (g) de ratas tras infección vaginal con Candida albicans
Figure imgf000010_0003
Figure imgf000010_0002
Carga de levadura vaginal
La infección se mide contando la carga fúngica intravaginal de cada hisopo (figura 5) y calculando el área bajo la curva (ABC) (figura 6). Este procedimiento permite la comparación de la infección total de varios grupos de tratamiento con el grupo de control, mientras que los recuentos de ufc permiten una comparación en varios puntos temporales p.i. El ABC muestra claramente que un 2 % de miconazol no afecta al resultado de la infección, mientras que un 4 % de miconazol tiene un efecto positivo (reducción de un 33 % en el ABC). El potenciador DOM por sí solo no influye en el resultado de la infección, mientras que la combinación de 2 % MIC DOM reduce el ABC de la infección en un 66 %.
En las condiciones experimentales indicadas, se pudo demostrar un efecto antifúngico del miconazol cuando se usa al 4 %. No se observó ningún efecto antifúngico para miconazol al 2 %, pero se observó un efecto significativo cuando se añadió el potenciador bromuro de domifeno, aunque el bromuro de domifeno por sí solo no influye en el resultado de la infección.
Ejemplo 8: infección vaginal por cándida (II)
Los animales, preacondicionamiento, preparación de inóculo y procedimiento de infección son como se describe en el ejemplo 7.
Grupos de tratamiento
Se inicia tratamiento b.i.d. tópico la mañana después de la infección (D1) durante 4 días (200 pl/animal, aplicado insertando la punta de una jeringa de 1 ml en la vagina)
G1: formulación 1 o control infectado tratado con vehículo (VIC): b.i.d. (200 pl) (n.° 4)
G2: formulación 2 (nitrato de miconazol): b.i.d. 2 % superior durante 4 días (200 pl) (n.° 9)
G3: formulación 5 (nitrato de miconazol/1/3 mmol de bromuro de domifeno): b.i.d. 4 días (200 pl) (n.° 10)
G4: formulación 4 (1/3 mmol de bromuro de domifeno): b.i.d. 4 días (200 pl) (n.° 4)
Parámetros de evaluación
El control del estro, peso corporal y cargas vaginales de levadura se determinaron como se describe anteriormente.
Control del estro
Se observaron niveles altos de células epiteliales queratinizadas durante todo el experimento (tabla 5, que se relaciona con el estro. Se debe señalar que, para algunos animales en el grupo 3, la queratinización pareció disminuir alrededor del día 4. Esto se debe probablemente a la forma de muestreo, que se ha modificado para el día 9, demostrando que la queratinización todavía está en su sitio.
Tabla 5: porcentajes de células epiteliales queratinizadas
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000011_0001
Peso corporal
La desviación estándar del peso corporal promedio por animal permaneció constante durante el curso de la infección (tabla 6), indicando que no se produjo una pérdida de peso grave.
Tabla 6: peso corporal (en g) de ratas en varios días p.i.
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000012_0001
Cargas de levadura vaginal
La infección se mide contando la carga fúngica intravaginal de cada hisopo (tabla 7) y calculando el área bajo la curva (ABC) (figura 8). Este procedimiento permite la comparación de la infección total de varios grupos de tratamiento con el grupo de control, mientras que los recuentos de ufc permiten una comparación en varios puntos temporales p.i. El ABC muestra un claro efecto de miconazol al 2 %, coincidiendo con resultados previos, reduciendo la infección en un 65 %. También coincidiendo con resultados previos, la combinación de miconazol al 2 % potenciador reduce el ABC, pero solo hay un beneficio claro el día 4 en comparación con miconazol al 2 %. Coincidiendo con el primer experimento (exp. 2017-1146), domifeno por sí solo no reduce la infección. Para este experimento, no se ha observado agitación adicional de determinados grupos, al contrario que los resultados previos.
Tabla 7: carga de infección intravaginal
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0003
Figure imgf000013_0004
La figura 7 muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos en diferentes días p.i. La carga se muestra como el log de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. La figura 8 muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos. La carga se muestra como el área bajo la curva (ABC) en comparación con el grupo de control (G1) (= 100 %) se muestra como el log de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. G: grupo de tratamiento.
Tanto miconazol al 2 % como miconazol al 2 % combinado con domifeno reducen la infección. El día 4, hay un efecto adicional de domifeno, pero este efecto no se puede observar los días 9 y 14.
La figura 9 resume el resultado de 3 experimentos obtenidos con 12 ratas como control, 17 ratas con tratamiento con 2 % mcz, 8 ratas con bromuro de domifeno solo, 18 ratas con tratamiento con 2 % MCZ 1/3 DB, 6 ratas con tratamiento con 2 % MCZ 1/6 DB.
Ejemplo 9 Potenciación de miconazol por bromuro de domifeno frente a biopelículas de Candida glabrata
Materiales y procedimientos
Cepas y productos químicos. La cepa BG2 de C. glabrata se cultivó en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona bacteriológica al 2 % (LabM, Reino Unido) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich) en DMSO (VWR International, Bélgica). Se adquirió medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se suministró bromuro de domifeno (DB) por Purna Pharmaceuticals y se preparó una solución de trabajo de tritón al 1 % (Sigma-Aldrich) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Ensayo de tablero de ajedrez de biopelícula con determinación de UFC. Se diluyó un cultivo durante la noche de C. glabrata BG2, cultivado en YPD a 30 °C, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI y se añadieron 100 pl de esta suspensión a los pocillos de una microplaca de fondo redondo (TPP Techno Plastic Products AG, Suiza). Después de 1 h de adhesión a 37 °C, se aspiró el medio y se lavaron las biopelículas con 100 pl de PBS para retirar las células inadherentes, seguido de la adición de 100 pl de medio RPMI 1640. Se dejó que las biopelículas crecieran durante 24 h a 37 °C. Para determinar la posible potenciación de MCZ por DB, se usó un ensayo de tablero de ajedrez. Se añadió una combinación de MCZ y DB, diluidos dos veces en filas y columnas de una microplaca respectivamente a biopelículas de a C. glabrata (fondo de DMSO 1 %). Después de 38 h de incubación a 37 °C, se realizó la determinación de UFC en las biopelículas tratadas. Con este fin, las biopelículas se lavaron con PBS, se rasparon completamente del fondo de la placa y se disolvieron en 100 pl de tritón (1 %). Se plaquearon diluciones en serie (10-2, 10-3 y 10-4) en placas de agar YPD, seguido de un período de incubación de 24 h a 37 °C y posterior recuento de colonias.
Resultados y análisis
Bromuro de domifeno potencia miconazol frente a biopelículas de C. albicans
Los compuestos de amonio cuaternario, como DB, son potenciadores de MCZ frente a biopelículas de C. albicans. Para determinar si DB también es un potenciador de MCZ frente a biopelículas de C. glabrata, se realizó un experimento de tablero de ajedrez. La figura 10 muestra la supervivencia de células de biopelícula de C. glabrata después de un tratamiento individual o de combinación con MCZ y DB. Los valores de log UFC medios /- EEM se muestran para 6 repeticiones biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre ambos tratamientos individuales con MCZ (150 pM) y DB (37,5 pM) y una combinación. Se realizaron un ANOVA de bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey y se muestran las diferencias significativas.
Se sometieron a ensayo series de concentraciones de ambos compuestos y solo se observó una reducción significativa en UFC para una combinación de MCZ 500 pM con DB 37,5 pM en comparación con el tratamiento con compuesto individual.
La potenciación observada de MCZ por DB parece ser específica de MCZ
Se evaluó si DB también podría incrementar la actividad de posaconazol frente a biopelículas de C. glabrata. Posaconazol no mostró actividad antibiopelícula significativa por sí solo ni en combinación con DB (datos no mostrados).
Ejemplo 10 Potenciación de azoles por bromuro de domifeno frente a biopelículas de Candida albicans
Cepas y productos químicos. Tanto la cepa SC5314 como la cepa B59630 de C. albicans, amablemente suministradas por el laboratorio de microbiología, parasitología e higiene del prof. Paul Cos, se cultivaron en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona bacteriológica al 2 % (LabM, Reino Unido) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich), ketoconazol (TCI Europa, Bélgica), clotrimazol (Sigma-Aldrich), itraconazol (TCI) y fluconazol (MP Biomedicals, Francia) en DMSO (VWR International, Bélgica). Posaconazol (Noxafil) se compró a MSD. El medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio se adquirió de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se suministró bromuro de domifeno (DB) por Purna Pharmaceuticals y se preparó una solución de trabajo de tritón al 1 % (Sigma Aldrich) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Ensayo de tablero de ajedrez de biopelícula con determinación de UFC. Se diluyó un cultivo durante la noche de C. albicans cultivado en YPD a 30 °C, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI y se añadieron 100 pl de esta suspensión a los pocillos de una microplaca de fondo redondo (TPP Techno Plastic Products AG, Suiza). Después de 1 h de adhesión a 37 °C, se aspiró el medio y se lavaron las biopelículas con 100 pl de PBS para retirar las células inadherentes, seguido de la adición de 100 pl de medio RPMI 1640. Se dejó que las biopelículas crecieran durante 24 h a 37 °C. Para determinar la posible potenciación de los agentes antifúngicos por DB, se usaron ensayos de tablero de ajedrez. Se añadió una combinación del compuesto antifúngico, un imidazol (MCZ, ketoconazol o clotrimazol) o bien un triazol (fluconazol, itraconazol o posaconazol) y DB, diluidos dos veces en filas y columnas de una microplaca respectivamente, a biopelículas de C. albicans. Después de 24 h de incubación a 37 °C, se realizó la determinación de UFC en las biopelículas tratadas. Con este fin, las biopelículas se lavaron con PBS, se rasparon completamente del fondo de la placa y se disolvieron en 100 pl de tritón (1 %). Se plaquearon diluciones en serie (10-1, 10-2 y 10-3) en placas de agar YPD, seguido de un período de incubación de 24 h a 37 °C y posterior recuento de colonias.
Resultados y análisis
Los compuestos de amonio cuaternario, como DB, son potenciadores de MCZ frente a biopelículas de C. albicans. Los imidazoles, por ejemplo MCZ, y triazoles, como fluconazol, son dos grupos de azoles, caracterizados por 2 y 3 átomos de nitrógeno en el anillo de azol respectivamente (Cleary y col. (1990). DICP, Annals of Pharmacother., 24: 148-152; Troyer y col. (2013). J.chem, 2013: 1-23). Los azoles inhiben la biosíntesis de ergosterol y miconazol tiene un efecto adicional sobre las mitocondrias de la célula (Cleary y col. (1990). DICP, Annals of Pharmacother., 24: 148­ 152; Ghannoum y Rice (1999). Clinical Microbial.reviews, 12(4): 501-517; Portillo y Gancedo (1984) Eur. J Biochem, 143(2): 273-276; Swamy y col. (1974). Antimicrob. Agents Chemother. 5(4): 420-425). Para determinar si DB también potencia otros imidazoles y triazoles frente a biopelículas de C. albicans, se realizaron experimentos de tablero de ajedrez (figura 11).
La figura 11 muestra la supervivencia de células de biopelícula de C. albicans después del tratamiento individual o de combinación con un antimicótico y DB. (paneles A-D) Supervivencia de células de biopelícula de la cepa B59630 o la cepa SC5314 de C. albicans después del tratamiento individual o de combinación con un imidazol y DB. Los valores de log UFC medios /- EEM se muestran para al menos 3 réplicas biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre ambos tratamientos individuales con DB y con miconazol (A y C) (150 pM), ketoconazol (panel B) (300 pM) o bien clotrimazol (panel D) (150 pM) y combinaciones (fondo de DMSO al 1 %). Se realizaron un ANOVA bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey y se muestran las diferencias significativas.
(E-G) Supervivencia de células de biopelícula de C. albicans SC5314 después de tratamientos individuales o de combinación con un triazol y DB. Los valores de log UFC medios /- EEM se muestran para al menos 2 réplicas biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre ambos tratamientos individuales con DB y con fluconazol (panel E) (150 pM), itraconazol (panel F) (75 pM) o bien posaconazol (panel G) (285 pM) y combinaciones (fondo de DMSO al 1 %, 2 % y 0,5 % respectivamente). Se realizaron un ANOv A bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey y se muestran los valores de p.
Se sometieron a prueba series de concentraciones de azol y DB y la combinación, dando como resultado la reducción de UFC más significativa, se muestra en la figura 11. Solo se observaron reducciones significativas en UFC para combinaciones de DB con imidazoles en comparación con tratamientos de compuesto individual. La combinación MCZ y DB dio como resultado reducciones significativas en UFC en comparación con tratamientos de compuesto individual tanto para la cepa SC5314 como la cepa B59630 de C. albicans. En unos pocos casos, el tratamiento con estas combinaciones dio como resultado una esterilidad completa de la superficie. Los triazoles no mostraron actividad antibiopelícula significativa por sí mismos ni en combinación con DB, indicando que la potenciación observada de imidazoles por DB es específica de imidazol.
Ejemplo 11. Potenciación de miconazol por bromuro de domifeno frente a biopelículas de C. glabrata
Materiales y procedimientos
Cepas y productos químicos. La cepa BG2 de C. glabrata se cultivó en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona bacteriológica al 2 % (LabM, Reino Unido) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich) en DMSO. Se adquirió medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se suministró bromuro de domifeno (DB) por Purna Pharmaceuticals.
Ensayo de tablero de ajedrez con determinación de la concentración mínima inhibidora (MIC). Se diluyó un cultivo durante la noche de C. glabrata BG2, cultivado en YPD, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI, precalentado a 37 °C. Se añadieron 90 pl de la suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos, que contenían 10 pl de una combinación de MCZ y DB, diluidos dos veces en filas y columnas respectivamente (fondo de DMSO al 2 %). Después de 24 y 48 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia a 490 nm por un lector multimodo (lector de microplacas multimodo Synergy Mx, BioTek, EE. UU.).
El miconazol se potencia por DB frente a cultivos planctónicos de C. glabrata
El bromuro de domifeno (DB) es un potenciador del miconazol frente a biopelículas de C. glabrata. Para determinar si DB también potencia el miconazol frente a cultivos planctónicos de C. glabrata, se determinó la concentración mínima inhibidora (MIC), la concentración de miconazol que da lugar a una reducción en el crecimiento visible de un 50 %, se determinó por medio de un ensayo de tablero de ajedrez (figura 12). Los valores de MIC se determinaron usando Graphpad Prism 6 (tabla 8).
La figura 12 muestra que el tratamiento de MCZ-DB combinado reduce el valor de MIC en comparación con el monotratamiento de MCZ frente a cultivos planctónicos de C. glabrata. Los valores representan el crecimiento visible medio de 3 réplicas biológicas (A) como porcentaje del tratamiento de control (DMSO al 2 %) y (B) como porcentaje de monotratamiento con la correspondiente concentración de DB. Para diferentes concentraciones de DB, las curvas de dosis-respuesta de miconazol se muestran en diferentes colores (azul 0 pM; rojo 0,78 pM; verde 1,56 pM y púrpura 3,125 pM). Se sometió a prueba una serie de concentraciones de MCZ, que varían de 0,0075 pM a 1 mM. La absorbancia se midió después de 24 h de tratamiento.
Tabla 8. Valores de MIC para el tratamiento de 24 h con la combinación MCZ-DB frente a cultivos planctónicos de C. glabrata . Los valores de MIC, significativamente reducidos en comparación con el monotratamiento con MCZ, se indican en verde por # #. Se usó Graphpad Prism 6 para calcular los valores de MIC.
Figure imgf000016_0001
Los datos del tablero de ajedrez muestran que, en presencia de DB, se pueden usar concentraciones significativamente menores de MCZ para reducir el crecimiento visible con un 50 % en comparación con el monotratamiento con miconazol. Se observó una reducción significativa del valor de MIC para DB 3,125 pM.
Además, el cloruro de benzalconio (BKC), otro compuesto de amonio cuaternario, no pudo potenciar MCZ frente a cultivos planctónicos de C. glabrata (véase la figura 12C).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para uso tópico que comprende miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno como ingredientes activos para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en la que la infección fúngica es una infección con Candida sp.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en la que la infección fúngica es una infección con Candida albicans o Candida glabrata.
4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de una biopelícula formada por Candida sp.
5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección vulvovaginal.
6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que se formula como una crema.
7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que comprende además un mucoadhesivo.
8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en la que el exceso molar de miconazol o su sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4, o en la que la concentración de miconazol o su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
9. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y que comprende como ingredientes antifúngicos activos una mezcla de miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno.
10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende nitrato de miconazol.
11. La composición de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, que es una crema con una viscosidad de entre 300 cp y 300 cp a 180 rmp.
12. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que tiene un pH de entre 2,7 y 3,5.
13. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que el exceso molar de miconazol o su sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4, o en la que la concentración de miconazol o su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
14. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende además un mucoadhesivo.
15. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que se envasa en un aplicador para suministro vaginal.
ES18745504T 2017-07-18 2018-07-05 Composiciones frente a infecciones por cándida Active ES2895653T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1711512.2A GB201711512D0 (en) 2017-07-18 2017-07-18 Compositions against candida infections
LU100445 2017-09-20
PCT/EP2018/068192 WO2019015975A1 (en) 2017-07-18 2018-07-05 COMPOSITIONS AGAINST CANDIDA INFECTIONS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2895653T3 true ES2895653T3 (es) 2022-02-22

Family

ID=63012980

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES21191588T Active ES2960745T3 (es) 2017-07-18 2018-07-05 Composiciones contra infecciones por cándida
ES18745504T Active ES2895653T3 (es) 2017-07-18 2018-07-05 Composiciones frente a infecciones por cándida

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES21191588T Active ES2960745T3 (es) 2017-07-18 2018-07-05 Composiciones contra infecciones por cándida

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11793790B2 (es)
EP (2) EP3654973B1 (es)
CY (1) CY1125444T1 (es)
DK (1) DK3654973T3 (es)
ES (2) ES2960745T3 (es)
HR (1) HRP20211731T1 (es)
HU (1) HUE056271T2 (es)
LT (1) LT3654973T (es)
PL (2) PL3654973T3 (es)
PT (1) PT3654973T (es)
RS (1) RS62502B1 (es)
SI (1) SI3654973T1 (es)
WO (1) WO2019015975A1 (es)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU513753B2 (en) * 1974-07-08 1980-12-18 Johnson & Johnson Antimicrobial composition
DE3682908D1 (de) * 1985-09-24 1992-01-23 Ss Pharmaceutical Co Fungizides mittel.
WO1996040121A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Agent antifongique
US7868162B2 (en) * 1998-12-30 2011-01-11 Lakewood-Amedex, Inc. Antimicrobial and antiviral compounds and methods for their use
IL143477A (en) * 2001-05-31 2009-07-20 Finetech Pharmaceutical Ltd Process for the preparation of 17-phenyl-18,19,20-trinor-pgf2?? and its derivatives
AU2002228760A1 (en) * 2000-10-26 2002-05-06 Merck & Co., Inc. Mammalian metabolites of a tachykinin receptor antagonist
WO2015102850A2 (en) * 2014-01-02 2015-07-09 Cook Medical Technologies Llc Compositions, devices and methods for treating infections
US9782333B2 (en) * 2015-01-21 2017-10-10 Chattem Inc. Oral composition for xerostomia

Also Published As

Publication number Publication date
SI3654973T1 (sl) 2021-12-31
EP3949962C0 (en) 2023-09-13
US20200138786A1 (en) 2020-05-07
PL3654973T3 (pl) 2022-01-17
CY1125444T1 (el) 2023-03-24
HUE056271T2 (hu) 2022-02-28
EP3949962A1 (en) 2022-02-09
DK3654973T3 (da) 2021-11-15
WO2019015975A1 (en) 2019-01-24
EP3654973B1 (en) 2021-08-18
EP3949962B1 (en) 2023-09-13
PT3654973T (pt) 2021-10-15
EP3654973A1 (en) 2020-05-27
PL3949962T3 (pl) 2024-03-18
ES2960745T3 (es) 2024-03-06
LT3654973T (lt) 2021-11-25
HRP20211731T1 (hr) 2022-02-18
US20230414570A1 (en) 2023-12-28
US11793790B2 (en) 2023-10-24
RS62502B1 (sr) 2021-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10441595B2 (en) Methods for treating fungal infections
US10398725B2 (en) Ophthalmic compositions and methods of use
US20190142800A1 (en) Synergistic antifungal compositions and methods thereof
Sun et al. Caffeic acid phenethyl ester synergistically enhances the antifungal activity of fluconazole against resistant Candida albicans
US20170232004A1 (en) Methods for treating fungal infections
KR20010108469A (ko) 항진균 조성물
JP7224916B2 (ja) 真菌感染の処置のための投薬レジメン
US20170333339A1 (en) Antifungal compositions for thetreatmentof skin and nails
KR20170036058A (ko) 코 적용을 위한 시네올-함유 조성물
ES2895653T3 (es) Composiciones frente a infecciones por cándida
US20150366822A1 (en) Topical antifungal composition for treating onychomycosis
EP3452015A1 (en) Compositions and methods for treatment of inflammation or infection of the eye
WO2011115585A1 (en) Pharmaceutical combination of acetylsalicylic acid and antifungal compound for destroying or growth inhibition and reproduction of fungi
ZA200110386B (en) Stable xylometazoline and oxymetazoline solution.
EP4003016A1 (en) Antimycotic
RU2783649C2 (ru) Жидкая фармацевтическая композиция нафтифина
US11246857B2 (en) Anti-fungal inhibitors
WO2019099055A1 (en) Novel ophthalmic composition and methods of use
Müller Biofilm formation and its impact on antifungal therapy
US20190060224A1 (en) Novel ophthalmic composition and methods of use
US20190060355A1 (en) Novel ophthalmic composition and methods of use
WO2019040051A1 (en) NOVEL OPHTHALMIC COMPOSITION AND METHODS OF USE
MXPA04009775A (es) Composicion para el tratamiento topico de vulvovaginitis y micosis.
WO2011119119A2 (en) The combination of antifungal compound and modifier of proton homeostasis for destroying or growth inhibition and reproduction of fungi